MX2014014507A - Metodo para la expresion de proteinas heterologas usando un vector de arn virus de hebra negativa recombinante. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método de expresión de al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula, el método comprende introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde el ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteína P mutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un factor de reprogramación o programación celular o una proteína terapéutica. Además, la presente invención proporciona una célula o una población de células preparadas in vitro por el método así como una composición farmacéutica que comprende la célula o población de células.

Description

MÉTODO PARA.LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS USANDO UN VECTOR DE ARN VIRUS DE HEBRA NEGATIVA RECOMBINANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método de expresión al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula usando un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante el cual es deficiente en la replicación pero competente para la transcripción. En particular, la presente invención se relaciona con un método in vitro de reprogramación de una célula a un estado menos diferenciado y métodos de terapia genética in vivo e in vitro usando el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante. Además, la presente invención se relaciona con una célula o una población de células preparadas por los métodos in vitro y el uso de la célula o población de células preparadas como un medicamento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los vectores virales recombinantes se encuentran entre varios agentes conocidos disponibles para la introducción de genes ajenos o externos a células de mamíferos que median la expresión transgénica estable. Han sido usados varios virus para este propósito incluyendo retrovirus, herpes virus, adenovirus, y virus adenoasociados. Esos virus recombinantes son particularmente conocidos por su uso en la producción de vacunas virales o como vectores de terapia genética para el tratamiento de trastornos por deficiencias genéticas. Otras aplicaciones de los virus recombinantes incluyen la desdiferenciación de células a células pluripotentes conocidas como células no diferenciadas pluripotentes inducidas (iPS por sus siglas en ingles) por transducción mediada por retrovirus o lentivirus y la expresión de factores de rediferenciación o reprogramación celular específicos.

Un problema serio asociado con la liberación de genes en los métodos mediados por virus descritos anteriormente es la integración de material genético de un vector viral en el ADN genómico de la célula anfitriona, lo cual puede causar una transformación maligna de la célula anfitriona. En particular, la liberación mediada por retrovirus de genes se codifica para, por ejemplo, factores de reprogramación, puede dar como resultado la integración genómica del transgen. Esto puede disparar la activación de oncogenes o perturbar genes supresores de tumores, conduciendo la transformación de la célula maligna. Otro problema asociado con la integración de vectores virales es el hecho de que los transgenes integrados y desregulados pueden ser reactivados para producir una transformación celular.

Otros problemas incluyen la posibilidad de que el virus usado para la liberación genética pueda ser transmitido a células sanas vecinas del paciente o del paciente a otros individuos o hacia el ambiente. Un problema más es que el vector viral puede persistir y causar efectos adversos, como una reacción inmune contra componentes virales o efectos retardados de infección viral. Además, la expresión prolongada de genes ajenos también puede dar como resultado una reacción similar a una reacción inmune a autoantigenos o interferir con procesos celulares como las vias de señalización.

Para incrementar la seguridad de la liberación de genes meterlos a una célula anfitriona en procedimientos ex vivo e in vivo, en particular con vista a la propagación indeseable de los vectores virales, han sido propuestas varias estrategias diferentes. Por ejemplo, en la WO 2006/084746 Al se describe un ARN virus de hebra negativa, deficiente para la replicación, pero competente para la transcripción. Debido a su perfil de seguridad mejorado, este virus es descrito como adecuado para usarse como una vacuna viva.

Además, para evitar cualquier problema causado por la inserción del gen en el genoma de una célula blanco, se intentó introducir constructos genéticos virales que no se integren en el genoma de la célula blanco y permitan la expresión transitoria de un producto genético heterólogo. Por ejemplo, la WO 2010/008054 Al describe un método para la producción de una célula similar a ES (células embriónicas) usando un vector viral cromosómicamente no integrante como un vector de virus Sendai. Sin embargo, este vector viral es capaz de replicarse de manera eficiente en la célula blanco infectada y, de este modo, las partículas virales generadas se distribuirán uniformemente entre la células hijas después de cada división celular. De este modo, las células similares a ES producidas contienen cargas virales indeseablemente altas en su citoplasma.

Un método similar es descrito en la WO 2010/134526 Al donde es usado un vector de virus Sendai para reprogramar células somáticas en células no diferenciadas pluripotentes inducidas (IPS por sus siglas en ingles). El vector de virus Sendai no da como resultado la integración de secuencias del vector en el genoma de la célula anfitriona y, de este modo, reduce el riesgo de transformación tumorigénica causada por la integración aleatoria de secuencias del vector en el genoma anfitrión. Sin embargo, puesto que el vector de virus Sendai descrito la WO 2010/134526 Al es competente para la replicación, necesita ser removido con un esfuerzo considerable después de la reprogramación para asegurar un perfil de seguridad adecuado. Además, puesto que ni la velocidad de liberación de los ARNsi, que son usados en la WO 2010/134526 Al para la remoción de virus, ni la inhibición de la expresión mediada por ARNsi, alcanzarán el 100%, este método no puede obviar de manera suficiente los riesgos de salud asociados con el uso de virus vivos.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN En vista de la téenica anterior, el objetivo de la presente invención es proporcionar un vector viral novedoso que exhiba un perfil de seguridad mejorado y que sea capaz de expresar de manera eficiente una secuencia de ácido nucleico heteróloga durante un periodo de tiempo suficientemente prolongado. En particular, la presente invención tiene como propósito proporcionar métodos novedosos para la liberación y expresión de genes que codifican para proteínas terapéuticas en las células blancas como un método de terapia génica para varias enfermedades. Además, la presente invención tiene como propósito la liberación y la expresión genes que codifican para factores de reprogramación o programación celular para reprogramar al menos parcialmente células diferenciadas a una célula menos diferenciada que sea adecuada para usarse en la terapia de regeneración o para programar células para adoptar un estado diferenciado deseado.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método de expresión de al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula. El método puede ser un método in vitro o in vivo y comprende el paso de introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde el vector ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteína P utante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un factor de reprogramación o programación celular o una proteina terapéutica.

En una modalidad preferida, una célula al menos parcialmente diferenciada es reprogramada a una célula menos diferenciada por un método in vitro que comprende: (a) proporcionar una célula al menos parcialmente diferenciada de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina P mutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para factor de reprogramación celular.

En otra modalidad preferida, una célula a ser programada es programada a un estado diferenciado deseado por un método in vitro que comprende: (a) proporcionar una célula a ser programada de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula infectando la célula con un vector ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina P mutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un factor de programación celular.

En otra modalidad preferida más, es tratado un trastorno genético por un método in vivo que comprende administrar a un paciente un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga para inducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula del paciente, donde el ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina P mutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para una proteina terapéutica capaz de tratar el trastorno genético.

En otra modalidad preferida más, es tratado un trastorno genético por un método in vitro que comprende: (a) proporcionar una célula de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga y/o para permitir que la célula se expanda, donde el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina P mutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para una proteina terapéutica capaz de tratar el trastorno genético.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con una célula o una población de células preparadas por los métodos in vitro de la presente invención. Esta célula o población de células puede ser usada como un medicamento, en particular como un medicamento para usarse en terapia génica o terapia de regeneración.

En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una célula o una población de células preparadas por los métodos in vitro de la presente invención, o una célula de diferenciada o una población de células diferenciadas preparadas por el método in vitro de reprogramación de la presente invención.

Las modalidades preferidas de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención puede ser comprendida de manera más completa con referencia a la siguiente descripción detallada, los ejemplos, y las Figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra imágenes microscópicas de luz (parte superior) e imágenes de fluorescencia (parte inferior) de células Vero transducidas con VSe-PA2-77/GFP (proteina de fluorescencia verde) al día uno (di), dia seis (d6), dia doce (dl2) y dia treinta (d30) a una amplificación de lOOx.

La Figura 2 es una gráfica de barras que muestra la expresión de ARNm de fibroblastos de prepucio humano (HFF por sus siglas en ingles) transducidos con SeV-PA2-77/Oct4 a una MOI de 3 o 20, respectivamente, los dias dos, cinco, ocho y doce (d2, d5, d8 y dl2) en comparación con células HFF no transducidas como control negativo y un vector de lentivirus recombinante que alberga un transgen GFP y el transgen Oct4 como control positivo.

La Figura 3 es una gráfica de barras que muestra la expresión de ARNm de fibroblastos de prepucio humano (HFF por sus siglas en ingles) transducidos con SeV-PA2-77/Nanog con una MOI de 3 o 20, respectivamente, los dias dos, cinco, ocho y doce (d2, d5, d8 y dl2) en comparación con las células HFF no transducidas como control negativo y un vector de lentivirus recombinante que alberga un transgen de GFP y el transgen Nanog como control positivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método de expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga (algunas veces referida aquí "transgen") que codifica para un factor de reprogramación o programación celular o una proteina terapéutica en una célula. El método se basa en el uso de un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante especifico. Este vector de ARN virus de hebra negativa recombinante está diseñado para contener al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga y se caracteriza por su deficiencia de replicación siendo aún competente para la transducción en un grado que permite la producción eficiente de proteínas heterólogas de interés.

