CN105238793B - 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 - Google Patents
引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105238793B CN105238793B CN201510830014.0A CN201510830014A CN105238793B CN 105238793 B CN105238793 B CN 105238793B CN 201510830014 A CN201510830014 A CN 201510830014A CN 105238793 B CN105238793 B CN 105238793B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sox10
- pig
- gene
- inner ear
- deformity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用,猪SOX10突变基因为SOX10基因的第325位由A突变为T(SOX10 c.325A>T),该突变可引起内耳Mondini畸形并呈显性遗传,可用于人内耳Mondini畸形的发病机理、预防、诊断和治疗研究;也可以制备内耳Mondini畸形的疾病动物模型,该模型可用于人内耳Mondini畸形的发病机理、预防、诊断和治疗研究,对Mondini畸形研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及引起内耳畸形的猪SOX10突变基因,还涉及该基因的应用。
背景技术
SOX10(性别决定区盒基因10,SRY-box10)是动物胚胎发育调控的关键转录因子,物种之间高度保守。在胚胎发育过程中,SOX10在NCC迁移早期的背神经管及NCC衍生组织、耳基板以及随后的听囊中均有广泛表达。随着内耳发育和神经嵴细胞(NCC)分化,SOX10表达于内耳中神经嵴来源的胶质细胞(如Schwann细胞、Corti器血管纹中的支持细胞等),但在分化后的毛细胞中不表达。而SOX10基因突变是否与内耳畸形有关目前并不清楚。
耳聋是我国第二大致残疾病,严重影响人类生活质量最常见的感觉障碍疾病。据WHO2012年估计全球听力残疾人达3.6亿,占世界总人口5.3%,耳聋已成为世界性公共卫生问题,影响个人及家庭,给全社会带来沉重负担。世界各国通过流行病学调查先天性耳聋在新生儿中发生的总比例达到1/1000-3/1000。我国是世界上听力障碍人数最多的国家,据2006年第二次全国残疾人抽样调查显示,全国有听力残疾人2780万,且每年新增3万多聋儿。Mondini畸形是一种最常见先天性内耳畸形(congenital inner malformation),可引起感音神经性耳聋。先天性内耳畸形是胚胎发育期间由于基因突变等遗传因素,以及母亲妊娠期间病毒、细菌、螺旋体等感染或者药物(氨基糖苷类、反应停)、理化因素(X射线、化学制剂)等非遗传因素导致的内耳发育停止或变异。根据Sennaroglu方法,内耳畸形分类为:Michel畸形、耳蜗未发育、共腔畸形、耳蜗发育不全、不完全分隔I型及不完全分隔II型。其中,不完全分隔II型又被称为Mondini型,是1791年由Mondini医生首先描述,是内耳可能在胚胎期第7周发育异常形成的耳蜗不完全发育畸形,其主要形态学异常表现为耳蜗螺旋仅1圈半,而不是正常发育的2圈半;耳蜗基底圈正常,顶圈和第二圈融合。文献报道Mondini畸形在儿童的发病率可达1/1000至1/2000。解放军总医院对其基因库11000余例耳聋患者的调查结果分析,伴有内耳畸形的患者约占耳聋患者的13%。其中大前庭水管综合征约占内耳畸形患者的85%,Mondini畸形约占内耳畸形的13%,其余类型约占2%。同时,通过CT检查2747例感音神经性耳聋患者,发现843例内耳畸形患者,占比30.69%(843/2747),其中耳蜗畸形占52.31%(441/843),而Mondini畸形占耳蜗畸形的76.19(336/441)。因此,在我国人群中,Mondini畸形在感音神经性耳聋患者中的占比可高达12.16%。
