KR102329306B1 - Hla 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Hla 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 동형접합형을 사용함으로서 면역 거부 반응을 없애고, 안정적으로 뇌졸중 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

HLA 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물 {Composition of preventing and treating the stroke comprising HLA-homozygous iPSC-derived neural precursor cells}
HLA 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
허혈성 뇌졸중은 뇌졸중의 약 85%를 차지하는 가장 흔한 형태의 뇌졸중이다. 뇌졸중은 뇌의 혈류가 막혀 발생하는 것으로, 산소 또는 영양소의 결핍으로 뇌 세포가 죽게 된다. 뇌졸중이 발생한 후 6시간이 경과한 후에는 효과적인 치료방법이 없다.
그동안 뇌졸중으로 인한 뇌세포 손상을 치료하는 것은 불가능한 것으로 여겨졌으나, 최근 다양한 줄기세포를 이용한 허혈성 뇌졸중 세포 치료제들이 개발되고 있다. 줄기세포의 종류 중 하나인 인간유래 유도만능줄기세포는 환자 자신의 체세포를 사용하여 치료제로 사용할 수 있으므로 무궁무진한 가능성이 있다. 하지만 환자 개별적으로 임상등급의 세포주를 제작하는데 소요되는 비용이나 시간이 막대하여 현실적이지 못하며, 또한 만일 환자가 연로하거나 유전병을 가질 경우 만들어진 세포주의 품질을 보장하기 힘든 실정이다. 따라서 새로운 대안의 마련이 시급한 실정이다.
한국등록특허 제 2030906 호
일 양상은 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 단계를 포함하는, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시예의 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)는 완전히 분화된 뉴런이 아닌 신경전구세포를 유효성분으로 사용함으로써, 체내 적합성을 높이고 기존의 신체 조직과의 신경 연결 및 호환성을 증가시킬 수 있다.
용어 "인간백혈구항원 (human leucocyte antigen, HLA)"은 백혈구의 표면에 발현되는 유전적으로 매우 다양한 당단백질로서, 세포 내부에서 생성되는 자신 또는 외래의 펩타이드와 복합체를 형성하여 이를 세포 표면에 제시함으로써 T 세포가 이들을 인식할 수 있도록 하는 항원을 의미할 수 있다. 상기 인간백혈구항원에 의해 만들어지는 단백질들은 각 개인에게 특이한 조합으로 체세포 표면에 발현되며, 면역계는 이 항원을 활용하여 자기의 세포와 타인의 세포를 구별할 수 있다.
상기 인간백혈구항원의 대립인자 수는 클래스에 따라 상이할 수 있다. MHC class I는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함할 수 있다. MHC class II는 HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR를 포함할 수 있다.
용어 "동형접합 (homozygote)"이란 하나의 유전자에 대해 동일한 대립형질을 가지는 개체를 의미할 수 있다. 반대되는 개념으로서 하나의 유전자에 대해 상반되는 대립형질을 가지는 개체는 이형접합 (heterozygote)이라 할 수 있다.
HLA가 같은 동형접합의 건강한 공여자로부터 체세포를 기증받아 제작된 유도만능줄기세포는 유전질환을 유발하는 변이를 가지고 있지 않으며 HLA의 적합성이 맞는 많은 수용자에게 공급이 가능하다.
상기 인간백혈구항원 동형접합 줄기세포 또는 인간백혈구항원 동형접합 줄기세포 유래 신경전구세포는 HLA의 A타입, B타입 및 DRB1 타입의 적합성이 맞는 수용자에게 면역거부반응 없이 안정적으로 투여될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 HLA 동형접합체는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-DRB1이 동형접합일 수 있다. 구체적으로, 상기 HLA 동형접합체는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DRB1이 동형접합일 수 있다.
일 실시예의 HLA 동형접합체는 HLA-A가 *33:03, HLA-B가 *44:03, HLA-DRB1가 *07:01일 수 있다.
일 구체예에서 상기 인간 유도만능줄기세포는 제대혈 단핵구세포(Cordblood Mononuclear Cell; CMC) 또는 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)에서 유래된 것일 수 있다.
용어 "유도만능줄기세포"란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 유도만능줄기세포 (iPSCs: induced pluripotent stem cells) 라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 주입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다. 상기 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함할 수 있다.
일 일시예에서 상기 신경전구세포는 Sox2, Nestin, Musashi, Tuj1, GABA, DARPP-32, TH, SVP38, 및 PSD95로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 신경전구세포는 Sox2, Nestin, 및 Musashi로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 신경전구세포는 Sox2, Nestin, 및 Musashi를 포함할 수 있다.
용어 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(fate)를 가지고 있는 부모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(신경줄기세포)가 신경전구세포에 해당할 수 있다.
용어 "신경전구세포 (neural precursor cells, NPCs)"는 신경 세포의 형태 및 기능을 완전히 갖추기 전 단계의 세포를 의미한다. 상기 일 양상에 따른 신경전구세포는 Nestin, Sox2 및 Musashi 유전자 등을 발현하는 세포일 수 있다. 이들 유전자는 신경전구세포에서 고유하게 발현되는 유전자들로서, 이들의 발현은 형성된 세포가 신경전구세포임을 나타낸다.
용어 "뇌졸중"이란 뇌기능의 부분적 또는 전체적으로 급속히 발생한 장애가 상당 기간 이상 지속되는 것으로, 뇌혈관의 병 이외에는 다른 원인을 찾을 수 없는 상태를 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌졸중은 뇌경색(허혈성 뇌졸중), 뇌출혈(출혈성 뇌졸중), 일과성허혈발작 및 재발된 뇌졸중 중 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중일 수 있다.
일 실시예에 있어서 상기 뇌졸중은 만성, 아급성, 급성 단계일 수 있다. 구체적으로는 급성 뇌혈관 손상 후 3개월을 초과하지 않은 아급성 단계의 뇌졸중일 수 있다.
용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질환을 억제하거나 질환의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
상기 약학적 조성물은 신생 뇌혈관 발생 촉진 효과를 가질 수 있다. 상기 신생 뇌혈관 발생은 뇌졸중 또는 아급성 뇌졸중에 의하여 파괴된 뇌혈관의 복원, 재생 또는 신규한 혈관의 발생일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 뇌졸중 예방 또는 치료는 뇌혈관 신생에 의한 것일 수 있다.
