JP6846524B2 - 移植による、寿命の増強および/または細胞増殖性障害の治療のための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年9月13日に出願された米国仮出願第62/393、665号の利益を主張し、当該出願は、その全体が本出願において参考として援用される。
本出願に関連する配列表は、紙の複写物に代わってテキスト形式で提供され、ここで、本明細書に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、LELIWOTEMP_SQL_ST25.txtである。このテキストファイルは4KBであり、2017年9月13日に作成されており、そしてEFS−Webを介して電子的に提出されている。
本発明は幹細胞の分野に関する。特に本発明は、EKLFポリペプチドをコードする改変されたEklf遺伝子を持つ、造血幹細胞(HSC)ならびに/あるいは造血幹および前駆細胞(HSPC)の移植(例えば、骨髄移植または多能性幹細胞移植など)を通じて、被験体に腫瘍抵抗性および健康な長寿性を移譲することに関する。
造血とは、造血/血液系が複数の型の骨髄系およびリンパ系の血液細胞を生み出す過程である。リンパ系および骨髄系の分化系列決定は、多能性前駆細胞(MPP)、骨髄系共通前駆細胞(CMP)、骨髄系/赤血球系前駆細胞(MEP)、顆粒球/マクロファージ前駆細胞(GMP)、およびリンパ系共通前駆細胞(CLP)を含む多能性造血前駆細胞において生じ、MPPは、造血幹細胞(HSC)の自己複製と分化を介して生じる。HSCは恒常的な状態において、主にG0期にある。造血細胞系のまさに頂点として、HSCは造血における重要な役割を果たし、その恒常性の調節は、様々な造血系/血液細胞の下流の運命を決定する。とりわけ、いくつかのサイトカイン(例えば、IL−3、IL−7、SCF、TPOおよびGM−CSFなど)および転写因子(例えば、Notch1、Tal−1、HoxB4、GATA1、GATA2およびGATA3など)がHSCおよび造血前駆細胞の恒常性の調節に関与する。純化されたHSCの形態的および機能的な特性について、広範に特徴付けされている。また、HSCの自己再生、維持およびそして分化の調節についても、分子および細胞レベルでのいくつかの研究が報告されている。
EKLF/KLF1は、N末端活性化ドメイン、C末端ジンクフィンガードメイン、および複数の翻訳後修飾部位からなるKruppel−like因子ファミリーの第一のメンバーである。マウス胎児の肝臓のゲノムワイド解析では、特定の調節領域へのEKLFのDNA結合を介してそれらの活性化または抑制が調節される、いくつかの遺伝子が同定されている。EKLF/KLF1は当初、赤血球系に特異的な転写因子として同定されたが、のちに巨核球ならびにMEP、GMPおよびCMPを含む造血前駆細胞にも発現することが発見された(Frontelo, P., Manwani, D., Galdass, M., Karsunky, H., Lohmann, F., Gallagher, P.G., and Bieker, J.J. (2007). Novel role for EKLF in megakaryocyte lineage commitment. Blood 110, 3871−3880)。機能損失および機能増強研究は、EKLFが赤血球生成の過程だけではなく(Porcu, S., Manchinu, M.F., Marongiu, M.F., Sogos, V., Poddie, D., Asunis, I., Porcu, L., Marini, M.G., Moi, P., Cao, A., et al. (2011). Klf1 affects DNase II−alpha expression in the central macrophage of a fetal liver erythroblastic island: a non−cell−autonomous role in definitive erythropoiesis. Mol Cell Biol 31, 4144−4154)、MEPから赤血球または巨核球への分化運命の決定も調節していることを示している。
しかしながら、EKLFが、巨核球−赤血球の分離および単球からのマクロファージ化以外の造血の調節に関わるかどうか、そして、どれほど広範に関わるのかについては不明のままである。
本発明は第一に、造血転写因子EKLFをコードする遺伝的に操作されたEklf遺伝子からなる、骨髄単核細胞(BMMNC)または造血幹細胞(HSC)/造血幹および前駆細胞(HSPC)の移植により、腫瘍抵抗性および他の健康で長寿性な性質を移譲することの実行可能性に関する。第二に、本発明は、長期造血幹細胞(LT−HSC)におけるEKLFの発現、そして、したがって造血調節の標的としてのEKLFの実証に関する。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
