CN110402305A - 一种crispr文库筛选的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包含多个PB介导的CRISPR系统多核苷酸的基因组文库，其包含侧翼为最小的piggybac反向重复元件的最小向导RNA。还提供了使用所述多核苷酸文库进行体内基因组规模筛选的方法。

Description

一种CRISPR文库筛选的方法
技术领域
本发明关于用于诱变的载体构建、全基因组筛选技术，尤其关于作为递送向导RNA文库载体的piggyBac(PB)转座子，并且设计用于体内筛选。
背景技术
在过去的十年中，转座子诱变和RNA干扰介导的筛选一直是小鼠体内肿瘤基因筛选和验证的主要方法(Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics 46(1)：24-32.(2014)；Carlson CM，et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 102(47)：17059-17064.(2005)；Keng VW，et al.Naturebiotechnology 27(3)：264-274.(2009)；Dupuy AJ，et al.Nature 436(7048)：221-226.(2005)；Zender L，et al.Cell 135(5)：852-864.(2008)；Schramek D，et al.Science 343(6168)：309-313.(2014))。然而，由于效率低，这两种方法尚未得到广泛应用。近年来，CRISPR/Cas9已成为一种高效的诱变工具(Cong L，et al.Science 339(6121)：819-823.(2013)；Mali P，et al.Science 339(6121)：823-826.(2013))并被迅速应用为体内肿瘤诱导和肿瘤基因验证的一种技术(Sanchez-Rivera FJ，et al.Nature 516(7531)：428-+.(2014)；Chiou SH，et al.Genes&Development 29(14)：1576-1585.(2015)；Zuckermann M，et al.Nature Communications 6：9.(2015)；Maddalo D，et al.Nature 516(7531)：423-+.(2014)；Xue W，et al.Nature 514(7522)：380-384.(2014)；Weber J，etal.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 112(45)：13982-13987.(2015))。通过将CRISPR文库转导的癌细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内，已鉴定了多种与人类肺癌生长和转移有关的基因(Chen SD，et al.Cell160(6)：1246-1260.(2015))。然而，由于目前慢病毒递送方法的局限性，目前还没有成功地实现全基因组CRISPR的直接体内筛选(Chen SD，et al.Cell 160(6)：1246-1260.(2015)；Sanchez-Rivera FJ，et al.Nature 516(7531)：428-+.(2014))。此外，所有以前的筛选策略都有多个缺点。这些筛选通常从免疫缺陷的遗传背景或携带多个预先设计的突变的遗传背景开始，因此结果可能不适用于野生型小鼠(Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics46(1)：24-32.(2014)；Zender L，et al.Cell 135(5)：852-864.(2008))。他们通常需要1年以上才能获得肿瘤(Weber J，et al.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 112(45)：13982-13987.(2015)；Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics 46(1)：24-32.(2014)；Keng VW，et al.Naturebiotechnology 27(3)：264-274.(2009))。
总之，实现直接的体内全基因组CRISPR文库筛选和/或更好的体外筛选的关键是一种高效的递送系统。然而，所有先前测试过的系统都无法实现直接的体内全基因组CRISPR文库筛选。因此，我们迫切需要一种替代的传送系统，它可以克服这些缺点，并可用于体内直接的CRISPR文库筛选，以及更有效的体外筛选。
发明内容
本发明涉及载体构建技术，用于诱变全基因组筛选，尤其涉及piggyBac(PB)转座子作为递送向导RNA文库并且设计用于体内筛选的替代载体。本发明提供一种体内基因组规模筛选肿瘤发生的方法。
一方面，本发明提供一种全基因组文库，其包括：
多个PB介导的CRISPR系统多核苷酸，包括最小向导RNA，其侧翼为最小的piggyBac反向重复元件，并且所述向导序列能够靶向真核细胞群、组织群或有机体群中的多个基因组基因座中多个目的靶序列。
上述文库，其中真核细胞群是哺乳动物细胞群，例如小鼠细胞或人类细胞。
上述文库，其中真核细胞群是任何种类的细胞群，例如成纤维细胞。
上述文库，其中组织群是任何种类的非生殖组织，例如肝或肺的群。
上述文库，其中有机体群是小鼠群。
上述文库，其中基因组基因座中的靶序列是编码序列。
上述文库，其中所述靶序列的基因功能被所述靶向改变。
上述文库，其中所述靶向导致基因功能的敲除。
上述文库，其中靶向是靶向整个基因组。
在某些实施例中，其中基因功能的敲除是在多个独特的基因中实现的，所述基因在肿瘤发生、抗衰老和寿命中起着介导作用。
在具体实施例中，其中所述独特基因是抑癌基因。
本发明还提供了一种体内基因组规模的筛选方法，包括：
(a)导入含有和表达具有靶序列的RNA多核苷酸的哺乳动物中，
(b)编码含有至少一种PB-介导的一种或多种载体的CRISPR系统基因产物，载体包含：
(i)编码Cas9蛋白或其变体或其融合蛋白的第一多核苷酸，
(ii)编码PB转座酶或其变体或其融合蛋白的第二多核苷酸，
(iii)如权利要求1-11任一项所述的第三多核苷酸文库，
其中(i)，(ii)，和(iii)组分位于系统中的相同的或不同的载体，
PB转座酶由此将向导RNA引入基因组，向导RNA靶向靶序列，Cas9蛋白通过细胞修复机制修复产生至少一个位点特异性断裂，
(c)对所述哺乳动物的基因组DNA进行扩增和测序。
上述方法，其中所述基因产物的基因功能被所述系统改变。
上述方法，其中所述系统导致基因功能的敲除。
上述方法，其中基因功能的敲除是在多个独特的基因中实现的，所述基因在肿瘤发生、抗衰老和寿命中起着介导作用。
上述方法，其中步骤(a)中的所述哺乳动物表达至少一个癌基因或敲除至少一个抑癌基因以产生用于筛选而不形成肿瘤的致敏背景。
上述方法，其中所述癌基因是具有显性G12V突变的NRAS。
上述方法，其中所述抑癌基因选自由Cdkn2b、Trp53、Klf6、miR-99b、Clec5a、Sel1l2、Lgals7、Pml、Ptgdr、Tspan32、Fat4、Pik3ca、Pdlim4、Cxcl12、Lrig1、Batf2、Prodh2、Chst10、Diras1、Ephb4、Timp3、Hrasls、Banp、和Cyb561d2的组。
在某些实施例中，其中所述哺乳动物是小鼠。
在具体实施例中，其中PB介导的CRISPR系统通过流体动力学尾静脉注射引入小鼠。
在具体实施例中，其中PB介导的CRISPR系统通过体内转染如纳米颗粒和电穿孔引入。
重要性
由于全基因组的CRISPR/Cas9文库主要是在慢病毒载体中构建的，因此由于递送效率低，无法进行直接的体内筛选。在此，我们检验了piggyBac(PB)转座子作为提供用于体内筛选的向导RNA(gRNA)文库的替代载体。通过流体动力学尾静脉注射，我们将PB-CRISPR文库递送到小鼠。在不到2个月的时间内便观察到了肿瘤的快速形成。通过对PB介导的gRNA插入的测序分析，我们鉴定了相应的介导肿瘤发生的基因。我们的结果表明，PB是一种用于表型驱动筛选的可以有效进行体内CRISPR文库递送的简单且无病毒的选择。