일 실시예에서 상기 약학적 조성물에 의해 RECA1+ 혈관 수가 대조군에 비해 0.1 내지 10배, 0.1 내지 5배, 0.5 내지 2배, 1.1 내지 1.5배, 예를 들어 1.15 내지 1.3배 증가할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 뇌 신경 염증 예방 및 개선 효과를 가질 수 있다. 상기 뇌 신경 염증은 뇌졸중에 의하여 유발된 것일 수 있으며, 아급성 뇌졸중에 의하여 유발된 것일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 뇌졸중 예방 또는 치료는 뇌 신경 염증 예방 및 개선에 의한 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 뇌 내 아교 섬유의 과생성 방지 효과를 가질 수 있다. 상기 뇌 내 아교 섬유는 아급성 뇌졸중에 의하여 과도하게 생성되어 아교 흉터를 생성하는 주원인이 되는 것일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 뇌졸중 예방 또는 치료는 뇌 내 아교 섬유의 과생성 방지에 의한 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형 입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내로 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
일 실시예에서 상기 약학적 조성물은 신경전구세포를 약 0.01 x 105 개/ 2 μl 내지 100 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 100 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 20 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 10 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 2 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 0.1 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 100 x 105개 / 2 μl, 1 x 105 개 / 2 μl 내지 100 x 105 개 / 2 μl, 5 x 105 개 / 2 μl 내지 100 x 105 개 / 2 μl, 10 x 105 개 / 2 μl 내지 100 x 105 개 / 2 μl, 0.1 x 105 개 / 2 μl 내지 10 x 105 개 / 2 μl, 1 x 105 개 / 2 μl 내지 10 x 105 개 / 2 μl, 또는 5 x 105 개 / 2 μl 내지 10 x 105 개 / 2 μl 로 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 약학적 조성물은 섬유아세포를 약 0.01 x 105 개/ 2 μl 내지 100 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 100 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 20 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 10 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 2 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 0.1 x 107개 / 2 μl, 0.1 x 105 개/ 2 μl 내지 100 x 105개 / 2 μl, 1 x 105 개 / 2 μl 내지 100 x 105 개 / 2 μl, 5 x 105 개 / 2 μl 내지 100 x 105 개 / 2 μl, 10 x 105 개 / 2 μl 내지 100 x 105 개 / 2 μl, 0.1 x 105 개 / 2 μl 내지 10 x 105 개 / 2 μl, 1 x 105 개 / 2 μl 내지 10 x 105 개 / 2 μl, 또는 5 x 105 개 / 2 μl 내지 10 x 105 개 / 2 μl 로 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 신경전구세포가 hNu+ 또는 hNestin+인 경우에 생착능이 높은 신경전구세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 신경전구세포가 hNestin+인 경우에 생착능이 높은 신경전구세포일 수 있다.
일 실시예에서 상기 신경전구세포가 hMAP2+ 또는 NeuN+ 인 경우에 성숙한 뉴런으로 분화할 수 있다. 구체적으로, 신경전구세포가 hMAP2+ 또는 NeuN+ 인 경우에 GABA성 뉴런, DARPP-32+ 중간 가시 뉴런 또는 TH+ 도파민성 뉴런으로 분화할 수 있다.
다른 양상은 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 단계;를 포함하는, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시예에서 상기 인간 유도만능줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 단계는 상기 인간 유도만능줄기세포를 신경전구세포 분화용 배지에서 배양하여 수행될 수 있다.
상기 분화용 배지는 bFGF, ROCK 억제제, 항진균제 항생제, 비 필수 아미노산 (NEAA), 나트륨 피루베이트, D- 글루코스, L- 글루타민, 베타 -MeOH, 및 B-27을 포함할 수 있다. 일 실시예에서 형성된 배상체를 자연살해세포 분화용 배지에서 배양하는 단계는 폴리-L-오르니틴 또는 라미닌 코팅된 배양 용기에서 수행될 수 있다.
상기 배양 용기에 코팅된 폴리-L-오르니틴은 신경전구세포 분화용 배지 100 μl 당 0.5 ㎍ 내지 2 g, 1 ㎍ 내지 1 g, 10 ㎍ 내지 500 mg, 10 ㎍ 내지 100 mg, 10 ㎍ 내지 10 mg, 10 ㎍ 내지 1 mg, 10 ㎍ 내지 500 ㎍, 10 ㎍ 내지 200 ㎍ 또는 50 ㎍ 내지 150 ㎍로 포함될 수 있다.
상기 배양 용기에 코팅된 라미닌은 신경전구세포 분화용 배지 100 μl 당 0.5 ㎍ 내지 2 g, 1 ㎍ 내지 1 g, 1 ㎍ 내지 500 mg, 1 ㎍ 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 1 ㎍ 내지 1 mg, 1 ㎍ 내지 100 ㎍, 1 ㎍ 내지 50 ㎍, 1 ㎍ 내지 20 ㎍ 또는 5 ㎍ 내지 15 ㎍로 포함될 수 있다.
일 실시예에서 줄기세포를 신경전구세포 분화용 배지에서 배양하는 단계는 1일 내지 20일, 1일 내지 15일, 구체적으로는 5일 내지 13일, 더욱 구체적으로는 6일 내지 12일 동안 수행될 수 있다.
일 실시예에서 상기 방법은 신경전구세포를 함유하는 배상체 (EB, embryoid body)를 형성하는 단계를 더 포함하여 수행될 수 있다.
일 실시예에서 배상체는 분화용 배지 2 ml 당 5개 내지 30개 배상체의 농도로 시딩 (seeding)될 수 있다. 구체적으로는 분화용 배지 2 ml 당 10개 내지 20개 배상체의 농도로 시딩될 수 있다. 더욱 구체적으로는 분화용 배지 2 ml 당 12개 내지 18개 배상체의 농도로 시딩될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 분화용 배지 2 ml 당 14개 내지 16개 배상체의 농도로 시딩될 수 있다.
기타 성분 등에 대한 상세한 설명은 상술한 바와 같다.
일 양상에 있어서, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 포함하는, 뇌졸중 치료용 키트를 제공한다.
기타 성분 등에 대한 상세한 설명은 상술한 바와 같다.
일 양상에 있어서, 개체에 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 투여할지를 결정하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
용어 "개체"란 뇌졸중이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 제외한 포유동물일 수 있다.
용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 투여는 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 국부적으로 투여되는 부위는 손상된 뇌혈관이 있는 부위에 직접 투여되는 것일 수 있다.
일 실시예에서 상기 약학적 조성물을 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 구체적으로는 피부 외용으로서 자궁 내막에 바르는 도포 형태로 투여할 수 있고, 자궁 내막에 주사의 형태로 직접 주입하는 것도 가능하다. 보다 구체적으로 상기 약학적 조성물은 개체의 자궁 내막에 도포되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.
상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물이 인간백혈구항원 유도만능줄기세포를 약 0.1 x 107 개 내지 100 x 107개, 0.1 x 107 개 내지 10 x 107 개, 1 x 107 개 내지 10 x 107 개, 1 x 107 개 내지 5 x 107 개, 또는 2 x 107 개 내지 4 x 107 개 포함하는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다.
