KR20080089157A - 배아줄기세포 유래 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법 - Google Patents

배아줄기세포 유래 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080089157A
KR20080089157A KR1020080010309A KR20080010309A KR20080089157A KR 20080089157 A KR20080089157 A KR 20080089157A KR 1020080010309 A KR1020080010309 A KR 1020080010309A KR 20080010309 A KR20080010309 A KR 20080010309A KR 20080089157 A KR20080089157 A KR 20080089157A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
neural progenitor
cell
progenitor cells
embryonic stem
Prior art date
Application number
KR1020080010309A
Other languages
English (en)
Inventor
박성혜
백선하
김대열
김은영
박세필
Original Assignee
(주)미래생명공학연구소
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)미래생명공학연구소 filed Critical (주)미래생명공학연구소
Publication of KR20080089157A publication Critical patent/KR20080089157A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은, 배아줄기 세포 유래의 인간 신경 전구 세포 주입을 통한 뇌경색 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법을 제공한다. 본 발명에 따라, 쥐의 뇌경색이 발생한 부위에 분화된 신경 전구 세포를 주입하면, 쥐의 뇌 신경 보조 세포 및 뇌 신경 세포의 분화를 유도할 수 있다.

Description

배아줄기세포 유래 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법{Method to differentiate brain cell of rat under cerebral infarction using human embryonic stem cell-derived neuronal precursor}
본 발명은 배아 줄기세포 유래의 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법에 관한 것이다.
일반적으로 뇌혈관 질환 또는 뇌졸증은 선진국의 경우 심장질환, 암 다음으로 세번째 사망원인을 차지한다. 상기 뇌졸증 환자들은 직장을 잃게 되고 회복하기까지 장기간 입원이 필요하므로 경제적 손실 또한 크다.
상기 뇌졸증은 뇌혈관을 침범하는 여러 병리학적 이상에 의해 유발되며, 결과적으로는 신경계 이상으로 뇌경색 또는 뇌출혈로 나타납니다. 서구 선진국에서는 뇌졸증의 약 80%는 허혈성 뇌경색이며 20%는 뇌출혈이 차지한다. 한국의 경우 이전에는 서구 선진국에 비해 뇌출혈의 빈도가 높았으나 현재 허혈성 뇌경색의 빈도가 증가하는 추세이다.
일반적인 뇌졸증 발병 후의 치료는 경색이나 출혈의 악화를 최소화시키고, 뇌졸증 재발을 예방하며 뇌부종을 줄이는 것을 목표로 한다.
상기 뇌졸증에 대한 치료 방법으로는 재활 치료 등과 같은 운동 요법이 실시되고 있으며, 상기 운동 요법에는 보행 훈련(gait training) 및 트레드밀(treadmill)과 같이 회전식 벨트 위를 달리는 훈련 등이 있다.
그러나 상기 뇌졸증에 대한 치료 방법으로는 상기와 같은 운동 요법 이외에 다른 대안이 별로 없는 실정이다. 이에 따라 다양한 방법의 뇌졸증 치료법 개발이 요구되고 있다.
줄기세포(stem cell)는 신체 내 모든 조직을 만들어 낼 수 있는 기원세포로서, 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 상기 줄기세포는 분화 자극에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포 분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산할 수 있는 특성이 있고, 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있는 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있다.
줄기 세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고, 상기 줄기 세포는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotency)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아 줄기 세포(embryotic stem cell) 및 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체 줄기 세포(adult stem cell)로 구분된다.
배아 발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포 내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서, 상기 세포 내괴로부터 형성된 배아 줄기 세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아 줄기 세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모 든 세포로 분화할 수 있으며, 성체 줄기세포와 달리 배 세포(germ cell)도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다. 그러나 상기 배아 줄기 세포가 분화되어 각 장기가 형성되는 과정에 이르면, 상기 배아 줄기 세포는 조직 특이적 줄기 세포로 변하게 된다. 상기 조직 특이적 줄기 세포는 분화 능력이 각각의 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 된다.
인간 배아 줄기 세포는 인간 배아(blastocyst) 형성 시 세포 내괴만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아 줄기 세포는, 일반적으로 불임 시술 뒤 남은 냉동 배아로부터 얻어진다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화 가능하며, 사멸하지 않고 미분화 상태에서 배양 가능하고, 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가진다.
따라서 상기와 같은 인간 배아 줄기 세포로부터 각조직의 줄기세포로 분화 유도할 수 있는 기술을 사용하여, 다양한 질환 치료에 대한 응용이 실시되고 있다. 그러나 현재까지는 인간 배아 줄기 세포가 질환 치료로 사용되는 경우는 드문 상황이다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 자세하게는 인간 신경 전구 세포 주입을 통해 쥐의 뇌신경 세포 분화를 유도하여, 허혈성 뇌 경색을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 특징에 따른 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법은, 인간 배아 줄기 세포를 준비하는 단계, 상기 인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계, 상기 분화된 신경 전구 세포를 회수하는 단계, 및 상기 회수된 신경 전구 세포를 쥐의 뇌경색 부위에 주입하여 상기 뇌경색 부위에 주입된 상기 신경 전구 세포를 신경 세포로 분화시키는 단계를 포함한다.
