TWI650419B

TWI650419B - 藉移植增加壽命及/或治療細胞增殖疾病之方法

Info

Publication number: TWI650419B
Application number: TW106131490A
Authority: TW
Inventors: 沈哲鯤; Che-Kun James Shen; 徐于喬; Yu-Chiau SHYU; 洪浚皓; Chun-Hao Hung
Original assignee: 中央研究院; Academia Sinica
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2019-02-11
Also published as: US11266697B2; EP3512538A4; KR102291187B1; CA3036690C; WO2018052964A1; US20220143102A1; JP2021088596A; AU2017326234A1; KR20190040498A; KR20210094665A; AU2017326234B2; EP3512538A1; JP6846524B2; JP2019532099A; CA3036690A1; TW201812002A; US20190282625A1; KR102434566B1; CN110114077A

Abstract

本發明發現，首先，經由移植由編碼造血轉錄因子EKLF之經基因工程改造之EKLF基因組成的骨髓單核細胞(BMMNC)或造血幹細胞(HSC)/造血幹祖細胞(HSPC)來傳遞腫瘤抗性及其他健康長壽特徵之可行性。其次，本發明證明EKLF在長期造血幹細胞(LT-HSC)中之表現，且因此EKLF作為調節造血之靶標。

Description

藉移植增加壽命及/或治療細胞增殖疾病之方法

本發明係關於幹細胞之領域。特定而言，本發明係關於經由移植(諸如骨髓移植或多能幹細胞移植)攜載編碼EKLF多肽之經修飾Eklf基因的造血幹細胞(HSC)及/或造血幹祖細胞(HSPC)向個體傳遞腫瘤抗性及健康長壽。

造血為造血/血液系統產生多種類型之骨髓及淋巴血球之過程。淋巴及骨髓譜系定型發生於包括多能祖細胞(MPP)、共同骨髓祖細胞(CMP)、骨髓/紅血球系祖細胞(MEP)、粒細胞/巨噬細胞祖細胞(GMP)及共同淋巴祖細胞(CLP)之多能造血祖細胞中，其中經由造血幹細胞(HSC)之自我更新及分化產生MPP。在恆定條件下，HSC主要駐留於G0期。由於處於造血細胞系統之最頂部，HSC在造血中起主要作用，且調節HSC之恆定決定了各種造血細胞/血球之下游命運。值得注意的是，多個細胞介素(諸如IL-3、IL-7、SCF、TPO及GM-CSF等)及轉錄因子(諸如Notch1、Tal-1、HoxB4、GATA1、GATA2及GATA3等)涉及HSC及造血祖細胞之恆定之調節。經純化HSC之形態學及功能特性已經廣泛地被表徵。並且，已有多項研究在分子及細胞層次上對HSC之自我更新、維持及分化之調節進行報導。

長壽基因具有顯而易見的利益及重要性，此兩者是有關於其壽命延長潛在性及提高生活品質之可能性。然而，關於此等基因如何起作用以防止老化且促進壽命延長，此等基因中只有極少數已經被鑑別出來且甚至更少數被理解。WO 2016036727提供包含一或多個經修飾紅血球系Kruppel樣因子(EKLF)基因之非人類轉殖基因動物，該一或多個經修飾EKLF基因編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽。經基因改變之EKLF小鼠顯示壽命延長、健康壽命延長及對癌症發病率及/或癌轉移之抗性。因此，經修飾Eklf基因及其產物可用於防止老化並治療腫瘤。

EKLF/KLF1為Krüppel樣因子家族之第一個成員，由N端活化結構域、C端鋅指結構域及多個轉譯後修飾位點組成。小鼠胎肝臟之全基因組分析已鑑別出多個基因，該多個基因之活化或抑制係經由EKLF與特定調節區域之DNA結合所調節。EKLF/KLF1最初經鑑別是紅血球系特異性轉錄因子，但隨後發現亦在包括MEP、GMP以及CMP之巨核細胞及造血祖細胞中表現(Frontelo,P.、Manwani,D.、Galdass,M.、Karsunky,H.、Lohmann,F.、Gallagher,P.G.及Bieker,J.J.(2007)。Novel role for EKLF in megakaryocyte lineage commitment.Blood 110,3871-3880)。功能喪失及功能獲得研究已證明EKLF不僅調節紅血球生成之過程(Porcu.S.、Manchinu,M.F.、Marongiu,M.F.、Sogos,V.、Poddie,D.、Asunis,I.、Porcu,L.、Marini,M.G.、Moi,P.、Cao,A.等人(2011)。Klfl affects DNase II-alpha expression in the central macrophage of a fetal liver erythroblastic island：a non-cell-autonomous role in definitive erythropoiesis.Mol Cell Biol 31,4144-4154)，且亦決定自MEP至紅血球或巨核細胞之分化命運。

然而，除巨核細胞-紅血球分離及單核細胞至巨噬細胞外，EKLF是否及如何廣泛參與造血之調節仍然係未知的。

本發明係關於，首先，經由移植由編碼造血轉錄因子EKLF之經基因工程改造之Eklf基因組成的骨髓單核細胞(BMMNC)或造血幹細胞(HSC)/造血幹祖細胞(HSPC)來傳遞腫瘤抗性及其他健康長壽特徵之可行性。其次，本發明係關於EKLF在長期造血幹細胞(LT-HSC)中之表現，且因此EKLF作為調節造血之靶標的驗證。

造血系統之恆定一部分取決於LT-HSC之自我更新與具有分化能力之各種造血前驅細胞之增殖的平衡，該等分化能力係由各種細胞介素及信號轉導路徑調控。本發明發現EKLF在長期造血幹細胞(LT-HSC)中以相對較高水準表現，該等長期造血幹細胞處於造血/血液系統之分化程序之最頂部。本發明亦發現EKLF之耗竭會導致不同類型的造血細胞/血球之群體變化，特定而言，LT-HSC減少且造血祖細胞增加。因此，腫瘤抗性及健康長壽可經由攜載編碼造血轉錄因子EKLF之經基因工程改造之Eklf基因的骨髓移植或HSC/HSPC之幹細胞移植來傳遞。

因此，本發明提供一種增加個體之壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之方法，其包含：(a)將胚胎幹細胞(ESC)、經誘導多能細胞(iPSC)及/或臍帶血幹細胞(CBSC)基因工程改造成具有編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾紅血球系Kruppel樣因子(Eklf)基因；(b)使該等經基因工程改造之 ESC、iPSC及/或CSBC分化，以獲得造血幹細胞(HSC)及/或造血幹祖細胞(HSPC)；及(c)將HSC及/或HSPC移植至個體；藉此經移植HSC及/或HSPC向個體賦予健康長壽及/或腫瘤抗性或轉移抗性。

本發明亦提供一種增加個體之壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之方法，其包含：(a)自包含一或多個經修飾Eklf基因的供體個體收集骨髓，該一或多個經修飾Eklf基因編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽；(b)分離包含HSC及/或HSPC之骨髓單核細胞(BMMNC)，該等HSC及/或HSPC攜載該一或多個經修飾Eklf基因；及(c)將BMMNC移植至受體個體，藉此受體個體被賦予腫瘤抗性及/或健康長壽。

因此，本發明提供用編碼EKLF多肽之基因所工程改造之細胞，該EKLF多肽相較於野生型EKLF多肽包含至少一個胺基酸修飾，其中該細胞為ESC、iPSC、CBSC、HSC、HSPC或BMMNC。

在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾包含對應於全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾。在關於小鼠以外之動物的某些實施例中，一或多個胺基酸修飾包含對應於小鼠EKLF多肽中之此殘基之小分子類泛素化胺基酸殘基之修飾，但該修飾可位於不同位置處。舉例而言，在人類EKLF多肽中，對應於小鼠EKLF多肽中之位置74之小分子類泛素化位點係位於胺基酸殘基54處。在特定實施例中，其為Lys殘基。在某些實施例中，對應於位置54或位置74之胺基酸之修飾為用Arg取代Lys(K54R或K74R)或用賦予腫瘤抗性及健康長壽之另一胺基酸取代Lys。

在一些實施例中，經由使用編碼經修飾EKLF多肽之病毒載體，或經由使用成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白質 (Cas)系統來轉導細胞以表現經修飾EKLF多肽。