일 실시예에서 상기 신경전구세포에 의해 상기 조성물을 투여 받은 숙주의 ED1+-Iba1+ 세포의 감소 효과가 있을 수 있다.
기타 성분 등에 대한 상세한 설명은 상술한 바와 같다.
또 다른 양상은 상기 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경 염증 예방 및 개선용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌 신경 염증 예방 및 개선방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는, 뇌 내 아교섬유 과생성 방지용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌 내 아교 섬유 과생성 방지 방법을 제공한다.
일 실시예에서, iNOS 발현 미세 아교세포/대식세포는 인터루킨-1 베타 (IL-1β) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)와 같은 전 염증성 사이토 카인을 분비하여 뇌졸중시 뇌 손상을 악화시킬 수 있다.
일 실시예에서, CD206 (만노스 수용체라고도 함)-발현 미세 아교 세포 / 대식세포는 비정상적인 염증을 억제하고 뇌졸중 후 손상된 부위의 노폐물과 죽은 세포를 식균함으로써 치유 과정에 참여할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는, 신생 뇌혈관 발생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신생 뇌혈관 생성 촉진 방법을 제공한다.
일 실시예의 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포는 뇌혈관 관련 질환에 면역 거부반응 없이 안정적으로 뛰어난 치료효과를 나타낼 수 있다.
도 1A는 (A) hiPSC의 NPC 및 성숙한 뉴런으로의 분화 절차를 보여주는 개략도이다. 도 1B는 대표적인 면역세포화학적 이미지이다 (스케일 바 = 100 μm). 도 1C는 hiPSCs-NPCs 유래 성숙한 뉴런의 대표적인 면역세포화학적 이미지이다 (스케일 바 = 50 μm).
도 2A는 일 실시예의 신경전구세포가 이식된 후 마우스 모델의 행동 실험 변화의 Rotarod 실험 결과이다. 도 2B는 일 실시예의 신경전구세포가 이식된 후 마우스 모델의 행동 실험 변화의 스테핑 실험 결과이다. 도 2C는 일 실시예의 신경전구세포가 이식된 후 마우스 모델의 행동 실험 변화의 수정된 신경학적 심각도 점수 (mNSS) 실험 결과이다. 도 2D는 일 실시예의 신경전구세포가 이식된 후 마우스 모델의 행동 실험 변화의 계단 실험 (staircase test) 결과이다. 도 2E는 일 실시예의 신경전구세포가 이식된 후 마우스 모델의 행동 실험 변화의 아포모르핀 유도 회전 실험 (apomorphine-induced rotation test) 결과이다. 도 2F는 세포 이식 후 12 주 동안 각 행동 실험의 회복률을 나타낸다. 도 2G (좌측)는 크레실 바이올렛 염색 결과를 나타낸다. 도 2G (우측)는 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 경색 크기의 정량 분석 결과이다(그룹당 n = 7).
도 3A는 일 실시예의 쥐 뇌에서 조직 분석의 개략도이다. 도 3B는 일 실시예의 이식 후 12 주에 MCAo 래트에서 이식 된 hiPSC-NPC의 hNu DAB 면역 염색의 대표적인 이미지이다.
도 4A는 hNestin 및 hMAP2에 대한 이중 면역조직화학적 염색 (Immunohistochemistry, IHC) 이미지를 나타낸다. 도 4B (좌측)는 섬유아세포 및 iPSC-NPC 그룹의 hNu 및 hNestin에 대한 이중 IHC의 또 다른 이미지를 나타낸다. 도 4B (중앙)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 4B (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+-hNestin+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 4C (좌측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNestin 및 Ki67에 대한 이중 IHC 이미지를 나타낸다. 도 4C (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNestin+-Ki67+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 5A (좌측)은 hNu 및 hMAP2에 대한 이중 IHC 대표적인 이미지이다. 도 5A (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+-hMAP2+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 5B (좌측)은 hMito 및 NeuN에 대한 이중 IHC 이미지를 나타낸다. 도 5B (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hMito+-NeuN+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 5C (좌측)은 hNu 및 GABA에 대한 이중 IHC 이미지를 나타낸다. 도 5C (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+-GABA+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 5D (좌측)은 hNu 및 DARPP-32에 대한 이중 IHC 이미지를 나타낸다. 도 5D (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+-DARPP-32+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 5E (좌측)은 hNu 및 TH에 대한 이중 IHC 이미지를 나타낸다. 도 5E (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+-TH+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다. 도 5F (좌측)은 hNu 및 GFAP에 대한 이중 IHC 이미지를 나타낸다. 도 5F (우측)은 iPSC-NPC 그룹에서 hNu+-GFAP+ 세포의 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 6A (좌측)은 hiPSC-NPC 및 Fluoro-Gold (FG)의 주입 부위를 보여주는 개략도이다. 도 6A (우측)은 선조체에서 FG+-hNu+ 세포의 비율에 대한 정량 분석 결과이다. 도 6B는 선조체(노란색)에서 FG+(녹색) 및 hNu+(빨간색) 이중 양성 세포의 공동 국소화 이미지이다.
도 7A (좌측)은 ED1 및 Iba1에 대한 이중 IHC 이미지이다. 도 7A (우측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSCNPC 그룹에서 ED1+-Iba1+ 세포의 정량 분석 결과이다. 도 7B (좌측)은 ED1 및 CD206에 대한 이중 IHC 이미지이다. 도 7B (우측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 ED1+-CD206+ 세포의 정량 분석 결과이다. 도 7C (좌측)은 경색 주변 영역에서 GFAP (녹색)에 대한 IHC 이미지이다. 도 7C (중앙)은 배양액 대조군(Medium), 섬유아세포 대조군(Fibroblast) 및 iPSC-NPC 그룹의 경색 주변 영역에서 GFAP + glial 흉터의 평균 면적의 정량 분석 결과이다. 도 7C (우측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹의 경색 주변 영역에서 GFAP + glial scar의 평균 두께에 대한 정량 분석 결과이다.
도 8 (좌측)은 ED1 및 iNOS에 대한 이중 IHC 이미지이다. 도 8 (우측)은 배양액 대조군(Medium), 섬유아세포 대조군(Fibroblast) 및 iPSC-NPC 그룹에서 iNOS+-ED1+ 세포의 비율에 대한 정량 분석한 결과이다.
도 9A는 MCAo 래트의 경색 주변 피질에서 GFAP 면역 염색 이미지이다. 도 9B (좌측)은 배양액 대조군(Medium), 섬유아세포 대조군(Fibroblast) 및 iPSC-NPC 그룹에서 GFAP+ 아교 흉터 영역의 정량 분석 결과이다. 도 9B (우측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 GFAP+ 아교 흉터의 평균 두께의 정량 분석 결과이다.
