KR20140125682A - 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

인간 유도만능줄기세포(hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 뇌졸중 치료용 키트, 이를 이용하는 뇌졸중 치료 방법 및 뇌졸중 치료를 위한 hiPSC 유래 신경전구세포의 제조 방법이 제공된다.

Description

인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for the treatment of stroke comprising neural precursor cells derived from human induced pluripotent stem cells}

인간 유도만능줄기세포 (human induced pluripotent stem cells; 이하 hiPSC로 약칭함)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물, 이를 이용한 뇌졸중 치료용 키트, 뇌졸중 치료 방법 및 이를 위한 신경전구세포의 제조 방법에 관한 것이다.

뇌졸중 (stroke 또는 cerebrovascular disease)은 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터져서 손상 받은 부위의 뇌세포가 죽게 되어 그에 따른 의식소실, 언어장애, 반신마비 등 신체장애가 나타나는 신경학적 증상이다.

뇌졸중은 크게 뇌혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중(뇌경색)과 뇌혈관이 터지는 출혈성 뇌졸중(뇌출혈)으로 구분된다. 허혈성 뇌졸중의 경우에서는 혈관의 동맥경화증으로 인한 뇌동맥의 혈전이나 색전과 심장질환 등에 의한 심인성 색전이 주된 원인이며, 뇌출혈의 경우는 고혈압에 의한 원발성 뇌출혈과 동정맥 기형이나 동맥류에 의한 지주막하 출혈이 중요한 원인이다.

뇌혈관이 막혀서 발생하게 되는 뇌경색은 다시 뇌혈전증과 뇌색전증으로 구분되는데, 뇌혈전증은 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등에 의하여 동맥경화증이 초래되어 동맥의 벽이 두꺼워지거나 딱딱해지게 되고, 이로 인해 혈관이 좁아지고 혈관의 안벽이 상처받기 쉬워 매끄럽지 못해서 피가 엉겨 붙으면서 결국 막히게 되어 혈액의 공급이 현저히 줄거나 중단되어 뇌세포로 가는 산소 및 영양공급이 부족하여 뇌기능의 장애가 초래되는 경우에 해당하며, 뇌색전증은 심장판막증 또는 심방세동 등의 질환에 의하여 심장 내의 피의 흐름에 이상이 생겨 혈액의 일부가 심장 내에 부분적으로 정체, 응고되어 피찌꺼기(혈전)가 생기게 되며, 이것이 떨어져 나가 뇌혈관을 막게 되어 뇌경색이 발생하게 된다.

뇌출혈의 경우에는 고혈압으로 인해 뇌혈관 내의 압력도 높아지기 때문에 작은 혈관의 벽이 견디지 못하고 터지는 원발성 뇌출혈, 혈관벽의 일부가 약해서 그 약한 부분의 벽이 늘어나 꽈리모양으로 불거져 나온 상태인 뇌동맥류가 어떤 계기에 터져서 발생하는 지주막하 출혈, 뇌동정맥 기형이 선천적으로 존재해 동맥의 높은 압력이 정맥으로 직접 전달되어 발생하는 뇌출혈로 나누며, 이 외에 혈액응고의 장애로 출혈 소인을 가진 경우에도 발생하게 된다.

현재 치료방법으로서는 항혈전제, 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등을 이용한 약물요법이 사용되고 있으나, 현재 유일하게 허가된 약물인 항혈전제(tPA)는 뇌경색 발생 후 4~5 시간 이내에만 효과를 나타낸다. 하지만, tPA는 출혈성 뇌졸중의 경우 병을 더욱 악화시키게 되며, 알러지 등의 부작용을 유발하게 된다. 즉, 뇌졸중은 진단도 쉽지 않고 조기 발견이 어려우며 아직까지도 근본적인 치료법이 없는 상태이다.

본 발명자는 뇌졸중의 치료 방법을 연구하던 중 인간 유도만능줄기세포 및 이로부터 분화된 세포를 이용하여 뇌졸중을 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 뇌졸중으로 진단된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중 치료 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 PA6 기질세포와 공배양하는 단계를 포함하는 뇌졸중 치료를 위한 hiPSC 유래 신경 전구세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유도만능줄기세포" 또는 "iPSC"는 체세포 또는 이미 분화된 세포를 처리하여 만능분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 여기에서 처리하는 방법은 화합물, 유전적 변환 또는 특정 조건으로 배양하는 방법 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "인간 유도만능줄기세포" 또는 "hiPSC"는 인간의 체세포 또는 인간의 분화된 세포를 처리하여 만능분화성을 갖게 된 세포를 나타낸다.

상기의 인간 유도만능줄기세포는 섬유아세포 유래일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈액 등 다양한 기원으로부터 유래할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "섬유아세포"는 콜라겐 등 조직성분을 합성하는 세포이다. 또한, 상기 인간 유도만능줄기세포는 인간 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 등 리프로그래밍 관련 유전자를 발현시켜 제작될 수 있다. 이때, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자 등의 발현은 레트로바이러스 감염 또는 에피조말 시스템(episomal system)을 통해 유래될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "신경전구세포 (neural precursor cells, NPCs)"는 신경 세포의 형태 및 기능을 완전히 갖추기 전 단계의 세포를 의미한다. 상기 일 양상에 따른 신경전구세포는 Nestin, Sox2 및 Musashi 유전자 등을 발현하는 세포일 수 있다. 이들 유전자는 신경전구세포에서 고유하게 발현되는 유전자들로서, 이들의 발현은 형성된 세포가 신경전구세포임을 나타낸다.

상기 일 양상에 따른 신경전구세포는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 것으로, 인간 유도만능줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화는 적절한 성장 인자 또는 화학물질을 처리하는 것에 의해 달성될 수 있다. 또한, 인간 유도만능줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화는 적절한 세포와의 공배양에 의해 분화시킬 수 있다. 예를 들면, 인간 유도만능줄기세포를 PA6 기질세포와 공배양하여 분화시킬 수 있다.

상기 일 양상에 따른 약학적 조성물은 뇌졸중 치료용 약학적 조성물이며, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중 일 수 있다.

상기 일 양상에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로션, 연고, 동결건조제 등 다양한 제형으로 제재화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸 알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 양상은 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 키트를 제공한다.

상기 일 양상에 따른 hiPSC는 섬유아세포 유래일 수 있으며, 상기 신경전구세포는 Nestin, Sox2 및 Musashi 등 유전자를 발현하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 조성물을 뇌졸중으로 진단된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중 치료 방법을 제공한다.

