KR20150014482A - 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법 - Google Patents

재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150014482A
KR20150014482A KR1020147034235A KR20147034235A KR20150014482A KR 20150014482 A KR20150014482 A KR 20150014482A KR 1020147034235 A KR1020147034235 A KR 1020147034235A KR 20147034235 A KR20147034235 A KR 20147034235A KR 20150014482 A KR20150014482 A KR 20150014482A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
virus
protein
nucleic acid
Prior art date
Application number
KR1020147034235A
Other languages
English (en)
Inventor
마리안 위건드
Original Assignee
앰백 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 앰백 아게 filed Critical 앰백 아게
Publication of KR20150014482A publication Critical patent/KR20150014482A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18822—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18852—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18861—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18862—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/24—Vectors characterised by the absence of particular element, e.g. selectable marker, viral origin of replication

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

본 발명은, 세포를, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터로 감염시킴으로써, 세포에 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하며, 상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함하므로써, 바이러스 전사 능력은 소실하지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열이 세포의 리프로그래밍 또는 프로그래밍 인자, 또는 치료 단백질을 코딩하는 것인, 세포에서 하나 이상의 이종 핵산 서열을 발현하는 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 시험관내에서 제조된 세포 또는 세포 집단 뿐만 아니라 상기 세포 또는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

재조합 네거티브―가닥의 RNA 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법 {METHOD FOR EXPRESSION OF HETEROLOGOUS PROTEINS USING A RECOMBINANT NEGATIVE-STRAND RNA VIRUS VECTOR}
본 발명은 복제-불능 (replication-deficient)이지만 전사-적격성 (transcription-competent) (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 이용하여 세포에서 하나 이상의 이종 핵산 서열을 발현하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 이용하여, 세포를 분화 수준이 낮은 상태로 리프로그래밍하는 시험관내 방법과, 생체내 및 시험관내 유전자 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 시험관내 방법으로 제조된 세포 또는 세포 집단, 및 상기 제조된 세포 또는 세포 집단의 의약제로서의 용도에 관한 것이다.
재조합 바이러스 백터는 외래 유전자를 포유류 세포에 도입하는데 이용가능한 몇가지 공지된 물질들 중 하나로, 이식 유전자의 안정적인 발현을 매개한다. 이러한 목적으로 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-부속 바이러스 등의 여러가지 바이러스들이 사용되고 있다. 이들 재조합 바이러스는 특히 바이러스 백신의 제조에 이용되거나 또는 유전자 결함성 장애를 치료하기 위한 유전자 치료 벡터로서 이용되는 것으로 알려져 있다. 재조합 바이러스의 다른 용도로는, 특정 재-분화 인자 또는 리프로그래밍 인자의, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질전이 및 발현에 의해 유도된, 다능성 줄기 (iPS) 세포로 알려져 있는 만능 세포로의 세포의 탈-분화를 포함한다.
전술한 바이러스-매개 방법에서 유전자 전달과 관련된 심각한 문제점은, 유전 물질이 바이러스 벡터로부터 숙주 세포 게놈 DNA에 전달 및 삽입될 때, 숙주 세포의 악성 변환이 유발될 수 있다는 것이다. 특히, 예를 들어, 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 레트로바이러스-매개에 의해 전달하게 되면, 이식 유전자가 게놈내에 삽입될 수 있다. 이는, 온코진의 활성화를 촉발하거나, 또는 종양 억제자 유전자를 교란시킴으로써 악성 세포로의 형질전환을 유발할 수 있다. 바이러스 벡터의 삽입과 관련된 다른 문제로는, 삽입되어 하향-조절된 이식 유전자가 재-활성화되어, 세포의 형질전환을 야기할 수 있다는 것이다.
또 다른 문제는, 유전자를 전달하는데 사용되는 바이러스가 환자의 건강한 이웃 세포로, 또는 환자로부터 다른 개체나 환경으로 전파될 가능성이 있다는 것이다. 추가적인 문제는, 바이러스 벡터가 존속하여, 바이러스 구성 성분에 대한 면역 반응 또는 바이러스 감염의 지연성 효과와 같은 부작용이 야기될 수 있다는 것이다. 아울러, 외래 유전자의 지속적인 발현으로, 자가 항원에 대한 자가면역-유사 반응이 발생하거나 또는 시그널링 경로와 같은 세포성 프로세스를 방해할 수 있다.
생체외 및 생체내 처리시 외래 유전자의 숙주 세포로의 전달 안전성을 높이기 위해, 특히 바이러스 벡터의 부적절한 전파를 방지할 목적으로, 여러가지 전략들이 제시되어 왔다. 예를 들어, WO 2006/084746 A1에서는, 복제-불능이나, 전사-적격성의 (-) 가닥의 RNA 바이러스를 개시하였다. 이의 안전성 프로파일 개선으로 인해, 이 바이러스는 생 백신으로 사용하는데 적합한 것으로 기술되어 있다.
또한, 타겟 세포의 게놈에 유전자를 삽입함으로써 생기는 모든 문제점들을 방지하기 위해, 타겟 세포의 게놈에 삽입되지 않고 이종 유전자 산물을 일시적으로 발현할 수 있도록 하는 바이러스 게놈 구조체의 도입이 시도되었다. 예를 들어, WO 2010/008054 A1은 센다이 바이러스 벡터와 같은 염색체 비-삽입형 바이러스 벡터를 이용하여 ES (배아 세포)- 유사 세포를 제조하는 방법을 개시하였다. 하지만, 이 바이러스 벡터는 감염된 타겟 세포에서 효율적으로 복제될 수 있었으며, 따라서, 제조된 바이러스 입자들이 각 세포 분열 후 딸 세포들에 균일하게 분산되게 될 것이다. 따라서, 제조되는 ES-유사 세포는 그 세포질에 부적절하게도 다량의 바이러스를 가지게 된다.
유사한 방식으로써, 체세포를 유도된 만능성 줄기 (iPS) 세포로 리프로그래밍하는데 센다이 바이러스 벡터를 사용하는 방법이, WO 2010/134526 A1에 기술되어 있다. 센다이 바이러스 벡터는 벡터 서열을 숙주 세포의 게놈에 삽입시키지 않기 때문에, 숙주 게놈으로의 바이러스 서열의 무작위 삽입으로 인해 야기되는 종양성 형질전환이 발생할 위험이 낮아진다. 그러나, WO 2010/134526 A1에 기술된 센다이 바이러스 벡터는 복제-적격성을 갖추고 있기 때문에, 적절한 안전성 프로파일을 확보하기 위해서는 리프로그래밍 이후에 상당한 노력을 통해 이를 제거하여야 한다. 또한, 바이러스를 제거하기 위한 목적으로 WO 2010/134526 A1에 사용되는 siRNA 전달율도 siRNA 매개 발현 저해도 모두 100%에 도달하지 않을 것이므로, 이런 방식은 생 바이러스의 사용과 관련된 건강 상의 위험을 충분히 방지할 수 없다.
종래 기술에 비추어, 본 발명의 과제는 충분한 장기간 동안 이종 핵산 서열을 효율적으로 발현할 수 있으며 개선된 안전성 프로파일을 나타내는, 새로운 바이러스 벡터를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 과제는, 다양한 질환에 대한 유전자 치료 방법으로서 치료 단백질을 코딩하는 유전자를 전달 및 발현하는 새로운 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 과제는 적어도 부분적으로 분화된 세포를, 재생 치료에 사용하는데 적합한 보다 분화 수준이 낮은 세포로 리프로그래밍하거나, 또는 세포를 원하는 분화 상태로 만들기 위해, 세포 리프로그래밍 인자 또는 프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 전달 및 발현하는 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은, 세포에서 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 상기 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시킴으로써, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열은 세포의 리프로그래밍 인자 또는 프로그래밍 인자 또는 치료 단백질을 코딩한다.
바람직한 구현예에서, 적어도 부분적으로 분화된 세포는, (a) 공여체로부터 적어도 부분적으로 분화된 세포를 제공하는 단계, (b) 상기 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 상기 세포에 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계, 및 (c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내 방법에 의해, 보다 분화 수준이 낮은 세포로 리프로그래밍되며, 여기서, 상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열은 세포의 리프로그래밍 인자를 코딩한다.
다른 바람직한 구현예에서, 프로그래밍할 세포는, (a) 공여체로부터 프로그래밍할 세포를 제공하는 단계, (b) 상기 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 상기 세포내로 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계, 및 (c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내 방법에 의해, 원하는 분화 상태로 프로그래밍되며, 여기서, 상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열은 세포의 프로그래밍 인자를 코딩한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 유전자 장애는, 환자에게, 하나 이상의 이종 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 투여하여, 환자의 세포에 상기 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하는, 생체내 방법에 의해 치료되며, 여기서 상기 재조합 (-) 가닥 RNA 바이러스는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열은 유전자 장애를 치료할 수 있는 치료 단백질을 코딩한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 유전자 장애는, (a) 공여체로부터 세포를 제공하는 단계, (b) 상기 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 상기 세포내로 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계, 및 (c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계 및/또는 세포를 증폭시키는 단계를 포함하는, 시험관내 방법에 의해 치료되며, 여기서, 상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열은 유전자 장애를 치료할 수 있는 치료 단백질을 코딩한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다. 이러한 세포 또는 세포 집단은 의약제로서, 특히 유전자 치료 또는 재생 치료에 사용하기 위한 의약제로서 사용될 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포 집단, 또는 본 발명의 시험관내 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포 집단으로부터 유래된 재분화된 세포 또는 재분화된 세포의 집단을 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예들은 첨부된 청구항에 기술된다.
본 발명은 후술하는 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 충분하게 이해될 수 있다.
도 1은 SeV-PD2-77/GFP (그린 형광 단백질)로 형질전이된 Vero 세포의, 1일 (d1), 6일 (d6), 12일 (d12) 및 30일 (d30)째의, 100X 배율의 광 현미경 사진 (상단) 및 형광 사진 (하단)을 도시한 것이다.
도 2는, 양성 대조군으로서 GFP 이식 유전자 및 Oct4 이식 유전자를 보유한 재조합 렌티바이러스 벡터와 음성 대조군으로서 비-형질전이된 HFF 세포를 비교하여, SeV-PD2-77/Oct4 MOI 3 또는 20로 형질전이된 인간 포피 섬유모세포 (HFF)에서의 2일, 5일, 8일 및 12일째의 mRNA 발현을 도시한 막대 차트이다.
도 3은, 양성 대조군으로서 GFP 이식 유전자 및 Nanog 이식 유전자를 보유한 재조합 렌티바이러스 벡터와 음성 대조군으로서 비-형질전이된 HFF 세포를 비교하여, SeV-PD2-77/Nanog MOI 3 또는 20로 형질전이된 인간 포피 섬유모세포 (HFF)에서의 2일, 5일, 8일 및 12일째 (d2, d5, d8 및 d12)의 mRNA 발현을 도시한 막대 차트이다.
