CN115724965A - 一种豚鼠sox10多克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豚鼠SOX10多克隆抗体的制备方法及其应用,多克隆抗体以如SEQ ID NO.1所示核酸序列对应的蛋白产物作为抗原，免疫豚鼠后，通过抗原亲和方法从免疫后豚鼠血清中纯化获得。该抗体能够在体外培养的细胞、小鼠神经组织中特异性的识别SOX10+的少突胶质细胞。该抗体特异性标记中枢神经系统所有的不同发育阶段的少突胶质细胞和外周神经系统中的施旺细胞，在少突胶质细胞和施旺细胞发育、髓鞘形成、脱髓鞘疾病、脑肿瘤、神经损伤等相关神经科学研究中，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种豚鼠SOX10多克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术
脊椎动物中枢神经系统主要由神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞组成。其中，少突胶质细胞主要形成包裹神经元轴突的髓鞘，从而几十倍的加快神经冲动沿神经元轴突的传导速度，以此保证脊椎动物更快更精确的运动速度。髓鞘发育障碍的小鼠模型往往导致震颤、瘫痪、癫痫等神经功能障碍。人类的髓鞘相关疾病包括脑白质营养不良、多发性硬化症等，都会导致个体严重的神经功能障碍甚至死亡。此外，与其他中枢神经系统起源的神经细胞类型不同，少突胶质细胞前体细胞在整个动物生命周期中都具有增殖能力，因此是很多脑肿瘤，尤其是胶质瘤的起源细胞。因此，少突胶质细胞的发育及其相关疾病研究是神经科学研究的重要组成部分。
然而，要研究少突胶质细胞，首先需要能够再体内体外水平对少突胶质细胞进行特异性的标记，这就需要少突胶质谱系细胞特异性的抗体(少突胶质谱系细胞指各种发育阶段的少突胶质细胞的总称，包括少突胶质前体细胞、正在分化的少突胶质细胞、成熟的少突胶质细胞)。之前的研究多以Olig2作为少突胶质谱系细胞的标记物。但是，越来越多的研究证实，Olig2并不是一个好的少突胶质谱系细胞的标记物。原因在于：首先，在神经前体细胞产生少突胶质前体细胞之前，Olig2已经表达于神经前体细胞中；其次，Olig2同时表达在新生和幼年动物的星形胶质细胞中，只在成年动物脑中才特异性标记少突胶质谱系细胞。相比之下，SOX10在中枢神经系统中只特异性标记少突胶质谱系细胞，既不标记神经前体细胞，也不标记星形胶质细胞。此外，SOX10既标记中枢神经系统的少突胶质谱系细胞，也标记外周神经系统的髓鞘形成细胞，即施旺细胞。但由于长期以来缺乏可靠的SOX10抗体，导致研究者们普遍使用Olig2作为少突胶质谱系细胞的标记物。然而，这一做法会导致研究结果的不准确甚至是错误。为了解决这一少突胶质谱系细胞的标记准确性问题，本发明提供了一种制备豚鼠SOX10多克隆抗体的制备方法，并列举了几种应用场景。
发明内容
本发明提供了一种豚鼠SOX10多克隆抗体的制备方法及其应用，以解决现有技术的上述问题。
一种豚鼠SOX10多克隆抗体，抗体为SEQ ID NO.1所示核酸序列对应的蛋白产物作为抗原。
作为优选的技术方案，所述抗体为特异性识别SOX10的多克隆抗体。
作为优选的技术方案，所述抗体为豚鼠来源的SOX10的多克隆抗体。
作为优选的技术方案，所述抗体经抗原亲和纯化。
作为优选的技术方案，所述抗体特异性识别小鼠、大鼠、狗、鸡与人的SOX10蛋白，不识别SOX10的同源物SOX9与SOX8。
本发明还公开了一种制备如权利要求1所述的豚鼠SOX10多克隆抗体的方法，包括下列步骤：
1)将小鼠SOX10的C端片段对应的DNA片段与谷胱甘肽转移酶GST的DNA片段融合，再克隆到原核表达载体pEASY中，提取质粒后转入包含λ噬菌体DE3区的大肠杆菌BL21表达菌株中，IPTG诱导携带6xHis标签的目标蛋白表达；
2)通过镍柱从细菌裂解液的上清液中纯化目标蛋白；
3)以纯化后的目标蛋白免疫豚鼠，并在免疫结束后获取豚鼠血清；