상기 일 양상의 투여는 가능한 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 내, 또는 정맥 내, 비강 내, 복강 내, 피하 또는 국소 투여 등이 가능하다. 이 중 정맥 내 주사가 많이 사용되고 있으며, 신경계질환인 경우 뇌정위수술법(stereotaxic surgery)을 이용하여 뇌의 특정 부위로의 이식이 가능하다. 따라서 뇌경색의 경우 경색 부위(ipsi-lateral)로 직접 투여할 수 있으며, 경색부위의 반대측(contra-lateral)으로 투여할 수도 있다. 랫트를 이용한 동물실험인 경우, 뇌에 직접 주입할 경우 통상 1~2 ul를 사용하되, 최대 5 ul를 초과하지 않으며, 꼬리의 정맥(tail vein)을 통한 주입의 경우 100 ~ 1,000 ul 등의 다양한 용적을 사용할 수 있다. 이식 세포의 개수는 각각 세포의 특성 및 연구 목적에 따라 다를 수 있지만, 통상 100,000 ~ 1,000,000 개 전후의 세포를 사용할 수 있다. 투여 횟수는 목적에 따라 단회 또는 반복해서 주입이 가능하며, 투여기간은 세포이식 후 관찰 및 추적 기간 전체를 의미한다.

사람의 경우, 뇌에 직접 주입할 경우 및 정맥(vein)을 통해 주입할 경우 통상의 줄기세포를 투여하는 양을 고려하여 적절히 투여할 수 있다. 또한, 용량은 시기에 따라 적절히 선택되어 사용될 수 있다.

일 구체 예에서, 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포를 뇌졸중의 동물 모델에서 경색부위의 반대측에 주입하였으며, 대다수의 이식된 세포가 경색 부위 주위로 이동 (migration)한다. 또한 주입된 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포는 염증, 신경교증 및 세포사멸 또는 이들의 조합을 억제하며, 내인성 신경형성작용을 촉진한다.

다른 양상은 hiPSC를 PA6 기질세포와 공배양하는 단계; 상기 공배양으로부터 발생한 로제트(rosette; 장미꽃 봉오리 모양)-유사 세포군을 분리하는 단계; 및 상기 로제트-유사 세포군을 배양하여 뉴로스피어 (neurosphere; 신경구)를 유도시키는 단계를 포함하는, 뇌졸중 치료를 위한 hiPSC 유래 신경전구세포의 제조 방법을 제공한다.

상기 방법은 hiPSC를 PA6 기질세포와 공배양하는 단계를 포함한다. 상기 배양은 체내(인 비보; in vivo) 또는 체외(인 비트로; in vitro) 배양일 수 있다. 상기 배양은 hiPSC와 PA6 기질세포가 직접적인 접촉을 하는 상태에서 배양하는 것일 수 있다. 하지만, 상기 배양은 상기 hiPSC와 PA6 기질세포가 포어를 갖는 막에 의하여 격리된 상태에서 배양되는 것일 수도 있다. 상기 막은 hiPSC의 배양액 중의 생리활성 물질이 투과할 수 있고 세포는 투과할 수 없는 포어 크기 및 배치를 갖는 것일 수 있다. 상기 생리활성 물질은 예를 들면, 단백질, 당 및 핵산일 수 있다. 상기 배치는 예를 들면, 상기 막의 상부에는 상기 간엽 줄기세포를 배양하고 막의 하부에는 상기 신경세포를 배양하여 중력에 의하여 상기 생리활성 물질이 막을 투과하여 하부로 이동할 수 있는 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 공배양으로부터 발생한 로제트-유사 세포군을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 일 양상에 따른 분리는 미분화 세포로부터 또는 배양 용기로부터 로제트-유사 구조를 분리하는 것으로, 화학적 또는 물리적인 방법에 의할 수 있다. 로제트-유사 구조는 줄기세포의 분화과정에서 발생학적으로 신경전구체(neural precursor)로 분화되었음을 의미한다.

상기 방법은 상기 로제트-유사 세포군을 배양하여 뉴로스피어 (neurosphere)를 유도시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "뉴로스피어"는 신경줄기세포의 배양시 형성되는 3차원적인 세포덩어리이다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양은 인 비트로 또는 인 비보 배양일 수 있다. 상기 인 비트로 배양은 해당 분야에서 알려진 신경줄기세포 또는 신경세포 배양 배지에서 알려진 조건에서 배양하는 것을 포함한다. 일 구체 예에서, 분리시킨 로제트-유사구조를 삼차원 배양하여 뉴로스피어를 유도한다.

상기 방법은 상기 뉴로스피어로부터 분리된 세포를 배양하여 신경전구세포로 분화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법에서 뉴로스피어로부터 세포를 분리하는 방법은 뉴로스피어를 형성하고 있는 세포간의 결합을 분리시키는 것으로, 해당 분야에서 알려진 물리적 또는 화학적 방법에 의할 수 있다.

일 양상에 따른 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물, 치료용 키트 및 치료방법에 의하면, 상기 신경 전구세포는 뇌졸중의 경색부위로 선택적인 이동이 가능하며, 염증, 신경교증 또는 세포사멸 등을 억제할 수 있고, 내인성 신경형성과정을 촉진함으로써, 효과적으로 뇌졸중의 치료가 가능하다. 또한, 일 양상에 따른 뇌졸중 치료를 위한 신경전구세포의 배양 방법에 의하면, 효율적으로 신경전구세포로 분화시킬 수 있으며, 이 과정에서 미분화 상태의 세포가 포함되지 않으므로 종양형성을 억제할 수 있다.