상기 인간 배아 줄기 세포를 상기 신경 전구 세포로 분화시키는 방법은, 인간 배아 줄기 세포를 1차 배양액을 포함한 지지세포(STO cell, sustentacular cell) 상에서 1차 배양하는 단계, 상기 일차 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 2차 배양액을 포함한 비부착성(non-herent) 세균 배양 접시(bacteriological culture dish) 상에서 2차 배양하여 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계, 상기 2차 배양된 배아체를, 3차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 3차 배양하여 신경 전구 세포를 유도하는 단계, 및 상기 3차 배양된 신경 전구 세포를, 4차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 4차 배양하여 신경 전구 세포 형성을 유지하는 단계를 포함한다.
상기 주입된 신경 전구 세포를 신경 세포로 분화시키는 단계는, 상기 신경 전구 세포가 신경 보조 세포 및 신경 세포 중 적어도 하나의 세포로 분화되는 단계를 포함한다.
상기 쥐의 뇌신경 세포 분화를 유도하기 위해서는, 상기 신경 전구 세포를 뇌에 주입한 쥐에 운동 요법을 실시하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법을 보다 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법은, 인간 배아 줄기 세포를 준비하는 단계, 상기 인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계, 상기 분화된 신경 전구 세포를 회수하는 단계, 및 상기 회수된 신경 전구 세포를 쥐의 뇌경색 부위에 주입하여 상기 뇌경색 부위에 주입된 상기 신경 전구 세포를 신경 세포로 분화시키는 단계를 포함한다.
상기 인간 배아 줄기 세포는 배반 포기배(blastocyst) 등의 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 인간 배아 줄기 세포는 동결 전의 세포를 이용할 수도 있고, 동결된 세포를 융해하여 사용할 수도 있다.
상기 인간 배아 줄기 세포를 상기 신경 전구 세포로 분화시키는 방법은, 상기 인간 배아 줄기 세포를 상기 신경 전구 세포로 분화시키는 방법은, 인간 배아 줄기 세포를 1차 배양액을 포함한 STO 지지세포 상에서 1차 배양하는 단계, 상기 일차 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 2차 배양액을 포함한 비부착성(non-herent) 세균 배양 접시(bacteriological culture dish) 상에서 2차 배양하여 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계, 상기 2차 배양된 배아체를, 3차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 3차 배양하여 신경 전구 세포를 유도하는 단계, 및 상기 3차 배양된 신경 전구 세포를, 4차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 4차 배양하여 신경 전구 세포 형성을 유지하는 단계를 포함한다.
상기 인간 배아 줄기 세포를 1차 배양액을 포함한 STO 지지세포 상에서 1차 배양하는 단계는, 증식이 억제된 STO 지지 세포를 사용하여 배아 줄기 세포를 배양함으로써, 배아 줄기 세포의 자연적 분화는 억제하면서 자가 증식만 일어나도록 하는 단계이다.
상기 1차 배양액은 혈청 대체물(serum replacement), 글루타민, β-머캅토에탄올, 리보뉴클레오시드(ribonucleoside), 비필수 아미노산, 및 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor) 등을 포함하는 Knockout-DME(Dulbecco's modified Eagle) 배양액이다.
이 경우, 상기 1차 배양액에 포함된 bFGF는 in vitro 상태에서 다양한 형태의 세포 증식을 야기하는 기능을 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 1차 배양액으로 Knockout-DME 배양액을 사용하였으나, 이와 다르게 DME 배양액 등도 사용할 수 있다.
상기 1차 배양이 끝나면, 상기 배양된 인간 배아 줄기 세포들을 트립신 및 EDTA 처리하여 STO 세포로부터 분리하고, 2차 배양액을 포함한 비부착성(non- herent) 세균 배양 접시(bacteriological culture dish) 상에서 2차 배양하여 배아체(embryoid body)를 형성한다.
상기 2차 배양액은 RA(retinoic acid) 등을 포함한다.
상기 2차 배양액 내에 포함된 RA는 신경 세포 분화 유도 시약이다. 따라서 RA 존재 하에서 형성된 배아체는, 인간 배아 줄기 세포가 분화를 시작한 것으로 볼 수 있다.
이후에 상기 2차 배양된 배아체를, 3차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 3차 배양하여 신경 전구 세포를 유도한다.
상기 3차 배양액은 bFGF 등을 포함하는 N2 배양액이다. 상기 N2 배양액에는 상기 bFGF 외에도 인슐린, 트랜스페린, 푸트레신, 프로게스테론, 소듐 셀레나이트, 헤파린 등을 더 포함할 수 있다.
