CN105646719A - 一种高效定点转基因的工具及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种高效定点转基因的工具。所述工具包含或可产生gRNA-不具备内切酶活性的Cas9蛋白-PB转座酶复合物，所述gRNA靶向基因组特定位点；所述不具备内切酶活性的Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的双突变Cas9蛋白。本发明通过设计靶向动物基因组的导向RNA(gRNA)，在gRNA与定点转座酶共表达情况下，PB转座酶随着CRISPR/cas9和gRNA的复合物靶向到基因组的特异位置，PB转座酶在特异的位点实现转座功能，如此同时共转染供体质粒(包含有外源目标基因的载体)，即可将外源的目标载体转座到基因组中特异性位点，从而实现定点转基因。

Description

一种高效定点转基因的工具及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种高效定点转基因的工具。
背景技术
定点转基因是将目的基因精确的整合到基因组的预定位置，可以有效的避免外源基因的随机整合，造成宿主基因的插入突变从而产生不可预知的影响。此外，外源基因整合到基因组中非活跃区受到位置效应影响导致外源基因表达量低或者表达完全沉默。通过基因组学研究以及生物信息分析，发现在动物基因组中存在一些基因表达的安全位点，外源基因整合到基因组中的该位点时，外源基因既不会影响动物本身基因组的稳定和安全，外源基因的表达也不会受到染色体状态影响。大量研究发现小鼠的ROSA26以及人AAVS1和hROSA26位点可作为转基因的安全位点。随着人类基因组研究进一步深入，越来越多的转基因安全位点将会被发现，应用于转基因动物制备或是细胞或者基因治疗。
怎样将外源的基因高效的整合到这些安全位点，一直是困扰科学家的难题。虽然利用基因打靶技术以及将外源基因精确的整合到基因组中的靶位点，但是同源重组的效率只有10-7，且操作过程繁琐，劳动量巨大。最近发展ZFN、TALEN以及CRIPSR/Cas9基因编辑技术可以精确的切割动物细胞基因组DNA，可以人为制造细胞基因的插入或是缺失突变；虽然ZFN、TALEN、CRIPSR/Cas9切割基因组DNA，DNA双链断裂可以有效的提高同源重组效率，如果在供体模板DNA中插入外源基因也可以显著提高基因定点敲入的效率，但其本质仍然是同源重组，定点转基因效率仍然偏低。
CRISPR是在古细菌中发现的一种抵抗噬菌体入侵的免疫系统，近年来科学家根据CRISPR/Cas9的生物学特性，将其改造成为动物基因组DNA的基因编辑技术。
转座子是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位置的过程被称为转座。DNA转座子增效切离-粘贴机制，及在转座酶的催化下，DNA转座子从原始位置切离并插入到新的基因组位置。Piggbac(PB)转座子是一种能在哺乳动物细胞中发挥高效转座功能的DNA转座子，能将转座子基因随机插入到哺乳动物基因组中TTAA位点。PB转座子系统包含一个约为64kDa的转座酶，其供体质粒左端包含306bpPBL序列和右端包含237bpPBR序列。利用Piggbac转座子系统能够在动物细胞中实现高效的转基因，但是外源基因整合方式仍然为随机整合，因此实际应用中存在安全隐患。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高效定点转基因的工具。
研究发现Cas9蛋白第十位氨基酸残基D突变为A，第840位氨基酸残基H突变为A(D10A和H840A)，双突变的CRISPR/Cas9系统能够根据导向RNA(gRNA)序列结合到基因组的特异性位点，但其内切酶活性完全消失，因此不能切割基因组DNA。
为了实现高效的定点转基因，本发明利用piggbac转基因效率高的优点，并且结合双突变CRISPR/cas9系统的靶向功能。利用基因工程技术，将二者融合成为一种能够实现高效定点转基因的DNA转座子系统。
具体而言，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种高效定点转基因的工具，所述工具包含或可产生：gRNA-不具备内切酶活性的Cas9蛋白-PB转座酶复合物，所述gRNA靶向基因组特定位点。
该工具可为重组表达载体，也可为其他形式的转基因工具，只要其在定点转基因方面应用时，利用“gRNA-不具备内切酶活性的Cas9蛋白-PB转座酶”复合物实现高效的定点转基因，该工具即在本发明的保护范围之内。