도 1은 미분화된 551-8 hiPSC (A)와 H9 인간 배아줄기세포(ESC) (B)를, 형태학적, 반-정량적 (semi-quantitative) RT-PCR (Oct4 및 Nanog) 및 면역 세포 화학적 분석 (OCT4, SSEA-4 및 TRA-1-81)에 의해 비교한 도면이다. 스케일 바: 100 ㎛.
도 2는 551-8 hiPSC의 뉴런으로의 분화를 나타낸 도면이다. (A)는 신경 분화의 단계적 과정을 나타내는 실험 계획도(experimental scheme)를 나타낸다. (B)는 551-8 hiPSC과 PA6 기질 세포의 공배양에 의해 형성된 신경 로제트-유사 구조를 나타낸다(단계 3). (C)는 신경 로제트-유사 구조로부터 단일 세포로 분리시킨 후 삼차원배양 과정을 통해 형성된 뉴로스피어를 나타낸다다(단계 4). (D)는 형성된 뉴로스피어를 accutase 처리를 통해 단일세포로 분리시킨 후 증식 (expansion)을 통해 만들어진 신경전구세포 (Neural precursor cells, NPCs)를 나타낸다(단계 5-NP). (E)는 접착된 뉴로스피어로부터 형성된 분화된 뉴런 세포를 나타낸다(단계 5-MN).(NP는 neural precursor을 의미하며, MN: mature neuron을 의미한다).
도 3은 551-8 hiPSC-유래 신경전구세포 (단계 5-NP)의 특징을 나타낸 도면이다, (A)는 높은 수준의 NESTIN 및 SOX2의 발현, 낮은 수준의 Tuj1 발현을 나타내는 면역세포화학적 염색을 나타낸다. DAPI는 각각의 세포에 대한 대비염색을 위하여 사용되었다. (B)는 전분화능 마커 (Oct4, Nanog), 신경 전구세포 마커 (Sox2, Nestin, Musashi), 초기 또는 후기 뉴런 마커 (Tuj1 또는 Map2) 및 아스트로사이트(astrocyte; 성상교세포) 마커 (GFAP)의 발현을 나타내는 반-정량적 RT-PCR 분석을 나타내다. 스케일바: 50 ㎛.
도 4는 551-8 hiPSC-유래 성숙한 뉴런 (단계 5-MN)의 특징을 나타낸 도면이다. (A)는 초기 (Tuj1), 성숙 (MAP2 및 NeuN), 전뇌/중뇌 (OTX2), 전뇌 (BF-1), 중형 돌기 투사 뉴런 (medium spiny projection neuron; DARPP-32), 아스트로사이트 (GFAP) 및 올리고덴드로사이트 (04) 마커의 발현을 나타내는 면역세포화학적 염색을 나타낸다. (B)는 전분화능 (즉, Oct4, Nanog), 초기 및 후기 뉴런 (Tuj1 또는 Map2), 전뇌 (Bf-1), 전뇌/중뇌 (Otx2), 중뇌/후뇌 (En2), GABA 성 (GABAergic) 뉴런 (GAD67), 중형 돌기 투사 뉴런 (DARPP-32), 성상세포(아스트로사이트; astrocyte)(GFAP) 및 희돌기세포(올리고덴드로사이트; oligodendrocyte)(MBP)의 마커의 발현을 나타내는 반-정량적 RT-PCR 분석을 나타낸다. 스케일바: 50 ㎛.
도 5는 551-8 hiPSC-유래 NP 세포를 설치류의 MCAo 모델로의 이식한 후의 생체 내 기능 분석을 나타낸 도면이다. (A)는 MCAo 동물모델을 만드는 시간표 및 행동 검사를 위한 전 수치(프리-스코어; pre-score)의 결정, 세포 이식(Cell Tx), 다양한 행동 검사(Behavioral tests) 및 동물 MRI 촬영 및 동물 희생 후의 조직학적 분석(Perfusion & IHC)을 나타내는 실험 계획도를 나타낸다. (B)는 551-8 hiPSC-유래 NP 세포의 이식후의 행동 개선 검사 결과를 나타낸다. 로타로드 검사, 스테핑 검사 및 mNSS 검사는 매주, 아포모르핀 검사는 격주로, 8주 까지 수행되었다. * 는 p<0.05를 **는 p<0.001를 나타낸다. (C)는 이식된 세포 및 이로부터 분화된 세포의 특성을 조사하기 위한 면역조직학적 염색을 나타낸다. 이식된 세포의 운명을 검출하기 위하여, 인간세포특이적 핵에 대한 항체 (hNu) 또는 인간세포특이적 미토콘드리아에 대한 항체 (hMito)가 사용되었다. 이식된 세포는 인간특이적 NESTIN (hNESTIN)를 포함하여, MAP2, NeuN, DARPP-32, GAD65/67, TH, GFAP 및 O4 등을 발현했다. DAPI는 세포간의 대비염색을 위해 사용되었다. 화살표는 동시에 발현된 마커를 나타낸다. 스케일바= 20 ㎛.
도 6은 설치류 MCAo 모델의 경색의 대측면에 551-8 hiPSC-유래 신경전구세포를 이식한 후 생체 내 운명 및 동태의 추적을 나타낸 도면이다. (A)는 전후 (antero-posterior) 시퀀스 (4.2 mm 부터 -1.20 mm까지, 브레그마 (bregma)로부터 측정함)에 따른 T2- 및 T2*- 강조 영상 (weighted imaging)의 단면도를 나타내는 4.7T 동물 MRI 분석을 나타낸다. Feridex로 표지된 이식된 세포가 경색 부위 (화살표 머리)로 이동함을 나타낸다. (B)는 경색부위에서의 Feridex-표지된 이식된 세포의 검출을 나타내는 프루시안 블루 (Prussian blue) 염색결과를 나타낸다. (C)는 CXCR4와 동시에 발현되기도 하는, 인간 특이적 미토콘드리아 (hMito)의 발현에 의해 확인된, 이식된 세포의 존재 부위를 나타내는 면역세포화학적 염색 결과를 나타낸다. 스케일바: 50 ㎛.
도 7은 551-8 hiPSC-유래 NP 세포의 이식 효과를 나타낸 도면이다. (A)는 면역조직화학적 염색 및 세포계수에 의해 판단된 이식된 동물에서의 염증 (Iba-1, ED1), 신경교증 (GFAP) 및 세포사멸 (TUNEL)의 감소를 통계학적 분석을 통해 유의성을 나타낸 도면이다. DAPI는 각 세포간의 대비염색을 위하여 사용되었다. (B)는 이식된 동물에서의 내인성 신경형성과정(BrdU)의 촉진 및 이동성 신경아세포 (DCX) 및 신생 신경줄기세포(PSA-NCAM)의 형성을 나타내는 면역조직화학적 염색결과를 나타낸다. 세포 계수 및 통계학적 분석 또한 수행되었다. * 는 p<0.05를 ** 는 p<0.001를 나타낸다. 스케일바 =50 ㎛.
도 8은 MCAo 동물 모델로의 이식 후의 551-8 hiPSC-유래 NPCS의 작용양상 (action mode)를 나타낸 모식도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 551-8 hiPSC 의 배양 및 신경분화

인간 iPSC (Detroit 551-iPS8, 이하 551-8 hiPSC로 간략히 기재함)를 배양 및 유지시켰다. 대조군으로, H9 인간 ES 세포 (WiCell로부터 제공받음)을 사용하였다. iPSC의 신경분화는 세포를 PA6 기질 세포 (stromal cell) (RIKEN Cell Bank로부터 제공받음)와 함께 공배양 (coculture)함으로써 유도시켰다. 미분화된 iPSC 콜로니를 손으로 떼내 분리시키고, 10% KO-SR (knockout serum replacement, Invitrogen)를 포함하는 GMEM로 이루어진 분화 배지(DM-PA6)로 신선하게 준비한 PA6 세포를 옮겼으며, 4일 후, DM-PA6 중 KOSR를 N2 보조제 (N2 supplements) (Invitrogen)로 교체시켰다. 11~13일 이후, 신경상피세포 (neuroepithelial cell, NE)를 포함하는 명확한 신경 로제트-유사 구조가 형성되었고, 이를 기계적으로 분리한 후, 뉴로스피어 (neurosphere) 형성을 유도하기 위하여 7일 동안 비접착성 페트리 접시로 옮겨 현탁배양시켰다.

실시예 2. 신경전구세포의 분화 및 특성 확인

2.1. 신경전구세포의 분화

이식 (transplantation)을 위한 NPC를 제조하기 위하여, 뉴로스피어를 단일세포로 분리하였으며, 뒤이어 Accutase^TM (Chemicon)로 처리하고 이를, 폴리 L-오르니틴 (poly L-ornithine, PLO; 15 ㎍/ml, Sigma) 및 피브로넥틴 (fibronectin, FN; 1 ㎍/ml, Sigma)으로 코팅된 60 mm² 조직 배양 접시에 도말 (plate)하였다. NPC는 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신, 1% 비필수적 아미노산, 0.1% 베타-머캡토에탄올 (β-mercaptoethanol), N2 보조제 및 20 ng/ml bFGF (Invitrogen) 등이 첨가된 GMEM 배양액 내에 유지시켰다.