본 발명은 세포의 리프로그래밍 인자, 프로그래밍 인자 또는 치료 단백질을 코딩하는 이종 핵산 서열 (본원에서, "이식 유전자"로도 지칭됨)을 세포에서 발현하는 방법을 제공한다. 본 방법은 특정한 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터의 사용을 토대로 한다. 이 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 보유하도록 설계되며, 대상 이종 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 정도로 전사-적격성을 가지면서도 복제 불능인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 일반적으로 백신 접종과는 무관하며, 특히 백신으로서의 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터의 사용과는 무관하다. 즉, (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터에 의해 코딩되는, 세포의 리프로그래밍 인자, 프로그래밍 인자 또는 치료 단백질은 백신 접종의 용도로는 사용되지 않으며, 전형적으로 적합하지 않다.
본 발명의 방법에서, 복제-불능의 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 세포 (본원에서 "숙주 세포"로도 지칭됨)를 감염시키는데 사용하여, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 세포에 도입시킨다. 도입되어진 핵산은, 세포의 게놈에 삽입되지 않고, 세포질에 체류하여 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소 (vRdRp)에 대한 주형으로서 사용됨으로써 타겟 세포의 번역 장치에 의해 번역되어 원하는 이종 단백질을 생산하는 (+) RNA 가닥을 만들어내는, RNA이다.
놀랍게도, 본 발명의 방법은 이식 유전자를 높은 수준으로 발현시키며, 동시에 우수한 안전성 프로파일을 가진다. 본 발명에 사용되는 복제-불능의 RNA 바이러스로의 감염 시, 야생형 RNA 바이러스에 비해 제공되는 주형이 훨씬 적다. 주형의 수적 감소를 감안하면, 본원에 기술된 복제-불능의 RNA 바이러스 이용시 관찰되는 이종 단백질 발현은 예상치 못하게도 높았다.
아울러, 본 발명의 방법은, (-) 가닥의 RNA 바이러스는 숙주의 염색체에 삽입되지 않는 것으로 간주되므로, 염색체 삽입과 관련된 악성 변환 위험성이 없다. 아울러, 분화된 세포에서 리프로그래밍 인자를 코딩하는 염색체-삽입된 유전자들이 나중에 재발현될 위험성도 존재하지 않는다. 또한, 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 벡터는 환자의 이웃한 건강한 세포로, 또는 환자로부터 다른 개체나 환경으로 전파되지 않는다.
아울러, 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 입자는 각 세포 분열 주기에서 생산되는 딸 세포들에 균등하게 분산되므로, 따라서 점차적으로 검출불가한 수준으로 희석된다. 다시 말해, 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 종래에 개시된 추가적인 정교한 정제 없이도, 감염된 타겟 세포에서 완전히 없어진다.
또한, 본 발명의 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 바이러스 구성 성분에 대한 면역 반응, 바이러스 감염의 지연 효과, 자가 항원에 대한 자가면역-유사 반응, 내인성 숙주 유전자의 발현 변형 및 예상치 못한 부작용과 같은, 바이러스 벡터의 영속성과 관련된 위험성을 피할 수 있다.
복제-불능이면서 RNA 게놈은 전사하는 RNA 바이러스 벡터의 전사 능력은, 바이러스 P 단백질에 돌연변이가 발생한 결과이다. 이 P 단백질은 P 단백질과 L 단백질로 구성된 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소 (vRdRp)의 일부이다. vRdRp는 바이러스 전사와 바이러스 복제 둘다를 수행한다. 이들 2가지 기능은 따라서 (-) 가닥 RNA 바이러스에서 커플링되어 있다. P 단백질에서의 돌연변이는, 바이러스 게놈의 복제력은 없애지만, 도입된 이종 핵산 서열의 발현에 필수적인 바이러스 전사 능력은 없애지 않는 것으로, 확인되었다. 즉, P 단백질에서의 특정 돌연변이는 vRdRp의 복제 활성과 전사 활성의 커플링을 해체시킨다.
타겟 세포에 감염된 후, 본원에 기술된 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스는 바이러스 게놈에 포함된 바이러스 단백질과 하나 이상의 이종 핵산 서열에 의해 코딩된 이종 단백질의 발현을 허용한다. 이종의 유전자 산물을 발현하기 위해서는, 본 발명에 사용되는 재조합 바이러스는 초기 일차 전사 (early primary transcription)를 수행할 수 있어야 한다. 본원에서, 용어 "초기 일차 전사"는, 바이러스 입자에 본래 포함된 vRdRp 분자에 의해 바이러스 RNA 게놈이 전사되는, 감염된 숙주 세포에서의 첫번째 전사 현상을 지칭한다.
아울러, 본 발명에 사용되는 재조합 바이러스는 후기 일차 전사를 수행할 수 있어야 한다. 용어 "후기 일차 전사"는, 본원에서, 신규 단백질 합성이 개시되고 전사가 신규 합성된 vRdRp에 의해 더욱 더 수행되는 단계를 지칭한다. 초기 일차 전사와는 대조적으로, 후기 일차 전사 시에는 바이러스 복제는 새로운 단백질 합성에 의존한다. 본원에서 그렇지 않지만 종래 기술 분야에서는, 용어 "이차 전사"가 때때로 후기 일차 전사의 동의어로 사용됨에 유념한다.
N 단백질이 충분한 양으로 생산되자마자, vRdRp는 복제 모드로 전환되어 안티-게놈 (antigenome)을 합성한다. 안티-게놈 주형으로부터 새로운 게놈이 복제되어, N 단백질로 싸이게 된다. 세포에서 바이러스 전사에 대한 주형의 수가 증가할 수록, 이른바 "이차 전사" 단계가 시작되며, 일차 전사 보다 훨씬 우수한 전사 효율을 나타낸다. 본원에서, 용어 "일차 전사"는, 달리 언급되지 않은 한, 초기 및 후기 일차 전사 둘다를 의미한다.
바람직하게는, 후기 일차 전사를 수행하는 재조합 바이러스 벡터의 전사력은, 대응되는 야생형 바이러스, 즉, 본원에 기술된 바와 같이 유전자 P에 돌연변이가 없는 바이러스의 바이러스 단백질 합성의 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상 또는 5% 이상으로 단백질을 합성하는 수준이다. 후기 일차 전사 활성은, 대응되는 야생형 바이러스의 활성 보다 바람직하게는 20배 이하, 더 바람직하게는 10배 이하이다. 후기 일차 전사력은, 기술된 바와 같이 (예, WO 2006/084746 A1의 실시예 7.1 및 7.3, 이의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 이종 유전자 산물, 예컨대 리포터 단백질을 정량적인 측정함으로써 확인할 수 있다.
이와 관련하여, (복제-가능한) 야생형 RNA 바이러스가 감염되는 동안에는, 전사 및 복제의 주형으로서 작용하는 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNF)를 재생할 수 없는, 본 발명에 사용되는 복제-불능 RNA 바이러스와 비교해, 주형이 약 500 - 약 1000배 이상 많이 존재한다는 사실에 비추어, 전술한 이종 발현 수준이 예상치못하게도 높다는 것에 주목하여야 한다.
본 발명의 의미내에서, "복제력 소실"은, 타겟 세포에서, 즉 P 유전자의 돌연변이에 의해 영향을 받은 임의의 인 트랜스 (in trans) 기능을 제공 및 보완하지 않는 세포에서, 남아있는 복제력, 즉 바이러스 게놈의 증폭을 검출할 수 없다는 것을 의미한다. 실제, 바이러스 복제는 전체적으로 없어지는 것으로 간주된다. 감소된 또는 조건성 복제-불능과는 반대로, 바이러스 게놈의 복제를 허용하는 허용 조건 (permissive condition)이 존재하지 않는다. 복제력 소실은 당해 기술 분야에 기술된 바와 같이 확인할 수 있다 (예, WO 2006/084746 A1의 실시예 8, 이의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명에서 사용되는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는, 바람직하게는, 야생형 균주, 돌연변이 균주, 실험실-계대 배양 균주, 백신 균주, 유전자 구축된 균주 등을 비롯하여, 모노네가비랄레스 (Mononegavirales) 과의 비-분할형 (non-segmented) (-) 가닥의 RNA 바이러스로부터 유래된다. 본원에서, 용어 "바이러스 벡터"는 세포에 형질감염되어 세포 게놈내에서 복제되거나 또는 세포 게놈과는 독립적으로 복제될 수 있는, 바이러스-유래 핵산으로서, 전체 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 바이러스 게놈과 부속 단백질로 구성된 바이러스 코어를 포함한다. 본 발명에 사용되는 복제-불능의 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터는 처음 (-) 가닥의 RNA 바이러스를 유전자 변형시킴으로써 수득할 수 있다.
(-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 파라믹소비리대 (Paramyxovirdae), 랍도비리대 (Rhabdoviridae), 필로비리대 (Filoviridae), 보르나비리대 (Bornaviridae), 아레나비리대 (Arenaviridae) 또는 부니아비리대 (Bunyaviridae) 과 또는 이들의 재조합 변이체에 속하는 (-) 가닥의 RNA 바이러스로부터 선택할 수 있다. 본 발명에 사용하기 특히 바람직한 것은 파라믹소바이러스, 예컨대 센다이 바이러스, 파라인플루엔자바이러스 (PIV), 예를 들어, 1형, 2형, 3형, 4a형 또는 4b형의 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV), 뉴캐슬 질환 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 또는 랍도바이러스, 예로, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 또는 광견병 바이러스이다. 본 발명에서 특히 바람직한 구현예에서, 바이러스는 센다이 바이러스, 센다이 푸시미 균주 (ATCC VR105), 센다이 해리스 균주, 센다이 칸텔 균주 또는 센다이 Z 균주이다.
적합한 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 감염시킬 세포 타입과 적용 부위에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, 센다이 바이러스 및 유행성 이하선염 바이러스는 매우 광범위한 숙주 세포 특이성을 나타낸다. 센다이 바이러스는 말 유래 세포 및 다양한 동물의 B-림프구와 같은 다수 타입의 조직의 다양한 동물 세포에 감염할 수 있다. 다른 예로, 숙주 세포 특이성이 높은 (-) 가닥의 RNA 바이러스, 예를 들어, 홍연 바이러스 또는 우역 바이러스가 적합할 수 있다. 인공적으로 변형된 숙주 세포 특이성을 가진 바이러스도 사용할 수 있다.