为了更好地实现转基因目的与效果，本发明所述的不具备内切酶活性的Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的双突变Cas9蛋白。
基于上述技术方案，本发明给出一个具体的转基因工具，即一种高效定点转基因的载体，所述载体包含：
1)可转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列；
2)编码双突变Cas9蛋白的核苷酸序列；所述双突变Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的Cas9蛋白；
3)编码PB转座酶的核苷酸序列。
所述载体的表达产物中，tracrRNA与crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体gRNA，双突变Cas9蛋白与PB转座酶之间通过6个串联重复的GGS肽链连接，gRNA引导双突变Cas9蛋白与PB转座酶靶向作用于基因组特定位点。
该gRNA需要针对具体的特异靶向位点进行设计，设计过程可根据本领域常规设计方法进行，设计过程本发明不另作限定。gRNA的具体序列本发明也不另作限定，本领域技术人员可以理解为任意一个可针对基因组特定位点的gRNA，只要能实现靶向引导作用即可。
双突变Cas9蛋白与PB转座酶之间通过6个串联重复的GGS肽链(linker)连接的目的在于，在该linker的存在下，双突变Cas9蛋白与PB转座酶避免空间位阻对重组蛋白各功能域的影响，高效的发挥各功能域的活性。
综上，上述载体将表达“gRNA-双突变Cas9蛋白-linker-PB转座酶”复合物，双突变Cas9蛋白与PB转座酶将由gRNA靶向引导至基因组的特异性位点。当存在外源目的基因时，双突变Cas9蛋白与PB转座酶将发挥作用，实现外源目的基因的定点转座。
作为优选，所述tracrRNA与crRNA在U6和H1启动子的驱动下转录，提高二者配对形成gRNA的效率。
作为优选，所述载体中含有CMV增强子，目的在于提高融合蛋白的表达效率。
为了更好地利用所述载体表达上述复合物，本发明为载体中的主要元件提供一个具体的连接方式，从5’到3’端依次为U6启动子驱动crRNA表达框，CMV启动子驱动Cas9蛋白-PB转座酶融合蛋白表达框，H1启动子驱动tracrRNA框。参见图2。
第二方面，本发明提供一种高效定点转基因的方法，如图1所示，将前述工具或前述载体，与含有外源目的基因的载体共转染到宿主细胞中。即可将外源目的基因的转座到基因组中的目标特异性位点上，从而实现定点转基因。本发明构建的载体所表达目的产物可以将任意外源基因定点整合到目的位置。
第三方面，本发明提供一种具体针对人ROSA26位点高效转基因的方法，将前述载体与含有外源目的基因的载体共转染到宿主细胞中；其中，转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列分别为aaacGAGGCTGTGCTTCGGCGCTC和taaaGAGCGCCGAAGCACAGCCTC。
进一步说明，tracrRNA序列是固定的，crRNA是要根据靶点来设计的，设计的寡聚核酸退火后形成种子DNA，用酶BbsI切开crRNA表达匡后，插入靶点互补配对的序列大约20bp，表达的crRNA产物即可与靶向的DNA发生互补配对。
同理，当目的基因需要定点转入其他位点时，本领域技术人员可针对目标位点设计相应的用于转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列，使二者配对后的RNA二聚体具有靶向该目标位点的功能。
第四方面，本发明还提供了前述工具或前述载体在高效定点转基因方面的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明利用蛋白肽链将PB转座酶与双突变的Cas9蛋白连接成为一种新型重组蛋白。通过设计靶向动物基因组的导向RNA(gRNA)，在U6和H1启动子驱动下转录crRNA和tracrRNA二聚化形成gRNA；在gRNA与定点转座酶共表达情况下，PB转座酶随着CRISPR/cas9和gRNA的复合物靶向到基因组的特异位置，PB转座酶在特异的位点实现转座功能，如此同时共转染供体质粒(包含有外源目标基因的载体)，即可将外源的目标载体转座到基因组中特异性位点，从而实现定点转基因。该体系创新性的结合突变CRISPR/cas9靶向性与piggbac高效转座功能，载体表达的重组蛋白具有定点转座功能，从而实现高效的定点转基因。