被験体の長寿性を増加させ、ならびに/あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、
(a)野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子(Eklf)遺伝子を有するように胚性幹細胞(ESC)、人工多能性細胞(iPSC)および/または臍帯血幹細胞(CBSC)を遺伝的に操作すること、
(b)該遺伝的に操作されたESC、iPSCおよび/またはCSBCを分化させ、造血幹細胞(HSC)ならびに/あるいは造血幹および前駆細胞(HSPC)を得ること、ならびに
(c)該HSCおよび/またはHSPCを被験体に移植することを含み、
これにより、移植された該HSCおよび/またはHSPCは、健康な長寿性ならびに/あるいは腫瘍抵抗性または転移への抵抗性を該被験体に与える、方法。
(項目2)
前記野生型EKLFポリペプチドが、野生型ヒトEKLFまたは野生型マウスEKLFまたは他の脊椎動物の野生型EKLFである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記改変マウスEKLFポリペプチドが、前記野生型マウスEKLFの74位に相当するリシン(K)残基の、アルギニン(R)、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記改変ヒトEKLFポリペプチドが、前記野生型ヒトEKLFの54位に相当するリシン(K)残基の、アルギニン(R)、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記改変EKLFポリペプチドが、前記マウスEKLFのK74、および前記ヒトEKLFのK54にオーソロガスなSUMO化可能部位に相当するリシン(K)残基の、アルギニン(R)、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む改変脊椎動物EKLFポリペプチドであり、該脊椎動物がマウスまたはヒトではない、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記1つまたは複数のアミノ酸の改変が、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの68位に相当するアミノ酸の改変を含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記細胞が、前記改変EKLFポリペプチドをコードするウイルスベクターの使用により、前記改変EKLFポリペプチドを発現するように形質導入される、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、弱毒化ワクチニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記細胞が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)およびCRISPR関連タンパク質(Cas)系の使用により、前記改変EKLFポリペプチドを発現するように形質導入される、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記改変EKLFポリペプチドの前記発現が、寿命の増強、抗転移性、および/または抗腫瘍形成性を引き起こす、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記EKLFがLT−HSC内で比較的高いレベルで発現され、そして、EKLFの枯渇が異なる型の造血/血液細胞の集団変化を引き起こす、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記EKLFが、LT−HSCおよび前記造血前駆細胞(例えば、MPP、CMP、GMP、およびMEP)内で、コロニー刺激因子2受容体サブユニットCsf2rbの発現を負に調節する、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記腫瘍が、肝臓がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞がん、メラノーマ、肺がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞がん、頭部および頸部がん、子宮頸がん、すい臓がん、食道がん、または扁平上皮がんである、項目1に記載の方法。ある好ましい例では、該細胞増殖性障害は、メラノーマである。
(項目14)
受取被験体の長寿性を増加させ、ならびに/あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、(a)野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を含むドナー被験体から骨髄を回収すること、(b)該1つまたは複数の改変eklf遺伝子を持つ、HSCおよび/またはHSPC HSCおよび/またはHSPCを含む骨髄単核細胞(BMMNC)を単離すること、ならびに(c)受取被験体に該BMMNCを移植することを含み、これにより、該受取被験体は腫瘍抵抗性および/または健康な長寿性を与えられる、方法。