본 발명에서, 본 발명에 사용되는 재조합 RNA 바이러스의 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 돌연변이된 P 단백질은, 바이러스의 전사 능력은 소실시키지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실시키는, 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 하나 이상의 돌연변이는 특정 타입의 돌연변이로 한정되지 않으며, 바이러스의 전사 능력은 소실시키지 않으면서, 바람직하게는, 초기 및/또는 후기 일차 전사 능력은 소실시키지 않으면서, 복제 능력은 소실시키는 결과를 초래하는 한에서는, 결손, 치환 및/또는 삽입을 포함한다.
돌연변이는 해당 (-) 가닥의 RNA 바이러스의 P 단백질의 N-말단 영역에 작용한다. 바람직하게는, P 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이는, 센다이 바이러스나 센다이 이외의 다른 바이러스의 P 단백질의 아미노산 서열 (번호 지정은 예를 들어 WO 2006/084746 A1에서와 같이 지정됨) 2 - 77, 특히 아미노산 서열 33 - 41 중 하나 이상의 아미노산의 또는 이들 아미노산으로의, 또는 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 서열 2 - 77, 특히 아미노산 서열 33 - 41에 대응되거나 또는 이와 상동적인 아미노산 서열의 결손 또는 치환, 또는 이들 아미노산 서열로의 삽입이다.
본 발명의 의미에서, 용어 "상동성"은 상동성 수준이 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 것을 지칭한다. 더 바람직한 구현예에서, 용어 "상동성"은 동일성 수준이 45%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 95% 이상인 것을 의미한다.
센다이 바이러스 P 단백질의 아미노산 서열 2 - 77 중 하나 이상의 아미노산, 또는 센다이 이외의 다른 바이러스의 경우에는, 센다이 이외의 다른 바이러스로부터 유래된 등가의 P 단백질에서의 대응되거나 또는 상동적인 아미노산 서열의 결손이 특히 바람직하다. 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 2 - 77 또는 33 - 41의 결손, 또는 센다이 이외의 다른 바이러스의 경우에는, 센다이 이외의 다른 바이러스로부터 유래된 등가의 P 단백질에서의 대응되거나 또는 상동적인 아미노산 서열의 결손이 가장 바람직하다. 아울러, 아미노산 320의 하류에 위치한 센다이 바이러스 P 단백질의 C-말단 영역, 또는 센다이 바이러스 이외의 다른 바이러스로부터 유래된 등가의 P 단백질에서 대응되는 또는 상동적인 C-말단 영역은, 바람직하게는, 이 C-말단 영역은 바이러스 전사에 필수적인 것으로 생각되므로, 돌연변이를 포함하지 않는다.
재조합 RNA 바이러스 벡터는, 전술한 P 유전자의 돌연변이 뿐만 아니라, 바이러스의 다른 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 바이러스 전파 또는 바이러스 세포독성을 낮추거나, 바이러스 세포 특이성을 변형시키거나 또는 바이러스의 약독화를 매개하는 하나 이상의 유전자에, 추가적인 돌연변이를 보유할 수 있다. 예를 들어, 재조합 RNA 바이러스 벡터는 바이러스 외막 단백질을 코딩하는 유전자들 중 하나에 돌연변이 또는 결손을 추가로 가질 수 있다.
또한, 재조합 RNA 바이러스 벡터는, C, W 및 V ORF가 P 유전자의 N-말단 ORF와 겹치기 때문에, 바이러스 P 단백질에서의 N-말단의 결손의 결과로서, C, W 및/또는 V 오픈 리딩 프래임 (ORF)에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 아울러, 본원에 사용되는 재조합 RNA 바이러스 벡터는 C' 유전자의 얼터너티브 개시 코돈 ACG의 결손을 추가로 가질 수 있다. C' 유전자는 감염된 세포에서 항-IFN 반응 활성을 나타내는 것으로 공지된 비-구조 단백질을 코딩한다. C' 유전자의 개시 코돈의 결손시, 감염된 타겟 세포에서의 이종 유전자 산물의 발현 수준이 증가되는 것으로 확인되었다. 전형적으로, 따라서 수득가능한 이식 유전자의 발현 증가는 약 5% 이상, 바람직하게는 약 10% 이상, 더 바람직하게는 약 20% 이상이다.
본 발명에서, (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 이종 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 본원에서, 용어 "이종"은 본 발명의 범위내에서 사용되는 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 벡터 이외의 다른 소스로부터 유래된 단백질 또는 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다. 이종 핵산 산물은 바람직하게는 단백질이며, 특히 세포의 분화 수준이 낮은 상태로의 세포 리프로그래밍을 매개하거나 촉진시키는 리프로그래밍 인자, 해당 세포를 원하는 분화 상태로 분화시키는 프로그래밍 인자, 및 치료 단백질이다. 그러나, 이는 또한 리보자임, 안티센스-분자, siRNA 분자, miRNA 또는 piRNA 분자일 수 있다. 이종 핵산 서열은 전형적으로 바이러스 게놈에, 적절한 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결되게 포함된다.
본원에서, 용어 "리프로그래밍 인자" 또는 "세포의 리프로그래밍 인자"는 이종의 유전자 산물, 바람직하게는, 자체로 또는 다른 유전자 또는 이종 유전자 산물과 조합하여, 적어도 부분적으로 분화된 세포를 분화 수준이 낮은 세포로 전환시킬 수 있는, 단백질 또는 miRNA를 지칭하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서, 용어 "리프로그래밍 인자"에는, 세포 리프로그래밍을 촉진시키는 보조 인자가 포함된다 (즉, 이들 보조 인자들은 세포 리프로그래밍 효율을 높임). 세포 리프로그래밍 인자는 전형적으로, 배아 줄기 세포 또는 초기 배아에서 발현되지만, 분화된 체세포 대부분에서는 발현되지 않거나 발현 감소를 보이는, 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 이러한 배아 줄기 세포 특이 유전자는 전형적으로 전사 인자 및 핵단백질이다.
본원에 사용하기에 바람직한 세포 리프로그래밍 인자는 Oct-3, Oct-4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, Lin28, ASCL1, MYT1L, TBX3b, SV40 large T, hTERT, miR-291, miR-294, miR-295, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 이종 핵산 서열에 의해 코딩되는 "프로그래밍 인자"는, 소정의 세포를 원하는 분화된 상태로 분화시킬 수 있는 인자를 의미하는 것으로 의도된다. 그 예로는, 비-제한적으로, 신경 성장인자 (NGF), 섬유모세포 성장인자 (FGF), 인터루킨-6 (IL-6), 골 형태형성 (bone morphogenic) 단백질 (BMP), 뉴로게닌 3 (neurogenin 3) (Ngn3), 췌장 및 십이지장 호메오박스 1 (pancreatic and duodenal homeobox 1) (Pdx1), Mafa 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에 사용되는 치료 단백질은, 전형적으로, 중증 복합형 면역부전증에서의 아데노신 데아미나제 (ADA), 만성 육아육종 질환에서의 p91-PHOX, B형 혈우병에서의 팩터 IX, A형 혈우병에서의 팩터 VIII, 낭포성 섬유증에서의 낭포성 섬유증 막관통 컨덕턴스 조절자 (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 겸상 적혈구 빈혈에서의 베타-글로빈 (HBB), 뒤셴 근위축증에서의 디스트로핀, 레쉬-니한 증후군에서의 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실-트랜스퍼라제 (HGPRT), 페닐케톤뇨에서의 페닐알라닌 하이드록실라제 (PAH), 고셰병에서의 글루코실세르아미다제 (GBA 및 GBA2), 마판 증후군에서의 피브릴린-1 (FBN1), 헌팅턴 질환에서의 헌팅틴 (HTT) 및 이들의 조합과 같은 유전자 장애에서, 돌연변이의 결과로서 기능부전인 단백질의 생물 활성 형태를 포함한다.
또한, 본 발명의 방법은, 하나 이상의 치료 유전자를 전달함으로써, 다인성 유전자 장애들을 치료하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료 유전자로는, 아포지단백질 (apolipoprotein) B (apoB), 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR), 저밀도 지단백질 수용체 어댑터 단백질 1 (LDLRAP1), 프로단백질 컨버타제 섭틸리신/케신 타입 9 (PCSK9), 및 이들의 조합을 포함한다. 아울러, 파킨슨 질환을 치료하기 위한 치료 유전자로는 시뉴클레인 알파 (synuclein alpha, SNCA), parkin (PRKN), 루신-풍부 리피트 키나제 2 (LRRK2), PTEN 유발성 추정 키나제 1 (PINK1), 파킨슨 단백질 7 (DJ-1) 및 ATPase 타입 13A2 (ATP13A2)를 포함한다. 아울러, 암을 치료하기 위한 치료 유전자로는 암 자살 유전자, 항-신생혈관 인자, 및 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2) 및 암배아 항원 (CEA)을 포함한다.
특히 암 면역요법에 사용하는데 적합한 치료 단백질은, 과립구-대식식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 상피 성장 인자 (EGF) 등의 성장 인자, 및 인터루킨 IL-2, IL-4, IL-5, IL-12 및 IL-17을 비롯한 사이토카인, 뿐만 아니라 인터페론 등의 면역억제 단백질과 같은, 면역 자극 인자들을 더 포함할 수 있다.
복제-불능의 RNA 바이러스 벡터에 삽입되는 이종 핵산 서열은, 적용 부위와 핵산 서열이 전달되는 타겟 세포에 따라 인간 또는 다른 포유류로부터 유래될 수 있다. 핵산 서열 및 코딩된 아미노산 서열은, 이종 유전자 산물이 야생형 유전자 산물과 비슷한 기능적 활성을 나타내는 한 반드시 야생형 서열이어야 하는 것은 아니다. 핵산 서열은 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결손을 가질 수 있다. 이종 유전자 산물은 예를 들어 테그 (tag), 바람직하게는 VP16 테그를 더 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
이종의 핵산 서열의 고도 발현이 필요한 경우, 이 서열은 바이러스의 (-) 가닥 RNA 게놈의 3' 영역으로, 바람직하게는 바이러스 N 유전자 바로 앞에 삽입된다. 그 이유는, (-) 가닥의 RNA 바이러스는 파라믹소바이러스와 같이 이의 (-) 가닥 게놈의 3' 말단에서 전사 유닛들을 대부분 효율적으로 전사하기 때문이다. 유전자의 전사 수준은 하류로 갈수록 점차 감소되며, 이런 현상을 극성 효과 (polarity effect)라고 한다. 이는, 바이러스 게놈의 여러 부위에 이종 이식 유전자를 삽입함으로써, 이종 이식 유전자의 발현 수준을 조절하는 것이 가능하다. 그래서, 세포 독성 또는 발암 가능성을 가진 이종의 유전자 산물 (예, c-Myc)을 코딩하는 핵산 서열을, 바이러스 (-) 가닥의 게놈의 5' 영역에 삽입할 수 있다. 편리하게는, 이종의 핵산 서열은 전사 카세트로서 삽입할 수 있다. 수종의 이종의 핵산 서열은 바이러스 게놈에 독립적인 전사 카세트로서 삽입할 수 있다. 전사 카세트는 통상적으로 전사 개시 서열, 전사 종결인자, 바람직하게는 번역 신호들과 작동가능하게 연결된 이종의 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
또한, 이종 핵산 서열을 mRNA 안정화 인자와 작동가능하게 연결하는 것도 가능하다. 예를 들어, 우드척 간염 바이러스의 전사 후 조절 인자 (WPRE: Woodchuck hepatitis virus post-trancriptional regulatory element)를, mRNA를 안정시키고 그 발현을 연장하기 위해, 이식 유전자의 3' UTR 영역에 삽입할 수 있다.