도 10A는 DCX 및 BrdU에 대한 이중 IHC 이미지이다. 도 10B (좌측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 DCX+ 세포의 정량 분석 결과이다. 도 10B (중앙)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 BrdU+ 세포의 정량 분석 결과이다. 도 10B (우측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 DCX+-BrdU+ 세포의 정량 분석 결과이다.
도 11A는 RECA-1에 대한 DAB 면역 염색 이미지이다. 도 11B (좌측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 경색 주변 혈관 수의 정량 분석 결과이다. 도 11B (우측)은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군 및 iPSC-NPC 그룹에서 경색 주변 혈관의 분기점 수에 대한 정량 분석 결과이다. 도 11C는 BrdU 및 PECAM1에 대한 이중 IHC 이미지이다. 도 11D는 STEM121 및 vWF에 대한 이중 IHC 이미지이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포의 제조
hiPSC 세포주는 37℃에서 5 분간 TrypLE 용액 (GIBCO)으로 처리하기 전에, CO2 배양기에서 100ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 및 10μmol/L Y27632 (ROCK 억제제)가 보충된 Stemfit® Basic02 배지 (일본 Ajinomoto사 제공)에서 7일간 배양되었다.
해리된 hiPSC 세포주는 신경 유도를 위해 37℃의 CO2 배양기에서 SFEBq 배지에 배양되었다. SFEBq 배지는 1 % 항진균제 항생제, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 0.1 % 베타 -MeOH, 20 % KnockoutTM SR, 10μmol/L SB431542, 100 nM LDN193189 및 3X ROCK 억제제가 보충된 DMEM / F12 (Invitrogen)로 구성되었다. 세포는 SFEBq 배지에서 8일 동안 유지되었다. 배아체는 신경전구세포 배지에서 해리되었다. 신경전구세포 배지는 1 : 100 항진균제 항생제, 1 : 100 NEAA, 나트륨 피루베이트, D- 글루코스, L- 글루타민, 1 : 1000 베타 -MeOH, 1:50 B-27 (비타민 A 미포함), 20ng / ml bFGF로 이루어졌으며, 디쉬는 폴리-L-오르니틴과 라미닌으로 코팅되었다 (도 1A 참조). 이식을 위해 신경전구세포는 accutase로 분리시켰다.
실험예 2. hiPSC-NPC의 신경 분화 및 면역 세포 화학적 분석
실험예 2.1. hiPSC-NPC의 신경 분화
hiPSC에서 유래한 NPC의 분화 능력을 확인하기 위해 자발적으로 성숙한 뉴런으로 분화시켰다. 상기 과정에서 분화된 hiPSC-NPC를 계대하고 배지를 신경 기저 A 배지, 1x GlutaMAX 및 1x B27 보충제로 구성된 성숙한 뉴런 배지로 변경하였다 (도 3A 참조). 분화시키기 위해, 배지에 성숙 뉴런의 경우 20ng / mL BDNF, GABA 성 뉴런의 경우 10ng / mL BDNF 및 0.5μmol / L 퍼모르파민, 도파민 성 뉴런의 경우 100 ng/mL SHH, 100 ng/mL FGF8 and 1 μg/mL cAMP를 첨가하였다.
hiPSC를 신경전구세포 (NPC)로 분화하여 Sox2, Nestin 및 Musashi와 같은 NPC에 대한 마커를 발현시켰다 (도 1B 참조). 다음으로, 뉴런으로 분화하고 Tuj1, GABA, TH 및 DARPP-32와 같은 다양한 뉴런 마커를 발현할 수 있는 잠재력을 관찰하였다 (도 1C 참조). Tuj1+, GABA+ 및 TH+ 세포는 신경분화 유도 후 3 주에 관찰된 반면, DARPP-32+ 세포는 신경분화 유도 후 13 주에 관찰되었다. 또한 hiPSC-NPC에서 유래한 뉴런이 신경분화 유도 후 13 주에 SVP38 및 PSD95에 대한 면역 반응성을 보였음을 확인하였다. 분화된 세포가 성숙한 뉴런으로 분화함에 따라 시냅스 형성을 이뤘음을 확인하였다 (도 1C 참조).
실험예 2.2. hiPSC-NPC의 면역 세포 화학적 분석
신경 분화 과정에서 NPC 및 성숙한 뉴런에 대한 항체를 사용한 형태학적 분석 및 면역 세포 화학적 염색을 수행하였다. 세포를 4 % 파라포름알데히드로 15 분간 고정하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 0.1 % Triton X-100 / PBS로 3 회 차단한 후 5 % 정상 말 혈청 / PBS로 30 분간 세척하였다. 표본을 4℃ 에서 12 시간 동안 1 차 항체와 함께 배양한 다음 PBS로 3 회 세척하였다 (표 1 참조).
Primary antibodies Dilution Host species Suppliers Catalogue number
Sox2 1:200 rabbit Millipore AB5603
Nestin 1:200 rabbit R&D System 841901
Musashi 1:200 rabbit Millipore AB5977
Tuj1 1:500 mouse Millipore MAB1637
GABA 1:500 rabbit Sigma-Aldrich A2052
DARPP-32 1:200 rabbit Cell Signaling MBS9407621
TH 1:200 rabbit Pel-Freez P40101-150
SVP38 1:200 mouse Abcam ab8049
PSD95 1:200 rabbit Cell Signaling 2507s
그 후, 2 차 항체를 적용하였다. 핵은 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 : 1000; Roche)로 카운터 염색하였다. 사용된 2 차 항체는 염소 항 마우스 IgG Alexa 555 (1 : 250; Thermo Fisher Scientific), 염소 항 토끼 IgG Alexa 488 (1 : 250; Thermo Fisher Scientific) 및 염소 항 마우스 IgM Alexa 555 (1 : 250; Thermo Fisher Scientific)이다.
실험예 3. 중대 뇌동맥 폐색 랫트 모델(Middle cerebral artery occlusion rat model)의 제조
모든 동물 실험은 차의과학대학교 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 지침 (IACUC150066)에 따라 수행되었다. 뇌졸중 모델은 90 분 동안 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAo)에 의해 유도되었다. 270g에서 300g의 크기를 가진 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐 (한국, 서울 오리엔트)가 사용되었다. 1 % 케타민 (57.6 mg / kg)과 자일라진 (7.7 mg / kg)으로 복강 내 (i.p.) 주사로 마취한 후, 랫트를 가열 패드에 눕혀서 37 ± 1℃ 의 체온을 유지했다. 우측 총 경동맥 (CCA), 외 경동맥 (ECA) 및 내 경동맥 (ICA)이 노출되었고, 그리고 무딘 말단 실리콘 코팅 모노 필라멘트 (Ethicon, Pinewood, UK; 4-0)를 삽입하여 90 분 동안 중대 뇌 동맥 (MCA)을 막은 후 제거했다. MCAo 수술 후 다음날, 적절한 뇌졸중 쥐 모델을 선택하기 위해 급성 신경학적 평가 (즉, 앞다리 및 뒷다리 배치 테스트 및 회전 동작 테스트)를 수행했다. 2 점과 3 점 (5 : 정상, 4 : 경미, 1 : 심각) 범위의 동물을 선택했다. 또한 신경전구세포를 이식 전 (즉, MCAo 유도 후 7 일), 실험을 위해 중등도에서 중증의 감각 운동 결손 (즉, 수정된 신경 학적 심각도 척도 [mNSS] 점수에서 15 점 이상)이 있는 쥐를 최종적으로 선택했다. 55 마리의 쥐 중 12 마리의 동물은 이식 전 사망 (n = 7), 경미한 신경학적 결함 (n = 5) 등 여러 가지 이유로 사용되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 총 40 마리의 랫트를 사용하였다.