附图说明
图1.PB-CRISPR载体及小鼠iPS细胞内Tet1和Tet2的靶向验证。(A)基于PB的CRIPSR载体。pCRISPR-sg4，具有neo基因的sgRNA表达载体；pCRISPR-sg5，具有嘌呤霉素基因的sgRNA表达载体。(B)pCRISPR-S10，表达Dox诱导的Cas9的PB质粒；pCRISPR-sg6-Tet1/Tet2，基于pCRISPR-sg6的Tet1或Tet2 sgRNA表达质粒。(C)PCR-RFLP分析pCRISPR-sg6-Tet1/Tet2靶向的Tet1/Tet2基因座。预期的突变将分别消除Tet1和Tet2的SacI或EcoRV位点。用PCR扩增Tet1或Tet2的靶区域(～500bp)。用相应酶消化PCR产物。结果显示在Tet1-克隆1，Tet1-克隆2和Tet2-克隆2中有成功靶向。(D)Tet1/Tet2 sgRNA靶向基因座的测序结果。Tet1-克隆1的测序结果显示在一个等位基因中有4bp的缺失及在另一个中有1bp的缺失，导致SacI位点的消除。Tet1-克隆2的测序结果显示两个等位基因都出现突变，一个存在3bp缺失并在另一个中有1bp的插入，导致SacI位点的消除。Tet1-克隆1的测序结果在一个等位基因中有8bp的缺失以及在另一个中有14bp的缺失，导致EcoRV位点的消除。
图2.PB-CRISPR文库的构建和体内递送。(A)PB-CRISPR文库构建工作流程。PB，piggyBac转座子；PB 3′TR/5′TR，PB 3′和5′末端重复序列；U6，人U6启动子；ccdB，细菌毒素基因；p(T)，poly T终止序列；sgRNA骨架，嵌合sgRNA骨架序列；20nt向导，嵌合sgRNA向导序列。(B)PB-CRISPR-M2文库与GeCKOv2小鼠文库在总gRNA分布上有很好的相关性(r2＝0.83)，GeCKOv2中95％的sgRNAs可在PB-CRISPR-M2中发现。(C)尾静脉注射法在体内递送PB-CRISPR-M2文库。pPB-IRES-EGFP，表达IRES-EGFP的PB质粒。pCAG-PBase表达CAG启动子驱动的PBase。小鼠注射了PB-CRISPR-M2文库、pPB-IRES-EGFP和CAG-PBase。对照组无pCAG-PBase注射。在注射后14天，对肝脏样本进行GFP表达评估，并用于NGS。比例尺，2mm。
图3.用PB载体转染小鼠睾丸。(A)用PB载体通过电穿孔在体内转染睾丸。对照睾丸只注射台盼蓝。实验睾丸注射pPB-IRES-EGFP和pCAG-PBase。(B)电穿孔24小时后，检测睾丸的GFP表达。虚线表示未被PB载体转染的睾丸。比例尺，1mm。
图4.定量RT-PCR检测在小鼠肝脏内注射了PB载体的转基因表达。(A)用于筛选实验的PB载体示意图。小鼠(n＝3)注射了pPB-hNRASG12V、pCRISPR-W9-Cdkn2a-sgRNA和pCAG-PBase。对照小鼠(n＝3)只注射了盐水。(B)小鼠肝脏样本的Cas9表达。(C)小鼠肝脏样本的hNRASG12V表达。
图5.用PB-CRISPR文库筛选成功诱导小鼠肝脏肿瘤。(A)进行PB-CRISPR的促进肝脏肿瘤发生基因筛选的方法。采用流体动力学尾静脉注射法进行PB-CRISPR系统的肝脏递送。(B)从筛选中获得的代表性肝脏肿瘤。比例尺，2mm。(C)中度分化肝内胆管细胞癌(ICC)的组织学和免疫组化分析。H&E切片显示，与正常肝脏组织相比，肿瘤细胞具有管状生长模式。肿瘤细胞表达CK19和Ki67。比例尺：低倍放大100μm，高倍放大50μm。
图6.典型肿瘤的组织学和IHC分析。(A)中度分化肝内胆管细胞癌(ICC)。肿瘤细胞表达细胞角蛋白标记物AE1/AE3。周围的基质可通过SMA、波形蛋白和胶原蛋白-4(Coll4)染色进行识别。(B)典型的未分化多形性肉瘤(UPS)。肿瘤细胞对AFP和CK19呈阴性，但具有较高的增殖能力，如Ki67染色所示。比例尺：低倍放大100μm，高倍放大50μm。
图7. 18例肿瘤的sgRNA含量总结。对每一个肿瘤进行PCR，检测NGS。平均每个肿瘤中有15个文库sgRNAs。在18个肿瘤中共分离出的271个sgRNAs中，相应的肿瘤显示有26个sgRNA靶向已知的TSGs(双侧Fisher精确检验，P＜0.01)。Cdkn2b和Trp53的靶向分别为4次和2次。
图8.Trp53和Cdkn2b的sgRNAs验证。(A)小鼠肝脏肿瘤发生的Trp53和Cdkn2bsgRNAs验证。每组均显示典型肿瘤。组织学和免疫组化分析显示为肝内胆管细胞癌。在注射后第21天检测小鼠时，有Cdkn2a-sgRNA的Trp53组，11只小鼠中有10只出现肝脏肿瘤(P＜0.01，卡方检验)。在没有Cdkn2a-sgRNA的Trp53组中，11只小鼠中有8只在28天时出现肝肿瘤(P＜0.01，χ2检验)。在Cdkn2b组中，11只小鼠中有4只在注射后45天出现肝脏肿瘤(P＜0.01，χ2检验)。比例尺：肿瘤2mm，H&E 100μm，CK19 50μm。(B)肿瘤中Trp53(插入缺失造成的移码)、Cdkn2b(插入缺失造成的移码和无义突变T)靶区的代表性Sanger测序结果。
具体实施方式
下文将参照具体实施例进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于描述本发明，而不限制本发明的范围。下述实施例中没有具体条件的实验方法一般是在常规条件下进行，没有具体说明的材料购自通用化学试剂公司。
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的生物系统或细胞类型。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施例，并非意在加以限制。如本说明书和所附权利要求书中所用，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数形式。因此，例如，“一个细胞”包括两个或更多个细胞或整个细胞培养物的组合；“一个多核苷酸”实际包括该多核苷酸的多个拷贝。除非在本说明书的提示下在本文和下文中定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
如本文所用，术语“多核苷酸”，“核酸”，“寡核苷酸”，“寡聚物(oligomer)”，“寡(oligo)”或等同术语是指包含核苷酸碱基单体的聚合排列的分子，其中单体序列定义多核苷酸。多核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸的聚合物以产生脱氧核糖核酸(DNA)，以及核糖核苷酸的聚合物以产生核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以是单链或双链。单链时，多核苷酸可以对应于基因的有义链或反义链。单链多核苷酸可以与靶多核苷酸的互补部分杂交以形成双链体，其可以是同源双链体或异源双链体。
多核苷酸的长度在任何方面都不受限制。核苷酸之间的连接可以是核苷酸间磷酸二酯键，或任何其他类型的键。多核苷酸可以通过生物学方法(例如，酶促法)在体内(在细胞中)或在体外(在无细胞系统中)产生。可以使用无酶系统化学合成多核苷酸。多核苷酸可以是酶促延伸的或酶促不可延伸的。
根据惯例，由3′-5′磷酸二酯键(包括天然产生的多核苷酸)形成的多核苷酸据说具有5′-末端和3′-末端，因为整合进聚合物中的核苷酸单体的连接方式是一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸通过磷酸二酯键与其相邻的3′氧(羟基)在一个方向上连接。因此，多核苷酸分子的5′-末端通常在核苷酸的戊糖环的5′位置具有游离磷酸基团，而多核苷酸分子的3′末端在戊糖环的3′位置具有游离羟基。在多核苷酸分子内，相对于另一个位置5′取向的位置称为“上游”，而另一个位置3′的位置称为“下游”。该命名方式反映了聚合酶沿着模板链以5′至3′方式行进和延伸多核苷酸链的事实。除非另有说明，每当多核苷酸序列出现时，应理解核苷酸从左至右是5′至3′定向。
如本文所用，术语“多核苷酸”并非仅限于天然存在的多核苷酸结构、天然存在的核苷酸序列、天然存在的骨架或天然存在的核苷酸间键。熟悉本领域的人熟知与本发明一起使用的多种多核苷酸类似物、非天然核苷酸、非天然磷酸二酯键连接和核苷酸间类似物。