4)通过抗原亲和纯化方法，从豚鼠血清中纯化SOX10抗体。
包含λ噬菌体DE3区的大肠杆菌BL21表达菌株采用大肠杆菌表达L21(DE3)。
本发明还公开了一种豚鼠SOX10多克隆抗体在标记中枢神经系统少突胶质谱系细胞方法的应用。
本发明还公开了一种豚鼠SOX10多克隆抗体的用途：
所述豚鼠SOX10多克隆抗体特异性标记中枢神经系统的少突胶质系细胞与周围神经系统的施旺细胞；在少突胶质细胞与施旺细胞发育、髓鞘形成与维持、脱髓鞘相关疾病、脑肿瘤的神经科学研究，以及相关疾病的诊断中具有重要的用途。
发明优点：
本发明提供了一种豚鼠SOX10多克隆抗体的制备方法，解决了目前没有可靠的少突胶质谱系细胞标记物的问题，能够极大的促进少突胶质细胞、施旺细胞发育和相关疾病的研究。由于市面上的抗体主要是兔来源抗体，以及少数小鼠单克隆抗体，本发明所提供的的豚鼠多克隆抗体，可以和其他既有抗体联用，进行多通道免疫荧光标记，更适合科学研究的进行。本发明所提供的抗体将促进少突胶质细胞和施旺细胞的相关研究。
附图说明
图1为SOX10与其同源蛋白SOX9和SOX8的结构示意图；
图2为纯化的抗原蛋白的SDS-PAGE电泳后的考马斯亮蓝R250染色结果；
图3.为本发明实施例免疫荧光检测小鼠胚胎E14.5时期(孕14.5天)脊髓和背根神经节中SOX9和SOX10的染色情况；
图4.为本发明实施例免疫荧光检测小鼠P7时期(出生后7天)大脑皮层中SOX10和星形胶质细胞标记物ALDH1L1的染色情况；
图5.为本发明实施例免疫荧光检测成年小鼠大脑中SOX10+少突胶质谱系细胞的分布情况；
图6.为本发明实施例免疫荧光检测小鼠脑中胶质瘤中的SOX10表达情况。
图7.为本发明实施例免疫荧光检测大鼠原代少突胶质前体细胞的PDGFRA和SOX10的表达情况。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种豚鼠SOX10多克隆抗体的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中的问题。
一种豚鼠SOX10多克隆抗体，抗体为SEQ ID NO.1所示核酸序列对应的蛋白产物作为抗原。
作为优选的技术方案，所述抗体为特异性识别SOX10的多克隆抗体。
作为优选的技术方案，所述抗体为豚鼠来源的SOX10的多克隆抗体。
作为优选的技术方案，所述抗体经抗原亲和纯化。
作为优选的技术方案，所述抗体特异性识别小鼠、大鼠、狗、鸡与人的SOX10蛋白，不识别SOX10的同源物SOX9与SOX8。
本发明还公开了一种制备如权利要求1所述的豚鼠SOX10多克隆抗体的方法，包括下列步骤：
1)将小鼠SOX10的C端片段对应的DNA片段与谷胱甘肽转移酶GST的DNA片段融合，再克隆到原核表达载体pEASY中，提取质粒后转入包含λ噬菌体DE3区的大肠杆菌BL21表达菌株中，IPTG诱导携带6xHis标签的目标蛋白表达；
2)通过镍柱从细菌裂解液的上清液中纯化目标蛋白；
3)以纯化后的目标蛋白免疫豚鼠，并在免疫结束后获取豚鼠血清；
4)通过抗原亲和纯化方法，从豚鼠血清中纯化SOX10抗体。
本发明还公开了一种豚鼠SOX10多克隆抗体在标记中枢神经系统少突胶质谱系细胞方法的应用。
本发明还公开了一种豚鼠SOX10多克隆抗体的用途：
所述豚鼠SOX10多克隆抗体特异性标记中枢神经系统的少突胶质系细胞与周围神经系统的施旺细胞；在少突胶质细胞与施旺细胞发育、髓鞘形成与维持、脱髓鞘相关疾病、脑肿瘤的神经科学研究，以及相关疾病的诊断中具有重要的用途。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例：
1)首先需要获取GST-SOX10的融合片段。该片段包含谷胱甘肽转移酶GST的全长序列和小鼠SOX10的307aa-466aa片段所对应的DNA序列。通过重叠延伸PCR技术，可将两个DNA片段拼接在一起。其中，GST片段来自pGEX-4T1质粒。引物设计如下：