본 발명의 측면에서, 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 벡터는 이종의 유전자 산물을 코딩하는 2 이상의 이종 핵산 서열을 보유할 수 있다. 다른 예로, 각각 이종의 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산 서열을 보유한, 2 이상의 복제-불능의 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터가 동시에 사용될 수 있다. 예를 들어, 복제-불능의 (-) 가닥 RNA 바이러스 벡터는 여러가지 리프로그래밍 인자들을 코딩하는 수개의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다른 예로, 서로 다른 리프로그래밍 인자를 코딩하는 다른 핵산 서열을 보유한 복수의 복제-불능성 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터들을 동시에 사용할 수 있다.
복제-불능의 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터는 용액, 현탁물, 동결건조물 또는 임의의 다른 형태의 형태로 제공할 수 있다. 또한, 이는, pH-조절제, 완충제, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 독성 조절제, 습윤제, 보강제 등과 조합하여 제공할 수도 있다.
적절한 바이러스 벡터는 환자의 의도한 용도, 신체 상태, 체중, 연령 및 성별, 투여 형태 및 조성물에 따라 투여한다. 전형적으로, 벡터 입자의 수는, 용도에 따라, 1회 투여 당, 적어도 1 x 104 - 1 x 108, 바람직하게는 5 x 105 - 1 x 107이다. 즉, 본 발명의 재조합 바이러스 벡터의 감염은, 용도에 따라, 감염다중도 (multiplicity of infection, MOI) 0.01 - 50, 더 바람직하게는 0.5 - 30으로 수행될 것이다.
본 발명에 따른 복제-불능의 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터는, 바이러스-생산 세포 및 바이러스-증폭 세포를 이용하여, WO 2006/084746 A1에 기술된 바와 같이 제조할 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바이러스 생산 세포는 바이러스 입자의 초기 생산에 사용된다. 바이러스 생산 세포는 바람직하게는 진핵 생물의 세포이며, 더 바람직하게는 포유류의 세포이다. 바이러스 생산 세포는, 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 복제-불능의 RNA 바이러스 벡터를 코딩하는 DNA 분자 뿐만 아니라, 유전자 산물이 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 인 트랜스 조합을 가능하게 하는 유전자 산물을 가지는 헬퍼 서열을 포함한다. 헬퍼 서열은 바이러스 N 단백질, 바이러스 P 단백질 및/또는 바이러스 L 단백질, 바람직하게는 바이러스 N 단백질과 바이러스 P 단백질을 포함한다. 헬퍼 세포는, 바이러스 N 단백질, 바이러스 P 단백질 및/또는 바이러스 L 단백질을 인 트랜스로 제공하는 하나 또는 수개의 추가적인 플라스미드 벡터를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 서열은 바이러스 P 유전자를 포함하며, 바이러스 N 및 P 유전자를 공동-발현함으로써 바이러스 입자의 생산을 유의하게 증가시킬 수 있다는 것이 놀랍게도 확인되었기 때문에, 바이러스 N 유전자를 더 포함한다. 다른 예로, 게놈에 삽입된 헬퍼 서열을 안정적으로 발현하는 헬퍼 세포를 사용할 수 있다.
헬퍼 서열은 바람직하게는 바이러스 생산 세포에서 DNA 의존적인 RNA 중합효소에 의한 전사를 허용하는 전사 신호와 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, 전사 신호는 해당 바이러스 생산 세포에 대해 이종인 전사 신호, 예컨대 T7 또는 SP6 프로모터 등의 박테리아파지 프로모터이다. 이 경우, 바이러스 생산 세포는, 헬퍼 서열의 전사를 매개하는, 이종의 DNA 의존적인 RNA 중합효소, 예컨대 T7 또는 SP6 RNA 중합효소를 포함한다.
본 발명에 사용되는 불제-불능의 RNA 바이러스를 코딩하는 DNA 분자는, 바람직하게는, 벡터 증폭 세포 (즉, E. coli와 같은 원핵 생물의 벡터를 증폭하는 세포) 뿐만 아니라 진핵 헬퍼 세포, 특히 포유류의 바이러스 생산 세포에서 증폭시키는데 적합한, 벡터 (예, 플라스미드 벡터)이다. 벡터는 복제 오리진 및/또는 선택 마커 서열 등의 상기 세포에서 증폭시키는데 필요한 유전자 인자들을 포함한다.
바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 분자는 헬퍼 서열과 연계되어 전술한 바와 같이 전사 신호와 일반적으로 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, DNA 분자는 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 서열의 3' 말단에 리보자임 서열과 전사 종결인자를 더 포함한다. 리보자임 서열은 바이러스 서열의 3' 말단에서 전사체의 절단을 허용한다.
바이러스 증폭 세포는 우선 바이러스 생산 세포에서 조립된 바이러스 입자를 증폭시키는데 사용된다. 바이러스 생산 세포로부터 입수되는 복제-불능의 재조합 RNA 바이러스는 바이러스 증폭 세포를 감염하는데 사용된다. 바이러스 증폭 세포는 전술한 바와 같이 헬퍼 서열들을 포함하여, 바이러스 N 단백질, 바이러스 P 단백질 및/또는 바이러스 L 단백질을 제공해준다. 바람직하게는, 게놈에 삽입된 헬퍼 서열을 안정적으로 발현하는 바이러스 증폭 세포를 사용한다. 바람직하게는, 바이러스 증폭 세포는 바이러스 N 및 P 단백질 뿐만 아니라 바이러스 L 단백질도 발현하도록 유전자 변형되는데, 그 이유는 이러한 공동-발현이 바이러스 생산성을 최대화한다고 놀랍게도 밝혀졌기 때문이다.
바람직하게는, 바이러스 증폭 세포는 포유류 세포이다. 특히, 바이러스 증폭 세포는 독일의 미생물 및 세포 배양물 콜렉션에 등재 번호 DSMACC2702로 기탁된 H29 세포일 수 있다. 다른 적합한 바이러스 증폭 세포로는, 언급된 헬퍼 서열 (즉, 바이러스 N, P 및/또는 L 유전자)로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염된, Vero 세포 (아프리카 푸른 원숭이의 신장 세포주) 유래 세포 또는 LLCMK2 세포 (레수스 원숭이 신장 세포주) 유래 세포가 있다.
본 발명의 방법에서, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 도입하기 위해, 매우 다양한 세포에 복제-불능의 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터를 감염시킬 수 있다. 복제-불능의 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터를 감염시킬 수 있는 세포의 예로는, 인간 포피 섬유모세포, 인간 조혈 줄기 세포 (CD34+ 세포), 수지상 세포, T 세포, B 세포, 대식 세포, 점막 조직의 세포, 간세포, 폐 섬유모세포 및 상피 세포를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
감염시킬 세포는 임의의 숙주 유기체로부터 수득하거나 유래할 수 있다. 세포는 해당 숙주 유기체로부터 생검 또는 혈액 샘플과 같은 샘플의 형태로 직접 취할 수 있다. 또한, 이는 숙주 유기체로부터 입수한 후 배양, 증식, 형질전환 또는 선택 처리에 노출된 세포일 수 있다. 일부 구현예들에서, 세포는 숙주 유기체에 포함될 수 있다. 예를 들어, 이는 숙주 유기체의 혈액 또는 장기에 존재할 수 있다.
세포가 유래되거나 수득되는 숙주 유기체는, 바람직하게는, 포유류이며, 특히 바람직하게는 인간이다. 포유류의 예는 비-제한적으로 랫, 마우스, 토끼, 기니아피그, 다람쥐, 햄스터, 들쥐, 오리너구리, 개, 염소, 말, 돼지, 코끼리, 닭, 마카크 및 침팬지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 적어도 부분적으로 분화된 세포를 분화 수준이 낮은 세포로 리프로그래밍하거나, 세포를 원하는 분화 상태로 프로그래밍하는, 시험관내 방법으로서, 본 방법은,
(a) 공여체로부터 프로그래밍할 세포 또는 적어도 부분적으로 분화된 세포를 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 제공된 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 상기 세포에 도입하는 단계, 및
(c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하며,
상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 이종의 핵산 서열은 세포의 리프로그래밍 인자 또는 프로그래밍 인자를 코딩한다.
용어 "분화된"은, 본원에서, 만능성 줄기 세포와 비교하여 제한된 잠재력을 나타내는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "잠재력"은 세포의 분화 가능성을 의미하며, 이는 세포가 다른 타입의 세포들로 분화할 수 있는 잠재력이다. 즉, 본 발명의 맥락에서, 분화된 세포는 다능성 줄기 세포 보다는 분화가 좀 더 진행된 모든 세포를 의미하며, 여전히 복수의 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있지만 전부 그런 것은 아닌 세포를 포함한다. 분화된 세포는, 구체적으로, 체세포를 포함한다. 마찬가지로, 용어 "분화"는 본원에서 특정 형태나 기능으로의 세포의 순응 (adaptation)을 지칭하는 것으로 의도된다. 분화는 보다 위임된 세포 (committed cell), 즉, 최종 분화된 세포와 같이 영구적으로 특정 기능을 위임받은 것으로 간주되는 세포를 만들어낸다.