La presente invención no se relaciona con la vacunación en general y el uso del vector de ARN virus de hebra negativa recombinante como vacuna en particular. Es decir que, el factor de reprogramación o programación celular o una proteína terapéutica codificada por el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante no es usada, y típicamente no es adecuada, para propósitos de vacunación.

El método de la presente invención, el vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación, recombinante, es usado para infectar una célula (algunas veces referida aquí como "célula anfitriona"), introduciendo por lo tanto al menos una secuencia de ácido nucleico hetereróloga en la célula. El ácido nucleico introducido es ARN el cual no se integrará al genoma de la célula sino que permanecerá en el citoplasma donde sirve como molde para la ARN polimerasa dependiente del ARN viral (vRdRp) para generar una hebra de ARN positiva la cual es codificada por la maquinaria de traducción de la célula blanco para producir las proteínas heterólogas deseadas.

De manera sorprendente, se encontró que el método de la presente invención da como resultado altos niveles de expresión del transgen, mientras que al mismo tiempo tiene un perfil de seguridad superior. Durante la infección con el ARN virus deficiente para la replicación usado en la presente invención existieron muchos menos moldes o patrones presentes en comparación con el ARN virus natural. Considerando el número reducido de moldes o patrones, la expresión de la proteína heteróloga observada fue inesperadamente alta usando el ADN virus deficiente para la replicación descrito aquí.

Además, el método de la presente invención elimina el riesgo de transformación maligna asociada con la integración cromosomal, puesto que se considera que los ARN virus de hebra negativa no se iantegran en los cromosomas del anfitrión. Además, el riesgo de reexpresión subsecuente de genes integrados cromosómicamente que codifican para factores de reprogramación en las células diferenciadas es eliminado. También, el vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación no es transmitido a células sanas vecinas del paciente o del paciente a otros individuos o hacia el ambiente.

Además, las partículas virales de ARN de hebra negativa deficientes para la replicación se distribuyen uniformemente a través de las células hijas producidas en cada ciclo de cada división celular y, de este modo, se diluyen progresivamente hasta niveles indetectables. En otras palabras, el vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación queda completamente eliminado de las células blanco infectadas sin la necesidad de una purificación elaborada adicional como se describió en la téenica anterior.

Además, los vectores de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación de la presente invención evitan los riesgos asociados con persistencia del vector viral, como reacciones inmunes contra componentes virales, efectos retardados de la infección viral, reacción similar a una reacción autoinmune con autoantígenos, expresión alterada de los genes endógenos del anfitrión y eventos adversos impredecibles.

La capacidad del vector de ARN virus para transcribir su ARN genómico siendo a la vez deficiente para la replicación es el resultado de mutaciones en la proteína viral. La proteína P es parte de la ARN polimerasa dependiente del ARN viral (vRdRp) consistiendo de proteínas P y L. La vRdRp lleva acabo la transcripción viral y la replicación viral. Esas dos funciones están por lo tanto acopladas en ARN virus de hebra negativa. Se encontró que las mutaciones en la proteína P conducen a una perdida de la capacidad de replicación del genoma viral mientras que la capacidad de transcripción viral, la cual es esencial para la expresión de las secuencias de ácido nucleico heterólogas introducidas, no se pierde. En otras palabras, ciertas mutaciones en la proteína P desacoplan las actividades de replicación y transcripción de la vRdRp.

Después de la infección de una célula blanco, el ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación descrito aquí permite la expresión de las proteínas virales y las proteínas heterólogas codificadas por al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga incluida en el genoma viral. Para expresar el producto del gen heterólogo, los virus recombinantes usados en la presente invención deben ser capaces de llevar a cabo una transcripción primaria temprana. Como se usa aquí, el término "transcripción primaria temprana" pretende referirse a los primeros eventos transcripcionales en una célula anfitriona infectada, donde el genoma del ARN viral es transcrito por las moléculas de vRdRp que fueron originalmente incluidas en las partículas virales.

Además, el virus recombinante usado en la presente invención debe ser capaz de llevar a cabo la transcripción primaria tardía. El término "transcripción primaria tardía", como se usa aquí, pretende referirse a la fase en la cual comienza la síntesis de proteínas de novo y la transcripción es llevada a cabo de manera creciente por vRdRp recién sintetizada. En contraste con la transcripción primaria temprana, la replicación viral durante la transcripción primaria tardía depende de la síntesis de proteína de novo. Debe notarse que en la téenica anterior, pero no aquí, el término "transcripción secundaria" es algunas veces usado como sinónimo de la transcripción primaria tardía.

Tan pronto como hayan sido producidas cantidades suficientes de proteína N, la vRdRp cambia a un modo replicativo para sintetizar antigenomas. Del molde del antigenoma, son replicados nuevos genomas que son encapsulados con las proteínas N. Cuando el número de moldes o patrones para la transcripción viral en las células se incrementa, comienza la llamada fase de "transcripción secundaria", la cual exhibe una eficacia de transcripción mucho mayor que la transcripción primaria. Como se usa aquí, el término "transcripción primaria" pretende significar la transcripción primaria temprana y tardía, a menos que se establezca otra cosa.

Preferiblemente, la capacidad del vector del virus recombinante para llevar a cabo la transcripción primaria tardía es tal que la síntesis de proteína es al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, o al menos 5% de la síntesis de proteína viral de un virus natural correspondiente, es decir un virus sin la mutación en el gen P como se describe aquí. La actividad de transcripción primaria tardía es preferiblemente no más de 20 veces, preferiblemente no más de 10 veces menor que la de un virus natural correspondiente. La capacidad para la transcripción primaria tardía puede ser determinada por la determinación cuantitativa de la expresión de un producto de un gen heterólogo, por ejemplo una proteína reportera, como se describió (véanse, por ejemplo, los ejemplos 7.1 y 7.3 de la WO 2006/084746 Al, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia).

En relación con esto, deberá notarse que los niveles de expresión heteróloga mencionados anteriormente son inesperadamente altos en vista del hecho que durante la infección con un ARN virus natural (competente para la replicación) existen aproximadamente de 500 hasta aproximadamente 1000 veces más moldes o patrones presentes en comparación con el ARN virus deficiente para la replicación usado en la presente invención, el cual no es capaz de generar complejos de ribonucleoproteína (RNFs) que actúen como patrones o moldes para la transcripción y replicación.

Dentro del significado de la presente invención, una "pérdida de la capacidad de replicación" significa que en una célula blanca, es decir una célula que no proporcione y complemente ninguna función in trans que sea afectada por mutaciones en el gen P, ni capacidad de replicación residual, es decir ni amplificación del genoma viral, que sea detectable. En efecto, se considera que la replicación viral es completamente abolida. En contraste con la eficiencia de la replicación disminuida o condicional, no existen condiciones permisivas que permitan la replicación del genoma viral. La pérdida de la capacidad de replicación puede ser determinada como es descrito en la téenica (véase, por ejemplo, el ejemplo 8 de la WO 2006/084746 Al, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia).

El vector de ARN virus de hebra negativa recombinante usado dentro de la presente invención es derivado preferiblemente de un ARN virus de hebra negativa, no segmentado, del orden Mononegavirales, incluyendo las cepas naturales, cepas mutantes, cepas pasadas en laboratorio, cepas de vacunación, cepas construidas genéticamente, y similares. Como se usa aquí el término "vector de virus" se relaciona con ácido nucleico derivado de virus que puede ser transfectado en células y replicado dentro de o independientemente de un geno a celular, e incluye virus completos o partículas virales, o núcleos virales consistentes de genoma viral y proteínas asociadas. El vector de ARN virus de hebra negativa, deficiente para la replicación en la presente invención puede ser obtenido modificando genéticamente un ARN virus de hebra negativa inicial.

El virus del cual el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante es derivado puede ser seleccionado de ARN virus de hebra negativa pertenecientes a las familias Paramyxovirdae , Rhabdoviridae , Filovíridae , Bornaviridae , Arenaviridae o Bunyavirídae, o variantes recombinantes de los mismos. Especialmente preferido para usarse en la presente invención es un paramixovirus, por ejemplo el virus Sendai, parainfluenza virus (PIV por sus siglas en ingles), por ejemplo virus de la parainfluenza humana (hPIV por sus siglas en ingles) tipo 1, 2, 3, 4a o 4b, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la peste bovina, virus sincitial respiratorio humano (RSV por sus siglas en ingles), o un rhabdovirus, por ejemplo virus de la estomatitis vesicular (VSV por sus siglas en ingles) o virus de la rabia. En una modalidad especialmente preferida de la invención, el virus es el virus Sendai, por ejemplo la cepa Sendai Fushi i (ATCC VR105), la cepa Sendai Harris, la cepa Sendai Cantell o la cepa Sendai Z.

Un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante adecuado puede ser elegido dependiendo del tipo de célula a ser infectada y de la aplicación. Por ejemplo, el virus Sendai y virus de las paperas muestran una especificidad de célula anfitriona muy amplia. El virus Sendai puede infectar una variedad de células animales de muchos tipos de tejidos como células derivadas equino y linfocitos B de varios animales. De manera alternativa, puede ser deseable usar ARN virus de hebra negativa que tengan una especificidad por la célula anfitriona alta, por ejemplo, el virus del sarampión o virus de la peste bovina. También pueden ser usados virus con especificidad por la célula anfitriona modificada artificialmente.