2.2. 성숙한 뉴런으로의 분화

iPSC를 성숙한 뉴런으로 분화시키기 위하여, 뉴로스피어를 20 ng/ml 뇌 유래 신경 영양인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF, R&D Systems)가 포함되지만 bFGF는 포함되지 않은 DM 배양액이 들어있는, PLO/FN이 코팅된 접시에 직접 도말하였다.

2.3. 면역세포화학적 분석

NPC 및 분화된 뉴런 세포의 마커 발현을 분석하기 위하여, 아래에 기술된 일차 항체를 이용한 면역세포화학적 분석을 수행하였다. OCT4 (1:250, Santa Cruz), SSEA-4 (1:100, Developmental Studies Hybridoma Bank), TRA-1-81 (1:250, Chemicon), 인간특이적 핵 (1:200, Chemicon), 인간특이적 미토콘드리아 (1:200, Chemicon), 인간특이적 네스틴 (NESTIN) (1:200, Chemicon), SOX2 (1:200, Chemicon), 타입 III-튜불린 (Tuj1) (1:500, Chemicon), OTX2 (1:500, Chemicon), BF-1 (1:100, Santa Cruz), MAP2 (1:200, Chemicon), NeuN (1:500, Chemicon), 감마-아미노뷰티르산 (Gamma-aminobutyric acid, GABA) (1:5000, Sigma), 글루타민산 디카르복실라제 65/67 (GAD65/67) (1:200, Chemicon), DARPP-32 (1:100, Cell Signaling), TH (1:1000, Pel-Freez), GFAP (1:500, BD Biosciences), O4 (1:250, Chemicon), Iba-1 (1:250, Wako), ED1 (1:250, Serotec), doublecortin (DCX) (1:200, Cell Signaling) 및 CXCR4 (1:40, R&D Systems). 사용한 이차 항체는 염소 항-마우스 IgG-접합된 Alexa-555 (1:200, Molecular Probes), 염소 항-토끼 IgG 접합된 Alexa-488 (1:200, Molecular Probes) 및 염소 항-마우스 IgM-접합된 Alexa-555 (1:200, Molecular Probes)이다. 공초점 레이저-주사 현미경 이미지 시스템 (LSM510, Carl Zeiss, Inc.)을 이용하여 염색 패턴을 조사한 후 촬영하였다. 그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이 NESTIN, SOX는 높은 수준으로 발현되며, Tuj1은 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

2.4. RNA 의 추출 및 역전사 중합효소 연쇄 반응 수행

트리졸 (Trizol) RNA 추출 방법 (Gibco)을 이용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 42 ℃에서 1시간 동안 M-MLV 역전사효소 (Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭은 제조사 (Intron, Korea)의 프로토콜에 따라서 Taq 중합효소를 이용하여 수행하였다. 프라이머 서열, 사이클의 수, 어닐링 온도는 하기 표 1에 기술한다. 하우스키핑 유전자인 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)를 내부 로딩 대조군 (internal loading control)으로 사용하였다.

유전자명	Forward (F) 및 Reverse (R) 프라이머 서열	크기	어닐링 온도(℃)	사이클 횟수	GenBank accession no.
Oct4	F: 5'-CTGAAGCAGAAGAGGATCAC-3' (서열번호1)	366	60	30	NM_002701.4
	R: 5'-GACCACATCCTTCTCGAGCC-3' (서열번호2)
Nanog	F: 5'-TTCTTGACCGGGACCTTGTC-3' (서열번호3)	256	60	30	NM_024865
	R: 5'-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3' (서열번호4)
Sox2	F: 5'-GCTGCAAAAGAGAACACCAA-3' (서열번호5)	232	59	30	NM_024865
	R: 5'-CTTCCTGCAAAGCTCCTACC-3' (서열번호6)
Nestin	F: 5'-TCCAGAAACTCAAGCACCA-3' (서열번호7)	183	59	30	NM_006617
	R: 5'-AAATTCTCCAGGTTCCATGC-3' (서열번호8)
Musashi	F: 5'-ACAGCCCAAGATGGTGACTC-3' (서열번호9)	191	59	30	NM_002442
	R: 5'-CCACGATGTCCTCACTCTCA-3' (서열번호10)
Beta III tubulin	F: 5'-ATGAGGGAGATCGTGCACAT-3' (서열번호11)	239	59	30	BC000748.2
	R: 5'-GCCCCTGAGCGGACACTGT-3' (서열번호12)
Map2	F: 5'-GCATATGCGCTGATTCTTCA-3' (서열번호13)	202	59	30	U01828
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Bf-1	F: 5'-CTCAGAACTCGCTGGGCAAC-3' (서열번호15)	225	59	30	NM_005249
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En-1	F: 5'-CTAGCCAAACCGCTTACGAC-3' (서열번호19)	358	59	30	NM_001426.3
	R: 5'-GCAGAACAGACAGACCGACA-3' (서열번호20)
Darpp-32	F: 5'-CCTGAAGGTCATCAGGCAGT-3' (서열번호21)	131	50	30	AF464196.1
	R: 5'-GGTCTTCCACTTGGTCCTCA-3' (서열번호22)
GAD67	F: 5'-AGCAAACCGTGCAATTCCTC-3' (서열번호23)	230	55	30	L16888.1
	R: 5'-AAATCGAGGATGACCTGTGC-3' (서열번호24)
GFAP	F: 5'-GCAGAGATGATGGAGCTCAATGACC-3' (서열번호25)	266	59	30	BC041765.1
	R: 5'-GTTTCATCCTGGAGCTTCTGCCTCA-3' (서열번호26)
MBP	F: 5'-ATTAGCTGAATTCGCGTGTG-3' (서열번호27)	235	59	30	M13577.1
	R: 5'-CTCTGAGTGCGCAAGTCTTC-3' (서열번호28)
GAPDH	F: 5'-GTCATACCAGGAAATGAGCT-3' (서열번호29)	422	60	30	BC083511.1
	R: 5'-TGACCACAGTCCATGCCATC-3' (서열번호30)

실시예 3. 뇌졸중 동물모델 및 이식 세포 준비

3.1. MCAo 동물 모델

차의과학대학교 동물 실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC; IACUC090012)의 규정에 따라서 동물실험을 수행하였다. 270-300 g의 수컷 성체 Sprague-Dawley 랫트를 이용하는 Longa의 방법 (Longa, E. Z.; Weinstein, P. R.; Carlson, S.; Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91; 1989)을 따라서 MCAo를 유도하였다.

중대뇌동맥 (middle cerebral artery, MCA)을 폐쇄하기 위하여 약 19 mm의 둔단 (blunt-ended) 모노필라멘트 (monofilament) (4-0, Ethicon, UK)를 경동맥분지 (carotid bifurcation)로부터 내경동맥 (internal carotid artery)으로 90분 동안 삽입하였으며, 그 뒤 모노필라멘트(monofilament)를 조심스럽게 빼내었다. 뇌졸증 동물 모델이 제대로 제작되었는지 여부를 결정하고 선별하기 위하여, 90분의 MCAo 유도 후 24시간이 경과된 이후에 앞다리 및 뒷다리의 배치 (placement) 및 서클링 행동 등을 포함하는 급성 신경학적 평가 법을 이용하였다. 3 점 또는 더 낮은 (정상: 5 점)을 기록한 동물들을 이식 실험에 사용하였다.