아울러, 용어 "리프로그래밍" 또는 "탈분화"는, 본원에서, 특정 세포의 분화 상태를 분화 수준이 낮은 상태로 전환하는 것을 지칭한다. 용어 "리프로그래밍" 및 "탈분화"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 형태 또는 기능에 있어서 전문성 소실을 의미한다. 탈분화는 위임 정도가 약한 세포를 만들어낸다. 즉, 이는 특정 세포의 잠재력 수준의 증가를 의미하며, 최종 분화된 세포를 소능성 (oligopotent), 바람직하게는 다능성, 또는 더 바람직하게는 만능성으로 전환하는 것을 포함한다. 또한, 소능성 또는 다능성 세포와 같이 만능성 세포와 비교해 잠재력이 제한적인 세포의 분화 상태를, 이 보다 분화 수준이 낮은 상태로 전환하는 것도 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 리프로그래밍 또는 탈분화는 만능성 줄기 세포를 제외한 세포를 이의 분화 경로의 초기 상태 또는 임의의 중간 상태로 되돌리는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락내에서, "적어도 부분적으로 분화된 세포"는, 본원에서, 다세포성 유기체의 신체를 구성하는 세포를 의미하나, 생식체, 생식 세포, 생식 모세포 또는 만능성 줄기 세포는 제외된다. 일부 분화된 세포의 예로는, 예를 들어, 체세포의 줄기 세포, 계통-제한된 줄기 세포, 전구 세포 및 선조 세포를 포함한다. (더) 분화된 세포로는 체세포, 예컨대 최종 분화된 체세포를 포함한다. 바람직하게는 적어도 부분적으로 분화된 세포는 체세포의 줄기 세포, 계통-제한된 줄기 세포, 전구 세포, 선조 세포 및 최종 분화된 체세포로부터 선택되는 포유류 세포이다.
용어 "줄기 세포"는, 본원에서, 무한정 증식할 수 있으며, 자가-재생력을 가지고 있고, 다양한 전문화된 세포 타입으로 분화될 수 있는, 다세포 유기체의 세포를 지칭한다. 줄기 세포로는 배아 줄기 세포 (즉, 배반포의 내부 세포 덩어리 (inner cell mass)로부터 유래된 만능성 줄기 세포) 및 "체세포 줄기 세포"라고도 하는 성체 줄기 세포 (즉, 신체의 복구 시스템으로서 작용하여 성체 조직을 보충하는, 다양한 조직들에서 확인되는 다능성 줄기 세포)를 포함한다. 그 예로는, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 소위 암 줄기 세포도 포함된다. 다수 타입의 암이 이러한 암 줄기 세포를 포함하고 있는 것으로 확인되었으며, 이들 암 줄기 세포는 자가-재생력과 분화력을 특징으로 한다. 암 줄기 세포는 이것이 기원한 선조체와 비슷하지만, 줄기 세포에서 정상적으로 발현되는 자가-재생-관련 프로그램을 발현한다.
"전구 세포 (precursor cell)"는 본 발명의 의미에서 한가지 이상의 최종 형태로의 분화가 위임된 상태로 발생되어진 줄기 세포이다. 전구 세포는, 예를 들어, 새로운 혈액 세포, 계통-제한적인 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포와 같은 특정 타입을 형성하는 것으로 위임된다.
"선조 세포"는 본 발명의 의미에서 특정 타입의 세포, 예컨대 성숙한 체세포로의 분화 능력은 가지고 있으나 자가-재생에는 제한적인 능력을 가지는, 단능성 또는 다능성 세포이다. 적합한 선조 세포의 예로는, 비제한적으로, 신경 선조 세포, 내피세포 선조 세포, 적혈구 선조 세포, 심장 선조 세포, 희돌기교세포 선조 세포, 망막 선조 세포 또는 조혈 선조 세포를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"체세포"는 본 발명의 의미에서 적어도 부분적으로 분화된 세포이며, 생식 세포나 생식체를 포함하지 않는다. 본 발명에 사용되는 체세포는 피부, 신장, 비장, 부신, 간, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 비장, 방광, 전립선, 고환, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 심장, 눈 또는 신경 조직 등의 임의 조직의 세포일 수 있다. 적합한 체세포의 예로는 섬유모세포, 골수 세포, B 림프구, T 림프구, 골 세포, 골수 세포, 혈관 주위 세포, 수지상 세포, 각질형성 세포, 지방 세포, 간엽 세포, 상피 세포, 표피 세포, 내피 세포, 연골 세포, 난구 세포, 신경 세포, 신경교 세포, 성상 세포, 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포 (예, 평활근 세포 또는 골격근 세포), 췌장의 베타 세포, 멜라노사이트, 조혈 세포, 근세포, 대식 세포, 단핵구 및 단핵 세포를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
"최종 분화된 체세포"는 본 발명의 의미에서 분화 경로의 최종 단계에 있는 세포이다. 최종 분화된 체세포는 더욱 전문화된 형태나 기능으로의 점진적인 발생학적 변화를 겪은 성숙한 세포이다. 분화된 세포는 구분되는 특징을 가지며, 특수 기능을 수행하며, 이 보다 분화 수준이 낮은 카운트파트 보다 분열 가능성이 낮다.
본 발명의 방법에 따라 리프로그래밍되는 적어도 부분적으로 분화된 세포는, 특정 유기체로 구체적으로 한정되지 않으며, 비-제한적인 예로서 전술한 유기체를 포함한다. 또한, 세포 타입도 구체적으로 한정되지 않으며, 비-제한적인 예로서 전술한 세포를 포함한다. 바람직하게는, 리프로그래밍되는 세포는 최종 분화된 체세포이다.
본 발명의 의미에서, 본 발명의 시험관내 리프로그래밍 방법에 의해 형성되는 "분화 수준이 낮은 세포"는 적어도 부분적으로 분화된 오리지날 세포에 비해 잠재력이 증가된 세포이다. 바람직하게는, 적어도 부분적으로 분화된 세포를 분화 수준이 낮은 세포로 시험관내 리프로그래밍하는 방법은, 적어도 부분적으로 분화된 세포가 소능성, 다능성 또는 만능성 세포로 리프로그래밍되는 것을 특징으로 한다.
"만능성 세포"는 3가지의 생식 층 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화될 수 있는 잠재력을 가진 세포를 의미한다. "만능성"은 "전능성 (omnipotency (세포가 유기체의 모든 세포가 될 수 있는 잠재성)" 보다 낮은 수준의 잠재력을 의미한다.
"다능성 세포"는 복수의 세포로 분화되지만 한정된 수의 계통으로만 분화할 수 있는 잠재력을 가진 세포를 의미한다. 이는 만능성 보다 잠재력 수준이 낮은 것을 의미한다. 다능성 줄기 세포는 그 조직과 오리진의 장기에 특이적인 세포 타입으로만 정상적으로 분화하는 줄기 세포이다. 다능성 줄기 세포는 태아, 신생아 및 성체 기간 동안의, 다양한 조직 및 장기의 성장과 발생 뿐만 아니라 조직 손상시 재생 유도 기능과 성체 조직 항상성 유지에 관여한다. 조직 특이적인 다능성 세포를 총괄하여 "성체 줄기 세포"라 한다.
"소능성 세포"는 몇 종의 세포 타입으로만 분화할 수 있는 잠재력을 가진 세포를 의미한다. "소능성"은 다능성 보다 잠재력 수준이 낮은 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 리프로그래밍 방법에 의해 형성되는 분화 수준이 낮은 세포는 "유도된 만능성 줄기 (iPS) 세포"이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "유도된 만능성 줄기 세포" 또는 용어 "iPS 세포"는, 특정 줄기 세포와 관련된 리프로그래밍 인자를 이종 발현함으로써, 적어도 부분적으로 분화된 세포, 즉, 비-만능성 세포, 전형적으로 체세포로부터 인위적으로 파생시킨 만능성 줄기 세포 타입을 지칭한다. iPS 세포는, 줄기 세포 관련 유전자 발현 패턴, 염색사 메틸화 패턴, 배가 시간, 배상체 (embryoid body) 형성, 기형종 형성, 성장할 수 있는 키메라 형성, 잠재력 및 분화력 (differentiability)과 같은, 많은 측면들에서, 배아 줄기 세포와 같이 천연 만능성 줄기 세포와 유사하다.
용어 "만능성 줄기 세포"는, 본원에서, 3가지 생식 층, 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 줄기 세포를 지칭한다. "만능성 줄기 세포"는 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도된 만능성 줄기 (iPS) 세포와 같은 천연 만능성 줄기 세포를 포함한다. 배아 줄기 세포는 배반포의 안에 존재하는 내세포 집단 (inner cell mass)으로부터 유래되며, 태반 세포 또는 그외 자궁을 유지하고 있는 세포를 제외한, 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 새로운 살아있는 유기체를 형성하지는 못한다.
만능성은, 해당 줄기 세포 또는 줄기-유사 세포가, 이후 세포 혼합물로부터 완전히 통합된 유기체를 형성하는, 배아의 배반포와 조합된 후, 2종 이상의 유기체로부터 유래된 세포 혼성물인 키메라를 형성하는 능력으로 평가할 수 있다. 만능성을 평가하는 다른 방법은, 기형종을 형성할 수 있는 마우스의 피부 아래에 해당 줄기 세포를 주입하는 것이다. 다른 평가 방법은 사배체 보완 (tetraploid complementation)인데, 이 방법은 더 분화될 수 없는 4N 배아에 이를 주입하여 해당 세포의 만능성을 측정하는 생체내 검사이다. 형성된 정상 2N 배아는 유입된 만능성 세포로부터 계속 만들어진다.
또한, 세포의 분화 상태는 세포에 의해 표시되는 표현형을 기반으로 미시적으로 평가할 수 있다. 이와 관련하여 분화 상태를 평가하는 적합한 기법은 라만 현미분광분석법 또는 FT-IR 분광분석법이다. 다른 예로, 세포의 분화 상태는 세포의 분화 상태 마커, 전형적으로 세포성 단백질의 양을 측정함으로써, 평가할 수 있다. 분화 마커는, 마이크로어레이 혼성화 또는 항체 염색 등의 다양한 기법을 이용하여 mRNA 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있다. 일반적으로, 세포의 분화 상태를 평가하기 위한 수종의 마커들의 조합을 선택하는 것이 유리하다.
세포의 분화 상태에 대한 마커 단백질의 예로는, 비-제한적으로, Nanog, Oct-3/4, Sox2, Sall4, Tcll, Tbx3, Eras, Klf2, Klf4, Klf5, Baf250a, BCO31441, Eno3, Etv5, Gm1739, Gtf2h3, Hes6, Jub, Mtf2, Myodl, Nmycl, Notch4, Nr5a2, Nrg2, Otx2, Rab2b, Rbpsuh, Rest, Stat3, Utfl, Tcfap2c 및 Zfp553, 또는 Nanog, Oct4, Sox2, Sall4, Tcl 1, Tbx3, Eras, Klf2, Klf4, Klf5, Baf250a, BC031441, Eno3, Etv5, Gm1739, Gtf2h3, Hes6, Jub, Mtf2, Myodl, Nmycl, Notch4, Nr5a2, Nrg2, Otx2, Rab2b, Rbpsuh, Rest, Stat3, Utf1, Tcfap2c 및 Zfp553 중 하나의 프로모터의 메틸화 상태를 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 iPS 세포는, 전형적으로, ES-유사 세포의 마커인 알칼리 포스파타제를 발현한다. 나아가, 본 발명의 iPS는 통상적으로 내인성 Oct-3/4 또는 Nanog, 특히 Oct-3/4와 Nanog 둘다를 발현한다. 아울러, 이 세포는 바람직하게는 TERT를 발현하며, 텔로머라제 활성을 나타낸다.