在一個實施例中，經修飾EKLF多肽之表現會導致壽命提高、抗轉移及/或抗腫瘤形成。

在一個實施例中，EKLF在LT-HSC中以相對較高水準表現，且EKLF之耗竭會導致不同類型的造血細胞/血球之群體變化。在另一實施例中，EKLF在LT-HSC及造血祖細胞(諸如MPP、CMP、GMP及MEP)中負調節群落刺激因子2受體次單位Csf2rb之表現。

圖1(A)至圖1(C)顯示基因剔除(KO)Eklf之小鼠之產生。(A)靶向策略。該示意圖顯示Eklf基因座之基因內容及靶向BAC構築體之圖譜，該靶向BAC構築體在Eklf基因之內含子1區域中攜載倒置的loxP-PGK-gb2-neo-loxP卡匣。關於基於PCR之基因分型，將50bp缺失(灰色區塊)導入至LoxP位點之5'端之後的內含子1中。用於基因分型之PCR引子之位置顯示為小的黑色箭頭：5'-缺失：5'-GCG GCG CGA TAA CTT CGT AT-3'(SEQ ID NO：1)、5'-PGK：5'-TTG AAT TCT GCT TCC TGT TGG A-3'(SEQ ID NO：2)、EKLF-F：5'-AGG CAG AAG AGA GAG AGG AGG C-3'(SEQ ID NO：3)、3'-缺失：5'-CCT ATT TCT CCA ACA GGA AGC A-3'(SEQ ID NO：4)、PGK-R：5'-CTG GCC CTC AAA CAA CCC TG-3'(SEQ ID NO：5)、3'-PGK：5'-GTT ATG CGG CCC TAG TGA TTT A-3'(SEQ ID NO：6)。Nifx及Fbwx9為側接Eklf基因座之兩個遠端基因座。neo，新黴素抗性基因；PGK，磷酸甘油酸激酶I啟動子；黑色箭頭，原核啟動子gb2；黑色箭頭頭部，loxP位點。(B)左側圖，同型接合Eklf ^-/-(KO)之貧血表現型。E14.5胚與WT E14.5胚之對比。右上2個圖，E14.5胚之基因分型。尾基因組DNA係藉由使用用於野生型(5'-PGK及3'-PGK)及突變型(5'-缺失及3'-缺失)之特定引子之PCR來擴增。+/+，野生型；+/-，異型接合Eklf ^+/-；-/-，同型接合Eklf ^-/-。右下2個圖，免疫墨點(IB)分析顯示EKLF蛋白質表現利用Eklf基因剔除而耗竭。β-肌動蛋白用作內部對照。(C)WT及Eklf ^-/-小鼠之E14.5胎肝臟細胞之對比FACS分析。注意，紅血球譜系之Ter119⁺細胞減少而Eklf ^-/- E14.5胎肝臟中之CD41⁺、CD42d⁺巨核細胞增多，此類似於Frohtelo等人的報導(2007)。N=3。

圖2(A)及圖2(B)顯示Eklf ^-/-E14.5胎肝臟之骨髓譜系細胞之群體變化。FACS分析。不同抗體組合用於鑑別LT-HSC(Lin^-、CD117⁺、Sca-1⁺、Thy1.1^lo、Flk2^-、CD34^-)、MPP(Lin^-、CD117⁺、Sca-1⁺、Thy1.1^-、Flk2⁺)、CMP(Lin^-、CD117⁺、Sca-1^-、CD34⁺、CD16/32^int)、GMP(Lin^-、CD117⁺、Sca-1^-、CD34⁺、CD16/32^hi)及MEP(Lin^-、CD117⁺、Sca-1^-、CD34^-、CD16/32^lo/int)。分化細胞經鑑別如下：單核細胞(CD11b⁺、CD11c^-)、樹突狀細胞(CD11b^-、33D1⁺)、巨噬細胞(F4/80⁺)。粒細胞之流資料並未顯示於此。N6。(B)顯示Eklf ^-/-E14.5胎肝臟相較於WT中之不同類型的細胞之造血之分化圖及群體變化的草圖表。

圖3(A)及圖3(B)顯示Eklf及其靶基因Csf2rb之表現。(A)自不同類型之造血幹細胞及祖細胞分離之RNA之RT-qPCR分析，該等造血幹細胞及祖細胞包括利用FACS自E14.5小鼠胎肝臟純化之LT-HSC、MPP、CMP、GMP及MEP。將所有前驅細胞中之Eklf mRNA之相對含量與左側圖中具有MEP設定為1之水準之小鼠紅白血病(MEL)細胞之相對含量進行比較。來自WT及Eklf ^-/-小鼠之E14.5胎肝臟之LT-HSC及MPP中之Eklf mRNA之比對RT-qPCR分析係分別顯示於右側圖中。(B)經純化CMP、GMP、MEP及MPP中之Csf2rb、Stat1及Stat2之mRNA含量之RT-qPCR分析。注意，所有四個細胞類型中之Csf2rb mRNA顯著增多，但是僅在MEP中之Stat2 mRNA增多且MEP以及MPP中之Stat1 mRNA增多。針對各類型之細胞分析五個生物複本。各條柱表示平均值±標準差。* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001。

圖4(A)至圖4(D)顯示利用EKLF對LT-HSC分化之調節。(A)藉由RT-qPCR分析自WT及KO E14.5小鼠胎肝臟純化之LT-HSC中之Csf2rb mRNA之相對含量。N5。** p<0.01。(B)WT-LT-HSC及KO-LT-HSC中之EKLF及CSF2RB之表現之免疫螢光染色分析。DAPI為細胞核標記。注意，KO-LT-HSC中缺乏EKLF信號。並且，來自KO-LT-HSC中之CSF2RB蛋白質之染色的信號強於WT-LT-HSC之彼信號。分析三個生物複本。LT-HSC之直徑的範圍為5μm至10μm。右側圖顯示相較於WT-LT-HSC之KO-LT-HSC中之CSF2RB蛋白質增多之統計分析。p<0.001(C)利用流式細胞量測術對自E14.5胎肝臟細胞純化(>90%)之WT-LT-HSC及KO-LT-HSC執行甲基纖維素群落分析。注意，當相較於WT-LT-HSC時，用細胞介素/因子處理3至4週的KO-LT-HSC顯示群落數目增大約2.5倍。每孔使用1,000細胞。N4。*** p<0.001。(D)顯示LT-HSC之恆定中之EKLF之調節作用之簡單模型，其中EKLF充當抑制劑以防止多餘的Csf2rb表現，且因此LT-HSC之分化。

圖5(A)及圖5(B)顯示在自EKLF(K74R)Kin小鼠的骨移植之後，WT小鼠中之癌症之抑制。(A)在分別自WT及Kin小鼠接受骨髓移植之後，來自WT小鼠之肺之代表性相片。(B)圖(A)之WT小鼠中之肺部病灶之數目之定量表示。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張於2016年9月13日申請之美國臨時申請案第62/393,665號之權益，其以全文引用之方式併入本文中。

為方便起見，此處收集在本發明之情形下使用之某些術語。除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有如本發明所屬之一般熟習此項技術者通常理解之相同含義。

除非上下文另外明確指示，否則如本文所用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括多個指示物。

定義

如本文所使用，術語「表現」意指當符合某個條件時之基因之轉錄，導致產生mRNA及通常經編碼之蛋白質。表現可透過細胞自然地(亦即，無人工干預)實現或執行或可人工地(亦即，有人工干預之參與，諸如藉由使用經由使用化學試劑調節之啟動子)實現或執行。表現亦可由位點特異性重組酶觸發之重組事件發起，諸如利用Cre媒介之重組。可藉由量測自基因轉錄之mRNA或藉由量測由基因編碼之蛋白質來量測表現。

如本文所使用，術語「核酸」係指聚核苷酸，諸如去氧核糖核酸(DNA)，且其中在適當情況下為核糖核酸(RNA)。核酸包括(但不限於)單股聚核苷酸及雙股聚核苷酸。

如本文所使用，術語「載體」意欲指能夠運輸其已連接之另一個核酸的核酸分子。術語「表現載體」係指包含以允許可操作地連接之核酸表現的方式可操作地連接至核酸之啟動子的載體。如本文所使用之載體或表現載體因此包括能夠合成由載體所攜載之相應重組基因編碼的主體蛋白質的質體或噬菌體。載體或表現載體亦包括能夠將核酸導入至細胞(例如，哺乳動物細胞)中之基於病毒的載體。某些載體能夠自主地複製及/或表現其所連接之核酸。

