CN103282487A

CN103282487A - 分化的体细胞向神经胶质细胞的细胞命运转化

Info

Publication number: CN103282487A
Application number: CN2011800624828A
Authority: CN
Inventors: 保罗·J·特萨; 罗伯特·H·米勒; 法迪·J·纳杰姆
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2013-09-04
Also published as: US9487757B2; WO2012058243A2; EP2633035A2; SG189844A1; US20180051259A1; CA2815222A1; EP2633035A4; US20120100615A1; US10119123B2; WO2012058243A3; IL225627A0

Abstract

本发明涉及分化的体细胞，如来自胚胎中胚层的那些分化的细胞，向神经胶质细胞的重编程。从这种重编程产生的神经胶质细胞在功能上与来自外胚层来源的神经胶质细胞等同。

Description

分化的体细胞向神经胶质细胞的细胞命运转化

相关申请的交叉参考

本申请要求转让给本申请的受让人的2010年10月26日提交的美国临时专利申请第61/406,670号的权益，并且该临时专利申请通过引用并入本文。

政府资助研究的声明

本发明部分地由美国国立精神卫生研究所(National Institute of MentalHealth，NIMH)支持，基金号为R21MH087877-01。

发明领域

本发明涉及重编程分化的体细胞为神经胶质细胞的领域。

发明背景

在下面的讨论中，将为了背景和介绍目的描述某些文章和方法。本文中所含的内容不被解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当时，证明本文引用的文章和方法在适用的法律条文下并不构成现有技术的权利。

多发性硬化症(MS)是复杂的神经疾病，其特征在于中枢神经系统(CNS)髓鞘的恶化。髓鞘是绝缘材料，主要由脂类组成，保护神经纤维-轴突，轴突在全身传递电脉冲。在MS中轴突的脱髓鞘化导致轴突退化和神经元细胞死亡，但更具体地，MS毁坏少突神经胶质细胞，所述少突神经胶质细胞是产生和保持髓鞘的特化的神经胶质细胞。

少突神经胶质祖先在发育中的大脑的腹侧区中从神经胶质祖先产生。少突神经胶质祖先活跃地迁移和增殖，填充CNS，最后成熟以靶向并延长沿轴突的髓鞘。然而，少突神经胶质祖先的亚群，保持作为停留的、未分化细胞，在髓鞘是否被损坏或恶化方面起作用。

当T-细胞穿过血脑屏障并攻击包被CNS轴突的髓鞘时，患有MS的人们遭受攻击。这种破坏应该诱导少突神经胶质祖先亚群的成熟，所述少突神经胶质祖先保持在CNS中以修复损坏的髓鞘。然而，相反，已经发现在髓鞘损坏之后，患有MS的人们的少突神经胶质祖先不趋向于成熟为少突神经胶质细胞，导致了不足够的髓鞘修复。

已经建议细胞移植疗法以治疗神经退行性疾病如MS、大脑性瘫痪和帕金森氏病；而基于细胞的疗法的广泛应用依赖于充足量的合适类型的，例如，少突神经胶质祖细胞(oligodendrocyte progenitor cell)的可得性。一种提供这些细胞的可能性是使用胚胎干细胞，如，参看Bjorklund等Nat.Neurosci.3：537-44(2000)(与帕金森氏病有关的研究)。胚胎干细胞能被扩增到实质上无限的数量并有在培养中产生所有类型细胞的潜能；然而，除了其他以外，基于胚胎干细胞的疗法被由于在患者和供体之间的免疫不相容性的免疫排斥反应而复杂。可选地，由体细胞核转移成功地产生克隆的干细胞创造了产生遗传上相同的“定制”细胞的可能性，通过使用来自患者的供体细胞作为细胞核的来源，因此消除了免疫抑制的要求(参看Hochedlinger等，N.Engl.J.Med.349：275-86(2003)；然而，细胞核转移方案的技术和逻辑障碍使在人类中体细胞核转移的实际实现变得复杂。

不被患者免疫不相容性而复杂化的神经胶质细胞的群体的大量生产将在CNS髓鞘化、疾病建模和药物筛选的研究方面证明是无价的。更重要的，在基于细胞的疗法中使用这些细胞促进髓鞘再生在再生医学中有巨大的意义。本发明提供这种神经胶质细胞，和产生它们的方法。

发明概述

本概述的提供是为了介绍一系列简化形式的概念，所述简化形式的概念将进一步在下面的发明详述中描述。本概述并不意图鉴定所请求保护主题的关键或必需的特征，也不意图用于限制所请求保护主题的范围。所请求保护的主题的其他的特征、细节、用途和优点将从下面书面的发明详述中明显，包括在附图描述的和在所附的权利要求书中定义的那些方面。

本发明涉及分化的体细胞向神经胶质细胞的重编程。从这一重编程产生的神经胶质细胞在功能上与来自外胚层来源的神经胶质细胞等同。重编程分化的体细胞以产生神经胶质细胞的群体的能力在CNS髓鞘化、疾病建模、药物筛选和更重要地再生医学的研究方面具有巨大的意义。这样，本发明的一个实施方案提供生产神经胶质细胞的方法，包括：提供来自哺乳动物患者或受治疗者的体细胞；培养所述体细胞；以及在所述培养的体细胞中表达一种或多种重编程因子，来产生神经胶质细胞的群体。

在本发明的一个方面，重编程因子包括选自Ascl1、Cenpa、Chd7、Creb312、E2f8、En2、Esco2、Etv6、Fen1、Foxn3、Gm98(MRF)、Grlf1、Gsx1、Hr、Klf13、Lbr、Lcor、Lcorl、Lig1、Mcm2、Mcm5、Mcm6、Mitf、Mybl1、Mycl1、Myt1、Ncor1、Nkx2-2、Nkx6-2、Nr2c1、Olig1、Olig2、Onecut2、Rbpjl、Rev31、Sox10、Sox6、Sox8、St18、Tcf712、Tcfeb、Tmpo、Top2a、Tox3、Wdhd1、Zfp276、Zfp37、Zfp488、Zfp536、Zfp579、Zfpm1或Zkscan1的一种或多种重编程因子。在其他方面，使用选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的至少两种重编程因子，在又其他方面，使用所有三种重编程因子Sox10、Nkx6.2或Olig2。在其他方面，除了一种或多种重编程因子Sox10、Nkx6.2或Olig2之外，还可以使用一种或多种另外的重编程因子。例如，除了一种或多种重编程因子Sox10、Nkx6.2或Olig2外，还可以使用一种或多种重编程因子Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98。在又其他方面，使用所有三种重编程因子Sox10、Nkx6.2和Olig2，以及使用一种或多种重编程因子Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98。

在本发明的一些方面，患者来源的体细胞选自成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成血细胞、淋巴细胞、和类似细胞。在优选的方面，患者来源的体细胞选自成纤维细胞和成血细胞。在本发明的一些方面，通过递送驱动一种或多种重编程因子表达的载体给体细胞，将重编程因子提供给体细胞。在这方面的优选的方法中，使用慢病毒载体将重编程因子递送给体细胞，在某些方面，载体是可诱导的载体。

在本发明的某些方面，该方法还包括在递送或诱导步骤之后的分选步骤，来从未诱导的、非重编程的体细胞分选诱导的神经胶质细胞的群体，从而产生富集的重编程的神经胶质细胞的群体。在本发明的一些方面，分选步骤通过使用对患者来源的体细胞或对重编程的神经胶质细胞特异的一种或多种标志物实现。在某些方面，对神经胶质细胞特异的一种或多种标志物用于分选，例如，蛋白脂质蛋白质1(PLP-1)、Ki67、A2B2、A2B5、血小板衍生的生长因子受体α(PDGFα)受体、SOX10、Olig1、硫酸软骨素蛋白聚糖Ng2、髓鞘碱性蛋白质(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)、GRM5、CD133、CLN11、ERBB3、ERBB4、TNR或半乳糖脑苷脂(O1、GalC)、和类似标志物。在本发明的又其他方面，分选步骤通过选择标记实现。另外地或可选地，用于转录因子如SOX10和Olig1的报道基因可以用来分离重编程的神经胶质细胞。