이후에 3차 배양액에 SHH(Sonic hedgehog) 및 FGF8(Fibroblast Growth Factor 8) 등을 더 첨가하여 4차 배양액을 제조하고, 상기 배양된 신경 전구 세포를, 상기 제조된 4차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 4차 배양하여 신경 전구 세포 형성을 유지한다.
따라서 상기 4차 배양액은 상기 3차 배양액에 SHH 및 FGF8 등을 더 첨가한 것이다.
상기 SHH 및 FGF8은 RA 및 bFGF와 더불어 신경 세포 분화를 유도하는 시약이다. 일반적으로 배아 줄기 세포로부터 신경 세포가 유도되기 위해서는, RA → bFGF → SHH, FGF8 순으로 배양액에 분화 유도 물질을 주입하는 것이 바람직하다.
본 실시예에서는 RA, bFGF, SHH, 및 FGF8을 모두 사용하여 신경 세포를 유도하였으나, 이와 다르게 상기 유도 물질 중 일부를 사용하여 신경 세포를 유도할 수 있다. 또한 상기 신경 유도 물질 이외의 물질들을 사용하여 신경 세포를 유도할 수도 있다.
상기와 같이 신경 전구 세포를 배양하는 것이 완료되면, 상기 배양된 신경 전구 세포를 회수한다. 상기 배양된 신경 전구 세포를 회수하는 단계에서는 상기 배양이 완료된 신경 전구 세포에 트립신(trypsin)을 처리하여 군체를 각각의 개별적인 신경 전구 세포로 분리한다.
이후에 상기 분리된 신경 전구 세포를 쥐의 뇌경색 부위에 주입한다. 상기 신경 전구 세포를 주입하는 방법은, 실험 개체의 손상을 최소로 하기 위해서는 정위 주입법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 정위 주입법으로는 입체 정위 수술 장치 등을 이용할 수 있다. 본 실시예에서는 상기 신경 전구 세포를 주입하기 위해 정위 주입법을 사용하였으나, 이와 다른 방법을 사용하여 신경 전구 세포를 주입할 수도 있다.
상기 주입된 신경 전구 세포는 일정 시간이 흐르면서 쥐의 뇌 내에서 분화하여, 신경 보조 세포 및 신경 세포 중 적어도 하나의 세포로 분화된다.
이하에서는 도면을 참조하여 상기 인간 배아 줄기 세포가 신경 세포로 분화되는 과정을 자세히 설명하도록 한다.
도 1은 인간 배아 줄기 세포의 분화 과정을 보여주는 사진이다.
도 1을 참조하면, 먼저 도 1의 A는 미분화 상태의 인간 배아 줄기세포를 염색하여 보여주는 사진이다.
도 1의 B는 상기 미분화된 인간 배아 줄기 세포를 분화시키는 과정 중 3배엽성의 배아체가 형성된 것을 보여주는 사진이다.
도 1의 B를 참조하면, 상기 인간 배아 줄기 세포는, RA 존재하에 분화를 통하여 배아체를 형성하게 된다.
이후 bFGF, SHH 및 FGF8 등에 의해 상기 배아체가 신경 전구 세포로 분화된다.
도 1의 C는 분화가 완료된 신경 전구 세포에 존재하는 Nestin 단백질을 보여주는 사진이다. 도 1의 D는 신경 보조 세포에 존재하는 GFAP(glial fibrillary acid protein)를 보여주는 사진이다. 도 1의 E 및 F는 신경 세포를 보여주는 사진이다. 상기 E는 미성숙한 신경 세포에 존재하는 NF160 단백질을 보여주는 사진이다. 상기 F는 성숙한 신경 세포에 존재하는 MAP2 단백질을 보여주는 사진이다.
도 1의 C, D, E 및 F를 참조하면, 상기 분화된 신경 전구 세포는, 이후에 신경 보조 세포 및 신경 세포 등으로 분화된다.
따라서 상기 도 1을 전체적으로 참조하면, 상기 인간 배아 줄기 세포는, 인간 배아 줄기 세포 → 배아체 → 신경 전구 세포 → 신경 보조 세포 및 신경 세포로 분화됨을 알 수 있다.
상기 쥐의 뇌경색 부위에 신경 세포 분화를 유도하기 위해서는, 상기와 같이 신경 전구 세포를 주입하는 단계 외에, 상기 신경 전구 세포를 뇌에 주입한 쥐에 운동 요법을 실시하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 운동 요법은 트레드밀(treadmill) 및 보행 훈련 등을 포함한다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하도록 한다. 그러나 하기 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
뇌경색이 발생한 쥐에 대해 신경 세포를 분화시키기 위해 먼저 인간 배아 줄기 세포를 준비하였다.