如本文所使用，術語「對偶基因」係指細胞內或群體內之基因之一個特定形式，該特定形式可與該基因之序列內之至少一個且經常多於一個變異位點之序列中之同一基因之其他形式不同。在不同對偶基因之間不同的此等變異位點處之序列被稱為「變異」、「多型性」或「突變」。當個體具有一個基因之兩種相同對偶基因時，據稱該個體針對該基因或對偶基因為同型接合。當個體具有一個基因之兩種不同對偶基因時，據稱該個體針對該基因為異型接合。特定基因之對偶基因在單個核苷酸或若干核苷酸中可彼此不同，且可包括核苷酸之取代、缺失及插入。基因之對偶基因亦可為含有突變之基因的形式。

術語「野生型」係指基因或基因產物，其具有當自天然產生之來源分離時那個基因或基因產物之特性。野生型基因或基因產物(例如，多肽)是在群體中最常被觀測到之基因或基因產物，且因此被任意用作基因之「正常」或「野生型」形式。

如本文所使用，術語「轉染」係指藉由核酸媒介之基因轉移將核酸(例如，表現載體)引入至受體細胞中。「轉形」係指細胞之基因型由於外源性DNA或RNA之細胞攝取而改變，且經轉形細胞表現所要異源蛋白質之過程。

如本文所使用，術語「嵌入(Kin)」係指將轉殖基因靶向插入宿主細胞基因組中，其導致轉殖基因表現。「嵌入」轉殖基因可包含轉殖基因之異型接合嵌入。在某些實施例中，「嵌入」導致以外源性基因(或其部分)替換內源性基因(或其部分)，例如導致一個或兩個對偶基因之靶向突變。「嵌入」亦涵蓋藉由將動物暴露於促進此類表現之物質下、藉由導入促進靶向插入之位點處之重組的酶(例如，Cre-lox系統中之Cre)，或藉由一些其他方法來表現轉殖基因。「同型接合」狀態意謂當相同對偶基因駐留於同源染色體上之對應基因座處時所存在的遺傳條件。相比之下，「異型接合」狀態意謂當不同對偶基因駐留於同源染色體上之對應基因座時所存在的遺傳條件。

如本文所使用，術語「CRISPR」、「CRISPR系統」或「CRISPR核酸酶系統」及其文法等效詞可包括結合至具有核酸酶功能性(例如，兩個核酸酶結構域)之DNA及Cas蛋白質(例如，Cas9)的非編碼RNA分子(例如，嚮導RNA)。

如本文所使用，術語「剔除(縮寫：KO)」為將生物體基因中之一者變得不起作用之基因技術(生物體之「剔除」)。

如本文所使用，術語「轉殖基因」係指核酸序列，該核酸序列與接受導入該核酸序列之轉殖基因動物或細胞部分或完全異源(亦即，外來)，或與接受導入該核酸序列之轉殖基因動物或細胞之內源性基因同源，但其被設計成計畫插入或插入至動物之基因組中，此方式將會改變其所插入之細胞之基因組。轉殖基因可操作地連接至一或多個轉錄調節序列及針對所選擇核酸之最佳表現所必需的任何其他核酸，諸如內含子。因此，術語「轉殖基因」在本文中用作描述含有轉殖基因之動物或構築體之屬性的形容詞。舉例而言，「轉殖基因動物」為非人類動物，較佳地為非人類哺乳動物，更佳地為嚙齒動物，其中該動物之細胞中之一或多者含有藉助於諸如在此項技術中熟知之轉殖基因技術(包括基因嵌入技術)之人工干預導入的異源性核酸。核酸經導入至細胞中，其係經由刻意的基因操作(諸如由顯微注射或藉由用重組病毒感染)直接地或間接地導入至細胞之前驅細胞中。轉殖基因動物包括(但不限於)嵌入動物。

如本文所使用，術語「表現」意指基因在符合某種條件時之轉錄，導致產生mRNA及通常產生所編碼之蛋白質。可透過細胞自然地(亦即，無人工干預)實現或執行表現或可人工地(亦即，有人工干預之參與，諸如藉由採用使用化學劑調節之啟動子)實現或執行表現。亦可由位點特異性重組酶觸發之重組過程(諸如利用Cre媒介之重組法)啟動表現。可藉由量測自基因轉錄之mRNA或藉由量測由基因編碼之蛋白質來量測表現。

如本文所使用，術語「野生型」係指基因或基因產物，其具有該基因或基因產物自天然產生之來源分離時之特性。野生型基因是在群體中最常被觀測到之基因，且因此被任意用作基因之「正常」或「野生型」形式。相比之下，術語「經修飾」、「突變體」、「多型性」及「變異」係指在相較於野生型基因或基因產物時，於序列及/或功能屬性方面顯示修飾(亦即，特性改變)的基因或基因產物。注意，天然產生之突變體可經分離；當與野生型基因或基因產物進行比較時，此等突變體是依據其已改變特性之事實來鑑別。

如本文所使用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物。

如本文所使用，術語「哺乳動物」係指哺乳綱之所有成員，包括人類、靈長類、家畜及農畜(諸如兔、豬、綿羊及牛)；以及動物園動物、競技用動物或寵物；及嚙齒動物，諸如小鼠及大鼠。術語「非人類哺乳動物」係指除人類外的哺乳綱之所有成員。

如本文所使用，術語「個體」係指包括可得益於本發明之方法之人類物種的動物。除非明確指示性別，否則術語「個體」意欲係指雄性及雌性兩者。因此，術語「個體」包含可得益於本發明之治療方法的任何哺乳動物。

如本文所使用，術語「調控」係關於改變效果或結果之能力。

如本文所使用，術語「移植」及其變體係指將移植物(transplant)(亦被稱作移植物(graft))插入至受體中，無論移植物係同基因的(其中供體與受體基因上相同)、同種異體的(其中供體與受體具有不同基因來源但為相同物種)抑或異種的(其中供體與受體來自不同物種)。

如本文所使用，術語「供體」係指骨髓細胞之自然來源之動物，較佳地為哺乳動物。供體可為健康的哺乳動物，亦即未患有任何明顯疾病之哺乳動物。替代地，供體可為患有疾病(例如，癌症)之哺乳動物。受體為接收來自供體之骨髓細胞的動物，較佳地為哺乳動物。受體可為健康的哺乳動物，亦即未患有任何明顯疾病之哺乳動物。替代地，受體可為患有疾病(例如，癌症)之哺乳動物。根據本發明之實施例，供體及受體可為同一哺乳動物。

如本文所使用，如本文所使用之術語「有效量」係指在必需的劑量以及時間段下，有效實現關於治療疾病之所要結果的量。舉例而言，在治療癌症時，減小、預防、延遲或抑止或停滯癌症之任何症狀的藥劑(亦即，化合物、多肽、編碼治療性多肽之聚核酸或經工程改造以表現治療性多肽之細胞)將為有效的。藥劑之有效量不需要治癒疾病或病況，但將提供針對疾病或病況之治療，使得該疾病或病況之發作得以延遲、受阻或預防，或改善該疾病或病況症狀。有效量可為呈適合形式的一個、兩個或更多個劑量，其欲在整個指定時間段中以一次、兩次或更多次給藥。

如本文所使用，如本文所使用之術語「治療」意欲意謂獲得所要藥理學及/或生理效應，例如延遲或抑制癌症發生、生長或轉移，或減輕對器官之損傷。就完全或部分預防或抑制疾病或其症狀發生而言，該作用可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於疾病之副作用而言，該作用可為治療性的。如本文所使用之「治療」包括對哺乳動物(尤其人類)中之疾病之預防性(例如，防治性)、治癒性或緩解性治療；且包括：(1)疾病或病況(例如，癌症或心臟衰竭)之預防性(例如，防治性)、治癒性或緩解性治療，防止在易罹患該疾病但又尚未診斷為患有該疾病之個體中發生；(2)抑制疾病(例如，藉由阻滯其發展)；或(3)減輕疾病(例如，減少與該疾病相關聯之症狀)。

如本文所使用，術語「投與(administered)」、「投與(administering)」或「投與(administration)」在本文中可互換使用以指遞送之模式，包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、顱內或皮下投與本發明之藥劑(例如，化合物或組合物)。

如本文所使用，如本文所使用之術語「有效量」指代在必需的劑量以及時間段下，有效實現關於治療疾病或病況(諸如老化)之所要結果的量。舉例而言，在治療癌症時，減少、抑制、預防、延遲或抑止或停滯癌症之任何症狀的藥劑(亦即，化合物、多肽或編碼治療性多肽之聚核酸)將為有效的。藥劑之有效量不需要治癒疾病或病況，但將提供針對疾病或病況之治療，使得該疾病或病況之發作得以延遲、受阻或預防，或改善該疾病或病況症狀。有效量可為呈適合形式的一個、兩個或更多個劑量，其欲在整個指定時間段中以一次、兩次或更多次給藥。