附图说明
图1为本发明所述定点转基因方法的示意图。
图2为本发明所述高效定点转基因载体的示意图。
图3为本发明实施例1所述载体的构建流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1针对人ROSA26位点的高效定点转基因载体
本实施例以针对人ROSA26位点的高效定点转基因载体为例，用于说明本发明所述转基因工具(载体)的构建方法。
1.Kpn1和Fse1双酶切PX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-H1-shorttracr-PGK-puro(D-A)载体(购自Addgene)，胶回收大于5bk片段。基因合成aaaGGTACCCTGCAGCTAGCCTGCTGcaattgactatGTCGACactatggccggcccct片段，Kpn1和Fse1双酶切后插入到回收骨架载体中获得载体1(Vector1)。
2.以agaggtaccgcgttacataacttacggtaa和AGGCTAGcggatctgacggttcactaaaccagctct为上下游引物，以pEGFP-N1(购自上海吉满生物)为模板扩增CMVpromoter，Kpn1和Nhe双酶切插入Vector1，挑选克隆测序获得中间载体Vector2。
3.以tccgctagcgctaatgggtagttcttta和gtcaattgtcacacgtaatattacgaca为上下游引物，以pPrm1-Pbase(来自中国农业大大学国家农业生物技术国家重点实验室)为模板扩增pBase5片段，Nhe1和Mfe1双酶切插入Vector2，挑选克隆测序，获得中间载体vector3。
4.全基因合成pBase3序列，突变Bbs1酶切位点加入linker(6个串联的GGS序列)，得到如SEQIDNO.1所示的核苷酸片段，Mfe1和Sal1双酶切该片段后插入Vector3，获得中间载体Vector4。
5.以ggaGTCGACGACAAGAAGTACAGC和cctggccggccTCCCAGCTGAGACAGGTCGATCCG为引物，以pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression(购自Addgene)为模板，高保真扩增dual-dCas9片段(Cas9(D10A,H840A))，sal1和Fse1双酶切插入Vector4，挑选克隆测序，获得最终载体即为定点转基因的工具系统。构建流程如图3所示，载体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
实施例2实施例1载体在高效定点转基因方面的应用
本实施例以EGFP标记的新霉素抗性基因为外源目的基因，用于说明利用实施例1所述载体高效定点转入外源目的基因的方法。
1、在线(http://crispr.mit.edu/)设计针对于人ROSA26位点的特异性gRNA，首先合成aaacGAGGCTGTGCTTCGGCGCTC和taaaGAGCGCCGAAGCACAGCCTColigoDNA，双蒸水溶解后1:1混合，94℃温育30s，72℃温育2min，插入冰上保存，取0.5微升混合液加入到Bsa1酶切定点转座酶表达质粒，T4连接酶16℃反应2h，42℃热激转化感受态细胞，涂布到氨苄青霉素LB固体培养基培养板过夜培养，挑菌接种到液体LB培养基，过夜培养后提质粒测序鉴定。
2、将构建好的载体与携带有表达EGFP与新霉素抗性的供体质粒(ZGl-neo)，按照1:5比例混合，脂质体共转染293T细胞。
3、细胞转染后继续培养24小时，0.5％胰蛋白酶消化细胞传代，按照1×105接种到10cm皿，培养24小时后，加入G418持续筛选7天获得单克隆细胞系。
4、利用克隆环挑选G418(新霉素)抗性的细胞克隆，利用微量DNA提取试剂盒提取细胞DNA，用Hae111或Msp1酶切并自连后的基因组DNA作为方向PCR模板。
引物：CTTGACCTTGCCACAGAGGACTATTAGAGG与CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC用于检测转座子左侧末端(PBL)的邻接基因组序列；