迄今为止,Mondini畸形的研究仅限于临床病例观察检测、影像诊断、耳蜗移植治疗等临床现象研究,未开展相关致病机理实验研究,其发病原因及致病机理完全不清楚,在临床上未发现Mondini畸形致畸基因。在人群中,Mondini畸形常以并发症状出现,如:DFNB4(MIM#600791)、SHFM1(Split-Hand/Foot Malformation 1,MIM#183600)、BOR1(Branchiootorenal Syndrome 1,MIM#113650)、PDS(Pendred Syndrome,MIM#274600)、软腭-心-面综合征(Velocardiofacial Syndrome,MIM#192430)、DGS(Digeorge Syndrome,MIM#188400)、Wildervanck's syndrome等。尽管上述耳聋疾病的遗传因素已相对明确,但在这些疾病中往往仅部分病例伴发内耳Mondini畸形,因此其致病的遗传因素与内耳Mondini畸形的相关性并不确切。除并发症状外,Mondini畸形也可单独发生,但都以散发病例出现,并且人体临床样本存在表型差异大、遗传背景复杂、样本数量少以及研究材料(内耳组织等)获取困难等问题,目前并未发现Mondini畸形耳聋疾病的临床家系,导致学界对该症状可遗传性产生争议。因此动物模型在耳聋基因发现及功能验证、发病机理研究、诊断预防治疗方法评价等方面具有不可替代作用。
目前已有400余种遗传性耳聋动物模型报道,包括遗传工程动物模型、ENU化学诱变动物模型、自发突变动物模型三类。遗传工程耳聋动物模型最多,目前发现的几乎每一个耳聋基因均制备了基因敲除、敲入或敲低的遗传工程小鼠。此外,利用ENU诱变动物基因组发生高通量随机诱变也是制备耳聋动物新模型、发现致聋新基因并揭示耳聋新机制的有效途径,但大多以小型啮齿类哺乳动物(小鼠、大鼠等)为研究材料。除基因修饰耳聋动物模型外,已有5-6个自发突变耳聋动物模型报道,涉及牛、犬、马、猫等不同动物种属,主要突变基因为MITF,缺乏骨迷路异常动物模型,尤其没有Mondini内耳畸形动物模型,直接限制了Mondini畸形的深入研究,导致其致病基因及致病机理不清,进而限制了其预防、诊断、治疗的发展,成为Mondini畸形研究及发展的瓶颈。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因,可引起内耳Mondini畸形并呈显性遗传,能够用于人内耳Mondini畸形的发病机理、预防、诊断和治疗研究;本发明的目的之二在于提供引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因在制备内耳Mondini畸形并呈显性遗传的疾病动物模型的试剂中的应用,制成的模型可用于人内耳Mondini畸形的发病机理、预防、诊断和治疗研究,本发明的目的之三在于提供特异性检测人SOX10突变基因(SOX10 c.325A>T点突变)的试剂在预测或诊断引起内耳Mondini畸形的试剂中的应用,为预防、诊断人内耳Mondini畸形提供靶位点。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
1、引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因,所述猪SOX10突变基因为SOX10基因第325位由A突变为T。
2、所述引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因在制备内耳Mondini畸形的疾病动物模型的试剂中的应用。
3、特异性检测人SOX10突变基因的试剂在制备预测或诊断引起内耳Mondini畸形的试剂中的应用,所述人SOX10突变基因为人SOX基因第316位由C突变为T。
优选的,所述特异性检测人SOX10突变基因的试剂为PCR试剂或测序试剂。
本发明的有益效果在于:本发明定位了猪SOX10 c.325A>T点突变可引起内耳Mondini畸形并呈显性遗传,因此可以利用该突变用于人内耳Mondini畸形的发病机理、预防、诊断和治疗研究;也可以制备由SOX10 c.325A>T点突变引起的内耳Mondini畸形并呈显性遗传的疾病动物模型,该模型可用于人内耳Mondini畸形的发病机理、预防、诊断和治疗研究,打破了因没有Mondini内耳畸形动物模型限制Mondini畸形深入研究的瓶颈。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1为Mondini畸形耳聋猪听力ABR检测(A为正常巴马香猪ABR波形;B突变巴马香猪ABR波形;C为正常与突变巴马香猪听力各频率阈值)。
图2为突变猪高分辨率螺旋CT检测结果(a-d为4张连续扫描层面图像(采集层厚0.625mm),白色箭头为耳蜗位置,黑色箭头为前庭导水管位置;其中仅b层和c层能够看到耳蜗的底周,a层和d层基本看不到耳蜗,前庭导水管相对于正常猪无扩大;提示该个体耳蜗较短,且周数发育不全)。
图3为正常猪高分辨率螺旋CT检测结果(a-f为6张连续扫描层面图像(采集层厚0.625mm),白色箭头为耳蜗位置,黑色箭头为前庭导水管位置;其中a、b、c、d层均能看到清晰耳蜗的底周和第2周,e层能看到底周和部分第2周,f层只能看到底周;提示该个体耳蜗有2周以上,长度为上述突变猪的2倍以上)。