如本文所用，术语“基因”一般是指一个多核苷酸元件的组合，当以天然或重组方式进行操作连接时，提供某种产品或功能。术语“基因”是广义的解释，可以包括基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因组DNA形式。在某些用途中，术语“基因”包括转录序列，包括5′和3′端非翻译区域(5′-UTR和3′-UTR)、外显子和内含子。在某些基因中，转录区域将包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的某些用途中，“基因”仅包括编码多肽所需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在某些方面，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转运RNA(tRNA)基因。在某些方面，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区域，包括上游和下游调节区域、增强子和启动子。术语“基因”包括基因的mRNA、cDNA和基因组形式。
在某些方面，基因的基因组形式或基因组克隆包括转录的mRNA序列，以及位于转录物之外的其他非转录序列。位于mRNA转录单元外的调控区称为5′或3′侧翼序列。一种基因的功能性基因组形式，通常含有调节转录所必需的调节元件，有时是充足的调节元件。术语“启动子”通常用于描述一段足以提供精确的转录起始的DNA区域，通常但不限于转录起始位点的5′端。在某些方面，“启动子”还包括其他顺式作用调节元件，对于强或高水平的转录或提供诱导性转录必要的调节元件。在某些实施例中，启动子具有组成性活性，而在替代实施例中，启动子具有条件性活性(例如，仅在某些生理条件下启动转录)。
通常，术语“调控元件”是指控制核酸序列表达某些方面的任何顺式作用基因元件。在某些用途中，术语“启动子”基本上包含启动转录所需的最小序列。在某些用途中，术语“启动子”包括开始转录的序列，此外，还包括能够上调或下调转录的序列，通常分别称为“增强子元件”和“沉默子元件”。
特定的DNA调控元件，包括启动子和增强子，通常只在一类生物体内起作用。例如，来自细菌基因组的调控元件通常在真核生物中不起作用。然而，来自更密切相关生物体的调控元件经常表现出交叉功能。例如，来自特定哺乳类生物(如人类)的DNA调节元件，最常在其他哺乳类物种(如小鼠)中发挥作用。此外，在设计能跨多种物种发挥作用的重组基因时，已知能跨物种发挥作用的多种调控元件(例如，在所有哺乳动物细胞中，包括小鼠宿主细胞和人类宿主细胞)具有保守序列。
如本文所用，术语“基因组”是指生物体(包括病毒)具有的全部遗传信息或可遗传物质，如生物体或病毒的全部遗传互补物。基因组通常指生物体染色体中的所有遗传物质，此外，稳定地传递给子细胞的染色体外遗传信息(如线粒体基因组)。基因组可以由RNA或DNA组成。基因组可以是线性的(哺乳动物)或环状的(细菌)。基因组物质通常存在于染色体等离散单元上。
如本文所用，术语“载体(vector)”、“载体(vehicle)”、“构建体”和“质粒”用于任何重组多核苷酸分子，其可被传播并用于将核酸片段从一个生物体转移到另一个生物体。载体通常包括介导载体增殖和操作的部分(例如，一个或多个复制起点、具有药物或抗生素抗性的基因、多个克隆位点、允许基因表达的可操作连接的启动子/增强子元件等)。载体通常是重组核酸分子，通常来源于噬菌体或动植物病毒。质粒和黏粒就是指这两种重组载体。“克隆载体”或“穿梭载体”或“亚克隆载体”包含促进亚克隆步骤的可操作连接部分(例如，包含多个限制性内切酶靶序列的多克隆位点)。核酸载体可以是线性分子，也可以是环状，这取决于载体类型或应用类型。某些环状核酸载体可以在被递送到细胞前被有意地线性化。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含可操作连接的多核苷酸元件的重组载体，所述多核苷酸元件可促进和优化所需基因(例如，编码蛋白质的基因)在特定宿主生物体中的表达(例如，细菌表达载体或哺乳动物表达载体)。例如，促进基因表达的多核苷酸序列可包括启动子、增强子、转录终止序列和核糖体结合位点。
如本文所用，“宿主细胞”是指任何包含异源核酸的细胞。异源核酸可以是载体，例如穿梭载体或表达载体。在某些方面，宿主细胞能够驱动编码在载体上的基因的表达。在某些方面，宿主细胞支持载体的复制和增殖。宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌或哺乳动物细胞(如人类细胞或小鼠细胞)。当一种合适的宿主细胞(例如一种合适的小鼠细胞)被用于建立一个稳定的整合细胞系时，该细胞系可被用于建立一个完整的转基因生物。
将载体/构建体或其他核酸(例如体外转录的RNA)递送到宿主细胞(例如细菌细胞和哺乳动物细胞)的方法(即手段)是本领域的普通技术人员所熟知的，在本文中未提供详细信息。将核酸递送到宿主细胞的任何方法可与本发明一起使用。
例如，将载体或其他核酸分子递送到细菌细胞如大肠杆菌的方法(称为转化)是常规的，包括电穿孔方法和大肠杆菌细胞的转化，这些方法通过二价阳离子(如CaCl2)的预处理而变成感受态。
将载体或其他核酸(例如RNA)递送到培养中的哺乳动物细胞的方法(称为转染)是常规的，许多转染方法可与本发明一起使用。这些方法包括但不限于磷酸钙沉淀、电穿孔、基于脂质的方法(脂质体或阳离子脂质体)，例如(LifeTechnologiesTM)和TransfectinTM(Bio-Rad实验室)、阳离子聚合物转染，例如使用DEAE-右旋糖酐、直接核酸注射、基因枪颗粒注射，以及使用工程病毒载体的病毒转导(称为转导，使用例如工程单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、疫苗病毒、Sindbis病毒)和声孔效应。这些方法中的任何一种都可用于本发明。
本发明进一步提供包含本文所述任何重组表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”指任何类型的含有本发明的重组表达载体的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，也可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可为培养细胞或原代细胞，即直接从生物体例如人体中分离的细胞。宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。本领域已知的合适的宿主细胞，包括例如DH5a大肠杆菌细胞，中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体，宿主细胞优选原核细胞，例如DH5α细胞。为了产生重组修饰的TCR、多肽或蛋白质，宿主细胞优选哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞是人类细胞。宿主细胞可以是任何类型的细胞，可以来自任何类型的组织，也可以是任何发育阶段。
本发明还提供了包含本文所述的至少一种宿主细胞的细胞群。所述细胞群可以是包含所述任何重组表达载体的宿主细胞的异源群，除了至少一种其他细胞外，例如不包含任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或除T细胞外的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以是基本相同的群体，其中群体主要(例如，基本上由其组成)由包含重组表达载体的宿主细胞组成。群体也可以是的细胞克隆群，其中群体的所有细胞都是包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，这样群体的所有细胞都包含重组表达载体。在本发明的一个实施例中，细胞群是包含包含如本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群。