본 발명에서, 여러가지 리프로그래밍 인자들을 조합 사용하여, 리프로그래밍될 세포의 세포 리프로그래밍을 유도할 수 있다. 리프로그래밍 인자를 코딩하는 수개의 유전자를 동일한 복제-불능의 RNA 바이러스 벡터에 삽입할 수 있다. 다른 예로, 여러가지 리프로그래밍 인자를 코딩하는 여러가지 핵산 서열들을 각각 개별 복제-불능의 바이러스 벡터에 삽입할 수 있다. 본 발명에 사용되는 복제-불능의 RNA 바이러스 벡터 역시 대상 이종의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산 서열을 보유한 여러가지 타입의 하나 이상의 벡터와 조합하여 사용할 수 있다.
본원에 채택된 복제-불능의 RNA 바이러스 벡터로부터 발현되는 리프로그래밍 인자는, bFGF, SCF, MAP 키나제 저해제, DNA 메틸라제 저해제 (예, 5-아자시티딘) 및 히스톤 데아세틸라제 저해제 (예, 서베로일아닐리드 하이드록사믹산 (SAHA), 트리코스타틴 A (TSA) 및 발프로산 (VPA))를 비롯하여, 세포의 리프로그래밍을 촉진하는 화합물과 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 이들 화합물의 첨가는 세포 리프로그래밍을 유도하는데 필요한 리프로그래밍 인자의 수를 제한할 수 있다. 아울러, 복제-불능의 RNA 바이러스를 이용한 체세포로의 리프로그래밍 인자의 전달은, 추가적인 내인성 리프로그래밍 인자의 내인성 발현을 유도하기 위해, 체세포에 대한 화합물 처리와 조합할 수 있다.
본 발명의 시험관내 프로그래밍 방법에서, 원하는 분화 상태로 프로그래밍되는 세포는, 비-제한적인 예로, 전술한 세포, 즉, 인간 포피 섬유모세포, 인간 조혈 줄기 세포 (CD34+ 세포), 수지상 세포, T 세포, B 세포, 대식세포, 점막 조직의 세포, 간세포, 폐 섬유모세포 및 상피 세포 등의, 최종 분화된 체세포이다.
본 발명의 맥락에서, 전형적으로 줄기-유사 세포를 리프로그래밍하는 시험관내 방법에 의해 수득되는 세포를 이용하여, 원하는 구체적인 분화된 세포를 입수할 수 있다. 이러한 세포는, 본 발명의 시험관내 프로그래밍 방법에 의해 수득되는 세포와 마찬가지로, 예를 들어 재생 의학에 사용할 수 있으며, 동일 개체 유래 세포를 이용하여 선택된 세포 타입의 세포를 제공할 수 있다는 이점을 가진다. 예로서, 인간 조혈 줄기 세포는 골수 이식이 필요한 의학적 치료에 사용할 수 있다. 또한, 이들 세포는 하나 이상의 세포주를 형성하는데에도 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 수득되는 세포는 수많은 생리학적 병태 및 질환, 예컨대, 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 질환, 난소암 및 백혈병과 같은 말기 암, 및 HIV 감염 ("AIDS")과 같은 면역계를 손상시키는 질환을 치료하는데 사용하기 적합할 것으로 예상된다. 치료가능한 생리학적 병태의 다른 예로는, 비-제한적으로, 척추 손상, 다발성 경화증, 근 위축증, 당뇨병, 간 질환, 즉, 고콜레스테롤혈증, 심장 질환, 연골 치환, 화상, 족부 궤양, 위장 질환, 혈관 질환, 신장 질환, 요로 질환 및 노화성 질환 및 병태를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 세포에서 이종 핵산 서열을 발현하는 방법은, 하나 이상의 이종 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 환자에게 투여하여, 상기 환자의 세포로 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하며, 상기 재조합 (-) 가닥 RNA 바이러스는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 이종의 핵산 서열은 유전자 장애를 치료할 수 있는 치료 단백질을 코딩하는 것인, 유전자 장애를 치료하는 생체내 방법이다.
다른 바람직한 구현예에서, 세포에서 이종 핵산 서열을 발현하는 방법은,
(a) 공여체로부터 세포를 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 제공된 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 상기 세포에 상기 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계, 및
(c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계 및/또는 세포를 증폭시키는 단계를 포함하며,
상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함함으로써, 바이러스 전사 능력은 소실되지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며, 상기 이종의 핵산 서열이 유전자 장애를 치료할 수 있는 치료 단백질을 코딩하는,
유전자 장애를 치료하는 시험관내 방법이다.
본 발명의 생체내 방법 및 시험관내 방법으로 치료할 유전자 장애는, 바람직하게는, 중증복합형 면역부전증, 만성 육아종성 장애, 혈우병 A/B, 낭포성 섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증, 뒤셴 근위축증, 레쉬-니한 증후군, 페닐케톤뇨, 고셰병, 마판 증후군, 헌팅턴 질환, 고콜레스테롤혈증, 파킨슨 질환, 디조지 증후군, 알츠하이머 질환 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
유전자 치료 방식은, 치료할 유전자 장애 및 감염시킬 세포 타입에 따라, 시험관내 또는 생체내로 수행할 수 있다.
생체내 유전자 치료 방식의 경우, 복제-불능 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터는 통상적인 방식으로, 예를 들어, 경구, 국소, 비강, 폐 등으로, 에어로졸, 용액, 산제 등의 형태로 투여할 수 있다. 생체내 유전자 치료 방식은 혈액 세포에 작용하는 유전자 장애를 타겟팅할 수 있다. 이 경우, 복제-불능 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터는 비경구로 투여할 수 있다. 폐 세포를 타겟팅하고자 한다면, 복제-불능 (-) 가닥의 RNA 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물을 폐로 투여할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 시험관내 방법, 특히 세포 리프로그래밍 또는 프로그래밍 시험관내 방법 및 시험관내 유전자 장애 치료 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다.
세포 또는 세포 집단은 다양한 질환을 치료하기 위한 약제로서 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 시험관내 리프로그래밍 방법에 의해 수득되는 리프로그래밍된 세포는 원하는 세포 타입으로 분화한 후, 소정의 질환의 치료에 사용할 수 있다. 특히, 시험관내 리프로그래밍 방법에 의해 제조되는 iPS 세포는 재생 치료법과 기초 연구에 이용할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 환자-특이적인 iPS 세포는, 예를 들어, 줄기 세포 요법에 사용하기 적합하다. 환자로부터 수집된 체세포를 먼저 본 발명의 시험관내 리프로그래밍 방법을 이용하여 분화 수준이 낮은 상태로 리프로그래밍하고, (예, 레티노익산, 성장인자, 사이토카인 및 호르몬을 처리함으로써) 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 따라 원하는 체세포 타입으로 분화시킨 후, 이를 환자에게 투여한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세포 또는 세포 집단, 또는 본 발명의 시험관내 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포 집단으로부터 유래된 재분화된 세포 또는 재분화된 세포의 집단을 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다. 탈분화된 세포를 분화시키기 위한 수단은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 또한 상기에 언급되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 용액, 현탁물 또는 의도한 용도에 적합한 임의의 다른 형태일 수 있다. 전형적으로, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다. pH 값을 조정하기 위한 제제, 완충제, 긴장성 조절제 등도 포함할 수 있다. 본 조성물은 일반적인 경로로 투여할 수 있다. 바이러스는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여되며, 투여량은 구체적인 용도 (예, 재생 치료 또는 유전자 치료), 질환 타입, 환자의 체중, 연령, 성별 및 건강 상태, 투여 방식과 제형 등에 따라 결정된다. 투여는 필요에 따라 1회 또는 수회일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 인간 의학 및/또는 수의학에 적용하기 적합하다. 재생 치료 뿐 아니라 유전자 치료에도 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 약학 조성물은 항종양 치료에 사용할 수 있다.
이제 본 발명은 하기 실시예들을 들어 더욱 설명될 것이다.
실시예
하기에서는, 본 발명의 방법의 사용이 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 이용하여 안전하고 신뢰할 수 있는 방식으로 이식 유전자 발현을 효과적이고 장기간 구현할 수 있음을 보여준다. 본 발명과 관련된 이러한 예상치 못한 유익한 특징들은 지금까지 의학적인 상태를 치료하는데 유용한 것으로 간주된 바 없는, 본원의 바이러스 벡터 타입의 새로운 활용 분야를 열어준다.
실시예 1
장기 이식 유전자 발현
Vero 세포에, N-말단 아미노산 2-77가 결여된 절단형 P 단백질을 코딩하는 돌연변이된 P 유전자와 유전자 발현의 전체 마커로서 그린 형광 단백질 (GFP)을 포함하는 바이러스 게놈 (SeV-PD2-77/GFP)을 가진 재조합 센다이 바이러스 (SeV)를, 감염 다중도 (MOI) 1로 감염시켰다. 형광 및 광 현미경 사진 (노출 시간 2초)을 100X 배율로 1일, 6일, 12일 및 30일에 취하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 검출가능한 GFP의 수준은 30일 정도의 기간 동안 매우 약간 감소되었으며, 30일 후에도 여전히 높은 것으로 생각되었다. 즉, 본 발명에 사용된 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는, 예상치 못하게도, 이식 유전자의 장기간 발현을 가능하게 한다. 이는, 생체외 및 생체내 유전자 치료학적 방식, 재생 치료에 사용하기에 적합한 분화 수준이 낮은 상태의 세포로의 세포 리프로그래밍 및 다양한 질환 치료에 사용하기 위한 특이적으로 분화된 세포 상태의 세포로의 세포 프로그래밍과 같은 새로운 다양한 응용 분야를 제공해준다.
실시예 2
이종 mRNA 발현에 대한 실시간 모니터링
바이러스 게놈에 이식 유전자 (SeV-PD2-77/Oct4)로서 포함된 전사 인자 "Oct4"를 가지는 재조합 복제-불능의 센다이 바이러스, 또는 바이러스 게놈에 이식 유전자 (SeV-PD2-77/Nanog)로서 포함된 전사 인자 "Nanog"를 가지는 재조합 복제-불능의 센다이 바이러스를 사용하여, 인간 포피 섬유모세포 (HFF)를 MOI 3 또는 20으로 감염시켰다. 2, 5, 8 및 12일째에, 총 세포 RNA를 트리아졸 (Invitrogen)을 이용하여 추출하고, 실시간 RT-PCR을 수행하였다. cDNA 합성 단계는 mRNA만 증폭시키는 올리고-(dT)12-18 프라이머를 이용하여 수행하였다 (효소 "superscript II"; Invitrogen).