图4为正常猪和突变猪磁共振(MRI)水成像(a为正常猪,b为突变猪,白色箭头为耳蜗位置;结果可清晰显示内耳膜迷路形态结构,正常猪可见3周半耳蜗,突变猪仅可见1周半耳蜗)。
图5为成年突变猪畸形耳蜗组织学结构观察(A:耳聋猪耳蜗组织学结构(HE);B正常猪耳蜗组织学结构(HE))。
图6为内耳Mondini畸形耳聋猪与同窝正常猪的耳蜗实体结构观察(A:正常猪的耳蜗实体结构;B:内耳Mondini畸形耳聋猪)。
图7为突变个体(左)和正常个体(右)外貌。
图8为胚胎发育时期正常和突变猪的耳蜗组织学结构变化。
图9为全基因组SNP关联分析结果。
图10为SOX10突变(c.325A>T)Sanger测序结果。
图11为SOX10 p.R109W突变分子在细胞中表达后的定位观察。
图12为白化耳聋仔猪ABR检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、内耳Mondini畸形猪遗传家系的建立
以我国巴马香猪为模式动物,利用强化学诱变剂乙烷亚硝基脲(ENU)开展了猪基因组的高通量随机诱变,获得了呈高度稳定显性遗传的、内耳呈典型Mondini畸形的耳聋猪遗传家系。具体过程如下:通过对G0代巴马香猪公猪进行ENU化学诱变,使其能够产生携带基因突变的精子;然后与野生型母猪交配,通过对G1代的大规模表型筛选,获得1头呈重度耳聋及色素分布异常的G1公猪;利用该G1公猪与正常母猪交配,目前已产生175头F2代个体,其中具耳聋突变表型的个体79头,正常表型个体96头;F2代个体与家系其它猪及野生型猪之间交配共产生F3代74头。该家系目前共包括290头个体,包括ENU处理的G0诱变公猪1头,G1首建公猪1头,G2代猪175头,G3代猪74头,及参与家系配种的野生型猪39头。
将所有耳聋家系产生的F2代进行显性遗传卡方适合度检验,如表1所示。
表1、耳聋家系F2代产仔记录
卡方检验表明耳聋家系产生的F2代耳聋与正常个体数量符合1︰1的分配比例,同时性状在不同性别间无差异分布。表明该家系耳聋性状遗传模式符合常染色体单基因显性遗传的孟德尔遗传定律,故可确定该小型猪家系是一个呈单基因显性遗传的遗传性耳聋家系。目前,已经建立了遗传关系清楚、连续传代3代共290头个体、Mondini畸形表型符合孟德尔显性遗传模式的遗传大家系。
实施例2、家系特征分析
(一)突变猪听力表型检测
突变巴马香猪个体均表现出先天性的听力缺陷,对声音刺激没有反应。将1月龄巴马香猪和正常巴马香猪分别麻醉后采用Smart EP诱发电位仪进行脑干听觉诱发电位(ABR)检测,结果如图1所示。结果表明参测的所有突变巴马香猪在各频率的仪器最大输出均不能引出ABR峰,表现出重度耳聋。而正常巴马香猪能引出正常ABR峰,听力阈值在30~40dB SPL间,听力正常。
(二)内耳Mondini畸形形态学研究
对耳聋猪和正常猪分别进行了高分辨率螺旋CT、MRI磁共振水成像影像学诊断,结果如图2~4所示。结果显示,正常巴马香猪耳蜗为3周半,而突变猪耳蜗螺旋仅1周半,其耳蜗基底圈正常,顶圈和第二圈融合,且无前庭导水管扩大及其它病理变化,呈单纯Mondini畸形。通过对内耳Mondini畸形耳聋猪的耳蜗组织进行进一步的实体观察,确证了其内耳Mondini畸形表型。
然后通过切片观察.耳蜗组织学结构,结果图5所示。结果显示,畸形耳蜗残存底回耳蜗毛细胞仍然存在,螺旋神经节细胞存在,但已有损伤。
再对耳聋猪和正常猪分别进行耳蜗整体固定脱钙处理实体结构观察,结果如图6所示。结果同样显示,正常巴马香猪耳蜗为3周半,而突变猪耳蜗螺旋仅1周半,其耳蜗基底圈正常,顶圈和第二圈融合。
(三)突变猪白化表型观察
图7为正常巴马猪和突变巴马猪的表型。结果显示,正常巴马猪呈典型“两头乌”特征,即头部和臀部为黑色,其它部位为白色,而突变个体表现为除头部有黑色斑块外,其它部位为全白色。另还表现出虹膜变浅的特征,其角膜瞳孔外区域较普通巴马香猪的棕色明显变淡,呈浅蓝色。
(四)正常与对照猪的耳蜗组织的转录组初步分析
前期对家系内同一窝的6头个体(3头正常猪,3头Mondini畸形猪)进行了耳蜗组织RNA-Seq转录组分析,共发现差异表达基因141个。表达差异GO富集分析(GO EnrichmentAnalysis)表明,三个通路富集程度较高(-LOG10(P-value)值大于3)。1)色素相关基因(pigmentation):富集的基因包括:MITF、CITED1、DCT、TYR,均是色素形成相关分子,以上4个基因在畸形猪耳蜗组织中表达大幅下调;2)运输相关基因(transport):这个通路是与一些离子的运输传递相关,其中ATP1B2,与Na+和K+运输相关,ATP2B3与Ca2+运输相关,研究显示SLC12A2和ATP2B2与耳蜗Corti的缺失,Corti支持细胞缺失,以及耳蜗毛细胞异常相关。3)次生代谢相关基因(secondary metabolic process):该通路所富集3个基因为CITED1、DCT和TYR,全部包括在pigmentation通路的富集基因中。以上初步研究结果提示,其突变位点(SOX10R109W)可能影响SOX10蛋白结合靶点功能及特性的变化,影响SOX10分子与数个基因转录调控区域结合,通过特定的分子网络变化发挥其生物学效应而导致内耳畸形。