在本发明的又另外的方面，该方法还包括在诱导步骤之后扩增诱导的、培养的、患者来源的体细胞，或者在分选步骤之后扩增分选的重编程的神经胶质前体细胞的步骤。

在另一方面，本发明提供由任何前述的方法产生的神经胶质细胞的群体。神经胶质细胞的群体的特征在于，群体中至少5％、8％、10％、15％或更多的细胞表达神经胶质特异的细胞标志物，富集的神经胶质细胞的群体的特征在于，富集的群体中的至少20％、30％、40％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的细胞表达神经胶质特异的细胞标志物。在一方面，通过重编程因子Sox10、Nkx6.2和Olig2诱导患者来源的体细胞，接着，在音猬因子(sonic hedgehog)、头蛋白(noggin)、胰岛素样生长因子、神经营养因子3和/或三碘甲状腺原氨酸存在下培养来进一步分化。在某些方面，神经胶质细胞是星形胶质细胞(astrocyte)、星形胶质(astroglia)或少突神经胶质细胞，在其他方面，神经胶质细胞是少突神经胶质祖细胞。

在本发明的又另一个方面，提供产生少突神经胶质祖细胞的方法，包括：提供来自患者的成纤维细胞；培养成纤维细胞；递送驱动一种或多种重编程因子表达的载体给成纤维细胞，所述一种或多种重编程因子选自Sox10、Nkx6.2、Olig2、Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98；在培养的成纤维细胞中诱导一种或多种重编程因子表达以产生诱导的成纤维细胞，从而诱导诱导的成纤维细胞的群体重编程以产生少突神经胶质祖细胞的群体。在本发明的一个方面，重编程因子包括选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的一种或多种重编程因子。在其他方面，使用选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的至少两种重编程因子，在又其他方面，使用所有的重编程因子Sox10、Nkx6.2或Olig2。在其他方面，除了选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的一种或多种重编程因子外，可以使用一种或多种另外的重编程因子。例如，除了一种或多种重编程因子Sox10、Nkx6.2或Olig2外，可以使用重编程因子Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98中的一种或多种。在又其他方面，使用所有三种重编程因子Sox10、Nkx6.2和Olig2，和使用重编程因子Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98中的一种或多种。

本发明的其他方面包括包含本发明的重编程的神经胶质细胞的药物制剂、诊断工具和研究工具。

附图说明

图1表示根据本发明的一个方面的一种方法的简化反应步骤。

图2A-E是从进行根据本发明的方法得到的结果的图。

定义

本文中所用的术语意图具有如本领域普通技术人员理解的简单和普通的意思。除非特别指出，否则下面的定义目的是帮助读者理解本发明，但不是意图改变或者以其他方式限制这些术语的意思。

术语“星形胶质细胞”和“星形胶质”指将神经元锚定于它们的血液供应的神经胶质细胞。本发明的星形胶质细胞指原浆型和纤维性星形胶质细胞二者。原浆型星形胶质细胞有短的、厚的、高分支的突起并典型地见于灰质中。纤维性星形胶质细胞具有长的、薄的、少分支的突起并更通常见于白质中。本发明的星形胶质细胞特征在于，表达一种或多种标志物-神经胶质细胞纤维酸性蛋白质(GFAP)、S100beta、谷氨酰胺合成酶、GLAST或GLT1，并具有选自结构性星形胶质细胞表型或功能性星形胶质细胞表型的至少一种星形胶质细胞表型。星形胶质细胞的结构性表型包括圆型细胞核、“星形”体和许多长的突起，所述许多长的突起作为血管脚踏板在CNS小血管上结束。结构性星形胶质细胞表型的另外例子可以在下面的材料中发现：Reynolds和Weiss，Science255：1707-1710(1992)；Reynolds等，J.Neurosci.12：4565-4574(1992)；和Kandel等(1991)，Principles ofNeuroscience(第三版)(Appleton&Lange)。

“结合剂”是通过化学或物理方式结合的与特定的细胞命运的细胞上的一个或多个区域互补的任何分子。为了本发明的目的，结合剂优选与对特定的细胞命运的细胞独特的细胞表面分子或细胞内蛋白质或部分选择性相互作用，所述特定的细胞命运的细胞例如，少突神经胶质前体细胞(OPC)。能使用本发明研究和/或鉴定的结合剂的例子包括，但不限于：肽、蛋白质(包括衍生的或标记的蛋白质)；抗体或其片段；小分子；适体；碳水化合物和/或其他非蛋白质结合部分；天然存在的结合伴侣的衍生物和片段；肽模拟物和药效团。

在本文使用的术语“生物过程”包括正常生理过程，如髓鞘再生、神经保护等，以及病理过程，如在疾病和疾患中涉及的那些，如自身免疫性疾病、神经退行性疾病、涉及遗传功能障碍的疾病、等等。

在本文使用的术语“诊断工具”指为了对患者样品进行诊断试验或测试，使用的本发明的任何组合物或测试。作为诊断工具，本发明的神经胶质细胞组合物可以被认为是分析物特异性试剂的集合，这样可以形成被联邦或州机构批准的诊断测试的部分。本发明组合物作为诊断工具的用途不意味着与组合物在治疗剂开发中的任何用途有关。

在本文使用的术语“体细胞起源的分化的细胞”或“分化的体细胞”或“体细胞”指起源于胚胎的中胚层、内胚层和外胚层的细胞，包括骨、软骨、肌肉、结缔组织、皮肤、血管组织和生殖、排泄和泌尿生殖系统的某些细胞。

在本文使用的术语“分化因子”指促进体细胞分化或重编程的任何因子或因子的组合，可以包括，例如，至少一种编码转录因子的核酸序列，包括但不限于SOX10、Nxk6.2、Nxk2.2、Olig1、Olig2、ST18、MYT1或GM98。

术语“赋形剂”指加入到药物组合物中的进一步促进细胞的施用的惰性物质。赋形剂的例子，包括但不限于盐水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

术语“神经胶质细胞”和“神经胶质”是非神经元细胞，它提供支持和营养，维持内稳态，形成髓鞘，参与神经系统中的信号传递。本发明的神经胶质细胞的例子包括但不限于星形胶质细胞和少突神经胶质祖细胞(OPC)、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞。本文所用的术语“神经胶质细胞”指神经胶质谱系的完全分化的细胞，如少突神经胶质细胞和星形胶质细胞、以及完全分化的神经胶质细胞的前体，如OPC。

如本文使用的，“可诱导启动子”是能响应于“调节剂”(例如，强力霉素)或刺激如热，直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因(例如，重编程因子的基因)的转录的启动子。当不存在“调节剂”或刺激时，DNA序列或基因将不被转录。术语“不被转录”或“实质上不被表达”意思是转录水平比在合适的刺激或调节剂存在下观察到的转录水平低至少50倍；优选地，比在合适的刺激或调节剂存在下观察到的转录水平低至少100倍、250倍、或500倍。

如在本文使用的，术语“慢病毒”指一组(或科学上的属)逆转录病毒，它们具有将病毒DNA或有效载荷并入宿主基因组的能力。

术语“少突神经胶质细胞”指成熟的、充分分化的少突神经胶质细胞。成熟的少突神经胶质细胞可以根据结构和功能表型与少突神经胶质祖细胞区分。成熟的少突神经胶质细胞功能表型的例子包括，但不限于一种或多种标志物的表达，如蛋白脂质蛋白质(PLP)和髓鞘碱性蛋白质(MBP)表达、髓鞘相关的糖蛋白(MAG)、髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)、还有半乳糖脑苷脂(O1、GalC)。成熟的少突神经胶质细胞结构表型的例子包括，但不限于，分支的和分叉的表型和髓鞘膜的形成。

本文所用的术语“少突神经胶质祖细胞”和“OPC”指具有分化成少突神经胶质细胞的能力的细胞。少突神经胶质祖细胞可以通过结构和功能表型与少突神经胶质细胞区分。OPC功能表型的例子包括，但不限于，有丝分裂的细胞(即在培养中能分裂和被扩增三或更多代)，具有迁移能力，以及在体内和体外分化成髓鞘化表型来实现髓鞘化的潜能。

如本文使用的，术语“调节剂”指化学试剂或生物分子，如代谢物、小分子，或生理或环境条件如热或冷。含有可诱导启动子的重组细胞可通过向细胞或生物体外部地施加试剂或刺激于，或通过暴露于合适的环境条件或生物分子，来暴露于调节剂或刺激。可诱导启动子基本上只在调节剂或刺激存在下起始转录。可诱导启动子的例子包括四环素响应元件和从β-干扰素基因、热休克蛋白基因、金属硫蛋白基因衍生的启动子或从类固醇激素响应基因衍生的启动子。

在本文中使用的，术语“重编程(reprogram)”或“重编程(reprogramming)”指改变体细胞的分化的状态来采取替换的细胞状态的身份和功能的过程。

在本文使用的术语“研究工具”指用于学术的或商业的性质的科学查询的本发明的任何神经胶质细胞组合物或测试，包括药物和/或生物治疗剂的开发。本发明的研究工具不意味着治疗性的或受到监管部门的批准；而是，本发明的研究工具意味着促进研究并帮助这些开发活动，包括目的是产生支持监管意见书的信息而进行的任何活动。