본 실시예에 사용하는 인간 배아 줄기 세포(hES 세포)는 NIH 코드로 MB01을 사용하였으며, 상기 MB01 세포는, 5년 이상 되어 폐기될 세포를 동결-융해한 배반 포기배로부터 생성되었다. MB01 hES 세포들은 STO 지지세포 (ATCC CRL-1503, 250000 cells/1.77cm2, #3653, Becton Dickinson, NJ USA)에서 20 % serum replacement (Gibco), 1 mM glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1 % ribonucleosides, 1 % non-essential amino acids, 및 4 ng/ml bFGF이 첨가된 Knockout-Dulbecco's modified Eagle's (Gibco, Grand Island, NY) 배양액에서 배양되었다. 상기 hES 세포들을 신경 전구세포로의 분화를 위해, 0.025% trypsin 및 EDTA로 분리한 후 3x104cells/cm2 밀도로 a non-adherent bacteriological culture dish에서 4일 동안 배양하여 배아체를 형성하였다. 또한 상기 배양 시 배양액에는 RA(10-6M, Sigma)를 첨가하였다. 이 후 상기 배아체는 0.1% gelatin coated dish에 평판 배양되었고, 10 일 동안 10ng/ml bFGF가 첨가된 N2 신경 분화 배양액에서 배 양시켜 신경전구세포로 유도하였다. 또한 200 ng/ml SHH (sonic hedgehog) 및 100ng/ml FGF8을 넣어 4-6일간 추가 배양하여 신경전구세포의 형성을 유지시켰다.
이와 동시에 5마리의 흰쥐(Sprague Dawley)에 대해, 나일론을 이용한 중간대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA) 폐색과 재관류법을 이용하여, 뇌조직의 허혈성 손상을 유발하였다. 먼저 1% ketamine (30 mg/kg) 및 xylazine hydrochloride (4 mg/kg)로 흰쥐를 복강 내 마취하고, 경부를 정중 절개하여 좌측 총경동맥을 박리하였다. 그리고 총경동맥을 따라 원위부로 진행하여 외경동맥과 내경동맥을 분리하였다. 이후 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고, 총경동맥 분지부에 작은 창을 내었다. 상기 창을 통해 미리 화염을 이용하여 끝을 뭉툭하게 한 4.0 나일론 사 (Ethicon, Edinburg, UK)를 밀어 넣어, 경동맥 분지에서 16-18mm가 들어가게 위치시켰다. 그 다음, 중대뇌동맥을 폐쇄한 후 내경동맥도 결찰하였다. 혈류 차단 2시간이 지난 후, 피부 밖에 남겨져 있던 나일론 사를 조심스럽게 당겨 측부 순환을 통해 재관류하여 뇌경색 유발을 완료 하였다.
상기 뇌경색 유발 1주일 후에, 정위 주입을 통하여 상기 뇌경색 부위에 상기 분화된 신경 전구 세포를 주입하였다.
상기 분화된 신경 전구 세포에 대해, 먼저 정위 주입 1시간 전에 0.01% trypsin을 처리하여 각각의 세포로 분리하여 회수하고, 10ng/ml Hoechst 33258로 10분간 염색하여 상기 신경 전구 세포를 준비하였다.
상기 뇌경색이 유발된 5마리의 흰쥐에 대해, 각각 1% ketamin (30 mg/kg)과 xylazine hydrochloride (4 mg/kg)으로 복강 내 마취한 후, 백서의 직장에 체온측 정 probe을 삽입하고, 수술 동안 체온을 38도로 유지하였다. 이후 입체 정위 수술장치(streotaxic apparatus)를 이용하여, 좌표로는 bregma에서 오른쪽으로 3mm, 위로 2mm, 깊이 5mm 부위의 intraventricular space에 5X105개의 상기 준비된 신경 전구 세포가 들어 있는 용액 0.5μl를 10분간 서서히 주입하였다. 상기 주입은 1㎖ gas-tight glass syringe(Hamilton, Reno, NV, USA)에 polyethylene 튜브로 연결하여 perfusion pump(Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA)를 이용하였으며, 0.5λl/min 유속으로 0.5㎕ 주입하였다. 이 후에 5분간 방치한 다음 syringe를 제거하여 상기 신경 전구 세포의 주입을 완료하였다.
[실시예 2]
5마리의 흰쥐(Sprague Dawley)에 대해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 뇌경색을 유발한 후, 운동요법을 실시하였다.
운동요법은 쥐를 위하여 특수 제작된 트레드밀(Columbus instrument, U.S.A)에서 시행하였다. 뇌경색 유발 24시간 후, 각각의 흰쥐를 대상으로 상기 트레드밀 상에서 분당 20m의 속도로 15분간 준비 운동을 시행하여, 초최대 강도의 운동 속도를 결정하였다. 초최대 강도의 운동 속도는 운동 시작 후 3분 이내에 실험동물이 피로로 인하여 더 이상 트레드밀을 따라 주행을 할 수 없는 강도일 때의 운동 속도로 정의하였다. 초최대 운동 속도를 결정한 후, 각각의 실험동물마다 초최대 운동 속도의 30%로 운동하게 하였다. 운동은 15분의 준비운동으로 초최대 운동 속도의 10%의 부하로 운동하고 이후 30%의 트레드밀 속도로 30분 동안 운동을 시행하였다.