De acuerdo con la presente invención, la proteina P mutante codificada por el genoma viral de ARN virus recombinante usado en la presente invención contiene al menos una mutación que conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral. Al menos una mutación no está restringida a un tipo particular de mutación e incluye supresiones, constituciones y/o inserciones, siempre que den como resultado una pérdida de la capacidad de replicación sin una pérdida de la capacidad de transcripción viral, preferiblemente sin una pérdida de la capacidad de transcripción primaria temprana y/o tardía.

La mutación afecta a la región N-terminal de la proteína P del ARN virus de hebra negativa respectivo. Preferiblemente, al menos una mutación en el gen P es una supresión, inserción o reemplazo de uno o más aminoácidos de o en la secuencia de aminoácidos 2 a 77 (numeración como, por ejemplo, en la WO 2006/084746 Al), en particular de o en la secuencia de aminoácidos 33 a 41, de la proteína P del virus Sendai o, en el caso de un virus diferente al Sendai, de o en la secuencia de aminoácidos correspondiente a u homologa a la secuencia de aminoácidos 2 a 77, en particular la secuencia de aminoácidos 33 a 41, de la proteína P del virus de Sendai.

Dentro del significado de la presente invención, el término "homologa" se refiere a un grado de homología de al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. En modalidades más preferidas, el término "homólogo" significa valores de identidad de aminoácidos de más de 45%, 55%, 65%, 75%, 85% o 95%.

Particularmente preferida es una supresión de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos 2 a 77 de la proteína P del virus de Sendai o, en el caso de un virus diferente al Sendai, de la secuencia de aminoácidos correspondiente u homologa en una proteína P equivalente de del virus diferente al virus Sendai. Más preferida es una supresión de los aminoácidos 2 a 77 o 33 a 41 del virus Sendai o, en el caso de un virus diferente al Sendai, una supresión de la secuencia de aminoácidos correspondiente u homologa o en una proteina P equivalente del virus diferente al virus Sendai. Además, la región C-terminal de la proteina P del virus Sendai corriente abajo del aminoácido 320, o en la región C-terminal correspondiente u homologa de una proteina P equivalente de un virus diferente al Sendai, preferiblemente no incluye mutaciones puesto que se piensa que región C-terminal es esencial para la transcripción viral.

Además de las mutaciones en el gen P descritas anteriormente, el vector viral de ARN recombinante puede albergar mutaciones adicionales en uno o más genes virales diferentes, lo cual preferiblemente hace disminuir la propagación viral o citotoxicidad viral, alterar la especificidad de celular viral o mediar atenuación del virus. Por ejemplo, el vector de ARN viral recombinante puede adicionalmente tener mutaciones o supresiones en uno de los genes que codifican para proteínas de la envoltura viral.

También, el vector de ARN viral recombinante puede tener una o más mutaciones en los marcos de lectura abierta (ORFs por sus siglas en ingles) C, W, y/o V como resultado de las supresiones N-terminales de la proteina P viral, debido a que los ORF C, W, y V que se superponen con el ORF N-terminal del gen P. Además, el vector de ARN viral recombinante usado aqui puede tener adicionalmente una supresión del codón de inicio alternativo ACG del gen C' . El gen C' codifica para una proteina no estructural que se sabe exhibe una actividad de respuesta anti-IFN en células infectadas. Se encontró que la supresión del codón de inicio del gen C' da como resultado un incremento en la expresión de productos genéticos heterólogos en células blanco infectadas. Típicamente, el incremento así alcanzadle en la expresión del transgen es al menos aproximadamente 5%, preferiblemente al menos aproximadamente 10% y de manera más preferible al menos aproximadamente 20%.

De acuerdo con la presente invención, el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante comprende además al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica para un producto del gen heterólogo. Como se usa aquí, el término "heterólogo" pretende referirse a una proteína o derivado de ácido nucleico de una fuente diferente a la del vector de ARN virus de hebra negativa deficiente en replicación que es usado dentro de la presente invención. El producto del gen heterólogo es preferiblemente una proteína, en particular un factor de reprogramación que media o facilita la reprogramación celular de una célula a un estado menos diferenciado, un factor de programación que diferencia una célula dada en un estado diferenciado deseado, y una proteina terapéutica. Sin embargo, también puede ser una ribozima, una molécula antisentido, una molécula de ARNsi, un ARNmi, o una molécula de ARpi. La secuencia de ácido nucleico heteróloga es incluida típicamente en el geno a viral y ligada operativamente con las secuencia de control de expresión apropiadas.

Como se usa aquí, el término "factor de reprogramación" o "factor de reprogramación celular" pretende referirse a un producto del gen heterólogo, preferiblemente una proteína o un ARNmi, que es capaz de convertir una célula al menos parcialmente diferenciada a una célula menos diferenciada, ya sea por sí mismo o en combinación con otros genes o productos del gen heterólogo. También incluidas dentro del término "factor de reprogramación", como se usa aquí, son factores auxiliares que facilitan la reprogramación celular (es decir, aquellos factores auxiliares que incrementan la eficiencia de la reprogramación celular). Los factores de reprogramación celular son típicamente proteínas codificadas por genes que son expresados en células no diferenciadas embriónicas o en el embrión inicial, pero que no son expresadas o exhiben una disminución de la expresión en la mayoría de las células somáticas diferenciadas. Esos genes específicos de células no diferenciadas embriónicas son típicamente factores de transcripción y nucleoproteínas.

Los factores de reprogramación celular preferidos para usarse en esta invención se seleccionan del grupo que consiste de Oct-3, Oct-4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, Lin28, ASCL1, MYT1L, TBX3b, SV40 grande T, hTERT, miR-291, miR-294, miR-295, y combinaciones de los mismos.

El "factor de programación" codificado por al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga pretende significar un factor que es capaz de diferenciar una célula dada a un estado diferenciado deseado. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, factor del crecimiento nervioso (NGF por sus siglas en ingles), factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF por sus siglas en ingles), interleucina 6 (IL-6), proteína morfogénica ósea (BMP por sus siglas en ingles), neurogenina 3 (Ngn3), homeobox pancreática y duodenal 1 (Pdxl), Mafa, y combinaciones de las mismas.

Las proteínas terapéuticas para usarse en la presente invención comprenden formas biológicamente activas de proteínas que son disfuncionales, típicamente como resultado de mutaciones, en trastornos genéticos, como la adenosina desaminasa (ADA por sus siglas en ingles) en deficiencia inmune combinada severa, p91-PHOX en el desorden granulomatoso crónico, factor IX en la hemofilia B, factor VIII en la hemofilia A, regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quistica (CFTR por sus siglas en ingles) en la fibrosis quistica, b-globina (HBB por sus siglas en ingles) en anemia de células falciformes, distrofina en la distrofia muscular de Duchenne, hipoxantinguaninfosforribosil-transferasa (HGPRT por sus siglas en ingles) en el síndrome de Lesch-Nyhan, fenilalanina hidroxilasa (PAH por sus siglas en ingles) en la fenilcetonuria, glucosilceramidasa (GBA y GBA2 por sus siglas en ingles) en la enfermedad de Gaucher, fibrilina-1 (FBNl por sus siglas en ingles) en el síndrome de Marfan, y huntingtina (HTT por sus siglas en ingles) en la enfermedad de Huntington, y combinaciones de las mismas.

El método de la presente invención también puede ser usado para el tratamiento de trastornos genéticos multifactoriales mediante la liberación de uno o más genes terapéuticos. Por ejemplo, los genes terapéuticos para el tratamiento de la hipercolesterolemia incluyen la apolipoproteína B (apoB), receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR por sus siglas en ingles), proteína adaptadora del receptor de lipoproteína de baja densidad 1 (LDLRAP1), proteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), y combinaciones de las mismas. Además, los genes terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson incluyen sinucleina alfa (SNCA por sus siglas en ingles), parkina (PRKN por sus siglas en ingles), cinasa 2 repetida rica en leucina (LRRK2 por sus siglas en ingles), cinasa 1 putativa inducida por PTEN (PINK1 por sus siglas en ingles), proteina 7 de parkinson (DJ-1), y ATPasa tipo 13A2 (ATP13A2). Además, los genes terapéuticos para el tratamiento del cáncer incluyen genes suicidas del cáncer, factores antiangiogénicos, y autoantigenos del cáncer, incluyendo la proteina 2 relacionada con la tirocinasa (TRP-2 por sus siglas en ingles) y antígenos carcinoembriónico (CEA por sus siglas en ingles).

Las proteínas terapéuticas adecuadas, en particular para usarse en la in unoterapia del cáncer, pueden incluir además factores estimuladores inmunes, como factores del crecimiento incluyendo el factor estimulante de la colonia de granulocitos de macrófagos (GM-CSF por sus siglas en ingles) y factor del crecimiento epitelial (EGF por sus siglas en ingles), y citosinas incluyendo las interleucinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-12 e IL-17, asi como proteínas inmunosupresoras como los interferones.