(項目15)
前記野生型EKLFポリペプチドが、野生型ヒトEKLFまたは野生型マウスEKLFまたは他の脊椎動物の野生型EKLFである、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記改変マウスEKLFポリペプチドが、前記野生型マウスEKLFの74位に相当するリシン(K)残基の、アルギニン(R)、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記改変ヒトEKLFポリペプチドが、前記野生型ヒトEKLFの54位に相当するリシン(K)残基の、アルギニン(R)、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目14に記載の方法。
(項目18)
前記改変EKLFポリペプチドが、前記マウスEKLFのK74、およびヒトEKLFのK54にオーソロガスなSUMO化可能部位に相当するリシン(K)残基の、アルギニン(R)、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む改変脊椎動物EKLFポリペプチドであり、該脊椎動物がマウスまたはヒトではない、項目14に記載の方法。
(項目19)
前記1つまたは複数のアミノ酸の改変が、前記全長野生型マウスEKLFポリペプチドの68位に相当するアミノ酸の改変を含む、項目14に記載の方法。
(項目20)
前記EKLFがLT−HSC内で比較的高いレベルで発現され、そして、EKLFの枯渇が異なる型の造血/血液細胞の集団変化を引き起こす、項目14に記載の方法。
(項目21)
前記EKLFが、LT−HSCおよび前記造血前駆細胞(例えば、MPP、CMP、GMP、およびMEP)内で、コロニー刺激因子2受容体サブユニットCsf2rbの発現を負に調節する、項目14に記載の方法。
(項目22)
前記細胞が、前記改変EKLFポリペプチドを発現するように遺伝的に変更された動物から得られる、項目14に記載の方法。
(項目23)
前記腫瘍が、肝臓がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞がん、メラノーマ、肺がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞がん、頭部および頸部がん、子宮頸がん、すい臓がん、食道がん、または扁平上皮がんである、項目14に記載の方法。ある好ましい例では、該細胞増殖性障害は、メラノーマである。
(項目24)
野生型のEKLFポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸の改変を含むEKLFポリペプチドをコードする遺伝子により操作された細胞であって、該細胞は、ESC、iPSC、CBSC、HSC、HSPCまたはBMMNCであり、そして、該1つまたは複数のアミノ酸の改変が、全長野生型ヒトEKLFの54位または全長野生型マウスEKLFポリペプチドの74位に相当するアミノ酸の改変を含み、そして54位または74位に相当する該アミノ酸の該改変が、Lysの、Argによる(K54RもしくはK74R)または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換であり、該脊椎動物がマウスまたはヒトではない、細胞。
(項目25)
1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を持ち、そして発現する、HSCおよび/または/HSPCを得るためのin vitroの方法であって、野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を有するようにESC、iPSC、および/またはCBSCを遺伝的に操作すること、ならびに(b)該遺伝的に操作されたESC、iPSC、および/またはCSBCを分化させ、該1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を持ち、そして発現するHSCおよび/またはHSPCを得ることを含み、ここで、該HSCおよび/またはHSPCは健康な長寿性および/または腫瘍抵抗性もしくは転移抵抗性を与える、方法。
(項目26)
腫瘍抵抗性および健康な長寿性の性質を有する1つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子(eklf)遺伝子を発現するHSCおよび/または/HSPCを得るためのin vitroの方法であって、(a)野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つもしくは複数の改変EKLF遺伝子を有するように骨髄単核細胞(BMMNC)を遺伝的に操作すること、ならびに該1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を持つHSCおよび/またはHSPCを単離することを含む方法。