(五)突变猪胚胎动态发育形态学研究
通过精确控制配种时间,配合超声影像诊断,确认胚胎发育阶段,对怀孕母猪进行剖腹产采集胚胎内耳及耳蜗组织样本。
采集17个胚胎发育时间点(23d、26d、29d、38d、42d、45d、49d、56d、63d、70d、77d、84d、91d、98d、105d、112d、115d)内耳畸形猪和正常对照猪耳蜗组织,进行不同胚胎发育时期正常和突变猪的耳蜗组织学结构分析,结果如图8所示。结果显示在胚胎发育第29天时候开始,内耳畸形猪耳蜗发育出现异常。
实施例3、家系基因定位
(一)全基因组关联分析确定致病基因及突变位点
共检测家系内个体48头,包括20头患病个体和28头正常个体,采用PorcineSNP60v2Genotyping BeadChip进行全基因组SNP分型。采用PLINK软件包对耳聋性状与SNP位点基因型进行关联性分析,结果如图9所示。在芯片上62163个SNP中,call rate大于95%的有61565个SNP,并可被定位于Sscrofa10.2猪基因组中(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Annotation)。结果表明,5号染色体上的11个SNP位点(10.5-17.5Mb)与白化耳聋性状表现出最强关联(P值1-6×10-6)。人瓦氏综合征(Waardenburg syndrome)相关基因SOX10位于该区域附近(7289992-7299054bp)。因此我们选择SOX10作为致病侯选基因进行了4个外显子及外显子边界的全测序。4个家系内个体(2个患病个体,2个正常个体)测序结果表明,与猪的参考序列(NM_001099933.1,C_010447,编码区如SEQ ID NO.1所示)对比,共发现8个序列变异,均为单核苷酸多态性(SNP),其中6个SNP位于蛋白编码区,2个SNP位于3’非翻译区。6个编码区的SNP中有3个为非同义突变,导致氨基酸变化。其中仅c.325A>T表现为与白化耳聋性状完全共分离(在患病猪中为杂合子AT,正常猪中为纯合子AA)。该突变引起猪SOX基因编码蛋白的109位氨基酸由精氨酸(Arg)变为色氨酸(Trp)(p.R109W)。我们对家系所有290个体进行该位点的测序验证,证实所有123个患病个体均在c.325位点均表现为AT杂合,而其它正常个体表现为AA纯合。因此,确定SOX10基因的第2外显子突变(c.325A>T)导致氨基酸改变(p.R109W),并与白化耳聋性状表现为完全共分离,为该猪家系内耳Mondini畸形表型的显性遗传致病突变位点(图10)。
序列对比与结构分析表明本发明定位的SOX10基因的第2外显子点突变(c.325A>T,p.R109W)对应于人SOX10基因的106位氨基酸残基,位于SOX10的高活性组分结构域(Highmobility group,HMG)中的核定位信号序列(NLS),理论上该突变影响SOX10与DNA结合的功能特性,进而导致基因转录发生改变。
(二)突变SOX10基因的初步细胞表达功能实验
使用pEGFP-N1质粒构建SOX10野生型、突变型载体,具体方法如下:设计添加酶切位点的猪SOX基因PCR引物:
SOX10正向引物F:5’-actctcgagatggcggaggagcaggacc-3’(SEQ ID NO.2),下划线为XhoI酶切位点;
SOX10反向引物R:5’-actaagcttaggccgggacagcgtcgtg-3’(SEQ ID NO.3),下划线为HindIII酶切位点;
分别提取患病猪和正常猪基因组组织mRNA为模板,用上述引物RT-PCR扩增、纯化,XhoI和HindIII双酶切,获得1.4kb的基因片段;用XhoI和HindIII双酶切pEGFP-N1质粒,获得4.7kb的载体片段。上述1.4kb的基因片段和4.7kb载体片段连接、转化,测序验证,获得野生型和突变型SOX10基因的EGFP融合蛋白细胞表达载体。分别将SOX基因野生型表达载体和突变表达载体转染小鼠细胞系(NIH3T3)及猪的成纤维细胞,研究SOX10转录因子的亚细胞定位,结果如图11所示。结果表明,空载体组绿色荧光定位在核内和胞质。野生型SOX10主要定位在核内,这一结果与SOX10作为转录因子,会定位在核内相符合。p.Arg109Trp(R109W)突变组的SOX10定位在核内和胞质,并且一些细胞中存在SOX10在胞质内聚集的情况,说明点突变影响了SOX10蛋白的亚细胞分布。