Las secuencias de ácido nucleico heterólogas incorporadas en el vector de ARN virus deficiente para la replicación pueden ser derivadas de humanos u otros mamíferos dependiendo de la aplicación y la célula blanco en la cual vayan a ser liberadas las secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos codificadas no necesariamente tienen que ser secuencias naturales en tanto los productos del gen heterólogo muestren actividad funcional comparable a la del producto del gen natural. Las secuencias de ácido nucleico pueden albergar intercambios, inserciones o supresiones de nucleótidos. Los productos del gen heterólogo pueden ser expresados como proteínas de fusión, por ejemplo que comprendan adicionalmente una marca, preferiblemente una marca de VP16.

Si se desea una alta expresión de la secuencia de ácido nucleico heteróloga, la secuencia es insertada preferiblemente en la región 3' del genoma del ARN de hebra negativa viral, de manera preferible directamente antes del gen N viral. La razón es que los ARN virus de hebra negativa como los paramixovirus trascriben de manera más eficiente unidades de transcripción en el extremo 3' de su genoma de hebra negativa. Los niveles de transcripción de los genes más corriente abajo disminuyen gradualmente, un fenómeno que es conocido como efecto de la polaridad. Esto permite la regulación del nivel de expresión de un transgen heterólogo insertando esté en diferentes sitios en el genoma viral. En consecuencia, una secuencia de ácido nucleico que codifique para un producto de un gen heterólogo con potencial citotóxico u oncogénico (por ejemplo C-Myc) puede ser insertado en la región 5' del genoma de hebra negativa viral. De manera conveniente, las secuencias de ácido nucleico heterólogas pueden ser insertadas como casetes transcripcionales. Varias secuencias de ácido nucleico heterólogas pueden ser insertadas como casetes transcripcionales independientes en el genoma viral. Un casete transcripcional usualmente comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para el producto del gen heterólogo ligado operativamente a una secuencia de inicio de la transcripción, un terminador transcripcional, y señales de traducción preferiblemente.

También es posible ligar operativamente una secuencia de ácido nucleico heteróloga con un elemento estabilizador de ARNm. Por ejemplo, un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck (WPRE por sus siglas en ingles) puede ser insertado en la región 3'UTR del transgen para estabilizar su ARNm y prolongar su expresión.

En el contexto de la presente invención, el vector de ARN de virus de hebra negativa deficiente para la replicación puede albergar más de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifique para un producto del gen heterólogo. De manera alternativa, más de un vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación, cada uno de los cuales albergue al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifique para un producto del gen heterólogo, puede ser usado de manera concurrente. Por ejemplo, el vector de ARN de virus de hebra negativa deficiente para la replicación puede comprender varias secuencias de ácido nucleico heteróloga que codifiquen para diferentes factores de reprogramación. De manera alternativa, vectores de ARN de virus de hebra negativa deficientes para la replicación múltiples que alberguen diferentes secuencias de ácido nucleico heteróloga que codifiquen para diferentes factores de reprogramación pueden ser usados simultáneamente.

El vector de ARN de virus de hebra negativa deficiente para la replicación puede ser proporcionado en forma de una solución, suspensión, liofilizado, o en cualquier forma alternativa. También puede ser proporcionado en combinación con agentes ajustadores del pH, amortiguadores, agentes para ajustar la toxicidad como cloruro de sodio o dextrosa, agentes humectantes, adyuvantes y similares.

La dosis de vector viral apropiada depende de la aplicación pretendida, la condición física, peso, edad y sexo del paciente, la forma de administración, y la composición. Típicamente, el número de partículas de vector varía de al menos 1 x 104a 1 x 108, preferiblemente de 5 x 105 a 1 x 107, por dosis dependiendo de la aplicación. En otras palabras, la infección con el vector viral recombinante de la invención preferiblemente será llevada a cabo con una multiplicidad de infección (MOI por sus siglas en ingles) de 0.01 a 50, de manera más preferible de 0.5 a 30, dependiendo de la aplicación.

Los vectores de ARN de virus de hebra negativa deficientes para la replicación de la presente invención, pueden ser preparados como se describe en la WO 2006/084746 Al, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia, por medio de células productoras de virus y células amplificadoras de virus.

Las células productoras de virus son usadas para la producción inicial de partículas virales. La célula productora de virus es preferiblemente una célula eucariótica, de manera más preferible una célula de mamífero. La célula productora de virus, preferiblemente comprende la molécula de ADN que codifica para el vector de ARN virus deficiente para la replicación usado en la presente invención, así como secuencias auxiliares cuyos productos genéticos permitan el montaje de las partículas virales recombinantes de la presente invención in trans. Las secuencias auxiliares comprenden la proteína N viral, la proteína P viral, y/o la proteína L viral, preferiblemente la proteína N viral y la proteína P viral.

La célula auxiliar puede comprender uno o varios vectores plasmídicos adicionales, que proporcionen la proteina N viral, proteina P viral, y/o la proteina L viral in tans. Preferiblemente, las secuencias auxiliares comprenden el gen P viral y adicionalmente el gen N viral puesto que se encontró, de manera sorprendente, que la producción de partículas virales puede ser incrementado significativamente coexpresando los genes N y P virales. De manera alternativa, puede ser usada una célula auxiliar que exprese de manera estable secuencias auxiliares que estén integradas en su genoma.

Las secuencias auxiliares son preferiblemente ligadas operativamente con una señal transcripcional que permita la transcripción por una ARN polimerasa dependiente del ADN en la célula productora de virus. Preferiblemente, la señal transcripcional es una señal transcripcional heteróloga para la célula heteróloga de virus dada, por ejemplo un promotor de bacteriófago como un promotor T7 o SP6. En este caso la célula productora de virus debe comprender la ARN polimerasa dependiente del ADN heteróloga, por ejemplo la ARN polimerasa T7 o SP6, la cual media la transcripción de las secuencias auxiliares.

La molécula de ADN que codifica para el ARN virus deficiente para la replicación usado en la presente invención es preferiblemente un vector (por ejemplo, un vector plasmídico) que no únicamente es adecuado para la propagación en una célula amplificadora del vector (es decir, una célula de amplificación de vector procariótica como E. coli) , sino también en una célula auxiliar eucariótica, en particular una célula productora de virus de mamífero. El vector comprende los elementos genéticos necesarios para la propagación en las células, como un origen de replicación, y/o secuencias marcadoras de selección.

La molécula de ADN que codifica para el genoma viral está comúnmente ligada operativamente con una señal transcripcional como se describió anteriormente en relación con las secuencias auxiliares. Generalmente, la molécula de ADN comprende además un terminador transcripcional y una secuencia de ribozima 3' de la secuencia de ADN que codifica para el genoma viral. La secuencia de ribozima permite la escisión del transcripto en el extremo 3' de la secuencia viral.

La célula amplificadora de virus es usada para amplificar las partículas de virus inicialmente ensambladas en la célula productora de virus. El ARN virus deficiente para la replicación recombinante obtenido de la célula productora de virus es usado para infectar la célula amplificadora de virus. La célula amplificadora de virus contiene secuencias auxiliares como se describió anteriormente, las cuales proporcionan la proteina N viral, la proteina P viral, y/o la proteina L viral. Preferiblemente, es usada una célula amplificadora de virus que expresa de manera estable secuencias auxiliares en las cuales están integradas en su genoma. Preferiblemente, las células amplificadoras de virus son modificadas genéticamente para expresar únicamente las proteínas virales N y P, pero no la proteína L viral, puesto que se encontró, de manera sorprendente, que esta coexpresión conduce a las tasas de producción de virus más altas.

Preferiblemente, la célula amplificadora de virus es una célula de mamífero. En particular la célula, la célula amplificadora de virus puede ser la célula H29 depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares bajo el número de acceso DSMACC2702. Otras células amplificadoras de virus adecuadas son células derivadas de células Vero (una línea celular de riñón de mono verde Africano) o células derivadas de células LLCMK2 (una línea celular de riñón de mono Rhesus), las cuales son transfectadas de manera estable o transitoria con las secuencias auxiliares mencionadas (es decir, el gen N, P, y/o L viral).

De acuerdo con el método de la presente invención, una variedad de células diferentes pueden ser infectadas con el vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación para introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga. Los ejemplos de células que pueden ser infectadas con el vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos de prepucio humano, células no diferenciadas hematopoyéticas humanas (células CD34+), células dendríticas, células T, células B, macrófagos, células de tejido mucoso, hepatocitos, fibroblastos de pulmón y células epiteliales.

Las células a ser infectadas pueden ser obtenidas o derivadas de cualquier organismo anfitrión. La célula puede ser tomada directamente de un organismo anfitrión respectivo en forma de una muestra, como una biopsia o una muestra de sangre. También puede ser una célula que haya sido obtenida de un organismo anfitrión y posteriormente cultivada, crecida, transformada o expuesta a un tratamiento seleccionado. En algunas modalidades, la célula puede ser incluida en un organismo anfitrión. Por ejemplo, puede estar presente en la sangre o en un órgano del organismo anfitrión.