如本文所用，涉及核酸或多肽的术语“重组”表示物质(例如重组核酸、基因、多核苷酸、多肽等)已被人类干预改变。一般来说，重组分子部分的排列不是天然的结构，或者重组多核苷酸或多肽的主要序列在某种程度上被操作。如果一个天然生成的核苷酸序列从其起源处(如染色体)的天然位置被移除，或从重组DNA构建体被转录，则该序列为重组多核苷酸。如果基因开放阅读框已从其天然环境中被移除并克隆到任何类型的核酸载体中(即使该ORF与天然生成的基因具有相同的核苷酸序列)，则该核苷酸序列是重组分子。本领域技术人员熟知生成重组分子，尤其是重组核酸的方案和试剂。在某些实施例中，术语“重组细胞系”是指包含重组核酸，也就是说，不属于宿主细胞的核酸的任何细胞系。
如本文所用，术语“标记”通常是指当存在于细胞中(例如，被表达)时，产生可视化或识别包含该标记的细胞的属性或表型的生物学特征或特性。常用的标记类型有多种，可以是例如视觉标记，像显色，例如lacZ互补(β-半乳糖苷酶)或荧光，例如绿色荧光蛋白(GFP)或GFP融合蛋白的表达，RFP、BFP、选择性标记、表型标记(生长速度、细胞形态、菌落颜色或菌落形态、温度敏感)、营养缺陷标记物(生长需求)、抗生素敏感性和抗性、分子标记物，如通过抗原敏感性(如血型抗原和组织相容性标记物)可区分的生物分子、细胞表面标记物(如H2KK)、酶标记物和核酸标记，例如限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNP)和各种其他可扩增的遗传多态性。
如本文所用，“选择性标记”或“筛选标记”或“阳性选择标记”的表述是指当存在于细胞中时，产生属性或表型的标记，该属性或表型允许从不表达可选标记特征的其他细胞中选择或分离这些细胞。许多基因被用作选择性标记，例如广知的编码抗药性或营养缺陷修复的基因。例如，卡那霉素(新霉素)抗性可作为一种特性来选择携带编码细菌卡那霉素抗性基因(例如，新霉素磷酸酶II)的质粒的细菌。当培养物用新霉素或类似抗生素处理时，未转染的细胞最终会死亡。
类似的机制也可用于选择含有编码新霉素抗性基因(两个氨基糖苷磷酸转移酶基因中的任何一个；neo选择性标记)载体的转染的哺乳动物细胞。该筛选过程可用于建立稳定的哺乳动物细胞系。
如本文所用，术语“报告子”通常是指可用于可视化、定量或识别目标系统的所需组分的部分、化合物或其他组分。报告子通常是编码报告蛋白的基因，但并非唯一。例如，“报告基因”是当在细胞中表达时，允许对该细胞进行可视化或鉴定，或允许定量重组基因表达的基因。例如，报告基因可以编码蛋白质，例如，其活性可以定量的酶，例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)或萤火虫荧光素酶蛋白质。报告者还包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或GFP的任何重组变体，包括增强型GFP(EGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP和衍生物)、青色荧光蛋白(CFP和其他衍生物)、黄色荧光蛋白(YFP和其他衍生物)和红色荧光蛋白(RFP和其他衍生物)。
如本文所用，术语“细菌”或“细菌的”指原核生物真细菌，基于许多定义明确的形态学和生物化学标准可与古细菌区分。
如本文所用，术语“真核生物”是指属于真核界的生物(通常是多细胞生物)，通常通过存在膜结合核和其他膜结合细胞器、线性遗传物质(即线性染色体)、缺少操纵子、存在内含子、信息盖帽和多聚腺苷酸mRNA、一种独特的核糖体结构和其他生物化学特征区别于原核生物。
如本文所用，术语“哺乳动物”或“哺乳动物的”是指一组真核生物，它们是吸热性羊膜动物，通过拥有毛发、三个中耳骨、雌性中有乳腺、大脑新皮层和大多数分娩产下幼体而区别于爬行动物和鸟类。最大的一类哺乳动物，有胎盘亚纲(真兽亚纲)，有一个在怀孕期间供养后代的胎盘。有胎盘亚纲包括啮齿目(包括小鼠和大鼠)和灵长类(包括人类)。
如本文所用，术语“编码”广泛地指聚合物大分子中的信息用于指导异于第一分子的第二分子的产生的任何过程。第二分子可能具有异于第一分子的化学性质的化学结构。
例如，在某些方面，术语“编码”描述了DNA半保守复制过程，其中双链DNA分子中的一条链被用作模板，通过DNA依赖的DNA聚合酶对新合成的互补姐妹链进行编码。在其他方面，DNA分子可以编码RNA分子(例如，通过使用DNA依赖性RNA聚合酶的转录过程)。同样，RNA分子可以编码多肽，就像在翻译过程中一样。当用于描述翻译过程时，术语“编码”也可延伸到编码氨基酸的三联体密码子。在某些方面，RNA分子可以编码DNA分子，例如通过包括RNA依赖性DNA聚合酶的逆转录过程。在另一方面，DNA分子可以编码多肽，在这种情况下，“编码”应理解为包括转录和翻译过程。例如，术语“编码”是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。如果能被转录和/或翻译产生多肽，核酸序列或构建体被称为“编码”多肽。
如本文所用，术语“转录元件”是指可转录的DNA区域，该区域可与载体中的启动子进行操作性连接，或在整合进基因组后与启动子进行功能性接近。在某些情况下，当启动子和要转录的DNA区域一起在转录单元时，该单元可称为“盒”，例如卡那霉素/新霉素抗性盒。转录单元可以包含被转录以产生mRNAs或调节性RNAs的，有或没有启动子序列的DNA区域。
如本文所用，术语“靶向”或“靶序列”不受靶DNA源的限制，靶DNA源可以是预期重组的任何DNA源。例如，靶DNA可以位于染色体(即基因组DNA)中，也可以位于载体中，例如文库中。
通常，“CRISPR系统”是指参与CRISPR相关(“Cas”)基因表达或指导其活性的转录物和其他元素，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或tracrRNA活性部分)、tracr匹配序列(包括“直接重复”和在内源性CRISPR系统中tracrRNA处理的部分直接重复)、向导序列(在内源性CRISPR系统中也称为“间隔子”)或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。在某些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元素衍生自包含内源性CRISPR系统的特定生物(例如化脓性链球菌)。通常，CRISPR系统可表征为促进靶序列位点处CRISPR复合物形成的元件(在内源性CRISPR系统中也称为原间隔区)。在CRISPR复合物的形成过程中，“靶序列”是指设计成具有互补性向导序列的序列，其中目标序列和向导序列之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。如果有足够的互补性来引起杂交和促进crispr复合体的形成，则不一定需要完全互补。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在某些实施例中，靶序列可以在真核细胞的细胞器内，例如线粒体或叶绿体。可用于重组成包含靶序列的靶基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在本发明方面，外源模板多核苷酸可称为编辑模板。在本发明的一个方面，重组是同源重组。
如本文所用，术语“PiggyBac”或“PB”是指PiggyBac转座子和/或PiggyBac转座酶，其可提供与野生型PiggyBac转座酶和/或转座酶类似或增加的转座频率。
如本文所用，术语“PiggyBac转座酶”或“PB转座酶”是指从粉纹夜蛾(卷心菜钩子蛾)分离出的转座酶，或编码所述转座酶的核酸序列。
如本文所用，术语“可操作连接”是指核酸序列的连接，使得一个序列可以为连接的序列提供所需的功能。在启动子的上下文中，“可操作连接”是指启动子与目标的序列连接，使得目标序列的转录受该启动子的控制和调节。当目的序列编码蛋白质并且当需要表达该蛋白质时，“可操作连接”意指启动子以这样的方式与序列连接，使得所得的转录物将被有效翻译。可操作连接的核酸序列包括但不限于提供基因表达功能的序列(即，基因表达元件，例如启动子、5′非翻译区、内含子、蛋白质编码区、3′非翻译区、多聚腺苷酸化位点和/或转录终止子)，提供DNA转移和/或整合和/或切除功能的序列(即转座子序列、转座酶编码序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)，提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记、生物合成基因)，提供可评分标记功能的序列(即，报告基因)，促进序列体外或体内操作的序列(即，多连接体序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即，细菌复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