该结果与本发明定位的SOX10基因的第2外显子点突变(c.325A>T,p.R109W)对应于人SOX10基因的106位氨基酸残基的理论预期相符合。即该位点位于SOX10的高活性组分结构域(High mobility group,HMG)中的核定位信号序列(NLS),从而改变SOX10蛋白细胞内定位,影响SOX10与DNA结合的功能特性,进而导致基因转录发生改变。
实施例4、SOX10 c.325A>T点突变小型猪遗传工程疾病动物模型制备
通过CRISPR/Cas9系统介导的高效遗传修饰,将SOX10 p.R109W突变位点(SOX10c.A325>T)靶向导入正常猪SOX10基因相应序列,阳性猪表现为内耳Mondini畸形并呈显性遗传。
(一)SOX10 c.325A>T点突变遗传工程小型猪制备
1.sgRNA位点选择(sgSOX10-exon2:):
序列:5’-agagcaaaccgcacgtcaagagg-3’(SEQ ID NO.4),位于猪SOX10基因第二外显子的正义链,其中加粗部分为PAM结构。在PAM结构中,带下划线的A碱基为拟突变为T的目标碱基。
2.作为同源重组模板的单链寡核苷酸DNA(pSOX10-exon2-ssODN)的设计:
将目标碱基由A变为T,同时将PAM结构上游的第一、第四和第七位碱基分别作无义突变,以排除同源重组后CRISPR系统再切割的可能性。序列如下:
5’-ctacgactggaccctggtgcccatgcccgtgcgcgtcaacggcgccagcaagagcaaaccgcatgtgaaaTggcccatgaacg ccttcatggtgtgggcgcaggcggcgcgcaggaagctggctcttgacgtgcgg-3’(SEQ ID NO.5);
其中:大写T碱基为可导致猪SOX10分子R109W突变的错义突变碱基;带下划线的小写碱基t,g和a为防止基因敲入位点被再次切割的无义突变碱基。
3.sgRNA的体外转录载体的构建
1)依据所选择的sgRNA位点,合成如下互补的寡核苷酸:
sgSOX10-exon2-top strand:5’-taggttcatgggcctcttgacgtg-3’(SEQ ID NO.6);
sgSOX10-exon2-bottom strand:5’-aaaccacgtcaagaggcccatgaa-3’(SEQ IDNO.7);
2)将上述合成的寡核苷酸等摩尔浓度混合,充分变性后缓慢复性为双链DNA;
3)用BsaI酶切质粒pUCkan-T7-sgRNA质粒(参考文献Shen,B.et al.,Generationof gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting.Cell Res.23,720-723(2013)),将酶切产物凝胶电泳后回收线性质粒片段;
4)将上述获得的双链DNA片段与线性质粒片段通过T4DNA连接酶相连接,并将连接产物转化至感受态细菌DH5α;
5)转化细菌经过含卡拉霉素的培养基筛选培养后,挑取单克隆菌落于含卡那霉素的SOC培养基中震荡培养,提取重组质粒,该质粒即为sgSOX10-exon2的体外转录载体;
4.sgRNA的体外转录与纯化
1)用内切酶DraI过夜酶切重组质粒,充分实现sgSOX10-exon2体外转录载体质粒的线性化;
2)在酶切体系中加入PK至终浓度为100μg/mL,SDS至终浓度0.5%,50℃孵育45min;
3)向转录模板溶液中加入十分之一体积的醋酸钠溶液;
4)向体系中加入等体积酚:氯仿,充分震荡混匀,12000g室温离心10min,然后将上清转到新的RNase-free tube中;
5)向新的上清中加入相当于上清液体积2.5倍的无水乙醇,-80℃冰冻30min;
6)4℃,12000g离心10min,弃去上清,用75%乙醇小心洗涤管壁,空气中干燥15min或至4℃干燥2h;
7)加8μl的Nuclease free water重悬,取1μl进行核酸定量;
8)以上述纯化的线性化质粒为模板,利用MEGAshortscript Kit,通过体外转录获得sgRNA(操作详见说明书)。
9)利用MEGAclear kit纯化上述体外转录的sgRNA;
10)测定纯化的sgRNA溶液的浓度,并根据以1-5μl/管进行分装;
11)取1管凝胶电泳检测其质量,并将分装后的sgRNA置于-80摄氏度冰箱保存;
5.Cas9mRNA的制备
1)用AgeI内切酶充分(过夜)酶切Cas9mRNA体外转录载体质粒(Addgene,Cat.:44758),并取少量酶切产物进行凝胶电泳,检测酶切效果;
2)在酶切反应体系中加入PK至终浓度为100μg/mL,SDS至终浓度0.5%,50℃孵育45min。