El organismo anfitrión del cual la célula es derivada u obtenida, es preferiblemente un mamífero y especialmente preferido un humano. Los mamíferos ejemplares son seleccionados de, pero no se limitan a, el grupo consistente de rata, ratón, cone o, cobayo, ardilla, hámster, protus, ornitorrinco, perro, cabra, caballo, cerdo, elefante, pollo, macaco y chimpancé.

En una modalidad preferida, el método de la presente invención es un método in vifcro de reprogramación de una célula al menos parcialmente diferenciada a una célula menos diferenciada o programación de una célula a ser programada a un estado diferenciado deseado, el método comprende: (a) proporcionar la célula al menos parcialmente diferenciada o una célula a ser programada de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula proporcionada en el paso (a) infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde el vector ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina P mutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin pérdida de la capacidad de transcripción viral, y donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un factor de reprogramación o programación celular.

El término "diferenciada", como se usa aquí, pretende referirse a una célula que exhibe una potencia restringida en comparación con células no diferenciadas pluripotentes. El término "potencia" significa el potencial de diferenciación de una célula, esto es el potencial de una célula para diferenciarse en diferentes tipos de célula. De este modo, en el contexto de la presente invención las células diferenciadas representan a todas las células que están más diferenciadas que las células no diferenciadas pluripotentes y que incluyen células que aún poseen la capacidad para diferenciarse en linajes celulares múltiples, pero no todos. Las células diferenciadas incluyen, en particular, células somáticas. Igualmente, el término "diferenciación", como se usa aqui, pretende referirse a la adaptación de las células a una forma o función particular. La diferenciación conduce a una célula más comprometida, es decir, una célula que se considera está permanentemente comprometida a una función especifica, como una célula diferenciada terminalmente.

Además, el término "reprogramación" o "diferenciación", como se usa aqui, se refiere a la conversión del estado diferenciado de una célula particular, a un estado menos diferenciado. Los términos "reprogramación" y "diferenciación" sin usados de manera intercambiable aqui y se refieren a una pérdida de la especialización en la forma o función. La diferenciación conduce a una célula menos comprometida. De este modo, se refiere al incremento del grado de potencia de una célula particular, e incluye convertir una célula diferenciada terminalmente a una célula oligopotente, preferiblemente a una multipotente, o más preferiblemente a una pluripotente. También incluye convertir el estado diferenciado de una célula que exhiba potencia restringida en comparación con células multipotentes, como una célula oligopotente o una multipotente, a un estado menos diferenciado. En el contexto de la presente invención, reprogramación o diferenciación significa revertir una célula diferente a una célula no diferenciada pluripotente a su estado inicial o cualquier estado intermedio en su camino de diferenciación.

Dentro del contexto de la presente invención, una célula "al menos parcialmente diferenciada", como se usa aquí, se refiere a una célula que constituye el cuerpo de un organismo multicelular, excluyendo un gameto, una célula germinal, un gametocito o una célula no diferenciada pluripotente. Los ejemplos de células parcialmente diferenciadas incluyen, por ejemplo, células no diferenciadas somáticas, células no diferenciadas restringidas por el linaje, células precursoras, y células progenitoras. Los ejemplos de células (más) diferenciadas incluyen células somáticas, como células somáticas diferenciadas terminalmente. Preferiblemente, la célula al menos parcialmente diferenciada es una célula de mamífero seleccionada de una célula no diferenciada somática, una célula no diferenciada restringida por el linaje, una célula precursora, una célula progenitora, y una célula somática diferenciada terminalmente.

El término "célula no diferenciada", como se usa aquí, se refiere a una célula de organismos multicelulares que puede proliferar indefinidamente y tiene la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en diversos tipos de células especializadas. Las células no diferenciadas incluyen células no diferenciadas embriónicas (por ejemplo células no diferenciadas pluripotentes, derivadas de la masa celular interna de los blastocistos) y células no diferenciadas adultas también conocidos como "células no diferenciadas somáticas" (es decir, células no diferenciadas multipotentes encontradas en varios tejidos que actúan como sistema de reparación para el cuerpo, reabasteciendo los tejidos adultos). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células no diferenciadas mesenquimales, células no diferenciadas he atopoyéticas y células no diferenciadas neurales. También se incluyen las llamadas células no diferenciadas del cáncer. Se ha encontrado que muchos tipos de cáncer incluyen esas células no diferenciadas del cáncer, las cuales se caracterizan por su capacidad de autorrenovación y capacidad de diferenciación. Las células no diferenciadas del cáncer se asemejan a las progenitoras de las cuales surgieron, pero expresan un programa asociado con la autorrenovación, normalmente expresado en células no diferenciadas.

Una "célula precursora" dentro del significado de la presente invención es una célula no diferenciada que se ha desarrollado hasta una etapa donde está comprometida con la diferenciación en una o más formas finales. Las células precursoras están por ejemplo comprometidas a formar un tipo particular de células rojas nuevas, células no diferenciadas restringidas por el linaje, o células no diferenciadas somáticas.

Una "célula progenitora" dentro del significado de la presente invención es una célula unipotente o multipotente, la cual tiene la capacidad de diferenciarse en un tipo especifico de célula, por ejemplo, una célula somática madura, y tiene una capacidad limitada de autorrenovación. Los ejemplos de células progenitoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células progenitoras neuronales, células progenitoras endoteliales, células progenitoras eritroides, células progenitoras cardiacas, células progenitoras oligodendrociticas, células progenitoras retínales, o células progenitoras hematopoyéticas.

Una "célula somática" dentro del significado sentido de la presente invención es cualquier célula al menos parcialmente diferenciada y no incluye células germinales o gametos. Una célula somática para usarse en la presente invención puede ser una célula de cualquier tejido, incluyendo la piel, riñón, bazo, glándulas adrenales, hígado, pulmón, ovario, páncreas, útero, estómago, colon, intestino delgado, bazo, vejiga, próstata, testículos, timo, músculo, tejido conectivo, hueso, cartílago, tejido vascular, corazón, ojo o tejido neural. Los ejemplos de células somáticas adecuados incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, células mieloides, linfocitos B, linfocitos T, células óseas, células de médula ósea, pericitos, células dendríticas, queratinocitos, células adiposas, células mesenquimales, células epiteliales, células epidérmicas, células endoteliales, condrocitos, células de cúmulos, células neuronales, células gliales, astrocitos, células cardiacas, células esofágicas, células musculares (por ejemplo, células de músculo liso o células de músculo esquelético), células beta pancreáticas, melanocitos, células hematopoyéticas, miocitos, macrófagos, monocitos, y las células mononucleares.

Una "célula somática diferenciada terminalmente" en el significado de la presente invención es una célula en la etapa final de una vía de diferenciación. Una célula diferenciada terminalmente es una célula madura que ha experimentado cambios de desarrollo progresivos hasta una forma o función más especializada. Las células diferenciadas tienen distintas características, efectúan funciones especificas, y es menos probable que se dividan en sus contrapartes menos diferenciadas.

La célula al menos parcialmente diferenciada, la cual es reprogramada de acuerdo con el método de la presente invención, no se limita particularmente a un organismo especifico e incluye, pero no se limita a, los organismos mencionados aquí anteriormente. También, el tipo de célula no está particularmente limitado e incluye, pero no se limita a, las células mencionadas anteriormente. Preferiblemente, la célula a ser reprogramada es una célula somática diferenciada terminalmente.

Dentro del significado de la presente invención, la "célula menos diferenciada", que es generada por el método de reprogramación in vitro de la presente invención, es una célula que tiene un mayor grado de potencia en comparación con la célula original que está al menos parcialmente diferenciada. Preferiblemente, el método de reprogramación in vitro de una célula al menos parcialmente diferenciada a una célula menos diferenciada se caracteriza porque la célula al menos parcialmente diferenciada es reprogramada a una célula oligopotente, ultipotente o pluripotente.

Una "célula pluripotente" significa una célula que tiene el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales, ectodermo, mesodermo y endodermo. "Pluripotentes" se refiere a un grado de potencia menor que la omnipotencia (el potencial de una célula para dar lugar a todas las células de un organismo).

Una "célula multipotente" significa una célula que tiene el potencial de diferenciarse en células de linajes múltiples pero en un número limitado. Esto se refiere a un grado de potencia menor que la pluripotencia. Las células no diferenciadas multipotentes son células no diferenciadas que se diferencian normalmente sólo en tipos celulares específicos para su tejido y órgano de origen. Las células no diferenciadas multipotentes están implicadas no únicamente en el crecimiento y desarrollo de varios tejidos y órganos durante los periodos fetal, neonatal y adulto, sino también en el mantenimiento de la homeostasis del tejido adulto y la función de inducir regeneración tras el daño tisular. Las células multipotentes específicas de un tejido son llamadas colectivamente "células no diferenciadas adultas".

Una "célula oligopotente" significa una célula que tiene el potencial de diferenciarse en unos cuantos tipos de células. "Oligopotente" se refiere a un grado de potencia menor que la ultipotencia.