실험예 4. 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 투여한 중대 뇌동맥 폐색 마우스 모델의 제조
hiPSC-NPC의 치료 효과를 조사하기 위해 이식 실험을 다음과 같이 세 실시예로 설계했다.
(1) 실시예 1 (배양액 대조군, 그룹 1) : 미디어 2㎕ (n = 10)
(2) 실시예 2 (섬유아세포 대조군, 그룹 2) : 2X105 / 2㎕의 섬유아세포 (n = 10),
(3) 실시예 3 (iPSC-NPC 그룹, 그룹 3) : 2X105 / 2㎕의 hiPSC-NPC (n = 10).
MCAo 유도 7 일 후, 다음과 같은 두 부위 (각각 1 Х 105 세포 / ㎕)에 이식했다.
(i) 전방-후방 (AP) : +1.0 mm; 내측면 (medial-lateral; ML) : -2.5 mm; 등-배쪽 (dorsal-ventral; DV) : 브레그마에서 -2 mm,
(ii) AP : +1.0 mm; ML : -2.5mm; DV : 브레그마에서 -7mm.
모든 동물은 Cyclosporine A (15 mg / Kg : CKD Pharmaceuticals, Korea)로 이식 전 1 일부터 연구기간 내내 매일 복강 내로 면역 억제되었다.
실험예 5. 조직학적 분석
hiPSC-NPC 이식 후 12 주에 모든 동물을 1 % 케타민 (30mg / kg)과 자일 라진 하이드로 클로라이드 (4mg / kg)의 복강 주사로 마취한 다음 식염수와 4 % 파라 포름 알데히드를 경동맥으로 관류하였다. 뇌를 추출하고 4℃에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 하룻밤 후 고정한 다음, 30 % 수크로스 용액으로 2 일 동안 침전 할 때까지 옮겼다. 뇌는 OCT 화합물 (Lot No. 3801480; Leica)에서 동결 후 -80℃에서 보관하였다. 뇌를 저온 유지 장치 (Leica CM3050 S; Leica Microsystems)를 사용하여 관상적으로 40μm 두께로 절편하고 사용할 때까지 24 웰 플레이트에 보관하였다.
실험예 6. 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포의 이식 후 중대뇌동맥 폐색 마우스 모델의 행동 회복 확인
hiPSC-NPC 이식이 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion; MCAo)로 인한 행동 이상을 개선할 수 있는지 확인하기 위해 hiPSC-NPC 이식 후 12 주 동안 5 번의 rotarod 실험, stepping 실험, mNSS(modified neurological severity score) 실험, 계단 실험, 아포모르핀 유도 회전 실험 테스트를 수행하고, 뇌경색의 크기를 측정했다.
실험예 6.1. 행동 실험 방법
hiPSC-NPC 이식시 행동 변화를 모니터링하기 위해 5 가지 테스트를 수행하였다 (각 그룹에 대해 n = 10). 동물 간의 변이를 줄이기 위해 랫트를 MCAo 유도 전 연속 3 일 동안 동일한 조건에서 하루에 세 번 로타로드 및 계단 테스트를 위해 훈련시켰다. 기준 표준의 경우 로타로드, 스테핑 및 계단 실험을 MCAo (사전 데이터) 전에 수행하였으며 5 개 테스트 모두 MCAo 후 1 일 (0W 데이터), MCAo 후 1 주 (1W 데이터) 및 12 주 동안 매주 수행하였다.
실험예 6.1.1. 로타로드(Rotarod) 실험
운동 기능과 균형 제어를 조사하기 위해 로타로드 테스트를 수행하였다. 동물이 0에서 40 rpm으로 가속 된 로타로드에서 떨어질 때까지의 지속 시간을 측정하였다. 총 120 초 이내에 이 테스트는 매주 하루 세 번 수행되었으며 평균 시간을 계산하였다.
실험예 6.1.2. 스테핑(Stepping) 실험
감각 및 운동 기능을 조사하기 위해 스테핑 실험을 수행하였다. 모든 동물을 동일한 위치에 유지시키고, 각 동물의 앞다리 1 개와 뒷다리 2 개를 고정하였다. 고정되지 않은 랫트의 앞다리는 보드 (길이 900mm, 5 초 동안)에 닿아 실험자에 의해 처음에는 앞뒤로 천천히 옆으로 움직였다.
동일한 방법을 사용하여 두 개의 앞다리를 교대로 측정하였다. 랫트가 2 개의 앞다리를 보드에 올려 놓은 걸음 수를 세고 뇌졸중에 영향을 받은 앞다리와 영향을 받지 않은 앞다리의 비율 평균을 계산하였다. 실험은 매주 하루에 세 번에 걸쳐 수행하였다.
실험예 6.1.3. 수정된 신경학적 심각도 점수 (mNSS) 실험
이식 후 허혈성 뇌졸중으로 손상된 쥐의 신경 학적 결손을 평가하기 위해 mNSS 실험을 수행했다. 이 실험은 운동, 감각, 빔 균형 및 반사 테스트 32-35의 복합 테스트이며 0-28 등급으로 등급이 매겼다 (정상 점수 : 0, 최대 결손 점수 : 28). 테스트는 매주 수행하였다.
실험예 6.1.4. 계단 실험
'사이트 별 (site-specific)' 숙련된 도달 및 잡기 작업에서 앞다리의 독립적인 사용을 평가하기 위해 계단 실험을 수행하였다. 동물은 앞다리를 사용하여 오목한 구멍에 놓인 펠릿을 먹는 방법을 배우기 위해 실험 전에 사전 훈련시켰다. 각 랫트는 영향을 받은 5 개의 펠릿이 있는 계단 장치에 15 분 동안 왼쪽에 놓여졌고 랫트가 먹은 펠릿의 수를 세었다. 실험은 격주로 3 일 연속 하루에 한 번 수행하였다.