如在本文中使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和类似术语，指获得所希望的药理和/或生理效果。这种效果可以是在完全地或部分地阻止疾病或其症状方面是预防性的，和/或可以是在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响方面是治疗性的。本文所用的“治疗”，包括在哺乳动物，优选地在人类中的疾病的任何治疗，包括(a)阻止受治疗者发生疾病，这个受治疗者可能易患疾病但还没有诊断有疾病；(b)抑制疾病，即阻止它的发展；和(c)缓解疾病，例如，引起疾病的倒退以完全或部分的去除疾病症状。

术语“载体”指病毒或非病毒的载体核酸分子(通常是DNA分子)，出于引入宿主细胞的目的，目的核酸序列能被插入所述载体中。“表达载体”是特化的载体，其含有在宿主细胞中表达目的核酸序列所需的必需的调节区域。在大多数方面，目的核酸序列，如在本文描述的一种或多种重编程因子，与载体中的另外的序列可操作地连接。术语“可操作地连接”意思是对分化因子的表达必需的调节序列被放置在载体中的合适的位置，从而实现编码序列的表达。

如在本文中使用的，已经耗尽表达非神经胶质细胞的标志物的细胞的细胞的群体指经历了选择过程或重编程过程的细胞的群体，所述选择过程或重编程过程从神经胶质细胞的群体除掉了至少一些体细胞。这种选择过程可以通过保留神经胶质细胞的存活力的任何合适的方法来实现。优选地，耗尽的群体含有少于95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％或少于0.1％的非神经胶质细胞。而且，可以对重编程的神经胶质细胞的群体进行细胞分选来产生含有少于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％或少于0.1％的非神经胶质细胞的富集的重编程的神经胶质细胞的群体。

发明详述

本文所描述的技术的实践，除非另外指明，可以使用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。这些常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、以及使用标记物的杂交的检测。合适的技术的具体的示例可以参考本文的实施例。然而，当然，其他相当的常规的操作步骤也可以使用。这些常规的技术和描述可以在标准的实验室手册中发现，如Butler(2004)，Animal Cell Culture(BIOSScientific)；Picot(2005)，Human Cell Culture Protocols(Humana Press)，Davis(2002)，Basic Cell Culture，第二版(Oxford Press)；Lanza等(编著)(2009)，Essentials of Stem Cell Biology，第二版(Elsevier Academic Press)；Lanza，(编著)(2009)，Essential Stem Cell Methods(Elsevier Academic Press)；Loring等(编著.)(2007)，Human Stem Cell Manual(Elsevier Academic Press)；Freshney(2010)，Culture of Animal Cells(John Wiley&Sons)；Ozturk和Hu(2006)，Cell Culture Technology for Phamaceutical and Cell-BasedTherapies(CRC Press)；Sambrook和Russell(2006)，Condensed Protocolsfrom Molecular Cloning：A Laboratory Manual；以及Sambrook和Russell(2002)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(均来自Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Stryer，L.(1995)Biochemistry，第四版(W.H.Freeman)；Gait(1984)，″Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach″(IRL Press)；Nelson和Cox(2000)，Lehninger，Principles ofBiochemistry，第三版(W.H.Freeman)；和Berg等(2002)Biochemistry，第五版(W.H.Freeman)；所有的参考书为了所有目的通过引用全文并入本文。

注意，在本文和所附的权利要求书中，单数形式″一(a)″、″一(an)″和″该(the)″包括复数形式指代物，除非上下文另外清楚地指明。另外，提及“分选”或“诱导”包括本领域技术人员已知的等效步骤和方法的提及，等等。

除非另外指出，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。在本文提到的所有出版物为了描述和公开可以与目前描述的发明关联的设备、制剂和方法的目的通过引用并入。

当提供数值的范围时，应理解，在该范围的上限和下限之间的每一个其间的数值，和该指定的范围中的任何其他指定的或其间的数值，都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，对于指定范围中任何具体地排除的限值，也被包括在本发明中。当指定的范围包括一个或两个限值时，排除这些包括的限值的一个或两个的范围也包括在本发明中。

在下列描述中，列出很多具体的细节来提供对本发明的更全面地理解。然而，对本领域技术人员来说这是明显的：本发明可以没有这些具体的细节之一或更多也可以实施。在另外的例子里，为了避免模糊本发明，没有描述本领域技术人员公知的公知特征和操作步骤。

本发明涉及分化的体细胞-如来自中胚层的那些分化的细胞-向神经胶质细胞的重编程。从这样的重编程产生的神经胶质细胞功能上等同于来自外胚层来源的神经胶质细胞。将分化的体细胞重编程来产生神经胶质细胞的群体的能力在CNS髓鞘化、疾病建模、药物筛选的研究具有巨大的意义，更重要地，用于再生医学中。

图1显示根据本发明的一个方面的方法100的简化的反应步骤。简单地说，在第一步中，体细胞样品从哺乳动物受治疗者或患者获得110。在第二步，培养患者来源的体细胞样品120。接着，将一种或多种重编程因子递送到培养的体细胞中130。然后在患者来源的体细胞中诱导重编程因子的表达，于是将体细胞重编程为神经胶质细胞140。然后任选地分选被诱导的、培养的、重编程的患者来源的体细胞以允许扩增150，然后任选地分选整个细胞群体来从诱导的重编程的神经胶质细胞中分离未被诱导、非重编程的体细胞，产生富集的神经胶质细胞的群体160。然后诱导的、重编程的神经胶质细胞的群体可以用于基于细胞的治疗、或药物筛选、髓鞘化或疾病建模实验170。

详细看一看方法100的各步，第一步110要求收集患者来源的细胞样品。本发明的方法产生来自患者自己的细胞的重编程的细胞的群体，因此，消除了与免疫不相容性相关的并发症。患者来源的体细胞样品可以从皮肤、结缔组织、血液或骨髓中收集，其中，样品收集技术是本领域已知的。本领域技术人员将领会并理解所要求的样品的特殊类型的选择和样品制备的合适的程序(参见，例如，Tietz，Burtis等(编著)(2006)Textbook ofClinical Chemistry and Molecular Diagnostics(第四版)；Venkatesh Iyengar，等(1998)Element Analysis of Biological Samples：Priniciples and Practices；以及Wells，D.(2002)，High Throughput Bioanalytical Sample Preparation(Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis)，各通过引用并入)。

第二步120包括培养患者来源的体细胞，优选在体外。细胞培养技术是本技术公知的，并参考教科书如Butler(2004)，Animal Cell Culture(BIOSScientific)；Picot(2005)，Human Cell Culture Protocols(Humana Press)；Davis(2002)，Basic Cell Culture，第二版，(Oxford Press)；Freshney(2010)，Cultureof Animal Cells(John Wiley&Sons)；以及Ozturk和Hu(2006)，Cell CultureTechnology for Phamaceutical and Cell-Based Therapies(CRC Press)。例如，来自皮肤的原代成纤维细胞的培养典型地包括在BME成纤维细胞培养基或DMEM(Dulbecco’s MEM)和胶原酶或胰蛋白酶(大约6∶1比例)中切碎组织样品，于37℃将浆状物放置于试管中14-24小时，以600g离心试管10分钟，去除上清液，将细胞团重新悬浮于细胞培养基中，并将重新悬浮的细胞置于密封的细胞培养烧瓶中，在CO₂温箱中于37℃过夜。第二天，松开烧瓶的盖子以将培养基暴露于CO₂气氛中，然后允许细胞生长，并如所需地更换培养基和分开细胞。

在第三步130中，将一种或多种重编程因子递送到培养的患者来源的体细胞。常规的基于病毒和非病毒的基因传递方法能被使用来将编码重编程因子的核酸体外引入体细胞。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸核酸、能直接被翻译的修饰的RNA分子、以及与递送传递工具如泊洛沙姆和脂质体复合的核酸。非病毒递送编码本文提供的重编程因子的核酸的方法包括脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒小体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸DNA、人造病毒粒子和试剂增强的摄取DNA。脂质转染在例如美国专利5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述，脂质转染试剂商业上有售(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适于多核苷酸的有效的受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括在Felgner，WO91/17424和WO91/16024中公开的。另外，蛋白质能被直接转染进细胞。在又另一个替代方案中，试剂如小分子可以被递送到患者来源的体细胞中，刺激重编程因子的内源性产生。

脂质：包括靶向的脂质体如免疫脂质复合物的核酸复合物的制备，是本领域技术人员公知的(参见，例如，Crystal，Science270：404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy等，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy2：710-722(1995)；Ahmad等，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美国专利4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。

