KR20190040498A - 이식에 의해서 수명을 향상시키고/거나 세포 증식성 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 첫 째로, 조혈 전사인자 EKLF를 인코딩하는 유전자 조작 Eklf 유전자로 이루어진 골수 단핵 세포(BMMNC) 또는 조혈모세포(HSC)/조혈모 및 선조 세포(HSPC)의 이식을 통한 종양 저항성 및 다른 건강 장수의 전달의 실행가능성을 발견하였다. 둘 째로, 본 발명은 장기간 조혈모세포 (LT-HSC)에서의 EKLF의 발현 및 그에 따른 조혈의 조절의 표적으로서의 EKLF를 입증하였다.

Description

이식에 의해서 수명을 향상시키고/거나 세포 증식성 질환을 치료하는 방법
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 본원에서 그 전체가 참조로 통합되는 2016년 9월 13일자 출원된 미국가출원 일련번호 제62/393,665호의 우선권의 이익을 주장한다.
서열목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 서류 사본 대신에 텍스트 포맷(text format)으로 제공되며, 본원에서 명세서에 참조로 통합된다. 서열목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 LELIWOTEMP_SQL_ST25.txt이다. 그러한 텍스트 파일은 4 KB이며, 2017년 9월 13일에 생성되었고, EFS-Web를 통해서 전자적으로 제출된다.
발명의 분야
본 발명은 줄기 세포 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 변형된 Eklf 유전자를 가진 조혈모세포(hematopoietic stem cell: HSC) 및/또는 조혈모 및 선조 세포(hematopoietic stem and progenitor cell: HSPC)의 이식(예컨대, 골수 이식 또는 만능 줄기세포 이식)을 통한 대상체에서의 종양 저항성 및 건강한 수명의 전달에 관한 것이다.
조혈은 조혈/혈액계가 복수의 유형의 골수성 및 림프성 혈액 세포를 생성시키는 과정이다. 림프성 및 골수성 계통 결정은 다분화능 선조세포(multipotent progenitor: MPP), 공통 골수성 선조세포(common myeloid progenitor: CMP), 골수성/적혈구 선조세포(myeloid/erythroid progenitor: MEP), 과립구/대식세포 선조세포(granulocyte/macrophage progenitor: GMP), 및 공통 림프성 선조세포 (common lymphoid progenitor: CLP)를 포함한 다분화능 조혈 선조세포에서 발생하며, MMP는 조혈모세포(hematopoietic stem cell: HSC)의 자기 재생 및 분화를 통해서 생성된다. HSC는 일차적으로 항상성 조건 하에 GO 기에 자리한다. 조혈 세포계의 맨 위에 위치하여, HSC는 조혈에서 주요 역할을 하며, 이의 항상성의 조절이 다양한 조혈/혈액 세포의 하류 운명을 결정한다. 특히, 많은 시토카인(예컨대, IL-3, IL-7, SCF, TPO 및 GM-CSF 등) 및 전사인자(예컨대, Notch1, Tal-1, HoxB4, GATA1, GATA2, 및 GATA3 등)이 HSC 및 조혈 선조세포의 항상성의 조절에 연루되어 있다. 정제된 HSC의 형태학적 및 기능적 특성은 광범위하게 특성화되었다. 또한, 많은 연구가 분자 및 세포 수준에서의 HSC의 자기-재생, 유지 및 분화의 조절에 대해서 보고되었다.
장수 유전자는 삶의 연장 가능성과 삶의 질을 향상시킬 가능성 둘 모두를 위해서 분명한 관심의 대상이고 중요하다. 그러나, 이들 유전자 중 매우 적은 유전자가 확인되었고, 이들 유전자가 노화를 방지하고 삶의 연장을 촉진시키기 위해서 어떻게 작용하는지에 대해서는 거의 이해되지 않고 있다. WO 2016036727호는 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형를 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 적혈구 Kruppel-유사 인자(Erythroid Kruppel-like factor: EKLF) 유전자를 포함하는 비-인간 유전자 이식 동물을 제공하고 있다. 유전적으로 변경된 EKLF 마우스는 연장된 수명, 연장된 건강수명, 및 암 발병 및/또는 전이에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서, 변형된 Eklf 유전자 및 이들의 생성물은 노화를 방지하고 종양을 치료하기에 유용하다.
EKLF/KLF1는 N-말단 활성화 도메인, C-말단 아연 핑거 도메인(C-terminal zinc finger domain), 및 복수의 번역 후 변형 부위(multiple post-translational modification site)로 이루어진 Kruppel-유사 인자 패밀리의 제 1 구성원이다. 마우스 태아 간의 게놈-전체 분석(genome-wide analysis)은 활성화 또는 억제가 특이적 조절 영역에의 EKLF의 DNA-결합을 통해서 조절되는 많은 유전자를 확인하였다. EKLF/KLF1은 초기에 적혈구-특이적 전사인자로서 확인되었지만, 후에 MEP 및 GMP 뿐만 아니라 CMP를 포함한 거대핵세포(megakaryocyte) 및 조혈 선조세포에서 또한 발현되는 것으로 밝혀졌다(Frontelo, P., Manwani, D., Galdass, M., Karsunky, H., Lohmann, F., Gallagher, P.G., and Bieker, J.J. (2007). Novel role for EKLF in 거대핵세포 lineage commitment. Blood 110, 3871-3880). 기능 상실 및 기능 획득 연구는 EKLF가 적혈구 생성의 과정을 조절할 뿐만 아니라(Porcu, S., Manchinu, M.F., Marongiu, M.F., Sogos, V., Poddie, D., Asunis, I., Porcu, L., Marini, M.G., Moi, P., Cao, A., et al. (2011). Klf1 affects DNase II-alpha expression in the central macrophage of a fetal liver erythroblastic island: a non-cell-autonomous role in definitive erythropoiesis. Mol Cell Biol 31, 4144-4154), MEP로부터 적혈구 또는 거대핵세포로의 분화 운명 결정을 조절한다는 것을 밝혀냈다.
그러나, EKLF가 거대핵세포-적혈구 분리 및 단핵구-대-대식세포가 아닌 조혈의 조절에 참여하는지 및 얼마나 광범위하게 참여하는지가 아직 알려지지 않았다.
본 발명은 우선 조혈 전사인자 EKLF를 인코딩하는 유전자 조작 Eklf 유전자로 이루어진 골수 단핵 세포(BMMNC) 또는 조혈모세포(HSC)/조혈모 및 선조 세포(HSPC)의 이식을 통해서 종양 저항성 및 다른 건강 장수 특성(healthy longevity character)의 전달 가능성에 관한 것이다. 두 번째로, 본 발명은 장기 조혈모세포(long-term hematopoietic stem cell: LT-HSC)에서의 EKLF의 발현 및 그에 따른 조혈 조절의 표적으로서의 EKLF의 입증에 관한 것이다.
조혈계의 항상성은 일부 LT-HSC의 자가-재생과 상이한 조혈 전구체의 이들의 분화 능력에 의한 증식의 균형에 좌우되며, 이는 다양한 시토카인 및 신호 전달 경로에 의해서 조절된다. 본 발명은 EKLF가 장기 조혈모세포(LT-HSC)에서 비교적 높은 수준으로 발현되며, 이는 조혈/혈액계의 분화 프로그램의 맨 위에 있다는 것을 밝혀냈다. 본 발명은 또한 EKLF의 고갈이 상이한 유형의 조혈/혈액 세포의 집단 변화, 특히, LT-HSC의 감소 및 조혈 선조세포의 증가를 유도한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 종양 저항성 및 건강 장수는 조혈 전사인자 EKLF를 인코딩하는 유전자 조작 Eklf 유전자를 갖는 골수 이식 또는 HSC/HSPC의 줄기 이식을 통해서 전달될 수 있다.
따라서, 본 발명은 대상체의 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제하거나 감소시키기 위한 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 적혈구 Kruppel-유사 인자(Eklf) 유전자를 보유하도록 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 세포(iPSC) 및/또는 제대혈 줄기 세포(CBSC)를 유전적으로 조작하고; (b) 조혈모세포(HSC) 및/또는 조혈모 및 선조 세포(HSPC)를 얻기 위해서 유전자 조작된 ESC, iPSC, 및/또는 CSBC를 분화시키고; (c) HSC 및/또는 HSPC를 대상체에 이식함을 포함하고; 이식된 HSC 및/또는 HSPC가 대상체에 건강 장수 및/또는 종양 저항성 또는 전이 저항성을 부여하는, 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체의 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제시키거나 감소시키기 위한 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 포함하는 공여 대상체로부터 골수를 수집하고; (b) 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 갖는 HSC 및/또는 HSPC HSC 및/또는 HSPC를 포함하는 골수 단핵 세포(marrow mononuclear cell: BMMNC)를 분리하고; (c) BMMNC를 수용 대상체에 이식하여, 수용 이식체에게 종양 저항성 및/또는 건강 장수를 부여하는, 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는, EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자에 의해서 조작된 세포로서, ESC, iPSC, CBSC, HSC, HSPC 또는 BMMNC를 제공한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 전장(full length) 야생형 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 74에 상응하는 아미노산의 변형을 포함한다. 마우스가 아닌 동물과 관련된 특정의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 마우스 EKLF 폴리펩티드에서의 이러한 잔기에 상응하는 수모화된(sumoylated) 아미노산 잔기의 변형을 포함하지만, 그것은 상이한 위치에 자리할 수 있다. 예를 들어, 인간 EKLF 폴리펩티드에서, 마우스 EKLF 폴리펩티드 내의 위치 74에 상응하는 수모화 부위는 아미노산 잔기 54에 자리할 수 있다. 특정의 구체예에서, 그것은 Lys 잔기이다. 특정의 구체예에서, 위치 54 또는 74에 상응하는 아미노산의 변형은 Arg (K54R 또는 K74R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 Lys의 치환이다.
일부 구체예에서, 세포는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 바이러스 벡터의 사용을 통해서 또는 군집화되고 규칙적 간격으로 분포된 짧은 회문 반복체(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 및 CRISPR 회합된 단백질(Cas) 시스템의 사용을 통해서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 발현시키도록 형질 도입된다.
일 구체예에서, 변형된 EKLF 폴리펩티드의 발현은 향상된 수명, 항-전이, 및/또는 항-종양발생을 유도한다.
일 구체예에서, EKLF는 LT-HSC에서 비교적 높은 수준으로 발현되며, EKLF의 고갈은 상이한 유형의 조혈/혈액 세포의 집단 변화를 유도한다. 또 다른 구체예에서, EKLF는 LT-HSC 및 조혈 선조세포(예컨대, MPP, CMP, GMP, 및 MEP)에서의 집락 자극인자 2 수용체 서브유닛 Csf2rb의 발현을 음으로 조절한다.