실험예 6.1.5. 아포모르핀 유도 회전 실험
또한 흑색질의 민감하고 신속한 행동 상관 관계를 제공할 수 있는 아포모르핀 유도 회전 실험을 수행하였다. 흑질 영역이 손상되었을 때, 아포모르핀 (0.02 % 아스코르베이트 함유 식염수에 1.0mg / kg; Sigma)을 주사한 동물을 영향을 받지 않은 쪽을 향해 회전시켰다. 모든 동물에게 움직임을 전기 기계 센서로 전달하는 얇은 강철 와이어가 달린 하네스를 장착하였다. 모든 동물에 아포모르핀을 복강 내 주사하고 5 분 후부터 60 분 이내의 회전 횟수를 세었다. 이 실험은 0, 2, 4, 8 및 12 주에 수행하였다.
실험예 6.2. 경색 크기 측정 방법
최종 경색 크기 (각 그룹의 n = 7)를 측정하기 위해 16 개의 2μm 두께 관상 절편에 대한 크레실 바이올렛 염색을 수행하였다. 각 동물에서 총 8 개의 연속 조직절편을 분석하였다. 경색 크기는 하기 수학식 1을 사용하여 손상되지 않은 대측 반구의 백분율로 정의하였다.
[수학식 1]
추정된 경색 크기 (%) = [1-(남은 동측 반구 영역 / 손상되지 않은 반대측 반구 영역)] Х 100.
관심 영역은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였으며, 값은 뇌당 8 개의 연속 관상 조직절편에 대해 합산하였다.
실험예 6.3. 통계 분석
모든 실험의 통계 분석은 Prism 소프트웨어 (버전 8.0, GraphPad)를 사용하여 수행하였다. 조직 분석은 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 수행되었으며 행동 성능은 양방향 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 다중 그룹 비교를 위해 사후 Tukey's b 테스트가 사용하였다. 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시하였다. P 값 < 0.5는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 6.4. 결과
그 결과, hiPSC-NPC 그룹은 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군만 이식된 그룹에 비해 5 가지 행동 테스트 모두에서 상당한 개선 양상을 나타냈다. 로타로드 테스트에서 hiPSC-NPC 그룹은 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 4 주부터 막대에서 떨어지는 시간이 늘어났다. 이러한 통계적 차이는 최대 12 주까지 유지되었다 (도 2A 참조).
스테핑 테스트에서 hiPSC-NPC 그룹은 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군만 이식된 그룹에 비해 7 주에서 최대 12 주까지 상당한 행동 개선을 나타냈다 (도 2B 참조).
mNSS 테스트에서 hiPSC-NPC 그룹은 신경학적 결손 점수를 5주에서 최대 12 주까지 크게 줄였다 (도 2C 참조).
계단 테스트에서 hiPSC-NPC 그룹은 4 주에서 최대 12 주까지 상당한 행동 개선을 나타냈다. 또한, 아포모르핀 유도 회전 테스트에서 hiPSC-NPC 그룹은 12 주차에 두 개의 대조군에 비해 상당한 개선을 나타냈다 (도 2D 및 2E 참조).
hiPSC-NPC 그룹은 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 5 가지 테스트 모두에서 기준선에서 상당한 행동 개선을 보였다 (도 2F 참조).
행동 개선 외에도 hiPSC-NPC 그룹 (35.01 ± 3.45 %)의 최종 경색 크기는 배양액 대조군 (53.35 ± 2.47 %) 및 섬유아세포 대조군 (49.30 ± 2.73 %)에 비해 현저하게 감소했다 (도 2G 참조).
이는 곧, 허혈성 뇌졸중의 아급성 단계에서 hiPSC-NPC의 뇌내 이식이 허혈성 뇌졸중 모델에서 기능적 결함을 복원했음을 의미한다.
실험예 7. 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포의 이식 후 생존 및 생착 확인
hiPSC-NPC가 이식 후 생존하고 생착할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 다양한 세포 마커에 대한 면역 조직 화학 실험을 수행했다.
실험예 7.1. 면역 조직 화학 실험 방법
면역조직화학 실험은 하기와 같은 방법으로 이루어졌다. 자유 부유 뇌 절편을 PBS에서 15 분 동안 3 회, 0.3 % Triton X-100 (Sigma, USA)을 포함하는 tPBS 용액에서 10 분 동안 3 회 세척 한 다음 5 % 정상 말 혈청을 포함하는 tPBS 용액에서 60 분 동안 실온에서 차단했다. 조직절편은 1 차 항체와 함께 4℃ 에서 12 시간 동안 배양되었다 (표 2 참조).
Primary antibodies Dilution Host species Suppliers Catalogue number
Human nuclei (hNu) 1:100 mouse Millipore MAB1281
Human mitochondria (hmito) 1:100 rabbit Millipore AB3598
STEM121 1:250 mouse Takara Y40410
hNestin 1:200 rabbit R&D System 841901
hNestin 1:250 mouse Abcam ab22035
Ki67 1:200 mouse Invitrogen 14-5699-82
GABA 1:250 rabbit Sigma-Aldrich A2052
DARPP-32 1:250 rabbit Cell Signaling MAB9407621
TH 1:250 rabbit Pel-Freez P40101-150
hMap2 1:250 rabbit Santa Cruz SC-20172
NeuN 1:250 mouse Millipore MAB377
GFAP 1:500 mouse BD Biosciences MAB2594
GFAP 1:250 rabbit Dako Z033429
Iba1 1:250 rabbit Wako 019-19741
ED1 1:250 mouse Serotec MCA341R
CD206 1:200 goat Santa Cruz SC-34577
iNOS 1:200 rabbit Santa Cruz SC-649
BrdU 1:200 mouse BD Biosciences 555627
DCX 1:250 rabbit Cell Signaling 4604S
RECA1 1:250 mouse Abcam Ab9774
PECAM1 1:200 goat R&D Systems AF3628
vWF 1:200 rabbit Invitrogen PA5-104687
그 후, 조직절편을 PBS에서 10 분 동안 5 회 세척 한 다음 각 1 차 항체에 대한 해당 형광-접합 된 2 차 항체에서 90 분 동안 반응시켰다. 그런 다음 조직절편을 PBS에서 10 분 동안 세척 한 다음 DAPI (1 : 500, Roche, USA) 염색에서 30 분 동안 배양하여 세포 핵을 확인했다.
이 연구에 사용 된 2 차 항체는 다음과 같다:
염소 항-마우스 IgG- 접합 Alexa-488 (1 : 250; Invitrogen), 염소 항-토끼 IgG- 접합 Alexa-488 (1 : 250; Invitrogen), 염소 항-마우스 IgG- 접합 Alexa-555 (1 : 250) ; Invitrogen), 염소 항 토끼 IgG 결합 Alexa-555 (1 : 250; Invitrogen) 및 당나귀 항 염소 IgG 결합 Alexa-555 (1 : 250; Invitrogen).