이후 뇌경색 유발 1주일 후에 실시예 1과 동일한 방법으로 신경 전구 세포를 주입하고, 이후 상기 뇌경색 유발 4주 후까지 하루 30분씩 매일 상기 운동 요법을 계속 시행하였다.
[비교예 1]
5마리의 흰쥐(Sprague Dawley)에 대해 상기 실시예 2과 동일한 방법으로 뇌경색 유발 및 운동요법을 실시하였다.
단, 본 비교예 1에서는 상기 실시예 2와 다르게, 신경 전구 세포 대신 PBS(Phosphate buffered solution)를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 주입하였다.
[비교예 2]
5마리의 흰쥐(Sprague Dawley)에 대해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 뇌경색을 유발하였다. 또한 실시예 1과 같이 운동요법를 실시하지 않았으며, 신경 전구 세포 대신 PBS를 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 주입하였다.
(1) 주입한 신경 전구 세포 유무 확인
상기 실시예 1,2 및 비교예 1,2의 개체(총 20 마리)를 뇌경색 유발 28일 후에 희생시켰다. 실험동물에게 1% ketamine (30 mg/kg) 및 xylazine hydrochloride (4 mg/kg)를 복강 내 주사하여 마취한 후 단두대에서 동물의 두부를 단두시키고(decapitation), 뇌조직을 제거하였다. 희생된 동물들은 서울대학교 병원 임상의학연구소에 위치한 사육 시설에서 동물 사육규정에 따라 처리하였다.
상기의 뇌조직 중 각각의 실시예 및 비교예에 대하여 각각 뇌조직을 2개씩 취한 다음, 신속히 얼린 후 -70에서 보관하였다. 얼릴 때 액체질소가 들어있는 용기 속에 isopentane이 들어 있는 용기를 중탕하여 넣은 후 isopentane에서 공기 방울이 다 나올 때까지 저은 후 이 용액에 넣어 얼렸다. 이후 10% 중성포르말린에 24시간 고정한 후 rodent brain matrix에 넣고 2mm 간격으로 관상절편을 만들었다. 이후 H & E(hematoxylin and eosin), LFB(luxol fast blue) 및 PAS(Periodic acid Schiff)로 염색하여 관찰하였다.
(2) 분화된 신경 보조 세포 및 신경 세포 관찰
상기 실시예 1에 대해, 상기와 같이 뇌조직을 채취하여 10% 중성 포르말린에 4시간 고정하였다. 이후 파라핀에 포매한 후 3-4 um로 박절하여 Xylene으로 파라핀을 제거하였다. 에틸알콜에서 단계적으로 함수한 후 methanol 300ml와 과산화수소 10ml로 20분간 전처치하여 내인성 과인산화 효소를 억제시켰다. 수세 후 pH6.0cml 10mmol/L citrate 완충액에 담가 microwave를 이용하여 20분간 가열하여 항원을 표출시켰다. 이후 pH 7.6 Tris 완충액으로 충분히 식힌 후 일차 항체를 처리하여 1시간 동안 반응 시켰다. 그 다음, Tris 완충액으로 세척 한 후 universal DAKO LSAB kit를 사용하여 30분간 2차 항체와 streptavidin-biotin 반응을 시킨 후 광학현미경으로 관찰하면서 4-5분간 diaminobenizidine으로 발색하였다. 이후 흐르는 물에 수세한 후 탈수를 거쳐 Hematoxylin 대조 염색을 하였다. 면역 조직화학 염색의 판독은 두 명의 병리의사가 함께 판독하였다.
이하에서는 도면을 참조하여 상기 실험의 결과를 설명하도록 한다.
도 2 및 3은 실시예 1에 대한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다.
도 2 및 3의 좌측 사진은 신경 전구 세포를 주입한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다. 도 2 및 3의 좌측 사진을 참조하면, 뇌경색으로 인해 사진 우측에 뇌조직이 함몰된 부분이 희게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 도 2 및 3의 우측 사진은 뇌경색이 일어난 부위에서 신경 보조세포가 형성된 것을 보여주는 사진이다.
도 4 및 5은 실시예 2에 대한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다.
도 4 및 5의 좌측 사진은, 신경 전구 세포를 주입하고 운동을 한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다. 도 4 및 5의 좌측 사진을 참조하면, 뇌경색으로 인해 사진의 우측에 뇌조직이 함몰된 부분이 적게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
도 4 및 5의 우측 사진은 실시예 2에 대해, 뇌경색이 일어난 부위에서 신경 보조세포가 형성된 것을 보여주는 사진이다.
도 6 및 7은 비교예 1에 대한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다.
도 6 및 7의 좌측 사진은, 신경 전구 세포를 주입하고 운동을 한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다. 도 6 및 7의 좌측 사진을 참조하면, 뇌경색으로 인해 사진의 우측에 뇌조직이 함몰된 부분이 희게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
도 6 및 7의 우측 사진은 비교예 1에 대해, 뇌경색이 일어난 부위에서 신경 보조세포가 형성된 것을 보여주는 사진이다.