如本文所用，术语“基因产物”指由编码RNA分子或多肽的DNA序列的表达而产生的RNA分子或多肽。
如本文所用，术语“重组表达载体”指一种经基因修饰的重组寡核苷酸或多核苷酸，当重组载体与宿主细胞接触时，在足以在细胞内表达mRNA、蛋白质、多肽或肽的条件下，其包含编码mRNA、蛋白质、多肽和肽的核苷酸序列，。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，这些核苷酸可以是单链或双链、合成或部分从天然来源获得，并且可以包含天然、非天然或改变的核苷酸。核苷酸之间的键可以是天然存在的，也可以是非天然存在的或修饰的。
本发明进一步提供任何包含发明性多核苷酸的重组表达载体。本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于传播和扩展的载体或用于表达的载体或两者具有，例如质粒和病毒。载体可选自由pUC系列、pcDNA系列、pBluescript系列、pET系列、pGEX系列和pEX系列组成的组。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT111、λZapII、λEMBL4等。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19。动物表达载体的实例包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo。优选地，重组表达载体为pcDNA系列。
本发明的重组表达载体可以使用标准重组DNA技术制备。环状的或线性的表达载体的构建体可以制备出包含在原核生物或真核生物宿主细胞中起作用的复制系统。理想的是，重组表达载体包含调节序列，例如转录和翻译的起始和终止密码子，其对于将引入载体的宿主类型(如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，并考虑载体是DNA基还是RNA基。
重组表达载体可以包括一个或多个标记基因，用于选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀菌剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原生质体等。用于本发明表达载体的合适标记基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组胺醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄西林抗性基因。
重组表达载体可包含天然或标准启动子。启动子的选择，例如强、弱、诱导性、组织特异性和发育特异性，是在技术人员的普通技能范围内。同样，核苷酸序列与启动子的结合也在技术人员的技能范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在小鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。本发明的重组表达载体可设计为瞬时表达、稳定表达或二者兼用。此外，重组表达载体可用于组成性表达或诱导性表达。
此外，重组表达载体可包括自杀基因。术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是一种当该基因在细胞内表达时细胞对试剂(如药物)具有敏感性的基因，并可导致细胞的死亡。自杀基因是在本领域内已知的(参见，例如，自杀基因疗法：方法和综述，Springer，Caroline J.(英国癌症研究所癌症治疗中心，英国萨里萨顿)，胡马纳出版社，2004)，并包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝酸还原酶。
目前，真核细胞可以是任何类型的细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等，组织或生物体可以是任何类型的非生殖组织，如肝脏、肺、心脏、脑、眼、胃、胰腺、脾脏、膀胱等。
实施例
实施例1：质粒的构建
为了利用PB来递送和表达一个全基因组的单个向导RNA(sgRNA)文库以用于高通量筛选，我们构建了三个PB载体pCRISPR-sg4，pCRISPR-sg5和pCRISPR-sg6，这些载体均在人U6启动子的控制下表达sgRNA。来自于pZGs(Wu，S.，Ying，G.，Wu，Q.&Capecchi，M.R.Nat.Genet.39，922-930(2007))的PB骨架上的pCRISPR-sg4，pCRISPR-sg5和pCRISPR-sg6是通过对来自PX330的U6-sgRNA表达框的PCR组装构建的(Cong，L.et al.Science 339，819-823(2013))，SV40-neo from来自于pIRES2-EGFP(Clontech)，puro来自于pMSCVpuro(BD biosciences)，ccdB来自于pStart-K(Wu，S.，Ying，G.，Wu，Q.&Capecchi，M.R.Nat.Protoc.3，1056-1076(2008))。pCRISPR-sg4和pCRISPR-sg5分别携带嘌呤霉素和新霉素抗性基因(图1a)，方便用于培养细胞。PB载体通常可有小于10kb的多拷贝整合插入，和大于10kb的单拷贝整合插入(Woltjen，K.et al.Nature 458，766-770(2009)；Li，M.A.etal.Nucleic Acids Res 39，9(2011))。为了提高PB的体内使用效率，pCRISPR-sg6被设计为包含最小的sgRNA表达元件，没有任何筛选标记和相关的启动子，因此更可能导致多拷贝插入。将有毒基因ccdB包含在这些载体中，可以确保在文库构建过程中基本上没有背景菌落生长(图2a)。
pPB-hNRASG12V的构建是通过来自cDNA扩增的NRASG12V和来自pIRES2-EGFP的IRES-EGFP的PCR组装到来自于pZGs的PB骨架上(Wu，S.，Ying，G.，Wu，Q.&Capecchi，M.R.Nat.Genet.39，922-930(2007))。
为了构建pCRISPR-W9骨架，从来自pZGs(Wu，S.，Ying，G.，Wu，Q.&Capecchi，M.R.Nat.Genet.39，922-930(2007))的PB扩增末端重复序列，并将其插入到pX330中(Cong，L.et al.Science 339，819-823(2013))，用2A序列将GFP添加到Cas9基因中。
用引物xcl732/xcl733从寡核苷酸模板中扩增靶向单个基因的sgRNA(表1)。利用Gibson组装法(NEB)将纯化的PCR产物克隆到pCRISPR-sg6的BbsI位点，得到pCRISPR-sg6-Trp53和pCRISPR-sg6-Cdkn2b质粒。所有的质粒都通过测序确保正确。用Qiagen去内毒素大提质粒试剂盒制提取注射用质粒DNA。
表1.本研究中使用的引物
实施例2：PB-CRISPR载体在小鼠诱导多能干细胞中的检测
所使用的小鼠诱导多能干细胞系(iPS-ZX11-18-2)在前面描述过(Wu，S.，Wu，Y.，Zhang，X.&Capecchi，M.R.Proc.Natl.Acad.Sci.111，10678-10683(2014))。诱导型多能干细胞在DMEM(Gibco)、15％FBS(Gibco)、1×青霉素和链霉素(Gibco)和U/mL LIF(Millipore)组成的胚胎干细胞培养基中培养。用1.5μg表达Cas9核酸酶的pCRISPR-S10、1.5μg pCRISPR-sg6-Tet1/Tet2和1μg pCAG-PBase对1百万个细胞电穿孔。电穿孔之后，铺1000个细胞置于10cm培养皿中。10天后挑取单个克隆进行继续培养和分析。在PCR-RFLP试验中，使用前面发表的引物(Wang，H.Y.et al.Cell 153，910-918(2013))从多能诱导干细胞基因组DNA中扩增出约500bp的gRNA靶位点附近的DNA片段，进行限制性内切酶消化(表1)，并在2％琼脂糖凝胶上分离。结果证实在培养细胞中靶向小鼠Tet1和Tet2的PB载体介导的CRISPR突变产生(图1b-d)。