可选地，使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码重编程因子的核酸利用了将病毒靶向细胞并将病毒有效载荷运输到细胞核的高度进化的过程。各种病毒递送工具，如本领域已知的，能被用来将核酸(例如，编码分化因子的核酸)引入细胞。递送工具的选择依赖于多项因素，包括但不限于被传递的核酸的大小和所希望的靶标细胞。用于递送核酸如本文的方法中将要递送的重编程因子的常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯泡疹病毒载体。病毒载体当前是在靶标细胞中的基因转移的最有效的并且是通用的方法。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的基因转移方法整合到宿主基因组中是可能的，通常导致插入的转基因的长期表达。

逆转录病毒的向性能通过被掺入外来包膜蛋白而改变，扩展靶标细胞的潜在的靶标群体。慢病毒载体是能转导或感染非分裂细胞并典型的产生高病毒滴度的逆转录病毒。逆转录病毒载体包括顺式作用长末端重复序列，具有达6-10kb外来序列的包装能力。最小的顺式作用LTR对于载体的复制和包装是足够的，随后用于将治疗基因整合进靶标细胞来提供永久性的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下的那些：鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)、以及它们的组合。

慢病毒递送工具在，例如，美国专利6,312,682和6,669,936和美国专利申请公布2002/0173030中描述，并能用于，例如，将转基因引入成纤维细胞和其它的细胞。如所述的，慢病毒能将它们的RNA基因组的DNA拷贝整合进宿主细胞的基因组。参见，例如，Ory等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：11382-11388(1996)；Miyoshi等，J.Virology72：8150-8157(1998)；Dull等，J.Virol.72：8463-8471(1998)；Zuffery等，J.Virol.72：9873-9880(1998)；Follenzi等，Nature Genetics25：217-222(2000)以及Delenda，J.Gene Medicine6：S125-S138(2004)。在某些慢病毒工具中，这种整合功能已被禁止产生非整合慢病毒工具。参见，例如，Poon等，J.Virology77：3962-3972(2003)；以及Vargas等，Human Gene Therapy15：361-372(2004)。用于转导造血干细胞的整合和非整合慢病毒载体的使用描述在Haas等，Mol.Therapy2：71-80(2000)中，用于转导成纤维细胞的慢病毒载体的使用描述在：Ieda等，Cell142：375-86(2010)和Vierbuchen等Nature463：1035-41(2010)中，二者均通过引用全文并入。

重组的腺相关的病毒载体(rAAV)的使用是对慢病毒系统的可选的基因传递系统，并且是基于缺陷的和非致病性的细小病毒的腺相关的2型病毒。载体衍生自仅保留转基因表达盒侧翼的AAV145bp反转末端重复序列的质粒。由于整合进被传导的细胞的基因组，有效地基因转移和稳定的转基因递送是这个载体系统的关键特征。(参见Wagner等，Lancet351：91171702-3(1998)，以及Keams等Gene Ther.9：748-55(1996))。复制缺陷型重组腺病毒载体可以被工程化，以至于转基因代替了腺病毒E1a、E1b和E3基因；接下来，复制缺陷型载体在人类293细胞中繁殖，所述人类293细胞反向地提供已缺失的基因功能。腺病毒载体能在体外转导多种类型的组织，包括非分裂的、分化细胞，如在肝、肾和肌肉系统组织中发现的那些细胞。常规的腺病毒载体具有大的运载容量。

单纯泡疹病毒工具，其能在神经元和神经节中长期地表达，已被描述并也可以用于将重编程因子递送到受治疗者或患者来源的体细胞中。参见，例如，Krisky等，Gene Therapy5(11)：1517-1530(1998)；Krisky等GeneTherapy5(12)：1593-1603(1998)；Burton等Stem Cells19：358-377(2001)；以及Lilley等，J.Virology75(9)：4343-4356(2001)。

使用包装细胞来形成能感染宿主细胞如成纤维细胞的病毒颗粒。这样的细胞包括293细胞和Psi2细胞或PA317细胞。病毒载体通常由生产者细胞系产生，所述生产者细胞系将核酸载体包装到病毒颗粒中。载体典型的含有包装和接下来的整合进宿主所需的最小病毒序列，其他病毒序列被用于要表达的分化因子的表达盒替换。丢失的病毒功能被包装细胞系反向地提供。

考虑用于本发明方法的重编程因子包括SOX-10、Nkx6.2、Olig2、Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或MRF。转录因子SOX-10是在人类中的蛋白质，由SOX10基因编码。SOX10基因编码参与胚胎发育的调节和细胞命运的确定的SOX(SRY-相关的HMG-盒)家族的转录因子的成员。编码的蛋白质可以在与其他蛋白质一起形成蛋白质复合物之后作为转录激活剂。SOX-10作为核质穿梭蛋白作用并对于神经嵴和外周神经系统的发育是重要的。Nkx6.2或相关的NK6转录因子、locus2(还称为NKX6B、NKX同源盒2、和GTX)，表明参与少突神经胶质细胞髓鞘化的调节。Olig2是少突神经胶质细胞转录因子2，一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子。Olig2的表达主要局限在CNS并且是腹侧神经外胚层祖细胞系命运的调节物，并可以是少突神经胶质细胞和运动神经元发育所需的。Olig1是少突神经胶质细胞转录因子1，也是基本的螺旋-环-螺旋转录因子。

Nkx2.2或相关的NK2转录因子、locus2(还称为NKX2B、同源盒蛋白质NK-2同源B)是含同源盒结构域的蛋白质并且可以参与中枢神经系统的形态发生。而且，这种蛋白质被认为在轴突指导中起作用。ST18还称为抑制致瘤性蛋白质18，一种锌指蛋白质(还称为KIAA0535或ZNF387)，其阻遏来自靶标启动子的基本的转录活性。MYT1，髓鞘转录因子1，是由MYT1基因编码的人类蛋白质，并是神经特异性的、含锌指的结合DNA的蛋白质家族成员。MYT1结合CNS的蛋白脂质蛋白的启动子区域，在CNS的发育中起作用。MRF是髓鞘基因调节因子，还称为Gm98(髓鞘基因调节因子预测基因98)。

在步骤140中，当一种或多种重编程因子已被递送到培养的体细胞时，起始一种或多种重编程因子的表达来诱导将患者来源的体细胞重编程为神经胶质细胞。在本发明的某些方面，要表达的一种或多种重编程因子处在一种或多种组成型启动子的控制下，重编程因子的表达是组成性的，不需被主动地诱导。在本发明的其他方面，一种或多种重编程因子的表达处在可诱导的启动子系统的控制下。可以用来进行本发明方法的可诱导的启动子包括被激素和激素类似物如黄体酮、蜕皮激素和糖皮质激素调节的启动子以及被四环素、热休克、重金属离子、干扰素和乳糖操纵子活化化合物调节的启动子。对于这些系统的综述，参见Gingrich和Roder，Ann.Rev.Neurosci.21：377-405(1998)。组织特异性的表达在基因表达领域已被充分表征，并且组织特异性和其他可诱导启动子是本领域已知的。

在可诱导的表达系统中，一种或多种重编程因子的表达的控制通过将转化或转染有一种或多种重编程因子的患者来源的体细胞接触调节剂(例如，强力霉素)或者其他诱导剂来实现。用调节剂接触患者来源的体细胞诱导一种或多种重编程因子的表达，而调节剂的撤销抑制表达。然而，本领域技术人员应该认识到，在其他可诱导的载体中，相反的情况是正确的，即，调节剂抑制表达并且去除调节剂允许表达。表达的诱导只对重编程过程的某一部分是必需的。尽管表达的诱导必需的时间将随着使用的体细胞类型变化，可取的是在停止诱导刺激物之前，在至少一个亚组的培养的体细胞中检测神经胶质细胞。然而这是在本领域技术人员的能力之内的：通过常规的实验来鉴定用诱导刺激物处理体细胞必需的合适的时间。

当已经实现的在患者来源的体细胞的群体中表达一种或多种重编程因子时-诱导体细胞重编程为神经胶质细胞-重编程的细胞的群体任选地被允许扩增，150。扩增在适于重编程的细胞类型的条件下进行，并适当地补充和更换生长培养基和如所需地分开细胞。

当得到足够的重编程的细胞的群体时，诱导的、重编程的神经胶质细胞可以，任选地，从未被诱导、非重编程的患者来源的体细胞中分选出来160。在一个方面，使用荧光激活的细胞分选器(FACS)对细胞进行分选。荧光激活细胞分选(FACS)是已知的用于基于细胞的荧光性质分离包括细胞的颗粒的方法。参见，例如Kamarch，Methods Enzymol151：150-165(1987)。在单独细胞中荧光部分的激光激活导致小电荷，其允许从混合物中电磁分离正的和负的细胞。例如，用于检测重编程的神经胶质细胞表面上存在的神经胶质细胞抗原决定簇的抗体或配体用荧光染料如FITC或藻红蛋白标记。将细胞与用荧光标记的抗体或配体培养足够的时间段来允许标记的抗体或配体与神经胶质细胞结合。用细胞分选器处理细胞，允许目的细胞从其他细胞中分离。