Preferiblemente, las células menos diferenciadas generadas por el método de reprogramación de la presente invención son "células no diferenciadas pluripotentes inducidas (iPS por sus siglas en inlges)". En el contexto de la presente invención, el término "célula no diferenciada pluripotente inducida" o el término "célula iPS" pretende referirse a un tipo de célula no diferenciada pluripotente derivada artificialmente de una célula al menos parcialmente diferenciada, es decir, una célula no pluripotente, típicamente una célula somática, por expresión heteróloga de factores de reprogramación asociados con la célula no diferenciada específica. Las células iPS son similares a las células no diferenciadas pluripotentes naturales, como las células no diferenciadas embriónicas, con respecto a muchos aspectos, como los patrones de expresión génica asociados con la célula no diferenciada, los patrones de metilación de cromarina, el tiempo de duplicación, la formación del cuerpo ebriónico, la formación del teratoma, la formación una quimeras viable, la potencia y capacidad de diferenciación.

El término "célula no diferenciada pluripotente", como se usa aquí, se refiere a una célula no diferenciada que tiene el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales, ectodermo, mesodermo y endodermo. Las "células no diferenciadas pluripotentes" incluyen células no diferenciadas pluripotentes naturales como células no diferenciadas ebriónicas (ES por sus siglas en ingles) y células no diferenciadas pluripotentes inducidas (IPS por sus siglas en ingles). Las células no diferenciadas embriónicas son derivadas de la masa celular dentro de los blastocistos que tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula, excepto las células de la placenta u otras células de soporte del útero, y por lo tanto no pueden formar nuevos organismos vivos.

La pluripotencia puede ser evaluada por la capacidad de las células para formar una quimera, una mezcla de células de dos o más organismos, después de combinar las células no diferenciadas respectivas o células similares a células no diferenciadas con los blastocistos de un embrión que forme posteriormente un organismo completamente integrado a partir de la mezcla celular. Una forma más de evaluar la pluripotencia es la inyección de las células no diferenciadas respectivas debajo de la piel de un ratón donde puedan formar un teratoma. Un método de evaluación más es la complementación tetraploide, una prueba ín vivo que mide la pluripotencia de células correspondientes por su inyección en embriones 4N que son incapaces de diferenciarse adicionalmente. El embrión normal 2N resultante continúa desarrollándose a partir de las células pluripotentes importadas.

El estado de diferenciación de una célula también puede ser evaluado microscópicamente sobre la base del fenotipo presentado por la célula. La icroespectroscopía Raman o la espectroscopia FT-IR son téenicas adecuadas para evaluar el estado de diferenciación en este respecto. De manera alternativa, el estado de diferenciación de una célula puede ser evaluado midiendo la cantidad de marcador del estado de diferenciación de una célula, típicamente una proteína celular. El marcador de la diferenciación puede ser detectado a nivel de ARNm o proteína usando varias técnicas como hibridación de microarreglo o tinción de anticuerpo. Generalmente, es ventajoso seleccionar una combinación de varios marcadores para evaluar el estado de diferenciación de una célula.

Los ejemplos de proteínas marcadoras del estado de diferenciación de una célula incluyen, pero no se limitan a, Nanog, Oct-3/4, Sox2, Sall4, Tcll, Tbx3, Eras, Klf2, Klf4, Klf5, Baf250a, BC031441, Eno3, Etv5, Gml739, Gtf2h3, Hes6, Jub, Mtf2, Myodl, Nmycl, Notch4, Nr5a2, Nrg2, Otx2, Rab2b, Rbpsuh, Rest, Stat3, Utfl, Tcfap2c y Zfp553, o el estado de metilación del promotor de una de Nanog, Oct4, Sox2, Sall4, Tcll, Tbx3, Eras, Klf2, Klf4, Klf5, Baf250a, BC031441, Eno3, Etv5, Gml739, Gtf2h3, Hes6, Jub, Mtf2, Myodl, Nmycl, Notch4, Nr5a2, Nrg2, 0tx2, Rab2b, Rbpsuh, Rest, Stat3, Utfl, Tcfap2c, y Zfp553.

Las células iPS preparadas de acuerdo con la presente invención típicamente expresan fosfatasa alcalina, un marcador de células similares a ES. Además, las células iPS de la presente invención usualmente expresan Oct-3/4 o Nanog endógeno, en particular, ambos de Oct-3/4 y Nanog. Además, preferiblemente expresan de TERT, y muestran actividad de telomerasa.

Dentro de la presente invención, también puede ser usada una combinación de diferentes factores de reprogramación para inducir la reprogramación celular de una célula a ser reprogramada. Varios genes que codifican para factores de reprogramación pueden ser insertados en el mismo vector de ARN virus deficiente tras la replicación. De manera alternativa, diferentes secuencias de ácidos nucleicos que codifican para diferentes factores de reprogramación pueden ser cada uno insertados en vectores virales deficientes para la replicación separados. El vector de ARN virus deficiente para la replicación usado en la presente invención también puede ser usado en combinación con uno o más vectores de un tipo diferente que alberguen una o más secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que codifiquen para proteínas heterólogas de interés.

Los factores de reprogramación expresados del vector de ARN virus deficiente para replicación empleados aquí pueden ser usados en combinación con compuestos que faciliten la reprogramación celular, incluyendo inhibidores de bFGF, SCF, MAP cinasa, inhibidores de ADN metilasa (por ejemplo, 5-azacitidina), e inhibidores histona desacetilasa (por ejemplo, ácido suberoilanilido hidroxámico (SAHA por sus siglas en ingles), tricostatina A (TSA por sus sigas en ingles) y ácido valproico (VPA por sus siglas en ingles)). La adición de esos compuestos también puede limitar el número de factores de reprogramación necesarias para la inducción de la reprogramación celular. Además, la liberación de factores de reprogramación en células somáticas usando ARN virus deficiente para la replicación puede ser combinada con tratamiento químico de la célula somática para inducir la expresión endógena de factores de reprogramación endógenos adicionales.

En el método de programación in vitro de la presente invención, las células a ser programadas a un estado diferenciado deseado son células somáticas diferenciadas terminalmente que incluyen, pero no se limitan, a las células mencionadas aquí anteriormente, es decir fibroblastos de prepucio humano, células no diferenciadas hematopoyéticas humanas (células CD34+), células dendríticas, células T, células B, macrófagos y células de tejido mucoso, hepatocitos, fibroblastos de pulmón, y células epiteliales.

Dentro del contexto de la presente invención, las células obtenidas por el método de reprogramación in vitro, típicamente células similares a las no diferenciadas, pueden ser usadas para obtener células diferenciadas particulares de interés. Esas células, al igual que las células obtenidas por el método de reprogramación in vitro de la presente invención, pueden, por ejemplo, ser usadas en medicina regenerativa con la ventaja de que las células del mismo individuo pueden ser usadas para proporcionar células de un tipo de células seleccionado. Como un ejemplo ilustrativo, las células no diferenciadas hematopoyéticas humanas puede ser usada en tratamientos médicos que requieran trasplante de médula ósea. Esas células también pueden ser usadas en la formación de una o más líneas celulares.

Se espera que las células obtenidas de acuerdo a la invención sean adecuadas para usarse en el tratamiento de muchas condiciones fisiológicas y enfermedades, por ejemplo enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis múltiple, cánceres en etapa tardía como el cáncer de ovario y leucemia, y enfermedades que comprometan al sistema inmune, como infección con V1H ("SIDA"). Los ejemplos adicionales de condiciones fisiológicas que pueden ser tratados incluyen, pero no se limitan a, lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes, enfermedades hepáticas, es decir, hipercolesterolemia, enfermedades cardiacas, reemplazo de cartílago, quemaduras, úlceras de pie, enfermedades gastrointestinales, enfermedades vasculares, enfermedad renal, enfermedades del tracto urinario, y enfermedades y condiciones relacionadas con el envejecimiento.

En otra modalidad preferida, el método de expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula es un método in vivo para tratar un trastorno genético, el método comprende administrar a un paciente un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga para producir al menos una existencia de ácido nucleico heteróloga en una célula del paciente, donde el ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina premutante, lo cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sin una pérdida de la capacidad de transducción viral, y donde la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína terapéutica capaz de tratar el trastorno genético.

En una modalidad preferida más, el método de expresión de la secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula es un método in vitro para tratar un trastorno genético, el método comprende: (a) proporcionar una célula de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula proporcionada en el paso (a) infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos la secuencia de ácido nucleico heteróloga, para permitir que la célula se expanda, donde el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina P mutante, el cual conduce a una pérdida de la capacidad de replicación del genoma viral sino una pérdida de la capacidad de transducción viral, y donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para una proteina terapéutica capaz de tratar un trastorno genético.

El trastorno genético a ser tratado por los métodos in vivo e in vitro de la presente invención es seleccionado preferiblemente del grupo que consiste de deficiencia inmunológica combinada severa, trastorno granulomatoso crónico, hemofilia A/B, fibrosis quistica, anemia de células falciformes, atrofia muscular de Duchenne, síndrome de Lesch-Nyhan, fenilcetonuria, enfermedad de Gaucher, síndrome de Marfan, enfermedad de Huntington, hipercolesterolemia, enfermedad de Parkinson, síndrome de DiGeorge, enfermedad de Alzheimer, y cáncer.