도 8 및 9은 비교예 2에 대한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다.
도 8 및 9의 좌측 사진은, 인간 신경 전구 세포를 주입하고 운동을 한 쥐의 뇌단면을 보여주는 사진이다. 도 8 및 9의 좌측 사진을 참조하면, 실시예 1, 2 및 비교예 1에 비해, 뇌경색으로 인해 사진 우측에 뇌조직이 함몰된 부분이 가장 크게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
도 8 및 9의 우측 사진은 비교예 2에 대해, 뇌경색이 일어난 부위에서 신경 보조세포가 형성된 것을 보여주는 사진이다.
상기 결과에 따르면, 인간 신경 전구 세포 주입이 뇌경색 부위를 감소시키는 역할을 한 것을 확인할 수 있었으며, 운동 요법도 뇌경색 부위를 감소시키는 것을 확일할 수 있었다. 또한 동일한 역할세포 주입이나 운동 요법 단독 보다 두 방법을 모두 사용한 경우에 뇌경색 부위가 가장 많이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
도 10은 실시예 1의 분화된 신경 보조 세포를 보여주는 사진이다.
도 10의 좌측 사진은 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 기 염색된(Hoechst 염색) 인간 신경 전구 세포를 나타낸다. 상기 좌측 사진을 참고하면, 주입 후 3주가 지난 후에도 주입한 인간 신경 전구 세포가 죽지 않고 여전히 존재함을 알 수 있었다.
도 10의 중간 사진은 신경 보조 세포의 GFAP를 염색한 사진이다. 상기 중간 사진은, 뇌경색이 발생함에 따라 자체적으로 형성된 쥐 신경 보조 세포 및 주입한 인간 신경 전구 세포가 분화하여 형성된 신경 보조 세포를 모두 포함한다. 따라서 상기 두 신경 보조 세포를 분리하여 살펴보기 위해서는 주입한 신경 전구 세포와의 연관성을 관찰할 필요가 있다.
도 10의 우측 사진은 상기 좌측 사진과 중간 사진을 겹쳐서 본 사진이다. 도 10의 우측 사진을 참조하면, 진분홍색으로 나타난 부분이 좌측 사진의 인간 신경 전구 세포와 중간 사진의 신경 보조 세포의 위치가 대응하는 부분이다. 즉, 상기 도 10의 우측 사진에서 진분홍색으로 나타난 부분이, 상기 주입된 인간 신경 전구 세포가 분화되어 형성된 신경 보조세포로 볼 수 있다. 따라서, 도 10의 우측 사진을 참조하면, 주입한 인간 신경 전구 세포가 쥐의 뇌경색 부위에서 신경 보조 세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다.
도 11 및 12는 실시예 1의 분화된 신경 세포를 보여주는 사진이다.
도 11의 좌측 사진은 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 인간 신경 전구 세포를 보여주는 사진이다. 도 11의 중간 사진은 상기 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 미성숙한 신경 세포(Nestin 단백질 포함)를 보여주는 사진이다. 도 11의 우측 사진은 상기 좌측 사진 및 우측 사진을 겹쳐서 본 것이다. 도 11의 우측 사진을 참조하면, 진분홍색으로 나타난 부분이 좌측 사진의 인간 신경 전구 세포와 중간 사진의 미성숙한 신경 세포의 위치가 대응하는 부분이다. 즉, 상기 도 11의 우측 사진에서 진분홍색으로 나타난 부분이, 상기 주입된 인간 신경 전구 세포가 분화되어 형성된 미성숙한 신경 세포로 볼 수 있다. 따라서, 도 11의 우측 사진을 참조하면 쥐의 뇌경색 부위에 주입된 인간 신경 전구 세포가 미성숙한 신경 세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다.
도 12의 좌측 사진은 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 인간 신경 전구 세포를 보여주는 사진이다. 도 12의 중간 사진은 상기 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 성숙한 신경 세포(NeuN 단백질 포함)를 보여주는 사진이다. 도 12의 우측 사진은 상기 좌측 사진 및 우측 사진을 겹쳐서 본 것이다. 도 12의 우측 사진을 참조하면, 하늘 색으로 나타난 부분이 좌측 사진의 인간 신경 전구 세포와 중간 사진의 성숙한 신경 세포의 위치가 대응하는 부분이다. 즉, 상기 도 12의 우측 사진에서 하늘색으로 나타난 부분이, 상기 주입된 인간 신경 전구 세포가 분화되어 형성된 성숙한 신경 세포로 볼 수 있다.
따라서, 도 12의 우측 사진을 참조하면 쥐의 뇌경색 부위에 주입된 인간 신경 전구 세포가 성숙한 신경 세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다.
도 13, 14, 및 15는 실시예 1에서 분화된 신경 세포의 신호 전달 기능성 단백질들을 보여주는 사진이다.