通过使用对神经胶质细胞特异性的标志物可以实现重编程的神经胶质细胞从非重编程的体细胞分离，该标志物如PLP-1(蛋白脂质蛋白质1、一种跨膜蛋白脂质蛋白质，其是CNS中存在的主要的髓鞘蛋白质)、Ki67增殖标志物、细胞表面标志物A2B2或A2B5、巢蛋白、血小板衍生生长因子α受体、硫酸软骨素蛋白聚糖NG2、髓鞘相关的糖蛋白(MAG)、髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)、GRM5、CD133、CLN11、ERBB3、ERBB4、TNR、以及半乳糖脑苷脂(O1、GalC)、等等。参见例如Roy等，J.Neurosci.19：9986-95(1999)和Windrem等，J.Neurosci.，69：966-75(2002)。另外地或可选地，转录因子的报道基因如SOX10和Olig1可以用来分离重编程的神经胶质细胞。

可选地，在本发明的一些方面，磁珠也可用于从非重编程的体细胞分离重编程的神经胶质细胞。例如，可使用磁激活的细胞分选(MACS)技术从体细胞分选神经胶质细胞，该方法基于细胞与磁珠结合的能力分离细胞。可对磁性微球进行多种有用的修饰，包括抗体的共价加入，该抗体特异地识别神经胶质细胞表面分子或半抗原，其中一些在本文中描述过。然后施加磁场来物理上操作所选的珠子。在特定的方面，将针对神经胶质细胞表面标志物的抗体与磁珠耦合。然后将磁珠与神经胶质细胞培养物混合来允许结合。然后将细胞穿过磁场来分离出具有目的神经胶质细胞表面标志物的细胞。然后这些细胞能被分离和培养来产生富集的重编程的神经胶质细胞的群体。可选地，重编程的神经胶质细胞可以从未诱导的、非重编程的患者来源的体细胞中分选，通过使用各种技术筛选，例如，细胞表面分子或与患者来源的体细胞相关的其他配体的抗体，或使用免疫淘选或经由例如抗生素抗性或其他选择标记来筛选。

当获得重编程的神经胶质细胞的群体时，该细胞可被用于CNS髓鞘化、疾病建模、药物筛选和更重要地，再生医学170。

使用本发明的方法产生的重编程的神经胶质细胞的群体能用于在涉及神经胶质细胞的多种疾病状态、特别是涉及CNS的疾病的研究、开发和治疗干预。典型的疾病在下面详述。

多发性硬化症(MS)，一种CNS的进行性的、神经退行性疾病，最常以复发的/减轻的形式发生，其中，脱髓鞘化阶段之后是功能恢复阶段(Weiner，Ann.Neurol.65：239-248(2009))。恢复阶段包括经由少突神经胶质祖细胞的迁移和成熟的髓鞘再生(Chari，Int.Rev.Neurobiol.79：589-620(2007))。然而，当疾病进行时，随着功能的连续的丧失，不能髓鞘再生(Blakemore和Keirstead，J.Neuroimmunol.98：69-76(1999))。对完整的轴突不能变得髓鞘再生的可能的解释包括少突神经胶质祖细胞向脱髓鞘位点的补充的缺陷或少突神经胶质祖细胞分化成髓鞘化的少突神经胶质细胞的缺陷。虽然研究表明少突神经胶质祖细胞生物学的两个方面在MS中被改变，在成年CNS中协调这些过程的分子机理尚不能完全被理解。

由髓鞘丧失介导的其他病变包括缺血性脱髓鞘病变、发炎性脱髓鞘病变、儿科脑白质营养不良、粘多糖贮积症、围产期胚层出血、大脑性瘫痪、脑室周围白质软化(periventricular leukoinalacia)、辐射诱导的病变、精神疾病，如精神分裂症以及由于各种病因的皮质下脑白质病。缺血性脱髓鞘病变包括皮质中风、腔隙性梗塞、缺氧后脑白质病、糖尿病性脑白质病和高血压性脑白质病。发炎性脱髓鞘病变包括多发性硬化症、谢耳德氏病、横贯性脊髓炎、视神经炎、接种后脑脊髓炎和感染后脑脊髓炎。儿科脑白质营养不良病变包括溶酶体贮积病(例如，戴萨克斯病)、卡纳万氏病、佩-梅氏病和Crabbe氏球样体脑白质营养不良。

粘多糖贮积症的例子是Sly病。辐射诱导的病变包括辐射诱导的脑白质病和辐射诱导的脊髓炎。引起皮层下脑白质病的病因包括HIV/AIDS、头部外伤和多发梗塞状态。

在本发明的一个特定的方面，重编程的神经胶质细胞包括少突神经胶质祖细胞或少突神经胶质细胞并且要治疗的医学病变与不充分的髓鞘化相关。

根据所描述的优选的方面的又另外的特征，重编程的神经胶质细胞包括星形胶质细胞并且医学病变选自由亚历山大病、癫痫、阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症和神经发生缺陷组成的组。

用根据本发明的重编程的神经胶质细胞治疗的哺乳动物受治疗者优选地是人类，最优选地，是成人或出生后人类。可以使用多种将产生的细胞引入受治疗者的方法。这样，本发明的重要的方面涉及治疗患有髓鞘丧失或少突神经胶质细胞丧失介导的病变的受治疗者的方法，通过在有效治疗由髓鞘丧失或少突神经胶质细胞丧失介导的病变的条件下向受治疗者施用包含重编程的神经胶质细胞的药物组合物。

对于注射，药物组合物的活性成分可以被配制成水溶液，优选地，在生理上相容的缓冲液如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。这种注射包括实质内注射进脑的患病部分以及将在脑、脑干或CNS的远端部位引入细胞，迁移进脑的患病部分。

药物组合物的施用涉及从1×10⁴到1×10⁹的细胞剂量，依赖于希望的髓鞘再生程度。剂量和注射间隔可以被单独调整到活性组分足够有效地调整被移植的细胞髓鞘再生的水平。实现希望的效果必需的剂量将依赖于个体性质和施用途径。

依赖于要治疗的病变的严重性和响应性，剂量可以是单次施用或多次施用，治疗的过程持续从几天到几星期直到完成疾病状态的减缓。当然，要施用的组合物的量将依赖于被治疗的个体、病变的严重性、施用方式、处方医生的判断等等。施用的剂量和时间安排将对应于对单独的变化中的病变的仔细和连续的监测。例如，基于监测的指示，将对要治疗的MS患者施用足够减轻疾病的症状的细胞量。

本发明的重编程的神经胶质细胞可以与赋形剂一起施用，或以与可用于治疗神经退行性紊乱的治疗剂一起的“鸡尾酒”中，所述治疗剂如神经节苷脂；抗生素、神经递质、神经激素、毒素、神经突促进分子；或抗代谢物和神经递质分子的前体。另外地，本发明的重编程的神经胶质细胞可以与其他细胞一起施用。在移植之后，本发明的重编程的神经胶质细胞优选地在患病区域存活一段时间(例如，至少6个月)，以至于观察到治疗效果。

在本发明的一个方面，在施用辐射之后和脱髓鞘发生之前，给受治疗者施用重编程的神经胶质细胞。辐射施用的目的是治疗中枢神经系统的原发性和转移性肿瘤。在某些情况中，包括其中少突神经胶质祖细胞或少突神经胶质细胞缺陷与神经元的丧失组合时，移植混合的细胞的群体可以是期望的，如少突神经胶质祖细胞的群体和神经元或神经元前体的混合物。于是本发明的分化的细胞可以与神经元或神经元前体一起引入，如在美国公布20100021437中描述地产生的那些，其通过引用并入本文。在特定的方面，因此这是优选的：受治疗者接受少突神经胶质祖细胞和少突神经胶质细胞的群体和神经元来实现导向的分化。

通常，本领域已知的任何方法可以用来监测重编程的神经胶质细胞的移植的成功。例如，MRI可以被用于可视化脑白质并研究脱髓鞘化病变的负荷，如当前用于监测MS患者的实践。另外地，可以使用磁化传递对比来监测髓鞘再生(参见，例如，Deloire-Grassin，J.Neurol.Sci.178：10-16(2000))。N-乙酰基-天冬氨酸水平的磁共振光谱测量可以用来评价对局部神经元/轴突存活的作用。在移植之前使用顺磁颗粒标记重编程的神经胶质细胞允许由MRI追踪细胞分散体。系列的神经生理学是对监测传导有用的。视神经在这方面有特殊的优点。