如本文所使用，術語「細胞表面標記」意謂個體細胞在其細胞質膜上具有能夠結合至抗體及/或消化酶受質之蛋白質、酶或碳水化合物。細胞表面標記在此項技術中經識別以用作鑑別特定類型之細胞之特性。

如本文所使用，術語「造血幹細胞」係指源於個體之骨髓或血液之幹細胞。此等幹細胞為多能的且因此具有轉形為任何其他類型之血球或免疫細胞之能力。由於血球必須每日替換，因此此等幹細胞在血液內之作用為保持該身體恆定地補給血球。存在兩種不同類型之造血幹細胞，長期的及短期的。兩種類型之細胞之間的差異為，長期幹細胞可無限再生而短期幹細胞在長時段之後本身無法更新。此等長期幹細胞具有自我更新之能力，而短期幹細胞僅能存活約六個月。

如本文所使用，術語「增加壽命」、「增長壽命」及「壽命延長」在本文中可互換地使用且係指延遲正常老化過程及/或延長動物(例如，患有危及生命之病症(例如，癌症或腫瘤)之動物)的壽命。較佳地，與不成熟生命階段之延長相反，長壽係歸因於成熟生命階段之延長，且係由本發明方法治療所導致。

如本文所使用，術語「增加健康壽命」係指與老化相關聯之生理病變、疾病或病症之發作或嚴重性之延遲。增加健康壽命亦係指通常與老化(例如，在特定年齡時)相關聯之生理病變、疾病或病症之減少或減小的量。

如本文所使用，術語「對偶基因」係指細胞內或群體內之基因之一種特定形式，該特定形式可能與該基因之序列內之至少一個且經常多於一個變異位點之序列中之同一基因之其他形式不同。在不同對偶基因之間不同的此等變異位點處之序列被稱為「變異」、「多型性」或「突變」。當個體具有一個基因之兩種相同對偶基因時，據稱該個體針對該基因或對偶基因為同型接合。當個體具有一個基因之兩種不同對偶基因時，據稱該個體針對該基因為異型接合。

如所使用，術語「自體」係指源於同一個體之生物材料，稍後該材料將再導入至同一個體中。

如所使用，術語「異源」係指源於不同個體之生物材料，稍後該材料將再導入至不同個體中。

如本文所使用，術語「同種異體」係指源於與個體相同之物種之基因上不同之個體的生物材料，該材料將導入至該個體中。

增加壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之方法

在一個態樣中，本發明提供一種增加個體之壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之方法，其包含：(a)將胚胎幹細胞(ESC)、經誘導多能細胞(iPSC)及/或臍帶血幹細胞(CBSC)基因工程改造成具有編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾紅血球系Kruppel樣因子(Eklf)基因；(b)使該等經基因工程改造之ESC、iPSC及/或CSBC分化，以獲得造血幹細胞(HSC)及/或造血幹祖細胞(HSPC)；及(c)將HSC及/或HSPC移植至個體；藉此經移植HSC及/或HSPC向個體賦予健康長壽及/或腫瘤抗性或轉移抗性。本發明亦提供獲得攜載且表現一或多個經修飾Eklf基因之HSC及/或HSPC之活體外方法，包含：(a)將ESC、iPSC及/或CBSC基因工程改造成具有編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾Eklf基因；及(b)將經基因工程改造之ESC、iPSC及/或CSBC分化，以獲得攜載且表現一或多個經修飾Eklf基因之HSC及/或HSPC，其中HSC及/或HSPC賦予健康長壽及/或腫瘤抗性或轉移抗性。替代地，本發明提供ESC、iPSC、CSBC、HSC及/或HSPC在製造增加壽命及/或抑制或減少個體之腫瘤發生或腫瘤轉移之藥物中之用途，其中ESC、iPSC、CSBC、HSC及/或HSPC攜載且表現編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾Eklf基因。

在另一態樣中，本發明提供一種在受體個體中增加壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之方法，其包含：(a)自包含一或多個經修飾Eklf基因的供體個體收集骨髓，該一或多個經修飾Eklf基因編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽；(b)分離包含攜載該一或多個經修飾Eklf基因之HSC及/或HSPC之骨髓單核細胞(BMMNC)；及(c)將BMMNC移植至受體個體，藉此受體個體被賦予腫瘤抗性及/或健康長壽。替代地，本發明提供一種獲得表現具有腫瘤抗性及健康長壽特徵之一或多個Eklf基因之HSC及/或HSPC的活體外方法，其包含：(a)將BMMNC基因工程改造成具有編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾Eklf基因；及(b)分離攜載一或多個經修飾Eklf基因之HSC及/或HSPC。本發明亦提供基因工程改造BMMNC在製造用於在個體中增加壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之藥物的用途，其中BMMNC具有編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾Eklf基因。

特定實施例係針對具有編碼相較於野生型EKLF多肽包含一或多個胺基酸修飾之經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾Eklf基因的ESC、iPSC、CBSC或BMMC。在一些實施例中，細胞在一個或兩個EKLF基因座處包含編碼經修飾EKLF多肽之DNA。在一些實施例中，細胞在一個EKLF基因座處包含編碼經修飾EKLF多肽之DNA。在某些實施例中，細胞在兩個EKLF基因座處包含編碼經修飾EKLF多肽之DNA。在特定實施例中，細胞表現經修飾EKLF多肽。

在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾包含一個對應於全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾。在關於除小鼠外之動物的某些實施例中，一或多個胺基酸修飾包含對應於小鼠EKLF多肽中之此殘基之可小泛素化胺基酸殘基之修飾，但該修飾可位於不同位置處。舉例而言，在人類EKLF多肽中，對應於小鼠EKLF多肽中之位置74之小分子類泛素化位點係位於胺基酸殘基54處。在特定實施例中，其為Lys殘基。在某些實施例中，對應於位置74之胺基酸之修飾為用Arg取代Lys(K74R)或用賦予腫瘤抗性及健康壽命之另一胺基酸取代Lys。在其他實施例中，「另一胺基酸」為His。在除小鼠及人類外之脊椎動物中，經修飾脊椎動物EKLF多肽包含用精胺酸(R)或用賦予腫瘤抗性及健康長壽之另一胺基酸取代對應於與小鼠EKLF K74及人類EKLF K54直系同源之可小泛素化位點之離胺酸(K)殘基。

在某些實施例中，一或多個胺基酸修飾包含對應於全長野生型人類EKLF多肽之位置54之胺基酸之修飾。在一個實施例中，位置54處之胺基酸之修飾為用Arg取代Lys(K54R)或用賦予腫瘤抗性及健康長壽之另一胺基酸取代Lys。在其他實施例中，「另一胺基酸」為His。在某些實施例中，一或多個胺基酸修飾包含例如人類EKLF多肽中之經磷酸化之胺基酸之修飾，例如但不限於，對應於全長野生型小鼠EKLF多肽之位置68之經磷酸化胺基酸。

編碼所要EKLF突變型對偶基因產物(亦即，具有至少一個胺基酸修飾之EKLF)的聚核苷酸可由原生Eklf序列修飾或重新製造且利用相關技術中之任何已知方法選殖至合適的表現載體中。通常，攜載所要Eklf突變型對偶基因之聚核苷酸係可操作地連接至能夠影響所要EKLF突變型多肽在細胞中之表現的合適控制序列。在特定實施例中，編碼EKLF多肽之聚核苷酸為編碼小鼠EKLF蛋白質之聚核苷酸，且在某些實施例中，經修飾密碼子編碼在胺基酸位置74處之修飾。在特定實施例中，編碼EKLF蛋白質之聚核苷酸為編碼人類EKLF蛋白質之聚核苷酸，且在某些實施例中，經修飾密碼子編碼在胺基酸位置54處之修飾。某些實施例涵蓋，EKLF多肽在小鼠中之位置74處之離胺酸處，在人類中之位置54處之離胺酸處或在對應的小分子類泛素化位點處經小分子類泛素化。特定實施例涵蓋，人類EKLF多肽在位置54處之離胺酸處經小分子類泛素化。在某些實施例中，對應於小鼠EKLF多肽之位置74處之離胺酸的小分子類泛素化位點為人類EKLF多肽之位置54處之離胺酸。一些實施例涵蓋，在小鼠EKLF多肽中用精胺酸或用賦予腫瘤抗性及健康長壽之另一胺基酸修飾離胺酸74，在人類EKLF多肽中用精胺酸或用賦予腫瘤抗性及健康長壽之另一胺基酸修飾離胺酸54，或對其他EKLF多肽中之對應小分子類泛素化位點之修飾預防EKLF多肽之小分子類泛素化。哺乳動物中之EKLF多肽之小分子類泛素化位點之修飾導致哺乳動物之壽命增長、壽命增加及健康壽命增加，以及哺乳動物中之腫瘤形成減少及腫瘤轉移減少。另外，在患有黑素瘤之小鼠中測試EKLF K74R(或EKLF K54R)修飾對癌細胞之作用。出人意料地，EKLF K74R(或EKLF K54R)對偶基因之表現預防癌性黑素瘤細胞轉移且增加壽命。