3.2. 551-8 hiPSC의 배양 및 신경분화 유도

4개의 리프로그래밍 인자 (Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)를 레트로바이러스 감염을 통하여 Detroit 551 인간 섬유아세포로부터 iPSC (551-iPS8, 이하 551-8 hiPSC로 기재)를 제작하였다. 551-8 세포는 H9 hESC와 매우 유사한 특징을 갖는데, hESC와 유사한 형태 (morphology)를 가지며, 반정량적 (semiquantitative) RT-PCR 및 면역세포화학적 분석을 통해서 전분화능 (pluripotency) 마커의 발현을 나타내었는데 (도 1A 및 B), 이는 상기 세포가 전분화능을 갖는 것을 의미하는 것이다. 뇌졸중 동물모델에서 hiPSC의 치료 효과를 조사하기 위하여, 일차적으로 551-8 iPSC 및 H9 hESC의 신경 분화를 유도시켰다 (도 2A).

신경분화 프로토콜은 5단계로 나뉘는데, 미분화 H9 또는 551-8 세포를 마우스 배아 섬유아세포 (mouse embryonic fibroblast, MEFs)에 유지 (단계 1), PA6 기질 세포 (stromal cell)와의 공배양 (단계 2), 신경 로제트-유사 구조의 단리 (단계 3, 도 2B), 및 뉴로스피어 형성 (단계 4, 도 2C)을 포함한다. 뒤이어, 이식을 위한 신경전구세포 (neural precursor cells, NPC)를 만들기 위하여 뉴로스피어를 단일 세포로 분리하거나 (단계 5-NP, 도 2D), 성숙한 뉴런으로 더 분화시킨다 (단계 5-MN, 도 2E).

단계 3의 분화 다음, 551-8 iPSC 및 H9 hESC가 로제트-형성 능력상에서 차이를 보임을 발견하였다. 80% 이상의 H9 세포의 콜로니가 로제트-유사 구조를 보인 반면, 551-8 iPSC의 경우 대략 20% 콜로니가 로제트-유사 구조를 나타내었다. 이 차이는 전분화능 줄기 세포들간의 개별적인 차이(clonal variation), 또는 iPSC가 갖는 고유한 특성에 기인하는 것일 수 있다.

551-8 세포의 초기 로제트-형성 능력이 H9 세포에 비하여 상대적으로 더 낮았으나, 단계 3에서 로제트-유사 구조를 분리시킨 후, 마지막 단계까지 더 분화시켰다. 흥미롭게도, 5-NP 단계에서는 NESTIN, SOX2, Musashi와 같은 NPC 마커가 551-8 iPSC에서 H9 세포의 것과 동등하게 높은 수준으로 강하게 발현됨을 발견하였다 (도 3A 및 B). 성숙한 신경 분화 단계 (단계 5-MN)에서, 일반뉴런 (Tuj1), 성숙한 뉴런 (MAP2 및 NeuN), 전뇌/중뇌 (Otx2), 전뇌 (BF-1), 중형 돌기 투사 뉴런 (medium spiny projection neuron) (DARPP-32), GABAergic (GABA 및 GAD67) 및 도파민성(dopaminergic) (TH) 뉴런을 포함하는 다양한 종류의 뉴런 세포의 마커 및, 아스트로사이트 (astrocyte)의 마커 (GFAP) 및 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)의 마커 (O4 및 MBP)들이 발현함을 관찰했다(도 4A, B).

이와는 대조적으로, 전분화능의 마커 (Oct4 및 Nanog) 또는 중뇌/후뇌의 마커 (En-1)는 검출되지 않았다 (도 4B). 이를 종합하여 볼 때, 이 결과는 551-8 iPSC이 그들의 낮은 로제트-형성 능력에도 불구하고, 이후의 신경분화과정에서는 문제가 없음을 나타낸다.

실시예 4. 뇌졸중 동물모델 대상 세포 이식 및 효과 분석

4.1. 세포 이식

MCAo 유도 후 7일째에, 총 10 마리 랫트에게 2 ㎕의 551-8 hiPSC-유래 NPCs (100,000 cells/㎕)를 경색 부위의 반대측 (contra-lateral)편에 주입하였으며, 브레그마(bregma)로 부터 AP +1.0 mm, ML +3.0 mm 및 DV -5.0 mm인 좌표를 표적으로 삼았다. 대조군의 경우 (n=10), 아무 것도 포함하지 않은 배지 (GMEM) 2㎕를 동일한 부위에 주입하였다. 동물 MRI 실험을 위하여, 동일한 세포를 종래 기술된 바와 같이 (Kim, D. et al. In vivo tracking of human mesenchymal stem cells in experimental stroke. Cell Transplant. 16:1007-1012; 2008), 페럼옥사이드 (ferumoxide) (Feridex®)-프로타민 황산염 복합체로 표지하였다. 이식된 동물에게 이식 24시간 전부터 이식 후 8주까지 매일 복강내로 면역억제제인 싸이클로스포린 A (cyclosporine A) (Sigma, 10 mg/kg)를 주입하였다.

4.2. 행동 분석

MCAo 모델이 적절히 형성되었는지 여부를 결정하고 세포 이식 후에 랫트가 기능적으로 회복되었는지를 평가하기 위하여, 이식한 다음, 매주 로타로드 (rotarod) 검사, 스테핑(stepping) 검사, mNSS (modified neurological severity score) 검사를, 2주마다 아포모르핀-유도 (apomorphine-induced) 회전 (rotation) 검사를 수행하였다. 기준선 점수를 결정하기 위하여, 이식 1-3일 이전에 각 검사를 먼저 수행하였다.

4.3. 통계적 분석

차의과학대학교 중앙 컴퓨터상의 통계 분석 시스템 (Enterprise 4.1; SAS Korea)을 이용하여 행동 데이터에 대한 통계적 분석을 수행하였다. 능력검사 (Performance measure)의 경우 PROC MIXED 프로그램을 사용했는데, 이 방법은 정상데이터 둘 다의 반복 측정 분석을 수행하기 위한 선형 혼합 모델 (linear mixed model)을 이용했다. 결과값을 평균±SEM (standard error of mean)로 나타냈다. p <0.05 값인 경우 유의적인 것으로 간주하였다.

4.4. MRI 영상을 이용한 이식된 세포의 검출

T2- 및 T2*-강조 영상 기술 (weighted imaging technique)을 이용하여 4.7T Bio Spec (Bruker, Germany) 장비를 동물 MRI 분석에 사용하였다. MRI 설정 및 검출 방법은 종래 기술된 바와 동일하다 (Kim, D. et al. In vivo tracking of human mesenchymal stem cells in experimental stroke. Cell Transplant. 16:1007-1012; 2008.). Feridex®로 표지된 551-8 hiPSC-유래 NPC를 검출하기 위하여, 프러시안 블루 (Prussian blue) 염색법이 기술된 바와 같이 수행되었으며, 이식된 세포의 생체내에서의 운명을 알아보기 위해 인간 특이적 핵 또는 미토콘드리아에 대한 항체와 더불어 관심을 갖고 있는 표적단백질에 대한 항체를 이용한 이중 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 이식 전, 프러시안 블루 염색 양상을 통해 이식에 이용될 세포가 Feridex®로 완전히 표지되었음을 확인하였다.