Los métodos de terapia genética pueden ser llevados a cabo in vitro o in vivo, dependiendo del trastorno genético a ser tratado de célula a ser infectada. Para los métodos de terapia genética in vivo, el vector de ARN virus de hebra negativa deficiente para la replicación puede ser administrado de la manera usual, por ejemplo oralmente, tópicamente, nasalmente, pulmonarmente, etc. en forma de aerosoles, soluciones, polvos y similares. Los métodos de terapia genética in vivo pueden tener como blanco trastornos genéticos que afecten células sanguíneas. En este caso el vector de ARN virus de hebra negra negativa deficiente para la replicación debe ser suministrado parenteralmente. Si las células de pulmón son el blanco, la composición farmacéutica que contiene el vector de ARN virus de hebra negra deficiente para la replicación puede ser administrado pulmonarmente.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una célula o una población de células preparadas por los métodos in vitro de la presente invención, en particular el método in vitro de programar o reprogramar una célula y el método in vitro de tratar un trastorno genético.

La célula o población de células puede ser usada como un medicamento para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Como se mencionó anteriormente, las células reprogramadas obtenidas por el método in vitro de reprogramación de acuerdo con la presente invención, pueden ser diferenciadas a un tipo de célula deseado y entonces usadas en el tratamiento de una enfermedad dada. En particular, las células IPS son generadas por el métodos in vitro de reprogramación pueden ser usadas en las terapias de regeneración asi como en investigación básica. Las células IPS especificas del paciente generadas de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, adecuadas para usarse en la terapia de células no diferenciadas. Las células somáticas recolectadas de un paciente son reprogramadas primero a un estado menos diferenciado un método de reprogramación in vitro la presente invención, diferenciadas en el tipo de células somáticas diferenciado de acuerdo a procedimientos conocidos por un experto en la téenica (por ejemplo, por tratamiento con ácido retinoico, factores de crecimiento, citoquinas y hormonas), y entonces administradas al paciente.

En otro aspecto la presente invención se relaciona con la composición farmacéutica que comprende la célula o la población de células de la presente invención, o una célula rediferenciada o una población de células rediferenciadas derivadas de la célula o población de células preparada por el método de reprogramación in vitro de la presente invención. Los medios para diferenciar una célula desdiferenciada son conocidos en la téenica y también son indicados aquí más arriba.

La composición farmacéutica de la presente invención puede estar en forma de una solución, una suspensión o cualquier otra forma para el uso detenido. Típicamente, la composición comprende además un soporte, diluente, y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. También pueden ser incluidos agentes para ajustar el valor de pH, amortiguadores, agentes para ajustar la tonicidad y similares. La composición puede ser administrada por las rutas usuales. Una dosis terapéuticamente efectiva del virus es administrada la paciente, dosis la cual depende de la aplicación particular (por ejemplo terapia de regeneración o terapia genética), del tipo de enfermedad, el peso, edad, sexo y estado de salud del paciente, la forma de administración de la formulación, etc. La administración puede ser individual o múltiple, según se requiera.

La composición farmacéutica de la presente invención es adecuada para aplicaciones en medicina humana y/o veterinaria. Puede ser usada para terapias de regeneración así como en terapia genética. En particular, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser usada en la terapia antitumor.

La presente invención será ahora ilustrada mejor mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Lo siguiente muestra que el uso del método de la presente invención permite la expresión transgénica eficiente y a largo plazo en una forma segura y confiable usando un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante. Esas caracteristicas inesperadas y ventajosas asociadas con la presente invención abren nuevos campos de aplicación para esos tipos de vectores virales que hasta ahora no habían sido considerados útiles en el tratamiento de condiciones médicas.

Ejemplo 1 Expresión transgénica a largo plazo Células Vero fueron infectadas con un virus Sendai recombinante (SeV por sus siglas en ingles) que tiene un genoma viral que codifica para un gen P mutante que codifica para una proteína P truncada que carece de los aminoácidos N-terminal 2 a 77 asi como proteína de fluorescencia verde (GFP por sus siglas en ingles) como marcador total de la expresión del gen (SeV-PA2-77/GFP) a una multiplicidad de infección (MOI por sus siglas en ingles) de 1. La fluorescencia y micrografías (tiempo de exposición de dos segundos) fueron tomadas a los días 1, 6, 12 y 30 a una amplificación de lOOx.

Como se muestra en la Figura 1, el nivel de GFP detectable declinó solo moderadamente durante un periodo de tiempo de no menos de 30 días y fue aún considerablemente alto después de 30 días. De este modo, el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante usado en la presente invención permite, de manera inesperada, la expresión a largo plazo de transgenes. Esto ofrece varios campos novedosos de aplicación como métodos terapéuticos genéticos vivo e in vivo, reprogramación de células a una célula de un estado menos diferenciado adecuada para usarse en terapias de regeneración, y programación de células de un estado celular menos diferenciado específicamente para usarse en el tratamiento de varias enfermedades.

Ejemplo 2 Verificación en tiempo real de la expresión de ARNm heterólogo Un virus Sendai deficiente para la replicación recombinante que tiene el factor de transcripción "Oct4" incluido en su genoma viral como un transgen (SeV-PA2- 77/Oct4) o un virus Sendai deficiente para la replicación recombinante que tiene el factor de transcripción "Nanog" incluido en su genoma viral como un transgen (SeV-PA2-77/Nanog) fue usado para infectar fibroblastos de prepucio humano (HFF por sus siglas en inlges) con una MOI de 3 o 20. A los días 2, 5, 8 y 12, el ARN celular total fue extraído usando Triazol (Invitrogen) y se efectuó una RT-PCR en tiempo real. El paso síntesis de ADNc fue efectuado usando un cebador oligo-(dT)12-18 que permite la amplificación del ARN únicamente (enzima "superscript II"; Invitrogen).

La RT-PCR en tiempo real fue llevada a cabo de acuerdo con procedimientos conocidos por un experto en la téenica. En breve, se usó qPCR SYBR Mezcla-Verde (ABgene; Surrcy, RU). La cantidad inicial de ADNc fue calculada comparando los valores del ciclo umbral (CT) de cada muestra con valores de CT de la curva estándar respectiva. Para este cálculo fue usado el software "Mastercycler ep realplex" (Eppendorf). Para la normalización, los niveles de expresión de los genes blanco fueron comparados con los niveles de transcripción de beta actina. Las células HFF no transducidas sirvieron como controles negativos.

Las condiciones de la PCR en tiempo real fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos, 40 ciclos de desnaturalización (95°C, 15 segundos), recosido (véase la Tabla más adelante para las temperaturas de recosido respectivos, 60 segundos), fase de extensión del cebador (72°C, 60 segundos). La existencia de la longitud de producto correcta fue controlada por medio de electroforesis en gel. Se usaron los siguientes pares de cebadores: Las células HFF no transducidas sirvieron como control negativo, definiendo el nivel más bajo de expresión de ARNm (como se define aquí en "0.000"). Como un control positivo, se usaron un rector de lentivirus que alberga un transgen de GFP y que expresa el transgen Oct4 y el transgen Nanog, respectivamente. El nivel de expresión es expresado con relación al de la beta actina que se determinó en paralelo. Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3.

Como puede observarse en la Figura 2, la transducción con una MOI de 3 (primeros cuatro puntos de lectura en la Figura 2) asi como la transducción con una MOI de 20 (indicada en la Figura 2 por "MOI20") resultó en un nivel expresión de ARNm de Oct4 que fue aún muy alta después de 5 dias (aproximadamente 30% para una MOI de 3 y más de 99% para una MOI de 20). Igualmente, como se muestra en la Figura 3, el nivel de expresión de Nanog fue aún muy alto después de 5 dias (aproximadamente 75% para una MOI de 3 y esencialmente 100% para una MOI de 20). Aún después de 8 dias se observó la expresión de ARNm de 0ct4 y Nanog significativa.

La expresión a largo plazo de Oct-4 y Nanog observada del vector Sendai deficiente para la replicación que alberga la supresión en la proteína P de los aminoácidos 2 a 77 fue un descubrimiento sorprendente. Hasta ahora, la vida media de la nucleocápsula del virus Sendai era reportada como de aproximadamente 4 horas (véase Mottet et al., Virology 176: 1-7 (1190)). Sobre la base de este valor, existia la creencia general de que los ARN virus de hebra negativa, como el virus Sendai, no son adecuados para muchas aplicaciones.

Sin embargo, contrario a la creencia general en la téenica, se encontró, de manera inesperada, que el ARN virus de hebra negativa recombinante permite la expresión a largo plazo de transgenes. Además, también se encontró que el ARN virus de hebra negativa de hebra recombinante alcanza niveles de expresión sorprendentemente altos en vista del hecho que durante la infección existen aproximadamente de 500 aproximadamente 1000 veces menos patrones en comparación con el virus natural.