실험예 7.2. 5'-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 주입
세포 이식 후, 12 주에 MCAo의 동 측면 globus pallidus (AP : -1.3mm, ML : -3.4mm, DV : -6.5mm)에 0.5 μL의 4 % Fluoro-Gold (FG) (Fluorochrome)를 정위 주입하였다.
또한, 내인성으로 증식하는 줄기세포를 검출하기 위해, 사망 전 12 시간 간격으로 1 주 동안 5'-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) (50 mg / kg; Sigma-Aldrich)을 복강 내 주사하였다 (각각 n = 3).
공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems, Germany)을 사용하여 형광 표지 조직절편을 이미지화했다. BrdU 양성 세포는 45 ℃에서 30 분 동안 1M HCl에서 DNA를 변성시킨 후 BrdU에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학방법에 의해 검출되었다. 2 차 항체 배양, 카운터 염색 및 공초점 분석 절차는 위에서 설명한 것과 동일하게 이루어졌다.
실험예 7.3. 세포의 개수 측정
세포의 개수 측정은 이중 면역 조직 화학적 염색 후 각 동물로부터 40 μm 두께 (AP : +1.0, 0 및 -1.0 mm)로 절단 된 3 개의 관상 절편이 사용되었다. 공 초점 레이저 스캐닝 현미경의 40X 대물 렌즈 하에서 허혈성 반감기 및 경계 영역의 피질 및 선조체의 관심 영역 (ROI)에서 공동 표지된 세포의 입체적 정량화를 수행했다. 이식된 인간 세포의 생존과 분화를 조사하기 위해, 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 40X 대물 렌즈를 사용하여 각 동물에서 AP : + 1.5mm에서 AP : -1.5mm로 시작하여 13 개의 뇌 조직절편을 분석했다. 데이터는 양성 세포의 백분율로 표시하였다.
이식 후 숙주 뇌에서 염증 반응의 변화를 조사하기 위해 40X 대물 렌즈를 사용하여 허혈 경계 영역에서 5 개의 ROI를 분석하였다. 데이터는 총 DAPI 양성 세포 중 양성 세포의 백분율로 표시하였다. 아교 흉터 형성의 변화를 측정하기 위해 GFAP 양성 영역의 허혈 영역에 인접한 5 개의 ROI를 정량화하였다. 아교 흉터 형성 영역과 그 두께는 상기 설명한 바와 같이 측정되었다. 데이터는 평균 면적 (μm2) / ROI 및 평균 두께 (μm) / ROI로 표시하였다.
내인성 신경 발생의 변화를 조사하기 위해 뇌실하 영역 (SVZ)의 세 영역에서 증식하는 세포를 계산하였다. 이를 위해 동측 SVZ 벽 내 5 개의 ROI에서 BrdU+ 세포 단독, DCX+ 세포 단독 및 BrdU+-DCX+ 공동 표지된 세포의 수를 계산하고 데이터를 DAPI 양성 세포 중 양성 세포의 백분율로 표시하였다.
대뇌 혈관의 정량적 측정을 위해, 광학 현미경의 10 배 대물 렌즈 (Nikon Eclipse E600) (각 그룹의 n = 5)에서 허혈성 반음부의 4 개의 ROI에서 내피 세포에 의해 형성된 RECA1+ 혈관을 세었다. 모든 세포 계수 분석은 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 수행하였다.
실험예 7.4. 결과
hNestin+ 세포에 대한 정밀한 정량 분석은 세포체의 밀도가 높고 말단 부위가 돌출되어 있기 때문에 용이하지 않았다. 하지만 이식 후 12 주에 우리는 이식 된 세포의 상당 부분이 iPSC-NPC 그룹의 주사 부위에 이식되었음을 관찰하였다 (도 3A 및 3B 참조). 핵심 영역에서 이식된 세포의 대부분은 미분화 Nestin+ NPC였다 (도 4A 및 4B (좌측) 참조) 그러나, 경색 영역을 향한 이식 코어 외부에서 이식된 세포의 상당 부분이 hMAP2+ 성숙한 뉴런으로 분화되었다. 섬유아세포 그룹에서는 이식된 세포가 검출되지 않았지만, hNu+, hNestin+ 세포는 이식 후 12 주에 명확하게 생착되었다.
hNu에 대한 DAB 면역 염색의 정량 분석 결과 총 20,846 ± 1,087 hNu+ 세포가 검출되었으며, 이는 이식된 세포의 10.42 ± 0.54 %를 차지하였다 (도 4B (중앙) 참조).
이식된 세포의 10 ± 5.01 %가 hNu 및 hNestin과 병합되어 이식된 세포의 상당 부분이 이식 후 12 주에 여전히 신경전구체 세포로 남아 있음을 확인하였다 (도 4B (우측) 참조).
증식하는 세포에 대한 마커인 Ki67에 대해 2.12 ± 0.45 %만이 양성으로 관찰되어 생착된 NPC의 대부분이 비 증식 상태로 남아 있음을 확인했다 (도 4C 참조).
이는 곧, 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포는 이식 후 대부분이 생존 및 생착됨을 의미한다.
실험예 8. 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포의 이식 후 효과 확인
실험예 8.1. 신경 세포 및 아교세포로의 분화 확인
이식된 신경전구세포가 더 분화된 형태로서, 신경 대체를 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, 경색 주변 영역에서 신경전구세포의 신경 세포 및 아교세포로의 분화에 대한 분석을 수행했다 (도 5A 참조).
그 결과, hiPSC-NPC 그룹의 약 1,329 ± 846 hNu+ 세포가 경색 주변 영역에서 검출되었으며, 여기서 hMAP2+ 또는 NeuN+ 성숙한 뉴런으로 분화되었다 (도 5A 및 5B 참조).
이식된 세포가 GABA 성 뉴런 (도 5C 참조), DARPP-32+ 중간 가시 뉴런 (도 5D 참조) 또는 TH+ 도파민 성 뉴런 (도 5E 참조), GFAP+ astroglial 세포 (도 5F 참조)로 분화되었음을 확인했다.
이는 곧, 인간백혈구항원 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포는 이식 후 신경세포 및 아교세포로 분화하여, 기존의 신경을 대체할 수 있다는 것을 의미한다.
실험예 8.2. 신경 연결 확인
이식된 세포가 숙주 뇌 세포와 신경 연결을 형성할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 역행 신경 추적자인 Fluoro-Gold (FG)를 동 측면의 globus pallidus에 주입하고, 동측 선조체에서 공동 표지된 hNu+-FG+ 세포를 분석했다 (도 6A (좌측) 참조).
그 결과, 이식된 hiPSC-NPC의 상당히 높은 비율 (76.22 ± 1.80 %)은 FG 신호에 대해 양성을 나타냈다 (도 6A (우측) 및 6B 참조).