4.5. 면역조직화학적 분석

면역조직화학적 분석을 위하여, 이식 후 8주에 랫트를 희생시켰으며, 4 %의 파라포름알데히드를 뇌에 분사하여 고정시켰다. 냉도조직절편기 (cryostat) (Microm, Germany)를 이용하여 40 μm 동결 관상면 절편 (frozen coronal section)을 준비하였다. 면역조직화학에 사용된 항체는 상기의 면역세포화학적 분석에서 기술된 것과 동일하였다. 내인성 (endogenous) 줄기세포를 검출하기 위하여, 5'-브로모-2'-데옥시유리딘 (5'-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)을 희생 직전에 12시간의 간격으로 3 차례 복강내 주입하였다. 45 ℃에서 30분 간 1M HCl를 이용하여 DNA을 변성한 다음 BrdU-양성 세포를 BrdU에 대한 항체 (1:500, BD Biosciences)를 이용하여 검출하였다.

4.6. TUNEL 분석법

세포사멸(apoptosis)이 일어난 세포를 검출하기 위하여, 동결 절편을 In Situ Cell Detection Kit를 이용하여 제조사 (Roche)의 방법을 따라서 염색하였다. 모든 절편은 DAPI로 대조염색되었다. TUNEL 염색에 양성반응을 보인 세포의 수를 Image J를 이용하여 측정한 후 통계분석을 실시하였다.

실시예 5. 뇌졸중 동물모델로의 세포 이식 효과의 확인

5.1. 551-8 hiPSC -유래 NPC 의 MCAo 동물 모델 대상 이식 후 행동 호전 여부 조사

iPSC-유래 NPC (iPSC-NPC)가 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)을 유도시킨 설치류 모델에 이식한 후 기능적 효과를 수행할 수 있는지를 검사하였다 (도 5). 이식 실험에 앞서, 90 분간 MCAo를 유도한 뒤, 행동 기준에 따라서 적절한 동물을 선별하였다. 일주일 후, 200,000개의 551-8 hiPSC-NPC (단계 5)를 2 ㎕ 부피로 경색이 일어난 부위의 반대측 (contra-lateral)편의 선조체 (striatum)에 이식하였다 (n=10).

위대조군 랫트에는 (n=10) 세포가 포함되지 않은 배양액 (GMEM) 만을 주사하였다. 이식 부위로 병변이 일어난 동측 (ipsi-lateral)이 아닌 반대편인 반반대측을 선택한 이유는 인간 골수-유래 중간엽 줄기세포 (bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)를 이용한 종전 MRI 연구를 통해 대부분의 줄기세포가 병변 부위로 이동하는 능력을 가지고 있음을 입증하였기 때문이다. 또한, 동측편 주사는, 이미 조직 손상과 염증반응이 유발된 경색 부위에 불가피하게 해밀톤 주사기가 삽입되므로 경색 부위에 추가적으로 상처를 일으킬 우려가 있다. 더욱이, 이 주사 부위는 MRI 상에서 위양성(false-positive)으로 잘못 판단될 수 있으므로, 반대측 주사를 통해 이와같은 MRI 결과의 오역 가능성을 피할 수 있다.

세포이식 후 기능적 효과를 평가하기 위하여, 4가지의 다른 행동 검사 (즉, 로타로드 검사, 스테핑 검사, mNSS 검사 및 아포모르핀-유도 회전 검사)를 수행하였다. 이식 후 8주까지 관찰하였으며, 유의적인 행동 회복 (p<0.05)이 이미 1주 (로타로드 검사에서) 또는 2주 (계단, mSS 및 아포모르핀-유도 회전 검사에서)에 관찰되었다(도 5B). 사용된 검사 중에서, 스테핑검사 및 아포모르핀-유도 회전 검사에 비하여, 로타로드 및 mNSS 검사에서 안정적이고 점진적인 개선양상이 관찰되었다. 운동기능 (motor function)의 개선뿐 아니라, mNSS 검사에서 감각 기능 (sensory function)의 개선도 관찰되었다. 종합하여 보면, 이 결과들은 이식된 551-8 hiPSC-NPC가 MCAo 뇌졸증 동물 모델에서 행동 개선에 기여함을 강력하게 나타내 준다.

5.2. 이식된 iPSC - NPC 으로부터 새로운 신경조직의 형성

8주간의 행동 검사 완료 후, 랫트를 희생시키고 뇌의 조직학적 분석을 수행하였다. 공여 인간 세포를 식별하기 위하여, 인간특이적 핵 항원 (hNu) 및 인간 미토콘드리아 (hMito)에 대한 항체를 사용하였다 (도 5C). 공초점 현미경 및 이중면역염색을 이용하여, 이식된 551-8 hiPSC-유래 세포 중 일부가 여전히 NESTIN-양성 신경전구세포임을 발견하였다. 하지만 중요한 사실은, 이식된 세포의 다수가 생존하여 MAP2- 및 NeuN-양성 성숙한 뉴런을 형성하였다는 점이다. 또한 이식된 세포는 선조체의 기능 (striatal function)에 필수적인, 중형 돌기 투사 뉴런 (medium spiny projection neuron)도 형성하였다.

더욱이, 일부 뉴런은 GABA 성 (GAD65/67) 및 도파민성 (TH) 마커를 발현하는 것을 관찰하였다. 이식된 세포로부터 아스트로사이트 (GFAP) 및 올리고덴드로사이트는 거의 형성되지 않았다.

최근 마우스 iPSC로부터 분화된 NPC가 MCAo 마우스 모델로 이식되었을 때 종양을 발생시킬 수 있다는 것이 보고되었으며, 이는 뇌졸증에서 iPSC-NPC를 이용한 세포치료에 있어 안정성 우려를 증가시켰다. 그러나, 본 발명에서, 세포 이식 및 위 대조군의 총 20 개의 그룹에서, 이식 세포의 과다 성장 또는 종양 형성에 대한 어떤 증거도 찾을 수 없었다. 마우스 iPSC에 대한 종전 보고에 반해서, 본 발명의 NPC 분화 프로토콜은 일련의 선별과정을 통하여 더욱 안정화되었으며, 미분화된 세포를 거의 포함하지 않는다. 종합하여 볼 때, 이러한 결과는 551-8 hiPSC-NPC가 이식 후 생존하며, 종양 형성 없이, 경색 부위에서의 신경 조직 형성 및 신경 재생에 기여한다는 것을 나타낸다.