도 1a 내지 도 1c는 Eklf의 유전자 녹아웃(knockout: KO)을 갖는 마우스의 발생을 나타낸다. 도 1a 표적화 전략. 계략도는 Eklf 유전자좌의 유전자 정황 및 Eklf 유전자의 인트론 1 영역 내의 역전된 loxP-PGK-gb2-neo-loxP 카세트를 갖는 표적화 BAC 구성물의 지도(map)를 나타낸다. PCR-기반 유전형 분석을 위해서, 50 bp 결실 (회색 블록)은 LoxP 부위의 5' 말단 후의 인트론 1 내로 도입되었다. 유전형 분석을 위해서 사용된 PCR 프라이머의 위치는 작은 검은색 화살표로서 나타낸다: 5'-결실: 5'-GCG GCG CGA TAA CTT CGT AT-3' (SEQ ID NO: 1), 5'-PGK: 5'-TTG AAT TCT GCT TCC TGT TGG A-3' (SEQ ID NO: 2), EKLF-F: 5'-AGG CAG AAG AGA GAG AGG AGG C-3' (SEQ ID NO: 3), 3'-결실: 5'-CCT ATT TCT CCA ACA GGA AGC A-3' (SEQ ID NO: 4), PGK-R: 5'-CTG GCC CTC AAA CAA CCC TG-3' (SEQ ID NO: 5), 3'-PGK: 5'- GTT ATG CGG CCC TAG TGA TTT A-3' (SEQ ID NO: 6). Nifx 및 Fbwx9는 Eklf 유전자좌를 플랭킹(flanking)하는 두 개의 원위 유전자좌이다. 네오, 네오마이신 저항 유전자; PGK, 포스포글리세레이트 키나아제 I 프로모터; 검은색 화살표, 원핵 프로모터 gb2; 검은색 화살표 헤드, loxP 부위. 도 1b 좌측 패널, 동형접합 Eklf-/-(KO)의 빈혈성 표현형. WT E14.5 배아와 비교한 E14.5 배아. 우측 상부 2개의 패널, E14.5 배아의 유전형 분석. 꼬리 게놈 DNA는 야생형 (5'-PGK 및 3'-PGK) 및 돌연변이 (5'-결실 및 3'-결실)에 대한 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해서 증폭되었다. +/+, 야생형; +/-, 이형접합 Eklf+/-; -/-, 동형접합 Eklf-/-. 우측 하부 2 개의 패널, Eklf 유전자 녹아웃에 의한 EKLF 단백질 발현의 고갈을 나타내는 면역블롯팅 (IB) 분석. β-액틴이 내부 대조군으로서 사용되었다. 도 1c는 WT 및 Eklf -/- 마우스의 E14.5 태아 간 세포의 비교 FACS 분석을 나타낸다. 적혈구 계통의 Ter119+ 세포의 감소 및 Eklf -/- E14.5 태아 간에서의 CD41+, CD42d+ 거대핵세포의 증가에 주목해야 하며, 이는 문헌(Frontelo et al. (2007))에 의한 보고서와 유사하다. N=3
도 2a 및 도 2b는 Eklf -/- E14.5 태아 간의 골수성 계통 세포의 집단 변화를 나타낸다. FACS 분석. 항체의 상이한 조합이 LT-HSC (Lin-, CD117+, Sca-1+, Thy1.1lo, Flk2-, CD34-), MPP (Lin-, CD117+, Sca-1+, Thy1.1-, Flk2+), CMP (Lin-, CD117+, Sca-1-, CD34+, CD16/32int), GMP (Lin-, CD117+, Sca-1-, CD34+, CD16/32hi) 및 MEP (Lin-, CD117+, Sca-1-, CD34-, CD16/32lo/int)를 확인하기 위해서 사용되었다. 분화된 세포는 다음과 같이 확인되었다: 단핵구 (CD11b+, CD11c-), 수지상 세포 (CD11b-, 33D1+), 대식세포 (F4/80+). 과립구에 대한 흐름 데이터는 여기에서 나타내지 않는다. N≥6. 도 2b의 카툰 차트(Cartoon chart)는 조혈의 분화 다이아그램 및 WT에 비교한 Eklf -/- E14.5 태아 간에서의 상이한 유형의 세포의 집단 변화를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 Eklf 및 이의 표적 유전자 Csf2rb의 발현을 나타낸다. 도 3a는 FACS에 의해서 E14.5 마우스 태아 간으로부터 정제된 LT-HSC, MPP, CMP, GMP 및 MEP를 포함하는 상이한 유형의 조혈모세포 및 선조세포로부터 분리된 RNA의 RT-qPCR 분석을 나타낸다. 전구체 세포의 모두에서 Eklf mRNA의 상대적인 수준은, MEP 내의 수준을 1로 설정하면, 왼쪽 패널 내의 마우스 적백혈병 (MEL) 세포의 수준과 비교된다. WT 및 Eklf -/- 마우스 각각으로부터의 E14.5 태아 간의 LT-HSC 및 MPP 내의 Eklf mRNA의 비교 RT-qPCR 분석이 우측 패널에 나타내어져 있다. 도 1b는 정제된 CMP, GMP, MEP 및 MPP 내의 Csf2rb, Stat1 및 Stat2의 mRNA 수준의 RT-qPCR 분석을 나타낸다. 모든 4 개의 세포형에서의 Csf2rb mRNA의 유의한 증가, 그러나, MEP 내에서만의 Stat2 mRNA의 증가 및 MEP 뿐만 아니라 MPP에서의 Stat1 mRNA의 증가를 주지해야 한다. 5 개의 생물학적 복사체가 각각의 유형의 세포에 대해서 분석되었다. 각각의 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
도 4a 내지 도 4d는 EKLF에 의한 LT-HSC 분화의 조절을 나타낸다. 도 4a는 WT 및 KO E14.5 마우스 태아 간으로부터 정제된 LT-HSC에서의 Csf2rb mRNA의 상대적인 수준이 RT-qPCR에 의해서 분석되었음을 나타낸다. N≥5.** p<0.01. 도 4b는 WT-LT-HSC 및 KO-LT-HSC에서의 EKLF 및 CSF2RB의 발현의 면역-형광 염색 분석을 나타낸다. DAPI는 핵 마커(nucleus marker)이다. KO-LT-HSC에서의 EKLF 신호의 결여를 주목해야 한다. 또한, KO-LT-HSC에서의 CSF2RB 단백질의 염색으로부터의 신호는 WT-LT-HSC의 것보다 더 강하다. 세 개의 생물학적 복사체가 분석되었다. LT-HSC의 직경은 5 내지 10㎛ 범위이다. 우측 패널은 WT-LT-HSC와 비교한 KO-LT-HSC에서의 CSF2RB 단백질의 증가에 대한 통계학적 분석을 나타낸다. p<0.001. 도 4c는 메틸셀룰로오즈 집락 분석이 유세포분석(flow cytometry)에 의해서 E14.5 태아 간 세포로부터 정제(>90%)된 WT-LT-HSC 및 KO-LT-HSC에 대해서 수행되었음을 나타낸다. WT-LT-HSC와 비교했을 때, 3 내지 4 중 동안 시토카인/인자로 처리된 KO-LT-HSC가 집락수의 약 2.5배 증가를 나타냈음을 주목해야 한다. 웰당 1,000 개의 세포가 사용되었다. N≥4. *** p<0.001. 도 4d는 LT-HSC의 항상성에서의 EKLF의 조절 역할을 나타내는 단일 모델을 나타내고 있으며, 여기에서, 그것은 과잉의 Csf2rb 발현 및 그 결과 LT-HSC의 분화를 방지하기 위한 억제자로서 작용한다.
도 5a 및 도 5b는 EKLF (K74R) Kin 마우스로부터의 골 이식 후의 WT 마우스에서의 암의 억제를 나타낸다. 도 5a는 WT 및 Kin 마우스 각각으로부터의 골수 이식을 받은 후의 WT 마우스로부터의 폐의 대표적인 사진이다. 도 5b는 도 5a의 WT 마우스에서의 폐 병소의 수의 정량적 제시를 나타낸다.
편의상, 본 개시의 문맥에서 사용된 특정의 용어가 여기에서 모아 정리된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
단수 형태는 본원에서, 문맥에서 명확하게 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 사용된다.
정의
본원에서 사용된 용어 "발현"은, 조건이 부합되는 때에, mRNA 및 일반적으로 인코딩된 단백질의 생성을 초래하는, 유전자의 전사를 의미하는 것으로 의도된다. 발현은 세포에 의해서 자연적으로 달성 또는 수행될 수 있거나(즉, 인공적인 개입 없이), 인공적으로 달성 또는 수행될 수 있다(즉, 화학 작용제의 사용에 의해서 조절된 프로모터의 사용에 의한 바와 같이, 인공적인 개입의 관여에 의해서). 발현은 또한 Cre-매개된 재조합에 의한 바와 같이, 부위-특이적 재조합효소에 의해서 촉발된 재조합 이벤트에 의해서 개시될 수 있다. 발현은 유전자로부터 전사된 mRNA를 측정함으로써 또는 유전자에 의해서 인코딩된 단백질을 측정함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 적절한 경우, 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 핵산은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 단일-가닥 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 또 다른 핵산에 연결되어 그러한 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 용어 "발현 벡터"는 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 벡터 또는 발현 벡터는 벡터에 의해서 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해서 인코딩된 목적 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드 또는 파아지를 포함한다. 벡터 또는 발현 벡터는 또한 핵산을 세포, 예를 들어, 포유동물 세포 내로 도입시킬 수 있는 바이러스-기반 벡터를 포함한다. 특정의 벡터는 그들이 연결되어 있는 핵산의 자기 복제 및/또는 발현시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "대립 유전자"는 세포 내의 또는 군집 내의 유전자의 한 가지 특이적 형태로서, 유전자의 서열 내의 적어도 하나 및 흔하게는 하나 초과의 변이 부위의 서열에서 동일한 유전자의 다른 형태와는 다를 수 있는 특이적 형태를 의미한다. 상이한 대립 유전자들 사이에서 상이한 이들 변이 부위에서의 서열은 "변이(variance)", "다형성(polymorphism)", 또는 "돌연변이(mutation)"라 지칭된다. 대상체가 유전자의 두 개의 동일한 대립 유전자를 갖는 경우에, 그러한 대상체는 그러한 유전자 또는 대립 유전자에 대해 동형접합이라고 한다. 대상체가 유전자의 두 개의 상이한 대립 유전자를 갖는 경우에, 그러한 대상체는 그러한 유전자에 이형접합이라고 한다. 특이적 유전자의 대립 유전자는 단일의 뉴클레오티드 또는 몇 개의 뉴클레오티드에서 서로 다를 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립 유전자는 또한 돌연변이를 함유하는 유전자의 형태일 수 있다.
용어 "야생형"은 천연 공급원으로부터 분리된 때의 유전자 또는 유전자 생성물의 특성을 가지는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미한다. 야생형 유전자 또는 유전자 생성물(예, 폴리펩티드)은 집단에서 가장 흔하게 관찰되며 그에 따라서 유전자의 "정상(normal)" 또는 "야생형" 형태로 임의로 설계되는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스펙션(transfection)"은 핵산 매개된 유전자 전달에 의한 수용 세포 내로의 핵산, 예를 들어, 발현 벡터의 도입을 의미하다. "형질전환(transformation)"은 세포의 유전자형이 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수의 결과로 변화되고 형질전환된 세포가 요망되는 이종 단백질을 발현하는 과정을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "녹-인(knock-in: Kin)"은 이식 유전자의 발현을 유도하는 숙주 세포 게놈 내의 이식 유전자의 표적된 삽입을 의미하다. "녹-인" 유전자 이식은 이식 유전자의 이형접합 녹-인을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, "녹-인"은 외인성 유전자(또는 이의 일부)에 의한 내인성 유전자(또는 이의 일부)의 대체를 초래하여, 예를 들어, 하나 또는 둘 모두의 대립 유전자의 표적된 돌연변이를 초래한다. "녹-인"은 또한 동물을 그러한 발현을 촉진시키는 물질에 노출시킴에 의한, 표적된 삽입 부위(예, Cre-lox 시스템에서의 Cre)에서 재조합을 촉진시키는 효소를 도입함에 의한, 또는 일부 다른 방법에 의한 유전자 이식의 발현을 포함한다. "동형접합" 상태는 동일한 대립 유전자가 상동 염색체 상의 상응하는 유전자좌에 자리하는 때에 존재하는 유전적 상태를 의미한다. 대조적으로, "이형접합" 상태는 상이한 대립 유전자가 상동 염색체 상의 상응하는 유전자좌에 자리하는 때에 존재하는 유전적 상태를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "CRISPR," "CRISPR 시스템" 또는 "CRISPR 뉴클레아제 시스템" 및 이들의 문법적 균등물은 뉴클레아제 기능성(예, 두 개의 뉴클레아제 도메인)으로 DNA 및 Cas 단백질(예, Cas9)에 결합하는 비-코딩 RNA 분자(예, 가이드 RNA)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "녹아웃(knockout)(약어: KO)"은 유기체의 유전자 중 하나가 비작동적이게 하는 유전적 기술이다(유기체의 "녹아웃").
본원에서 사용된 용어 "이식 유전자"는 핵산 서열로서, 그러한 핵산 서열이 도입되는 유전자 이식 동물 또는 세포에 대해서 부분적으로 또는 전체적으로 이종, 즉, 외래이거나, 그러한 핵산 서열이 도입되는 유전자 이식 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 상동지만, 그것이 삽입되는 세포의 게놈이 변경되도록 하는 방식으로 동물의 게놈 내로 삽입되게 설계되거나 삽입되는 핵산 서열을 나타낸다. 이식 유전자는 하나 이상의 전사 조절 서열, 및 선택된 핵산의 최적의 발현에 필요할 수 있는 어떠한 다른 핵산, 예컨대, 인트론에 작동적으로 연결될 수 있다. 따라서, 용어 "유전자 이식"은 본원에서 이식 유전자를 지니는 동물 또는 구성물의 특성을 설명하기 위한 형용사로서 사용된다. 예를 들어, "유전자 이식 동물"은 그러한 동물의 세포의 하나 이상이 인간의 개입에 의해서, 예컨대, 유전자 녹-인 기술을 포함한, 본 기술분야에서 잘 공지된 유전자 이식 기술에 의해서 도입된 이종 핵산을 함유하는 비-인간 동물, 바람직하게는 비-인간 포유동물, 더욱 바람직하게는 설치류이다. 핵산은 정밀 유잔자 조작을 통한 세포의 전구체내로의 도입에 의해서, 예컨대, 미세주입에 의해서 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해서 직적적으로 또는 간접적으로 세포 내로 도입된다. 유전자 이식 동물은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 녹-인 동물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "발현"은, 조건이 부합되는 때에, mRNA 및 일반적으로 인코딩된 단백질의 생성을 초래하는, 유전자의 전사를 의미히는 것으로 의도된다. 발현은 세포에 의해서 자연적으로 달성 또는 수행될 수 있거나(즉, 인공적인 개입 없이), 인공적으로 달성 또는 수행될 수 있다(즉, 화학 작용제의 사용에 의해서 조절된 프로모터의 사용에 의한 바와 같이, 인공적인 개입의 관여에 의해서). 발현은 또한 Cre-매개된 재조합에 의한 바와 같이, 부위-특이적 재조합효소에 의해서 촉발된 재조합 이벤트에 의해서 개시될 수 있다. 발현은 유전자로부터 전사된 mRNA를 측정함으로써 또는 유전자에 의해서 인코딩된 단백질을 측정함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "야생형"은 천연 공급원으로부터 분리된 때의 유전자 또는 유전자 생성물의 특성을 가지는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 흔하게 관찰되며 그에 따라서 유전자의 "정상(normal)" 또는 "야생형" 형태로 임의로 설계되는 것이다. 반면에, 용어 "변형된", "돌연변이", "다형성" 및 "변이"는, 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때, 서열 및/또는 기능적 특성에서 변형(즉, 변경된 특성)을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미한다. 천연 돌연변이는 분리될 수 있으며; 이들은 이들이, 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때, 변경된 특성을 갖는다는 사실에 의해서 확인되다는 것을 주목해야 한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 의미하기 위해서 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 영장류, 가축 및 농장 동물, 예컨대, 토끼, 돼지, 양 및 소 뿐만 아니라; 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 설치류, 예컨대, 마우스 및 래트를 포함한 포유류의 모든 구성원을 나타낸다. 용어 "비-인간 포유동물"은 인간을 제외한 포유류의 모든 구성원을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"는 본 발명의 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 인류를 포함한 동물을 나타낸다. 용어 "대상체"는, 한 가지 성별이 특이적으로 지시되지 않는 한, 남성(숫컷) 및 여성(암컷) 둘 모두를 나타낸다. 따라서, 용어 "대상체"는 본원 발명의 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떠한 포유동물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "조절한다"는 효과 또는 결과를 변경시키는 능력에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "이식" 및 이의 변형은, 이식물이 동계(xenogeneic)이든지(공여체 및 수용체가 유전적으로 동일한 경우), 동종 이계(allogeneic)이든지(공여체 및 수용체가 상이한 유전적 기원이지만 동일한 종인 경우), 이종(xenogeneic)이든지(공여체와 수용체가 상이한 종인 경우) 간에, 수용체 내로의 이식물(또한, 그라프트(graft)라 칭함)의 삽입을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "공여체"는 동물, 바람직하게는 골수 세포의 천연 공급원인 포유동물을 의미한다. 공여체는 건강한 동물, 즉, 어떠한 명백한 질환을 앓고 있지 않는 포유동물일 수 있다. 대안적으로, 공여체는 질환(예, 암)을 앓고 있는 포유동물일 수 있다. 수용체는 공여체로부터의 골수 세포를 받는 동물, 바람직하게는 포유동물이다. 수용체는 건강한 동물, 즉, 어떠한 명백한 질환을 앓고 있지 않는 포유동물일 수 있다. 대안적으로, 수용체는 질환(예, 암)을 앓고 있는 포유동물일 수 있다. 본 개시의 구체예에 따르면, 공여체 및 수용체는 동일한 포유동물일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 질환의 치료와 관련하여 요망되는 결과를 달성하기 위해서 필요한 기간 동안 투여량에서의 유효한 양을 나타낸다. 예를 들어, 암의 치료에서, 암의 어떠한 증상을 감소시키거나, 방지하거나, 지연시키거나, 억제하거나, 저지하는 작용제(즉, 화합물, 폴리펩티드, 치료학적 폴리펩티드를 인코딩하는 다중핵산, 또는 치료학적 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 세포)가 유효할 수 있다. 작용제의 유효량은 질환 또는 병태를 치유하는 것을 필요로 하지 않지만, 질환 또는 병태에 대한 치료를 제공하여 그러한 질환 또는 병태의 개시가 지연되거나, 방해되거나, 예방되게 하거나, 질환 또는 병태 증상이 개선되게 할 것이다. 그러한 유효량은 지정된 기간 전체에 걸쳐서 하나 또는 둘 이상의 횟수로 투여되기에 적합한 형태로 하나 또는 둘 이상의 투여로 분할될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 요망되는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 얻은 것, 예를 들어, 암 발생, 성장 또는 전이를 지연 또는 억제하는 것, 또는 기관에 대한 손상을 개선시키는 것을 의미하도록 의도된다. 그러한 효과는 질환 또는 이의 증상의 발생을 완전히 또는 부분적으로 방지 또는 억제하는 면에서 예방적일 수 있고/거나, 질환 및/또는 그러한 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료"는 포유동물, 특히, 인간에서의 질환의 방지적(예, 예방적), 치유적 또는 임시 방편적 치료를 포함하고; (1) 질환 또는 병태(예, 암 또는 심부전)에 취약할 수 있지만 아직 그러한 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단되지 않은 개체에서 발생으로부터 방지적(예, 예방적), 치유적 또는 임시 방편적 치료; (2) 질환을 억제하는 것(예, 그것의 발생을 저지함으로써); 또는 (3) 질환을 완화시키는 것(예, 질환과 관련된 증상을 감소시키는 것)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "투여된다", "투여되는" 또는 "투여"는, 제한 없이, 본 발명의 작용제(예, 화합물 또는 조성물)을 정맥내, 근육내, 복강내, 동맥내, 두개강내(intracranially), 또는 피하 투여함을 포함한, 전달 방식을 나타내기 위해서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 질환 또는 병태, 예컨대, 노화의 치료와 관련하여 요망되는 결과를 달성하기 위해서 필요한 기간 동안 투여량에서의 유효한 양을 나타낸다. 예를 들어, 암의 치료에서, 암의 어떠한 증상을 감소시키거나, 저해하거나, 방지하거나, 지연시키거나, 억제하거나, 저지하는 작용제(즉, 화합물, 폴리펩티드, 치료학적 폴리펩티드를 인코딩하는 다중핵산)가 유효할 수 있다. 작용제의 유효량은 질환 또는 병태를 치유하는 것을 필요로 하지 않지만, 질환 또는 병태에 대한 치료를 제공하여 그러한 질환 또는 병태의 개시가 지연되거나, 방해되거나, 예방되게 하거나, 질환 또는 병태 증상이 개선되게 할 것이다. 그러한 유효량은 지정된 기간 전체에 걸쳐서 하나 또는 둘 이상의 횟수로 투여되기에 적합한 형태로 하나 또는 둘 이상의 투여로 분할될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "세포 표면 마커"는 대상 세포가 이의 세포성 플라즈마 막 상에서 항체에 결합하고/거나 효소 기질을 소화시킬 수 있는 단백질, 효소 또는 탄수화물을 갖는다는 것을 의미한다. 세포 표면 마커는 특정 유형의 세포의 특성을 확인하는 역할을 하는 것으로 본 기술분야에서 인식되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "조혈 줄기세포"는 대상체의 골수 또는 혈액으로부터 유래되는 줄기세포를 나타낸다. 이들 줄기세포는 만능이며, 그에 따라서, 어떠한 다른 유형의 혈액 세포 또는 면역 세포 내로 형질전환되는 능력을 갖는다. 혈액 내에서의 그들의 역할은, 혈액 세포가 매일 대체되어야 하기 때문에, 신체를 혈액 세포로 지속적으로 보충되게 유지시키는 것이다. 두 가지의 상이한 유형의 조혈모세포, 즉, 장기 및 단기 조혈모세포가 있다. 이러한 두 가지 유형의 세포 사이의 차이는, 장기 줄기세포는 무한하게 재생할 수 있는 반면에, 단기 줄기세포는 자신들 장기간에 걸쳐서 재생할 수 없다는 것이다. 이들 장기 줄기세포는 자가-재생 능력을 가지고 있는 반면에, 단기 줄기세포는 단지 약 6개월 동안 생존할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "수명을 향상시키는", "수명을 증가시키는" 및 "생명-연장"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 정상적인 노화 과정을 지연시키고/거나 동물, 예를 들어, 생명-위협 질환(예, 암 또는 종양)을 앓고 있는 동물의 수명을 연장시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 장수는 미성숙 생명기(immature life phase)와는 상반되는 성숙 생명기(mature life phase)의 연장에 기인하며, 본 발명의 방법에 의해서 치료됨으로써 유도된다.
본원에서 사용된 용어 "건강 수명을 향상시키는"은 노화와 연관된 육체적 퇴화, 질환, 또는 질병의 개시 또는 중증도에서의 지연을 의미한다. 향상된 건강 장수는 또한, 노화와 정상적으로 연관된, 예를 들어, 특정의 연령에서의 육체적 퇴화, 질환, 또는 질병의 감소 또는 감소된 양을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "대립 유전자"는 세포 내의 또는 집단 내의 유전자의 한 가지 특이적 형태로서, 유전자의 서열 내의 적어도 하나 및 흔하게는 하나 초과의 변이 부위의 서열에서 동일한 유전자의 다른 형태와는 다를 수 있는 특이적 형태를 나타낸다. 상이한 대립 유전자들 사이에서 상이한 이들 변이 부위에서의 서열은 "변이(variance)", "다형성(polymorphism)", 또는 "돌연변이(mutation)"라 지칭된다. 대상이 유전자의 두 개의 동일한 대립 유전자를 갖는 경우에, 그러한 대상은 그러한 유전자 또는 대립 유전자에 대해 동형접합이라고 한다. 대상이 유전자의 두 개의 상이한 대립 유전자를 갖는 경우에, 그러한 대상은 그러한 유전자에 이형접합이라고 한다.
본원에서 사용된 용어 "자기(autologous)"는 나중에 다시 도입될 동일한 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "이종(heterologous)"은 나중에 다시 도입될 상이한 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "동종 이계(allogeneic)"는 도입된 개체와 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 의미한다.
수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제 또는 감소시키는 방법
한 가지 양태에서, 본 발명은 대상체의 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제시키거나 감소시키는 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 적혈구 Kruppel-유사 인자(Eklf) 유전자를 보유하도록 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 세포(iPSC) 및/또는 제대혈 줄기 세포(CBSC)를 유전적으로 조작하고; (b) 유전자 조작된 ESC, iPSC, 및/또는 CSBC를 분화시켜 조혈모세포 (HSC) 및/또는 조혈모 및 선조 세포(HSPC)를 얻고; (c) HSC 및/또는 HSPC를 대상체에 이식함을 포함하고; 이식된 HSC 및/또는 HSPC가 대상체에 건강 장수 및/또는 종양 저항성 또는 전이 저항성을 부여하는, 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 가지며 이를 발현하는 HSC 및/또는 HSPC를 얻는 시험관내 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 보유하도록 ESC, iPSC 및/또는 CBSC를 유전적으로 조작하고; (b) 유전자 조작 ESC, iPSC 및/또는 CSBC를 분화시켜 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 가지며 이를 발현하는 HSC 및/또는 HSPC를 얻는 것을 포함하며, HSC 및/또는 HSPC가 건강 장수 및/또는 종양 저항성 또는 전이 저항성을 부여하는, 방법을 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 대상체의 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제 또는 감소시키는 약물의 제조에서 ESC, iPSC, CSBC HSC 및/또는 HSPC의 용도로서, ESC, iPSC, CSBC HSC 및/또는 HSPC가 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 보유하고 이를 발현하는, 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 수용 대상체에서 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제 또는 감소시키기 위한 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 포함하는 공여 대상체로부터 골수를 수집하고; (b) 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 갖는 HSC 및/또는 HSPC HSC 및/또는 HSPC를 포함하는 골수 단핵 세포(BMMNC)를 분리하고; (c) BMMNC를 수용 대상체에 이식함을 포함하고, 수용 이식체에게 종양 저항성 및/또는 건강 장수를 부여하는 방법을 제공한다. 대안적으로 본 발명은 종양 저항성 및 건강 장수 특성을 갖는 하나 이상의 Eklf 유전자를 발현하는 HSC 및/또는 HSPC를 얻는 시험관내 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 보유하도록 BMMNC를 유전적으로 조작하고; (b) 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 보유하는 HSC 및/또는 HSPC를 분리함을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제 또는 감소시키기 위한 의약의 제조에서 유전적으로 조작된 BMMNC의 용도로서, BMMNC가 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 갖는, 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명은, 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는, EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자에 의해서 조작된 세포로서, ESC, iPSC, CBSC, HSC, HSPC 또는 BMMNC인 세포를 제공한다.
특정의 구체예는 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 Eklf 유전자를 갖는 ESC, iPSC, CBSC 또는 BMMC에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 세포는 하나 또는 둘 모두의 EKLF 유전자좌에서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 하나의 EKLF 유전자좌에서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 특정의 구체예에서, 세포는 둘 모두의 EKLF 유전자좌에서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 특정의 구체예에서, 세포는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 발현한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 전장 야생형 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 74에 상응하는 아미노산의 변형을 포함한다. 마우스가 아닌 동물과 관련된 특정의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 마우스 EKLF 폴리펩티드에서의 이러한 잔기에 상응하는 수모화가능한(sumoylatable) 아미노산 잔기의 변형을 포함하지만, 그것은 상이한 위치에 자리할 수 있다. 예를 들어, 인간 EKLF 폴리펩티드에서, 마우스 EKLF 폴리펩티드 내의 위치 74에 상응하는 수모화 부위는 아미노산 잔기 54에 자리할 수 있다. 특정의 구체예에서, 그것은 Lys 잔기이다. 특정의 구체예에서, 위치 74에 상응하는 아미노산의 변형은 Arg (K74R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 Lys의 치환이다. 다른 구체예에서, "또 다른 아미노산"은 His이다. 마우스 및 인간이 아닌 척추동물에서, 변형된 척추동물 EKLF 폴리펩티드는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 아르기닌(R) 또는 또 다른 아미노산에 의한 마우스 EKLF K74 및 인간 EKLF K54에 이종상동성인 수모화가능한 부위에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함한다.
특정의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 전장 야생형 인간 EKLF 폴리펩티드의 위치 54에 상응하는 아미노산의 변형을 포함한다. 일 구체예에서, 위치 54에서의 아미노산의 변형은 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 Arg (K54R) 또는 또 다른 아미노산에 의한 Lys의 치환이다. 다른 구체예에서, "또 다른 아미노산"은 His이다. 특정의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은, 예를 들어, 인간 EKLF 폴리펩티드에서 포스포릴화되는 아미노산, 예컨대, 이로 한정되는 것은 아니지만, 전장 야생형 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 68에 상응하는 포스포릴화된 아미노산의 변형을 포함한다.
요망되는 EKLF 돌연변이 대립 유전자 생성물(즉, 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는 EKLF)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연 Eklf 서열로부터 변형되거나 처음부터 제조될 수 있고, 관련 기술분야에서의 어떠한 공지된 방법에 의해서 적합한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 전형적으로는, 요망되는 Eklf 돌연변이 대립 유전자를 갖는 폴리뉴클레오티드는 세포 내의 요망되는 EKLF 돌연변이 폴리펩티드의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 특정의 구체예에서, EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 마우스 EKLF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 특정의 구체예에서, 변형된 코돈은 아미노산 위치 74에서 변형을 인코딩한다. 특정의 구체예에서, EKLF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 EKLF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 특정의 구체예에서, 변형된 코돈은 아미노산 위치 54에서의 변형을 코딩한다. 특정의 구체예는 아미노산 위치 54가 마우스내의 위치 74에서의 라이신에서, 인간 내의 위치 54에서의 라이신에서, 또는 상응하는 수모화 부위에서 수모화된다는 것을 고려한다. 특정의 구체예는 인간 EKLF 폴리펩티드가 위치 54에서의 라이신에서 수모화된다는 것을 고려한다. 특정의 구체예에서, 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 74에서의 라이신에 상응하는 수모화 부위는 인간 EKLF 폴리펩티드의 위치 54에서의 라이신이다. 일부 구체예는 아르기닌에 의한 또는 마우스 EKLF 폴리펩티드에서의 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 라이신 74에 대한 변형, 아르기닌에 의한 또는 인간 EKLF 폴리펩티드에서의 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 라이신 54에 대한 변형, 또는 다른 EKLF 폴리펩티드 내의 상응하는 수모화 부위에 대한 변형이 EKLF 폴리펩티드의 수모화를 방지한다는 것을 고려한다. 포유동물에서의 EKLF 폴리펩티드의 수모화 부위의 변형은 포유동물의 장수의 증가, 수명의 증가 및 건강 수명의 증가 뿐만 아니라 포유동물에서의 종양 전이의 감소를 유도한다. 또한, 암성 세포에 대한 EKLF K74R(또는 EKLF K54R) 변형의 역할이 흑색종을 갖는 마우스에서 시험되었다. 놀랍게도, EKLF K74R(또는 EKLF K54R) 대립 유전자는 암성 흑색종 세포가 전이되는 것을 방지하고 수명을 증가시킨다.
특정의 구체예에서, 요망되는 EKLF 돌연변이 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드, 바이러스, 또는 다른 적합한 레플리콘(replicon) 내로 삽입된다. 바람직하게는, 요망되는 EKLF 돌연변이 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은, 골수 세포, 예를 들어, HSC의 고도로 정제된 집단 내로 후속적으로 도입되는, 바이러스의 게놈 내로 통합된다. 본 개시에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스(parvovirus)(예, 아데노-관련된 바이러스), 코르코아바이러스(corcoavirus), 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)(예, 인플루엔자 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus)(예, 홍역 및 센다이(Sendai) 바이러스), 랩토바이러스(rhabdovirus)(예, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스(picornavirus) 및 알파바이러스(alphavirus), 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1 및 2(Herpes Simplex virus types 1 and 2), 엡스타인 바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)) 및 폭스바이러스(poxvirus)(예, 백시니아(vaccinia), 조류 폭스(fowlpox) 및 카나리 폭스(canarypox))을 포함한 이중 가닥 DNA 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 조류 백혈병-육종(avian leucosis-sarcoma), 포유류 C-타입, B-타입 바이러스, D-타입 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(spumavirus)를 포함한다. 다른 예는 쥐 백혈병 바이러스, 쥐 육종 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 개코 원숭이 내재성 바이러스(baboon endogenous virus), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon ape leukemia virus), 매이슨 화이저 원숭이 바이러스(Mason Pfizer monkey virus), 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus), 유인원 육종 바이러스(simian sarcoma virus), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 및 렌티바이러스를 포함한다.
대안적으로, 세포는 군집화되고 규칙적 간격으로 분포된 짧은 회문 반복체(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 및 CRISPR 회합된 단백질(Cas) 시스템의 사용을 통해서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 발현시키도록 형질 도입되며, 여기에서, 적어도 두 개의 벡터는 변형된 Eklf 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산의 유전자좌에서 표적 서열과 세포 내로 혼성화하는 Cas 효소 및 RNA를 각각 수송하기 위해서 사용된다. Cas 효소는 유전자좌 내의 표적 서열과 혼성화되어 발현된 변형된 Eklf 유전자 생성물을 분열시키는 RNA에 의해서 후속적으로 동원된다. 일부 구체예에서, Cas 효소는 타입 II CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구체예에서, 타입 II CRISPR 시스템 효소는 Cas9 효소이다. 일부 구체예에서, Cas9 효소는 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae), 에스. 표게네스(S. pyogenes), 또는 에스. 써모필러스 Cas9(S. thermophilus Cas9)이고, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 동족체 또는 오르소로그(ortholog)일 수 있다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포 내의 발현에 코돈-최적화된다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소는 표적 EKLF 서열의 위치에서 하나 또는 두 개의 가닥의 분열을 유도한다.
패키징 세포주(packaging cell line)는 또한 요망되는 유전자 생성물(예, ELKF K54R 또는 EKLF K74R 폴리펩티드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함한 재조합 바이러스 벡터를 생성시키기 위해서 사용될 수 있다. 패키징 세포주의 사용은 생산된 재조합 비리온의 감염성의 효율 및 범위 둘 모두를 증가시킬 수 있다. 요망되는 유전자 생성물(예, 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 본 EKLF)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 게놈을 포함한 재조합 바이러스 벡터를 생성시키기에 유용한 패키징 세포주는 숙주 세포, 예컨대, 포유류 숙주 세포를 바이러스의 게놈 내로 통합된 요망되는 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산을 갖는 바이러스 벡터와 함께 트랜스펙션시킴으로써 생산된다. 세포주를 생성시키기에 적합한 숙주 세포는 인간(예, 헬라 세포), 소, 돼지, 마우스(예, 배아 줄기 세포), 토끼 및 원숭이(예, COS 1 세포)의 세포를 포함한다. 세포주를 생성시키기에 적합한 숙주 세포는 배아 세포, 골수 줄기세포 또는 다른 선조 세포일 수 있다.
세포를 형질 도입 또는 형질 전환시키기에 적합한 방법의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 감염법, 칼슘 포스페이트 침전법(calcium phosphate precipitation), 전기 천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection), 리포펙션(lipofection) 및 직접 도입(direct uptake)을 포함한다. 그러한 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 요망되는 EKLF 돌연변이 대립 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 게놈을 포함한 재조합 바이러스 벡터로 이루어진 바이러스 스톡(virus stock)은 바이러스 생산에 적합한 조건(예, 적절한 성장 배지에서 적절한 기간 동안) 하에 형질 도입된 세포를 유지시킴으로써 생산된다. 그러한 조건은 본 개시에서 중요하지 않으며 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.
요망되는 핵산 생성물을 인코딩하며, 세포 내의 요망되는 핵산 생성물의 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 서열에 작동적으로 연결되는, 재조합 유전자는 특정의 관심 세포에 유입되는 바이러스의 게놈 내로 통합될 수 있다. 세포는 요망되는 핵산 생성물을 인코딩하는 안정하게 통합된 재조합 유전자를 포함하도록 유전적으로 변경되거나 형질 전환된다. 이어서, 그러한 방식으로 유전적으로 변경되거나 형질 전환되는 세포는 포유동물(예, 수용체)에의 투여 전에 재조합 유전자의 발현에 대해서 시험될 수 있다. 예를 들어, 발현되는 요망되는 유전자 생성물(예, EKLF K54R 또는 EKLF K74R 폴리펩티드)의 양은 표준 방법(예, 웨스턴 분석(Western blot)에 의해서)에 따라서 측정될 수 있다. 이러한 방식으로, 요망되는 핵산 생성물이 포유동물에의 투여 전에 형질 전환된 세포에서 적합한 수준으로 발현되었는지가 시험관내 측정될 수 있다.
적합한 수준으로 요망되는 핵산 생성물을 발현하는 유전적으로 변경된 세포는 수용 대상체 내로 도입 또는 주입되기 전에 특정의 수로 팽창(성장)될 수 있다. 세포를 팽창시키는 방법은 관련 기술분야에서 잘 공지되어 있다.
만능 줄기 세포의 배양에 적합한 어떠한 배양 배지가 본 발명에 따라서 사용될 수 있고, 몇 가지 그러한 배지가 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 만능 줄기 세포의 배양에 적합한 배양 배지는 녹아웃 DMEM, 20% 녹아웃 혈청 대체물, 비필수 아미노산, 2.5% FBS, 글루타맥스(Glutamax), 베타-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 10 ng/㎕ bFGF, 및 항생제를 포함할 수 있다. 사용되는 배지는 또한, 예를 들어, 2.5% FBS가 없는, 또는 더 높거나 더 낮은 %의 녹아웃 혈청 대체물을 갖는, 또는 항생제가 없는 이러한 배지의 변형일 수 있다. 사용되는 배지는 또한 미분화된 조건, 예컨대, mTeSR(STEMCELL Technologies로부터 구입가능), 또는 Nutristem(Stemgent로부터 구입가능), 또는 ES 배지, 또는 본 기술분야에 공지된 어떠한 다른 적합한 배지에서 인간 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 어떠한 다른 적합한 배지일 수 있다. 저온 보호제(cryoprotective agent)와 함께 또는 그것 없이 동결된 조직 샘플에서 성장한 세포의 집단으로부터 만능 줄기 세포를 생성시키거나/얻는 그 밖의 예시적인 방법.
유전자 조작 ESC, iPSC, 및/또는 CSBC는 HSC 및/또는 HSPC를 얻도록 분화될 수 있다. 예를 들어, 다양한 분화 인자의 사용에 의한, 만능 줄기 세포의 유도 분화 또는 자발적 분화를 위한 방법이 본 기술분야에서 공지되어 있다. 만능 줄기 세포의 분화가 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 모니터링될 수 있다. 줄기세포와 분화 인자-처리된 세포 사이의 파라미터에서의 변화는 처리된 세포가 분화되었다는 것을 나타낼 수 있다. 현미경 관찰이 이용되어 분화 동안의 세포의 형태를 직접 모니터링할 수 있다.
일부 예에서, 세포는 Lin, Sca-1, CD7, CD27, CD34, CD38, CD43, CD45RO, CD45RA, CD59, CD90, CD90.1, CD93, CD105, CD109, CD110, CD111, CD117, CD123, CD131, CD133, CD135(Flt3), CD150, CD166, CD173, CD174, CD184, CD202b, CD243, CD271, CD309, CD338, GATA-2, GATA-3, c-myb, Aiolos, TdT, Ikaros, PU.1,HLA DR, 및 MHC 클래스 I로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커에 대해서 양으로 염색하는 인간 HSC이다. 다른 예에서, 세포는 Lin, Sca-1, CD27, CD34, CD38, CD43, CD59, CD90.1, CD117, CD123, CD127, CD135, CD150, GATA-2, GATA-3, TdT, Ikaros, PU.1, Aiolos, c-myb 및 MHC 클래스 I로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커에 대해서 양으로 염색하는 마우스 HSC이다.
본 발명은 놀랍게도 EKLF가 LT-HSC에서 비교적 높은 수준으로 발현되며 EKLF의 고갈이 상이한 유형의 조혈/혈액 세포의 집락 변화를 유도한다는 것을 발견하였다. 더욱이, EKLF가 LT-HSC 및 조혈 선조세포(예컨대, MPP, CMP, GMP, 및 MEP)에서의 집락 자극인자 2 수용체 서브유닛 Csf2rb의 발현을 음으로 조절한다. 그 결과, LT-HSC는 EKLF의 고갈 및 그에 따른 Csf2rb의 증가 시에 증가된 분화 능력을 얻는다. LT-HSC로부터 출발하여 모노-골수성 계통 및 EKLF 전체를 통해서 EKLF-CSF2RB 축에 의한 조혈의 조절은 하류 조혈 선조 세포로의 과분화로부터 LT-HSC를 방지함을 통해서 LT-HSC의 항상성을 일부 유지시킨다. 일 구체예에서, EKLF의 고갈은 LT-HSC에서의 Csf2rb의 발현을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, EKLF의 발현은 조혈모세포/선조세포에서의 Csf2rb의 발현을 감소시킨다. EKLF는 억제자로서 작용하여 과잉의 Csf2rb 발현 및 후속적인 LT-HSC의 분화를 억제한다.
상기 주어진 바와 같이, 본 발명은 EKLF 발현의 고갈이, 예상치 못하게, 장기 조혈모세포(LT-HSC)를 포함하는 상이한 유형의 조혈 세포의 집단을 크게 변화시킴을 나타내고 있다. 흥미로운 상관관계로, EKLF는 LT-HSC에서 뿐만 아니라 다분화능 선조세포(MPP)에서 비교적 높은 수준으로 발현된다. 더욱이, EKLF는 LT-HSC, MPP, GMP, 및 CMP에서의 IL-3, GM-CSF 및 IL-5에 대한 수용체의 공통 서브유닛으로 공지된 집락-자극인자 2 수용체 알파 서브유닛(CSF2RB)의 발현을 억제하는 듯하다. 그 결과, LT-HSC는 EKLF의 고갈 및 그에 따른 Csf2rb의 증가 시에 증가된 분화 능력을 얻는다. 이들 결과는 함께 LT-HSC로부터 출발하여 모노-골수성 계통 전체에 걸친 EKLF-CSF2RB 축에 의한 조혈의 조절을 입증한다.
본 발명의 특정의 구체예에 따르면, 세포는 변형된 Eklf 유전자, 변형된 EKLF 폴리펩티드 및 본원에 기재된 형질도입(또는 트랜스펙션) 방법에 따라 시험관내 유전자 조작된다. 배아 줄기 세포(ESC)는 영장류 종의 구성원의 배반포(blastocyst)로부터 분리될 수 있다. 인간 배아 줄기(hES) 세포는 문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998] 및 문헌[Reubinoff et al, Nature Biotech. 18:399, 2000]에 의해서 기재된 기술을 사용하여 인간 배반포 세포로부터 제조될 수 있다. iPSC는 일반적으로 큰 핵-세포질 비율, 한정된 경계 및 두드러진 핵을 가진 평탄 집락들로서 성장하는 hESC-유사 형태를 갖는다. 또한, iPSC는 일반적으로 알칼리 포스파타제, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, 및 zfp42를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지된 하나 이상의 주요 전분화능(pluripotency) 마커를 발현한다. 예시적인 iPSC는 유전자 Oct-4, Sox-2, c-Myc, 및 Klf가 형질도입된 세포이다. 다른 예시적인 iPSC는 OCT4, SOX2, NANOG, 및 LIN28가 형질도입된 세포이다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 인자들, 예컨대, OCT4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, 및 Lin28로 이루어진 군으로부터 선택된 인자들을 재프로그래밍(reprogramming)하는 다양한 상이한 칵테일(cocktail)이 사용되어 iPSC를 생성시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 제대혈 줄기 세포는 다분화능 세포이며, 태반 및 출산후의 부착된 탯줄에 유지된 제대혈로부터 분리될 수 있는, 상이한 줄기세포로 형성되는 능력을 갖는 것으로 여겨진다.
본 발명의 특정의 구체예에 따르면, 세포는 요망되는 핵산 생성물을 발현하도록 유전적으로 변경되는 동물로부터, 예컨대, EKLF K74R(또는 EKLF K54R) 폴리펩티드를 발현하는 녹-인 (Kin) 마우스로부터 얻어진다. 그러한 구체예에서, 요망되는 EKLF K74R 돌연변이 대립 유전자를 지니고 있는 유전자 이식 Kin 마우스는 Cre-loxP 재조합 시스템의 사용에 의해서, 또는 본 기술분야에서 잘 공지된 어떠한 다른 방법, 예컨대, 부위-유도된 재조합 시스템에 의해서 생성된다. 유전자 이식 동물은 관심의 표현형을 갖는 동물을 선택하기 위해서 스크리닝되고 평가된다. 초기 스크리닝은, 예를 들어, 이식 유전자의 통합이 수행되었는지를 입증하기 위해서 동물 조직을 분석하기 위한 써던 블롯(Southern blot) 분석 또는 PCR 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 유전자 이식 동물의 조직에서의 이식 유전자의 mRNA 발현의 수준은 또한 동물로부터 얻은 조직 샘플의 노턴 블롯(Northern blot) 분석, 동일반응계내 혼성화 분석, 및 역전사효소-PCR(RT-PCR)을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 적합한 조직의 샘플은 이식 유전자에 특이적인 항체를 사용하여 면역 세포 화학적으로 평가될 수 있다. 이식 유전자의 존재를 평가하는 대안적인 또는 추가의 방법은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 적합한 생물학적 분석, 예컨대, 효소 및/또는 면역학적 분석, 특정의 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 및 흐름 혈액 세포계산 분석 등이다. 혈액의 분석이 또한 혈액 내의 이식 유전자 생성물의 존재를 검출하기에 유용할 수 있다.
본 개시의 다른 구체예에 따르면, 세포는 정상의 건강한 공여 포유동물로부터 분리되고, 이어서, 요망되는 핵산 생성물(즉, 인간 EKLF K54R 폴리펩티드)를 발현하도록 유전적으로 변경되며, 이들 유전적으로 변경된 세포가 이어서 팽창되고 수용 포유동물에게 투여된다.
본 개시의 추가의 구체예에 따르면, 세포는 치료를 필요로 하는 포유동물로부터 분리되고, 이어서, 세포가 요망되는 핵산 생성물(즉, EKLF K54R 폴리펩티드)를 발현하도록 유전적으로 변경되고, 팽창되고, 이식에 의해서 동일한 포유동물에게 반송된다.
세포의 이식
바람직하게는, 수용 대상체(예, 인간)에 대한 세포의 이식 방식은 주입 및/또는 볼루스 주사를 포함한 정맥내 또는 주사에 의한 복강내 방식이다. 비경구, 점막, 이식, 근육내, 피내 및 경피와 같은 다른 방식이 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 골수 세포는 포유동물내로의 특정의 투여 방식 및 경로에 적합한 배지, 예컨대, 포스페이트 완충 식염수 중에 투여된다.
본 발명은 놀랍게도, 수용 대상체에의 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 지니고 이를 발현하는 BMMC, HSC 또는 HPSC의 이식 후에, 수용 대상체는 더 긴 수명을 영위할 수 있고, 종양 세포의 성장 및/또는 전이를 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 결과는 EKLF 돌연변이 대립 유전자 유전자 생성물을 발현하도록 조작된 자기 또는 이종 세포의 이식을 통한 전달이 대상체의 수명을 연장하고/거나 암을 치료하기 위한 새로운 방안을 제공할 수 있다는 것을 제안한다.
본 발명에 의해서 억제된 종양 질병은 간암, 결장암, 유방암, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 폐암, 교모세포종(glioblastoma), 뇌 종양, 조혈 악성종양(hematopoietic malignancies), 망막모세포종(retinoblastoma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 두경부암(head and neck cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 식도암(esophageal cancer), 또는 편평세포 암종(squama cell carcinoma) 중 어느 질병일 수 있다. 한 가지 바람직한 예에서, 세포 증식성 질환은 흑색종이다.
추가의 설명 없이도, 본 기술분야의 통상의 기술자는, 앞선 설명 및 이하 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조하고 이용하며 청구된 방법을 실행할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서, 하기 작용 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 특이적으로 지적하고 있으며, 어떠한 방식으로든 본 개시의 나머지를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
재료 및 방법
Eklf-KO 마우스의 생성
C57BL16, 또는 B6, 마우스(Jackson Laboratory)를 연구 전체에 걸쳐서 사용하였다. Eklf 유전자의 이형접합 및 동형접합 녹아웃을 갖는 B6 마우스 라인의 생성을 표준 원안에 따라서, Academia Sinica 소재의 IBM의 Transgenic Core Facility (TCF)에서 수행하였다. 유전자 조작 Eklf 유전자좌를 함유하는 BAC 구성물(더욱 상세한 설명에 대해서는, 도 1a의 범례 참조) 및 E2A-Cre 마우스를 Eklf-KO 마우스의 생성을 위해서 사용하였다.
EKLF (K74R) 녹-인 마우스의 생성
주형으로서 C57B/6J ES 세포로부터의 마우스 게놈 DNA를 사용하여, EKLF 엑손 2의 부분들을 함유하는 단편을 PCR 증폭시키고 표적 벡터를 구성시키기 위해서 사용하였다. 주형 표적 벡터내로 클로닝시키기 전에, 엑손 2에 의해서 인코딩된 코돈 74를 표준 돌연변이 유발 기술을 사용하여 아르기닌(K74R)을 코딩시키기 위해서 돌연변이시켰다. 네오마이신 카세트를 또한 표적 벡터내로 구성시켰으며, 여기에서, PGK-gb2-neo 주형이 E.coli 내에서의 카나마이신 저항의 발현을 위한 원핵 프로모터(gb2)를 포유류 세포 내에서의 네오마이신 저항의 발현을 위한 진핵 프로모터(PGK)와 조합하는 네오마이신/카나마이신 저항 유전자를 인코딩한다. 또한, 변형된 WT DNA를 이의 제거를 용이하게 하기 위해서 'loxP' 부위에 의해서 플랭킹시켰다. 이어서, 표적 구성물을 C57B/6J ES 세포 내로 전기 천공시키고, 네오마이신 저항을 위해서 선택하였다. 적절하게 표적된 ES 클론을 5' 및 3' 써던 블로팅에 의해서 확인하였다. neo 카세트의 제거 및 EKLF K74R을 인코딩하는 변형된 게놈 영역의 구성의 확인 후에, ES 클론을 배아세포 내로 주입시켜 키메라 마우스를 생성시켰다. 녹-인 대립 유전자를 함유하는 이형접합 마우스를 얻기 위해서, 생식선 전이 F1 라인(germline transmitting F1 line)을 전신에서 Cre 재조합효소를 발현하는 EIIa-Cre 마우스와 교배시켰다. 점 돌연변이를 함유하는 하나의 대립 유전자를 지닌 eklf 이형접합체를 상호교잡시켜 동형접합 eklf (K74R) 녹-인 마우스를 달성시켰다.
TaqMan 유전자 발현 분석
RNA를 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 제조하고, 표준 절차에 따라서 oligo-dT 프라이머 및 SuperScript III 역전사효소 (RT)(Invitrogen)를 사용하여 역전사시켰다. 인증된 TaqMan 분석법을 사용한 정량적 PCR(qPCR)을 디폴트 사이클링 조건(40 사이클 동안 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 15초 동안 95℃, 및 1분 동안 60℃) 하에 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 설비에서 수행하였다. 상대적인 (Mm04208330_g1 and Mm00516096_m1; Applied Biosystems) 발현 수준을 cDNA 샘플의 일련의 희석액의 표준 곡선으로부터 측정하였고, 이어서, β-액틴 (Actb:Mm00607939_s1; Applied Biosystems) 또는 Gapdh (Mm99999915_g1; Applied Biosystems) 발현 수준에 대해서 표준화시켰다.
골수 이식(BMT)
마우스의 골수를 CD45.2/EKLF(K74R) 공여 마우스(주령 8-10 주)의 대퇴골, 경골 및 상완골로부터 27G 바늘/주사기 및 19G 바늘/주사기에 의해서 추출하고, 수거하고, 여과기를 통해서 압박하였고, 이어서, 조혈 줄기세포(HSC) 풀(pool)을 Liou 등(2014)에 의해서 기재된 방법에 따라서 분리하였다. 주령 8 내지 10 주의 수용 CD45.1/WT C57BL/6 마우스에 치사 선량(10 Gy) 또는 반-치사 선량(5 Gy)의 X-선을 조사시켰다. 분리된 골수 HSC 혼합물을 조사된 수용 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 각각의 수용 마우스 내의 BMT의 성공을 유세포 분석에 의해서 확인하였다. BMT 후 8 내지 9 주에서, 항-종양발생이 이하 기재된 바와 같은 폐 집락 분석법(lung colony assay)에 의해서 평가하였다.
수명 측정
본 측정은 표준 절차를 따른다. EKLF (K74R) 녹-인 마우스의 수명을 무-특이적-병원균(SPF) 동물 시설에서 추적하였다.
종양발생에 대한 저항성의 분석
쥐 전이성 흑색종 세포, B16-F10 (106 세포/0.2mL)을 EKLF (K74R) Kin 마우스 및 야생형 마우스(그룹당 3 마리 마우스) 각각의 꼬리 정맥내로 정맥내(i.v. 주사)로 주사하여 이들 세포로부터의 종양 형성 및 전이의 가능성을 검사하였다. B16-F10 세포를 시험을 위해서 선택하였는데, 그 이유는 이들이 C57BL/6 마우스로부터 유래되고 C57BL/6 마우스(야생형 및 EKLF (K74R) 녹-인 마우스)와 면역학적으로 상용성이기 때문이다. 2 주 후에, 마우스를 CO2로 질식시켜 치사시키고, 이들의 폐를 추가의 검사를 위해서 제거하였다. 폐의 표면 상의 전이성 결절을 이미지 분석 소프트웨어(Image Inc.)에 의해서 측정하였다. 각각의 마우스의 종양의 수의 측정을 주사 14일 후에 수행하였다. 폐 상의 성공적인 집락 형성을 위한 한 가지 중요한 팁은 적절한 수의 암 세포를 주사를 위해서 사용하는 것이었다. 사람들은 일반적으로 2 내지 3 가지의 상이한 주사를 위한 암세포 투여량을 사용한다. 이어서, 폐 상의 종양 집락을 정량화하였고, 주사 2 내지 6 주 후에 비교하였다.
유세포측정 분석 및 세포 분류
쥐 E14.5 태아 간 세포를 40mm 나일론 세포 여과기(BD Biosciences)를 통해서 여과하여 단일-세포 현탁액을 얻었다. 보충 표 1에 열거된 바와 같이, 상이한 유형의 조혈 세포를 세포 표면 마커에 대한 하기 항체의 상이한 조합을 사용하여 확인하였다: 항-Lin, 항-Sca-1, 항-c-Kit (CD117), 항-CD34, 항-Thy1.1, 항-Flk2, 항-CD16/32, CD11b, 항-CD11c, 항-Ter119, 항- CD42d, 항-CD41, 항-Gr-1, 항-F4/80 및 항-33D1(BD Biosciences and Bioscience). 항체에 의한 면역염색 후에, 세포를 LSRII(BD Biosciences) 및 FlowJo software(Tree Star)에 의해서 분석하거나 FACSAriaII SORP (BD Biosciences)로 분류하였다.
보충 표 1
Figure pct00001
RNA 분석
쥐 E14.5 태아 간으로부터의 전체 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen)로 추출하였다. 정제된 세포의 마이크로-스케일 RNA를 RNAqueous-Micro Kit (Ambion)의 사용에 의해서 분리하였다. 이어서, cDNA를 RT-qPCR 분석에 대한 SuperScript II 역전사효소(RT)(Invitrogen)을 사용하여 합성하였다. cDNA의 정량적 실시간 PCR(qPCR) 분석을 LightCycler® 480 SYBR Green I Master(Roche Life Science)로 수행하였고, 생성물을 Roche LightCycler LC480 Real-Time PCR 계측기에 의해서 검출하였다. qPCR 분석에 사용된 프라이머의 서열을 보충 표 2에 나타낸 바와 같이 홈-설계하였고, 온라인 데이터베이스 프라이머뱅크(online database PrimerBank)(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank)로부터 다운로드하였다.
보충 표 2
Figure pct00002
면역형광 염색 분석
상기 기재된 바와 같은 흐름 분류에 의해서 정제된 LSK (Lin-, Sca-1+ 및 c-Kit+)-CD34--Flk2- LT-HSC를 4-웰 배양 슬라이드(Millipore Millicell EZ SLIDE) 상에 1% 파라포름알데하이드에 현탁시키고 고정하였으며, 0.1% (vol/vol) Triton X-100로 투과시켰고, 마우스 항-마우스-CSF2RB(Gene Tex) 또는 홈-메이드(home-made) 토끼 항-마우스 EKLF(AEK, Shyu et al., 2006)로 염색하였다. 항-마우스 및 항-토끼 이차 항체를 Alexa Fluor 488 및 543의 각각과 컨쥬게이션시켰다. 핵을 염색시키기 위해서 49-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Invitrogen)을 사용하였다. 형광 여기(fluorescence excitation) 및 이미지 발현을 LSM710 및 LSM510를 사용하여 달성시켰다. 이미지 데이터를 Image J 소프트웨어에 의해서 분석하였다.
메틸셀룰로오즈 집락 형성 분석
분석을 Miller 및 Lai(2005)에 의해서 기재된 바와 같이 수행하였다. 마우스 태아 간으로부터의 형광-활성화된 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter: FACS)-정제된 LT-HSC를 줄기세포 배양 배지(Serum-Free Expansion Media, STEMCELL)에서 배양하였다. LT-HSC를 rhEPO(GF M2534, STEMCELL) 없이 rmSCF, rhIL-6, rmIL-3의 첨가에 의해서 리플레이팅(replating)하였고, 형성된 집락의 수를 플레이팅 14일 후에 계수하였다.
통계
양측 스튜던트 t-시험(Microsoft Excel)을 사용하여 유의한 차이를 측정하엿다. p 값 ≤ 0.05가 유의한 것으로 고려되었다.
실시예 1: EKLF의 고갈 시의 조혈 세포의 항상성의 교란
적혈구 대 거대핵세포 계통의 분화가 아닌 조혈계의 항상성에 대한 EKLF의 조절 효과를 검사하기 위해서, 본 발명의 발명자들은 유전자 표적 접근법을 사용한 Eklf 유전자-녹아웃(KO)을 갖는 마우스 모델을 생성시켰다(도 1a). 동형접합 Eklf -/- 마우스는 E14.5 일에 배아 렌탈(lenthal)이었고, 돌연변이 배아는 글로빈 유전자 발현의 결여로 인해서 부분적으로 알비노-유사 표현형을 나타내는 빈혈이었다(도 1b). 이어서, 본 발명의 발명자들은 Eklf+/+ (WT) 및 Eklf-/- 마우스(KO)의 각각으로부터 E14.5 태아 간을 제조하였고, 항체의 상이한 조합물에 의해서 염색시킨 후에 유세포 분석기(flow cytometer)를 사용하여 분류하였다. 앞선 연구로부터 예상되는 바와 같이(Frontelo et al., 2007), EKLF의 부재는 KO 마우스의 E14.5 태아 간에서의 적혈구의 큰 손실 및 거대핵세포의 부수적인 증가를 유도하였다(도 1c).
두드러지게는, 본 발명의 발명자들은, KO E14.5 태아 간에서, MPP, CMP, GMP, MEP, 단핵구, 및 수지상 세포를 포함한 대부분의 유형의 조혈 세포의 수가 WT E14.5 태아 간에 비해서 증가되었음을 발견하였다. 다른 한편으로, CLP 및 과립구가 변화되지 않고 유지되는 반면에, LT-HSC 및 대식세포가 이들의 수에서 감소되었다(도 2 및 표 1).
표 1
Figure pct00003
상기 데이터는 EKLF가 조혈계의 항상성을 전체적으로 조절함을 입증하고 있다. 특히, 인자의 존재가 모노-골수성 계통에서 모든 선조세포를 증가시킬 것이다. 또한, EKLF는 LT-HSC의 항상성을 또한 조절하는 듯하다(아래 참조).
실시예 2: 조혈모세포 및 선조세포에서의 Eklf 및 Csf2rb 의 발현 패턴
조혈에 대한 EKLF의 조절 효과의 분자적 기초를 밝히기 위해서, 본 발명의 발명자들은 우선 LT-HSC 및 상이한 조혈 선조세포에서의 Eklf mRNA의 수준을 분석하고 비교하였다. WT E14.5 태아 간의 mRNA의 RT-qPCR 분석에 의해서 나타낸 바와 같이, MEP에서의 Eklf mRNA 수준은 마우스 적백혈병(MEL) 세포에서의 것과 비견되는 반면에, CMP 및 GMP에서의 것들이 상당히 낮았다(좌측 히스토바 다이아그램(histobar diagram), 도 3a). 이러한 Eklf 발현의 패턴은 성체 마우스 골수로부터 분리된 MEP, CMP, 및 GMP의 분석으로부터 유래된 것과 유사하였다(Frontelo et al., 2007). 그러나, 놀랍게도, E14.5 태아 간의 MPP 뿐만 아니라 LT-HSC에서의 Eklf mRNA의 수준들이 MEP의 것의 대략 50%로 비교적 높았다(좌측 히스토바 다이아그램의 우측 2개의 막대, 도 3a). 예상된 바와 같이, LT-HSC 및 MPP에 대해서 예시된 바와 같이, Eklf mRNA는 KO 마우스의 E14.5 태아 간의 상기 유형의 세포에서 부재하였다(우측 히스토바 다이아그램, 도 3a).