利便性のため、本開示の文章中で用いられる特定の用語はここに集められる。他で定義されない限り、この中で用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者による一般的な理解と同じ意味を有する。
本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、条件が合ったときの遺伝子の転写であって、結果としてmRNAおよび通常コードされたタンパク質を生じる転写を指すことを意図する。発現は、細胞によって(すなわち、人工的な介入なしに)自然に達成もしくは実施され得、または人工的に(すなわち、例えば化学的な試薬を用いて調節されるプロモーターの使用のような人工的な介入の中で)達成もしくは実施され得る。発現は、例えばCre媒介組み換えのような、部位特異的リコンビナーゼが誘発する組み換えイベントによっても始められ得る。発現は遺伝子から転写されたmRNAの測定により、または遺伝子によってコードされたタンパク質の測定により測定され得る。
1つの側面では、本発明は、被験体の長寿性を増加させ、ならびに/あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、(a)野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子(Eklf)遺伝子を有するように胚性幹細胞(ESC)、人工多能性細胞(iPSC)および/または臍帯血幹細胞(CSBC)を遺伝的に操作すること、(b)遺伝的に操作されたESC、iPSCおよび/またはCSBCを分化させ、造血幹細胞(HSC)ならびに/あるいは造血幹および前駆細胞(HSPC)を得ること、ならびに(c)HSCおよび/またはHSPCを被験体に移植することを含み、これにより、移植されたHSCおよび/またはHSPCは、健康な長寿性ならびに/あるいは腫瘍抵抗性または転移への抵抗性を被験体に与える、方法を提供する。本発明は、1つまたは複数の改変Eklf遺伝子を持ち、そして発現する、HSCおよび/または/HSPCを得るためのin vitroの方法であって、野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変Eklf遺伝子を有するようにESC、iPSC、および/またはCBSCを遺伝的に操作すること、ならびに(b)遺伝的に操作されたESC、iPSC、および/またはCSBCを分化させ、1つまたは複数の改変Eklf遺伝子を持ち、そして発現するHSCおよび/またはHSPCを得ることを含み、ここで、HSCおよび/またはHSPCは健康な長寿性および/または腫瘍抵抗性もしくは転移抵抗性を与える、方法も提供する。あるいは、本発明は、被験体の長寿性を増加させ、および/または腫瘍の発生もしくは腫瘍の移転を阻害または減少させるための医薬の製造における、ESC、iPSC、CSBC HSC、および/またはHSPCの使用であって、ここで、ESC、iPSC、CBSC HSC、および/またはHSPCは、野生型のEKLFポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変Eklf遺伝子を持ち、そして発現する、使用を提供する。
好ましくは、受取被験体(例えばヒト)への細胞の移植の様式は、点滴および/またはボーラス注入を含む静脈内投与、あるいは注入による腹膜内投与である。例えば、非経口投与、粘膜投与、埋め込み投与、筋肉内投与、皮内投与、経皮投与のような他の様式も用いられ得る。好ましくは、骨髄細胞は、哺乳動物への投与の特定の様式および経路に適した媒体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水の中で投与される。
Eklf−KOマウスの産出
赤血球系列に対する巨核球系列の分化以外の、造血系の恒常性におけるEKLFの調節効果を検査するために、本発明者らはまず、遺伝子標的化戦略を用いてEklf遺伝子ノックアウト(KO)を有するモデルマウスを産出した(図1A)。ホモ接合型Eklf−/−マウスはE14.5日で胎生致死であり、そして変異型の胚は貧血で、部分的にグロビン遺伝子の発現の欠如によるアルビノ様の形質を示した(図1B)。その後、本発明者らは、Eklf+/+(WT)マウスおよびEklf−/−(KO)マウスからE14.5胎児肝臓をそれぞれ調製し、そして異なる組み合わせの抗体で染色した後に、フローサイトメーターを用いて細胞をソートした。先行研究(Fronteloら、2007)から予想されるように、EKLFの不在は、KOマウスのE14.5胎児肝臓において、赤血球の大きな減少と、そして同時に、巨核球の増加を引き起こした(図1C)。
EKLFの造血系に対する調節効果の分子的な基盤を解明するために、本発明者らはまず、LT−HSCおよび異なる造血前駆細胞における、EklfのmRNAのレベルを解析、そして比較した。WTのE14.5胎児肝臓におけるmRNAのRT−qPCR解析が示すように、MEP内のEklfのmRNAのレベルは、マウスの赤白血病(MEL)細胞でのレベルと同等であり、一方で、CMPおよびGMPにおけるレベルは非常に低かった(図3A、左の棒グラフ)。このEklfの発現パターンは、成体マウスの骨髄から単離されたMEP、CMP、およびGMPの解析に由来する発現パターン(Fronteloら、2007)と類似した。しかし、驚くべきことに、E14.5胎児肝臓のMPPおよびLT−HSCにおけるEklfのmRNAのレベルは比較的高く、MEPにおけるレベルのおよそ50%であった(図3A、左の棒グラフの右の2つの棒)。LT−HSCおよびMPPで例示するように(図3A、右の棒グラフ)、KOマウスのE14.5胎児肝臓の上記の型の細胞においては、予想通りEklfのmRNAは存在しなかった。
Eklf−/−マウスのE14.5胎児肝臓におけるLT−HSC数の減少の基盤について、さらに理解するために、本発明者らは、MillerおよびLai(2005)によって記載されるように、ソートされたLT−HSCのコロニー形成アッセイを行った。予想されるように、プレート上のサイトカインを含まないメチルセルロース培地で、Eklf+/+またはEklf−/−どちらかのE14.5胎児肝臓からソートして純化したLT−HSCを培養したときには、コロニーは形成されなかった(データは示さない)。しかし、サイトカイン/因子rmSCF、rhIL−6、およびrmIL−3を用い、rhEPOを用いずにインキュベートしたとき、103個のWTのLT−HSCの内、およそ150個がコロニーを形成した(図4C、棒グラフの左の棒)。さらに、Eklf−/−のE14.5胎児肝臓からのLT−HSCは、サイトカイン/因子による刺激に関して、より頑強な分化能を獲得し、これはコロニー数の2.5倍の増加に反映された(図4C、棒グラフの右の棒)。図4Cのデータは、EKLFが、部分的には、LT−HSCが下流の造血前駆細胞へと過剰に分化することを防ぐことにより、通常の条件下でLT−HSCの恒常性を維持するということを示す。
EKLFのK74R変異アレルを持つトランスジェニックマウスを、国際公開第0367272016号に記載される手順に従って産出した。
Claims (18)
- 被験体の長寿性を増加させ、ならびに/あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法において使用するための、長期造血幹細胞(LT−HSC)を含む組成物であって、該LT−HSCは、以下:
(a)野生型ヒトEKLFの54位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換、または野生型マウスEKLFの74位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子(Eklf)遺伝子を有するように胚性幹細胞(ESC)、人工多能性細胞(iPSC)および/または臍帯血幹細胞(CBSC)を遺伝的に操作する工程、
(b)該遺伝的に操作されたESC、iPSCおよび/またはCSBCを分化させ、該LT−HSCを得る工程
の工程から調製されたものであり、
該LT−HSCは、Lin − 、CD117 + 、Sca−1 + 、Thy1.1 lo 、Flk2 − 、CD34 − として同定され、
該腫瘍が、メラノーマである、組成物。 - 前記改変EKLFポリペプチドが、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの68位に相当するアミノ酸の改変を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞が、前記改変EKLFポリペプチドをコードするウイルスベクターの使用により、前記改変EKLFポリペプチドを発現するように形質導入されている、請求項1に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、弱毒化ワクチニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項3に記載の組成物。
- 前記細胞が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)およびCRISPR関連タンパク質(Cas)系の使用により、前記改変EKLFポリペプチドを発現するように形質導入されている、請求項1に記載の組成物。
- 前記改変EKLFポリペプチドの前記発現が、寿命の増強、抗転移性、および/または抗腫瘍形成性を引き起こす、請求項1に記載の組成物。
- 前記EKLFがLT−HSC内で比較的高いレベルで発現され、そして、EKLFの枯渇が異なる型の造血/血液細胞の集団変化を引き起こす、請求項1に記載の組成物。