实施例3：文库构建
为了构建PB-CRISPR-M1文库，我们根据全基因组gRNA列表(Shalem，O.etal.Science 343，84-87(2014))合成了寡核苷酸，用引物对xcl732/xcl733扩增了sgRNA，并用Gibson组装法(NEB)克隆到pCRISPR-sg6的BbsI位点上。我们扩增了GeCKOv2小鼠全基因组CRISPR/Cas9敲除文库(Sanjana，N.E.，Shalem，O.&Zhang，F.Nat.Methods 11，783-784(2014))的sgRNA表达框，该文库有130，209个靶向所有小鼠蛋白编码基因和miRNA的合成sgRNA寡核苷酸，并克隆到pCRISPR-sg6上以获得PB-CRISPR-M2文库(图2a)。
为了构建PB-CRISPR-M2文库，我们从GeCKOv2小鼠文库(Sanjana，N.E.，Shalem，O.&Zhang，F.Nat.Methods 11，783-784(2014))中PCR扩增了U6-sgRNA表达框，并克隆到pCRISPR-sg6载体上。
对于PB-CRISPR-M1文库和PB-CRISPR-M2文库，用20μL连接产物对100μL DH10B感受态细胞进行了10次单个的电穿孔。细菌涂在100个15cm培养皿上获得107重组子。大约得到了80倍PB-CRISPR M1文库的全基因组gRNA和大约10倍PB-CRISPR M2文库的全基因组gRNA。收集细菌，用去内毒素大提质粒试剂盒(Qiagen)最大量提取PB-CRISPR文库。
用深度测序证实了这个PB-CRISPR文库的完整性，GeCKOv2中95％的sgRNAs出现在PB-CRISPR-M2文库中(图2b)。
我们也通过克隆130，209个合成的sgRNA寡核苷酸到pCRISPR-sg6上构建了PBsgRNA文库，得到了PB-CRISPR-M1文库。由于克隆的简单性，全基因组的PB-CRISPR文库可以快速构建，一周即可完成从寡核苷酸的合成到可使用的文库。
实施例4：深度测序和生物信息学分析
采用深度测序法对PB-CRISPR-M2和GeCKOv2文库进行分析。测序之后，我们比较了两个库的gRNA的标准化读数，并计算了斯皮尔曼相关效率来检测它们的相似度(r2＝0.83，P＜0.001)。
为了鉴定肿瘤中sgRNA的含量，从肿瘤基因组DNA或文库对照中扩增出约100bp的DNA片段，这些片段跨越PB文库的20nt gRNA区域。测序文库按照Illumina HiSeq2500的标准方案用这些PCR产物构建。对来自不同样本的单个库进行了条形码编码和合并。从原始数据中分离出约100bp的序列，并将其裁剪成包含sgRNA的28nt gRNA序列，这些序列与GeCKOv2库中的索引库相对应。使用完全映射的读取来生成gRNA读数列表。
为了检测sgRNA靶位点的突变，我们扩增了在中心包含gRNA序列的约300bp的DNA，并按照标准方案用Hiseq2500进行了NGS测序。用BWA aligner将深度序列数据比对到小鼠基因组上(mm9)(Li，H.&Durbin，R.Bioinformatics 25，1754-1760(2009))。由BWA Aligner生成的bam文件由samtools进行排序和索引(Li，H.et al.Bioinformatics 25，2078-2079(2009))。突变变异根据VarScan.v2.3.9命名(Koboldt，D.C.et al.Genome Res.22，568-576(2012))。
实施例5：建立动物模型
本研究中的所有小鼠实验均获得中国农业大学动物保护和使用委员会的批准。选取Charles River 4周龄的CD-1小鼠进行流体动力学尾静脉注射PB-CRISPR文库。已表明，通过小鼠尾静脉快速注射大体积的DNA溶液(约占体重的10％)可以在体内实现高效的基因传递和表达，尤其是在肝脏中(Liu F，Song Y，&Liu D.Gene Ther 6(7)，1258-1266(1999))。我们遵循了一个先前描述的注射方案(Sanchez-Rivera，F.J.et al.Nature 516，428-431(2014))。用于筛选和验证的动物数量来源于经验，并使用先前类似类型研究的数据通过强力分析进行确认(Chen，S.D.et al.Cell 160，1246-1260(2015)；Sanchez-Rivera，F.J.et al.Nature 516，428-431(2014))。小鼠随机分配到不同的实验组。所有注射的小鼠均被分析。评估小鼠肿瘤发生的研究人员是盲的，不知道该动物是来自对照组还是实验组。
为了评价向小鼠肝脏输送的效率，我们对PB-CRISPR-M2文库和pPB-IRES-EGFP同带有或没有PB转座酶(PBase)的过表达质粒pCAG-PBase进行了高压尾静脉注射，并在注射后第14天分析了肝脏样本(图2c)。当加入PBase时(共注入)，整个肝脏都能检测到强而均匀的GFP荧光，相反，对照组无PBase(n＝3)，GFP阳性细胞较少(图2)。采用深度测序法测定第14天肝标本中sgRNA的表达，平均每例肝标本中检出sgRNA文库的89.64±2.79％(n＝3)。此外，我们证实了PB可用于其他组织的有效递送，如睾丸(图3)。这些结果表明PB介导的体内CRISPR递送是非常有效的。
为了检测PB介导递送的体内文库大小，三只小鼠每只注射8μg的PB-CRISPR-M1文库、pPB-IRES-EGFP和pCAG-PBase，3只对照小鼠(无pCAG-PBase)每只注射8μg的PB-CRISPR-M2文库和pPB-IRES-EGFP。DNA在10％体重体积的盐水中混合。每次注射都在10秒内完成。注射后第14天，收集肝脏组织(约300mg)用于基因组DNA提取。用表1中的引物进行PCR扩增sgRNA。纯化的PCR产物用于NGS测序。
因为肝脏肿瘤筛选通常需要一年以上的时间才能获得肿瘤(Bard-Chapeau，E.A.et al.Nat.Genet.46，24-32(2014)；Keng，V.W.et al.Nat.Biotechnol.27，264-274(2009))，我们旨在寻找一个更快的方案来证明野生型小鼠进行PB-CRISPR文库筛选的可行性。最近一个CRISPR有效研究表明，用SB转座子递送Cdkn2a sgRNA和过表达RAS癌基因，连同靶向9个其他抑癌基因(TSGs)的sgRNAs可产生肿瘤，注射后仅需20-30周(Weber，J.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.112，13982-13987(2015))。我们进行了尾静脉注射，以检测PB所传递的Cdkn2a-sgRNA/NRASG12V过表达是否可作为敏感的遗传背景。根据说明书用RNeasyFibrous Tissue小提试剂盒(Qiagen)提取总的RNA。用M-MLV逆转录酶(Promega)将RNA(2μg)逆转录成cDNA，使用LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche)进行定量RT-PCR，程序为：预热(95℃，10秒)，扩增(95℃，10秒；60℃，10秒；72℃，10秒)30个循环，溶解曲线(95℃，5秒；65℃，1分钟)，冷却(40℃，10秒)。用于检测Cas9和hNRASG12V表达的引物见表1。基因表达用GAPDH来做标准化。注射后第61天我们检测了21只小鼠，没有发现肿瘤(表2)，而通过实时定量RT-PCR，能检测到这些小鼠肝脏中有Cas9和NRASG12V的表达(图4)。结果表明，Cdkn2a sgRNA/NRASG12V的敏感背景是2个月内快速筛选的理想选择，因为PB-CRISPR文库的额外触发可以加速肿瘤的形成。