在特定實施例中，將編碼所要EKLF突變型多肽之聚核苷酸插入至載體(例如DNA質體、病毒或其他合適複製子)中。較佳地，將編碼所要EKLF突變型多肽之核酸序列整合至病毒之基因組中，隨後將其導入至例如經高度純化之HSC群體之骨髓細胞中。適合用於本發明之病毒載體包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、小病毒(例如，腺相關病毒)、可卡病毒(corcoavirus)、負股RNA病毒(諸如正黏液病毒(例如，流感病毒)、副黏液病毒(例如，麻疹及仙臺病毒(Sendai))、棒狀病毒(例如，狂犬病及水皰性口炎病毒))、正股RNA病毒(諸如小核糖核酸病毒及α病毒)及雙股DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型及2型單純疱疹病毒、艾普斯登-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、巨細胞病毒)及痘病毒(例如，牛痘、禽痘及金絲雀痘)。其他病毒包括諾沃克病毒(Norwalk virus)、披衣病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒及肝炎病毒。反轉錄病毒之實例包括(但不限於)禽鳥白血球增多症肉瘤、哺乳動物C型病毒、哺乳動物B型病毒、哺乳動物D型病毒、HTLV-BLV組、慢病毒、泡沫病毒。其他實例包括鼠類白血病病毒、鼠類肉瘤病毒、小鼠乳房腫瘤病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒、禽鳥白血病病毒、人類T細胞白血病病毒、狒狒內因性病毒、長臂猿白血病病毒、梅森-菲舍猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)、猴免疫缺乏病毒、猴肉瘤病毒、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)及慢病毒。

替代地，經由使用成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白質(Cas)系統來轉導細胞以表現經修飾EKLF多肽，其中至少兩個載體分別用於將與編碼經修飾Eklf基因產物之核酸之基因組基因座中之靶標序列雜交之Cas酶及RNA運輸至細胞中。Cas酶隨後由與基因組基因座中之靶標序列雜交之RNA補充以裂解經表現修飾之Eklf基因產物。在一些實施例中，Cas酶為II型CRISPR系統酶。在一些實施例中，II型CRISPR系統酶為Cas9酶。在一些實施例中，Cas9酶為肺炎鏈球菌(S.pneumonia)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)或嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)Cas9，且可包括源於此等生物體之經突變Cas9。酶可為Cas9同源物或直系同源物。在一些實施例中，CRISPR酶經密碼子最佳化以供在真核細胞中表現。在一些實施例中，CRISPR酶導引靶標EKLF序列之位置處之一個或兩個股之裂解。

封裝細胞株亦可用於產生包含重組基因組之重組病毒載體，該重組基因組包括編碼所要基因產物(例如，EKLF K54R或EKLF K74R多肽)之聚核苷酸。使用封裝細胞株可增加所產生重組病毒體之感染力之效率及範圍兩者。用於產生包含包括編碼所要基因產物(例如，具有至少一個胺基酸修飾之本發明EKLF)之核酸的重組基因組之重組病毒載體的封裝細胞株係藉由用具有整合至病毒之基因組中之編碼所要基因產物的核酸的病毒載體轉染宿主細胞(諸如哺乳動物宿主細胞)來產生。用於產生細胞株之合適宿主細胞包括人類之細胞(例如，海拉細胞(Hela cell))、母牛細胞、豬細胞、小鼠細胞(例如，胚胎幹細胞)、兔細胞及猴細胞(例如，COS 1細胞)。用於產生細胞株之合適宿主細胞可為胚細胞、骨髓幹細胞或其他祖細胞。

用於轉導或轉形細胞之合適方法之實例包括(但不限於)感染、磷酸鈣沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染及直接攝取。此類方法均為此項技術中所熟知。由包含包括編碼所要EKLF突變型對偶基因產物之核酸之重組基因組的重組病毒載體組成之病毒原種係藉由將經轉導細胞維持在適用於病毒產生之條件(例如，在合適之生長培養基中且持續適合之時間段)下來產生。此類條件對於本發明不重要，且通常在相關技術中已知。

可將編碼所要核酸產物且可操作地連接至能夠影響所要核酸產物在細胞中之表現之控制序列的重組基因整合至進入特定相關細胞中之病毒之基因組中。細胞經基因改變或經轉形以包含編碼所要核酸產物之穩定併入之重組基因。以此方式，經基因改變或轉形之細胞可隨後在投與至哺乳動物(例如，受體)之前經檢查重組基因的表現。舉例而言，所表現之所要基因產物(例如，EKLF K54R或EKLF K74R多肽)之量可根據標準方法(例如，藉由西方墨點法)來量測。以此方式，可在活體外測定所要核酸產物在投與至哺乳動物之前是否已在經轉形細胞中以合適水準表現。

在導入或注入受體個體中之前，以合適水準表現所要核酸產物之經基因改變之細胞可擴增(生長)至某個數量。用於擴增細胞之方法在相關技術中為熟知的。

可根據本發明使用適用於培養多能幹細胞之任何培養介質，且若干此類培養基為此項技術中已知的。舉例而言，用於培養多能幹細胞之培養介質可包含：剔除DMEM、20%剔除血清替代物、非必需胺基酸、2.5% FBS、Glutamax、β-巰基乙醇、10ng/微升bFGF及抗生素。所採用之培養介質亦可為此培養介質之變化形式，例如，無2.5% FBS，或具有較高或較低%之剔除血清替代物或無抗生素。所採用之培養介質亦可為支援未分化條件中之人類多能幹細胞生長的任何其他合適培養介質，諸如mTeSR(獲自STEMCELL Technologies)或Nutristem(獲自Stemgent)或ES培養介質，或此項技術中已知之任何其他合適培養介質。其他例示性方法係自使用或不使用低溫保護劑凍結之組織樣本所生長之細胞群來產生/獲得多能幹細胞。

經基因工程改造之ESC、iPSC及/或CSBC可經分化以獲得HSC及/或HSPC。方法在此項技術中已知為用於多能幹細胞之導引分化或自發分化，例如藉由使用各種分化因子。可利用此項技術中已知之多種方法監測多能幹細胞之分化。幹細胞與經分化因子處理之細胞之間的參數的變化可指示經處理細胞已分化。顯微法可用於直接地監測細胞在分化期間之形態。

在一些實例中，細胞為選自由以下組成之群之至少一個標記染色呈陽性的人類HSC：Lin、Sca-1、CD7、CD27、CD34、CD38、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD90.1、CD93、CD105、CD109、CD110、CD111、CD117、CD123、CD131、CD133、CD135(Flt3)、CD150、CD166、CD173、CD174、CD184、CD202b、CD243、CD271、CD309、CD338、GATA-2、GATA-3、c-myb、Aiolos、TdT、Ikaros、PU.1、HLA DR及I類MHC。在其他實例中，細胞為選自由以下組成之群之至少一個標記染色呈陽性的小鼠HSC：Lin、Sca-1、CD27、CD34、CD38、CD43、CD59、CD90.1、CD117、CD123、CD127、CD135、CD150、GATA-2、GATA-3、TdT、Ikaros、PU.1、Aiolos、c-myb及I類MHC。