其他的更普遍的神经生理学评估的方法在Leocani等Neurol Sci.21(4增刊2)：S889-91(2000)中描述，其可以用于目的是多病灶性或更扩散的髓鞘修复的干预。但是，认识到临床改进也可以被评估。脱髓鞘化引起体态(发抖、哆嗦)和运动的改变。患有脑白质营养不良的儿童具有运动和智力的迟缓。感觉和运动神经传导性的电生理测量，如H-波测量，是用于监测与脱髓鞘外周神经病变相关联的神经病的传统方法(Lazzarini等(编著)(2004)Myelin biology and disorders(Elsevier Academic Press))。

本发明的诱导的神经胶质细胞的群体的一个重要的用途是作为研究工具，专门用于发现和开发用于参与疾病、紊乱和/或生理行为如神经修复的生物学过程的调节的治疗产品。所述研究工具可以用于药物发现和研究的各个方面，包括但并不限于候选药物的最初鉴定，候选药物活性的证实；以及在现有的药物产品中的活性的鉴定。

组合物的另外的用途是作为研究工具，专门用作诊断工具，来检测已知是对参与疾病或紊乱的生物学过程的调控必需的分子的存在或不存在。

这样，在一个方面，本发明包括研究工具，其含有本发明的组合物，和这样的研究工具在鉴定、研究和/或证实可用作治疗剂的选择性结合剂的活性中的用途。这样，本发明包括使用本发明的方法分离的结合剂，以及这些结合剂在治疗或诊断环境中的用途。

这样，根据本发明的又另外的方面，提供了一种确定治疗对CNS功能性的效果的方法，该方法包括将本发明的细胞经受治疗剂或结合剂(例如，药物、条件如电处理和辐射处理)；确定被治疗细胞的至少一种结构或功能表型，与未被治疗的细胞比较，因此确定治疗对CNS功能性的效果。本发明的细胞能用于鉴定和优化能经由神经胶质细胞的活性恢复神经功能的治疗，并因此能用于鉴定和优化适合治疗神经紊乱的药物(例如，包括被本发明设想的治疗方法)。

而且，确定治疗(针对CNS的疾病或任何其他组织)对神经功能性的效果能被用于评估这些临床治疗对CNS功能的毒性。这样，本发明的这个方面能用于确定各种治疗对经由神经胶质细胞的活性的神经功能的治疗和毒性效果，所述各种治疗如药物治疗以及电治疗。

本发明还能用于获得经受治疗的本发明的细胞中的基因表达谱和其变化。这样，根据本发明的这个方面的方法能用于确定，例如，响应于治疗的基因表达式样变化。

实施例

提出下面的实施例是为了给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的公开内容和描述，并不意味着限制发明人认为的发明范围，也不是指代表或暗示下面的实验是进行的所有的或仅有的实验。本领域技术人员应领会，可以对本发明进行多种改变和/或修改，如在特定的方面中所示的，而不偏离本发明广泛地描述的精神或范围。因此，目前的方面在所有方面中被认为是示例的而不是限制。

已经做了努力保证使用的数字的准确性(例如，量、温度等)，但仍应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指出，份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是或接近大气压。

通常，本文和在下面具体的实施例中描述的方法适用于哺乳动物多能干细胞；然而，本文描述的各个分化步骤所需的时间安排在哺乳动物之间可以变化。

实施例1：从成纤维细胞产生OPC

PLP1：GFP/rtTA成纤维细胞的分离.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和小鼠肺成纤维细胞(MLF)二者都从PLP1：eGFP小鼠和反向四环素-控制的反式激活因子(rtTA)小鼠(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J；JacksonLaboratory)定时自然交配的胚胎第13.5天(E13.5)产生。对于MEF，仔细地去除头部、脊髓和所有的内部器官来消除任何神经前体的污染。将组织的其余部分切成小片并用0.125％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)解离。将细胞扩增一代并冷藏保存备用。MLF通过使用0.125％胰蛋白酶-EDTA解离汇集的肺叶来分离，扩增两代，冷藏保存备用。MEF和MLF二者都在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM glutamax、1×非必需氨基酸、0.1mM2-巯基乙醇的DMEM中衍生。

八种转录因子(8TF)的选择.使用下面公众可得的数据集：GSM241931、GSM241936、GSM241929、GSM241937、GSM241934和GSM24193313。通过用‘基因本体细胞组分项’(GO cellular componentterm)“细胞核”和‘基因本体分子功能项’(GO molecular function term)“DNA结合”二者筛选基因来过滤假定的转录因子。选择在特定的谱系中富集了＞3倍的转录因子，并交叉参考干细胞衍生OPC和少突神经胶质细胞的微阵列数据。然后将数据z评分并使用gplots软件包的heatmap.2函数在R中给数据描绘热图(heatmap)。

慢病毒的产生.将MRF、Myt1、Nkx2.2、Olig1、ST18、Nkx6.2、Olig2和Sox10的小鼠编码区克隆进pLVX-Tight-Puro载体(Clontech)。根据制造商的方案，使用Lenti-X HT包装混合物和Lenti-Phos或Cal-Phos哺乳动物转染试剂盒(全部来自Clontech)，产生VSV-G假型慢病毒。将在大鼠尾胶原I包被的塑料制品(BD Biosciences)上培养的293T细胞(Clontech)以6.0和8.5×10⁴细胞/cm²之间接种并于16小时后转染。在48-72小时之后收获含病毒的单独的上清液并用0.45μm PVDF膜(Millipore)过滤。

诱导的少突神经胶质祖细胞(iOPC)的产生.将MEF或MLF以1.3×10⁴细胞/cm²接种并在两天的时间段用补充聚凝胺(8μg/ml)的新鲜的慢病毒感染四次。病毒感染期结束时标注‘0天’。细胞不被诱导或者在MEF培养条件下用2μg/ml强力霉素(Clontech)诱导三天。然后细胞用TrypLE Select抬升(lift)，并冷冻或在用0.1mg/ml聚-L-鸟氨酸(Sigma)和10μg/ml层粘连蛋白(Sigma；L2020)预包被的Nunclon-Δ盘上以2.0×10⁴细胞/cm²接种，并在OPC培养基(补充有1×N2(R&D Systems)、无维生素A的1×B-27(Invitrogen)、2mM Glutamax(Invitrogen)、200ng/ml SHH(R&D Systems)、20ng/ml FGF2(R&D Systems)和20ng/ml PDGF-AA(R&D Systems)的DMEM/F12(Invitrogen，11320))中培养。培养基两天换一次。通常在14-21天之间使用FACSAria(BD Biosciences)分选iOPC(PLP1：eGFP+细胞)，并进一步将其在具有FGF2、PDGF-AA和SHH的OPC培养基中扩增。用TrypLE Select(Invitrogen)每3-5天将iOPC传代并在补充有10％FBS和10％DMSO(Sigma)的DMEM中容易地冷冻/融化。

诱导的少突神经胶质祖细胞(iOPC)分化成诱导的少突神经胶质细胞(iOL).对于iOPC分化成iOL，将细胞以2.2×10⁴细胞/cm²铺板(来自MLF的iOPC以1.1×10⁴细胞/cm²)，并用补充有0.4ng/ml T3(Sigma)、200ng/ml SHH、100ng/ml头蛋白、10μM cAMP、100ng/ml IGF和10ng/mlNT3的OPC培养基诱导。三天之后固定培养物并对MBP染色。

免疫细胞化学.通过在4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中固定15分钟并接着用在PBS中的0.2％Triton-X透化10分钟，准备细胞用于免疫染色。然后于室温下用在PBS中的过滤的10％正常山羊(Abcam)或10％驴血清(Abcam)来封闭细胞的非特异性结合1-2小时。将第一抗体在封闭溶液中稀释并在4℃与样品孵化过夜。样品用PBS润洗并于室温下用合适的荧光标记的Alexa-Fluor第二抗体(Invitrogen1∶500)孵化一小时。对于细胞核染色，样品用1ug/ml DAPI(Sigma)孵化5分钟。使用的第一抗体是：Sox10(R&D Systems，AF2864；2μg/ml)、Olig2(Millipore，AB9610；1∶1000)、Nkx6.2(Abcam，ab58708；1μg/ml)、Sox1(R&D Systems，AF3369；1μg/ml)、Sox2(R&D Systems，MAB2018；1μg/ml)、Pax6(Covance，PRB-278P；0.67μg/ml)、Oct3/4(Santa Cruz，SC-5279；0.4μg/ml)、Nkx2.2(DSHB，74.5A5；4.4ug/ml)、GFAP(DAKO，Z0334；0.58μg/ml)和MBP(Covance，SMI-99p；2μg/ml)。