이는 곧, 이식된 신경전구세포가 선조체 뉴런과 성공적으로 연결되어 이식 된 세포와 숙주 사이에 뉴런 네트워크를 형성했음을 의미한다.
실험예 8.3. 숙주 면역 반응 및 신경교증 확인
이식 후 숙주 면역 반응 및 신경교증의 변화를 확인하기 위해 소교 세포 활성화, 다른 microglial 표현형의 비율 및 아교 흉터 형성 정도를 확인하였다.
그 결과, MCAo 쥐의 뇌에서는 경색 주변 영역에서 수많은 소교 세포 (Iba1+ 세포)가 발견되었으며, 그중 일부는 활성화된 형태 (ED1+ 세포)였다. 활성화된 식세포인 ED1+-Iba1+ 세포가 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군의 수준과 비교하여 iPSC-NPC 그룹에서 현저하게 감소되었음을 관찰하였다 (도 7A 참조).
또한, iNOS+-ED1+ 세포와 CD206+-ED1+ 세포에 대해 이중 면역 염색을 수행하여 다른 microglial 표현형의 비율을 추가로 조사하였다. 그 결과, CD206+-ED1+ 세포의 비율이 크게 증가하였다. iPSC-NPC 그룹은 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군의 수준과 비교하였다 (도 7B 참조). iNOS+-ED1+ 세포의 비율은 세 그룹간에 크게 다르지 않았다 (도 8 참조).
다음으로, GFAP에 대한 항체를 사용하여 면역 염색을 수행하여 아교 흉터 영역과 동측 반구의 두께를 평가하였다 (도 7C (좌측) 참조). 경색 주위 피질에서 세 그룹 사이에서 GFAP+ 신경교 흉터의 면적과 두께에 차이가 관찰되지 않았다 (도 9A 및 9B 참조).
그러나, 경색 주위 선조체 영역에서 hiPSC-NPC 그룹에서 아교 흉터의 면적은 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 감소했으며, 아교 흉터의 두께는 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 hiPSC-NPC 그룹에서 감소하였다 (도 7C 참조).
이는 곧, hiPSC-NPC의 이식이 뇌졸중 후 신경 염증을 개선 할뿐만 아니라 손상된 뇌의 치유 과정 촉진 및 쥐의 허혈성 뇌졸중의 아급성 단계에서 아교 흉터 형성을 방지함을 의미한다.
실험예 8.4. 내인성 신경 발생의 확인
허혈성 뇌 손상에서, 뇌실하 영역 (subventricular zone; SVZ)에서 생성된 내인성 신경전구세포는 손실된 뇌 세포를 대체하기 위해 손상 부위로 이동하는 것으로 알려져 있다. 이식된 신경전구세포가 내인성 SVZ 신경 발생에 영향을 미칠 수 있는지 조사하기 위해, BrdU 및 DCX에 대한 이중 염색을 수행하였다 (도 10A 참조).
그 결과, 면역 조직 화학 분석은 DCX+ 신경 아세포의 수가 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 hiPSC-NPC 그룹에서 유의하게 증가했음 확인했다 (도 10B (좌측) 참조). 동측성(ipsilateral) SVZ에서 BrdU+ 증식 세포의 수는 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 hiPSC-NPC 그룹에서 크게 증가했다 (도 10B (중앙) 참조). BrdU 및 DCX 이중 양성 세포 (즉, 증식하는 신경 아세포)의 수는 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군에 비해 hiPSC-NPC 그룹에서 크게 증가했다 (도 10B (우측) 참조).
이는 곧, hiPSC-NPC의 이식이 뇌졸중 후 손상된 뇌에서 SVZ 신경 발생을 향상 시킨다는 것을 의미한다.
실험예 8.5 신생 뇌혈관 발생의 확인
신경전구세포의 이식 후, 주변 영역에서 새로운 혈관 형성을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 면역 조직 화학 분석을 수행하였다 (도 11A 참조).
대뇌 혈관의 정량적 측정을 위해, 광학 현미경의 10X 대물 렌즈 (Nikon eclipse E600) (각 그룹의 n = 5)에서 허혈성 반응부의 4 개의 ROI에서 내피 세포에 의해 형성된 RECA1+ 혈관을 계산했다. 모든 세포 계수 분석은 ImageJ 소프트웨어 (NIH, USA)를 사용하여 수행되었다.
그 결과, 경색 주변 부위의 RECA1+ 혈관 수 (직경 30m 미만)가 배양액 대조군, 섬유아세포 대조군에 비해 hiPSC-NPC 그룹에서 유의하게 증가했음을 확인했다 (도 11B (좌측) 참조). 모세 혈관의 분기점 수는 배양액 대조군 및 섬유아세포 대조군과 비교하여 hiPSC-NPC 그룹에서도 크게 증가했다. 또한, 우리는 BrdU+ 증식 세포가 PECA1+ 용기 주위에 존재하는 것을 확인했다 (도 11B (우측) 및 11C 참조). STEM121+ 세포로 표시된 이식된 hiPSC-NPC가 경색 주변 영역의 RECA1+ 혈관내피세포 주변에서 검출되었음을 확인했다 (도 11D 참조).
이는 곧, 이식 된 hiPSC-NPC가 경색 주위 혈관의 복구 과정에 적극적으로 관여하고 혈관 신생을 촉진한다는 것을 의미한다.

Claims (10)

  1. HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포(hiPSC-NPCs)를 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서
    상기 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포는 제대혈 단핵구세포에서 유래한 것이고,
    상기 HLA 동형접합체는 MHC class I 또는 MHC class II가 동형접합인 것인, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 HLA 동형접합체는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1이 동형접합인, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 HLA 동형접합체는 HLA-A가 *33:03, HLA-B가 *44:03 또는 HLA-DRB1가 *07:01인 것인, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 신경전구세포는 Sox2, Nestin, 및 Musashi로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌졸중은 뇌경색, 뇌출혈, 일과성허혈발작 및 재발된 뇌졸중 중 선택된 어느 하나 이상인, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌졸중 예방 또는 치료는 뇌혈관 신생에 의한 것인, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 단계로서,
    상기 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포는 제대혈 단핵구세포에서 유래한 것이고,
    상기 HLA 동형접합체는 MHC class I 또는 MHC class II가 동형접합인 것인, 단계;를 포함하는, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 제조하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 분화시키는 단계는 신경전구세포 분화용 배지에서 이루어지는 것인, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 제조하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 분화용 배지는 폴리-L-오르니틴 또는 라미닌으로 코팅된 것인, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 제조하는 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 신경전구세포를 함유하는 배상체 (EB, embryoid body)를 형성하는 단계를 더 포함하는, HLA 동형접합체를 포함하는 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 제조하는 방법.
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