Ejemplo 3 Eliminación de la proteína C' del gen P Sendai En un intento por mejorar aun mas la expresión genética a largo plazo usando el reactor viral SeV-Ph2-77, se investigó una modificación genética dentro del gen P. De manera más especifica, el gen P Sendai codifica no únicamente para proteina P sino para otras proteínas no estructurales conocidas como "proteínas C". Esas proteínas son traducidas de un marco de lectura alternativo (posición 1 con relación a la proteína P) o resulta del uso de un codón de inicio de la traducción alternativo (AUG (ATG) en lugar de ACG). Se cree que el uso de este codón de inicio alternativo da como resultado una tasa de expresión genética reducida (reducción de aproximadamente 10-20% en comparación con el gen de tipo natural) de la proteína P. En la literatura, las proteínas C son descritas como si actuaran como factores reguladores en la interacción anfitrión-virus, principalmente como antagonistas de la respuesta del interferón.

En el experimento aquí descrito, el codón de inicio de la proteína C' en el genoma del vector viral de SeV-PA2-77 fue eliminado por mutagénesis dirigida al sitio. De manera más específica, el codón de inicio "ACG" fue modificado al codón sin sentido "UCU" o codones sin sentido similares. Aunque el experto habría esperado que el vector viral sea ahora eliminado de la célula mas rápido debido a la aparición inicial de una respuesta de interferón, se encontró, de manera sorprendente que la expresión del transgen se incrementó (20.40%) mientras que el tiempo de sobrevivencia del vector dentro de la célula no se acortó.

Ejemplo 4 Evaluación de un sistema de producción óptimo para un vector de virus Sendai deficiente para la replicación Se llevaron a cabo estudios comparativos para evaluar el sistema de producción óptima para un vector Sendai deficiente para la replicación que alberga la supresión de los aminoácidos 2-77 dentro del gen P. De manera mas especifica, se compararon tres escenarios diferentes: (1) Producción de la línea celular únicamente con el gen P como trasgen adicional. De este modo seria suficiente producir cantidades de alto nivel del vector puesto de los otros componentes virales (proteínas) son aun codificados en su origen material en el genoma del vector. (2) Producción de la línea celular con integración estable de los genes P y N del virus Sendai. Se esperaba que esta combinación resultara en un desequilibrio de las proteínas virales durante la producción del vector. Normalmente las proteínas N y P son producidas a un nivel aproximadamente igual que en la célula anfitriona (véase Homann et al., Virology 177: 131-140 (1990) y Tokusumi et al., Virus Research 86: 33-38 (2002)). Esta relación es considerada como genética para el crecimiento óptimo del virus. En este escenario sin embargo, se esperaba producir la proteina elemental en gran exceso lo cual daría como resultado una menor eficacia de producción puesto que se sabe que N es citotóxica debido a su actividad inherente para unir moléculas de ARN. (3) Producción de la línea celular con integración estable de los genes P y N y L del virus Sendai. Esta combinación refleja todos los componentes de la proteína de la nucleocápsula. Por lo tanto, podría tener un impacto sobresaliente sobre la producción del virus. Sin embargo, como ya se mencionó para el escenario (2), también puede dar como resultado un desequilibrio de los componentes virales N y L, los cuales ya están codificados en el genoma viral y de este modo son eficaces durante la producción del genoma viral.

De manera sorprendente, el escenario (2) fue identificado como la mejor combinación para la producción del vector viral. Aunque el escenario (3) fue igualmente bueno con respecto a la cantidad de vector que podría ser producida, y (2) ofrece la ventaja de que únicamente tienen que se producidos dos genes en la célula en lugar de tres como en el escenario (3).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de expresión de al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula, el método se caracteriza porque comprende introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante incluye un genoma viral que codifica para una proteina premutante, la cual conduce a una perdida de la capacidad de replicación del genoma viral de la capacidad de transducción viral, y donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un factor de reprogramación o programación celular o una proteina terapéutica.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante es un paramixovirus que incluye al virus Sendai, parainfluenza, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas, virus de sarampión, virus de la peste bovina, y virus sincitial respiratorio humano, o vector de rabdovirus, incluyendo el virus de la estomatitis vesicular y virus de la rabia.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la mutación de la proteina P es una supresión, inserción o reemplazo de uno o más aminoácidos de o en la secuencia de aminoácidos 2-77 de la proteina P del virus Sendai, en el caso de un virus diferente al Sendai, de o en una secuencia de aminoácidos homologa a la secuencia de aminoácidos 2-77 de la proteina P del virus Sendai.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la mutación es una supresión de (a) aminoácidos 2 a 77 de la proteina P del virus Sendai o, en el caso de un virus diferente al Sendai, una supresión de los aminoácidos homólogos a los aminoácidos 2-77 de la proteina P del virus Sendai o (b) los aminoácidos 33-41 de la proteina P del virus Sendai, o en el caso de un virus diferente al Sendai, una supresión de los aminoácidos homólogos a los aminoácidos 33-41 de la proteina P del virus Sendai.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el factor de reprogramación celular es seleccionado del grupo que consiste de Nanog, Oct-3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28, ASCL1, MYT1L, TBVX3b, SV40 grande T, hTERT, miR-291, miR-294, miR-295 y combinaciones de los mismos, y/o donde el factor de programación es seleccionado del grupo que consiste del factor del crecimiento nervioso (NGF por sus siglas en ingles), factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF por sus siglas en ingles), interleucina 6 (IL-6), proteina morfogénica ósea (BMP por sus siglas en ingles), neurogenina 3 (Ngn3), homeobox 1 pancreática y duodenal (Pdxl), Mafa, y combinaciones de los mismos.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteina terapéutica es seleccionada del grupo que consiste de adenosina desaminasa (ADA por sus siglas en ingles), p91-PHOX, factor IX, factor VIII, regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quistica (CFTR por sus siglas en ingles), b-globina (HBB por sus siglas en ingles), distrofina en la hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (HGPRT por sus siglas en ingles), fenilalanina hidroxilasa (PAH por sus siglas en ingles), glucosilceramidasa (GBA y GBA2 por sus siglas en ingles), fibrilina-1 (FBN1 por sus siglas en ingles), huntingtina (HTT por sus siglas en ingles), apolipoproteina B (apoB), receptor de lipoproteina de baja densidad (LDLR por sus siglas en ingles), proteina adaptadora del receptor de lipoproteina de baja densidad 1 (LDLRAP1 por sus siglas en ingles), proteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9 por sus siglas en ingles), sinucleina alfa (SNCA por sus siglas en ingles), parkina (PRKN), cinasa 2 repetida rica en leucina (LRRK2 por sus siglas en ingles), cinasa 1 putativa inducida por PTEN (PINK1 por sus siglas en ingles), proteína de parkinson 7 (DJ-1), ATPasa tipo 13A2 (ATP13A2), productos genéticos suicidas del cáncer, factores antiangiogénicos, autoantígenos del cáncer, incluyendo la proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TRP-2) y antígenos carcinoembriónico (CEA por sus siglas en ingles), factores estimuladores inmunes, factores del crecimiento incluyendo el factor estimulante de la colonia de granulocitos de macrófagos (GM-CSF por sus siglas en ingles) y factor del crecimiento epitelial (EGF por sus siglas en ingles), y citosinas incluyendo las interleucinas IL-2, IL-4, IL-g, IL-12 e IL-17, inmunosupresores y combinaciones de los mismos.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el cual es un método in vitro de reprogramación de una célula al menos parcialmente diferenciada a una célula menos diferenciada o programación de una célula a ser programada a un estado diferenciado deseado, el método se caracteriza porque comprende:(a) proporcionar una célula al menos parcialmente diferenciada o una célula a ser programada de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula proporcionada en el caso (a) infectando la célula con un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un factor de reprogramación celular.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porgue la célula al menos parcialmente diferenciada es una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste de una célula somática diferenciada terminalmente, una célula precursora, una célula no diferenciada restringida por el linaje, una célula no diferenciada somática y una célula progenitora.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la célula al menos parcialmente diferenciada es reprogramada a una célula oligopotente, multipotente o pluripotente.

10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la célula a ser programada es una célula somática diferenciada terminalmente.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es un método in vivo para tratar un trastorno genético, el método se caracteriza porque comprende administrar a un paciente un vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga para inducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula del paciente, donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para una proteina terapéutica capaz de tratar el trastorno genético.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el cual es un método in vitro para tratar un trastorno genético, el método se caracteriza porque comprende:(a) proporcionar una célula de un donador, (b) introducir al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula proporcionada en el paso (b) infectando la célula con el vector de ARN virus de hebra negativa recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y (c) cultivar la célula infectada bajo condiciones efectivas para expresar al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga y/o permitir que la célula se expanda, donde al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para una proteína terapéutica capaz de tratar el trastorno genético.

13. Una célula o una población de células preparadas in vito por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 12.

14. Una célula o una población de células de conformidad con la reivindicación 13 para usarse como un medicamento.

15. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una célula o una población de células de conformidad con la reivindicación 13, o una célula rediferenciada o una población de células rediferenciadas derivadas de una célula o una población de células preparadas por el método ín vi tro de reprogramación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.