3)向转录模板溶液中加入十分之一体积的醋酸钠溶液,充分混匀;
4)体系中加入等体积酚氯仿,充分震荡混匀,12000g室温离心10min,然后将上清转到新的RNase-free tube中;
5)向新的上清中加入2.5倍体积的无水乙醇,-80℃冰冻30min后,4℃、12000g离心10min,弃去上清;
6)用75%乙醇小心洗涤管壁,空气中干燥15min或至4℃干燥2h;
7)加8μl的Nuclease free water重悬,取1μl进行核酸定量;
8)以步骤3.7获得的线性化质粒为模板,利用mMESSAGE mMACHINE T7Ultra kit体外转录Cas9mRNA并进行加尾处理(操作详见说明书);
9)将获得的Cas9mRNA利用RNAeasy kit过柱纯化后(操作现将说明书),以1-1.5μL/管分装,并置于-80摄氏度保存备用。
6.同源重组模板ssODN的制备
1)通过寡核苷酸合成获得pSOX10-exon2-ssODN的单链片段;
2)用无核酶的去离子水溶解合成的DNA片段;
3)以2μL/管分装ssODN溶液,置于-80摄氏度保存备用。
7.SOX10点突变基因修饰猪的制备
1)猪1-cell胚胎的获取:依照参考文献2所述的方法,通过输卵管冲胚手术,从配种后24-48h的性成熟发情母猪体内获取1-cell早期胚胎;
2)将上述准备的sgRNA(sgSOX10-exon2)、pSOX10-exon2-ssODN片段和Cas9mRNA,分别以终浓度10ng/uL、10ng/uL和30ng/uL进行混合;
3)将步骤5.2制备的混合样本,通过显微注射导入胚胎细胞胞质;
4)将注射后的胚胎短暂培养后,移植于处于发情状态的代孕母猪输卵管内;
5)定期检查代孕母猪发情状况,直至小猪出生。
(二)SOX10 c.325A>T点突变遗传工程小型猪表型检测
共有3头受体母猪成功怀孕并出生3窝仔猪共17头,其中表现出白化耳聋表型9头。
1.听力检测
对白化耳聋仔猪进行了脑干听觉诱发电位(auditory brainstem response,ABR)检测。用速眠新II(846)按0.3ml/kg体重麻醉实验动物,并用37℃保温袋保温。测试仪器采用美国爱生公司SmartEP诱发电位仪,电极设置为:颅顶为纪录极,测试耳为参考极,鼻尖处为地线。刺激声用click和Tone burst(6K Hz,8KHz,16KHz)。Tone burst条件为:采用Blackman包装模式,1ms上升/下降时间,0ms的平台,刺激频率11/s,带通为0.1-3KHz,叠加次数512次,扫描时间10ms。检测结果如图12所示,结果显示白化耳聋个体在最大输出110db均不能引出ABR峰,表现出重度耳聋,而同窝正常个体均能引出正常ABR峰,听力阈值在40-60dB SPL间。
2.耳蜗实体观察
对耳聋猪和正常猪分别进行耳蜗整体固定脱钙处理实体结构观察,表明耳聋猪的耳蜗螺旋仅1周半,其耳蜗基底圈正常,顶圈和第二圈融合。
3.白化表型观察
后代中正常巴马猪呈典型“两头乌”特征,即头部和臀部为黑色,其它部位为白色,而突变个体表现为除头部有黑色斑块外,其它部位为全白色,虹膜变浅。
(三)SOX10 c.325A>T点突变遗传工程小型猪突变检测
对SOX10基因进行第2外显子的PCR扩增及测序。结果显示,所有白化耳聋个体均具有第2外显子点突变(c.325A>T,p.R109W),即基因型为AT,并携带有设计的同源重组模板的单链寡核苷酸DNA(pSOX10-exon2-ssODN)PAM结构上游的第一、第四和第七位碱基无义突变。而正常个体没有点突变,基因型为AA。
实施例5、猪SOX10点突变(c.325A>T,p.R109W)对应人突变位点的临床病例筛选
为了验证猪SOX10点突变(c.325A>T,p.R109W)对应人SOX10基因的106位氨基酸残基,共筛选病人106例,其中从解放军总医院1996年至今在其听觉植入中心行人工耳蜗植入手术的2000例患者中选取有内耳Mondini畸形的患者31例,选取解放军总医院海南分院收治的来自全国十几个省的内耳畸形患者75例。利用这些病人的DNA样本,对SOX10基因的第2外显子进行PCR扩增、测序。在3个病例中发现SOX10基因c.316C>T突变,并导致氨基酸改变,使SOX基因编码蛋白的106位氨基酸由精氨酸(Arg)变为色氨酸(Trp)(p.R106W)。3个病例情况如表2所示:
表2、SOX10点突变(c.325A>T,p.R109W)对应人突变位点的临床病例筛选