接下来，我们用pCRISPR-W9-Cdkn2a-sgRNA，pPB-hNRASG12V，和the PB-CRISPR-M2文库以及pCAG-PBase，在27只小鼠中对肝脏肿瘤发生进行了全基因组筛选(图5a和表2)。pCRISPR-W9-Cdkn2a-sgRNA表达由2A自裂肽连接的Cas9与EGFP，和Cdkn2a sgRNA。pPB-hNRASG12V是一个表达显性突变G12V的NRAS和IRES-EGFP的PB质粒。所有注射的小鼠都在注射后第45天，当本组中第一只小鼠死于肿瘤时进行检测。27只小鼠中有9只发展出了肿瘤，每只有1-9个肿瘤，但是没有在肝脏以外发现肿瘤。肿瘤由于体积大(约5mm-20mm)和强GFP荧光，很容易被发现(图5b)。
表2.小鼠肝脏中肿瘤发生的PB-CRISPR文库筛选
注：除筛选组的27只雄性小鼠外，我们还对20只未被列入表中的雌性小鼠进行了筛选。第61天，20只雌性小鼠未观察到诱导出肿瘤。已知，雄性小鼠比雌性小鼠更容易发生肝肿瘤(Naugler，W.E.et al.Science317，121-124(2007))。
实施例6：PB-CRISPR文库的流体动力学尾静脉注射和肿瘤检测
为了检测PB介导递送的体内文库大小，3只小鼠每只注射8μg的PB-CRISPR-M1文库，pPB-IRES-EGFP和pCAG-PBaseat，3只对照小鼠(无pCAG-PBase)每只注射8μg的PB-CRISPR-M2文库和pPB-IRES-EGFP。DNA在10％体重体积的盐水中混合。每次注射都在10内完成。注射后第14天，收集肝脏组织(约300mg)用于基因组DNA提取。用表1中的引物进行PCR扩增sgRNA。纯化的PCR产物用于NGS测序。采用深度测序法测定PB-CRISPR-M2和GeCKOv2文库。测序之后，我们比较了两个文库的gRNA的标准化读数，并计算了斯皮尔曼相关效率来检测它们的相似度(r2＝0.83，P＜0.001)。
对于体内筛选，每只小鼠注射混于10％体重体积的盐水中的各8μg的pCRISPR-W9-Cdkn2a-sgRNA，pPB-hNRASG12V，PB-CRISPR-M2文库和pCAG-PBase。对照组注射表2所示的质粒。
对于验证实验，每只小鼠注射相应的混于10％体重体积的盐水中的各8μg的PB-sgRNA、pCRISPR-W9-Cdkn2a-sgRNA(or pCRISPR-W9)、pPB-hNRASG12V、和pCAG-PBase。某一组中的第一只小鼠死亡的当天，检测同组所有的小鼠。如果验证组中没有小鼠死亡，所有小鼠在注射后的第45天检测。对照组的小鼠在注射后的第61天检测。
将肿瘤在4％福尔马林PBS中4℃下固定过夜，石蜡包埋，5μm切片，苏木精和伊红染色(H&E)以用于病理学检测。用以下抗体进行免疫染色：抗肌动蛋白抗体、抗平滑肌抗体，小鼠单克隆1A4抗体(Sigma，A5228)；单克隆抗波形蛋白克隆LN-6抗体(Sigma，V2258)；抗IV型胶原抗体(EMD密理博公司，AB8201)；抗甲胎蛋白1抗体(Abcam，ab46799)；纯化的抗Ki-67抗体(BD，550609)；抗AE1/AE3角蛋白抗体(Abcam，ab115963)。看切片的病理学家是盲法的。
苏木精和伊红(H&E)染色和免疫组织化学的组织学分析显示所分析的大多数肿瘤是肝内胆管癌(ICC)(图5c和图6)，与以前的观察一致，在小鼠肝肿瘤模型中诱导的大多数肿瘤是ICCs(Xue，W.et al.Nature514，380-384(2014)；Weber，J.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.112，13982-13987(2015))。另外，两个肿瘤看起来是未分化的多形性肉瘤(UPS)(图6)，这在小鼠肝脏肿瘤模型中还未报导过，但提示了如间质细胞等的非肝细胞的转染也可能导致肝脏肿瘤。快速肿瘤形成的结果表明，PB介导的CRISPR文库递送对于小鼠体内筛选是实用的。
实施例7：肿瘤中sgRNA含量的序列测定与鉴定
为了鉴定肿瘤中sgRNA的含量，从肿瘤基因组DNA或文库对照中PCR扩增出约100bp的DNA片段，这些片段跨越PB文库的20nt gRNA区域。测序文库按照Illumina HiSeq2500的标准方案用这些PCR产物构建。对来自不同样本的单个库进行条形码编码和合并。从原始数据中分离出约100bp的序列，并将其裁剪成包含sgRNA的28nt gRNA序列，这些序列与GeCKOv2库中的索引库相对应。使用完全映射的读取来生成gRNA读数列表。
为了检测sgRNA靶位点的突变，我们在中心扩增了包含gRNA序列的约300bp的DNA，并按照标准方案用Hiseq2500进行了NGS测序。用BWA aligner将深度序列数据定位到小鼠基因组上(mm9)(Li，H.&Durbin，R.Bioinformatics 25，1754-1760(2009))。由BWA Aligner生成的bam文件用samtools进行排序和索引(Li，H.et al.Bioinformatics 25，2078-2079(2009))。突变变异根据VarScan.v2.3.9命名(Koboldt，D.C.et al.Genome Res.22，568-576(2012))。
为了鉴定插入到肿瘤基因组中的sgRNA，我们挑选了18个肿瘤进行深度分析。我们用PCR从每个肿瘤中扩增sgRNA用于下一代测序(NGS)。我们用人类TSG作为比较信息，在小鼠基因组中生成了1149个TSG同源基因的列表(http：//bioinfo.mc.vanderbilt.edu/TSGene)(Zhao M，Sun J，&Zhao Z Nucleic Acids Res 41(Database issue)：D970-976.(2013))。在PB-CRISPR文库中，有6650个sgRNA靶向所有这些小鼠的TSG同源基因。在从18个肿瘤中鉴定出的271个sgRNA中，通过双面菲舍尔精确检验发现，靶向21只小鼠的TSG同源基因的26个sgRNA含量显著富集(P＜0.01)。
共鉴定出271个文库sgRNAs，每个肿瘤中含有15.06±7.64个sgRNAs(表3)。肿瘤内sgRNA计数的差异表明某些肿瘤可能具有多克隆起源。此外，从一只小鼠(如肿瘤5-1到肿瘤5-8)分离的肿瘤中sgRNA含量的差异表明它们是非克隆相关的。在271个sgRNA中，著名的TSG Trp53被靶向两次，而Cdkn2b，一个以前与小鼠肝癌无关的TSG(Krimpenfort P，etal.Nature 448(7156)：943-946(2007))，在4个肿瘤中被3个不同的sgRNA靶向(表4)。总共271个sgRNA中有26个靶向21只小鼠中的TSG同源基因。通过菲舍尔精确检验分析发现，这些靶向TSG的sgRNA显著富集(P＜0.01，图7，表3)(Zhao M，Sun J，&Zhao Z.Nucleic AcidsRes 41(Database issue)：D970-976.(2013))。
表3.肿瘤和CRISPR文库中sgRNA含量的测序读数
PB-CRISPR-M2中127417个基因
表4.被靶向两次或以上的基因
由于我们筛选中的每一个肿瘤都包含多个拷贝sgRNA的插入，我们检测了两个sgRNA是否可能引起的大的缺失和异位并对肿瘤发生起到一定的作用，如先前的报告所表明的那样(Maddalo D，et al.Nature 516(7531)：423-+(2014)；Blasco RB，et al.Cellreports 9(4)：1219-1227(2014))。为了检测这种可能性，我们选择了7个肿瘤：肿瘤1、2、3、4-2、5-4、5-6和5-7，并用所有可能的引物组合进行了PCR反应(表1)。然而，在7个肿瘤中没有发现易位和大的缺失。先前的研究表明，通过多次转座插入造成的插入突变可能有助于肿瘤的发生(Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics 46(1)：24-32(2014)；CarlsonCM，et al..Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 102(47)：17059-17064(2005)；Keng VW，et al.27(3)：264-274(2009)；Dupuy AJ，etal.Nature 436(7048)：221-226(2005))。然而考虑到对照组注射了同等数量的PB载体(表2)，但并没有发展出肿瘤，因此从筛选中获得的肿瘤应主要归因于CRISPR文库介导的突变。综上所述，这些分析表明，所鉴定出的TSG可能是筛选中肿瘤发生率增加的主要原因。
接下来我们测试了著名的Trp53的sgRNA，以验证它是否在我们的PB递送系统中有助于肿瘤形成。在含有Cdkn2a-sgRNA的Trp53组中，在注射后第21天检测所有小鼠，当天该组出现第一只小鼠死于肿瘤(图8a和表5)。引人注意的是，注射的11只小鼠中有10只发展出了肝肿瘤，肿瘤数目从少数几个到多于100个不等。为了更明确地证实Trp53-sgRNA，我们注射了不含Cdkn2a-sgRNA的Trp53-sgRNA。注射后第28天对所有小鼠进行检测，11只小鼠中有8只出现肝脏肿瘤(图8a和表5)。
表5.肿瘤发生中验证过的TSG
我们进一步对Cdkn2b的sgRNA进行了验证实验，之前没有报导其肿瘤抑制作用涉及可到小鼠肝癌。在含有Cdkn2a-sgRNA的Cdkn2b-sgRNA组中，注射后第21天，11只小鼠中有11只发生发展出了肝脏肿瘤(表5)，每只小鼠的肿瘤数目大于100，与筛选实验相比有大大的增加。在Cdkn2b-sgRNA组中，注射后第45天，11只小鼠中有4只发展出了肝脏肿瘤(图8a和表5)，肿瘤数目在1-3之间，表明单独的Cdkn2b可能是肝肿瘤发生中有效的TSG。此外，还证实了Trp53和Cdkn2b肿瘤中靶向区域的突变(图8b)。总之，这些结果证明了PB-CRISPR在体内筛选的快速性和有效性，并证明了已知和新的TSG的sgRNA在筛选中可以很容易地被发现。
实施例8：PB-CRISPR文库与以前方法的比较
此前，全基因组gRNA慢病毒文库用于筛选具有6-硫鸟嘌呤抗性的克隆(Koike-Yusa et al.，2014)。首先用慢病毒文库感染ES细胞，然后用FACS分选和扩增。用6TG(2M)处理10×106个突变的ESCs 5天，并再继续培养5天，从而获得6TG抗性的克隆。
相比之下，我们进行了PB-CRISPR文库筛选。首先用PB-CRISPR文库电穿孔ES细胞。然后将这些细胞直接用于6TG筛选，获得克隆的时间要快于先前方法的2倍。
本发明中，PB-CRISPR方法为直接进行体内CRISPR文库筛选和快速体内验证癌基因提供了一种有效的工具。与以往通过移植培养细胞进行的间接体内筛选相比(Chen SD，et al.(2015)Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth andMetastasis.Cell 160(6)：1246-1260.)，本发明的方法更简单，更容易通过重现体内环境的复杂性来发现相关的TSG。在这项原理验证研究中，本应用集中在一个快速筛选方案上，通过设计，该方案更有可能发现早期发生的肿瘤中的突变事件，但随着培养时间的延长或在其他遗传背景下，筛选中可能发展出具有不同突变特征的肿瘤。随着样本数量的增加，有可能获得一份更完整的与肝癌发生有关的TSG清单。
本发明中，PB-CRISPR方法具有一定的优点，例如可灵活控制PB-CRISPR文库拷贝数、可在体内直接筛选PB-CRISPR文库等。
此外，本发明的肿瘤筛选和验证速度是前所未有的。例如在Cdkn2b sgRNA的验证实验中，许多肿瘤在不到3周的时间内在肝脏内形成。相比之下，以前使用CRISPR和SB转座子或pX330质粒进行的体内肿瘤建模需要更长的时间才能形成肿瘤(Xue W，et al.(2014)CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.Nature 514(7522)：380-384；Weber J，et al.(2015)CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesisfor high-throughput functional cancer genomics in mice.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 112(45)：13982-13987.)。一种可能的解释是，在大多数流体动力学注射的肝细胞中，PB介导非常有效的稳定转移(图2)。将来，结合其他创新的递送方法，如纳米颗粒和电穿孔(Zuckermann M，etal.(2015)Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enablesversatile brain tumour modelling.Nature Communications 6：9；Platt RJ，et al.(2014)CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling.Cell159(2)：440-455.)，PB-CRISPR文库的及其简单性将大大增强已经很强大的CRISPR武器。

Claims (21)

1.一种全基因组文库，包括：
多个PB介导的CRISPR系统多核苷酸，包含最小向导RNA，侧翼为最小的piggyBac反向重复元件，并且所述向导序列能够靶向真核细胞群、组织群或有机体群中的多个基因座中的多个目标靶序列。
2.如权利要求1中所述文库，其中所述真核细胞群是哺乳动物细胞群，例如小鼠细胞或人类细胞。
3.如权利要求1中所述文库，其中所述真核细胞群是任何种类的细胞群，例如成纤维细胞。
4.如权利要求1中所述文库，其中所述组织群是任何种类的非生殖组织群，例如肝脏或肺。
5.如权利要求1中所述文库，其中有机体群所述有机体群是小鼠群。
6.如权利要求1中所述文库，其中基因组基因座中座中的靶序列是编码序列。
7.如权利要求1中所述文库，其中所述靶序列的基因功能被所述靶向改变。
8.如权利要求1中所述文库，其中所述靶向可导致基因功能的敲除。
9.如权利要求1中所述文库，其中所述靶向是靶向整个基因组。
10.如权利要求8中所述文库，其中基因功能的敲除是在多个独特的基因中实现的，所述基因在肿瘤发生、抗衰老和寿命中起着介导作用。
11.如权利要求10中所述文库，其中所述独特基因是抑癌基因。
12.一种体内基因组规模的筛选方法，包括：
(a)导入包含并表达具有靶序列的RNA多核苷酸的哺乳动物中，
(b)编码含有至少一种PB-介导的一种或多种载体的CRISPR系统基因产物，所述载体包含：
(i)编码Cas9蛋白或其变体或其融合蛋白的第一多核苷酸，
(ii)编码PB转座酶或其变体或其融合蛋白的第二多核苷酸，
(iii)如权利要求1-11所述的第三多核苷酸文库，
其中(i)，(ii)，和(iii)组分位于系统中的相同或不同载体，
PB转座酶由此将向导RNA引入基因组，向导RNA靶向靶序列，Cas9蛋白通过细胞修复机制修复产生至少一个位点特异性断裂
(c)对所述哺乳动物的基因组DNA进行扩增和测序。
13.如权利要求12中所述方法，其中所述基因产物的基因功能由所述系统改变。
14.如权利要求12中所述方法，其中所述系统导致基因功能的敲除。
15.如权利要求14中所述方法，其中基因功能的敲除是在多个独特的基因中实现的，这些基因在肿瘤发生、抗衰老和寿命中起着介导作用。
16.如权利要求12中所述方法，其中步骤(a)中的所述哺乳动物表达至少一个癌基因或敲除至少一个抑癌基因，以产生用于筛选而不形成肿瘤的致敏背景。
17.如权利要求16中所述方法，其中所述癌基因是具有显性G12V突变的NRAS。
18.如权利要求16中所述方法，其中所述抑癌基因选自由Cdkn2b，Trp53，Klf6，miR-99b，Clec5a，Sel1l2，Lgals7，Pml，Ptgdr，Tspan32，Fat4，Pik3ca，Pdlim4，Cxcl12，Lrig1，Batf2，Prodh2，Chst10，Diras1，Ephb4，Timp3，Hrasls，Banp和Cyb561d2组成的组。
19.如权利要求12中所述方法，其中所述哺乳动物是小鼠。
20.如权利要求19中所述方法，其中PB介导的CRISPR系统通过流体动力学尾静脉注射引入小鼠。
21.如权利要求19中所述方法，其中PB介导的CRISPR系统通过体内转染如纳米颗粒和电穿孔引入。
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