5.3. 동물용 MRI 를 이용한 551-8 hiPSC -유래 NPC 의 생체 내 운명 추적

경색 부위의 반대측으로 이식된 551-8 세포의 운명을 모니터링하기 위하여, T2- 및 T2*-강조 영상 기술을 이용한 4.7T 동물 MRI를 이용하였다 (도 6A). 동물 MRI는 이식 후 1일 후 및 이식 후 8주에서 행동 검사를 마친 후 동물 희생 바로 직전에 촬영되었다. 도 6A는 이식 후 8주 뒤의 T2 및 T2* 영상을 나타낸다.

흥미롭게도, 대다수의 이식된 세포가 경색 주변부 (peri-infacrt area)로 이동하며, 뇌졸중 동물 모델에서의 줄기세포의 병변친향성 (pathotropism)을 나타낸다는 것을 관찰할 수 있었다. 본 발명자들은 종전에 이 현상을 BM-MSC가 사용된 경우에 관찰한 바가 있으며, 더 최근에는, 인간 ESC-유래 NPC, 신경줄기세포 (neural stem cell, NSC) 및 제대혈-유래 MSC 등 다양한 종류의 세포를 이식한 경우에도 유사한 현상이 일어남을 관찰한 바가 있다. 중요한 사실은, Feridex®-표지된 이식된 세포는 주사 부위를 불문하고 광범위하게 이동, 분포하는데, 뇌량(corpus callosum)을 통하여 뇌의 반구를 접선으로 가로질러 이동할 뿐 아니라, 경색 부위 전체를 둘러쌈을 볼 수 있다(도 6A-C).

또한, 이동한 세포의 대부분 (80.10±8.50 %)에서 허혈성 손상 (ischemic injury)이 일어났을 때 이에 반응하여 아스트로사이트 및 혈관내피세포에 의해 상향 조절되는 것으로 알려져 있는 염증 화학주성인자 (inflammatory chemoattractant) SDF-1α (stromal cell-derived factor 1-α)의 동종 수용체 (cognate receptor)인 CXCR4를 발현한다는 것을 발견하였다 (도 6C). 따라서, 동물 MRI 연구 결과 및 이식된 세포의 대부분이 CXCR4를 발현하는 것으로 보아, hiPSC-유래 NPC가 조직의 회복과 재생을 위한 줄기세포의 호밍 (homing) 및 생착 (engraftment)을 위해 꼭 필요한 첫번째 단계인, 손상된 뇌로 이동하는 능력을 갖는다는 것을 시사한다.

5.4. 염증, 신경교증 ( gliosis ) 및 세포사멸 ( apoptosis )의 감소

염증은 허혈성 손상에 따른 뇌손상의 결정적인 매개체이다. 동물 모델 또는 인간 뇌졸중 환자 모두에서 입증된 바와 같이, 허혈성 뇌졸중 발생 후 염증 연쇄반응(cascade)은 미세아교세포 (microglia) 및 아스트로사이트의 빠른 활성을 포함한다. 본 발명에서 iPSC-이식된 그룹 및 위 대조군 그룹에서의 대표적인 두 미세아교세포 마커인 Iba-1 및 ED1 발현을 정량분석하였다. Iba-1 는 허혈 중심부 (core) 및 주변부 (penumbra) 모두에서 발현되는 반면, ED1는 허혈 중심부에서만 발현되었다. 주변부는 에너지 대사가 보존되는 제한된 혈액 공급 부위이다.

위 (sham) 대조군과 비교하여 볼 때, 551-8 hiPSC-유래 NPC가 이식된 동물의 경우 주변부에서의 차이는 비유의적임에도 불구하고 (14.86±1.10 vs.12.51±1.27 %, P=0.31), 허혈 중심부에서 Iba-1⁺ 세포 수의 유의적인 감소를 나타내었다 (53.40±4.66 vs. 17.31±1.40%, P<0.05) (도 7A, 첫번째 패널). 위 대조군과 비교하여 볼 때, 원형의 ED1-양성 세포 수 또한 이식된 그룹에서 유의적으로 감소됨이 나타났다 (23.84±2.71 vs. 12.50±0.10%, P<0.05) (도 7A, 두번째 패널). 본 분석은 이식 후 8주차에 수행되었기 때문에, 현재 염증 세포의 감소가 언제 처음 발생하였는지를 정확하게 알 수 없다. 그러나, 이 조직학적 발견은 초기 단계의 결과일 것으로 추정되고 있다.

또한, hiPSC-유래 NPC 이식 그룹 및 위대조군 그룹에서의 아스트로사이트의 수를 검사하였으며, 이식된 그룹에서 주변부의 GFAP-양성 아스트로사이트가 현저하게 감소하였음을 발견하였다 (87.70±5.7 vs. 32.14±3.53%, P<0.001) (도 7A, 세번째 패널). 허혈성 손상 후의 GFAP-양성 아스트로사이트의 확산 (신경교증) (gliosis)은 보통 신경교성 반흔 (glial scar) 형성으로 이어진다.

따라서 이식된 iPSC 신경교성 반흔 형성 또한 억제할 수 있다. 또한 이식된 그룹에서 TUNEL-양성 세포사멸 세포의 수가 유의적으로 감소함을 관찰하였다 (22.15±0.60 vs. 4.59±0.90%, P<0.001) (도 7A, 마지막 패널). 대부분의 세포사멸은 더욱 일찍, 경색 후 처음 2 주 동안 발생하기 때문에, 이 단계에서는 아주 적은 수의 뉴런만이 세포사멸한다. 따라서 TUNEL-양성 세포는 후기 단계에서 신경회복에 관여할 수 있는 세포사멸성 미세아교세포 (apoptotic microglia)에 의해 표현된 것일 수 있다.

미세아교세포 및 아스트로사이트의 활성이 신경 생존, 신경 형성 및 뇌졸증 후 기능적 회복에 해로운지 또는 이로운지는 여전히 논란이 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 결과는 이식된 hiPSC-유래 NPC가 동물 뇌졸중 모델에서의 염증, 신경교증 및 세포사멸의 감소에 기여한다는 것을 시사한다.

5.5. 내인성 ( endogenous ) 신경형성(neurogenesis) 과정의 촉진

뇌졸중에 의해 유도된 신경 형성(neurogenesis) 과정은 이미 성체 뇌에서 일어남이 관찰, 보고된 바가 있다. 즉, 뇌졸증에 의해 손상을 받을 경우 하부뇌실질 (subventricular zone, SVZ)에서 소량으로 존재하는 BrdU 양성 내인성 NSC 또는 NPC의 풀 (pool)이 증식하고 또한 신경모세포 (neuroblast)를 발생시키게 된다. 이와 같은 과정을 거쳐 새롭게 생성된 신경모세포는 선조체 (striatum)에 있는 손상된 부위로 이동하고, 이 중 일부는 기능적 뉴런으로 분화하는 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.