上述结果表明,人SOX10点突变(c.316C>T,p.R106W)可导致内耳Mondini畸形并引起感音神经性耳聋。本发明发现的猪内耳Mondini畸形致病基因SOX10点突变(c.325A>T,p.R109W)所对应的人SOX10点突变(c.316C>T,p.R106W),可用于内耳Mondini畸形引起的人耳聋的临床预测或诊断,包括特异性检测人SOX10突变基因的试剂在预测或诊断引起内耳Mondini畸形的试剂中的应用。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因在制备内耳Mondini畸形的疾病动物模型的试剂中的应用,其特征在于:所述动物为猪,所述猪SOX10突变基因为猪SOX10基因第325位由A突变为T,所述猪SOX10基因的核苷酸基因如SEQ ID NO.1所示。
2.特异性检测人SOX10突变基因的试剂在制备预测或诊断引起内耳Mondini畸形的试剂中的应用,其特征在于:所述人SOX10突变基因为人SOX基因第316位由C突变为T。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述特异性检测人SOX10突变基因的试剂为PCR试剂或测序试剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510830014.0A CN105238793B (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510830014.0A CN105238793B (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105238793A CN105238793A (zh) | 2016-01-13 |
CN105238793B true CN105238793B (zh) | 2019-04-16 |
Family
ID=55036613
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510830014.0A Active CN105238793B (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105238793B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106191070B (zh) * | 2016-07-26 | 2019-09-10 | 中国人民解放军第三军医大学 | 引起耳聋的猪kit突变基因及其应用 |
CN110872620B (zh) * | 2018-08-29 | 2023-07-18 | 深圳市科迈今美生物医疗有限公司 | 一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试剂盒及其应用 |
CN111500589A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-07 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 引起内耳发育不全的猪sox10突变基因及其应用 |
CN115724965A (zh) * | 2022-07-13 | 2023-03-03 | 浙江欧赛思生物科技有限公司 | 一种豚鼠sox10多克隆抗体的制备方法及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103282487A (zh) * | 2010-10-26 | 2013-09-04 | 卡斯西部储备大学 | 分化的体细胞向神经胶质细胞的细胞命运转化 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6506267B2 (ja) * | 2013-10-03 | 2019-04-24 | バイオケア メディカル, エルエルシー | 抗sox10抗体のシステムおよび方法 |
-
2015
- 2015-11-25 CN CN201510830014.0A patent/CN105238793B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103282487A (zh) * | 2010-10-26 | 2013-09-04 | 卡斯西部储备大学 | 分化的体细胞向神经胶质细胞的细胞命运转化 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Genetic counseling for a three-generation Chinese family with Waardenburg syndrome type II associated with a rare SOX10 mutation;Kaitian Chen et al;《International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology》;20150317;第79卷;第746页左栏最后1段 |