本發明意外地發現，EKLF在LT-HSC中以相對較高水準表現，且 EKLF之耗竭會導致不同類型之造血細胞/血球之群體變化。此外，EKLF在LT-HSC及造血祖細胞(諸如MPP、CMP、GMP及MEP)中負調節群落刺激因子2受體次單位Csf2rb之表現。因此，在EKLF耗竭之後，LT-HSC獲得增強的分化能力且隨後增大Csf2rb。利用始於LT-HSC且貫穿單骨髓譜系及EKLF之EKLF-CSF2RB軸調節造血有一部分是經由預防LT-HSC過度分化為下游造血祖細胞來維持LT-HSC之恆定。在一個實施例中，EKLF之耗竭在LT-HSC中增大Csf2rb之表現。在另一實施例中，EKLF之表現在造血幹細胞/祖細胞中減小Csf2rb之表現。EKLF充當抑制劑以防止多餘的Csf2rb表現，且因此LT-HSC之分化。

鑒於以上，本發明證明EKLF表現之耗竭大大地改變包括(出乎意料地)長期造血幹細胞(LT-HSC)之不同類型之造血細胞之群體。在有關相關性中，EKLF在LT-HSC以及多能祖細胞(MPP)中以相對較高水準表現。此外，EKLF在LT-HSC、MPP、GMP及CMP中似乎抑制已知為IL-3、GM-CSF及IL-5之受體之共同次單位的群落刺激因子2受體α次單位(CSF2RB)之表現。因此，在EKLF耗竭之後，LT-HSC獲得增強的分化能力且隨後增大CSF2RB。此等結果共同顯示，透過始於LT-HSC且貫穿單骨髓譜系之EKLF-CSF2RB軸來調節造血。

根據本發明之某些實施例，根據本文中所描述之經修飾Eklf基因、經修飾EKLF多肽及轉導(或轉染)方法在活體外對細胞進行基因工程改造。可將胚胎幹細胞(ESC)自靈長類物種之成員之胚胞分離。可使用由Thomson等人(Science 282：1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.,1998)及Reubinoff等人Nature Biotech.18：399,2000所描述之技術，由人類胚胞細胞製備人類胚胎幹細胞(hES)。iPSC通常具有hESC類形態，成長為具有大核質比之平坦群落，輪廓明確的邊界及明顯的細胞核。另外，iPSC通常表現由一般熟習此項技術者所熟知之一或多個關鍵多能性標記，包括但不限於鹼性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT及zfp42。說明性iPSC為基因Oct-4、Sox-2、c-Myc及Klf已經轉導至其中之細胞。其他例示性iPSC為OCT4、SOX2、NANOG及LIN28已經轉導至其中之細胞。熟習此項技術者將知曉再程式化因子之各種不同混合物可用於產生iPSC，再程式化因子為諸如選自由OCT4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog及Lin28組成之群的因子。臍帶血幹細胞係多能的且被認為具有形成不同幹細胞類型之能力，該等臍帶血幹細胞可在分娩之後自胎盤中及連接之臍帶中所餘留的臍帶血分離。

根據本發明之某些實施例，細胞得經基因改變以表現所要核酸產物之動物，諸如來自表現EKLF K74R(或EKLF K54R)多肽之嵌入(Kin)小鼠。在此等實施例中，攜載所要EKLF K74R突變型對偶基因之轉殖基因Kin小鼠係藉由使用Cre-loxP重組系統，或此項技術中熟知之任何其他方法(諸如定點重組系統)產生。轉殖基因動物經篩選及評估，以選拔彼等具有所需表現型之動物。可使用例如南方墨點分析或PCR技術分析動物組織，來執行初始篩選，以驗證轉殖基因之整合已發生。轉殖基因在轉殖基因動物之組織中之mRNA表現水準亦可使用包括(但不限於)以下技術來評定：自動物獲得之組織樣本之北方墨點分析、原位雜交分析及反轉錄酶-PCR(RT-PCR)。可使用對轉殖基因具有特異性之抗體，以免疫細胞化學方式評估合適組織之樣本。用於評估轉殖基因之存在的替代或額外方法包括(但不限於)：諸如酶及/或免疫分析之合適生物化學分析、用於特定標記或酶活性之組織學染色、流動式細胞量測分析及類似方法。血液分析亦可用於檢測血液中之轉殖基因產物之存在。

根據本發明之其他實施例，細胞自正常健康供體哺乳動物分離，接著經基因改變，以表現所要核酸產物(亦即，人類EKLF K54R多肽)，此等經基因改變之細胞接著被擴增且投與至受體哺乳動物。

根據本發明之其他實施例，自需要治療之哺乳動物分離細胞，細胞接著經基因改變，以表現所要核酸產物(亦即，EKLF K54R多肽)，擴增且藉由移植返回至同一哺乳動物。

細胞之移植

較佳地，細胞至受體個體(例如，人類)之移植模式係經靜脈內的，包括輸射及/或快速注射或腹膜內注射。亦可使用諸如非經腸、經黏膜、植入、肌肉內、皮內、經皮之其他模式。較佳地，以適用於投與至哺乳動物中之特定模式及途徑的介質(諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水)來投與骨髓細胞投與投與。

本發明意外地發現，在將攜載且表現編碼經修飾EKLF多肽之基因的BMMC、HSC或HPSC移植至受體個體之後，受體個體能夠享受更長壽命，抑制腫瘤細胞之生長及/或轉移。因此，結果表明，經由移植來遞送經工程改造以表現EKLF突變型對偶基因基因產物之自體或異源細胞可提供用於延長個體之壽命及/或治療癌症之新途徑。

受本發明抑制之腫瘤病症可為以下中之任一者：肝癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌、肝細胞癌、黑素瘤、肺癌、神經膠母細胞瘤、腦腫瘤、造血性惡性腫瘤、視網膜母細胞瘤、腎細胞癌、頭頸癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌或鱗狀細胞癌。在一個較佳實例中，細胞增殖病症為黑素瘤。

無需進一步描述，咸信一般熟習技術者可使用前述描述及以下說明性實例來製造及利用本發明之化合物且實施所主張之方法。以下工作實例因此尤其指出本發明的較佳實施例，且不被解釋為以任何方式限制本發明之其餘部分。

實例材料及方法 Eklf-KO小鼠之產生

在整個研究中使用C57BL16或B6小鼠(Jackson Laboratory)。遵循標準協定，在中研院IMB之轉殖基因核心設施(Transgenic Core Facility；TCF)中進行產生帶有Eklf基因之異型接合及同型接合剔除的B6小鼠系。含有經基因工程改造之Eklf基因座(欲知更多細節，參見圖1A之圖例)之BAC構築體及E2A-Cre小鼠係用於產生Eklf-KO小鼠。

EKLF(K74R)嵌入小鼠之產生

將來自C57B/6J ES細胞之小鼠基因組DNA用作模板，含有EKLF外顯子2之部分的片段經PCR擴增且用於建構靶向載體。在選殖至模板靶向載體中之前，使用標準突變誘發技術將由外顯子2編碼之密碼子74突變為精胺酸(K74R)之密碼子。亦將新黴素卡匣建構至靶向載體中，其中PGK-gb2-neo模板編碼新黴素/康黴素抗性基因，新黴素/康黴素抗性基因將用於在大腸桿菌中表現康黴素抗性之原核啟動子(gb2)與用於在哺乳動物細胞中表現新黴素抗性之真核啟動子(PGK)組合。另外，經修飾WT DNA由『loxP』位點側接以有助於其之移除。靶向構築體接著電穿孔至C57B/6J ES細胞中且針對新黴素抗性進行選擇。恰當地靶向之ES選植株是透過5'及3'南方墨點法鑑別。在移除neo卡匣且確認編碼EKLF K74R之經修飾基因組區域之架構之後，將ES選殖株注射至囊胚細胞中以產生嵌合體小鼠。為獲得含有嵌入對偶基因之異型接合小鼠，生殖系遺傳F1品系與在全身表現Cre重組酶之EIIa-Cre小鼠交配。攜載含有點突變之一個對偶基因之eklf異型接合子經相互交配以實現同型接合eklf(K74R)嵌入小鼠。

TaqMan基因表現分析

根據標準程序使用TRIzol試劑(Invitrogen)製備RNA且使用oligo-dT引子及SuperScript III反轉錄酶(RT)(Invitrogen)進行反轉錄。在內建循環條件(進行40個循環，50℃下持續2min，95℃下持續10min，95℃下持續15s及60℃下持續1min)下在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系統(Applied Biosystems)上進行使用經證實TaqMan分析之定量PCR(qPCR)。根據cDNA樣本之連續稀釋液之標準曲線測定相對EKLF(Mm04208330_g1及Mm00516096_m1；Applied Biosystems)表現水準且接著經標準化至β-肌動蛋白(Actb：Mm00607939_s1；Applied Biosystems)或Gapdh(Mm99999915_g1；Applied Biosystems)表現水準。