FACS和流式细胞术.对于PLP1：eGFP表达分析，细胞使用TrypLE抬升并用无生长因子的OPC培养基润洗2×。细胞在FACSAria或LSR流式细胞仪(BD Biosciences)上分析并用WinList3D7.0软件产生绘图。对于荧光激活的细胞分选和流式细胞术的象限门用少于0.1％阳性细胞的负对照(未被感染的MEF)设置。

RNA分离和qPCR.将细胞在1ml TRIzol(Invitrogen)中裂解并储藏于-80℃备用。用Phase-Lock Gel Tubes(5Prime)增强氯仿分离。收集水相并且RNA分离用RNeasy Plus试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案完成。400ngRNA用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)逆转录，并且使用8ng cDNA、TaqMan基因表达主混合物(TaqMan Gene Expression Master Mix)和TaqMan探针：Sox10(Mm01300162_ml)、Nkx6.2(Mm00807812_gl)、Olig1(Mm00497537_s1)、Nkx2.2(Mm01275962_ml)、Myt1(Mm00456190_ml)、ST18(Mm01236999_ml)、Gm98(MRF)(Mm01194959_ml)和Olig2(AJVI3GC，定制)，在7300实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行qPCR。使用Olig2(Mm01210556_ml)TaqMan探针在iOPC中检测内源性的Olig2表达，其中，一个引物位于CDS之外并因此不检测从慢病毒载体的表达。将所有的表达数据对Gapdh(Mm99999915_gl)标准化，并且对没有检测到表达的样品给出一个随机的Ct值40。所有的分析以一式四份技术重复进行，每份技术重复具有最少三个独立的生物学重复。相对的表达水平通过计算带有相应的S.E.M.的2^-ΔΔCt确定。

结果.八种转录因子基于它们在少突神经胶质细胞发育中已知的作用从OPC/少突神经胶质细胞谱系列表中选择：Olig1、Olig2、Nkx2.2、Nkx6.2、Sox10、ST18、Gm98(MRF)和Myt1(总称为8TF)，每个基因单独地克隆到强力霉素可诱导的慢病毒载体中。8TF集合用于感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，所述小鼠胚胎成纤维细胞从携带反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)以及修饰的PLP1：eGFP转基因的小鼠中分离，所述修饰的PLP1：eGFP转基因特异地在OPC和少突神经胶质细胞二者中表达。PLP1：eGFP/rtTA MEF被仔细地分离以不含所有的神经组织，如当由免疫染色、qPCR、微阵列和流式细胞术测试时缺乏神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、OPC和少突神经胶质细胞标志物所证明的。对于所有的实验，被感染的细胞的百分数通过对单独转录因子免疫染色以及由qPCR测量的转基因的诱导水平来监测。典型地，当用多种病毒感染时，30-60％的细胞被单个因子感染并因此只有小比例的细胞接受到所有的因子；然而，当被培养在含有FGF2、PDGF-AA和音猬因子(SHH)的OPC促进培养条件下时，用8TF集合感染和诱导(+强力霉素，+Dox)MEF一致性地导致在第21天时大百分数(～13％)的细胞表达OPC/少突神经胶质特异的PLP1：eGFP转基因。在同样的条件下培养的未被感染(无TF)和未被诱导的(-Dox)PLP1：eGFP MEF不含GFP+细胞。

然后缩小产生PLP1：eGFP+细胞(标为诱导的OPC，iOPC)必需的转录因子的数量。来自8TF集合的单个因子被去除并揭示出缺乏Sox10、Olig2或Nkx6.2的7TF集合在第21天PLP1：eGFP+细胞的百分数有大的下降；表示这些基因是有效的重编程所需的(参见图2a)。

为了进一步测试这些结果，将Sox10、Olig2和Nkx6.2(总称为3TF)在MEF中表达，结果表明这三种因子足够产生iOPC，其水平相当于8TF(比较图2a和2b)。然后研究Sox10、Olig2或Nkx6.2单个或成对地是否对于产生iOPC是足够的。发现PLP1：eGFP+细胞的百分数随着来自3TF集合的任何变化下降，表示这三种基因对有效地从MEF产生iOPC是必需的和足够的(参见图2b)。重要的是，这些3TF也能够诱导从替代的体细胞来源，即小鼠肺成纤维细胞产生iOPC(参见图2c)。

为了观察iOPC产生的动力学，在整个21天的诱导阶段以时间间隔进行流式细胞术。在诱导之后的5-7天之内检测出PLP1：eGFP+细胞的低百分数，但百分数在7-10天显著地增加并在诱导阶段的其余时期平稳(参见图2d)。这些结果表明重编程过程在7-10天内完成。为了进一步测试这点，研究了对iOPC的产生必需的最小诱导阶段。再一次，在诱导8-10天观察到iOPC百分数的主要改变，表示对从MEF有效地产生iOPC，需要外源性因子表达大约8-10天(图2e)。

接下来，研究了iOPC展现出的细胞和分子特征是否与真正的OPC的特征一致。在体内，OPC首先从发育中的脊髓的腹侧脑室区出现并特征性地表现出双极性形态，响应于PDGF和FGF增殖，表达确定的一组少突神经胶质细胞谱系基因，并响应于生长因子取消和暴露于甲状腺激素(T3)分化成少突神经胶质细胞。iOPC展现出双极性形态并能在培养中扩增至少五代，产生成百万的iOPC。进一步的，iOPC的总的基因表达谱表示出清晰的MEF-特异程序的下调和对少突神经胶质细胞谱系特异的基因如Nkx2.2、Olig1和Olig2的激活。既然许多OPC-特异的基因也在转录因子集合中，证实了内源性基因Olig2使用特异性qPCR引物激活。在MEF重编程为iOPC期间的基因表达变化进一步使用GREAT(基因组区域注解富集工具，Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)25研究。在MEF转化为iOPC期间被上调的基因的GREAT分析表明与以下显著相关：‘基因本体(GO)生物学过程’如“髓鞘化”(p＝7.75×10^-8)和“胶质发生”(p＝4.19×10^-5)、‘MGI(小鼠基因组信息学)表型本体’如“少突神经胶质细胞形态”(p＝2.98×10^-10)和“神经胶质细胞形态”(p＝3.52×10^-7)、以及‘MGI表达本体’如“TS22脊髓；侧壁；脑室层”(p＝5.77×10^-5)。在MEF转化成iOPC期间被下调的基因表明与大量的中胚层过程显著相关，与总的成纤维细胞基因表达程序的失活一致。合并地，这些结果表示，确定的一组转录因子在MEF中的表达能全面地抑制成纤维细胞特异的基因并激活与真正的OPC一致的基因表达程序以及细胞和分子特征。

证明iOPC能在体外响应于生长因子去除和T3的加入分化成少突神经胶质细胞。显著地，iOPC能使用8TF或3TF在2-3天内分化成‘诱导的少突神经胶质细胞’(iOL)。iOL展现出少突神经胶质细胞典型的多突起形态(multiprocessed morphology)并表达髓鞘碱性蛋白质(MBP)，一种髓鞘中基本的蛋白质组分。iOPC能被冷冻/融化并被扩增多代，而仍保持分化成MBP+iOL的能力。MBP+iOL的定量揭示出iOPC是细胞的异质混合物；然而，虽然iOL的产生效率是低的，但iOL只由被感染并用8TF或3TF集合诱导的细胞产生。未被感染的或未被诱导的成纤维细胞从不会产生少突神经胶质细胞。

实施例2：由成纤维细胞衍生的OPC的体外髓鞘化

髓鞘化分析.将出生后早期(P5)哆嗦者(shiverer)(C3Fe.SWV-Mbpshi/Mbpshi；Jackson Laboratory)或野生型小鼠的前脑和小脑解剖，在Leica Vibratome上产生300μm切片。切片如在Mi等Ann Neurol，65：304-15(2009)中描述的，在带有15％马血清、Hong’s N2和PDGF-AA的DMEM/BME基础培养基中培养三天。将5×10⁴-2×10⁵iOPC用拉式玻璃吸管人工地注射进每个切片并在培养中生长另外的10天。然后切片用4％多聚甲醛固定，用冰冷的5％乙酸/95％甲醇处理，测试MBP表达(Covance，SMI99；Jackson Labs，生物素-抗-小鼠IgG；Vector Labs，ABC；Sigma，DAB；或Alexa594第二抗体，1∶500)。