NM_001099933.1;NCBI;《NCBI》;20070725;第1-6页 |
SOX10基因在Waardenburg综合征发病中的作用研究进展;张华等;《中华耳鼻头颈外科杂志》;20131231;第48卷(第12期);第1043页左栏最后1段 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105238793A (zh) | 2016-01-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2018177351A1 (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
Lai et al. | Diverse phenotypes and specific transcription patterns in twenty mouse lines with ablated LincRNAs | |
CN105238793B (zh) | 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 | |
CN110506115A (zh) | 使用CRISPR/Cas9和三重指导序列进行外显子跳读修饰的优化策略 | |
CN109706184B (zh) | 自闭症模型犬的建立方法 | |
CN109628454A (zh) | 斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法 | |
CN105518132A (zh) | 缺乏lincRNA的非人类动物 | |
Hao et al. | Key genes and pathways associated with inner ear malformation in SOX10 p. R109W mutation pigs | |
CN104046644A (zh) | 人源化小鼠模型的构建方法和应用 | |
US20220369608A1 (en) | Method for establishing diabetes disease model dog | |
CN106232816A (zh) | snoRNA、组合物以及应用 | |
CN111500589A (zh) | 引起内耳发育不全的猪sox10突变基因及其应用 | |
CN107955818B (zh) | 一种非人灵长类动物神经疾病动物模型的建立方法及其用途 | |
Nakajima et al. | Generation of translucent Xenopus tropicalis through triple knockout of pigmentation genes | |
CN111705063B (zh) | Asgr1突变基因及其在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用 | |
CN110846321B (zh) | 一种突变基因及其用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途 | |
CN114868707B (zh) | 一种代谢性脑病和心律失常疾病的斑马鱼模型及其应用 | |
JP6443938B2 (ja) | コフィン−サイリス症候群の検出方法 | |
WO2021159741A1 (zh) | 一种用于制备irs基因缺陷的糖尿病克隆猪核供体细胞的crispr系统及其应用 | |
CN115181170A (zh) | 一种猪tmc1突变基因及其用途 | |
Mousel et al. | Genome-wide association identifies genomic regions associated with entropion in domestic sheep | |
JPWO2009017082A1 (ja) | 異常行動を示す遺伝子改変非ヒト哺乳動物及びその作製方法 | |
CN117051047A (zh) | 一种先天性肌无力斑马鱼模型的构建方法及其在表型鉴定和药物筛选中的应用 | |
CN118272448A (zh) | 真性小眼球动物模型的构建方法及其应用 | |
CN118326026A (zh) | 一种黏连蛋白病诊断标志物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |