KR20210106966A - 삼차원 뇌 오가노이드 유래 신경 줄기세포 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 3D 오가노이드를 패턴화하고 해체하여 해당 줄기세포 또는 전구세포를 배양하고 분화를 유도하여 최종 분화된 세포를 다량 확보하는 방법에 관한 것으로, 다량 확보된 세포는 기존 분화방법에 의해 분화된 세포에 비해 재현성, 안정성, 기능성 면에서 현저히 우수한 효과를 나타냄으로써 세포치료제나 치료 약물 스크리닝에 매우 유용하리라 기대된다.

Description

삼차원 뇌 오가노이드 유래 신경 줄기세포 및 그의 용도{Neural stem cells derived from 3D brain organoid and use thereof}

본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 3D 오가노이드를 분리 해체하여 최종 분화된 세포를 다량 확보하는 분화방법에 관한 것이다.

파킨슨병은 중뇌(midbrain) 흑질에 도파민 신경세포의 소실로 발생하는 신경퇴행성질환이다. 병변 부위와 병변세포가 명확하여 줄기세포 이식 치료에 가장 적합한 질환이라 알려져 있다.

파킨슨병 세포 치료를 위해서는 줄기세포로부터 인간 중뇌형 도파민 신경세포(midbrian-type dopamine neuron; mDA neuron)로 분화시키는 기술이 필요하며, 인간 만능 줄기세포(hPSC, 인간 배아줄기세포(hESC) 또는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC))로부터 mDA 신경세포로 분화시키는 분화 방법이 오랜 기간 동안 개발되어 왔다[비특허문헌 1]. 그러나 이러한 분화하는 방법은 임상적용에 사용하는데 있어서 다음과 같은 여러 문제점이 제기되었다.

첫째, 재현성에 문제가 있다. 기존의 이차원적인 방법이 매우 까다로와 다른 실험실에서는 재현이 잘 되지 않고, 개발한 모든 방법에서 개발에 사용한 H9 등의 일부 만능 줄기세포주에서만 적용되며 여러 다른 만능줄기세포주에서는 중뇌 도파민 신경세포로의 분화가 잘 일어나지 않았다.

둘째, 안정적인 중뇌인자(midbrain-specific factors) 발현의 문제점이 있다. Nurr1 Foxa2, Lmx1a와 같은 중뇌 인자는 중뇌 도파민 신경세포의 생존, 기능, 및 유지에 결정적으로 중요하다고 알려져서 이식 후 파킨슨병 치료능과 긴밀하게 관련되어 있다. 이 사실 때문에 최근 개발된 hPSC-mDA 신경세포 분화 프로토콜은 모두 중뇌 도파민 신경세포에서 중뇌 인자의 발현에 초점을 두고 개발되었다. 그러나 이 중뇌인자의 발현은 매우 불안정하여 중뇌 도파민 신경세포를 장기간 배양하던지 이식 후 쉽게 손실되어 버린다. 그러므로 현재까지 개발된 방법으로 분화된 세포를 이식하여 이식된 중뇌 도파민 신경세포에 일부 중뇌인자 발현(주로 Foxa2)만을 보여주고 있다.

셋째, 분화된 mDA 신경세포 배양에서는 성상교세포(astrocyte)가 존재하지 않는 문제점이 있다. 지금까지 개발된 방법으로 분화된 mDA 신경세포 배양에서는 성상교세포(astrocyte)가 포함되어 있지 않다. 성상교세포는 mDA 신경세포와 같은 신경세포의 생존, 기능 증진을 담당하는 세포로서 실제 뇌조직에서 신경세포의 정상적인 생존 및 기능 유지를 위해 필수적으로 필요한 세포이다. 또한, 성상교세포가 mDA 신경세포에서 중뇌인자의 발현을 유지하는데 필요하다.

마지막으로, 신경세포 분화로 얻을 수 있는 신경세포 양에 문제점이 있다. 지금까지 개발된 도파민성 신경세포 분화 방법에서는 중간에 증식에 가능한 신경줄기세포 단계 없이 바로 신경세포로 분화를 유도하여 한번의 분화를 통해 얻을 수 있는 최종 분화된 신경세포의 양에 한계가 있다.

3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders, Journal of Biomedical Science(2017) 24:59

이에, 본 발명자들은 이차원적인 세포의 배양에 대하여 오가노이드를 이용한 삼차원적 배양이 실제의 뇌 환경을 보다 가깝게 구현하고, 세포의 건강한 배양이 가능한 점에 착안하여 연구 노력하였다. 타겟 세포인 전구세포 또는 줄기세포가 충분히 포함될 수 있는 각각의 오가노이드를 각기 패턴화하여 원하는 운명체의 세포군을 다수의 세포군으로(target cell enriched) 제작하고, 이 오가노이드 조직을 해체하여, 전구세포 또는 줄기세포를 배양하였다. 다른 기술들은 세포의 확보를 위해서는 2차원적인 배양법으로 패턴화하여 양적으로 확보하든지, 중간 단계에서 3차원 sphere 형태만을 차용하여 분화법 개발에 응용하는 반면, 본 발명은 완벽한 형태의 오가노이드를 거쳐서, 적절한 배양으로 그 안에 원하는 상태의 세포를 충분하게(target cell enriched) 하기 때문에, 기존의 다른 기술에 비해 본 발명에서 분리된 세포는 오가노이드라는 완전한 3차원적 인공 뇌 부위를 거침으로써 세포 하나 하나가 보다 기능적으로 우수함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 3D 오가노이드를 패턴화하고 해체하여 해당 줄기세포 또는 전구세포를 배양하고 분화를 유도하여 최종 분화된 세포를 다량 확보하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 얻은 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 얻은 분화된 세포를 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 3D 오가노이드를 패턴화하고 해체하여 해당 줄기세포 또는 전구세포를 배양하고 분화를 유도하여 최종 분화된 세포를 다량 확보하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에 기재된 "만능 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)"는 몸을 구성하는 어떠한 형태의 세포로도 유도 분화가 가능한 줄기세포를 의미하며, 만능 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)와 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, Ipsc, 역분화 줄기세포)가 포함된다.

본 명세서에 기재된 "오가노이드(organoid)"는 줄기세포를 이용해 최소 기능을 할 수 있도록 만든 '미니 유사 장기’로서, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다. 즉, "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경, 장 등의 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 상기 오가노이드(organoid)는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 3D 오가노이드는 실제로 생체 내에서 상호 작용을 하고 있는 장기를 거의 완벽히 모사하여, 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다.

오가노이드는(organoid)는 일반적으로 인간 만능줄기세포를 배양하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 파킨슨병 유래의 유도만능 줄기세포로부터 신경외배엽 구체(neuroectodermal sphere) 형태의 신경외배엽 구체로 분화하거나 파킨슨병 유래의 유도만능 줄기세포로부터 진정 내배엽(definitive endoderm), 후장(hindgut) 으로의 단계별 분화를 통한 장관 오가노이드로 분화를 유도할 수 있다.

본 발명에서 용어, "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말하며, 예를 들어, 만능 줄기세포가 외배엽(대뇌 피질, 중뇌, 시상하부 등), 중배엽(난황낭 등) 및 내배엽 세포로 변하는 과정뿐 아니라 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정, 즉 전구세포가 특정 분화형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다.

기존의 인간 만능 줄기세포로부터 바로 분화 유도하여 해당 세포로 분화시키는 경우 세포주 또는 실험실(실험 환경)에 따라 재현성에 문제가 있으며, 안정적인 유지인자 발현이 되지 않으며, 일 례로 중뇌 도파민 신경세포의 경우에는 실제의 생체 환경과 달리 성상교세포가 함께 존재하지 않으며, 한번의 분화를 통해 얻을 수 있는 최종 세포의 양에 한계가 있다. 본 발명의 일 실시예와 같이 대뇌 성상전구세포, 중뇌 성상전구세포, 중뇌 도파민성 신경줄기세포, 또는 시상하부 신경줄기세포를 충분히 포함될 수 있는 오가노이드를 각기 패턴화하여 제작하고(target cell enriched), 즉 각 타겟으로 하는 세포를 최대한 함유하고 있는 오가노이드 확보, 이 오가노이드 조직을 해체하여 해당 줄기세포 또는 전구세포를 배양함으로써 이차원적으로 분화 유도된 세포군에 대비하여, 실제의 뇌로부터 분리된 세포와 보다 비슷하고, 그 특성이 잘 유지되고 있으며, 생존력이 확보된 세포군으로의 분화 확보가 가능하다.

본 발명에서, 용어 "패턴화"는 오르가노이드 제작시에, 중뇌성 패턴, 대뇌 피질성 패턴, 혹은 시상하부성 패턴, 이런식으로 뇌 세부 조직들 중 최종적으로 뽑아내고자 하는 세포의 오리진 조직의 특성을 지니는 운명체의 세포군을 다수의 세포군으로 함유되도록(target cell enriched) 오르가노이드를 제작함을 의미한다. 또한, 패턴화 마커는 중뇌성 패턴 시에는 Lmx1a, Foxa2, Nurr1, En1; 대뇌 피질성 패턴 시에는 Pax6, Foxg1; 시상하부성 패턴 시에는 Rax, Nkx2.2 등이 있다.

따라서, 본 발명에서는 제작된 3D 오가노이드를 해체하여 오가노이드로부터 증식이 가능한 줄기세포를 분리 배양하여 증식시킴으로써 최종 분화된 세포를 한번에 다량으로 확보할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면,

1) 인간 만능 줄기세포를 증식 배양하여 3D 오가노이드를 제작하는 단계;

2) 제작된 3D 오가노이드를 패턴화하고 해체하는 단계; 및

3) 상기 해제된 오가노이드로부터 뽑아낸 세포들 내 줄기세포 또는 전구세포를 배양하여 증식시키고 분화 유도하여 최종 분화된 세포를 다량 확보하는 단계

를 포함하는 인간 만능줄기세포로부터 제작된 3D 오가노이드를 해체하여 줄기세포 또는 전구세포를 다량 확보하고 이를 최종 분화하는 방법을 포함한다.

상기 줄기세포는 외배엽성 줄기세포(피부, 신경세포), 중배엽성 줄기세포(근육, 뼈 세포) 또는 내배엽성 줄기세포(소화, 호흡 세포)일 수 있다. 구체적으로, 중뇌 도파민성 신경줄기세포, 또는 시상하부 신경줄기세포일 수 있다.

상기 전구세포는 대뇌 성상전구세포, 또는 중뇌 성상전구세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포는 신경세포 또는 성상교세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 바람직하게 상기 인간 만능 줄기세포 및 줄기세포를 비트로넥틴(Vitronectin)을 이용하여 배양시킨다. 이때 비트로넥틴을 0.3 ~ 0.7 μg/cm² 사용하는 것이 적절하다. 현재까지 이식용 도파민성 신경세포를 양산하는 최신 연구 보고된 Parmar group의 CellStemCell(A. Kirkeby et al., Predictive Markers Guide Differentiation to Improve Graft Outcome in Clinical Translation of hESC-Based Therapy for Parkinson's Disease. Cell Stem Cell 20: 135-148, 2017), Nature Protocol(S. Nolbrant, A. Heuer, M. Parmar, A. Kirkeby, Generation of high-purity human ventral midbrain dopaminergic progenitors for in vitro maturation and intracerebral transplantation. Nature protocols 12, 1962-1979(2017))의 보고에 의하면 인간 배아줄기세포의 증식 및 배양을 위해 Lamin521(BioLamina사 LN-521)을 0.5 μg/cm² 사용하고, 중뇌 신경세포로의 분화 후에는 Lamin511(BioLamina사 LN-511)을 1 μg/cm² 사용하는 것이 매우 중요하다고 보고하였다. 이에 비해 본 발명의 실시예에서는 인간 배아줄기세포의 배양 및 중뇌 신경 줄기세포 배양에 모두 비트로넥틴(Gibco사 A31804)를 0.5 μg/cm² 사용하였다. 일반적으로 배양에 사용하는 60 mm dish의 코팅 단가로 봤을 때, 인간 배아줄기세포 배양을 위한 Lamin521은 7,282원/dish 본 발명에서의 비트로넥틴은 1,480원/dish, 그리고 중뇌 신경 줄기세포 배양을 위한 Lamin511은 23,832원/dish인데 반하여, 본 발명의 계속 비트로넥틴 사용으로 1,480원/dish 이다. 코팅 비용만을 보더라도 본 발명의 방법이 인간 배아줄기세포 배양 시에는 5배, 중뇌 신경줄기세포 배양 시에는 무려 16배 절감 효과가 있다.

본 발명에 사용된 용어 "다량"은 처음 사용한 만능줄기세포 1개의 배양접시(dish)의 시작으로부터 도입하였을 때 각 패턴화된 세포군에 따라 차이가 있지만, 대략 1000~7200여 vial의 냉동세포 확보가 가능하고 이는 일반적으로 한 두개의 배양접시 세포를 1개의 vial 로 냉동한다고 봤을 때, 약 1,000~14,000배로 증가된 양을 의미한다. 특히, 단순한 양적인 증식뿐만 아니라, 특성의 유지까지도 포함한다.

본 명세서에 기재된 "아교세포(gila)"는 뇌에 존재하는 세포 중 가장 많은 부분을 차지하는 세포로서, "성상교세포(astrocyte)"를 의미한다. 상기 성상교세포는 성상교세포라고도 하며, 신경세포의 보호 및 영양공급, 염증에 관여하며, 상기 미세아교세포는 뇌에서 염증을 담당하는 세포이다.

상기 성상교세포는 배아 또는 성체 줄기세포로부터 분화시켜 수득할 수도 있고, 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 분리하여 수득할 수도 있다.

"신경전구세포/신경줄기세포(Neural stem/precursor cells, NSCs/NPCs)"는 발생 중이거나 또는 성체에서의 뇌 조직으로부터 분리 및 배양되며, 배양된 NPC는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 도파민 신경세포의 대량 형성에 사용될 수 있다.

"신경세포"는 신경계의 세포이고, 용어 "뉴런" 또는 "뉴런 세포"로 서로 바꾸어 사용할 수 있다.

"도파민(DA) 신경세포"는 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase, TH)을 발현하는 신경세포를 말한다. 본 발명에서는 "도파민성 신경세포", "도파민 뉴런", "DA" 등으로 혼용하여 사용한다. 도파민 신경세포은 중간 뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체 내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 확보된 세포를 포함하는 세포치료제를 포함한다.

"세포치료제"는 대상체로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.

본 명세서에 있어서, "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 염소, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아 피그, 인간 등일 수 있다.

본 발명에서 “치료”란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.

본 발명의 세포치료제는 신경 퇴행성 질환, 염증성 퇴행성 질환 및 대사 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환에 대한 치료 효과를 나타낸다.

상기 신경계 퇴행성 질환은 예를 들어 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 대사 질환은 당뇨병, 비만 및 대사 장애로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법으로 확보된 세포는 세포 치료제로 적용될 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에 있어서, 세포 치료제로서 포함할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 치료제는 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 세포치료제는 질병 부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 세포치료제는 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 세포는 적합한 희석제에 약 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입 시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 뇌척수액 등이 있을 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 확보된 세포 또는 전구세포를 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명으로 확보된 세포의 중요한 특징으로 다량의 세포 생산 확보 가능성과 냉동보존 시에도 그 특성의 유지로 장기간 같은 성격의 세포군 유지 가능성, 생체 유래 세포와 보다 흡사하게 분화됨에 있다. 이러한 특성은 특히나, 동일한 상태의 다량의 세포를 요구하고 이의 반복 분석을 위해서는 장기간의 동일한 세포의 확보가 관건인, 다종의 약물의 동시 스크리닝 시에 적합하다. 주요 마커가 유지되는 동일한 성격의 세포군이 스크리닝 작업 시작 시점에서부터 끝나는 시점까지 계속 사용 가능함으로 스크리닝 세포에 매우 적합하다.

상기 약물은 신경 퇴행성 질환, 신경 퇴행성 질환, 염증성 퇴행성 질환 및 대사 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환을 치료하는 약물로서, 상기 신경 퇴행성 질환, 신경 퇴행성 질환, 염증성 퇴행성 질환 및 대사 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환에 대한 치료 효과를 나타낸다.

상기 신경계 퇴행성 질환은 예를 들어 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병을 포함하는 다양한 신경계 질환이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증,다발성 경화증 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 대사 질환은 당뇨병, 비만 및 대사 장애로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또한 분화 유도 후 전체 세포 집단에서 DAPI 양성 세포 중 신경세포 마커인 MAP2 양성 세포 비율이 75% 이상이고, 상기 MAP2 양성 세포 중 도파민성 신경세포의 마커인 TH 양성 세포 비율이 25% 이상이며, 상기 TH 양성 세포 중 NURR1 양성 세포의 비율이 70% 이상이거나, FOXA2, LMX1A 및 EN1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 양성인 세포의 비율이 75% 이상인 것을 특징으로 하는, 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포를 제공한다.

상기 신경줄기세포는 상기 DAPI 양성 세포 중 FOXA2/LMX1A, KI67/NESTIN, OTX2, SOX2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 양성인 세포의 비율이 75% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 신경줄기세포는 2D 배양 유래 신경줄기세포에 비해서 DBN1, HSP90AB, CCT8, SERBP1, KIF5B, RDX, MACFA, EIF4G2, HNRNPK, HSPAB, BZW1, ZC3H15, 및 RSL1D1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 현저하게 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 최종 분화된 도파민성 신경세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 도파민성 신경세포를 포함하는 세포집단을 제공한다.

상기 세포집단에서 상기 도파민성 신경세포는 성상교세포(GFAP⁺)와 함께 분화되는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포 또는 상기 도파민성 신경세포 또는 상기 세포집단을 유효성분으로 포함하는, 신경 퇴행성 질환 및/또는 염증성 퇴행성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있다.

본 발명은 또한 분화 유도 후 전체 세포집단에서 DAPI 양성 세포 중 시상하부 신경줄기세포 마커인 Rax 양성 세포 비율이 80% 이상이면서 4계대까지 증식 가능한, 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포를 제공한다.

상기 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포는 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 최종 분화되어, 2D 배양 유래 신경세포에 비해서 NKX2.1, RAX1, ISL, SF1 및 NGN3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 발현이 현저하게 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 분화되어 Leptin에 대한 반응성이 있는, 시상하부 오가노이드 유래 신경세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 시상하부 오가노이드 유래 신경세포를 포함하는, 세포집단을 제공한다.

상기 세포집단에 있어서, 상기 시상하부 오가노이드 유래 신경세포는 성상교세포(GFAP⁺)와 함께 분화되는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포 또는 상기 시상하부 오가노이드 유래 신경세포 또는 상기 세포집단을 유효성분으로 포함하는, 대사질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 대사질환은 당뇨병, 비만 및 대사 장애로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명에서는 제작된 3D 오가노이드를 해체하여 오가노이드로부터 줄기세포 또는 전구세포를 분리 배양하여 증식시킴으로써 최종 분화된 세포를 다량으로 분화시킬 수 있으므로, 다량의 세포를 한번에 확보할 수 있다. 일례로, 본 발명의 방법을 mDA 신경세포 분화에 적용하는 경우 세포주에 따른 또는 batch-to-batch variation 없이 손쉽게 분화를 유도할 수 있어 다른 실험실에서 쉽게 재현이 가능하다. 또한, 본 발명으로 분화된 중뇌형 신경줄기세포를 파킨슨병에 이식 시 mDA 신경세포의 생존, 기능, 및 유지에 결정적으로 중요하다고 알려진 일련의 Nurr1 Foxa2, Lmx1a 등이 이식된 mDA 신경세포에 충실하게 발현되어 세포이식 치료 효과가 현저히 개선됨을 확인하였다. 또한, mDA 신경세포와 함께 신경세포의 생존, 기능 증진을 담당하는 세포인 성상교세포도 존재하여 mDA 신경세포를 보호, 기능 증진시킴으로써 이식 시 세포 이식 치료 증진에 기여한 것으로 보인다.

따라서, 이렇게 다량으로 확보된 분화 세포(mDA 신경세포 외 대뇌 성상전구세포, 중뇌 성상전구세포, 중뇌 도파민성 신경줄기세포, 또는 시상하부 신경줄기세포 등 포함)들은 세포 치료제나 세포로 치료 가능한 약물 스크리닝에 사용될 수 있다.

도 1은 중뇌 오가노이드를 제작하여, 이로부터 중뇌성 신경줄기세포를 추출하는 방법을 나타낸 것이다 [A: 오가노이드로부터 신경줄기세포를 bFGF로 증식하여, 2D 환경 하에서 증식시키며 확보하는 방법을 나타낸 도면. B 및 C: 2주 동안 오가노이드로부터 증식한 중뇌형의 신경줄기세포의 형광염색으로 중뇌형(OTX2, FOXA2, LMX1A, PAX2, PAX5) 마커 및 신경줄기세포(SOX2, NESTIN, KI67) 마커의 발현 확인. D; 오가노이드로 부터 증식한 중뇌형의 신경줄기세포의 증식율 계산. PDL(population doubling level, bars) 및 누적(cumulative) PDL(line). E-G: 오가노이드로부터 증식한 중뇌형의 신경줄기세포의 12~15일 동안의 분화 유도 후 정확한 중뇌형 도파민 신경세포의 분화 확인. 도파민 신경세포 마커(TH)와 함께 중뇌형 마커(FOXA2, LMX1A, NURR1, EN1) 및 완전 성숙한 신경세포 분화 마커(AADC, SYPT, DAT)의 확인. F: 2D 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포 대비하여, 발현 % 확인. G: 각종 인간 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포를 이용했을 때 안정적으로 프로토콜이 구현됨을 확인. H: 2D로의 분화법 대비 오가노이드 유래 신경줄기세포의 분화 기술의 안정적 분화 성공율 확인.(성공의 기준으로 각 방법 수행 시, >70%(>30%) TH⁺ of MAP2⁺ neurons and >70%(>20%) NURR1⁺ of TH⁺ mDA neurons). I-L: 오가노이드 유래 신경줄기세포 분화 프로토콜이 보다 안정적으로 세포사멸을 억제하며 분화 가능함. EthD-1⁺ dead cells(I), cleaved caspase 3⁺ 사멸세포(J), FACS-이용 Annexin+/PI+ 세포 계산(K), and β-galactosidase-염색 세포로서 세포사멸예정세포(cell senescence)(L). *P= 0.0045(I), 0.02(J), 0.008-0.044(L), 0.003(K), n=3 independent experiments, one-tailed Student's t-test. scale bars, 25 μm(J), 50 μm(B, E, I, K)].
도 2는 오가노이드 유래 신경줄기세포의 전사적 조절(Transcriptome characteristics) 분석을 나타낸 것이다 [A 및 B: 중뇌 오가노이드(midbrain-like organoid(MLO)), 오가노이드 유래 신경줄기세포(Og-NSCs), 및 2D 유래 신경줄기세포(2D-NSCs)를 제작하여 그 RNA로부터의 전사인자와 기존에 보고된 발생 중의 중뇌 조직(published transcriptome datasets of prenatal midbrain), 성체의 도파민성 신경세포가 존재하는 선조체(adult substantia nigra), 성체의 대뇌 피질(cortex), 후뇌(hindbrain) 의 전사 인자 조절의 차이를 bulk RNA Sequencing 으로 분석함. A: Spearman's correlation plot. 2D 신경줄기세포와 오가노이드 유래 신경줄기세포의 DEGs(differentially expressed genes) 분석. B: bulk RNA Sequencing 데이터를 PCA(Principle component analysis). PCA score는 발현의 차이가 가장 많이 나는 1,000의 유전자를 중심으로 함. C-G: 오가노이드 유래 신경줄기세포(Og-NSCs), 2D 유래 신경줄기세포(2D-NSCs)의 전사 조절을 single cell RNA sequencing 분석함(각기 13,793개와 12,166개의 세포를 분석). C: t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding) map을 데이터 기반 색깔로 표현함. D: t-SNE projection으로 3개의 분리된 k-means clustering 됨.(Loupe Cell Browser ver. 3.0.1, 10X Genomics, Inc.). Og- 와 2D-신경줄기세포의 분석은 각기 밴다이어그램으로 분석(아래). E: 각 cluster 내의 다른 군 대비 과발현되는 40개의 유전자를 Hierarchical clustering 분석. F: 각 군의 과발현 유전자를 중심으로 Top-ranked GOs(UMI > 1, log₂FC > 0.5, P < 0.05, DAVID). G, 다른 군 대비 특이적 조절되는 대표적인 유전자 발현. 데이터는 색의 짙음으로 표시됨(log₂ expression(UMI). F-H, Og-신경줄기세포에서 2D-신경줄기세포의 분석 대비 보다 극명한 발현성을 보이는(DEGs) GOs(vs 2D-NSCs, log₂FC > 1, padj < 0.01)가 bulk(H)와 single-cell RNA-seq datasets(I) 분석함. 'cell-cell adhesion,'는 bulk-와 single-cell RNA-seq data에서 모두 발현 증대되어 Heatmap 분석함(J).
도 3은 미토콘드리아 기능면에서 Og-NSCs 및 도파민성 신경세포 성숙도와 기능성을 분석한 결과 및 두 그룹 간의 신경세포 성숙도 차이를 보여주는 결과이다. 결론적으로 기존에 생산되던 방식의 NSC 에 대비하여, Og-NSCs 는 보다 건강하고 성숙한 형태의 분화가 가능함을 보여준다. [A-F: 미토콘드리아 독소 실험 하에서도 오가노이드 신경줄기세포(Og-NSCs) 유래 신경세포는 미토콘드리아가 건강한 상태로 유지됨. A: Og-NSCs에서 과발현되는 미토콘드리아 인자의 STRING 분석(vs 2D-NSCs). B: 미토콘드리아의 합성 분석(Mitochondrial biogenesis(MitoTimer)). *p=0.0000005(48 hr), 0.024(24 hr), n=4 cultures. C: 미토콘드리아 ROS(MitoSox), D, 미토콘드리아 막전위(JC-1). *p=1.9e-46, independent cultures, 310-314 cells(C), p=3.5e-21, 세 번 이상의 독립실험으로 283-311 세포분석결과(D), Student's t-test. E, F, 미토콘드리아 독소 처리 하에서의 4일간 분화된 도파민성 신경세포의 생존 분석. 세포 생존/사멸(E), 도파민성 신경세포 길이 분석(F). ROT, rotenone; CC, cccp; HO, H

O₂ *p=0.013-0.165(E), p=0.000032-0.11(F) n=3, Student's t-test. G-P: 도파민성 신경세포 성숙도와 기능성 분석. G, Og-NSCs 발현 특이적인 유전자의 Heatmap 분석(vs 2D-NSCs). H, Neurolucida 분석 프로그램으로 대표적으로 분석된 Og-NSCs 유래 성숙도 높은 도파민성 신경세포. J, 12일 동안 분화 유도된 도파민성 신경세포 길이 분석. 23-58 세포/배양물로부터의 TH+ 섬유 길이를 측정하였다. *p=0.013, n=7(O g), 3(2D) independent cultures, t-test. I, K, 도파민성 신경세포의 시냅스 분석. 실제 시냅스를 형성하는 수를 synaptophysin 염색으로 분석함.(27-43 TH⁺ fibers/culture) *p=0.03, n= 5 cultures for each group. L-O, 신경세포 기능을 기반으로 한 Ca²⁺ influx 분석. L, Og-NSCs와 2D NSCs로 부터의 1AP을 내는 신경세포를 관찰. Og-NSCs(red) 및 2D-NSCs(black). 화살표 1AP point. M, 1 AP response amplitudes 평균값: [Ca²⁺ influx ]Og = 0.60 ± 0.09(n=10), [Ca²⁺ influx]2D = 0.16 ± 0.02(n=12). N, 자극에 의한 Ca²⁺ influx traces. O, 100AP response 동안 Ca2+ influx kinetics 평균값: [τ of Ca²⁺ influx]3D=0.85s ± 0.11(n=10), [τ of Ca²⁺ influx]2D=2.35s ± 0.43(n=12). *p=0.0009(M), p=0.005(O), Student's t-test. P, Pre-synaptic DA 분비, DA levels은 분화 13~15일 배지 내의 도파민 분비를 그 24시간 동안의 조건화 배지로 측정함. 30분 동안 KCl-depolarization 유도함. *p=0.0006-0.0009, n=4(Og), 5-6(2D) independent cultures. Q, R, Og-NSCs의 성상교세포 분화능. Single RNA-seq 의 cluster 1 에서 성상전구세포군이 관찰됨(Q). CD44⁺ 성상 전구세포군은 신경줄기세포군에 포함됨(R), 분화 이후 도파민성 신경세포(TH)와 함께 성상교세포(GFAP)가 같이 분화됨(S). Og-NSC 군에서 관찰되고 2D-NSC 군에서는 거의 없음. *p=0.004(R), p=0.0003(S), n=3-4 independent cultures. scale bars, 10μm(I), 25μm(B, R), 50μm(C, D, S), 100μm(H)].
도 4는 파킨슨병의 생체적 특징인 α-synucleiopathy 모델에서 관찰하는 경우, 본 발명의 방법으로 유도된 신경줄기세포는 심화된 파킨슨 병인인α-synuclein 전파가 잘 되지 않는 상태의 세포임을 볼 때, 파킨슨 세포치료제로 사용 시 유리하다고 할 수 있다 [오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포(Og-NSCs) 유래 신경세포는 상대적으로 α-syn이 덜 퍼지는 것으로 관찰됨. α-syn 질환 환경에서 보다 저항성 가질 수 있음. A-D, α-syn이 신경세포 내로 적게 침투되는 특성 관찰. Og-NSCs(vs 2D-NSC). A, 세포간에 α-syn 이동을 관찰할 수 있는 듀얼 쳄버 시스템. B: α-syn(GFP) 강도를 768 개(Og)와 740 개(2D)의 처리된 세포에서 비교함. *p=0.000004. Og-NSCs에서 상대적으로 덜 침투됨을 보임. C-F: 파킨슨 병인이 될 수 있는 α-syn 올리고머화를 바이러스를 이용한 과발현 시스템으로 유발시켰을 때, 특히 병인이 될 수 있는 p129-α-syn levels은 상대적으로 Og-NSCs에서 적게 관찰됨(C), α-syn 올리고머를 바이러스 과발현 유발 후(왼쪽) 혹은 임의로 PFF(preformed α-syn fibril) 처리 후(오른쪽)에 Western blot 분석. 파킨슨병 주요 병인이 될 수 있는 α-syn 올리고머가 Og-NSCs에서 덜 발생함을 보임(D), Bi-FC 시스템(E, F). Bi-FC-녹색 발현되는 inclusions이 상대적으로 Og-NSCs에서 덜 관찰됨. 이로서 같은 양의 α-syn 이라도 뭉쳐서 병인으로 될 확률이 낮음을 보여줌(F). *significance at p=0.001(C) and 0.02(F), n= 3 independent experiments. G, PFF-a syn 모델 동물에다가 Og-NSCs(left hemisphere)와 2D-NSCs(right-hemisphere)를 각각 이식 후 조직학적으로 분석함. 동물은 2주간 PFF와 a-syn AAV 바이러스로 파킨슨병 모델 유도하고, 각 세포 이식 후 1달 후 희생시킴. Og-NSCs 이식한 부위에서 상대적으로 적은 악성 α-syn(p129-α-syn)이 관찰되고, 건강한 도파민성 신경세포 관찰됨. scale bars, 50 μm(B, C, F), 100 μm(G)].
도 5는 Og-NSC 이식 후 나타날 수 있는 결과에 대해 다각도의 in vivo 예측 연구를 나타낸 것이다 [A: 도파민 신경세포의 이식 시 성공의 중요한 인자로 보고되어 있는 인자들의 발현을 Single cell RNA-seq data 에서 분석 결과, Og-NSCs 에서 상대적으로 높은 발현을 보임.(vs 2D-NSCs). 결과값은 색깔의 농도로 표시. log2(expression of unique molecular identifier(UMI) values)(좌), log2 Og/2D 발현값의 비율 평균으로 표시(우). B: pSyn-GCaMP6s-발현하는 신경세포를 dorsal striatum 에 이식하여, Two-photon 형광 endomicroscopy 관찰한 이미지 결과(상). GCaMP6s 형광의 각 다른색의 ROI(regions of interest)는 도면 위쪽 이미지의 동그라미로 표시됨(B, 하). C-F: Og-NSC-유래된 이식 부위의 Action potential firing 와 synaptic transmission. pDll1-GFP-hESCs로부터 분화되어, 신경줄기세포에서 형광을 발현하는 Og-NSCs 을 hemi parkinsonian 모델 동물의 선조체에 이식. 이식 1.5개월 후의 동물 뇌 슬라이스에서 Whole-cell patch clamp recording. 이식된 GFP+ 세포들의depolarizing current injection 으로 intrinsic excitability 관찰(C), -70 mV holding potential로 sEPSC 기록(D). Og-NSC 유래 이식부위의 sEPSCs의 평균 amplitude(E)와 frequency(F)를 이식하지 않은 부위의 정상 세포와 비교(좌). n=5(graft) 및 4(control, unlesioned) from 2 rats. G, H: 6-OHDA 파킨슨병 유발 동물에 이식된 Og-NSCs를 5개월 후에 ¹⁸F FP-CIT DAT binding 을 MRI와 PET 스캔으로 분석함. *p=0.021, n=8(graft) 및 5(control, lesioned). T: 이식 부위, scale bars, 200 μm.
도 6은 Og-NSCs 를 실제 파킨슨병 모델 동물에 이식 후 결과를 관찰한 것이다 [Og-NSCs 은 6-OHDA-유발 hemi parkinsonian 모델 랫트에 이식(A-O), 또한 필리핀 원숭이에도 이식함(P). A-C: 파킨슨병 동물의 이식 후, 행동학적 분석. A: 이식 6 개월 후, 암페타민-유발 rotation 스코어 관찰함. 시작 시점에 14마리 파킨슨병 모델 동물이 Og-NSCs 이식받았고, 암페타민-유래 행동학적 회복 스코어는 이식 후 1-6 달 동안 매달 분석함. 1-4개월 동안, 6 마리의 행동학적 회복 스코어가 >60% 이면, 분석을 위해 희생시켰음. 이식받기 전의 행동학적 스코어 분석 자료를 근거로 회복을 그것의 %로 표시함. 대조군으로는 생리식염수 이식 그룹으로 7마리를 사용하였다.(sham-(PBS-injected) controls(n=7) 분석은 *p=7.8e-10-0.037, one-way ANOVA.) Og-NSC-이식된 동물 모델의 다른 행동학적 실험으로 이식 6개월 후에 step adjustment tests 실시함, *p=5.58e-07-0.0006, one-way ANOVA, Tukey's post hoc analysis(B) 또한 cylinder tests도 실시함, *p=1.63e-08-0.000424, one-way ANOVA, Tukey's post hoc analysis(C)(n=8). D: Og-NSC-이식된 동물 모델 이식 후 6개월에 도파민 신경세포의 형태를 Neurite tracing(Neurolucida) 이미지로 관찰한 결과 성숙한 형태로 분화되었음을 확인함. E-O: 조직 형태학적 분석을 형광염색으로 확인함. E-G: 이식 부위의 TH⁺/FOXA2⁺, TH⁺/LMX1A⁺, TH⁺/NURR1⁺ 도파민성 신경세포 확인. 아래 확대된 이미지를 통해 이식된 도파민성 신경세포가 진정한 중뇌형의 신경세포임을 확인함. I: 중뇌성 인자들과의 형광 염색 결과 발현%를 8마리의 동물 이식 부위에서 확인함(13,697 TH⁺ 세포 개수 분석함). L-P: 이식 6개월 후에 이식 부위를 부피로 계산(L), TH+ 신경세포의 개수(M), density(N), body size(O) (n=8 rats). P, Og-NSC-이식된 성체 필리핀 원숭이(cynomolgus)에 이식 1개월 후에, TH+ 도파민 신경세포 중에 인간세포 유래 이식된 세포임을 나타내는, STEM121을 발현하고, 중뇌성 마커로 FOXA2 와 NURR1을 발현하는 이식된 도파민성 신경세포 확인. scale bars, 50 μm(E-G bottom, H, J, K, P bottom), 200 μm(P top), 500 μm(D-G)].
도 7은 hPSC로부터의 중뇌 유사 오가노이드의 생성 및 특성을 나타낸 것이다[A: 중뇌 유사 오가노이드를 생성하기 위한 실험 절차의 개략도. 시험관내(DIV) 배양 일에 걸친 오가노이드의 B-D, 위상차 이미지. 스케일 바, 200 μm. E-O: 오가노이드에 형성된 신경 구조에 대한 대표적인 면역 형광 이미지. 오가노이드는 시험관내 표시된 날에 동결 절편화되고 지시된 항체로 염색되었다. V, 심실; VZ, 심실 구역; IZ, 중간 구역; MZ, 맨틀 존, 스케일 바, 100 μm(E-P), 200 μm(B-D)].
도 8은 본 발명의 방법에 의해 중뇌 신경 발생에 중요한 FGF8의 처리 시간 조절로 중뇌 신경줄기세포 유지가 효율적으로 개선됨을 나타낸 것이다 [A: 프로토콜 A 및 B의 FGF8b 처리 계획. B: 2개의 상이한 FGF8b 처리 계획으로 산출된 오가노이드(Og)-NSC에서 복부 중뇌(VM)-특이적 및 시상 하부-특이적 마커의 발현에 대한 RNA-seq 데이터. C: 프로토콜 A 및 B로 유도된 EN1⁺/TH⁺ mDA 뉴런에 대한 대표 이미지. 스케일 바(50μm)].
도 9는 복부 중뇌(VM) 신경 줄기/전구 세포(NSC) 또는 2D 배양 환경에서 hPSC로부터 2D-NSC 생성을 나타낸 것이다[A: 2D에서 분화 hPSC의 세포 계대 동안 성상 세포 조절 배지(ACM) 처리의 요구. NSC를 제조하기 위해, ACM의 부재(-) 또는 존재(+)에서 VM-패터닝 화학 처리(상단 전, 상부 패널)로 분화된 hPSC를 분리하고 도금(통과 후)하였다. 표시된 중뇌-특이적 인자를 발현하는 세포의 위상차 및 면역 형광 염색의 이미지가 제시된다. B: 2D 배양 기반 hPSC-NSC/mDA 뉴런 분화 프로토콜의 도식적 개요. C에 의해 추정된 2D-NSC에서의 VM-특이적 NSC 마커 발현 NSC 확장 2주 후 면역 형광 염색. D: 집단 배가 수준(PDL, 막대) 및 누적 PDL(선)에 의해 표현된 2D-NSC의 세포 확장. E-F: mDA 뉴런은 분화 후 12-15일 후에 Og-NSC로부터 산출되었다. DA 뉴런(TH⁺ 세포의 %)의 중뇌-특이적 마커 발현을 3개의 독립적인 실험(F)으로부터 정량화하였다. 스케일 바, 50 μm].
도 10은 신경 줄기/전구 세포(NSC) 및 오가노이드-(상) 및 2D 기반 배양(하)에서 중뇌 관련 마커를 표현하는 mDA 신경세포에 대한 대표 이미지를 나타낸 것이다 [스케일 바, 50 μm].
도 11은　개발된 본 프로토콜이 인간 배아줄기세포/유도만능 줄기세포에 다양한 줄기세포주에 모두 범용 가능한 프로토콜임을 보여주는 결과이다 [복부 중뇌(VM) 신경 줄기/전구 세포(NSC) 및 중뇌-특이적 마커를 발현하는 mDA 신경세포는 시험된 모든 hPSC 라인에 걸쳐 생성된다. 3개의 hESC 및 4 hiPSC 라인을 도 1의 a에 요약된 오가노이드 프로토콜을 사용하여 VM-타입 NSC로 분화하도록 유도하였다. NSC는 2-3 세포 통과로 확장되었고 mDA 신경세포로 NSC의 최종 분화가 유도되었다. 말단 분화 후 7-12일 후 중뇌 마커 FOXA2, LMX1A, NURR1 및 EN1을 발현하는 NSC 단계(확장) 및 TH⁺ mDA 신경세포에서 FOXA2⁺, LMX1A⁺ NSC에 대한 대표적인 면역 염색 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바, 50 μm].
도 12는 오가노이드(Og)-신경줄기/전구 세포(NSC)는 인간 mDA 신경세포에 대한 확장 가능하고, 양적인 면에서나 그 세포생물학적 특성 유지에 있어서, 범용의 세포 치료제로의 사용 가능할 정도의 공급이 가능함을 보여주는 결과이다. [A: 5 세포 계대를 갖는 NSC 확장을 사용하여 미분화된 hPSC 1 다쉬로부터 mDA 뉴런 7,260 바이알(9,075 디쉬)을 생성하는 오가이드-기반 프로토콜의 도식적 개요. B: 다수의 NSC 계대 동안 Og-NSC의 mDA 신경원 용량의 유지. 　좌측에는 FOXA2+, NSC 단계에서의 LMX1A⁺ NSC(확장) 및 중뇌 마커 FOXA2, LMX1A, NURR1 및 EN1을 발현하는 TH+ mDA 뉴런에 대한 대표적인 면역 염색 이미지가 말단 분화 후 10-18일에 도시되어 있다. NSC 및 mDA 뉴런에서의 중뇌 마커 발현은 우측의 그래프에서 정량화되었다. n = 3 개의 독립적인 실험. C: mDA 신경원성 전위를 변경시키지 않으면서 액체 N2에 Og-NSC의 저장. 액체 N2 저장 있는(+) 그리고 없는(-) H9 Og-NSC로부터 분화된 mDA 뉴런의 대표적인 면역 염색 이미지가 도시되어 있다. 스케일 바, 50 μm].
도 13은 PD-iPSC로부터 유래된 mDA 신경세포를 이용한 PD 약물의 후보 화합물 스크리닝을 나타낸 것이다 [A: 실험 절차의 개략도. PD 환자(PD-ips1)로부터 유래된 hiPSC를 오가노이드-기반 프로토콜을 사용하여 mDA 신경세포로 분화시켰다. PD-iPSC-mDA 신경세포의 세포 생존을 MTT 분석 및 TH-양성 DA 신경세포의 면역 형광 강도-기반 카운팅을 사용하여 화합물의 존재 하에 평가하였다. Image Express Microconfocal(Molecular Devices, San Jose, CA)을 사용한 고함량 스크리닝(HCS) 분석을 TH 강도-기반 mDA 신경세포 생존 분석에 사용하였다. B: MTT 분석(상부) 및 TH⁺ 강도 측정(하부)에 의해 얻어진 스크리닝 데이터의 예. 노란색 선, 대조군의 평균값(비히클). C: 비히클(상부) 및 화합물 #9를 사용하여 10일에 PD-iPSC 유래 mDA 신경세포의 대표적인 TH/MAP2 이미지].
도 14는 계대 배양에 따라, 오가노이드(Og) 신경 줄기/전구 세포(NSC) 분화 발달 중뇌(VM)에서 mDA 신경세포의 개발 그 세포의 특성을 요약한 것이다. Og-NSC의 말단 분화는 bFGF의 철회 및 신경 영양 인자 BDNF, GDNF 및 cAMP의 존재에 의해 유도되었다. 면역 세포 화학적 분석은 증식 세포(Ki67), 성숙 신경세포(MAP2), DA 신경세포(TH) 및 중뇌(FOXA2, LMX1A, NURR1)에 특이적인 항체를 사용하여 지시된 분화 일에 수행되었다. 스케일 바, 50 μm.
도 15는 오가노이드(Og) 및 2D-NSC에서 신경 줄기/전구 세포(NSC)-(A), 만능 세포-(B) 및 세포 노화-특이적 유전자(D)의 단일 세포 RNA 발현 패턴을 나타낸 것이다 [다능성 유전자 SSEA4 및 TRA1-60의 낮은 발현 수준은 FACS 분석(C)에 의해 추가로 평가되었다].
도 16은 3D 대뇌 피질 오가노이드를 이용하여 대뇌 피질 신경줄기세포 분리를 위한 세부 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 17은 3D 대뇌 피질 오가노이드를 이용하여 신경줄기세포를 확보함을 나타낸 것이다[좌 그래프: 분화 프로토콜 적합성을 대뇌 마커인 pax6 발현을 통해 확인하였다. 우: 위쪽 사진은 오가노이드 해체(chop) 전에 사진으로 제대로 된 형태의 오가노이드 형성을 확인하였고, 아래 사진은 해체한 이후에 정상적인 신경줄기세포 형태로 성장함을 확인하였다].
도 18은 2D 및 3D 유래 배양으로부터 중뇌-신경줄기세포로의 최종 확립된 직접 분화 프로토콜을 나타낸 것이다[A: 인간 배아줄기세포를 이용해 단계적으로 배아줄기세포로부터 중뇌-신경줄기세포로의 직접 분화(Direct differentiation), 성상전구세포 확보, 그리고 그 이후에 성상 세포로의 말단 분화(Terminal differentiation)기술을 확립, B: 대뇌피질유래 성상교세포 확보의 프로토콜.(A)는(B)와 그 패턴화 법에 있어서 상이].
도 19는 2D 및 3D 유래 배양으로부터 중뇌-신경줄기세포로의 직접 분화 프로토콜을 이용한 성상교세포의 제조를 나타낸 것으로, 기존의 이차원적 배양법에 대비하여 본 발명의 방법으로 유래된 세포들이 보다 건강하고 마커 유지가 잘되는 행상된 형태의 세포임을 보여준다.
도 20은 in vitro 배양된 대뇌 피질형 및 중뇌형 성상교세포의 특성을 분석한 것으로, 둘 간에는 실제적인 신경세포의 지지 기능면에서는 중뇌 유래 성상세포가 유전자 분석 시 우수함을 보여준다.
도 21은 in vivo 이식 후 대뇌 피질형 및 중뇌형 성상교세포의 특성을 분석한 것으로, 둘 간에는 실제적인 신경세포의 지지 기능면에서는 중뇌 유래 성상세포가 유전자 분석 시 우수함을 보여준다.
도 22는 in vivo 성상전구세포의 이식으로부터 미세아교세포의 M2 타입의 양질의 세포로의 변화를 나타낸 것으로, 이는 향후 성상세포의 이식 시 그 환경의 개선이 가능하므로, 활용도가 클 것임을 예측할 수 있다.
도 23은 Xeno-free 시스템을 이용한 다른 종류의 유도만능 줄기세포의 적응 배양 결과를 나타낸 것이다. 실제 세포치료제 개발 시에는 Xeno-free 시스템을 이용해서 다양한 라인에 적용이 중요하므로, 기본적인 결과이다.
도 24는 다른 종류의 유도만능 줄기세포(CMC-iPSC#11)의 중뇌성 성상세포군으로의 프로토콜 적용 확인(좌) 및 정상적인 신경세포 분화 확인(우)을 나타낸 것이다.
도 25는 다른 종류의 유도만능 줄기세포(CMC-iPSC#11)의 프로토콜 적용을 확인한 것이다.
도 26은 TGF-β와 LIF를 이용한 효율적인 분화 유도를 통해 프로토콜 적용을 확인한 것이다.
도 27은 생성한 중뇌 성상교세포의 생리학적 특성을 분석한 것이다.
도 28은 중뇌형 성상교세포의 조건화 배지를 활용한 미세아교세포의 변화를 관찰한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vitro로 검증하였다.
도 29는 염증 유도 후 성상교세포 조건화 배지로 사멸 인자 억제 가능성을 확인한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vitro로 검증하였다.
도 30은 염증 유도 후 성상교세포 조건화 배지로 항염증 효과를 RT-PCR 을 이용하여 확인한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vitro로 검증하였다.
도 31은 선조체에 성상교세포 이식 후 비이식 부위와 염증반응 관련 RNA 발현을 분석한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vivo로 검증하였다.
도 32는 In vivo 성상교세포 이식 후, M1 마커 iNOS 발현을 나타낸 것이다. 신경줄기세포 이식 부위에 대비하여, 염증이 덜 발생되는 것을 확인하였다.
도 33은 In vivo 성상교세포 이식 후, M1 마커 CD11b 발현을 나타낸 것이다. 신경줄기세포 이식 부위에 대비하여, 염증이 덜 발생되는 것을 확인하였다.
도 34는 In vivo 성상교세포 이식 후, M1 마커 CD16.32 발현을 나타낸 것이다. 신경줄기세포 이식 부위에 대비하여, 염증이 덜 발생되는 것을 확인하였다.
도 35는 In vivo 성상교세포 이식 후, M2 마커 CD206 발현을 나타낸 것이다. 신경줄기세포 이식 부위에 대비하여, 염증이 덜 발생되는 것을 확인하였다.
도 36은 3D 오가노이드를 이용하여 시상하부 신경줄기세포 분리를 위한 세부 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 37은 3D 시상하부 오가노이드를 확보하고, 이에 맞는 마커의 발현을 확인한 것이다. 특이 마커로서 nestin, Rax, Sox2 의 발현이 잘 일어난다.
도 38은 증식 가능한 시상하부 신경줄기세포 확보됨을 확인한 것이다 [a: 시상하부 신경줄기세포 마커인 nestin/Rax를 97% 발현하는 4계대까지 증식 가능한 신경줄기세포 확보; b: 시상하부 신경줄기세포의 시상하부 관련 유전자 발현 확인].
도 39는 시상하부 신경줄기세포의 분화 유도 후 정상적인 신경세포와 성상교세포 분화를 확인한 것이다.
도 40은 시상하부 신경줄기세포로부터 분화 유도 후 렙틴(leptin)에 반응성 있는 세포로의 분화를 확인한 것이다. 이러한 기능 분석으로 시상하부세포의 기능적 특징을 잘 보이고, 분화후에 시상하부 신경세포 마커인 NPY, AGRP의 발현이 증진되어 있음으로, 기능적으로도 마커 발현 측면에서도 원하는 시상하부 신경줄기세포로의 패턴화가 잘 되었음을 확인하였다.
도 41은 3D 오가노이드 이용으로 개발된 시상하부 신경줄기세포가 이차원적 2D 환경에서 개발된 것 보다 생체 내의 마커 유전자군을 많이 발현함을 나타낸 것이다.
도 42는 3D 오가노이드 이용으로 개발된 시상하부 신경줄기세포의 생체 이식 가능성을 확인한 것이다.

이하, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 인간 유도만능 줄기세포로부터 중뇌 오가노이드를 이용하여 mDA(중뇌 도파민) 신경세포로의 분화

[실험방법]

인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능 줄기세포의 배양

한양대학교(서울, 대한민국)의 IRB(institutional review board)에 의해 승인된 hESC 리서치 가이드라인을 기초로 hESCs 및 hiPSCs를 배양하였다. 본 실험에서 사용된 hESCs 및 hiPSCs는 하기 표 1에 나타내었다.

hESC line
Name used in this paper	Original name	Karyotype		Establishing institute
HSF6	UC06	Female(46, XX)		UCSF
H9	WA09	Female(46, XX)		Wi cell
HUES6	HUES6	Female(46, XX)		Harvard University(HSCI iPS Core)
hiPSC line
Name used in this paper	Original name	Source (Human)	Reprogramming factors		Methods	Establishing Institute
Retro-1	Rv-hiPS 01-1	Newborn fibroblast	OCT4, SOX2, KLF4, MYC		Retrovirus	Harvard
Epi-ips	episomal-ips1	Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector	Hanyang Univ. (Our own)
CMC-ips#11	CMC-hipsc-011	Bone marrow blood	OCT4, SOX2, KLF4, MYC		Sendai virus	Catholic Univ.(Korea NIH SCRM)
PD-ips1	PD patient derived ips-1	Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector	Hanyang Univ. (Our own)
PD-#22	Corr. PD-ips#22	Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector and genome edited	Hanyang Univ. (Oure own)

미분화 hESC/iPSC의 증식 및 유지를 위해, 피더층 없이 37℃ 설정된 CO₂ 인큐베이터에서, mTESR-1 배지(Stemcell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canada)를 이용하여 Matrigel^TM 상에서 혹은 vitronectin(Human; Gibco Fisher Scientific, Waltham, MA)(Gibco A31804; 0.5 μg/cm²)-코팅된 6cm 디쉬(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 상에서 배양하였고, 배지 교체는 매일 수행하였다. 미분화된 줄기세포들은 매일 배지 교체로 분화능이 유지되었으며 4~5일마다 Acutase(Stemcell Technologies Inc.)를 이용하여 계대배양되었다.

3D 오가노이드제작법을 활용한 중뇌형 신경줄기세포의 제작

간단하게, 중뇌형의 3D 오가노이드를 먼저 제작하고, 이를 잘게 잘라서 배양접시에서 중뇌형의 신경줄기세포 상태로 대량 증식시키는 시스템을 사용하였다.

미분화 상태로 정상 배양하고 있던, hESC 및 hiPSC를 계대배양 시 Accutase^TM를 이용하여 떼어내고 바닥에 붙지 않는 바닥 둥근 형태의 96 well plate 에다가 미분화 상태의 인간배아줄기세포를 10,000 세포/well 로 분주하여 일단 오가노이드를 형성하게 하였다. 첫날의 배지 조성은 아래 표 4의 seeding base 배지에 표 2의 Day0에 해당하는 첨가물 조건(SB431542, 10 μM; Noggin, 100 ng/ml; ascorbic acid, 200 μM; Doxycyclin, 1 μg/ml; Y27632, 20 μM)으로 오가노이드 발생을 시작하였다. 다음날은 배지를 neural inducing base media(표 3)로 하고, 첫날 첨가 성분 중에 Doxycyclin, 1 μg/ml, Y27632, 20 μM을 제외한 성분에다가 추가적으로 purmophamine 2 μM, sonic hedgehog 100 ng/ml 을 첨가하면서 발생 유도하였다.(표 2 참조) 배양배지는 11일까지 neural inducing base media로 하고 첨가성분은 표 2 참조하여 첨가물을 농도에 맞춰 가감하며 발생 유도하였다. 배지는 날짜에 맞게 매일 교환하였다. 오가노이드의 바른 형성은 2~3일째에 세포괴의 형성으로 확인하고, 11일 이전에 세포 외곽으로의 buding 으로 체크하였다. 오가노이드 분화 11일째에 96well plate 에 하나씩 형성되어있는 오가노이드를 8개씩 그룹화하여 6 well low binding plate 한 well에 분주 배양하였다. Orbitary shaker(80~100 rpm)로 돌리면서 표 2의 성분이 들어간 midbrain patterning base media(표 3) 하에서 발생 유도하였다. 18일째에 30G 바늘로 하나의 오가노이드를 4~10 조각 정도로 잘라서 Accutase^TM를 10분간 처리한 후 1 ml 피펫으로 5회 피펫팅 후 원심분리법으로 Accutase^TM를 제거 후에 3 well 분량의 오가노이드 세포를 poly-L ornithine(PLO; 15 μg/cm²)/Fibronectin(FN; 1 μg/cm²) 혹은 vitronectin(VN; 0.5 μg/cm²) 코팅된 하나의 60mm 배양접시에 center plating 하였다.

Day 0	Seeding Base Media(recipe below) + SB431542(Tocris, #1614 10 μM) + Noggin(Peprotech, #120-10, 100 ng/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM) + Doxycycline(Sigma, #D9891, 1 ㎍/ml) + Y27632(Sigma, #Y0503, 20 μM)
Day 1	Neural Induction Base Media(recipe below) + SB431542(Tocris, #1614 10 μM) + Noggin(Peprotech, #120-10, 100 ng/ml) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2μM) + SonicHedgeHog(Peprotech, #100-45, 100 ng/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 2~4	Neural Induction Base Media(recipe below) + SB431542(Tocris, #1614 10 μM) + Noggin(Peprotech, #120-10, 100 ng/ml) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2μM) + SonicHedgeHog(Peprotech, #100-45, 100 ng/ml) + CHIR99021(Stemgent, #04-0004, 0.8 μM) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 5~6	Neural Induction Base Media(recipe below) + Noggin(Peprotech, #120-10, 100 ng/ml) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2 μM) + SonicHedgeHog(Peprotech, #100-45, 100ng/ml) + CHIR99021(Stemgent, #04-0004, 0.8 μM) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 7~10	Neural Induction Base Media(recipe below) + Noggin(Peprotech, #120-10, 100 ng/ml) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2 μM) + SonicHedgeHog(Peprotech, #100-45, 100 ng/ml) + Fgf8b(Peprotech, #AF-100-25, 100 ng/ml) + CHIR99021(Stemgent, #04-0004, 0.8μM) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 11~14	Midbrain Patterning Base Media(recipe below) + Noggin(Peprotech, #120-10, 100 ng/ml) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2 μM) + SonicHedgeHog(Peprotech, #100-45, 100 ng/ml) + Fgf8b(Peprotech, #AF-100-25, 100 ng/ml) + CHIR99021(Stemgent, #04-0004, 1.5 μM) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 15~16	Midbrain Patterning Base Media(recipe below) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2 μM) + Fgf8b(Peprotech, #AF-100-25, 5 0ng/ml) + CHIR99021(Stemgent, #04-0004, 1.5 μM) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 17	Midbrain Patterning Base Media(recipe below) + Purmorphamine(Calbiochem, #540223, 2 μM) + Fgf8b(Peprotech, #AF-100-25, 50 ng/ml) + CHIR99021(Stemgent, #04-0004, 1.5 μM) + bFGF(R&D systems, #233-FB, 20ng/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200 μM)
Day 18	Chop&Plating

Seeding Base Media	Neural Induction Base Media	Midbrain Patterning Base Media
Neurobasal/N2 2X(1:1) (Neurobasal, Gibco, #21103049) (N2 2X recipe as follows(1 L) D.W. 1L DMEM-F12 12 g Sodium Bicarbonate 1.69 g D-glucose 1.55 g L-Glutamine 0.073 g Apo-transferrin 200 mg Putrescine 200 ㎕ Selenite 120 ㎕ Progesterone 400 ㎕) MEM-NEAA (Sigma, #M7145, 1:100) β-mercaptoethanol (Sigma, #M6250, 0.1%) B27 w/o VitA (Gibco, #12587010, 1:50) GlutaMAX (Gibco, #35050061, 1:100) Insulin (Gibco, #12585014, 0.31㎕/ml)	Neurobasal/N2 2X(1:1) (Neurobasal, Gibco, #21103049) (N2 2X recipe as follows(1 L) D.W. 1 L DMEM-F12 12 g Sodium Bicarbonate 1.69 g D-glucose 1.55 g L-Glutamine 0.073 g Apo-transferrin 200 mg Putrescine 200 ㎕ Selenite 120 ㎕ Progesterone 400 ㎕) B27 w/o VitA (Gibco, #12587010, 1:50) Insulin (Gibco, #12585014, 0.31㎕/ml)	Human N2 (human N2 recipe as follows(1 L) D.W. 1 L DMEM-F12 12 g Sodium Bicarbonate 1.69 g D-glucose 1.55 g L-Glutamine 0.073 g Apo-transferrin 200 mg Insulin 312 ㎕ Putrescine 100 ㎕ Selenite 60 ㎕ Progesterone 200 ㎕)

중뇌 3D 오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포의 대량 증식

오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포는 30G needle 로 물리적으로 잘라서 계대배양하는 첫번째 plating 이후에는 계대배양을 위하여 일주일에 한 번씩 80~90% 정도 세포가 충만되었을 때, Accutase^TM를 이용하여 PLO/FN 혹은 PLO/VN 코팅된 60mm 배양접시에 3 X 10⁶의 세포를 평면 배양하였다. 중뇌형 신경줄기세포의 배양 배지는 표 4에 있는 midbrain patterning base 배지에 마이토젠(bFGF 20 g/ml, FGF-8 50 ng/ml), BDNF(20 ng/ml), GDNF(20 ng/ml), Ascorbic acid 200 μM, Doxycyclin, 1 μg/ml 를 첨가한 것을 증식 배지로 사용하였다. 단, 계대배양 당일은 이 배지에 Y27632, 20 μM를 첨가하였다. 매 계대배양마다 PLO/VN 24 well 코팅 플레이트에도 well 당 8 X 10⁴ 세포를 플레이팅하여 2~3일간 증식 후, 80-90% 세포 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때, 중뇌형 마커의 형광염색 혹은 마이토젠(mitogens; bFGF, FGF-8)를 제거함으로 인하여 NSCs의 분화를 유도하였다. 분화 배지는 상기 표 4에 있는 midbrain patterning base 배지에 BDNF(20ng/ml), GDNF(20ng/ml), Ascorbic acid 200uM, cAMP 500 uM을 첨가하여 12일간 신경세포 분화 유도 후 도파민성 신경세포와 중뇌형 마커가 공 발현되는지의 여부를 점검하였다.

3D 오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포의 냉동 보관

오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포는 대체적으로 5 계대까지는 최소한 그 특성의 변화가 없으므로 첫 번째 계대 이후 매 계대 마다 그 세포의 냉동보관 후 특성의 변화 없이 해동 사용이 가능하다. 세포의 냉동 보관은 계대 배양 시에 이루어지고, Accutase^TM를 이용하여 세포를 떼어내고 세포의 수를 계수하여 냉동 하나의 vial 에 6 X 10⁶의 세포를 증식배지와 10% 농도로 DMSO를 섞은 냉동 배지에 플어서 얼렸다. 첫 번째 24시간 동안 -70도 냉동 보관 후 다음 날 초저온 질소탱크에 사용시까지 보관하였다. 필요 시 하나의 vial을 37도 워터 베스에 빨리 해동하여, PLO/FN 혹은 PLO/VN 코팅된 60mm 배양접시에 평면 배양하였다. 해동 시 사용 배지는 신경줄기세포 증식배지를 사용하고, 해동 당일에는 이 배지에 Y27632, 20 μM를 첨가하였다.

면역 세포 화학

세포를 PBS(phosphate-buffered saline) 내에서 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 블록킹 용액(PBS 내의 1% BSA/0.03% 트리톤 X-100) 내에서 배양하였으며, 그런 다음 하기의 1차 항체들과 함께 배양하였다. Tuj1 항-토끼(1:2000, Babco), TH 항-마우스(1:1000, Immunostar), GFAP 항-마우스(1:100, ICN Biochemicals), 마이크로튜불-연관 단백질 2(MAP2, 1:200, Sigma) 하기의 형광 분자들로 표지된 2차 항체들을 시각화를 위해 사용하였다. 그 이외의 항체들은 표 4에 나열되어 있다. 알렉사 488(1:200, Invitrogen) 및 Cy3(1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories). DAPI 마운팅 배지를 갖는 벡타쉴드(Vectashield)(Vector Laboratories) 내에 염색된 샘플을 마운트하였고, 표면형광(epifluorescence) 현미경(Leica)을 이용하여 촬영하였다.

Antibodies	Working dilution	Company	Notes
Mouse monoclonal Antibody(Ab)
Oct4	1:200	1Santa Cruz Biotechnology	Use only Cy3 2nd antibody
Pax6	1:100	2DSHB
Cdh2(N-cadherin)	1:500	Santa Cruz Biotechnology
Neuron-specific class III beta-tubulin(TuJ1)	1:500	3Covance
Tyrosine Hydroxylase(TH)	1:1000	4Immunostar	Incubation for 2 days at 4℃
Ki67	1:100	5Novocastra
Pax5	1:50	6BD Biosciences
human Neural Cell Adhesion Molecule(hNCAM)	1:100	Santa Cruz Biotechnology
HuC/D	1:100	7Chemicon
Microtubule-Associated Protein 2(MAP2)	1:200	8Sigma
Dopamine Transporter(DAT)	1:100	BD Biosciences	Blocking with 0.1% Saponin
Human Nuclei antigen(HN)	1:1000	Chemicon
Rabbit polyclonal Ab
Nanog	1:200	Santa Cruz Biotechnology
Nestin #130	1:50	9Dr Martha Marvin, Dr Ron McKay
Sox2	1:100	Chemicon
TuJ1	1:2000	Covance
Pax2	1:100	Covance
TH	1:500	10Pel-freez
GFAP	1:400	11DAKO
Serotonin	1:4000	Sigma
γ-aminobutyric acid(GABA)	1:700	Sigma
GAD67	1:500	Chemicon
Vesicular monoamine transporter 2(VMAT2)	1:500	Pel-freez	Use only cy3 2nd antibody
Nurr1	1:500	Chemicon	0.1% SDS treatment for 5min before blocking
EN1	1:200	Chemicon	Incubation for 2 days at 4℃
Calbindin1, 28kDa(calbindin D28K)	1:250	Chemicon
potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 6(GIRK2)	1:200	Sigma
Cleaved Caspase-3	1:500	12Cell signaling

파킨슨병 모델 동물에 세포 이식 및 조직학적 절차

실험은 NIH(National Institutes of Health) 지침에 따라 수행되었다. Hemi-parkinsonian을 흑색질의 우측(AP-4.8 mm, ML-1.8 mm, V-8.2 mm) 및 MFB(median forebrain bundle)(AP -4.4 mm, ML -1.2 mm, V -7.8 mm)에 6-OHDA(6-hydroxydopamine, 8 μg/μl; 시그마) 3 μl의 단독 정위 주사로 성숙한 암컷 Sprague-Dawley 랫트(220-250g)에 유도하였다. 절치 막대(incisor bar)는 -3.5 mm로 설정되었고, AP와 ML 좌표는 브레그마에 상대적으로 주어진다. 암페타민-유도 회전 검사에서 상기 장애에 대해 같은 쪽 300회/시간을 가지는 랫트를 선택하였다. 이식을 위해, 랫트 E12 VM-NPC를 증식시키고, 2 : 1 비율로 Ctx^-, VM^- 성상교세포, N⁺F^-VM^- 성상교세포 또는 E14 Ctx^-NPCs(대조군)과 혼합시켰다. 혼합된 세포(1.5 x 10⁵ 세포/μl) 3 ㎕를 Rompun 100 μl/100 g(23.32 mg/ml)과 혼합된 100 μl/100 g(50 mg/ml)의 Zoletil에 의해 유도된 마취 하에서 선조체(bregma 및 dura에 상대적인 AP, ML 및 V의 좌표: [1] 0.07, -0.30, -0.55; [2] -0.10, -0.40, -0.50; 제로 아래 3.5 mm로 설정한 절치 막대)의 2개의 부위 각각에 10분에 걸쳐 주사하였다. 각 주사 완료 후 5분 동안 바늘(22 게이지)을 제 위치에 두었다. 랫트는 이식 1일 전부터 시작하여 1개월 동안 계속 시클로스포린 A(10 mg/kg, i.p.)를 매일 투여받았고 나머지 이식 후 기간 동안 면역 억제제 없이 유지되었다. 이식 6개월 후, 동물을 마취시키고 4% 파라포름알데히드로 경피 관류시켰다. 뇌를 제거하고 PBS 내 30% 수크로오스에 밤새 담그고 Tissue-Tek(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에서 냉동시킨 다음 냉동 마이크로톰(Leica)에서 슬라이스하였다. 자유 부동성 뇌 Free-floating brain부분(30 μm 두께)은 위에서 설명한대로 면역 조직 화학을 시행하고 공초점 현미경(Leica)으로 이미지를 얻었다. 이식된 뇌의 숙주 환경을 시험하기 위한 실험에서, 이식 후 1달째에 동물을 희생시키고 랫트 뇌 슬라이스 매트릭스(ZIVIC Instruments, Pittsburgh, PA) 상에서 1 mm 두께로 슬라이스하였고, 이식 후의 변화를 관찰하기 위해 이식부위의 조직을 적출하였다. 이식-숙주 계면(ca 2x2 mm)/이식의 8-12 군데의 영역을 해부하고 qPCR 분석을 수행하였다. 또한, 신경영양 및 전-염증성 아교세포 마커에 대해 면역 반응성인 세포는 이식 후 7-10 일에 동결 절단된 뇌 슬라이스의 이식-숙주 계면을 따라 계수되었다.

행동 테스트

동물 행동은 Y. H. Rhee et al., 의 논문(LIN28A enhances the therapeutic potential of cultured neural stem cells in a Parkinson's disease model. Brain: a journal of neurology 139, 2722-2739, 2016)에 기술된 것처럼 아포모르핀/암페타민-유도 회전 테스트를 사용하여 평가되었다. 아포모르핀(Sigma사)을 0.5mg/kg의 투여량으로 피하 주사하고 60분간 회전하며 관찰하였다. 결과는 최종 회전 수/60분의 단위로 나타내었다.

동물 PET/MRI 이미징 및 분석

PET-MRI 융합 영상화는 nanoScanPET/MRI 시스템(1T, Mediso, Hungary)을 사용하여 수행되었다. 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 0.2 mL의 FP-CIT에 꼬리 정맥 6.5±1.0 MBq를 통해 정맥 내로 투여하고 쥐를 마취(100% O₂ 가스 중 1.5% 이소플루란)로 유지하였다. MR 뇌 영상화는 FP-CIT 흡수 기간 동안 획득된 그라디언트 에코(GRE) 3D 시퀀스(TR= 25 ms, TE_eff= 3.4, FOV= 50 mm, matrix= 256x256)로 가중치가 부여된 T1 및 고속 스핀 에코(FSE) 3D 시퀀스(TR= 2400 ms, TE_eff= 110, FOV= 50 mm, matrix= 256x256) 가중치가 부여된 T2 이미지를 얻었다. 20분의 정적 PET 이미지는 MRI 범위의 단일 시야에서 1-3의 일치로 획득되었다. 동물 베드(헝가리 Multicell Mediso, 헝가리)의 가열 공기로 체온을 유지하고 호흡 유발을 위해 압력 감지 패드를 사용했다. PET 이미지는 Tera-Tomo 3D에 의해 전체 탐지기 모드에서 모든 수정과 높은 정규화 및 8회 반복으로 재구성되었다. 재구성된 이미지의 3차원 VOI(volume of interest) 분석은 InterView Fusion 소프트웨어 패키지(Mediso, Hungary)를 사용하고 표준 흡수 값(SUV, standard uptake value) 분석을 적용하여 수행되었다. VOI는 코로나 이미지에서 2 mm 스피어로 고정되었고, 선조(striatum) 및 대한 VOI가 도출되었다. 각 VOI 부위의 SUV는 다음 식을 사용하여 계산되었다. SUVmean =(Bq/cc × 체중 단위로 관심있는 종양 부피의 종양 방사능)/ 주사된 방사능.

고 처리량 전체 전사체 RNA 시퀀싱

RNA의 경우, Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 분리한 후 Ribo-Zero Magnetic kit(Epicentre Inc., Madison, WI, USA)를 이용한 rRNA 제거를 수행하였다. 라이브러리 구축은 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit(Lexogen Inc., Vienna, Austria)를 사용하여 수행되었다. 고 처리량(High-throughput) 시퀀싱은 HiSeq 2000(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 paired-end 100 시퀀싱으로 수행되었다. RNA-Seq 판독 값을 TopHat 소프트웨어를 사용하여 맵핑하여 bam 정렬 파일을 수득하였다. 전사 영역에 맵핑된 리드 카운트는 BEDTools(v2.25.0) 및 R/Bioconductor(version 3.2.2; R Development Core Team, 2011)를 사용하여 정렬 파일에서 추출되었다. 정렬 파일은 전사체를 조립하고, 이의 존재비를 추정하고, 유전자, linc RNA 또는 아이소형의 차등 발현을 검출하는데 사용되었다. 유전자 영역의 발현 수준을 결정하기 위해 FPKM(fragments per kb of exon per million fragments)을 사용하였다. 샘플 간의 비교를 위해 전역 정규화를 사용하였다. 유전자 분류는 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)에 제출된 검색을 기반으로 한다.

GO 및 KEGG 경로 분석은 DAVID Bioinformatics Resources 버전 6.8을 사용하여 수행되었다. 풍부한 범주의 GO 및 KEGG 경로 분석은 p-값 0.05까지 제시되었다.

10× 유전체학 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 및 데이터 분석

단일세포 전사인자 조절분석(scRNA-seq)은 Chromium Controller(10× Genomics, San Francisco, CA) 프로그램을 이용하여, Chromium Single Cell Gene Expression Solution 과 Chromium Single Cell 3' GEM, Library and Gel Bead Kit v2(10× Genomics) 실험 후에 진행하였다. 15,000개의 단일세포로 분리한 세포를 Single Cell A chip with Master mix solution에 얹어서 진행하였다. 각기 단일세포들은 세포 내부의 전사인자들이 역전사되고, oligo dT 코딩된 UMIs 을 emulsion 하여 RNA 바코딩되었다. 바코드된 Libraries는 Illumina HiSeq 4000 platform(Macrogen Inc., Seoul, Korea)으로 시퀀싱되었다. Cell Ranger(v2.1.1, 10× Genomics)로 결과를 분석하였다. 2D-NSCs 분석 시에는, 2D_cellRanger로는 12,166 cells 대략 평균 57,343 reads 그리고 세포당 2,284 유전자(24,055 전체 유전자중) 그리고 Og-NSCs 분석 시에는(3D_cellRanger로) 13,739 cells 대략 평균 39,191 reads 그리고 한 세포당 2,353 유전자(23,860 전체 유전자중)가 분석되었다. 세포의 전사인자 발현은 UMI count로 표시하였다. t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding) 분석을 k-means clustering으로 세포의 다양성 분석을 수행하였다(performed by Loupe Cell Browser ver. 3.0.1, 10× Genomics, Inc.). 발현의 현저한 차이를 보이는 상위 40개의 발현 증가된 유전자들을 을 Hierarchical clustering analysis법으로 분석하고, 이를 기반으로 각 cluster 를 나누었다. Og-NSCs 의 GO and KEGG pathway 분석을 위해, 580 differentially upregulated genes(UMI > 1, log₂FC > 0.5, P < 0.05)을 분석하였다. 유전자 분석은 주로 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 이용하여 분석하였다. 네트워크 분석은 Cytoscape(version 3.7.1+JAVA v8, provided by NIGMS)을 이용하여 분석하였다.

미토콘드리아 기능 분석

미토콘드리아의 재생 다이나믹스는 integrated portions of young(green) and old(red) MitoTimer proteins(Ferree, A.W., Trudeau, K., Zik, E., Benador, I.Y., Twig, G., Gottlieb, R.A., and Shirihai, O.S.(2013). MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy 9, 1887-1896; Hernandez, G., Thornton, C., Stotland, A., Lui, D., Sin, J., Ramil, J., Magee, N., Andres, A., Quarato, G., Carreira, R.S., et al.(2013). MitoTimer: a novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy 9, 1852-1861)를 이용하여 분석하였다. NSCs 세포에 pMitoTimer 벡터(Addgene52659; Addgene, Watertown, MA)를 electroporation(NEPA21, Nepagene, Japan)으로 주입하여 발현시킨 후, 2일 후에, red 대비 green 형광으로 생성되는 미토콘드리아를 조사하였다. 미토콘드리아 ROS 및 멤브레인 포텐셜은 MitoSox(Thermo Scientific Inc., Waltham, MA)와 NucleoCounter3000(NC3000; Chemometec, Allerod, Denmark)로 각각 측정하였다. ROS 생성은 분석 2시간 전에 H₂O₂(500 μM)을 처리 후 유도 분석하였다. 미토콘드리아의 독성 저항성 연구는 10 μM Rotenone, 4 μM CCCP 또는 250 μM H₂O₂를 1시간 처리하여 TH 형광염색 분석하였다.

DA 방출 분석

DA 신경세포의 시냅스 전 활동은 분화된 VM-NPC 배양물에서 방출된 DA 신경전달물질의 수준을 측정함으로써 결정되었다. 24시간 배양된 배지(분화 12-13 일)를 수집하여 ELISA 키트(BA E-5300, LDN)를 사용하여 DA 수준을 측정하였다. 또한, 멤브레인 탈 극성에 의해 유발된 DA 방출은 56 mM KCl의 존재 또는 부재 하에 30분 동안 새로운 N2 배지에서 배양(배양 12일째) 배양함으로써 평가하였다. 유발된 DA 방출은 KCl 있는 DA 수준에서 KCl 없는 DA 방출을 뺀 값으로 계산되었다.

세포 간 α-syn 전달 분석

성상교세포에서 분비된 factor에 의한 세포간 α-synuclein 응집체 이동 확인

신경모세포종(neuroblastoma)에서 유래된SH-SY5Y(아주대 박상면교수님) 세포에 A53Tα-syn-EGFP 을 과발현되는 세포와의 공배양을 이용하여 분석 실험하였다.

5일간 RA를 이용하여 분화 유도하여, A53Tα-syn-EGFP가 발현되어 나오게 유도한 SH-SY5Y 세포를 듀얼 챔버 시스템으로, 10일간 분화 유도된 신경줄기세포와 24 시간 공배양하여 A53Tα-syn-EGFP의 이동을 GFP 발현 정도로 비교 분석하였다. αsynuclein의 이동(transmission)을 항체를 이용한 α-syn-GFP의 밝기를 통한 면역염색(Immunoncytochemistry)으로 확인하였다.

병리학적 α-syn 응집체 검출

분화 중 α-synuclein 응집체인 PFF(pre-formed fibrils)를 처리하여(8 μg/ml of medium) a-synuclein aggregation을 유발하며 20일 분화 후에 a-synucelin aggregation 정도를 분석하였다. 또는 lentiviruses expressing α-syn(pEF1α-α-syn) 를 이용하여 과발현 유도하여 분석하였다. Thioflavin S(단백응집을 측정하는 염색법; sigma Aldrich)과 a-synuclein 항체를 이용한 면역염색(Immunoncytochemistry) 및 단백질전기영동법(Western blot)으로 존재 확인 및 그 응집을 단백질 크기 변화로 관찰하였다.

Bi-FC(Bimolecular fluorescence complementation)

Og-NSCs 또는 2D-NSCs에 lentiviruses expressing Venus1-α-syn(V1S; N-terminal of α-syn), α-syn-Venus2(SV2; C-terminal of α-syn)를 발현 유도하고, 25일 분화된 도파민성 신경세포에서 Aggregated α-syn 를 GFP로 분석하였다.

이식된 이식편으로의 인 비보 a-syn 전파

암컷 SD(Sprague Dawley) 랫트들(225-250 g)에 AAV expressing human hα-syn(AAV2-CMV-hα-syn, 2×10¹³ genome copies)와 PFF(10 μg)를 선조체에 주사하여 발현 및 응집 유도하였다. anteroposterior(AP), -0; mediolateral(ML), -3.0; dorsoventral(DV), -5.0. 2주 후에, Og-NSCs 및 2D-NSCs을 선조체의 양쪽에 가가 이식하였다. 이식 한달 후, α-syn의 이식 세포 전이를 면역조직화학을 분석하였다(α-syn and p129-α-syn).

이식편에서 신경세포를 발현하는 GCaMP6의 2-광자 영상

시냅신 프로모터(pSyn-GCaMP6s)의 제어 하에 GCaMP6(Addgene, # 40753)을 생성하고 인비트로 배양을 형질도입하는데 사용하였다. 각각의 형질도입 반응에 2 ml/6-cm 디쉬 또는 200 μl/웰(24-웰 플레이트) 및 10⁶ 형질도입 단위(TU/ml(60-70 ng/ml)를 사용하였다. AAV2-CMV-hα-syn의 패키징 및 생산은 한국과학기술연구원(서울)에서 수행 하였다.

3 계대에서의 Og-NSC는 이식 3일 전에 렌티바이러스(pSyn-GCaMP6)로 형질도입되었다. 이어서, 세포를 4개의 야생형 SD 랫트에 이식하고, 랫트를 이식 1개월 후 분석하였다. 2 광자 이미징은 　 680 ~ 1080 nm, 80 MHz 반복 속도 및 140 fs 펄스 폭에서 조정할 수 있는 파장을 갖는 Ti:Sapphire femtosecond 레이저(Chameleon Vision, Coherent Inc., USA)가 장착된 상업용 현미경 시스템(SP-5, Leica, Germany)을 사용하여 수행되었다.

인비보 뇌 영상화를 위해, 직경 1.0 mm, 길이 9.20 mm의 단일 GRIN 렌즈(NEM-100-25-10-860-S-1.0p-ST, GRINTECH GmbH)를 사용하였다. 가스 마취 하에 랫트를 수술 적으로 노출된 뇌가 위를 향하도록 랫트 머리 홀더에 장착했다. GRIN 렌즈를 플레이트의 구멍을 통해 알루미늄 플레이트에 고정시키고 플레이트를 번역하여 뇌를 위쪽에서 삽입했다. 10× 건식 대물 렌즈(Leica HC PL FLUOTAR 10.0×0.30)를 현미경 시스템으로부터 여기 레이저를 결합시키기 위해 GRIN 렌즈의 한쪽 끝에 가깝게 위치시켰다. 여기 파장은 GCaMP6의 2 광자 여기에 대해 900 nm로 설정되었다. 여기 레이저를 뇌에 주사하여 2 광자 영상화를 수행하였다. 이미징 시야(FOV) 및 이미징 속도는 각각 512×512 픽셀 및 9.03 프레임/s로 387.50 μm x 387.50 μm이었다. 뇌로부터의 방출 광은 GRIN 렌즈에 의해 수집되었고, 대물 렌즈를 통해 현미경 시스템에 결합되었다. 현미경 시스템에는 4개의 검출 채널(Ch1: 430-480 nm, Ch2: 500-550 nm, Ch3: 565-605 nm 및 Ch4: 625-675 nm)이 있었고 두 번째 채널(Ch2)에서 GCaMP6 형광이 수집되었다. 여기 레이저 출력은 58.08 mw이다.

칼슘 이미징 분석

Fluo3-AM를 1시간 처리하여 세포 안에 흡수시키고 배지에 형광이 남아있지 않도록 PBS 로 3회 세척하였다. 공초점 현미경으로 형광을 관찰하면서 형광 intensity를　1~3초 간격으로　사진을 찍고, 각　시간대별의 사진에서 세포 하나 하나를 ROI를 측정, 형광의 intensity가 변하는 것을 확인하였다. 필요에 따라 FACS 로 게이팅하였다.

실험 결과

인간배아줄기세포로부터 중뇌형 오가노이드 제작

기존에 이차원적인 2D 배양을 기반으로 한 분화 기술은 실제 뇌 생체 내의 3차원적 복잡한 네트워크를 대변해 주지 못한다. 3차원 발생을 기반으로 한 프로토콜의 개발만이 실제 뇌의 조직 특성을 대변해 줄 수 있다. 따라서 우선적으로 본 연구팀은 기존의 3D 중뇌형 오가노이드를 먼저 제작하였다. 성공적으로 제작된 중뇌형의 오가노이드는 발생 초반에는 신경줄기세포 마커인 PLZF⁺, Sox2⁺와 함께 ZO-1과 N-cadherin이 발현되었다(도 7의 E&F). 일반적인 신경줄기세포 마커라 할 수 있는, Nestin, Sox2와 함께 anterior embryonic brain 마커(OTX2), 배쪽 VM floor plate 마커(FOXA2, LMX1A)가 발현된다(도 7의 G-I). 발생을 더 유도하면 증식 마커인 Ki67⁺, SOX2⁺ 밖의 레이어로 신경세포 마커인 MAP2가 발현되고, 더 구체적으로 생체의 뇌 레이어와 같이 PCNA⁺(the proliferative ventricular zone; VZ), MASH1⁺(VZ, intermediate zone(IZ) 와 mantle zone(MZ)), 그리고 NURR1⁺ cells(IZ and MZ)에 각기 특이적으로 발현하는 구조를 확인하였다(도 7의 L, M). 특징적으로, IZ 와 MZ에서, 대포적인 중뇌 특이적인 인자인 FOXA2⁺, LMX1A⁺와 NURR1⁺ 세포가 도파민성 신경세포 마커인 TH(tyrosine hydroxylase)와 같이 발현됨으로써 진정한 중뇌 타입의 도파민성 신경세포임을 확인하였다(도 7의 N, O, P).

중뇌 오가노이드로부터 중뇌 타입의 신경줄기세포(Og-NSCs) 분리

파킨슨병의 세포 치료제로서 사용 시 보다 진화된 형태의 신경줄기세포로서 오가노이드 유래 중뇌형의 신경줄기세포(Og-NSCs)의 분리 배양 기술을 개발하였다. 선행 연구로서 발생 10~35일 중의 오가노이드로부터 신경줄기세포를 추출하려 하였으나, 효율이 높지 않았다. 오가노이드 내의 신경줄기세포 비율을 높임으로써 적량의 세포 확보가 가능하다고 보고, 세포양을 높이려는 노력으로 프로토콜을 수정하였다.

(1) 계속적으로 분화 유도하면, 줄기세포군의 양이 자동적으로 줄어들기 때문에, 10일차로부터 진행되는 최종 발생 분화 프로토콜을 중단하고, 증식시키는 방향으로 개선하였다. (2) 17 일차부터 신경줄기세포 특이적으로 늘릴 수 있는, bFGF를 추가하는 방법으로 수정하였다 (3) 중뇌 특이적인 인자들(SHH/Purmorphamine/CHIR999021) 의 처리 시기를 늘림으로써(1일~18일 까지), 즉, 중뇌 패턴화시키는 과정을 늘려서 중뇌 특이적인 신경줄기세포의 증식을 유도하였다. (4) 기존의 방법과 달리 FGF8b 처리 시기를 7 일부터 시작하였다(도 8의 A).

이러한 세밀한 시기의 조절을 통해 중뇌 유도 시 오염되기 쉬운 시상하부(sunthalamic)로의 발생을 줄일 수 있고, 특이적인 마커 중 하나인 EN1 의 발현을 현저히 높일 수 있다(도 8). 이와 같은 여러 변형들을 적용하여, 중뇌형 오가노이드 발생 유도 18일차에 2D 환경으로 증식 배양하였다. 인간 비트로넥틴이 코팅된 plates에 bFGF-supplemented hN2 배지로 배양하였다. 분리 후에 세포는 84-97%의 오가노이드 유래 신경줄기세포(Og-NSCs)를 함유하였다(신경줄기세포 마커 SOX2, NESTIN를 발현하고, OTX2 중뇌성 마커로서 도파민성 신경세포 특성 초기 확보에 매우 중요한 FOXA2, LMX1A발현으로 확인하였다(도 1의 B, C). 신경줄기세포 주위로 PAX2, PAX5 인자의 발현을 확인함으로써 진정한 중뇌성의 세포로 발생했음을 확인하였다(도 1의 B). 오가노이드 유래 중뇌성 신경줄기세포(Og-NSCs)는 FOXA2⁺, LMX1A⁺ 등 중뇌 특이적 마커(도 12)의 발현을 통해, 계대 배양 동안 그 특성을 성실히 유지하며 증식 가능함을 관찰하였다(도 1의 D). 2D hESC 배양에서 VM 유형 NSC를 준비하려고 했다. VM-유사 성상세포(Astrocyte conditioned medium, ACM)에 의해 조절된 배지의 처리는 세포 통과 동안 세포 생존 및 중뇌 마커 발현에 중요하였다(도 9의 A). ACM 처리 및 상기 기재된 NSC 집단을 풍부하게 하기 위한 변형과 함께, 본 발명자들은 또한 종래의 2D 배양에서 hESC의 분화로부터 확장 가능한 FOXA2+/LMX1A+VM-NSC를 제조할 수 있었다(도 9).

오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포(Og-NSCs)는 최종 분화 과정을 통해 중뇌형 마커가 완벽히 발현하는 완전한 형태의 도파민성 신경세포로의 분화가 가능

최종 분화 과정을 거쳐서 중뇌성 Og-NSCs는 효율적으로 완전한 형태의 도파민성 신경세포로의 분화가 가능하다(도 1의 E, F). Og-NSC-유래 도파민성 신경세포는 중뇌성 마커로서 도파민 신경세포 마커인 TH 와 더불어, FOXA2(95%), LMX1A(96%), NURR1(91%), EN1(86%)을 동시에 발현하였다. 반면에 기존의 2D 배양 환경에서는 44-61% 정도의 낮은 중뇌성 인자 발현을 보였다(도 9의 E, F, 및 도 10). 더욱이 이러한 오가노이드 유래 중뇌성 신경줄기세포 분리 프로토콜은 여러 다양한 인간 배아줄기세포 및 역분화 줄기세포에 공히 적용 가능하다(도 1의 G 및 도 11). 8개의 인간 만능줄기세포(3 hESCs and 5 hiPSCs)로 진행한, 117의 실험 중 111번의 성공율로 상당히 높은 성공율을 보였다. 반면에 2D 방법을 훨씬 적용이 어려워서, 63번 중 28번의 성공율을 기록했다(도 1의 H).

가장 높은 중뇌 인자 발현을 나타내는 H9 hESC 라인이 본 연구 전반에 걸쳐 주로 사용되었다. 이는 오가노이드 유래 개발된 프로토콜이 매우 안정적이며, 세포의 분리, 증식, 분화 등의 일반적인 과정 중에 작은 양만이 세포사멸의 과정을 거치는 것으로 보인다. 이는 2D 방법과 대조적으로, 절차 동안 상당한 비율의 세포 사멸이 나타났다. 실제로 배양 시에 ethidium heterodimer-stained 사멸된 세포(도 1의 I), cleaved caspase 3⁺ 사멸된 세포(도 1의 J) 분석과 새포 분리 후 진행한 FACS 분석을 통한 Annexin⁺/PI⁺ 사멸 세포의 분석에서도 상대적으로 수가 적은 안정적인 결과를 보였다(도 1의 K). β-galactosidase⁺ 세포로 대표되는 노화 세포(세포사멸 전 단계)도 Og-NSC 배양에서 현저히 적음을 보인다(도 1의 L). 복합적으로 새로 확보된 프로토콜은 기존의 것과 비교하였을 때, 보다 안정적으로 중뇌형의 신경세포 확보가 가능하다.

Og-NSC 배양된 세포는 신약 개발 플렛폼 세포로의 활용이 가능

Og-NSCs 는 중뇌형으로 패턴화 되어 분화 이후 완전한 형태의 도파민성 신경세포로의 분화가 가능하고 아울러 5 계대 이상 그 특성을 유지할 수 있다(도 1의 D 및 도 12의 A, B), 산술적으로 1 개의 배양접시(dish)로부터 7,260 vials(9,075 배양접시)의 Og-NSCs 확보가 가능하다(도 12의 A). 아울러 그 기능의 상실 없이 질소탱크에 보존이 가능하다(도 12의 C). 이와 같은 결과로 실제 굴지의 제약 회사(Chong Kun Dang Pharm., Seoul, KOREA)와 후보 파킨슨병 신약 개발에 사용되고 있다(도 13). Og-NSC 배양 시스템의 확장 가능하고 저장 가능한 속성은 제약 회사(Chong Kun Dang Pharm., Seoul, KOREA)와 협력하여, hESC(H9) 및 PD-hiPSC(PD-ips1) 라인으로부터의 mDA 신경세포를 사용하여 PD 약물을 개발하기 위해 후보 화학 물질의 대량 스크리닝을 받았다(도 13).

미분화 상태의 Og-NSCs는 적당한 중뇌형의 신경줄기세포 마커를 완벽히 발현한다(도 1의 B, C 및 도 14의 A, E, F). 분화 이전에는 분화 neuronal/DA neuronal 마커들을 일절 발현하지 않는다(MAP2, TH)(도 14의 B, C). 최종 분화 유도 후에는 증식 마커인 Ki67+의 발현이 줄어들면서 신경세포의 특성으로 신경돌기가 늘어나는 등의 형태적 변화가 일어난다(도 14의 A-C). 실제의 중뇌형 신경줄기세포의 발상단계와 같이 전구세포 단계부터 특이 마커인 NURR1가 발현 시작해서 분화 후까지 계속적으로 발현된다(분화 2일부터 최종 분화 단계까지)(도 14의 D). 실제적으로 중뇌에서의 생체적 발생 리듬에 맞춰서, 계속적으로 FOXA2와 LMX1A 가 발현되고, 분화 이후에는 LMX1A+ 발현이 약간 줄어드는 경향을 보였다(도 14의 E, F). 중뇌형 세포의 중요 마커인 NURR1, FOXA2, LMX1A 의 경우 최종 분화된 도파민성 신경세포에 겹쳐서 잘 발현되었다(도 1의 E-G). 이러한 발견은 복합적으로 인비트로 NSC 분화가 VM에서의 생리적 mDA 뉴런 발달을 요약하여, 존재하지 않았던 인간 mDA 뉴런 발달을 연구하기 위한 시험관내 모델로서 유용할 수 있음을 나타낸다.

bulk 와 single cell RNA sequencing을 이용하여, Og-NSCs의 전사조절 특성 분석

Og-NSCs의 분자생물학적 전사조절 분석을 위해, RNA sequencing(RNA-seq) 분석을 수행하였다. 오가노이드 유래 중뇌형 신경줄기세포(Og-NSCs)와 기존의 분화법으로 발생한 신경줄기세포(2D-NSCs)를 기존의 인간 태아 및 성체 뇌 조직과 전사조절인자의 차이를 비교 분석하였다(Carithers, L.J., Ardlie, K., Barcus, M., Branton, P.A., Britton, A., Buia, S.A., Compton, C.C., DeLuca, D.S., Peter-Demchok, J., Gelfand, E.T., et al.(2015). A Novel Approach to High-Quality Postmortem Tissue Procurement: The GTEx Project. Biopreserv Biobank 13, 311-319.; Jo, J., Xiao, Y., Sun, A.X., Cukuroglu, E., Tran, H.D., Goke, J., Tan, Z.Y., Saw, T.Y., Tan, C.P., Lokman, H., et al.(2016). Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell 19, 248-257.). 기존의 보고(Jo, J., Xiao, Y., Sun, A.X., Cukuroglu, E., Tran, H.D., Goke, J., Tan, Z.Y., Saw, T.Y., Tan, C.P., Lokman, H., et al.(2016). Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell 19, 248-257.)와 마찬가지로, PCA(principal component analysis)와 Spearman's correlation 분석 결과 중뇌형 오가노이드는 현저히 인간 태아의 뇌와 유사함을 보였다(도 2의 A, B). Og-NSCs는 중뇌형의 오가노이드와 유사하여 그 특징을 유지하고 있고,(Spearman's correlation co-efficiencies:0.79-0.97) 또한 실제 태아의 중뇌와도 비슷하여(0.70-0.85), 실제로 신경줄기세포로 뽑아낸 Og-NSCs는 분리 및 계대 배양 과정에도 그 특성이 유지됨을 알 수 있다.

신경줄기세포군락의 세포 개개의 특성의 확인을 위해서, single-cell RNA-seq 를 수행하였다(Og-NSCs: total 13,793 cells analyzed; 2D-NSCs: 12,166 cells; On average, there were 3.8×10⁵ post-normalization reads per cell and 2,227 genes detected in each individual cell) 평균적으로, 세포 당 정규화 후 3.8×10⁵ 판독 값 및 각각의 개별 세포에서 2,227개의 유전자가 검출되었다. 예상대로, ~99.7%의 Og-NSC와 기존 2D-NSC 세포들이 신경줄기세포 마커인 NESTIN, VIMENTIN, NCAM1, SOX2, NOTCH1, MUSASHI1을 발현하였다(도 15의 A). 전분화능 세포의 마커인 POU5F1, NANOG, KLF4는 오직 0.09%, 0.45%, 0.91%의 Og-NSC 새포에서 발현되고, 발현되는 세포 조차 그 발현양은 미미했다(average unique molecular identifiers(UMI) were <0.005)(도 15의 B). 대부분이 신경줄기세포이기는 하지만 기존의 2D-NSCs 경우는 상대적으로 약간 높은 전분화능 세포의 발현을 보였다(0.19%, 2.69%, and 1.24%, respectively, with an average UMI of < 0.031). Og-NSCs 와 2D-NSCs 모두 세개의 마커를 동시에 발현하는 세포는 없으므로, 이는 신경줄기세포만을 분리배양이 가능함을 보여주는 것이다. FACS 분석을 통해 TRA-1-60과 SSEA-4의 발현도 거의 없음을 확인하였다(도 15의 C). 앞서 노화 세포(세포사멸 전 단계)도 Og-NSC 배양에서 현저히 적음을 보임과 아울러(도 1의 L), 사멸유전자를 발현하는 세포도 아주 적은 것으로 분석되었다(도 15의 D). 특히, 2D-NSC의 세포와 비교하여 Og-NSC의 세포의 매우 낮은 비율은 p16/INK4a를 발현하였으며, 이는 세포 aging/senescence 및 뇌(Molofsky, A.V., Slutsky, S.G., Joseph, N.M., He, S., Pardal, R., Krishnamurthy, J., Sharpless, N.E., and Morrison, S.J.(2006). Increasing p16INK4a expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing. Nature 443, 448-452.; Nishino, J., Kim, I., Chada, K., and Morrison, S.J.(2008). Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell 135, 227-239.)와 다른 조직(Sousa-Victor, P., Gutarra, S., Garcia-Prat, L., Rodriguez-Ubreva, J., Ortet, L., Ruiz-Bonilla, V., Jardi, M., Ballestar, E., Gonzalez, S., Serrano, A.L., et al.(2014). Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature 506, 316-321; Wang, J., Lu, X., Sakk, V., Klein, C.A., and Rudolph, K.L.(2014). Senescence and apoptosis block hematopoietic activation of quiescent hematopoietic stem cells with short telomeres. Blood 124, 3237-3240)에서 줄기세포의 복구 능력의 저하에 중요한 특징이다.

t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding) 분석을 통해서 분석한 Og-NSCs 세포군은 세 개의 clusters로의 분류가 가능하다(도 2의 C-E). 각 세포 cluster 의 특성의 확인을 위해, 발현 증가된 유전자군의 GO(gene ontology) 분석을 수행하였다(UMI > 1, log₂FC > 0.5, P < 0.05)(도 2의 F), cluster 3의 경우, 25%(Og-NSC)와 12%(2D-NSC)(도 2의 D)를 차지하는데, 유전자 분석 결과 신경세포로 이미 운명 결정된 세포 군으로 분화 인자도 상당수 포함한다. cluster 1에서 과발현되는 유전자군의 경우는 도파민 신경세포가 발생되는 흑질(SN) 발생에 중요한 유전자군이 많이 발현되는데(ENO3, RSPO2, FGF9, LDHA, NR4A2, INA, LMX1A, OTX2, HSPA5, SYNGR3, RAD1, UCHL1, EN1, NDUFS3, and SEC16A), 따라서cluster 1 중뇌로의 패턴화가 가장 완성된 세포군이라고 할 수 있다. 특히나, 71%의 Og-NSCs 세포들, 13% 의 기존 2D-NSCs 세포들이 cluster 1에 해당된다. 이러한 유전자적 분석 결과 또한 Og-NSC 배양이 훨씬 더 중뇌형의 패턴화되어 있고, 안정적으로 세포 사멸 없이 전분화능 세포의 오염없이 세포군의 확보 가능함을 보여주었다.

GO와 KEGG 분석을 통해, bulk와 single cell RNA-seq 데이타(Og-NSCs vs 2D-NSCs)를 보다 자세히 분석하였다(도 2의 H, I). Og-NSCs에서 상대적으로 많이 발현되는 유전자 그룹은(2D-NSCs에 대비) 두 가지 방법의 seq data에 의하면, cell adhesion 과 ECM으로 줄기세포의 발생과 기능 유지에 그 중요함이 강조된 유전자군이다. 두 가지 방법의 seq data에 의해 모두 높이 발현되는 이 유전자군의 발현은 unsupervised hierarchal clustering으로 연구하였다(도 2의 J). 그것의 특별한 기능도 기술하였다.(표 5).

Cell-cell adhesion
Gene ID	Alias	Functions
HSP90AB1	Heat Shock Protein HSP 90 Beta	involved in signal transduction, protein folding, and degradation
DBN1	Developmentally-Regulated Brain Protein	a cytoplasmic actin-binding protein which plays a role in the process of neuronal growth
SERBP1	SERPINE1 mRNA Binding Protein 1	play a role in the regulation of mRNA stability
CCT8	Chaperoin Containing TCP1 Subunit 8	involved in the transport and assembly of newly synthesized proteins
RDX	Radixin	a cytoskeletal protein importanct in linking actin to the plasma membrane
KIF5B	Kinensin Family Member 5B	microtubule-dependent motor required for normal distribution of mitochondria and lysosomes
MACF1	Microtubule-Actin Crosslinking Factor 1	acts as a positive regulator of Wnt receptor signaling pathway
EIF4G2	Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 Gamma 2	plays a role in the switch from cap-dependent to IRES-mediated translation during mitosis
HNRNPK	Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein K	plays an important role in p53/TP53 response to DNA demage
HSPA8	Heat Shock 70-kDa Protein 8	plays a pivotal role in the protein quality control system
ZC3H15	Zinc Finger CCCH-Type Containing 15	protects DRG1 from proteolytic degradation
BZW1	Basic Leucine Zipper and W2 Domains 1	enhances histone H4 gene transcription
RSL1D1	Ribosomal L1 Domain Containing 1	regulates cellular senescence through inhibition of PTEN translation
HSP90AB1	Heat Shock Protein HSP 90 Beta	involved in signal transduction, protein folding, and degradation
DBN1	Developmentally-Regulated Brain Protein	a cytoplasmic actin-binding protein which plays a role in the process of neuronal growth
Neuron Maturity
Gene ID	Alias	Functions
CADPS	Calcium-dependent secretion activator 1	calcium-binding protein involved in exocytosis of vesicles
P2RX7	P2X purinoceptor 7	receptor for ATP that acts as a ligand-gated ion channel
CADPS2	Calcium-dependent secretion activator 2	regulates the exocytosis of synaptic and dense-core vesicles in neurons and neuroendocrine cells
SYT10	Synaptotagmin 10	calcium sensors in the regulation of neurotransmitter release and hormone secretion
UNC13C	Unc-13 Homolog C	plays a role in vesicle maturation during exocytosis
RIMS1	Regulating synaptic membrane exocytosis protein 1	synaptic vesicle protein that regulates synaptic vesicle exocytosis
PCLO	Protein piccolo	regulates the cycling of synaptic vesicles. Similar role to Bassoon, RIMS1/2
KCNMB3	Calcium-activated potassium channel subunit beta-3	modulates the calcium sensitivity and gating kinetics of KCNMA1
SCN1A	sodium channel, voltage-gated, type I, alpha subunit	mediates the voltage-dependent sodium ion permeability of excitable membrane
KCND2	Potassium voltage-gated channel subfamily D member 2	mediates transmembrane potassium transport in excitable membranes
ANK3	Ankyrin-3	plays key role in cell motility, activation, and proliferation
SCN2A	sodium channel, voltage-gated, type II, alpha subunit	responsible for the generation and propagation of action potentials in neurons and muscle
SCN9A	sodium channel, voltage-gated, type 9, alpha subunit	mediates the voltage-dependent sodium ion permeability of excitable membranes
GPER1	G protein-coupled estrogen receptor 1	stimulates cAMP production, calcium mobilization and tyrosine kinase Src
MYO5A	Myosin-Va	a class of actin-based motor proteins involved in cytoplasmic vesicle transport
GRIK1	Glutamate receptor, ionotropic, kainate 1	meidates excitatory neurotransmission and is critical for normal synaptic function
AKAP9	A-kinase anchor protein 9	required to maintain the integrity of the Golgi apparatus
GABBR2	Gamma-aminobutyric acid (GABA) B receptor, 2	regulates the release of neurotransmitters and the activity of ion channels
PMCHL1	Pro-Melanin Concentrating Hormone-Like 1	pseudogene found in fetal newborn and adult brain
KCNQ5	Potassium voltage-gated channel subfamily KQT member 5	associates with KCNQ3 to form a potassium channel
PCDHB16	Protocadherin beta-16	plays a critical role in the establishment and function of specific cell-cell neural connections
DLG2	Disks large homolog 2	part of the postsynaptic protein scaffold of excitatory synapses
PCDHB9	Protocadherin beta-9	plays a critical role in the establishment and function of specific cell-cell neural connections
PTPRD	Receptor-type tyrosine-protein phosphatase delta	promotes neurite growth, and regulating neurons axon guidance
CEP89	Centrosomal protein 89	plays a role in mitochondrial metabolism
PCDHB3	Protocadherin beta-3	plays a critical role in the establishment and function of specific cell-cell neural connections
GRIN2A	Glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1	ionotropic glutamate receptor
PDYN	Prodynorphin	preproproteins of ligands for the kappa-type of opioid receptor
HOMER1	Homer protein homolog 1	plays a role in synaptic plasticity
GRM5	Metabotropic glutamate receptor 5	involved in the regulation of neural network activity and synaptic plasticity
ATXN3	Ataxin-3	deubiquitinating enzyme involved in protein homeostasis maintenance
GRIA2	Glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 2	function as ligand-activated cation channels
LRP6	Low-density lipoprotein receptor-related protein 6	a co-receptor with LRP5 for transducing signals by Wnt protein
RIT2	GTP-binding protein Rit2	binds and modulates the activation of POU4F1
HTR2A	5-Hydroxytryptamine Receptor 2A	5-HT2A receptor
OPRD1	δ-opioid receptor	inhibits neurotaransmitter release by reducing calcium ion currents
DCC	Deleted in Colorectal Carcinoma	mediates axon guidance of neuronal growth cones toward sources of netrin 1 ligand
KIF5B	Kinensin Family Member 5B	microtubule-dependent motor required for normal distribution of mitochondria and lysosomes
LMX1A	LIM Homeobox Transcription Factor 1 Alpha	plays a role in the development of dopamine-producing neurons during embryogenesis
PTPRO	Receptor-type tyrosine-protein phosphatase O	plays a role in the inhibition of cell proliferation and facilitation of apoptosis
SHH	Sonic hedgehog	key inductive signal in patterning of the ventral neural tube
EPHA5	EPH Receptor A5	functions as an axon guidance molecule during development
WNT3	Wnt Family Member 3	functions in the canonical Wnt signaling pathway
ISPD	Isoprenoid Synthase Domain Containing	catalyzes the formaion of CDP-ribotol nucleotide sugar form D-ribotol 5-phosphate
SOS1	SOS Ras/Rac Guanine Nucleotide Exchange Factor 1	guanine nucleotide exchange factor for RAS proteins, membrane proteins
SPTBN1	Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1	actin crosslinking and molecular scaffold protein
OPHN1	Oligophrenin 1	Rho-GTPase-activating protein
CNTN1	Contactin 4	axon-associated cell adhesion molecule
UNC5D	Unc-5 Netrin Receptor D	plays a role in cell-cell adhesion and cell guidance
SPTA1	Spectrin Alpha, Erythrocytic 1	links the plasma membrane to the actin cytoskeleton
CHL1	Cell Adhesion Molecule L1 Like	palys a role in nervou systme development and in synaptic palsticity
FEZ2	Fasciculation and Elongation Protein Zeta 2	involved in axonal outgrowth and fasciculation
MYH10	Myosin Heavy Chain 10	plays a role in cytokinesis, cell shape
SPTB	Spectrin Beta, Erythrocytic	plays a role in cell membrane organization and stability

또한 Og-NSC 세포군에서 특이적으로 많이 발현되는 유전자군으로는 중뇌의 패턴화와 관계된 'SN development' 'negative regulation of cell death'(도 2의 I)이다. single cell RNA-seq analysis 분석 시에 특히 Og-NSCs 군에서 미토콘드리아의 생물학적 기능에 관련된 유전자군이 대거 조절되어 있음을 볼 수 있었다(mitochondria function, ER and protein folding, and autophagy), 이는 세포 노화와 사멸과 밀접히 관계된 신경퇴행성 질환의 상화에서 대표적으로 그 영향이 나타나는 기관으로 미토콘드리아가 밀접하므로 그 중요성을 강조할 수 있다. 이 데이터는 KEGG 분석 시에도 대표적인 신경 퇴행성 질환인 'Parkinson's disease', 'Huntington's disease','Alzheimer's disease' 가장 상위에 변화로 랭크됨을 통해서 그 연관성을 추측할 수 있다(도 2의 I).

인간 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포의 분화 시 미토콘드리아의 기능은 매우 중요하다. 특히나 신경줄기세포의 미토콘드리아의 경우 신경퇴행성 질환의 진행과 발병에 매우 중요하다고 알려져 있다. 미토콘드리아의 유전자는 미토콘드리아의 생성 및 그 다이나믹스에 관련된 것들도 포함하는 Og-NSCs 두 가지의 다른 bulk 와 single-RNA-seq 분석에서 기존의 방법으로 유도된 세포 대비 모두 조절되었다(도 3의 A). 유전자 분석과 마찬가지로 Mitotimer로도 분석 가능한데, Og-NSCs 세포군에서 기존의 2D-NSCs보다 훨씬 건강하고 기능적으로 우수함을 볼 수 있었다(도 3의 B). Og-NSC의 건강하고 기능적으로 우수함은 미토콘드리아 ROS 분석으로도 알 수 있다(MitoSox, 도 3의 C). 또한 미토콘드리아 막 전위도 Og-NSC 군에서 높음으로 모든 면에서 우수함이 보였다(JC-1, 도 3의 D). 개선된 미토콘드리아 회전율 및 산화 방지제 용량과 함께, Og-NSC로부터 분화된 mDA 신경세포는 2D-NSC로부터 유래된 것 보다 다양한 미토콘드리아 독소에 의해 유도된 세포 사멸(도 3의 E) 및 신경 돌기 변성(도 3의 F)에 더 큰 저항성을 나타냈다.

Og-NSCs로부터 분화 유도된 도파민성 신경세포 mDA neurons는 성상교세포와 공존함으로써 신경세포의 기능이 향상되고 성숙됨

유전자의 전사적 조절은 실제로 세포군의 형상이 변화되기에 앞서 이른 변화를 보여준다. 예를 들면 신경줄기세포로부터 볼 수 있는 변화를 실제 유전자 분석 시에는(differentially expressed genes(DEGs) 에서는) 배아줄기세포 단계에서부터 볼 수 있는 것이 그 예일 것이다. bulk RNA-seq 분석에서, Og-NSCs(vs 2D-NSCs) 세포에서는 신경세포의 성숙과 관련된 유전자가 높이 발현되었다(도 2의 H 및 도 3의 G). 유전자 발현 프로파일에서와 같이, 2D 대응물과 비교하여, Og-NSCs에서 분화 유도된 중뇌형 도파민 신경세포는 신경세포 분화 후 보다 성숙된 형태를 보이고,(도 3의 H, J), 시냅스 형성(도 3의 I, K), action potential-유발 Ca²⁺ 다이나믹스(도 3의 L-O), 탈분극 유도된 도파민 분비에 의해 평가된 전-시냅스성 도파민 신경세포 기능(도 3의 P) 면에서 훨씬 성숙한 형태를 보인다.

현재 존재하는 모든 hPSC-mDA 분화 프로토콜에서, 성상 세포 분화 없이 mDA 뉴런이 생성된다. 유사하게, 배양된 2D-NSC에서 성상 세포 분화가 발견되지 않았다(도 3의 R, S). 흥미롭게, Og-NSCs의 cluster 1(중뇌성의 SN 발생 세포군, 더 높은 SN 발달 유전자 발현을 갖는 클러스터)의 subpopulation 17%의 세포들은 glia 발달과 연관된 유전자들(EIF2B5, MT3, PLP1, CDK6, SCL1A3, HES1, HES5, 및 SOX8 )을 공통적으로 높이 발현하는 특성을 보였다(도 3의 Q). Og-NSC 배양물이 VM(SN)-타입 glia 전구체 집단을 함유함을 나타내었다. 일관되게, Og-NSC 배양에서 세포의 일부는 말초 분화 시 성상 세포로 분화되는 신경 원성 전구체(도 3의 R)에서 특이적으로 발견되는 CD44를 발현시켰다(도 3의 S). 이 세포들은 성상전구세포의 마커인 CD44를 발현함으로써(도 3의 R), 향후 최종 분화 시 성상교세포로의 분화를 기대할 수 있다(도 3의 S). 이는 실제의 중뇌발달의 패턴과 같이 mDA 신경세포가 GFAP⁺ 성상교세포와 혼재하여 발생됨을 알 수 있다(도 3의 S).

따라서, 생체 내에서 중뇌에서와 같이 분화된 배양물에서 mDA 뉴런을 GFAP⁺ 성상교세포와 혼재시켰다(도 3의 S). 성상교세포의 일반적인 신경 영양 작용 외에도 VM형 성상교세포는 다른 뇌 영역으로부터의 성상 세포 보다 우수한 특이적 dopaminotrophic 기능을 발휘하는 것으로 알려져 있다.

기존의 보고에 근거하여 성상교세포의 사이토카인 분비능력을 감안해 볼 때, 성상교세포는 도파민성 신경세포가 발생할 때 긍정적으로 영향 미칠 것을 기대할 수 있다. 이러한 정보에 기초하여 도 3의 E-P, 도 1의 E-L에서 보는 것처럼 인접 성상 세포는 mDA 뉴런 성숙, 생존, 시냅스 전 기능 및 중뇌-특이적 인자 발현에 대해 신경 영양 지원을 발휘할 수 있다.

Og-NSCs로부터 분화된 도파민성 신경세포는 α-syn의 oligomerization과 병적인 확산(propagation)이 덜 된다.

원래의 환자 뇌에 존재하는 α-synucleinopathy의 이식된 세포에로까지의 확산을 막기 위해, 또한 장기적으로 파킨슨병 세포 치료의 성공을 위해서는 세포치료제로 사용할(이식할) 세포의 α-syn 확산 저항성의 확보가 중요하다. 독성의 α-syn 병적 확산(pathogenic propagation)은 α-syn의 세포간 이동과, α-syn 응집(aggregates) 또한 이식된 세포로의 이동과 관계된다. α-syn 의 세포간 이동 능력을 측정하기 위해, 듀얼 챔버 시스템(Choi, Y.R., Cha, S.H., Kang, S.J., Kim, J.B., Jou, I., and Park, S.M.(2018b). Prion-like Propagation of alpha-Synuclein Is Regulated by the FcgammaRIIB-SHP-1/2 Signaling Pathway in Neurons. Cell reports 22, 136-148)을 활용하여 Og-NSCs 와 2D-NSCs에서 각각 분석하였다. GFP-labeled α-syn(SH-SY5Y neuronal 세포에서 과발현시킨 단백질)을 챔버 위에 위치시키고, 배양된 Og-NSC(2D-NSC)-유래된 신경세포를 밑에 위치시켜서 단백질 이동 후 흡수 확장되는 것을 관찰 결과(도 4의 A), GFP-labeled α-syn의 형광값이 Og-NSC 유래 신경세포에서 현저히 낮게 관찰되었다(도 4의 B).

α-syn 이동뿐 아니라 다른 중요 이슈로 이식된 세포로의 α-syn의 병적 확산을 독성의 α-syn 응집체로 분석하였다. 세포 내부의 α-syn 양이 증가하는 환경과 혹은 외부의 α-syn 유입 시의(exogenous α-syn fibril seed) 조건으로 나누어 응집 정도를 비교 분석하였다.

Og-NSCs 와 2D-NSCs 세포군에 α-syn을 과발현하는 렌티바이러스를 감염시키고, 도파민성 신경세포 분화 후 H₂O₂ 로 산화 스트레스를 유발하여, 독성의 α-syn 응집 및 확산 분석하였다. 독성 α-syn이랄 수 있는 인산화된α-syn at serine 129(p129-α-syn)이나, GFP⁺ α-syn 이동이 Og-NSC 에서 낮게 관찰되었다(도 4의 C). 따라서, 독성의 α-syn 응집 또한 분화된 Og-NSC 세포군에서 적게 관찰되었다(도 4의 D, 좌). α-syn fibril(PFF)을 주입함으로써 외부의 α-syn 유입 시의(exogenous α-syn fibril seed) 조건을 마련하여, 관찰한 결과에서도 독성의 α-syn 응집이 기존의 2D-NSCs에서 보다 많은 것으로 보아(도 4의 D, 우), 다양한 조건의 독성의 α-syn 응집이 Og-NSC 세포군에서 낮게 관찰되었다. 다음으로 독성의 α-syn 응집을 Bi-FC(bimolecular fluorescence complementation) 시스템으로 관찰하였다. 이 시스템은 α-syn이 amino(N) terminus(V1S)이나 carboxy(C) terminus(SV2) Venus fragment이 각기 발현되어서 응집되면 진하게 형광을 보임으로서 관찰하는 시스템이다(도 4의 E, F). 산화 스트레스와 미토콘드리아 파괴는 α-syn의 단백질 misfolding과 응집을 유발한다고 알려져 있다. Og-NSC-유래 도파민성 신경세포의 α-synucleinopathy에 대한 상대적인 저항성은 낮은 산화 및 미토콘드리아 스트레스에 기인한다고 볼 수 있다(도 3의 B-F). 또한, 분화된 Og-NSC 세포군에 성상교세포가 함유되어 있는 것도, 성상교세포의 원래 기능으로 독성의 α-syn 응집을 줄일 수 있으므로, α-synucleinopathy 의 감소에 기여한다고 볼 수 있다. 종합적으로 Og-NSCs 유래 신경세포는 독성의 α-syn 확산이 상대적으로 억제되어 있는데, 이는 세포 내외의 α-syn 연구 결과 확인하였다.

최종적으로, Og-NSCs 또는 2D-NSCs을 생체 뇌조직 내 이식하고 실제 뇌 환경에서의 α-syn 확산 및 응집을 관찰하였다. 인간 특이적인 α-syn 과발현 AAV 바이러스와 PFF를 랫트의 선조체에 주사하여 α-syn 병에 의한 파킨슨병을 유도하고, 2주 후에 Og-NSCs 와 2D-NSCs 를 각기 모델 동물 선조체에 이식하여 생체 뇌 환경 내에서의 차이점을 관찰하였다. 1 달 후에 이식 조직의 분석 결과, 심각한 α-synucleinopathy 환경 하에서 기존의 2D-NSC-유래된 이식 부위는 거의 생존한 도파민성 신경세포가 없을 뿐더러(도 4의 G, lower panel), α-syn⁺와 p129-α-syn⁺ 공동 발현되는 루이체(Lewy bodies) 가 관찰되고, 신경돌기가 거의 분화되지 못함을 볼 수 있음으로써 기존의 세포군은 세포 치료제로 적합하지 못함을 보여주었다. 반면에, 새로 개발한 Og-NSC 세포군 유래 이식 부위의 경우는 신경세포의 모양이 훨씬 건강하고, 심각한 신경돌기의 퇴화가 없었다.(도 4의 G, upper panel). 더욱이, 독성의 α-syn⁺(p129-α-syn⁺) 응집이 신경세포의 여러 부위에서 적게 관찰되었다. 파킨슨병의 환자의 경우, 세포치료제의 이식 후에도 환자 유래 α-syn의 이식된 세포로의 확산이(host-to-graft α-syn propagation) 이 환자의 생존 동안(이식 후 11~16년) 심각한 문제로 제기되었다. 동물 모댈의 경우 α-syn 확산 응집은 훨씬 빠른 기간인 한 달 정도면 관찰되는데, 환자의 뇌 환경을 완벽히 반영하지는 못하지만, in vitro와 in vivo assays 연구 결과를 통해서, Og-NSCs 유래의 세포가 독성 α-syn 확산 및 응집에 보다 저항성 있음을 보여준다.

Og-NSC 이식으로 파킨슨병 동물 모델의 건강한 도파민성 신경세포를 제공

최종적으로 세포 치료제로서의 Og-NSCs 유래 세포군의 가능성을 6-OHDA(6-hydroxydopamine) 으로 파킨슨병 유발한 모델 동물 시스템에서 이식 후 관찰하였다. 최근에 인간 배아줄기세포 유래 세포의 이식 후 성공을 가늠할 수 있는 유전자에 대한 연구가 있었다. 예상대로 이 유전자 그룹은 single cell RNA-seq 분석 결과, 새로 개발한 Og-NSCs 세포군에서 상대적으로 많이 발현됨을 볼 수 있었다.(기존의 2D 세포군 대비)(도 5의 A). 이식된 도파민성 신경세포의 시냅스 가소성은 향후 세포의 생존과 이식의 성공에 매우 중요하다. 신경세포로서의 기능을 분석하기 위해, Og-NSCs 세포군에 GFP 형광이 달린 GCaMP6s(calcium indicator protein, which emanates green fluorescence by Ca⁺⁺ binding)을 발현시킨 후 뇌의 선조체에 이식하였다. 신경세포에 특별한 자극 없이도 신경세포의 기능을 이식 한달 후 two-photon endomicroscopy로 관찰하였다(도 5의 B, top), 이식된 Og-NSCs 세포에서 자발적인 신경세포를 통한 신호 전달을 볼 수 있었다. Ca²⁺ transients(ΔF/F)는 신경세포의 2-5Hz의 action potential frequency를 보여주는데(도 5의 B, bottom), 이는 원래 뇌 조직의 SNpc(substantia nigra pars compacta)에서 발생한 도파민성 신경세포의 그것과 유사하다. 이식된 Og-NSC세포에 의한 시냅스 가소성을 더 확인하기 위해, delta-like canonical Notch ligand 1에 GFP가 달린(Dll1; pDll1-GFP-hESC) 유전자를 발현하는 인간 배아줄기세포군로부터 Og-NSCs를 제작하고, 이는 분화된 신경세포에만 형광 발현되므로, 파킨슨병 모델 동물에 세포 이식 후 형광 발현하는 세포만을 분석하였다. 한 달 반 후에 patch clamp 분석 시, action potentials(도 5의 C)와 spontaneous excitatory postsynaptic currents(sEPSCs)(도 5의 D) 이식된 GFP 발현하는 신경세포에서 관찰하였다. 이식된 신경세포의 시냅스 가소성은 반대쪽 병변이 없는 정상적인 세포의 그것과 큰 차이가 없었다(도 5의 E, F). 이는 Og-NSCs 이식 후에도 신경세포가 기능적으로 완벽한 형태를 가진다는 것을 보여주었다. 이식된 도파민성 신경세포가 완전히 성숙되어 도파민 분비 등의 완벽한 시냅스 기능을 하는지를 보기 위해 도파민 수송체에 의한 도파민 흡수를 [¹⁸F]FP-CIT PET scan 으로 본 결과, 파킨슨병 동물의 선조체는 낮은 도파민 흡수력을 보이지만(2% of the intact hemisphere), 상대적으로 Og-NSCs 세포군의 이식 5개월 후에는, 정상의 40%까지 회복됨을 보였다(도 5의 G, H).

파킨슨병 동물 모델에 Og-NSCs 세포군을 이식하고, 행동학적 연구를 수행한 결과 amphetamine-induced rotational 행동분석 결과 일관된 회복 효과를 볼 수 있었다. 이식 ~6 개월 동안, 14마리 중 11마리의 행동학적 회복(rotation scores) 은 이식 이전의 >50% 를 기록하였다. 이식 후 6개월째에 관찰한 8 마리의 경우, 모든 동물에서 >79%의 결과를 보였다(도 6의 A). 이식된 동물에서 stepping test(도 6의 B)와 cylinder test(도 6의 C)에서도 회복 효과를 보였다.

Og-NSCs 를 모델 동물에 이식 6개월 후 분석한 결과, 이식 부위에 건강한 도파민성 신경세포 조직을 확인하였다(graft volume: 4.50±1.56 mm³, TH⁺ cells: 9031±3773 cells, n=8 from 6 rounds of independent transplantation experiments, 도 6의 D-O). 이식 부위는 일정하게 특이적인 증식은 관찰되지 않았다. 이는 in vitro 상에 Og-NSCs 유래 도파민성 신경세포로의 분화와 같은 양상이다(도 2의 H 및 도 3의 G-I), 특히나 이식된 도파민성 신경세포는 원래의 뇌조직에 있는 세포와의 시냅스를 성숙하게 형성하며 정상적인 신경돌기를 뻗고 있다(도 6의 D). 중뇌 특이적인 인자들은 도파민성 신경세포의 생존과 성숙에 매우 중요하지만 특히나 이식 후에 그 발현이 잘 유지되지 않는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유에서 기존의 논문들은 대부분 이식 후의 조직에서는 전체의 중뇌성 인자의 발현을 보여주지 못하고, 최대 FOXA2/TH⁺ 발현 세포의 이미지 정도 보여 주었는데, 본 프로토콜로 개발된 Og-NSCs 유래된 이식 세포군은 중요한 중뇌 인자들을 모두 발현한다. 이식 6개월 후까지도, 96.7%(3,106/3,196, FOXA2), 93.8%(3,338/3,549, LMX1A), 95.0%(3,496/3,678, NURR1), 91.5%(2,989/3,274, EN1)의 주요 중뇌 인자들이 도파민성 신경세포의 마커인 TH+와 공통으로 발현된다(from 8 animals; 도 6의 E-I). 특히나 A9 nigral 도파민성 신경세포의 마커인 GIRK2(도 6의 J)을 발현하고, A9 nigral 도파민성 신경세포의 주요 특징과 같이 이식된 도파민성 신경세포는 다방향으로 신경돌기를 뻗는 성숙한 형태이고(도 6의 E-G, H, 아래 도면 및 도 6의 P), 원래의 뇌조직 세포와도 성숙한 신경돌기를 뻗고 있음을 보인다.(도 6의 D). 이식된 도파민성 신경세포 주위에는 인간 GFAP(hGFAP)-를 발현하는 성상교세포가 포진하고 있고(도 6의 K), 이는 이식한 Og-NSC-유래 성상교세포가 도파민성 신경세포가 신경돌기를 뻗어 시냅스를 형성하고 세포의 성숙에 도움을 주고 있음을 보여준다. 예전에 성상교세포의 공이식이 비슷한 효과를 보여준 것과 같다. 영장류에서의 효과도 보기 위해, Og-NSCs 유래 세포군을 두 마리의 성체 필리핀 원숭이의 선조체에 이식하였고, 한 달 후에 중요 중뇌성 마커인 FOXA2 와 NURR1를 공발현하는 성숙한 형태의 도파민성 신경세포를 확인하였다(도 6의 P).

토의

배양된 오가노이드는 조직 발달 및 인간 질병 모델링 연구에 적용되는 것 외에도 재생 의학에서 기증자 이식의 원천이 될 수 있다. 그러나 뇌 오가노이드를 심부 뇌 영역에 이식하는 것은 숙주 뇌 조직을 손상시키지 않으면 서 실행 가능하지 않기 때문에, 뇌 오가노이드를 이식하는 것은 뇌 장애 치료에 적용되지 않을 것이다. 더욱이, 이식된 뇌 오가노이드의 치료 결과는 이식된 오가노이드에서 자가-조직화된 구조가 매우 정밀한 방식으로 숙주 뇌와 상호 작용하는 새로운 신경망을 확립할 수 있어야 한다. 대조적으로, 다른 조직의 이식된 오가노이드(간, 장, 신장, 췌장 등)는 이식된 후 단리된 기능적 단위(간 버드, 췌장 섬, 신장 네프론 등)로서 치료 기능을 발휘할 수 있다. 따라서, 오가노이드 이식이 다른 엑스트라 -CNS 장애를 치료할 가능성이 있을 수 있지만, 뇌 장애를 치료하기 위해 뇌 오가노이드를 직접 이식하는 것은 무리가 있다.

모든 조직 발달은 순차적인 생성 과정, 조직-특이적 줄기/전구 세포의 증식 및 조직-특이적 세포로의 이들의 분화를 통해 달성된다. 배양 조직-특이적 줄기/전구 세포는 발달 연구 및 약물 스크리닝을 위한 생물 검정 플랫폼뿐만 아니라 재생 의학을 위한 공여자 세포를 제공할 수 있다. 그러나, hPSC로부터 적절한 VM-패터닝을 갖는 NSC 배양의 유도는 이전 연구에서 달성되지 않았다. 본 발명자들은 VM-특이적 NSC 배양 제조에 어려움이 배양 내 VM 영역 특이성의 불안정성에 기인한다는 것을 깨달았다. VM-특이적 마커 발현의 유지는 세포 밀도에 매우 민감하므로, NSC 제조에 필요한 세포 분리 및 리플레이팅 과정 중에 쉽게 소실된다(도 9의 A).

따라서 hPSC-mDA 뉴런 프로토콜은 매우 높은 세포 밀도 또는 Laminin-511 또는 111(Biolamina, LN-511, LN-111)과 같은 특정 플레이트 코팅 재료로 개발되었다. 다양한 세포 해리 조건(Acutase, collagenase, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺-free HBSS), 세포 생존 사이토카인(TGFβ, 독시사이클린, cAMP, 아스코르브산, Y27632), 개방성 후성 유전 적 상태를 유발하는 화학 물질(5-azacytidine, VPA)을 이용한 다양한 노력, TSA), β-에스트라디올 또는 DAPT(Notch 억제제)는 문제를 해결하지 못했다.

최근의 연구(Song, J.J., Oh, S.M., Kwon, O.C., Wulansari, N., Lee, H.S., Chang, M.Y., Lee, E., Sun, W., Lee, S.E., Chang, S., et al. (2018). Cografting astrocytes improves cell therapeutic outcomes in a Parkinson's disease model. The Journal of clinical investigation 128, 463-482.)에서 본 발명자들은 배양된 성상교세포로부터 분비된 인자, 특히 VM 조직으로부터 유래된 인자가 1차 NSC 및 mDA 뉴런 배양에서 세포 생존 및 중뇌-특이적 인자 발현을 촉진시키기 위해 강한 영양 효과를 발휘한다는 것을 관찰하였다.

따라서 배양된 성상세포(ACM)에서 준비된 조절 배지의 처리를 통해 본 연구에 사용된 2D-NSC 배양 프로토콜을 개발할 수 있었다(도 9). 그러나 2D-NSC 배양의 유도는 여전히 전술한 안정성 및 재현성 문제를 가졌다. 대조적으로 안정한 VM 마커 발현을 갖는 NSC는 설치류 배아 VM 조직으로부터 용이하게 단리되고 배양되어, hPSC 유래 중뇌 오가노이드로부터 인간 VM-특이적 NSC를 분리하도록 자극하고, 생리학적 배아 뇌의 구조와 유사한 환경에 구축된 구조 및 영역 특이성을 갖는다.

오가노이드-기반 제제는 충실한 중뇌-특이적 마커 발현을 갖는 NSC 배양에서 VM-패턴의 안정성뿐만 아니라 매우 낮은 수준의 세포 사멸, 노화, 산화 및 미토콘드리아 스트레스를 갖는 일반적인 배양 안정성과 관련하여 큰 성공을 거두었다. 다른 주목할만한 관찰은 Og-NSC가 mDA 뉴런과 혼재된 성상 세포로 분화되는 VM- 특이적 유전자 발현 프로파일을 갖는 성상교세포 전구 세포 집단을 함유한다는 것이었다. 대조적으로, mDA 뉴런 분화는 hPSC-mDA 분화에 대한 기존의 모든 방법에서 성상교세포 분화 없이 유도되며, 결과적으로 분화된 mDA 뉴런 배양물에는 astroglia이 없었다. 따라서, astroglial support가 없으면, 신경 성숙도 및 기능은 생체 내 대응물에서 분화된 mDA 신경세포의 것과 동일할 것으로 예상될 수 없었다. 실제로, 불충분한 성숙 및 기능은 시험관내 질병 모델링 및 요법에서 hPSC와 차별화된 mDA 신경세포의 유용성에서 결정적인 단점으로 제안되었다. 대조적으로 혼재된 성상교세포로부터의 영양 적지지 하에서, Og-NSC-유래 mDA 신경세포는 개선된 시냅스 성숙, 기능성, 독성 모욕에 대한 내성, 및 이식 후 생체 내 및 생체 내에서 긴 중뇌 특정 인자 발현의 개선 된 세트를 나타냈다. Og-NSC의 이러한 모든 특성은 궁극적으로 재현성 있는 방식으로 이식 후 우수하고 장기적인 치료 효능에 기여한다. 또한, 오가노이드 유래 NSC는 약물 스크리닝, 발달 연구 및 질병 모델링을 위한 생물 검정 플랫폼뿐만 아니라 치료를 위한 기증자 세포 제조에 필요한 확장 가능한 세포 공급원임을 보여주었다.

본 발명에 기초하여, 오가노이드-기반 방법은 CNS뿐만 아니라 CNS 외 장애에 대한 강력한 치료 잠재력을 갖는 조직 특이적 줄기/전구 세포를 제조하는 차세대 공통 전략이 될 수 있다.

즉, 2차원의 배양 대비 오르가노이드의 세포가 더욱 건강하고 세포치료시 우수한 결과를 보일 수 있을 것임에는 의심의 여지가 없으나, 뇌조직의 특성상 '괴'의 형태인 오르가노이드를 바로 이식하는 방법은 바람직하지 않으므로, 본 발명이 신경계용 세포치료제의 가장 적절한 모델이라 할 수 있다.

실시예 2: 인간 만능 줄기세포로부터 대뇌 피질 오가노이드를 이용하여 대뇌 피질 신경줄기세포로의 분화

[실험과정]

인간 만능 줄기세포(hESCs/hiPSCs) 배양

한양대학교(서울, 대한민국)의 IRB(institutional review board)에 의해 승인된 hESC 리서치 가이드라인을 기초로 hESCs 및 hiPSCs를 배양하였다.

본 실험에서 사용된 hESCs 및 hiPSCs는 하기 표 6에 나타내었다.

hESC line
Name used in this paper		Original name			Karyotype	Establishing institute
HSF6		UC06			Female(46, XX)	UCSF
H9		WA09			Female(46, XX)	Wi cell
HUES6		HUES6			Female(46, XX)	Harvard university(HSCI iPS Core)
hiPSC line
Name used in this paper	Original name		Source (Human)	Reprogramming factors		Methods	Establishing institute
Retro-1	Rv-hiPS 01-1		Newborn fibroblast	OCT4, SOX2, KLF4, MYC		Retrovirus	Harvard
Epi-ips	episomal-ips1		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector	Hanyang Univ. (Our own)
CMC-ips#11	CMC-hipsc-011		Bone marrow blood	OCT4, SOX2, KLF4, MYC		Sendai virus	Catholic Univ. (Korea NIH SCRM)
PD-ips1	PD patient derived ips-1		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector	Hanyang Univ. (Our own)
PD-#22	Corr. PD-ips#22		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector and genome edited	Hanyang Univ. (Our own)

미분화 hESC/iPSC의 증식 및 유지를 위해, 피더층 없이 37℃ 설정된 CO₂ 인큐베이터에서, mTESR-1 배지(Stemcell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canada)를 이용하여 Matrigel^TM 상에서 혹은 vitronectin(Human; Gibco Fisher Scientific, Waltham, MA)(Gibco A31804; 0.5 μg/cm²)-코팅된 6 cm 디쉬(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 상에서 배양하였고, 배지 교체는 매일 수행하였다. 미분화된 줄기세포들은 매일 배지 교체로 분화능이 유지되었으며 4~5일마다 Acutase(Stemcell Technologies Inc.)를 이용하여 계대 배양되었다.

3차원 대뇌 피질 오가노이드 제작

인간 배아/유도만능 줄기세포 는 Acutase를 이용해 디쉬에서 떼어 신경세포 분화유도 배지에 담겨 low attachment 96-well round bottom plate(Corning, Corning, NY)에 1 well 당 10,000개 세포씩 150 μL로 주입됐다(분화 0일 차). 신경세포 분화유도 배지의 조성은 아래 표와 같다. 처음 seeding할 때는 KSR-hES media(DMEM 40 ml, KSR 10 ml, 2-mercapto 20 μl, MEM-NEAA 500 μl, GlutaMAX 500 μl) 와 bFGF(4 ng/ml), ROCK inhibitor Y27632(20 μM), Doxycyclin 1 μg/ml를 넣는다. Y27632는 첫날 24시간 동안만 처리하였다. 2일 차에는 Retinoic acid가 없는 B27와 Insulin(15.6 μl/50 ml), SB431542(10 μM), LDN(10 μM), A-83(10 μM) 이 추가되며 본격적인 신경계 분화를 유도한다. 2~3일 사이에는 기본 배지를 전체의 1/2만 N2: Neurobasal(1:1, Gibco)로 사용하다가 이후 18일째의 2D 상태로 chopping 후 플레이트에 깔 때까지는 전체 기본 배지를 N2: Neurobasal(1:1, Gibco) 로 사용하였다. 배지 조성이 바뀔 시마다 전체 배지가 교체되었다. 8 일 차부터 bFGF(20 ng/ml)와 EGF(20 ng/ml)가 추가되었다.

18일때까지 아래의 표와 같은 배지에 맞춰 배양하며 오가노이드를 형성하였다.

대뇌 피질 오가노이드로부터 대뇌 피질 신경줄기세포 및 성상전구세포 분리하여 신경세포 및 성상교세포로 분화

18일 차에 오가노이드들은 Acutase로 37℃에 7분 소화된 뒤 30gauge 바늘로 잘게 찢어졌으며 vitronectin-coated 6 cm plates(Corning, cells from 24 organoids/plate)에 깔렸다. 이 시점에서 세포들은 신경줄기세포(Neural Stem Cell, NSC) 단계이며 증식 가능하고 5-7일마다 계대 배양되었다. NSC 배양에 사용된 배지는 N2 expansion 배지로, 조성은 다음과 같다(1X N2 supplement containing, 200 μM ascorbic acid, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF, and 1μg/ml doxycycline). 배지 교체는 매일 이루어졌으며 처음 2차원 배양으로 전환 시, 그리고 계대배양 시마다 하루동안 Y27632가 5 μM의 농도로 처리되었다. 신경세포로의 최종 분화는 N2 분화 배지로 유도됐다(10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 200 μM ascorbic acid).

대뇌피질 오가노이드로부터 대뇌 피질 성상전구세포를 분리 및 배양

만들어진 대뇌피질형의 Og-NSCs를 실제 뇌 발생 단계에 맞게 계대를 더 늘리면, 특별히 배지 조성 등의 변화 없이 9계대 이후에 성상전구세포가 주로 함유된 Og-성상전구세포의 배양이 가능하다. 9계대~11계대는 건강한 상태로 사용이 가능하다. 대뇌피질형의 Og-NSCs 와 같이 증식 배지로는 N2 expansion 배지로, 조성은 1X N2 supplement containing, 200 μM ascorbic acid, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF, and 1μg/ml doxycycline 이다. 배지 교체는 매일 이루어졌으며 처음 2차원 배양으로 전환 시, 그리고 계대배양 시마다 하루 동안 Y27632가 5 μM의 농도로 처리되었다. 중뇌의 오가노이드 유래 성상전구세포처럼(실시예 3 참조) 계대가 오래된 증식단계의 세포를 이식 연구에 사용한다. 분석을 위해서는 위의 최종 분화 배지로 높은 계대의 세포군은 성상교세포의 성격을 띠게 된다.

대뇌 피질 신경세포 및 성상교세포로의 분화 확인

대뇌 피질형의 신경세포를 제작하고 이를 통하여 수 차례의 계대 배양을 통해 성상전구세포 확보를 위해 우선적으로 대뇌피질형의 패턴화를 실시하였다. 인간 배아줄기세포로부터 신경계의 분화 유도 후 이의 확인은 우선적으로 패턴화의 확인으로, PAX6, FOXG1 등의 대뇌 피질형의 마커 발현을 확인하였다. 아울러 수 차례의 계대 배양을 거쳐서 성상전구세포로의 발생이 되면, GFAP, AQP4, ALDH1L1, GLAST 등의 성상세포성 인자의 발현을 확인하였다. 마커의 확인은 RNA 추출 후 -real time PCR 혹은 면역염색법을 이용한 동시에 발현 확인 등의 과정을 통해 가능하다.

[결과]

3D 오가노이드 제작

우선적으로 대뇌 피질세포군으로의 정상적인 오가노이드 형태로의 분화가 되면서, 패턴화가 되며, 향후 성상전구세포로의 분화가 완성됨을 확인하는 것이 결과의 포인트이다. 도 17에서 보는 바와 같이 정상적인 형태의 오가노이드가 완성되고, 이를 해체한 이후에도 그 패턴화 마커인 PAX6, FOXG1의 발현이 유지됨을 확인하였다.

제작된 대뇌 피질 3D 오가노이드로부터 대뇌 피질 신경줄기세포 및 성상전구세포 확보

언급된 프로토콜과 같이 SB431542(10 μM), LDN(10 μM), A-83(10 μM) 이 추가되며 본격적인 신경계 분화를 유도를 수행하고(도 16 아래, 도 18의 대뇌 피질 유도 scheme) 정상적인 형태의 오가노이드가 형성됨을 도 17과 같이 확인하였다. 이의 확인을 위해, RNA-real time PCR로 대뇌 피질 부위 패턴화 인자인 PAX6, FOXG1의 발현을 확인하였다(도 17, 도 25). 앞서 언급한 방법대로 수 차례의 계대 배양을 거쳐서, 성상전구세포로의 발생을 유도하고 확보할 수 있는데, 면역염색법을 이용하여, 그 충분한 발현을 GFAP, AQP4, ALDH1L1, GLAST 등의 발현을 확인할 수 있었으며, 동시에 이 세포군에서 패턴화 인자의 발현을 확인할 수 있었다(도 25).

대뇌 피질 신경세포 및 성상교세포 분화 확인

신경계 패턴화 인자인 SB431542(10 μM), LDN(10 μM), A-83(10 μM)이 추가되며 본격적인 신경계 분화를 유도를 수행하여 대뇌 피질형 뇌 오가노이드로 패턴화 하였지만, 신경줄기세포로부터의 신경세포 및 여러 계대의 분열을 통해 성상전구세포로의 분화 이후의 과정은 초기 패턴화만 달리하고 중뇌 오가노이드를 통한 분화의 과정과 다르지 않다. 중뇌 성상전구세포의 분화처럼 비교하였을 때, 면역염색법을 이용, 그 충분한 발현을 GFAP, AQP4, ALDH1L1, GLAST 등의 발현을 확인할 수 있으며, 동시에 각각의 세포군에서 패턴화 인자의 발현을 확인할 수 있었다(도 25). 그 기능적인 면에서 전기 생리학적 기능면에서도 활성화된 성상세포로의 분화가 완성될 수 있음을 알 수 있다.

본 실시예에서 대뇌 피질 특이적인 신경줄기세포 생산이 가능한 3D 오가노이드를 활용한 방법을 확립하였다. 3D 오가노이드를 활용함으로써 실제 생체 대뇌와 같은 구조의 조직으로부터 신경줄기세포를 추출하므로, 보다 건강하고 실제적인 형태의 세포 확보가 가능함을 기대할 수 있다.

실시예 3: 인간 유도만능 줄기세포로부터 중뇌 오가노이드를 이용하여 중뇌 성상교세포로의 분화 확인

[실험과정]

인간 만능 줄기세포(hESCs/hiPSCs) 배양

한양대학교(서울, 대한민국)의 IRB(institutional review board)에 의해 승인된 hESC 리서치 가이드라인을 기초로 hESCs 및 hiPSCs를 배양하였다.

본 실험에서 사용된 hESCs 및 hiPSCs는 하기 표 7에 나타내었다.

hESC line
Name used in this paper		Original name		Karyotype		Establishing institute
HSF6		UC06		Female(46, XX)		UCSF
H9		WA09		Female(46, XX)		Wi cell
HUES6		HUES6		Female(46, XX)		Harvard university(HSCI iPS Core)
hiPSC line
Name used in this paper	Original name		Source (Human)	Reprogramming factors	Methods		Establishing institute
Retro-1	Rv-hiPS 01-1		Newborn fibroblast	OCT4, SOX2, KLF4, MYC	Retrovirus		Harvard
Epi-ips	episomal-ips1		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53	Episomal vector		Hanyang Univ.(Our own)
CMC-ips#11	CMC-hipsc-011		Bone marrow blood	OCT4, SOX2, KLF4, MYC	Sendai virus		Catholic Univ. (Korea NIH SCRM)
PD-ips1	PD patient derived ips-1		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53	Episomal vector		Hanyang Univ. (Our own)
PD-#22	Corr. PD-ips#22		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53	Episomal vector and genome edited		Hanyang Univ. (Our own)

미분화 hESC/iPSC의 증식 및 유지를 위해, 피더층 없이 37℃ 설정된 CO₂ 인큐베이터에서, mTESR-1 배지(Stemcell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canada)를 이용하여 Matrigel^TM 상에서 혹은 vitronectin(Human; Gibco Fisher Scientific, Waltham, MA)(Gibco A31804; 0.5 ug/cm²)-코팅된 6cm 디쉬(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 상에서 배양하였고, 배지 교체는 매일 수행하였다. 미분화된 줄기세포들은 매일 배지 교체로 분화능이 유지되었으며 4~5일마다 Acutase(Stemcell Technologies Inc.)를 이용하여 계대배양되었다.

3차원 중뇌 오가노이드 제작

중뇌형의 오르가노이드 제작까지는 실시예 1에서와 같이 동일한 방법으로 제작한다. 성공적으로 제작된 중뇌형의 오가노이드는 발생 초반에는 신경줄기세포 마커인 PLZF⁺, Sox2⁺와 함께 ZO-1과 N-cadherin이 발현되었다(도 7의 E&F). 일반적인 신경줄기세포 마커라 할 수 있는, Nestin, Sox2와 함께 anterior embryonic brain 마커(OTX2), 배쪽 VM floor plate 마커(FOXA2, LMX1A)가 발현된다(도 7의 G-I). 발생을 더 유도하면 증식 마커인 Ki67⁺, SOX2⁺ 밖의 레이어로 신경세포 마커인 MAP2가 발현되고, 더 구체적으로 생체의 뇌 레이어와 같이 PCNA⁺(the proliferative ventricular zone; VZ), MASH1⁺(VZ), intermediate zone(IZ)와 mantle zone(MZ)), 그리고 NURR1⁺ cells(IZ and MZ)에 각기 특이적으로 발현하는 구조를 확인하였다(도 7의 L, M). 특징적으로, 오르가노이드에서도 중뇌 특이적인 인자인 FOXA2⁺, LMX1A⁺와 NURR1⁺ 세포가 발현됨으로써 진정한 중뇌 타입의 오르가노이드로 바로 제작됨을 확인한다.

중뇌 오가노이드로부터 중뇌 신경줄기세포 분리하여 신경세포로의 분화

hESCs/hiPSCs는 Acutase를 이용해 디쉬에서 떼어 신경세포 분화유도 배지에 담겨 low attachment 96-well round bottom plate(Corning, Corning, NY)에 1 well 당 10,000개 세포씩 150μL로 주입됐다(분화 0일 차). 신경세포 분화 유도 배지의 조성은 다음과 같다(N2: Neurobasal(1:1, Gibco) containing B27 without vitamin A(2%, Invitrogen Fisher Scientific, Waltham, MA), GlutaMAX(1%, Invitrogen Fisher Scientific), minimum essential media-nonessential amino acid(1%, MEM-NEAA, Invitrogen Fisher Scientific), β-mercaptoethanol(0.1%, Invitrogen Fisher Scientific), SB431542(10 μM, Tocris, Bristol, UK), Noggin(200 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ), ascorbic acid(200 μM, Sigma-Aldrich), insulin(25 mg/L), ROCK inhibitor Y27632(20 μM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Y27632는 첫날 24시간 동안만 처리하였다). 오가노이드의 Ventral Midbrain 타입 신경줄기세포 증대를 위해 분화 1일 차부터 신경세포 분화 유도 배지에 sonic hedgehog(100 ng/ml, SHH, Peprotech)와 purmorphamine(2 μM, Calbiochem, MilliporeSigma, Burlington, MA)이 추가되었다. 2일 차에는 CHIR99021(0.8 μM, Stemgent, Cambridge, MA)가 추가되었다. 배지 조성이 바뀔 시마다 전체 배지가 교체되었다. 5일 차부터 SB431542가 빠졌고 7일차부터 FGF8b(100 ng/ml, Peprotech)가 추가되었다. 11일 차에 기본 배지가 N2로 완전히 바뀌었으며 B27, GlutaMAX, MEM-NEAA, β-mercaptoethanol은 첨가되지 않았다. 11일 차부터 첨가되는 CHIR99021의 농도가 약 2배(1.5 μM)로 늘었으며, 이 때부터 오가노이드들은 96well plate에서 6 well plate(low attachment, Corning)로 옮겨졌고 오비탈쉐이커 위에서 80rpm의 속도로 배양되었다. 15일 차부터 Noggin과 sonic hedgehog가 빠졌으며 17일 차부터 bFGF(20 ng/ml)가 추가되었다. 18일 차에 오가노이드들은 Acutase로 37 ℃에 7분 소화된 뒤 30gauge 바늘로 잘게 찢어졌으며 비트로젝틴-코팅된 6 cm plates(Corning, cells from 24 organoids/plate)에 깔렸다. 이 시점에서 세포들은 신경줄기세포(Neural Stem Cell, NSC) 단계이며 증식 가능하고 5-7일마다 계대배양되었다. NSC 배양에 사용된 배지는 N2 증식 배지로, 조성은 다음과 같다(N2 containing 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 200 μM ascorbic acid, 100 ng/ml FGF8b, 20 ng/ml bFGF, and 1μg/ml doxycycline). 배지 교체는 매일 이루어졌으며 처음 2차원 배양으로 전환 시, 그리고 계대배양 시마다 하루동안 Y27632가 5 μM의 농도로 처리되었다. 신경세포로의 최종 분화는 N2 분화 배지로 유도됐으며 조성은 다음과 같다(10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 200 μM ascorbic acid, and 500 μM db-cAMP).

중뇌 오가노이드로부터 중뇌 성상전구세포 분리하여 성상교세포로 분화

만들어진 중뇌형의 Og-NSCs를 실제 뇌 발생 단계에 맞게 계대를 더 늘리면, 특별히 배지 조성 등의 변화 없이 9계대 이후에 성상전구세포가 주로 함유된 Og-성상전구세포의 배양이 가능하다. 9계대~11계대는 건강한 상태로 사용이 가능하다. Og-NSCs와 같이 증식 배지로는 N2 증식 배지로, 조성은 N2 containing 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 200 μM ascorbic acid, 100 ng/ml FGF8b, 20 ng/ml bFGF, and 1 μg/ml doxycycline이다. 배지 교체는 매일 이루어졌으며 처음 2차원 배양으로 전환 시, 그리고 계대배양 시마다 하루동안 Y27632가 5 μM의 농도로 처리되었다. 이식 시에는 증식 중의 성상전구세포를 사용하고, 연구를 위한 분화 시에는 N2 분화 배지로 유도됐으며 조성은 다음과 같다(10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 200 μM ascorbic acid, 및 500 μM db-cAMP).

[결과]

3D 중뇌 오가노이드 제작 확인

도 7에 결과로 보여주는 중뇌성의 오가노이드를 제작하고, 실제 뇌 발생 단계에 맞게 계대를 더 늘리면, 중뇌성 신경세포뿐만 아니라, 성상전구세포로의 분화가 가능한 중뇌성 오가노이드의 제작이 가능하다. 따라서, 중뇌성 오가노이드의 제작 및 그 특성에 관한 결과는 중뇌 오가노이드를 통한 신경세포의 분화 시에 보여주는 결과와 동일하다.

제작된 중뇌 3D 오가노이드로부터 중뇌 성상전구세포 확보 확인

① 중뇌 신경 줄기세포 직접 분화(Direct differentiation)및 성상전구세포 확보

hESC/iPSC로부터 신경줄기세포로의 중뇌-신경줄기세포로의 분화를 유도하기 위해 배아줄기세포 단계에서 약 20일 동안 Neuroectoderm 유도인자 및 중뇌 타입 신경줄기세포 유도 인자를 이용해 중뇌-신경줄기세포를 확보하였다. 확보된 신경줄기세포는 증식 및 Stock에 용이하며 계대배양을 통해 더 많은 수의 신경줄기세포를 얻을 수 있다. 제대로 된 분화 여부의 확인은 Nestin, Sox2 등 신경줄기세포 마커와 Foxa2 및 Lmx1a 등 중뇌-신경줄기세포의 마커 발현율을 통해 확인할 수 있다. 본 프로토콜을 적용 시 다음과 같이 95% 이상의 높은 효율로 중뇌 신경줄기세포로의 분화를 유도할 수 있다. 성상전구세포를 얻기 위해 추가로 여러 번의 계대배양 과정을 거친다. 초기 계대배양 시 말단 분화시킨 세포들은 성상교세포보다는 신경세포로의 분화율이 높지만 계대배양을 할수록 성상전구세포의 비율이 늘어난다. 기존 프로토콜은 계대배양 5번 후 분화 시 성상교세포를 확인할 수 있었지만, 보다 효율적인 성상전구세포의 확립을 위해서는 9 계대~11 계대의 신경줄기세포군을 성상전구세포군으로 사용한다. 이때 성상전구세포 마커인 CD44가 90% 이상이고, 분화 유도 시에는 도 19와 같이 분화된 성상교세포 마커군(GFAP, AQP4, GLAST, S100b)이 90% 이상 발현되었다.

② 중뇌형의 성상전구세포의 보다 양질의 효과 관찰

In vitro 상의 특성 분석 결과 중뇌형의 성상교세포가 보다 유용한 사이토카인 분비 및 신경세포 기능 유지에 관계된 인자가 과발현됨을 관찰하였다(도 20). in vivo 결과 역시 보다 유용한 인자의 분비가 중뇌형의 성상교세포에서 발현 촉진됨을 관찰하였다(도 21). 아울러 이러한 성상교세포의 영향은 미세아교세포에 영향을 미쳐서 보다 좋은 타입의 미세아교세포로의 변화에 관여하여 항염증 효과의 시너지 효과를 기대할 수 있다(도 22).

중뇌 성상교세포 분화 확인

hiPSC을 이용한 프로토콜 적용 확인

H9 hESC 뿐만 아니라 다른 종류의 배아줄기세포에도 확보된 프로토콜이 적용되는지를 알아보기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 중앙질병관리본부로부터 iPSC를 확보하였다(CMC-hiPSC-003 및 011). 배양 단계에서 기존에 인간 배아줄기세포의 배양에 사용되던 마우스 feeder 또는 matrigel 등 동물로부터 유래된 성분을 사용하지 않는 Xeno-free 시스템을 이용해 적응 배양하는데 성공했고(도 23), 다수의 세포 stock을 확보하였다.

이렇게 확보된 hiPSC를 본 프로토콜에 적용한 결과, 신경줄기세포로 잘 분화됨을 확인했고 더 나아가 계대배양 과정에서 H9 hESC와 같이 GFAP 등의 성상교세포 마커가 증가하는 현상을 확인할 수 있었다(도 24).

정상적으로 중뇌 성상교세포로의 분화를 확인하였다(도 25). 즉, 이를 통해 본 프로토콜을 H9 hESC 뿐만 아니라 다른 종류의 배아줄기세포에도 적용을 할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 사용 iPSC line 중에 #11이 보다 분화 용이하고, 향후 실제적인 사용시, 가용한 유도만능 줄기세포의 확보에 매우 중요한 단계가 될 것이다.

TGF-β와 LIF를 이용한 효율적인 분화 유도

TGF-β와 LIF를 이용한 효율적인 분화 유도를 통해 보다 다량의 성상교세포 확보 기술을 확보하였다. 증식단계에 TGF-β를 처리하고, 분화 단계에 LIF를 처리함으로써 보다 많은 양의 성상세포가 분화됨을 보이고,(GFAP 마커 발현으로) 이러한 성상세포에서 보다 많은 양의 신경조절인자가 발현되는 양질의 세포로됨을 관찰하였다(도 26). 성상전구세포의 양을 확인하기 위해, 증식 단계에 분열하는 세포에만 마킹될 수 있는 EdU를 30분간만 처리하고 완전히 분화 후, 성상세포와 동시에 발현되는 양을 봄으로서 성상세포의 전구세포 증감을 확인한 결과, 성상전구세포의 양이 1.5배 증가됨을 확인하였다.

최종 프로토콜을 통해 확보된 성상교세포의 유래물질의 활용성을 보기 위해 우선적으로 조건화 배지의 특성 분석

- 세포 특성 분석: 확보된 성상교세포의 특성을 분석하기 위해 생리학적 특성을 분석하여 중뇌성 성상교세포의 생리 활성도를 측정하였고, 이를 통해 분화 유래물 확보 및 이식에 적합한 미성숙의 성상교세포임을 확인하였다[도 27]. 완전히 성숙한 형태의 성상세포는 나쁜 환경에서 쉽게 나쁘게 동화될 수 있음을 감안하여 이러한 미성숙한 형태의 세포가 이식에는 보다 적합하다.

- 기능 분석: 이식 후에 성상교세포의 기능을 보기 위해 실시하였고, 이식 후 생체 내에서 양질의 세포로서의 기능 수행이 가능한지를 in vitro와 in vivo에서 관찰하였다. In vitro 결과는 주변부의 환경 개선에 적합한지를 알아보기 위해, 조건화 배지를 이용한 실험을 실시하였다.

그 결과는 도 28, 도 29, 도 30에 나타내었다. 도 28은 중뇌형 성상교세포의 조건화 배지를 활용한 미세아교세포의 변화를 관찰한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vitro로 검증하였다. 미세아교세포가 함유되어 있는 세포 배양에서, LPS 처리로 염증 유발 시, 중뇌 성상세포의 조건화 배지의 처리로, 나쁜 방향의 미세아교세포 마커인 iNOS, Cd11b, CD16.32가 감소되고, 좋은 방향의 미세아교세포로의 변환을 보여주는 마커인 Arg, CD206의 발현이 증대되었다.

도 29는 염증 유도 후 성상교세포 조건화 배지로 사멸 인자 억제 가능성을 확인한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vitro로 검증하였다. 역시 미세아교세포가 함유되어있는 세포 배양에서, LPS 처리로 염증 유발 시, 중뇌 성상세포의 조건화 배지의 처리로, 세포 사멸 마커인 b-gal, p16 발현이 감소되었다.

도 30은 염증 유도 후 성상교세포 조건화 배지로 항염증 효과를 RT-PCR로 확인한 것이다. 이를 통해 성상세포에 의한 항염증 효과를 in vitro로 검증하였다. 역시 미세아교세포가 함유되어있는 세포 배양에서, LPS 처리로 염증 유발 시 중뇌 성상세포의 조건화 배지의 처리로, inflammosome 형성 관련 인자의 발현 감소와 신경화 인자의 발현 증가를 확인하였다.

최종 프로토콜을 통해 확보된 성상교세포의 in vivo 내에서의 활용성을 보기 위한, 이식 후 특성 분석

우선적으로 in vivo 생체 뇌에 이식 후 성상교세포의 주변 환경에 대한 긍정적인 역할에의 영향을 보는 연구 관찰하였다. Striatum 부위에 성상교세포를 이식 후, 항염증 인자 및 염증인자, 사이토카인 분비 등의 결과를 확인하였다. 성상교세포 이식 부위에 TNF-a, IL1b, iNOS, CD11b 등 염증인자의 발현이 감소되었고, 주변부위에도 IL1b, iNOS, CD11b 등 염증인자의 발현이 감소되었고, 이식 부위 및 주변부에 BDNF, GDNF, Arg1 사이토카인 발현이 다소 증대되었다(도 31).

성상교세포의 생체 이식 후 환경 개선 효과를 미세아교세포의 변화로 in vivo 에서 관찰

확보된 성상교세포를 랫트의 뇌 선조체에 이식 후 반대쪽에는 신경줄기세포를 대조군으로 이식하여, 대표적인 환경 변화 관찰로 미세아교세포의 M1 M2 변환 여부를 확인하였다.

LPS로 염증을 유발하고, 성상교세포 이식 후 관찰한 결과 성상교세포 이식 부위에 나쁜 타입의 M1 마커인 iNOS, CD11b, CD16 등의 발현이 억제되고(도 32~34), M2의 마커로 CD206의 발현이 증대되어 있음을 관찰하여서, 성상교세포의 긍정적인 영향을 보았다(도 35).

실시예 4: 인간 유도만능 줄기세포로부터 시상하부 오가노이드를 이용하여 시상하부 신경세포 및 성상교세포로의 분화 확인

[실험과정]

인간 만능 줄기세포(hESCs/hiPSCs) 배양

한양대학교(서울, 대한민국)의 IRB(institutional review board)에 의해 승인된 hESC 리서치 가이드라인을 기초로 hESCs 및 hiPSCs를 배양하였다.

본 실험에서 사용된 hESCs 및 hiPSCs는 하기 표 8에 나타내었다.

hESC line
Name used in this paper		Original name			Karyotype		Establishing institute
HSF6		UC06			Female(46, XX)		UCSF
H9		WA09			Female(46, XX)		Wi cell
HUES6		HUES6			Female(46, XX)		Harvard university (HSCI iPS Core)
hiPSC line
Name used in this paper	Original name		Source (Human)	Reprogramming factors		Methods		Establishing institute
Retro-1	Rv-hiPS 01-1		Newborn fibroblast	OCT4, SOX2, KLF4, MYC		Retrovirus		Harvard
Epi-ips	episomal-ips1		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector		Hanyang Univ.(Our own)
CMC-ips#11	CMC-hipsc-011		Bone marrow blood	OCT4, SOX2, KLF4, MYC		Sendai virus		Catholic Univ. (Korea NIH SCRM)
PD-ips1	PD patient derived ips-1		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector		Hanyang Univ. (Our own)
PD-#22	Corr. PD-ips#22		Skin	OCT4, SOX2, KLF4, shp53		Episomal vector and genome edited		Hanyang Univ. (Our own)

미분화 hESC/iPSC의 증식 및 유지를 위해, 피더층 없이 37℃ 설정된 CO₂ 인큐베이터에서, mTESR-1 배지(Stemcell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canada)를 이용하여 Matrigel^TM 상에서 혹은 vitronectin(Human; Gibco Fisher Scientific, Waltham, MA)(Gibco A31804; 0.5 μg/cm²)-코팅된 6 cm 디쉬(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 상에서 배양하였고, 배지 교체는 매일 수행하였다. 미분화된 줄기세포들은 매일 배지 교체로 분화능이 유지되었으며 4~5일마다 Acutase(Stemcell Technologies Inc.)를 이용하여 계대배양되었다.

3차원 시상하부 오가노이드 제작

도 36과 같은 프로토콜로 오가노이드 제작하였다.

기본적으로 배아/유도만능 줄기세포로부터 신경계의 오가노이드를 제작하므로, 인간 배아/유도만능 줄기세포는 Acutase를 이용해 디쉬에서 떼어 신경세포 분화유도 배지에 담겨 low attachment 96-well round bottom plate(Corning, Corning, NY)에 1 well 당 10,000개 세포씩 150 μL로 주입되었다(분화 0일 차). 신경계로의 오가노이드 제작을 위해서 SB-431542 10 μM, Noggin, 100 ng/mL을 처리하며, 신경계로 유도하고 배쪽 유도인자인 SHH, Purmophamin 처리로 패턴화하였다. 구체적인 배지 조성은 다음 표 9, 표 10과 같다.

시상하부 오가노이드로부터 시상하부 신경줄기세포를 분리하여 신경세포로 분화 확인

날짜에 따른 분화유도 배지의 조성은 다음 표 9와 같다.

Day	Media Composition
96-well (seeding: 1 × 10 4 cells/well)
D0	Neurobasal : 2Х N2 (1:1)
	1×B27 (- RA)
	1×MEM NEAA
	1×Glutamax
	β-mercaptoethanol, 55 μM
	Penicillin/Streptomycin
	Ascorbic Acid, 200 μM
	Doxycycline, 1 μg/mL
	Y-27632, 10 μM
	SB-431542. 10 μM
	Noggin, 100 ng/mL
D1-6	Neurobasal : 2×N2 (1:1)
	1×B27 (- RA)
	1×MEM NEAA
	1×Glutamax
	β-mercaptoethanol, 55 μM
	Penicillin/Streptomycin
	Ascorbic Acid, 200 μM
	SB-431542. 10 μM
	SHH, 100 ng/mL
	Purmorphamine, 2 μM
D7-12	Neurobasal : 2×N2 (1:1)
	1×B27 (- RA)
	1×MEM NEAA
	1×Glutamax
	β-mercaptoethanol, 55 μM
	Penicillin/Streptomycin
	Ascorbic Acid, 200 μM
	Noggin, 100 ng/mL
	SHH, 100 ng/mL
	Purmorphamine, 2 μM
Move to 6-well culture plate
D13-20	N2 medium
	Penicillin/Streptomycin
	Ascorbic Acid, 200 μM
	FGF2, 20 ng/mL
Chopping
D18~21	N2 medium
	Penicillin/Streptomycin
	Ascorbic Acid, 200 μM
	Doxycycline, 1 μg/mL
	FGF2, 20 ng/mL

처음 seeding 할 때는 N2: Neurobasal(1:1, Gibco), B27(RA 미포함), 2-mercapto 55 μM, MEM-NEAA, GlutaMAX, Ascorbic Acid, 200 μM, SB431542(10 μM), Noggin 100 ng/ml, ROCK inhibitor Y27632(20 μM), Doxycyclin 1ug/ml 를 넣었다. Y27632, Doxycyclin 은 첫날 24시간 동안만 처리하였다. 1~6일 사이에는 기본 배지를 사용하면서 SHH, 100 ng/mL, Purmorphamine, 2 μM 를 추가하였다. 7~12일 사이에는 기존의 기본 배지를 사용하면서 SB431542만 없는 배지를 사용하였다. 13일째의 6 well plate(low binding)로 이동하여, orbitary shaker로 교반시켰다. 13~20일에는 N2배지에 Ascorbic Acid, 200 μM, FGF2, 20 ng/mL 만 첨가하고 배양하다가, 21일째(18일 이후에는 가능함)의 2D 상태로 chopping 후 플레이트에 깔 때까지는 전체 기본 배지를 N2로 사용하며, 플레이트 첫날만 Doxycyclin 첨가하였다. 배지 조성이 바뀔 시마다 전체 배지가 교체되었고, 증식 배지로는 13일차에 사용하던 배지를 사용하였다. 계대배양 시마다 하루동안 Doxycyclin 1 μg/ml, Y27632가 5 μM의 농도로 처리되었다. 신경세포로의 최종 분화는 N2 분화 배지로 유도되었다(10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 200 μM ascorbic acid).

기본 배지는 다음 표 10과 같다.

2× N2 medium	N2 medium
12 g DMEM/F12(- HEPES buffer, - sodium bicarbonate)	12 g DMEM/F12(- HEPES buffer, - sodium bicarbonate)
1.69 g Sodium bicarbonate	1.69 g Sodium bicarbonate
1.55 g D(+) Glucose	1.55 g D(+) Glucose
0.073 g L-Glutamine	0.073 g L-Glutamine
200 mg Apo-transferrin	100 mg Apo-transferrin
Progesterone, 40 nM	Progesterone, 20 nM
Putrescine, 200 μM	Putrescine, 100 μM
Selenite, 60 nM	Selenite, 30 nM
Insulin, 200 nM	Insulin, 200 nM
1 L water	1 L water

시상하부 오가노이드로부터 시상하부 성상전구세포를 분리하여 성상교세포로 분화 확인

만들어진 시상하부형의 Og-NSCs를 실제 뇌 발생 단계에 맞게 계대를 더 늘리면, 특별히 배지 조성 등의 변화 없이 9계대 이후에 성상전구세포가 주로 함유된 Og-성상전구세포의 배양이 가능하다. 9계대~11계대는 건강한 상태로 사용이 가능하다. 시상하부형의 Og-NSCs와 같이 증식 배지로는 N2 증식 배지로, 조성은 1X N2 supplement containing, 200 μM ascorbic acid, 20 ng/ml bFGF, and 1μg/ml doxycycline이다. 배지 교체는 매일 이루어졌으며 처음 2차원 배양으로 전환 시, 그리고 계대 배양 시마다 하루 동안 Y27632가 5 μM의 농도로 처리되었다. 중뇌의 오가노이드 유래 성상전구세포처럼 계대가 오래된 증식 단계의 세포를 이식 연구에 사용한다.

[결과]

3D 시상하부 오가노이드 제작 확인

제작된 시상하부의 오가노이드는 도 37에 보듯이 정상적인 형태를 띠고, 시상하부 마커로서 RAX와 함께 신경줄기세포의 마커인 Nestin, Sox2를 함께 발현하는 초기의 형태를 띠게 된다.

제작된 시상하부 3D 오가노이드로부터 시상하부 신경줄기세포 및 성상전구세포 확보 확인

시상하부 오가노이드로부터 해체 추출된 신경줄기세포는 도 38의 결과와 같이 시상하부 마커가 96.8% 발현되는 제대로 패턴화된 신경줄기세포가 됨을 확인하였다. 양적으로는 4계대까지의 신경줄기세포를 신경세포분화 용도로 사용 가능한데, 처음의 10,000개로부터 1000배 정도의 신경줄기세포로의 확보가 가능하다(도 38). 신경줄기세포는 패턴화 마커로서 RAX, NKX2.2가 발현된다.

시상하부 신경세포 및 성상교세포 분화 확인

만들어진 시상하부 줄기세포는 도 39의 결과에서 보듯이, 분화 시에 신경세포인 MAP2 발현하는 세포와 GFAP 발현하는 성상세포로의 분화가 가능하다. 신경세포의 경우는 시상하부 특이적인 마커인 NPY, a-MSH 를 발현하는 세포로 분화된다.

분화 이후에 기능적으로 완전한 세포로의 형성을 확인하기 위해, 특이적으로 leptin 반응성을 봤을 때(도 40) p-stat3 기전이 반응되는 민감성이 측정되었고, 유전자 반응을 봤을 때, anorexic 관련, POMC, CARTPT, PCSK1,2, LEPR, MC4R의 발현이 증대되어 있고, orexic 관련 유전자인 NPY, AGRP, NPY1R의 발현이 증대되어 있어서 완전히 기능할 수 있음을 시사한다. 특히, 2차원적인 배양에 비해, 3차원적 오가노이드 유래 세포가 보다 잘 패턴화되어 있음을 NKX2.1, RAX, ISL, SF1, NGN3 의 발현을 통해 알 수 있다(도 41).

Leptin에 반응성 있는 줄기세포로서의 시상하부 신경줄기세포의 확보는 실제적으로 생체내의 것들과 유사하게 그 기능을 수행할 수 있음을 보여줌과 아울러 향후 비만, 당뇨 등의 대사질환 연구 및 치료제 개발에 주요하게 사용될 가능성 있음을 시사한다(도 40).

3D 오가노이드 이용으로 개발된 시상하부 신경줄기세포의 생체 이식 가능성 확인

3D 오가노이드 이용으로 개발된 시상하부 신경줄기세포의 생체 이식 가능성을 확인하였다. 1X10⁵ 개의 시상하부 신경줄기세포를 3^rd ventricle에 이식 후, 7일 후에 그 생착 가능성을 확인하였다. hNCAM/Rax 가 발현되는 시상하부 신경줄기세포가 안정적으로 생착됨을 확인하고, 동시에 hGFAP/POMC 가 발현되는 시상하부 신경줄기세포 형태를 띠고 있음을 확인하였다(도 42).

Claims (16)

1. 분화 유도 후 전체 세포 집단에서 DAPI 양성 세포 중 신경세포 마커인 MAP2 양성 세포 비율이 75% 이상이고, 상기 MAP2 양성 세포 중 도파민성 신경세포의 마커인 TH 양성 세포 비율이 25% 이상이며, 상기 TH 양성 세포 중 NURR1 양성 세포의 비율이 70% 이상이거나, FOXA2, LMX1A 및 EN1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 양성인 세포의 비율이 75% 이상인 것을 특징으로 하는, 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포.
2. 제1항에 있어서,
   상기 DAPI 양성 세포 중 FOXA2/LMX1A, KI67/NESTIN, OTX2, SOX2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 양성인 세포의 비율이 75% 이상인 것을 특징으로 하는, 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   2D 배양 유래 신경줄기세포에 비해서 DBN1, HSP90AB, CCT8, SERBP1, KIF5B, RDX, MACFA, EIF4G2, HNRNPK, HSPAB, BZW1, ZC3H15, 및 RSL1D1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 현저하게 증가한 것을 특징으로 하는, 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 최종 분화된 도파민성 신경세포.
5. 제4항의 도파민성 신경세포를 포함하는 세포집단.
6. 제5항에 있어서,
   상기 도파민성 신경세포는 성상교세포(GFAP⁺)와 함께 분화되는 것을 특징으로 하는, 세포집단.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 중뇌형 오가노이드 유래 신경줄기세포 또는 제4항의 도파민성 신경세포 또는 제5항 또는 제6항의 세포집단을 유효성분으로 포함하는, 신경 퇴행성 질환 및/또는 염증성 퇴행성 질환의 치료용 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 구성된 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 신경 퇴행성 질환 및/또는 염증성 퇴행성 질환의 치료용 약학적 조성물.
9. 제7항에 있어서,
   상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 구성된 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 신경 퇴행성 질환 및/또는 염증성 퇴행성 질환의 치료용 약학적 조성물.
10. 분화 유도 후 전체 세포집단에서 DAPI 양성 세포 중 시상하부 신경줄기세포 마커인 Rax 양성 세포 비율이 80% 이상이면서 4계대까지 증식 가능한, 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포.
11. 제10항에 있어서,
    시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 최종 분화되어, 2D 배양 유래 신경세포에 비해서 NKX2.1, RAX1, ISL, SF1 및 NGN3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 발현이 현저하게 증가한 것을 특징으로 하는, 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포.
12. 제10항 또는 제11항의 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 분화되어 Leptin에 대한 반응성이 있는, 시상하부 오가노이드 유래 신경세포.
13. 제12항의 시상하부 오가노이드 유래 신경세포를 포함하는, 세포집단.
14. 제13항에 있어서,
    상기 시상하부 오가노이드 유래 신경세포는 성상교세포(GFAP⁺)와 함께 분화되는 것을 특징으로 하는, 세포집단.
15. 제10항 또는 제11항의 시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포 또는 제12항의 신경세포 또는 제13항 또는 제14항의 세포집단을 유효성분으로 포함하는, 대사질환 치료용 약학적 조성물.
16. 제15항에 있어서,
    상기 대사질환은 당뇨병, 비만 및 대사 장애로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 대사질환 치료용 약학적 조성물.

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