- 前記EKLFが、LT−HSCおよび前記造血前駆細胞内で、コロニー刺激因子2受容体サブユニットCsf2rbの発現を負に調節する、請求項1に記載の組成物。
- 受取被験体の長寿性を増加させ、ならびに/あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法において使用するための、骨髄単核細胞(BMMNC)を含む組成物であって、該BMMNCは、以下:(a)野生型ヒトEKLFの54位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換、または野生型マウスEKLFの74位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を含むドナー被験体から骨髄を回収する工程、ならびに(b)該1つまたは複数の改変eklf遺伝子を持つ長期造血幹細胞(LT−HSC)を含む骨髄単核細胞(BMMNC)を単離する工程、の工程から調製されたものであり、該LT−HSCは、Lin − 、CD117 + 、Sca−1 + 、Thy1.1 lo 、Flk2 − 、CD34 − として同定され、該腫瘍が、メラノーマである、組成物。
- 前記改変EKLFポリペプチドが、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの68位に相当するアミノ酸の改変を含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記EKLFがLT−HSC内で比較的高いレベルで発現され、そして、EKLFの枯渇が異なる型の造血/血液細胞の集団変化を引き起こす、請求項9に記載の組成物。
- 前記EKLFが、LT−HSCおよび造血前駆細胞内で、コロニー刺激因子2受容体サブユニットCsf2rbの発現を負に調節する、請求項9に記載の組成物。
- 前記細胞が、前記改変EKLFポリペプチドを発現するように遺伝的に変更された動物から得られたものである、請求項9に記載の組成物。
- 前記造血前駆細胞が、多能性前駆細胞(MPP)、骨髄系共通前駆細胞(CMP)、顆粒球/マクロファージ前駆細胞(GMP)または骨髄系/赤血球系前駆細胞(MEP)である、請求項8または12に記載の組成物。
- 前記EKLFが、部分的にLT−HSCが下流の造血前駆細胞へと過剰に分化することを防ぐことにより、LT−HSCの恒常性を維持する、請求項8または12に記載の組成物。
- 野生型のEKLFポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸の改変を含むEKLFポリペプチドをコードする遺伝子を有する長期造血幹細胞(LT−HSC)であって、該1つまたは複数のアミノ酸の改変が、全長野生型ヒトEKLFの54位または全長野生型マウスEKLFポリペプチドの74位に相当するアミノ酸の改変を含み、そして54位または74位に相当する該アミノ酸の該改変が、Lysの、Argによる(K54RもしくはK74R)置換である、LT−HSC。
- 1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を持ち、そして発現する、長期造血幹細胞(LT−HSC)を得るためのin vitroの方法であって、(a)野生型ヒトEKLFの54位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換、または野生型マウスEKLFの74位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を有するようにESC、iPSC、および/またはCBSCを遺伝的に操作すること、ならびに(b)該遺伝的に操作されたESC、iPSC、および/またはCSBCを分化させ、該1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を持ち、そして発現するLT−HSCを得ることを含み、ここで、該LT−HSCは健康な長寿性および/または腫瘍抵抗性もしくは転移抵抗性を与え、該腫瘍が、メラノーマである、方法。
- 腫瘍抵抗性および健康な長寿性の性質を有する1つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子(eklf)遺伝子を発現する長期造血幹細胞(LT−HSC)を得るためのin vitroの方法であって、(a)野生型ヒトEKLFの54位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換、または野生型マウスEKLFの74位に相当するリシン(K)残基のアルギニン(R)による置換を含む改変EKLFポリペプチドをコードする、1つもしくは複数の改変EKLF遺伝子を有するように骨髄単核細胞(BMMNC)を遺伝的に操作すること、ならびに(b)該1つまたは複数の改変EKLF遺伝子を持つLT−HSCを単離することを含み、該腫瘍が、メラノーマである、方法。
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