GST-F:5-CTACTAGCTAGCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGG-3
GST-SOX10-F:5-CCTCCAAAATCGGATccaggccatgtgggtagctactcg-3
GST-SOX10-R:5-tacccacatggcctggATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCC-3
SOX10-R:5-gtcttggcCGAGCTCTTAaaactggggtcgtgagatggaggg-3
用引物GST-F和GST-SOX10-R做PCR，模板为质粒pGEX-4T1(Addgene,#27458001)，进行PCR-1#扩增，目标产物约680bp。用引物GST-SOX10-F和SOX10-R为引物，模板为成年小鼠脑总RNA提取物经逆转录后得到的cDNA，进行PCR-2#扩增，目标产物约320bp。2次PCR均为30uL体系，5个循环。酶采用TAKARA公司的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(#R050Q)，扩增体系参考DNA聚合酶说明书。PCR-1#,PCR-2#结束之后，以这两份PCR产物作为模板(用量为1uL/30uL体系)，以GST-F和SOX10-R为引物，进行第三轮PCR反应，即为PCR-3#。PCR反应体系同上，但扩大为60uL，循环数设定为30，目标片段大小约960bp。扩增结束后，PCR-3#产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，之后通过胶回收试剂盒纯化目标片段(50uL水洗脱产物)。该DNA片段即为GST-SOX10。目标片段经NheI和SacI双酶切(酶购自Thermo,#FD0974,#FD1133)，体系50uL,胶回收产物43uL,Buffer 5uL,两种内切酶各1uL，37℃孵育过夜。DNA Clean-Up试剂盒回收酶切后的PCR产物至30uL去离子水，备用。
2)接着，对载体
E1(北京全式金生物技术股份有限公司，#CE111-01)进行NheI、SacI双酶切，即质粒2ug，50uL体系，内切酶每种2.5uL，37℃孵育过夜。1％琼脂糖凝胶电泳，通过胶回收试剂盒纯化约5.7kb的目标片段(30uL水洗脱产物)。将该片段与前述GST-SOX10片段进行连接：载体片段1uL,GST-SOX10双酶切片段5uL，去离子水2.5uL,Ligase Buffer 1uL，T4 Ligase 0.5uL。室温连接30min，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。次日，挑单克隆菌落测序。测序正确的克隆可接种培养后提取质粒。即获取pEASY-GST-SOX10质粒。该质粒在T7启动子的驱动下，当加入IPTG作为诱导物时，可以表达GST-SOX10融合蛋白，且其N端带有6x His标签可用于纯化。
3)前述质粒提取后，转入大肠杆菌BL21(DE3)中。挑单克隆菌，接入200ml LB培养基中，37℃，200rpm培养10小时，之后加入200uL的1mol/L IPTG室温诱导表达过夜。次日离心收集菌体。10mL PBS重悬菌体，超声破碎菌体(160W,超声2秒,停2秒，共10分钟)。补充PBS至40mL，12000rpm离心10分钟。上清经Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒(上海生工，C600332)纯化，得到目标蛋白5mL。取纯化后的蛋白10uL,加入3uL 5x Western blot上样缓冲液，加热后进行10％SDS-PAGE电泳。电泳结束后通过考马斯亮蓝R-250染色检测样品纯度。结果如图2所示。经测定，该蛋白样品浓度为0.5mg/mL。所用试剂盒的操作步骤参考试剂盒提供的说明书.