실시간 RT-PCR은 당해 기술 분야의 당업자에 공지된 절차에 따라 수행하였다. 간략하게는, qPCR SYBR Green-Mix (ABgene, Surrey, UK)를 사용하였다. cDNA의 출발 양은, 각 샘플의 역치 사이클 (CT) 값들을 해당 표준 곡선의 CT 값과 비교함으로써, 계산하였다. 이 계산을 위해, 소프트웨어 "Mastercycler ep realplex" (Eppendorf)를 사용하였다. 정규화를 위해, 타겟 유전자들의 발현 수준들을 베타 액틴 전사체 수준과 비교하였다. 비-형질전이된 HFF 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
실시간 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분간 초기 변성; 변성 (95℃, 15초), 어닐링 (각 어닐링 온도들에 대해 하기 표 참조, 60초) 및 프라이머 연장 단계 (72℃, 60초)로 구성된 사이클 40회. 정확한 산물의 길이 존재는 겔 전기영동을 이용하여 관리하였다. 아래 프라이머 쌍들을 사용하였다:
정방향 역방향 어닐링 온도
베타 액틴 CAAGAGATGGCCACTGCC
(서열번호 1)		 CTTGATCTTCATGGTGCTAGGA
(서열번호 2)		 55℃
Nanog GGACAGGTTTCAGAAGCAGAAG
(서열번호 3)		 ACCATTGCTAGTCTTCAACCAC
(서열번호 4)		 59℃
Oct4 ATCCTCCCTTTATCCAGCCC
(서열번호 5)		 AGAAGGCGAAGTCTGAAGCC
(서열번호 6)		 60℃
비-형질전이된 HFF 세포를 mRNA 발현의 최저 수준을 규정해주는 음성 대조군으로 사용하였다 (본원에서는 "0.000"로 정해됨). 양성 대조군으로서, GFP 이식 유전자를 가지고 있으며, Oct4 이식 유전자와 Nanog 이식 유전자를 각각 발현하는, 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. 발현 수준은 병행 측정한 베타 액틴의 발현 수준에 대해 상대적으로 표시한다. 그 결과는 도 2 및 도 3에 나타낸다.
도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, MOI 3으로의 형질전이 (도 2에서 처음 4번의 시점들) 및 MOI 20으로의 형질전이 (도 2에서"MOI20"으로 표시됨) 시, Oct4의 mRNA 발현 수준이 5일 후에도 여전히 높았다 (MOI 3의 경우 대략적으로 약 30%, MOI 20의 경우에는 99% 이상). 마찬가지로, 도 3에 나타낸 바와 같이, Nanog의 발현 수준 역시 5일 후에도 여전히 높았다 (MOI 3의 경우 대략적으로 약 75%, MOI 20의 경우에는 기본적으로 100%). 심지어 8일 후에도 Oct4와 Nanog의 현저한 mRNA 발현이 관찰되었다.
P 단백질에서 아미노산 2-77이 결손된 복제-불능의 센다이 벡터로부터 관찰되는 장기간의 Oct-4 및 Nanog 발현은 놀라운 결과였다. 지금까지, 센다이 바이러스 핵캡시드의 반감기는 대략적으로 약 24시간인 것으로 보고되었다 (Mottet et al., Virology 176: 1-7 (1990)). 이 결과를 토대로, 센다이 바이러스와 같은 (-) 가닥의 RNA 바이러스가 다수 용도에 적합하지 않다는 것이 당해 기술 분야에서의 통념이었다.
그러나, 당해 기술 분야의 통념과는 대조적으로, 재조합 (-) 가닥의 RNA 바이러스가 이식 유전자를 장기간 발현시킬 수 있다는 것을 예상치 못하게도 발견하게 되었다. 아울러, 재조합 (-) 가닥의 RNA 바이러스는, 또한, 감염 시, 야생형 바이러스에 비해, 주형이 약 500 - 약 1000배 적게 존재한다는 사실에 비추어, 놀랍게도 높은 발현 수준을 달성하는 것으로 확인되었다.
실시예 3
센다이 P 유전자로부터 C' 단백질의 제거
바이러스 벡터 SeV-PΔ2-77을 이용한 장기간의 유전자 발현을 더욱 강화하기 위한 시도로, P 유전자에서의 유전자 변형을 조사하였다. 보다 구체적으로, 센다이 P 유전자는 P 단백질 뿐만 아니라 "C 단백질"로 알려진 그외 비-구조 단백질을 수개 코딩하고 있다. 이들 단백질은 얼터너티브 리딩 프레임 (P 단백질에 대해 -1 위치)으로부터 번역되거나, 또는 얼터너티브 번역 개시 코돈 (ACG 대신 AUG (ATG))을 이용하여 번역된다. 이러한 얼터너티브 개시 코돈의 사용으로, P 단백질의 유전자 발현율이 감소되는 것으로 보인다 (야생형에 대해 약 10-20% 감소). 문헌에서, C 단백질은 숙주 바이러스 상호작용에서 조절 인자로서, 주로 인터페론 반응의 길항제로서 작용하는 것으로 기술되어 있다.
본원에 기술된 실험에서는, SeV-PΔ2-77의 바이러스 벡터 게놈에서 C' 단백질의 개시 코돈을 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 제거하였다. 보다 구체적으로, 개시 코돈 "ACG"를 넌센스 코돈 "UCU" 또는 비슷한 넌센스 코돈으로 바꾸었다. 당업자라면 이 바이러스 벡터가 현재 인터페론 반응의 조기 발현으로 인해 세포에서 더 빨리 제거될 것이라고 예상할 것이지만, 놀랍게도, 이식 유전자의 발현이 증가 (20-40%)되었고, 벡터의 세포내 생존 시간도 단축되지 않았다.
실시예 4
복제-불능의 센다이 바이러스 벡터에 대한 최적 생산 시스템 평가
아미노산 2-77이 제거된 P 유전자를 가진 복제-불능의 센다이 벡터에 대한 최적의 생산 시스템을 평가하기 위해, 비교 실험들을 수행하였다. 보다 상세하게는, 3가지 조건을 비교하였다:
(1) 추가적인 이식 유전자로서 P 유전자만 가진 생산 세포주. 다른 모든 바이러스 구성 성분 (단백질)들이 여전히 벡터 게놈에서 이의 야생형 오리진에 코딩되어 있기 때문에, 벡터를 높은 수준의 양으로 생산하는데 충분하여야 한다.
(2) 센다이 바이러스 P 유전자 및 N 유전자가 안정적으로 통합된 생산 세포주. 이 조합은 벡터를 생산하는 동안 바이러스 단백질의 불균형을 발생시킬 것으로 예상되었다. 정상적으로는, N 단백질과 P 단백질은 숙주 세포에서 거의 동일한 수준으로 생산된다 (Homann et al., Virology 177: 131-140 (1990) 및 Tokusumi et al., Virus Research 86: 33-38 (2002)). 이 비율은 바이러스의 최적 증식에 중요한 것으로 간주된다. 그러나, 본 설정의 경우, N이 RNA 분자에 결합하는 고유한 활성으로 인해 세포독성인 것으로 알려져 있기 때문에, 생산율이 더 낮아야 하는 바이러스 N 단백질이 과잉 생산될 것으로 예상되었다.
(3) 센다이 바이러스 P, N 및 L 유전자가 안정적으로 통합된 생산 세포주. 이 조합은 핵캡시드의 모든 바이러스 단백질 구성 성분들을 반영하는 것이다. 따라서, 바이러스 생산을 지지하는 영향력을 가질 수 있다. 그러나, (2)번 세팅에서 이미 언급한 바와 같이, 또한 바이러스 게놈에 이미 코팅되어 있어, 바이러스 게놈이 생산되는 동안 발현되는, 바이러스 구성 성분 N과 L의 불균형이 발생할 수 있다.
놀랍게도, (2)번 조건이 바이러스 벡터를 생산하는데 최상의 조합인 것으로 파악되었다. (3)번 조건이 생산될 수 있는 벡터의 양과 관련해서는 충분히 비슷하였지만, (3)번 조건이 3번인 것에 비해 (2)번 조건에는 오직 2개의 유전자만 세포에 도입한다는 점에서 유리하다.