骨髓移植(BMT)

小鼠之骨髓係利用27G針頭/針筒及19G針頭/針筒自CD45.2/EKLF(K74R)供體小鼠(8週至10週大)之股骨、脛骨及肱骨骨頭提取，收集並擠推通過濾網，且接著根據由Liou等人(2014)所描述之方法分離造血幹細胞(HSC)池。用致死劑量(10Gy)或半致死劑量(5Gy)之X射線輻照年齡為8週至10週大之受體CD45.1/WT C57BL/6小鼠。將經分離之骨髓HSC混合物注射至經輻照受體小鼠之尾部靜脈中。BMT在每隻受體小鼠中之成功係由流式細胞量測術分析確認。在BMT之後8至9週時，接著利用如下文所描述之肺部群落分析評估抗腫瘤形成。

壽命量測

此遵循標準程序。在不含特定病原體(SPF)之動物環境中追蹤EKLF(K74R)嵌入小鼠之壽命。

對腫瘤形成之抗性之分析

鼠類轉移性黑素瘤細胞B16-F10(10⁶細胞/0.2mL)分別經靜脈內注射至EKLF(K74R)Kin小鼠及野生型小鼠(每組3隻小鼠)之尾部靜脈內(靜脈內注射)，以自此等細胞及轉移檢查腫瘤形成之可能性。針對測試選擇B16-F10細胞，此係因為其源於C57BL/6小鼠且與C57BL/6小鼠(野生型及EKLF(K74R)嵌入小鼠)免疫相容。兩週以後，用CO₂窒息殺死小鼠且將其肺部移除以用於進一步檢查。肺部表面上之轉移性結節係藉由影像分析軟體(Image Inc.)量測。在注射後14天進行各小鼠之腫瘤數目之量測。成功地對肺進行群落化(colonization)分析的一個竅門係使用適合數目之癌細胞以供注射。人類通常使用2種至3種不同劑量之癌細胞以供注射。在注射後之2週至6週時，接著定量且比較肺部上之腫瘤群落。

流式細胞分析及細胞分選

鼠類E14.5胎肝臟細胞經由40mm耐綸細胞過濾器(BD Biosciences)過濾以得到單細胞懸浮液。如補充表1中所列，使用抗細胞表面標記之以下抗體之不同組合來鑑別不同類型之造血細胞：抗Lin、抗Sca-1、抗c-Kit(CD117)、抗CD34、抗Thy1.1、抗Flk2、抗CD16/32、CD11b、抗CD11c、抗Ter119、抗CD42d、抗CD41、抗Gr-1、抗F4/80及抗33D1(BD Biosciences及Bioscience)。在用抗體進行免疫染色之後，用LSRII(BD Biosciences)及FlowJo軟體(Tree Star)分析細胞或用FACSAriaII SORP(BD Biosciences)分選該等細胞。

RNA分析

用TRIzol試劑(Invitrogen)自鼠類E14.5胎肝臟提取總RNA。用RNAqueous Micro Kit(Ambion)分離經純化細胞之微型RNA。接著使用用於RT-qpCR分析之Superscript II反轉錄酶(RT)(Invitrogen)合成cDNA。用LightCycler®480 SYBR Green I Master(Roche Life Science)進行cDNA之定量即時pCR(qpCR)分析，且利用Roche LightCycler LC480即時PCR儀器檢測產物。用於qPCR分析之引子之序列為自行設計，如補充表2中所顯示，或自線上資料庫PrimerBank下載：http：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank。

免疫螢光染色分析

依據由如上文所描述之流式分選所純化之LSK(Lin^-、Sca-1⁺及c-Kit⁺)-CD34^--Flk2^- LT-HSC經懸浮且利用1%多聚甲醛固定於4孔培養載玻片上(Millipore Millicell EZ SLIDE)、用0.1%(vol/vol)Triton X-100滲透，且使用小鼠抗小鼠CSF2RB(Gene Tex)或自製兔抗小鼠EKLF(AEK、Shyu等人，2006)染色。抗小鼠及抗兔二級抗體分別與Alexa Fluor 488及543共軛。49-6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen)係用於細胞核染色。使用LSM710及LSM510實現螢光激發及影像表現。影像資料由Image J軟體分析。

甲基纖維素群落形成分析

該分析遵循由Miller及Lai(2005)描述之彼等。在幹細胞培養介質(無血清擴增培養基，STEMCELL)中培養來自小鼠胎肝臟之經螢光激發細胞分選儀(FACS)純化之LT-HSC。重新接種LT-HSC並添加rmSCF、rhIL-6、rmIL-3但未添加rhEPO(GF M2534，STEMCELL)，且在接種後的第14天計數所形成之群落數目。

統計

使用雙尾斯圖登氏t檢定(student's t-test)(Mierosoft Exeel)測定顯著差異。將p值0.05視為顯著的。

實例1 EKLF耗竭之後造血細胞之恆定之干擾

為檢查EKLF除了對紅血球系譜系對比於巨核細胞譜系之分化外對造血系統之恆定的調節效應，吾等首先使用基因靶向方法產生帶有Eklf剔除(KC)之小鼠模型(圖1A)。使同型接合Eklf ^-/-小鼠在E14.5天時胚致死，且突變型胚貧血，由於缺乏血球蛋白基因表現而部分呈現類白化表現型(圖1B)。吾等接著分別由Eklf ^+/+(WT)及Eklf ^-/-小鼠(KO)製備E14.5胎肝臟，且在用不同組合之抗體染色之後使用流式細胞儀來分選細胞。如自先前研究(Frontelo等人，2007)所預期，缺少EKLF會導致紅血球大量損耗且KO小鼠之E14.5胎肝臟中之巨核細胞伴隨增加(圖1C)。

明顯地，吾等發現，在KO E14.5胎肝臟中，大多數類型之造血細胞(包括MPP、CMP、GMP、MEP、單核細胞及樹突狀細胞)之數目相較於WT E14.5胎肝臟亦有所增加。另一方面，CLP及粒細胞保持不變，而LT-HSC及巨噬細胞數目減少(圖2及表1)。

以上數據顯示EKLF整體地調節造血系統之恆定。特定而言，因子之存在將增加單骨髓譜系中之所有祖細胞。同樣地，EKLF似乎亦調節LT- HSC之恆定(參見下文)。

實例2 Eklf及Csf2rb在造血幹細胞及祖細胞中之表現模式

為闡明EKLF對造血之調節效應的分子基礎，吾等首先分析且比較LT-HSC及不同造血祖細胞中之Eklf mRNA含量。如由對WT E14.5胎肝臟之mRNA之RT-qPCR分析所顯示，MEP中之Eklf mRNA含量與小鼠紅白血病(MEL)細胞中之彼含量相當，而CMP及GMP中之彼等含量極低(圖3A，左直方圖)。Eklf表現之此模式類似於源於自成年小鼠骨髓分離之MEP、CMP及GMP分析之彼模式(Frontelo等人，2007)。然而意外地，E14.5胎肝臟之MPP以及LT-HSC中之Eklf mRNA之含量相對較高，約為MEP之含量之50%(圖3A，左直方圖之右側2個條柱)。如所預期，KO小鼠之E14.5胎肝臟之以上類型細胞中不存在Eklf mRNA，如針對LT-HSC及MPP所例示(圖3A，右直方圖)。

造血系統之恆定一部分取決於LT-HSC之自我更新與具有其分化能力之不同造血前驅細胞之增殖之平衡，該等分化能力由各種細胞介素及信號轉導路徑調控(Ghiaur等人，2013；Kent等人，2013；Wang等人，2013)。考慮到KO小鼠之E14.5胎肝臟中之造血細胞之群體變化(圖1)，吾等進行3個基因Csf2rb、Stat1及Stat2之表現的定量RT-qPCR分析，這3個基因已知涉及造血幹細胞及祖細胞之增殖、自我更新及/或維持(Anam及Davis，2013)。如圖3B中所顯示，Stat1 mRNA及Stat2 mRNA之含量在CMP及GMP中保持不變，但在剔除Eklf後於MEP中有所提高。另一方面，編碼IL-3/IL-5/GM-CSF受體之共同次單位CSF2RB的Csf2rb mRNA之含量在這三個祖細胞以及MPP中大量提高(圖3B)。