도 13의 좌측 사진은 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 인간 신경 전구 세포를 보여주는 사진이다. 도 13의 중간 사진은 신경 세포의 수초 구성 단백질(A2B5)을 나타낸 사진이다. 도 13의 우측 사진은 상기 좌측 사진 및 우측 사진을 겹쳐서 본 것이다. 도 13의 우측 사진을 참조하면, 진분홍색으로 나타난 부분이 좌측 사진의 인간 신경 전구 세포와 중간 사진의 신경 세포의 수초 구성 단백질 A2B5의 위치가 대응하는 부분이다. 즉, 상기 도 13의 우측 사진에서 진분홍색으로 나타난 부분이, 주입된 인간 신경 전구 세포에 의해 분화된 신경 세포의 신호 전달 기능성 단백질들을 보여주는 것이다.
도 14의 좌측 사진은 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 인간 신경 전구 세포를 보여주는 사진이다. 도 14의 중간 사진은 신경 세포의 수초 구성 단백질(GalC)을 나타낸 사진이다. 도 14의 우측 사진은 상기 좌측 사진 및 우측 사진을 겹쳐서 본 것이다. 도 14의 우측 사진을 참조하면, 진분홍색으로 나타난 부분이 좌측 사진의 인간 신경 전구 세포와 중간 사진의 신경 세포의 수초 구성 단백질 GalC의 위치가 대응하는 부분이다. 즉, 상기 도 14의 우측 사진에서 진분홍색으로 나타난 부분이, 주입된 인간 신경 전구 세포에 의해 분화된 신경 세포의 신호 전달 기능성 단백질들을 보여주는 것이다.
도 15의 좌측 사진은 쥐의 뇌경색 부위에 존재하는 인간 신경 전구 세포를 보여주는 사진이다. 도 15의 중간 사진은 신경 세포의 수초 구성 단백질(O1)을 나타낸 사진이다. 도 15의 우측 사진은 상기 좌측 사진 및 우측 사진을 겹쳐서 본 것이다. 도 15의 우측 사진을 참조하면, 진분홍색으로 나타난 부분이 좌측 사진의 인간 신경 전구 세포와 중간 사진의 신경 세포의 수초 구성 단백질 O1의 위치가 대응하는 부분이다. 즉, 상기 도 15의 우측 사진에서 진분홍색으로 나타난 부분이, 주입된 인간 신경 전구 세포에 의해 분화된 신경 세포의 신호 전달 기능성 단백질들을 보여주는 것이다.
상기와 같이 A2B5, GalC, 및 O1 등과 같은 수초 구성 단백질이 형성되면, 분화되어 형성된 신경 세포가 실제로 뇌 조직내에서 신호 전달 기능을 수행한다는 것을 알 수 있다. 따라서 상기 결과에 의해, 쥐의 뇌경색 부위에 주입된 인간 신경 전구 세포는 신경 세포로 분화될 뿐만 아니라 실제로 신호 전달 기능을 수행함을 알 수 있었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 분화된 인간 신경 전구 세포 주입을 통해 뇌경색이 유발된 쥐의 뇌신경 세포 분화를 유도할 수 있다. 즉, 인간 신경 전구 세포를 주입함으로써, 뇌경색이 발생한 부위의 함몰을 감소시킬 수 있으며, 상기 신경 전구 세포로부터 분화된 신경 세포에 의해 실질적인 신경 전달 기능을 수행하게 함으로써 쥐의 뇌경색을 치료할 수 있다.
또한 본 발명은, 분화된 인간 신경 전구 세포 주입을 통해 인간의 뇌경색을 치료하는 새로운 방법으로도 응용될 수 있다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구 범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
도 1은 인간 배아 줄기 세포의 분화 과정을 보여주는 사진이다.
도 2 및 도 3은 실시예 1에 대한 쥐의 뇌 단면을 보여주는 사진이다.
도 4 및 도 5는 실시예 2에 대한 쥐의 뇌 단면을 보여주는 사진이다.
도 6 및 도 7은 비교예 1에 대한 쥐의 뇌 단면을 보여주는 사진이다.
도 8 및 도 9는 비교예 2에 대한 쥐의 뇌 단면을 보여주는 사진이다.
도 10은 실시예 1의 분화된 신경 보조 세포를 보여주는 사진이다.
도 11 및 12는 실시예 1의 분화된 신경 세포를 보여주는 사진이다.
도 13, 14, 및 15는 실시예 1에서 분화된 신경 세포의 신호 전달 기능성 단백질들을 보여주는 사진이다.