引物：CCTCGATATACAGACCGATAAAACACATGC与AGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATC用于检测转座子左侧末端(PBR)的邻接基因组序列。将PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega)后进行铡序。测序结果用美国国家生物技术信息中心(NCBI)或欧洲生物信息学研究所基因组浏览器Ensembl的人类基因组数据库进行BLAST比对分析。
5、通过对PCR序列测序比对分析分析发现，定点转酶介导的外源基因均整合到3号染色人ROSA26基因座位置，其中有四个细胞克隆外源基因整合到基因组中同一位置；对照组中所检测的五个细胞克隆外源基因分别随机整合到五条不同的染色体上。
定点转座酶介导外源基因整合位点
克隆编号 邻接基因组序列 染色体 基因/EnsembleID号
1 TTAACCGAGACCGCGCCC 3 hROSA26
2 TTAAGGGGCTAACTTGGT 3 hROSA26
3 TTAACCGAGACCGCGCCC 3 hROSA26
4 TTAACCGAGACCGCGCCC 3 hROSA26
5 TTAACCGAGACCGCGCCC 3 hROSA26
PB转座子介导外源基因整合位点
克隆编号 邻接基因组序列 染色体 基因ID号
1 TTAAAGAAACACAG 4 NM_003603
2 TTAAAAAAAATTTAT 12 Q9Y2I9
3 TTAAAACGGAAGTT 2 ERBB4
4 TTAAAGTAAGAAAT 19 XM-37l190
5 TTAATAATTTGTCC 22 PLA2G6
对比重组转座酶与普通PB转座酶介导外源基因整合位点，可以发现重组转座酶的外源基因均整合到目标位点，而普通PB转座酶介导的外源基因随机分布基因组各条染色体。从结果证明重组转座酶可以高效将外源基因定向转座到目标位置。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高效定点转基因的工具，其特征在于，所述工具包含或可产生：gRNA-不具备内切酶活性的Cas9蛋白-PB转座酶复合物，所述gRNA靶向基因组特定位点。
2.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述不具备内切酶活性的Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的双突变Cas9蛋白。
3.一种高效定点转基因的载体，其特征在于，所述载体包含：
1)可转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列；
2)编码双突变Cas9蛋白的核苷酸序列；所述双突变Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的Cas9蛋白；
3)编码PB转座酶的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体的表达产物中，tracrRNA与crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体gRNA，双突变Cas9蛋白与PB转座酶之间通过6个串联重复的GGS肽链连接，gRNA引导双突变Cas9蛋白与PB转座酶靶向作用于基因组特定位点。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述tracrRNA与crRNA在U6和H1启动子的驱动下转录。
6.根据权利要求3～5任一项所述的载体，其特征在于，所述载体中含有CMV增强子。
7.根据权利要求3～5任一项所述的载体，其特征在于，所述载体从5’到3’端依次为U6启动子驱动crRNA表达框，CMV启动子驱动Cas9蛋白-PB转座酶融合蛋白表达框，H1启动子驱动tracrRNA框。
8.一种高效定点转基因的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的工具或权利要求3～7任一项所述的载体，与含有外源目的基因的载体共转染到宿主细胞中。
9.一种针对人ROSA26位点高效转基因的方法，其特征在于，将权利要求3～7任一项所述的载体，与含有外源目的基因的载体共转染到宿主细胞中；其中，tracrRNA和crRNA的核苷酸序列分别为aaacGAGGCTGTGCTTCGGCGCTC和taaaGAGCGCCGAAGCACAGCCTC。
10.权利要求1或2所述的工具或权利要求3～7任一项所述的载体在高效定点转基因方面的应用。
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