4)取目标抗原蛋白样品500uL，与等体积弗氏完全佐剂混合后进行乳化，每只2月龄豚鼠注射500uL乳化物。此后每隔2周免疫一次，剂量与首次相同，共免疫5次，但之后4次佐剂均使用弗氏不完全佐剂。末次免疫后3天取豚鼠全血，离心收集血清。
4)制备抗原亲和柱。所使用的原料为CNBr活化琼脂糖(上海生工，C500099)，操作步骤见试剂说明书。用量为每1mL活化琼脂糖偶联1mg抗原蛋白。将5mL豚鼠血清与制备好的抗原亲和填料混合后室温孵育1小时，去除多余血清后，将填料用PBS清洗2次。抗体经1mLpH2.5的0.1M醋酸缓冲液洗脱后，用pH8.0的1mol/L Tris缓冲液中和至pH7.5。抗体测定浓度后，加入PBS调整为终浓度2mg/ml，加等体积甘油后保存备用。
5)取冰冻切片的小鼠神经组织，以及培养皿中体外培养的大鼠原代少突胶质前体细胞，进行免疫荧光实验。实验步骤为常规的冰冻切片免疫荧光(IF-Fr)和细胞面荧光(ICC)实验步骤。实验结果见图3-图7。由图3可知，SOX10和SOX9共同标记脊髓中的少突胶质前体细胞(白色箭矢所示)，而SOX9还标记神经前体细胞和星形胶质细胞(白色三角箭头所示)，周围神经系统的背根神经节中的施旺细胞则只表达SOX10。SOX9和SOX10免疫荧光信号并不完全重叠，也进一步证明了这两个抗体的特异性，即他们不会识别各自的同源蛋白。由图4可见，SOX10只标记小鼠大脑皮层中少突胶质谱系细胞，完全不标记ALDH1L1+的星形胶质细胞。图5和图6分别表示SOX10标记的正常小鼠脑组织和胶质瘤脑组织中的SOX10表达情况。图7则表明几乎所有体外培养的PDGFRA+少突胶质前体细胞都表达SOX10。以上这些结果，证明了本发明所述方法获得的豚鼠SOX10抗体的特异性和有效性，即能够在体内体外准确的标记SOX10+少突胶质谱系细胞以及施旺细胞。
同时，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种豚鼠SOX10多克隆抗体，其特征在于：抗体为SEQ ID NO.1所示核酸序列对应的蛋白产物作为抗原。
2.如权利要求1所述的一种豚鼠SOX10多克隆抗体，其特征在于：所述抗体为特异性识别SOX10的多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的一种豚鼠SOX10多克隆抗体，其特征在于：所述抗体为豚鼠来源的SOX10的多克隆抗体。
4.如权利要求1、2或3所述的一种豚鼠SOX10多克隆抗体，其特征在于：所述抗体经抗原亲和纯化。
5.如权利要求1所述的一种SOX10豚鼠多克隆抗体，其特征在于：所述抗体特异性识别小鼠、大鼠、狗、鸡与人的SOX10蛋白，不识别SOX10的同源物SOX9与SOX8。
6.一种制备如权利要求1所述的豚鼠SOX10多克隆抗体的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)将小鼠SOX10的C端片段对应的DNA片段与谷胱甘肽转移酶GST的DNA片段融合，再克隆到原核表达载体pEASY中，提取质粒后转入包含λ噬菌体DE3区的大肠杆菌BL21表达菌株中，IPTG诱导携带6xHis标签的目标蛋白表达；
2)通过镍柱从细菌裂解液的上清液中纯化目标蛋白；
3)以纯化后的目标蛋白免疫豚鼠，并在免疫结束后获取豚鼠血清；
4)通过抗原亲和纯化方法，从豚鼠血清中纯化SOX10抗体。
7.一种如权利要求1所述的豚鼠SOX10多克隆抗体在标记中枢神经系统少突胶质谱系细胞方法的应用。
8.一种如权利要求1所述的豚鼠SOX10多克隆抗体的用途，其特征在于：
所述豚鼠SOX10多克隆抗体特异性标记中枢神经系统的少突胶质系细胞与周围神经系统的施旺细胞；在少突胶质细胞与施旺细胞发育、髓鞘形成与维持、脱髓鞘相关疾病、脑肿瘤的神经科学研究，以及相关疾病的诊断中具有重要的用途。
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