Claims (11)

  1. 인간 배아 줄기 세포를 준비하는 단계;
    상기 인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계;
    상기 분화된 신경 전구 세포를 회수하는 단계; 및
    상기 회수된 신경 전구 세포를 쥐의 뇌경색 부위에 주입하여 상기 뇌경색 부위에 주입된 상기 신경 전구 세포를 신경 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 배아 줄기 세포는 배반 포기배인 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인간 배아 줄기 세포를 상기 신경 전구 세포로 분화시키는 방법은,
    인간 배아 줄기 세포를 1차 배양액을 포함한 STO 지지세포 상에서 1차 배양하는 단계;
    상기 일차 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 2차 배양액을 포함한 비부착성(non-herent) 세균 배양 접시(bacteriological culture dish) 상에서 2차 배양하여 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계;
    상기 2차 배양된 배아체를, 3차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 3차 배양하여 신경 전구 세포를 유도하는 단계; 및
    상기 3차 배양된 신경 전구 세포를, 4차 배양액을 포함한 부착성 젤라틴 코팅 접시(gelatin coated dish) 상에 4차 배양하여 신경 전구 세포 형성을 유지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 1차 배양액은 혈청 대체물(serum replacement), 글루타민, β-머캅토에탄올, 리보뉴클레오시드(ribonucleoside), 비필수 아미노산, 및 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 Knockout-DME(Dulbecco's modified Eagle) 배양액인 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 2차 배양액은 RA(retinoic acid)를 포함하는 배양액인 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 3차 배양액은 bFGF를 포함하는 N2 배양액인 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 4차 배양액은 상기 3차 배양액에 SHH(Sonic hedgehog) 및 FGF8(Fibroblast Growth Factor 8)을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 배양된 신경 전구 세포를 회수하는 단계는 상기 배양된 신경 전구 세포에 트립신(trypsin)을 처리하여 군체를 분리하는 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 회수된 신경 전구 세포를 쥐의 뇌경색 부위에 주입하는 단계는 정위 주입법을 이용하는 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 주입된 신경 전구 세포를 신경 세포로 분화시키는 단계는,
    상기 신경 전구 세포가 신경 보조 세포 및 신경 세포 중 적어도 하나의 세포로 분화되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 신경 전구 세포를 뇌에 주입한 쥐에 운동 요법을 실시하는 단계를 더 포함하는 쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법.
KR1020080010309A 2007-03-30 2008-01-31 배아줄기세포 유래 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법 KR20080089157A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20070031496 2007-03-30
KR1020070031496 2007-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080089157A true KR20080089157A (ko) 2008-10-06

Family

ID=40151058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080010309A KR20080089157A (ko) 2007-03-30 2008-01-31 배아줄기세포 유래 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20080089157A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022250477A1 (ko) * 2021-05-27 2022-12-01 차의과학대학교 산학협력단 Hla 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022250477A1 (ko) * 2021-05-27 2022-12-01 차의과학대학교 산학협력단 Hla 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nori et al. Human oligodendrogenic neural progenitor cells delivered with chondroitinase ABC facilitate functional repair of chronic spinal cord injury
CN103396993B (zh) 衍生自灵长类胚胎干细胞的用于脊髓损伤的再髓鞘化和治疗的少突胶质细胞
JP4330995B2 (ja) 絨毛膜絨毛、羊水、および胎盤からの胎児性幹細胞を単離、増殖、および分化させる方法、ならびにその治療的使用方法
Sieber‐Blum et al. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle
US20030219866A1 (en) Stem cell-like cells
CN102191221B (zh) 一种能无限自我更新的神经干细胞、其制备方法及其用途
Fink et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells into the striata of R6/2 mice: behavioral and neuropathological analysis
JP2005522213A (ja) 脈管形成性の始原細胞をインビトロで同定し、単離し、または分化させるための新規な方法
JP2015165823A (ja) 体性に由来する複数の細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊
Yao et al. Transdifferentiation-induced neural stem cells promote recovery of middle cerebral artery stroke rats
Xue et al. Nestin expression in Müller glial cells in postnatal rat retina and its upregulation following optic nerve transection
JP2020202865A (ja) 神経前駆細胞集団およびそれらの使用
US8030072B2 (en) Method of isolating epidermal neural crest stem cells
KR20090035372A (ko) 인간 배아줄기세포로부터 척수신경계 희소돌기 아교세포생산을 위한 삼단계 분화기법
Saxena et al. Role of stem cell research in therapeutic purpose--a hope for new horizon in medical biotechnology.
JP2008029331A (ja) 体性に由来する複数の細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊
WO2006117237A2 (en) Regeneration system, its production and use
Sukach et al. Formation of spherical colonies as a property of stem cells
Abdanipour et al. Intraspinal transplantation of motoneuron-like cell combined with delivery of polymer-based glial cell line-derived neurotrophic factor for repair of spinal cord contusion injury
KR20080089157A (ko) 배아줄기세포 유래 인간 신경 전구 세포를 이용한 뇌경색쥐의 뇌신경 세포 분화 유도 방법
KR100890992B1 (ko) 중간엽 줄기세포에서 신경세포로의 분화 유도 방법
Pascucci et al. CD34 glycoprotein identifies putative stem cells located in the isthmic region of canine hair follicles
US20180057790A1 (en) Functional Myelination of Neurons
CN110093306A (zh) 人工毛囊及其制备方法和应用
JP5249789B2 (ja) 毛髪の形成方法及び生物材料

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application