吾等進一步分析了Csf2rb mRNA在LT-HSC中之表現水準。如圖4A 中所示，Csf2rb mRNA在LT-HSC中以及在EKLF耗竭之後有所增加。螢光共免疫染色顯示，CSF2RB蛋白質之含量在KO小鼠E14.5胎肝臟之LT-HSC中亦有所提高(圖4B)。引起關注的是，EKLF主要存在於LT-HSC之細胞溶質中(圖4B)，分佈模式類似於先前在紅血球系祖細胞中所觀測的那樣(Shyu等人，2014)。

實例3 利用EKLF對LT-HSC之多譜系分化決策之負調節

為進一步理解Eklf ^-/-小鼠之E14.5胎肝臟中LT-HSC數目減小之基礎，吾等如由Miller及Lai(2005)所描述對經分選LT-HSC進行群落形成分析。如所預期，當來自Eklf ^+/+或Eklf ^-/- E14.5胎肝臟之經分選純化之LT-HSC在培養盤上之無細胞介素甲基纖維素介質中培養時，未形成群落(數據未顯示)。然而，當在rhEPO不存在下與細胞介素/因子rmSCF、rhIL-6及rmIL-3一起培育時，約10³ WT LT-HSC中有150個形成群落(圖4C，直方圖之左條柱)。此外，在由細胞介素/因子刺激之後，來自Eklf ^-/-E14.5胎肝臟之LT-HSC獲得更穩固之分化能力，如由群落數目增加2.5倍所反映(圖4C，直方圖之右條柱)。圖4C之數據指示在正常條件下，EKLF一部分經由預防LT-HSC過度分化成下游造血祖細胞而維持LT-HSC之恆定。

實例4 EKLF(K74R)小鼠之骨髓至WT小鼠之移植在WT小鼠中賦予腫瘤抗性

根據描述於WO 2016036727中之程序產生攜載EKLF K74R突變型對偶基因之轉殖基因小鼠。

在此實例中，CD45.1/野生型小鼠(受體)接受CD45.2/EKLF(K74R)小鼠(供體)之骨髓移植，接著使用如上文所描述之腫瘤群落分析評估每隻受體小鼠之腫瘤抗性。

如圖5A中所描繪，在移植來自EKLF(K74R)小鼠之骨髓HSC細胞之後，WT小鼠變得更具腫瘤抗性，如由黑素瘤細胞之靜脈內注射誘導之肺部病灶之數目顯著減小(降低約3倍)所證明(圖5B)。數據指示EKLF K74R小鼠之腫瘤抗性能力是由經基因工程改造之造血/血液系統所賦予，該腫瘤抗性能力可藉由骨髓移植轉移至其他小鼠。

Claims

一種經基因工程改造之長期造血幹細胞(LT-HSC)的用途，其係用於製備增加個體之壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移的藥物，其中LT-HSC係由下列方法所製備：(a)將胚胎幹細胞(ESC)、經誘導之多能細胞(iPSC)及/或臍帶血幹細胞(CBSC)基因工程改造成具有編碼經修飾EKLF多肽的一或多個經修飾紅血球系Kruppel樣因子(Eklf)基因，該經修飾EKLF多肽包含對應於該全長野生型人類EKLF之位置54或該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾，且該對應於位置54或位置74之胺基酸之修飾為用Arg取代Lys(K54R或K74R)；及(b)使該等經基因工程改造之ESC、iPSC及/或CSBC分化，以獲得LT-HSC。
如請求項1之用途，其中該LT-HSC鑑別為Lin^-、CD117⁺、Sca-1⁺、Thy1.1^lo、Flk2^-及CD34^-。
如請求項1之用途，其中該經修飾EKLF多肽包含對應於該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置68之胺基酸之修飾。
如請求項1之用途，其中該等細胞係經由使用編碼該經修飾EKLF多肽之病毒載體轉導，以表現該經修飾EKLF多肽。
如請求項4之用途，其中該病毒載體係源於疱疹病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒、減毒之牛痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒或腺相關病毒。
如請求項1之用途，其中該等細胞係經由使用成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白質(Cas)系統轉導，以表現該經修飾EKLF多肽。
如請求項1之用途，其中該經修飾EKLF多肽之表現導致壽命增加、抗轉移及/或抗腫瘤形成。
如請求項1之用途，其中該EKLF在LT-HSC中以相對較高水準表現，且EKLF之耗竭導致不同類型的造血細胞/血球之群體變化。
如請求項1之用途，其中該EKLF負調節群落刺激因子2受體次單位Csf2rb在LT-HSC及造血祖細胞中之表現。
如請求項1之用途，其中該腫瘤為肝癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌、肝細胞癌、黑素瘤、肺癌、神經膠母細胞瘤、腦腫瘤、造血性惡性腫瘤、視網膜母細胞瘤、腎細胞癌、頭頸癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌或鱗狀細胞癌。
一種經基因工程改造之骨髓單核細胞(BMMNC)的用途，其係用於製備增加受體個體之壽命及/或抑制或減少腫瘤發生或腫瘤轉移之藥物，其中BMMNC係由下列方法所製備：(a)自包含一或多個經修飾EKLF基因之供體個體收集骨髓，該一或多個經修飾EKLF基因編碼經修飾EKLF多肽，該經修飾EKLF多肽包含對應於該全長野生型人類EKLF之位置54或該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾，且該對應於位置54或位置74之胺基酸之修飾為用Arg取代Lys(K54R或K74R)；及(b)分離包含攜載該一或多個經修飾eklf基因之長期造血幹細胞(LT-HSC)之骨髓單核細胞(BMMNC)。
如請求項11之用途，其中該LT-HSC鑑別為Lin^-、CD117⁺、Sca-1⁺、Thy1.1^lo、Flk2^-及CD34^-。
如請求項11之用途，其中該經修飾EKLF多肽包含對應於該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置68之胺基酸之修飾。
如請求項11之用途，其中該EKLF在LT-HSC中以相對較高水準表現，且EKLF之耗竭導致不同類型的造血細胞/血球之群體變化。
如請求項11之用途，其中該EKLF負調節群落刺激因子2受體次單位Csf2rb在LT-HSC及造血祖細胞中之表現。
如請求項11之用途，其中該等細胞係得自經基因改變以表現該經修飾EKLF多肽之動物。
如請求項11之用途，其中該腫瘤為肝癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌、肝細胞癌、黑素瘤、肺癌、神經膠母細胞瘤、腦腫瘤、造血性惡性腫瘤、視網膜母細胞瘤、腎細胞癌、頭頸癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌或鱗狀細胞癌。
如請求項9或15之用途，其中該造血祖細胞包括多能祖細胞(MPP)、共同骨髓祖細胞(CMP)、粒細胞/巨噬細胞祖細胞(GMP)及骨髓/紅血球系祖細胞(MEP)。
如請求項9或15之用途，其中該EKLF經由預防LT-HSC過度分化為下游造血祖細胞來維持LT-HSC之恆定。
一種用編碼EKLF多肽之基因工程改造之長期造血幹細胞(LT-HSC)，該EKLF多肽相較於野生型EKLF多肽包含至少一個胺基酸修飾，且其中該一或多個胺基酸修飾包含對應於該全長野生型人類EKLF之位置54或該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾，且該對應於位置54或位置74之胺基酸之修飾為用Arg(K54R或K74R)取代Lys。
一種獲得攜載且表現一或多個經修飾EKLF基因之長期造血幹細胞(LT-HSC)之活體外方法，其包含：(a)將ESC、iPSC及/或CBSC基因工程改造成具有編碼相較於野生型人類EKLF之位置54或該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾，且該對應於位置54或位置74之胺基酸之修飾為用Arg(K54R或K74R)；及(b)使該等經基因工程改造之ESC、iPSC及/或CSBC分化，以獲得攜載且表現該一或多個經修飾EKLF基因之LT-HSC，其中該等LT-HSC賦予健康長壽及/或腫瘤抗性或轉移抗性。
一種獲得表現具有腫瘤抗性及健康長壽特徵之一或多個經修飾紅血球系Kruppel樣因子(eklf)基因之長期造血幹細胞(LT-HSC)的活體外方法，其包含：(a)將骨髓單核細胞(BMMNC)基因工程改造成具有編碼相較於野生型人類EKLF之位置54或該全長野生型小鼠EKLF多肽之位置74之胺基酸之修飾，且該對應於位置54或位置74之胺基酸之修飾為用Arg(K54R或K74R)；及(b)分離攜載該一或多個經修飾EKLF基因之LT-HSC。