SEQUENCE LISTING <110> AmVac AG <120> Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand RNA virus vector <130> 108695P546EP <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer beta actin <400> 1 caagagatgg ccactgcc 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer beta actin <400> 2 cttgatcttc atggtgctag ga 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer Nanog <400> 3 ggacaggttt cagaagcaga ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer Nanog <400> 4 accattgcta gtcttcaacc ac 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer Oct4 <400> 5 atcctccctt tatccagccc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer Oct4 <400> 6 agaaggcgaa gtctgaagcc 20

Claims (15)

  1. 세포에서 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는 방법으로서,
    상기 세포에, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시킴으로써, 상기 세포에 상기 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하며,
    상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터는 돌연변이된 P 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함하므로써, 바이러스 전사 능력은 소실하지 않으면서 바이러스 게놈 복제 능력은 소실하게 되며,
    상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열은 세포의 리프로그래밍 또는 프로그래밍 인자, 또는 치료 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터가 센다이 바이러스, 파라인플루엔자바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스를 포함하는 파라믹소바이러스, 또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 또는 광견병 바이러스를 포함하는 랍도바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 P 단백질의 돌연변이는 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 서열 2-77 중 하나 이상의 아미노산의 결손 또는 치환, 또는 이들 서열로의 삽입, 또는 센다이 바이러스 이외의 다른 바이러스의 경우, 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 서열 2-77과 상동적인 아미노산 서열의 결손 또는 치환, 또는 이들 서열로의 삽입인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는,
    (a) 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 2-77의 결손, 또는 센다이 바이러스 이외의 다른 바이러스의 경우, 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 2-77에 상동적인 아미노산들의 결손, 또는
    (b) 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 33-41의 결손, 또는 센다이 바이러스 이외의 다른 바이러스의 경우, 센다이 바이러스의 P 단백질의 아미노산 33-41에 상동적인 아미노산들의 결손인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 세포의 리프로그래밍 인자가 Nanog, Oct-3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28, ASCL1, MYT1L, TBX3b, SV40 large T, hTERT, miR-291, miR-294, miR-295 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 및/또는
    상기 프로그래밍 인자가 신경 성장인자 (NGF), 섬유모세포 성장인자 (FGF), 인터루킨-6 (IL-6), 골 형태형성 단백질 (BMP), 뉴로게닌3 (Ngn3), 췌장 및 십이지장 호메오박스 1 (Pdx1), Mafa 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 치료 단백질이 아데노신 데아미나제 (ADA), p91-PHOX, 팩터 IX, 팩터 VIII, 낭포성 섬유증 막관통 컨덕턴스 조절자 (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 베타-글로빈 (HBB), 디스트로핀 (dystrophin), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실-트랜스퍼라제 (HGPRT), 페닐알라닌 하이드록실라제 (PAH), 글루코실세르아미다제 (GBA 및 GBA2), 피브릴린-1 (FBN1), 헌팅틴 (HTT), 아포지단백질 (apolipoprotein) B (apoB), 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR), 저밀도 지단백질 수용체 어댑터 단백질 1 (LDLRAP1), 프로단백질 컨버타제 섭틸리신/케신 타입 9 (PCSK9), 시뉴클레인 알파 (synuclein alpha, SNCA), parkin (PRKN), 루신-풍부 리피트 키나제 2 (LRRK2), PTEN 유발성 추정 키나제 1 (PINK1), 파킨슨 단백질 7 (DJ-1), ATPase 타입 13A2 (ATP13A2), 암 자살 유전자 산물, 항-신생혈관 인자, 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2) 및 암배아 항원 (CEA)을 포함하여 암 자가 항원, 면역 조절 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 상피 성장 인자 (EGF)를 포함하여 성장 인자, 인터루킨 IL-2, IL-4, IL-5, IL-12 및 IL-17을 포함하여 사이토카인, 면역억제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    (a) 공여체로부터 프로그래밍할 세포 또는 적어도 부분적으로 분화된 세포를 제공하는 단계,
    (b) 단계 (a)에서 제공된 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 상기 세포에 도입하는 단계, 및
    (c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 이종의 핵산 서열은 세포의 리프로그래밍 인자 또는 프로그래밍 인자를 코딩하는 것인,
    적어도 부분적으로 분화된 세포를 분화 수준이 낮은 세포로 리프로그래밍하거나, 세포를 원하는 분화 수준의 상태로 프로그래밍하는, 시험관내 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 적어도 부분적으로 분화된 세포가 최종 분화된 체세포, 전구 세포 (precursor cell), 계통-제한된 줄기 세포, 체세포의 줄기 세포 및 선조 세포 (progenitor cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 적어도 부분적으로 분화된 세포가 소능성 (oligopotent), 다능성 (multipotent) 또는 만능성 (pluripotent cell) 세포로 리프로그래밍 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 프로그래밍될 세포가 최종 분화된 체세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    하나 이상의 이종 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 환자에게 투여하여, 상기 환자의 세포로 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하며,
    상기 이종의 핵산 서열이 유전자 장애를 치료할 수 있는 치료 단백질을 코딩하는 것인,
    유전자 장애를 치료하는 생체내 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    (a) 공여체로부터의 세포를 제공하는 단계,
    (b) 단계 (a)에서 제공된 세포에, 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 포함하는 (-) 가닥의 재조합 RNA 바이러스 벡터를 감염시켜, 상기 세포에 상기 하나 이상의 이종 핵산 서열을 도입하는 단계, 및
    (c) 상기 감염된 세포를, 상기 하나 이상의 이종의 핵산 서열을 발현하는데 유효한 조건 하에 배양하는 단계 및/또는 세포를 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기 이종의 핵산 서열이 유전자 장애를 치료할 수 있는 치료 단백질을 코딩하는 것인,
    유전자 장애를 치료하는 시험관내 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 또는 제12항 중 어느 한항의 방법에 의해 시험관내에서 제조되는 세포 또는 세포 집단.
  14. 의약제로서 사용하기 위한 제13항의 세포 또는 세포 집단.
  15. 제13항에 따른 세포 또는 세포 집단, 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한항에 따른 시험관내 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포 집단으로부터 유래된 재분화된 세포 또는 재분화된 세포의 집단을 포함하는, 약학 조성물.
KR1020147034235A 2012-05-30 2013-05-24 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법 KR20150014482A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261652913P 2012-05-30 2012-05-30
US61/652,913 2012-05-30
EP12004148.8 2012-05-30
EP12004148.8A EP2669381A1 (en) 2012-05-30 2012-05-30 Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand RNA virus vector comprising a mutated P protein
PCT/EP2013/001547 WO2013178344A1 (en) 2012-05-30 2013-05-24 Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand rna virus vector

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207006156A Division KR20200037835A (ko) 2012-05-30 2013-05-24 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150014482A true KR20150014482A (ko) 2015-02-06

Family

ID=46229168

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147034235A KR20150014482A (ko) 2012-05-30 2013-05-24 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법
KR1020207006156A KR20200037835A (ko) 2012-05-30 2013-05-24 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207006156A KR20200037835A (ko) 2012-05-30 2013-05-24 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20150133531A1 (ko)
EP (2) EP2669381A1 (ko)
JP (2) JP2015523065A (ko)
KR (2) KR20150014482A (ko)
CN (2) CN104379752A (ko)
AU (1) AU2013270018B2 (ko)
CA (1) CA2873814A1 (ko)
EA (1) EA201492202A1 (ko)
IL (1) IL235381A0 (ko)
IN (1) IN2014DN08960A (ko)
MX (1) MX2014014507A (ko)
RU (1) RU2014152275A (ko)
SG (2) SG11201407866XA (ko)
WO (1) WO2013178344A1 (ko)
ZA (1) ZA201407468B (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY147379A (en) 2005-12-02 2012-11-30 Sinai School Medicine Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
ES2759015T3 (es) 2010-02-10 2020-05-07 Mayo Found Medical Education & Res Métodos y materiales para tratar el cáncer
EP2825693B1 (en) 2012-03-15 2018-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
EA038981B1 (ru) 2013-03-14 2021-11-17 Икан Скул Оф Медсин Эт Маунт Синай Вирусы болезни ньюкасла и их применение
SG11201607130RA (en) 2014-02-27 2016-09-29 Viralytics Ltd Combination method for treatment of cancer
US10441643B2 (en) 2014-03-19 2019-10-15 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
WO2015143223A1 (en) * 2014-03-19 2015-09-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
AU2015241422B2 (en) 2014-04-01 2020-12-03 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
US11672830B2 (en) * 2016-04-15 2023-06-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education MicroRNA-294 and Lin28A as a driver of cardiac tissue proliferation in response to pathological injury
EP3518941B1 (en) * 2016-09-30 2022-03-09 Mayo Foundation for Medical Education and Research Viral vectors for nuclear reprogramming
JP6949468B2 (ja) * 2016-10-17 2021-10-13 ルプレヒト−カールス−ウニベルジテート ハイデルベルク 腫瘍抗原をコードする麻疹ウイルス
US10633689B2 (en) * 2016-11-07 2020-04-28 Spark Therapeutics, Inc. Rab Escort Protein potency assay
US20210230631A1 (en) * 2018-04-27 2021-07-29 Rocket Pharmaceuticals, Ltd. Gene therapy for cns degeneration
CN108715868A (zh) * 2018-05-31 2018-10-30 深圳市免疫基因治疗研究院 一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
CN109666727B (zh) * 2018-12-29 2020-11-06 中国药科大学 一种高活性抑制pcsk9表达的微小rna的用途
CN110178792B (zh) * 2019-05-07 2021-11-16 哈尔滨医科大学 一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法
CN112795578B (zh) * 2021-02-07 2022-06-10 沈阳农业大学 稻瘟菌MoPTEN基因及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005006388A1 (de) 2005-02-11 2006-08-24 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replikationsdefiziente RNA-Viren als Impfstoffe
DK2322611T3 (en) 2008-07-16 2016-09-05 Ip Pharma Co Ltd A process for producing reprogrammed cells using chromosomally non-integrated viral vector
JP5633075B2 (ja) * 2009-05-18 2014-12-03 独立行政法人産業技術総合研究所 多能性幹細胞作成用ベクター材料及びこれを用いた多能性幹細胞作成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104379752A (zh) 2015-02-25
JP2018023388A (ja) 2018-02-15
EP2669381A1 (en) 2013-12-04
RU2014152275A (ru) 2016-07-20
EP2855683A1 (en) 2015-04-08
AU2013270018B2 (en) 2019-02-14
SG11201407866XA (en) 2014-12-30
CA2873814A1 (en) 2013-12-05
SG10201701054XA (en) 2017-04-27
AU2013270018A1 (en) 2014-12-18
KR20200037835A (ko) 2020-04-09
MX2014014507A (es) 2015-05-12
WO2013178344A1 (en) 2013-12-05
IN2014DN08960A (ko) 2015-05-22
US20150133531A1 (en) 2015-05-14
JP2015523065A (ja) 2015-08-13
ZA201407468B (en) 2022-11-30
EA201492202A1 (ru) 2015-03-31
CN108192921A (zh) 2018-06-22
IL235381A0 (en) 2014-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150014482A (ko) 재조합 네거티브―가닥의 rna 바이러스 벡터를 이용한 이종 단백질의 발현 방법
Bayart et al. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells
Revilla et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell‐based regenerative medicine
US9714280B2 (en) HLA G-modified cells and methods
JP5633075B2 (ja) 多能性幹細胞作成用ベクター材料及びこれを用いた多能性幹細胞作成方法
US20150184131A1 (en) Enhanced Efficiency of Induced Pluripotent Stem Cell Generation
EP2268809A1 (en) Method of nuclear reprogramming
US9365866B2 (en) Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same
KR20150035594A (ko) 합성 메신저 rna에 의한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리 유래
JP2019500910A (ja) ベクターを含まない人工多能性幹細胞を作製するための方法およびベクター
Jin et al. Effective restoration of dystrophin expression in iPSC Mdx-derived muscle progenitor cells using the CRISPR/Cas9 system and homology-directed repair technology
JP2016028592A (ja) 機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法
Wang et al. Measles vector as a multigene delivery platform facilitating iPSC reprogramming
Pietronave et al. Advances and applications of induced pluripotent stem cells
WO2012075462A2 (en) Methods and compositions for treatment of muscular dystrophy
TWI650419B (zh) 藉移植增加壽命及/或治療細胞增殖疾病之方法
WO2016072446A1 (ja) ウイルスベクター、細胞およびコンストラクト
WO2021173449A1 (en) Orthogonal safety switches to eliminate genetically engineered cells
Varga et al. Novel possible pharmaceutical research tools: stem cells, gene delivery and their combination
WO2012156721A1 (en) Methods for providing human cells comprising a human artificial chromosome
EP4242317A1 (en) Method for producing reversibly immortalized cell
WO2016171625A1 (en) Targeting telomerase for cell therapy
Lenardič et al. Generation of allogenic and xenogeneic functional muscle stem cells for intramuscular transplantation
KR20170023014A (ko) 합성 메신저 rna를 사용한 인간-유도된 만능 줄기 세포의 무-피더 유래
JP2004344001A (ja) 胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application