이러한 이유로 인해, 현재 내인성 신경형성과정을 증대시킴으로써 뇌졸중 치료에 활용하고자 하는 이론이 광범위하게 받아들여지고 있다. 이와 같은 근거를 바탕으로, 이식된 hiPSC-유래 NPC가 내인성 신경형성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 이를 위하여, 희생에 앞서 이식된 동물 및 위대조군 동물에 BrdU를 12시간의 간격으로 3차례 주사하였다. BrdU-양성 세포는 BrdU에 대한 항체를 이용한 면역조직화학을 이용하여 검출했으며, 신경세포의 이동과 관련 있는 DCX (doublecortin) 또는 PSA-NCAM (the polysialilated form of neural cell adhesion molecule)을 사용하여 중복염색을 실시했다.

iPSC-NPC 이식 그룹과 위대조군 그룹간에 반대측에서의 SVZ 지역에서의 BrdU-양성 세포의 발현 차이가 없는 반면 (12.12±2.39 vs.19.56±2.39), 병변이 일어난 동측편 SVZ 지역에서는 유의적인 차이가 있었다 (49.89±7.03 vs. 83.83±12.14, P<0.05, 도 7B). BrdU-양성 세포 중에서, 위대조군에 비하여 hiPSC-이식 그룹에서 DCX (12.17±2.39 vs.19.56±2.39, P<0.05) 또는 PSA-NCAM (42.20±16.38 vs. 70.67±16.27, P<0.05)과 함께 양성인 세포가 매우 다수임을 발견하였다. BrdU-양성 인간 세포는 발견되지 않았으며, 이는 이식된 hiPSC-유래 NPC가 BrdU 양성 세포과 관계 없음을 의미한다.

이를 종합하여 볼 때, 이러한 결과는 이식된 hiPSC유래 NPC가 SVZ에서의 내인성 신경 줄기세포의 증식뿐만 아니라 선조체에 있는 경색 부위로의 이동에도 크게 기여한다는 것을 시사한다. 그러나, SVZ 세포의 증식 및 DCX-양성 신경모세포 형성을 관찰하였음에도 불구하고, DARPP-32-양성 기능적 뉴런이 내인성 신경 줄기세포로부터 직접적으로 형성된다는 것에 대한 증거는 없었다.

따라서, 이 단계에서는 이식된 hiPSC-우래 NPC가 내인성 신경 형성 (즉, 증식 및 이동)의 일부를 촉진한다고 할 수 있지만, 모든 과정 (성숙한 뉴런 형성을 포함)을 촉진한다고는 할 수 없다. 이식된 iPCS-NPC가 내인성 신경형성의 향상을 유도하고 매개하는지에 관한 기전을 현재로서는 정확히 알 수는 없지만, hiPSC 유래 NPC로부터 신경영양 인자 (neurotrophic factor)의 분비, 염증의 조절 또는 신생혈관생성 (angiogenesis)의 촉진 등을 통해 중요한 역할을 할 것으로 추정되고 있다. 이와 관련하여, BDNF (brain-derived neurotrophic factor)와 같은 몇 가지 종류의 신경영양 인자가 위대조군에 비하여 이식된 동물에서 더 많이 발현됨을 관찰하였다.

요약하면, 본 발명자들은 뇌졸중 치료를 위하여 인간 iPSC로부터 유래된 NPC의 신경분화능 및 치료 효능에 대한 구체적인 분석을 수행하였다. 본 발명의 결과에 의하면, iPSC로부터 효율적으로 NPC를 만들 수 있으며, 이를 뇌졸중 동물모델에 이식했을 때 유의적으로 행동 회복이 일어났음을 보여주었다.

도 8에서 요약한 바와 같이, 이식된 hiPSC-유래 NPC는 행동 회복 및 신경조직 형성뿐 아니라, 뇌졸중-유래 염증 반응, 신경교증 및 세포사멸의 효과적인 감소를 촉진시켰다. 더욱 중요한 사실은, 이식된 hiPSC-유래 NPC에 의해 내인성 신경형성 과정이 촉진되었다는 것이다.

본 세포를 이식한 동물로부터 종양형성과 같은 안전성 문제는 발견되지 않았다. 지금까지, 다양한 종류의 줄기세포가 뇌졸중 동물 모델에서 신경분화능 및 치료가능성을 나타내었지만, 본 발명은 인간 hiPSC-유래 NPC가 다음의 3가지 작용 기전을 동시에 수행함으로써 손상된 뇌를 치료하는 능력을 갖는다는 결정적인 자료를 제공한다. 첫째, 이 세포는 경색 부위로 이동하고, 뇌졸중으로 인해 손상된 뇌에서 신경 조직을 형성한다. 둘째, 이 세포는 뇌졸중으로 인해 손상된 뇌에서 염증, 신경교증 및 세포사멸을 감소시킨다. 셋째, 이 세포는 뇌졸중으로 인해 손상된 뇌의 SVZ에서 내인성 신경형성 과정에 기여한다.

hiPSC가 손상된 신경의 복구(neuronal restoration), 신경 보호(neuroprotection), 신경 회로 연결 (neural circuit connection), 성숙한 뉴런 형성(mature neuron formation) 등에 직접적인 효과가 있는지를 증명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하지만, 세포 치료에서의 자가세포의 공급원(autologous source)으로서 iPSC가 갖는 중요성을 고려해 볼 때, 본 발명은 뇌졸중 치료에서의 iPSC의 치료 능력에 대한 중요한 가능성을 제공한다.

Claims (19)

1. 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 hiPSC는 체세포 유래인 것인 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포, 지방세포 및 혈액세포로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 신경전구세포는 Nestin, Sox2 및 Musashi 유전자를 발현하는 신경줄기세포인 것인 약학적 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 hiPSC는 인간 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 발현시켜 수득한 것인 조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 유전자는 염색체 삽입 방법 또는 염색체 비삽입 방법을 통해 발현되는 것인 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 염색체 삽입 방법은 레트로 바이러스를 이용하는 것이 조성물.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 염색체 비삽입 방법은 에피조말 벡터를 이용하는 것인 조성물.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 신경전구세포는 상기 hiPSC를 PA6 기질 세포와 공배양하여 분화시킨 것인 약학적 조성물.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중인 것인 약학적 조성물.
11. 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 키트.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 hiPSC는 섬유아세포를 포함한 다양한 체세포 유래인 것인 키트.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 신경전구세포는 Nestin, Sox2 및 Musashi 유전자를 발현하는 신경줄기세포인 것인 키트.
14. 청구항 1 내지 10의 조성물을 뇌졸중으로 진단된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중 치료 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 투여는 경구, 직장, 정맥, 비강, 복강, 피하 또는 국소 투여인 것인 치료방법.
16. hiPSC를 PA6 기질세포와 공배양하는 단계;
    상기 공배양으로부터 발생한 로제트-유사 세포군을 분리하는 단계; 및
    상기 로제트-유사 세포군을 배양하여 뉴로스피어 (neurosphere)를 유도시키는 단계를 포함하는, 뇌졸중 치료를 위한 hiPSC 유래 신경전구세포의 제조 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 hiPSC는 인간 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 발현시켜 수득한 것인 방법.
18. 청구항 16에 있어서, 상기 뉴로스피어로부터 분리된 세포를 배양하여 신경전구세포를 분화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
19. 청구항 16에 있어서, 상기 신경전구세포는 Nestin, Sox2 및 Musashi 유전자를 발현하는 신경줄기세포인 것인 방법.

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