结果.iOPC的功能通过测试iOPC将低髓鞘化的哆嗦者小鼠(MBPshi/shi)的轴突髓鞘化的能力来进一步调查，所述小鼠完全缺乏MBP和致密的髓鞘28。将iOPC注射进出生后早期哆嗦者前脑或小脑的器官型切片培养物，在那里，它们清楚地集群并沿着白质束对齐。重要的，在10天之内，大量iOPC产生了MBP+髓鞘。总之，这些数据清楚地证明，能通过调节成纤维细胞中确定的一组转录因子产生功能性的iOPC。iOPC在培养物中是可扩增的并有能力将低髓鞘化的小鼠的轴突髓鞘化。

实施例3：由成纤维细胞衍生的OPC的体内髓鞘化

髓鞘化分析.过去式！！！哆嗦者突变小鼠用作模型系统来证明使用本发明的中胚层细胞衍生的OPC的体内髓鞘再生。先天性的低髓鞘化的哆嗦者小鼠不能产生致密的髓鞘并且在18-21周龄前死亡。使用的模型如在美国专利申请第20080206209号和Windrem等Cell Stem Cell2，553-565，2008年6月中描述的，其均通过引用全文并入。

简单的说，出生后早期(P1-P3)哆嗦者(Mbpshi/shi)小鼠作为如实施例1的描述产生的成纤维细胞衍生的OPC移植的宿主。幼崽用异氟烷麻醉，并且将1.5μl在神经基础培养基中的167,000细胞/μl悬液单侧地注射来导向未来的胼胝体。经头骨使用Hamilton注射器注射入1.5mm的深度来进行注射。

注射成纤维细胞衍生的OPC的小鼠以及野生型小鼠和只注射媒介物的对照小鼠(假处理的小鼠)在不同时间点被处死来分析髓鞘化。幼崽用阿佛丁麻醉并灌注。OPC处理的和假处理的小鼠的大脑被固定、切片并对髓鞘化染色，如Windrem等Cell Stem Cell.，5；2(6)：519-20(2008)所描述的。

根据使用的细胞群体的剂量，从成纤维细胞衍生的OPC展示了部分或全部地恢复哆嗦者表型的能力。

前面仅仅示例了本发明的原理。应领会的是，本领域技术人员将能够设计虽然没有在本文中明确地描述或显示，但体现了本发明的原理并被包括在本发明的精神和范围中的各种布置。而且，本文中列出的所有的实施例和条件性语言主要预期帮助读者理解本发明的原理和由发明人贡献的概念以进一步推动本领域，应被诠释为不限于这些具体列出的实施例和条件。而且，本文中提及本发明的原理、方面和实施方案和其具体的例子的所有陈述预期包括其结构和功能上的同等物。另外地，预期这些同等物包括当前已知的同等物和未来开发的同等物，即，完成相同功能的开发的任何元素，而不论结构。因此，本发明的范围不预期被限制于在本文中所示的和描述的示例性方面。而是，本发明的范围和精神由所附的权利要求书体现。在下面的权利要求书中，除非使用术语“手段”，否则其中提及的性质或元素不应被解释为根据35U.S.C.§112，

的手段加功能(means-plus-function)的限制。

Claims

1.一种产生神经胶质细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供来自患者的体细胞；

(b)培养所述体细胞；以及

(c)在所述培养的体细胞中表达一种或多种重编程因子以产生神经胶质细胞的群体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自Sox10、Nkx6.2或Olig2。

3.如权利要求2所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的至少两种重编程因子在所述培养的体细胞中表达。

4.如权利要求3所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的所有三种重编程因子在所述培养的体细胞中表达。

5.如权利要求1所述的方法，其中选自Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98的一种或多种重编程因子在所述培养的体细胞中表达。

6.如权利要求5所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2和Olig2的一种或多种重编程因子和选自Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98的至少一种重编程因子在所述体细胞中表达。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子从包含可诱导启动子的载体表达。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述载体还包括选择标记。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞、造血细胞、脂肪细胞或软骨细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。

12.如权利要求1所述的方法，还包括在所述表达步骤之后的分选步骤，以从所述培养的体细胞分选所述神经胶质细胞的群体，来产生富集的神经胶质细胞的群体。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述分选步骤通过使用对神经胶质细胞特异的一种或多种标志物来实现。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种标志物选自PLP-1、髓鞘碱性蛋白(MBP)、A2B2、A2B5、nextin、血小板衍生生长因子α受体、SOX10、Olig1、硫酸软骨素蛋白聚糖NG2、髓鞘相关的糖蛋白、髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白、或半乳糖脑苷脂O1或GalC。

15.如权利要求1所述的方法，还包括在所述表达步骤之后扩增所述神经胶质细胞的群体的步骤。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述神经胶质细胞是少突神经胶质祖细胞。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子从所述体细胞中的一种或多种内源性基因表达。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子从所述体细胞中的一种或多种外源性基因表达。

19.如权利要求1所述的方法产生的神经胶质细胞的群体。

20.如权利要求19所述的神经胶质细胞的群体，其中所述神经胶质细胞是少突神经胶质祖细胞。

21.如权利要求20所述的神经胶质细胞的群体，其中所述细胞的群体的至少5％是神经胶质细胞。

22.如权利要求21所述的神经胶质细胞的群体，其中所述细胞的群体的至少10％是神经胶质细胞。

23.一种药物制剂，所述药物制剂含有如权利要求19所述的神经胶质细胞的群体。

24.一种研究工具，所述研究工具包括如权利要求19所述的神经胶质细胞的群体。

25.一种产生少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供来自患者的成纤维细胞；

(b)培养所述成纤维细胞；以及

(c)在所述成纤维细胞中表达选自Sox10、Nkx6.2、Olig2、Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98的一种或多种重编程因子来产生诱导的成纤维细胞的群体，其中所述诱导的成纤维细胞被重编程为少突神经胶质祖细胞。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自Sox10、Nkx6.2或Olig2。

27.如权利要求26所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2和Olig2的一种或多种重编程因子和选自Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98的至少一种重编程因子在所述体细胞中表达。

28.如权利要求25所述的方法，还包括在所述表达步骤之后分选所述少突神经胶质祖细胞的群体的步骤。

29.如权利要求28所述的方法，还包括在所述分选步骤之后扩增所述少突神经胶质祖细胞的群体的步骤。

30.如权利要求29所述的方法，还包括在音猬因子、头蛋白、胰岛素样生长因子、神经营养因子3和/或三碘甲状腺原氨酸中的一种或多种的存在下培养所述扩增的神经胶质细胞的群体。

31.如权利要求30所述的方法，包括在音猬因子、头蛋白、胰岛素样生长因子、神经营养因子3和/或三碘甲状腺原氨酸中的三种或更多种的存在下培养所述扩增的神经胶质细胞的群体。

32.如权利要求25所述的方法，其中一种或多种重编程因子从成纤维细胞中的一种或多种内源性基因表达。

33.如权利要求25所述的方法，其中一种或多种重编程因子从成纤维细胞中的一种或多种外源性基因表达。

34.一种产生少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供来自患者的成纤维细胞；

(b)培养所述成纤维细胞；

(c)递送驱动选自Sox10、Nkx6.2、Olig2、Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98的一种或多种重编程因子表达的载体到所述成纤维细胞；

(d)诱导所述一种或多种重编程因子表达来产生诱导的成纤维细胞的群体，其中所述诱导的成纤维细胞被重编程为神经胶质细胞；

(e)扩增所述神经胶质细胞；

(f)分选所述神经胶质细胞来产生富集的神经胶质细胞的群体；以及

(g)扩增所述富集的神经胶质细胞的群体。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自Sox10、Nkx6.2或Olig2。

36.如权利要求34所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2和Olig2的一种或多种重编程因子和选自Olig1、Nkx2.2、ST18、MYT1或GM98的至少一种重编程因子在所述体细胞中表达。

37.如权利要求36所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2或Olig2的至少两种重编程因子在所述体细胞中表达。

38.如权利要求37所述的方法，其中选自Sox10、Nkx6.2和Olig2的所有三种重编程因子在所述体细胞中表达。

39.如权利要求34所述的方法，其中所述富集的神经胶质细胞的群体包括至少30％的神经胶质细胞。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述富集的神经胶质细胞的群体包括至少50％的神经胶质细胞。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述富集的神经胶质细胞的群体包括至少80％的神经胶质细胞。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述富集的神经胶质细胞的群体包括至少90％的神经胶质细胞。

43.一种药物制剂，所述药物制剂含有如权利要求42所述的富集的神经胶质细胞的群体。

44.一种研究工具或诊断工具，所述研究工具或诊断工具含有如权利要求42所述的富集的神经胶质细胞的群体。