조혈계의 항상성은, 다양한 시토카인 및 신호 전달 경로에 의해서 조절되는, LT-HSC의 자기-재생 및 상이한 조혈 전구체의 이들의 분화 능력에 의한 증식의 균형에 일부 좌우된다(Ghiaur et al., 2013; Kent et al., 2013; Wang et al., 2013). KO 마우스의 E14.5 태아 간에서의 조혈 세포의 집락 변화를 고려하여(도 1), 본 발명의 발명자들은 조혈모세포 및 선조세포의 증식, 자기-재생, 및/또는 유지와 관련된 것으로 공지된 3 가지 유전자, 즉, Csf2rb, Stat1 및 Stat2의 발현의 정량적 RT-qPCR 분석을 수행하였다(Anam and Davis, 2013). 도 3b에 도시된 바와 같이, Stat1 mRNA 및 Stat2 mRNA의 수준이 CMP 및 GMP에서 변화되지 않고 유지되었지만, 이들은 Eklf의 녹아웃 시에 MEP에서 증가되었다. 다른 한편으로, IL-3/IL-5/GM-CSF 수용체의 공통 서브유닛 CSF2RB을 인코딩하는 Csf2rb mRNA의 수준이 이들 세 가지 선조체 뿐만 아니라 MPP에서 실질적으로 증가되었다(도 3b).
본 발명의 발명자들은 LT-HSC에서의 Csf2rb mRNA의 발현 수준을 추가로 분석하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, Csf2rb mRNA가 EKLF의 고갈시에 LT-HSC에서 또한 증가되었다. 형광 공동-면역염색은 CSF2RB 단백질의 수준이 또한 KO 마우스 E14.5 태아 간의 LT-HSC에서 평가되었음을 나타냈다(도 4b). 흥미롭게도, EKLF는 LT-HSC의 시토졸에 주로 존재하였으며(도 4b), 적혈구 선조세포에서 이전에 관찰된 것과 유사한 분포 패턴이었다((Shyu et al., 2014).
실시예 3: EKLF에 의한 LT-HSC의 다계통 분화 결정의 음성 조절
Eklf -/- 마우스의 E14.5 태아 간에서의 LT-HSC 수의 감소를 기초를 추가로 이해하기 위해서, 본 발명의 발명자들은 Miller 및 Lai (2005)에 의해서 기재된 바와 같이 분류된 LT-HSC의 군집 형성 분석을 수행하였다. 예상된 바와 같이, Eklf +/+ 또는 Eklf -/- E14.5 태아 간으로부터의 분류-정제된 LT-HSC가 플레이트 상의 무-시토카인 메틸셀룰로오즈 배지에서 배양되는 때에 형성되는 집락은 없었다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, rhEPO의 부재하에 시토카인/인자 rmSCF, rhIL-6 및 rmIL-3와 인큐베이션되는 때에, 103 WT LT-HSC로부터 대략 150개가 집락을 형성할 것이다(막대그래프의 좌측 막대, 도 4c). 추가로, Eklf -/- E14.5 태아 간으로부터의 LT-HSC는, 집락 수의 2.5배 증가에 의해서 반영되는 바와 같이, 시토카인/인자들에 의한 자극 시에 더욱 강한 분화 능력을 획득하였다(막대그래프의 우측 막대, 도 4c). 도 4c의 데이터는, 정상 조건하에, EKLF가 하류 조혈 선조 세포로의 과분화로부터 LT-HSC를 방지함을 통해서 LT-HSC의 항상성을 일부 유지시킨다는 것을 나타내고 있다.
실시예 4: WT 마우스에 대한 EKLF (K74R) 마우스의 골수의 이식은 WT 마우스에서의 종양 저항성을 부여한다.
EKLF K74R 돌연변이 대립 유전자를 가진 유전자 이식 마우스는 WO 0367272016호에 기재된 절차에 따라서 생성되었다.
이러한 실시예에서, CD45.1/야생형 마우스(수용체)에 CD45.2/EKLF (K74R) 마우스(공여체)의 골수를 이식하였고, 이어서, 각각의 수용 마우스의 종양 저항성을 상기 기재된 바와 같은 종양 집락 분석을 이용하여 평가하였다.
도 5a에 도시된 바와 같이, EKLF (K74R) 마우스로부터의 골수 HSC 세포의 이식 후에, WT 마우스는, 흑색종 세포의 정맥내 주사에 의해서 유도된 폐 병소의 수(약 3배 더 작음)에서의 현저한 감소에 의해서 입증되는 바와 같이, 훨씬 더 종양 저항성이 되었다(도 5b). 데이터는 EKLF K74R 마우스의 종양-저항성 능력이 유전자 조작 조혈/혈액계에 의해서 부여되며 이는 골수 이식에 의해서 다른 마우스에 전달될 수 있음을 나타내고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ACADEMIA SINICA SHEN, CHE-KUN JAMES SHYU, YU-CHIAU HUNG, CHUN-HAO <120> METHODS FOR ENHANCING LIFESPAN AND/OR TREATING CELLULAR PROLIFERATIVE DISORDERS BY TRANSPLANTATION <130> A21893/PC0099 <150> US 62/393,665 <151> 2016-09-13 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer(5'-deletion), synthetic sequence <400> 1 gcggcgcgat aacttcgtat 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer(5'-PGK), synthetic sequence <400> 2 ttgaattctg cttcctgttg ga 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer(EKLF-F), synthetic sequence <400> 3 aggcagaaga gagagaggag gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer(3'-deletion), synthetic sequence <400> 4 cctatttctc caacaggaag ca 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer(PGK-R), synthetic sequence <400> 5 ctggccctca aacaaccctg 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer(3'-PGK), synthetic sequence <400> 6 gttatgcggc cctagtgatt ta 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Eklf Forward sequence, synthetic sequence <400> 7 ggacacccag gaggacttc 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Eklf Reverse sequence, synthetic sequence <400> 8 gggtcctccg atttcagact ca 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Actin Forward sequence, synthetic sequence <400> 9 atggagggga atacagccc 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Actin Reverse sequence, synthetic sequence <400> 10 ttctttgcag ctccttcgt 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Csf2rb Forward sequence, synthetic sequence <400> 11 acagagaacc tagatcgagc c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Csf2rb Reverse sequence, synthetic sequence <400> 12 gtgtactctt cgctccactt g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Stat1 Forward sequence, synthetic sequence <400> 13 ctgaatattt ccctcctggg 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Stat1 Reverse sequence, synthetic sequence <400> 14 tcccgtacag atgtccatga t 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Stat2 Forward sequence, synthetic sequence <400> 15 gctgtcaagg ttctgcaaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Stat2 Reverse sequence, synthetic sequence <400> 16 cgcttggaga attggaagtt 20

Claims (26)

  1. 대상체의 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제하거나 감소시키기 위한 방법으로서, (a) 야생형 적혈구 Kruppel-유사 인자(EKLF) 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 적혈구 Kruppel-유사 인자(Eklf)를 보유하도록 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 세포(iPSC) 및/또는 제대혈 줄기 세포(CBSC)를 유전적으로 조작하고; (b) 조혈모세포(HSC) 및/또는 조혈모 및 선조 세포(HSPC)를 얻기 위해서 유전자 조작 ESC, iPSC, 및/또는 CSBC를 분화시키고; (c) HSC 및/또는 HSPC를 대상체에 이식함을 포함하고; 이식된 HSC 및/또는 HSPC가 대상체에 건강 장수 및/또는 종양 저항성 또는 전이 저항성을 부여하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    야생형 EKLF 폴리펩티드가 야생형 인간 EKLF 또는 야생형 마우스 EKLF 또는 다른 척추동물의 야생형 EKLF인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    변형된 마우스 EKLF 폴리펩티드가 아르기닌(R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 야생형 마우스 EKLF의 위치 74에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    변형된 인간 EKLF 폴리펩티드가 아르기닌(R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 야생형 인간 EKLF의 위치 54에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    변형된 EKLF 폴리펩티드가 아르기닌(R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 마우스 EKLF K74 및 인간 EKLF K54에 병렬 상동인 수모화가능한 부위(sumolyatable site)에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함하고, 척추동물이 마우스 또는 인간이 아닌 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 변형이 전장 야생형 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 68에 상응하는 아미노산의 변형을 포함하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    세포가 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 바이러스 벡터의 사용을 통해서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 발현하도록 형질 도입되는 방법.
  8. 청구항 6에 있어서,
    바이러스 벡터가 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 약독화된 백시니아 바이러스, 카나리 폭스 바이러스(canary pox virus), 아데노바이러스(adenovirus), 또는 아데노-관련된 바이러스(adeno-associated virus)로부터 유래되는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    세포가 군집화되고 규칙적 간격으로 분포된 짧은 회문 반복체(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 및 CRISPR 회합된 단백질(Cas) 시스템의 사용을 통해서 변형된 EKLF 폴리펩티드를 발현시키도록 형질 도입되는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    변형된 EKLF 폴리펩티드의 발현이 향상된 수명, 항-전이, 및/또는 항-종양발생을 유도하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    EKLF가 LT-HSC에서 비교적 높은 수준으로 발현되고, EKLF의 고갈이 상이한 유형의 조혈/혈액 세포의 집단 변화를 유도하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    EKLF가 LT-HSC 및 조혈 선조세포(예컨대, MPP, CMP, GMP, 및 MEP)에서의 집락 자극인자 2 수용체 서브유닛 Csf2rb의 발현을 음으로 조절하는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    종양이 간암, 결장암, 유방암, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 폐암, 교모세포종(glioblastoma), 뇌 종양, 조혈 악성종양(hematopoietic malignancies), 망막모세포종(retinoblastoma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 두경부암(head and neck cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 식도암(esophageal cancer), 또는 편평세포 암종(squama cell carcinoma)이고, 한 가지 바람직한 예로, 세포 증식성 질환이 흑색종인 방법.
  14. 수용 대상체의 수명을 증가시키고/거나 종양 발생 또는 종양 전이를 억제 또는 감소시키기 위한 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 EKLF 유전자를 포함하는 공여 대상체로부터 골수를 수집하고; (b) 하나 이상의 변형된 eklf 유전자를 갖는 HSC 및/또는 HSPC HSC 및/또는 HSPC를 포함하는 골수 단핵 세포(BMMNC)를 분리하고; (c) BMMNC를 수용 대상체에 이식하여, 수용 이식체에게 종양 저항성 및/또는 건강 장수를 부여하는, 방법
  15. 청구항 14에 있어서,
    야생형 EKLF 폴리펩티드가 야생형 인간 EKLF 또는 야생형 마우스 EKLF 또는 다른 척추동물의 야생형 EKLF인 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    변형된 마우스 EKLF 폴리펩티드가 아르기닌(R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 야생형 마우스 EKLF의 위치 74에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함하는 방법.
  17. 청구항 14에 있어서,
    변형된 인간 EKLF 폴리펩티드가 아르기닌(R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 야생형 인간 EKLF의 위치 54에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함하는 방법.
  18. 청구항 14에 있어서,
    변형된 EKLF 폴리펩티드가 아르기닌(R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 마우스 EKLF K74 및 인간 EKLF K54에 병렬 상동인 수모화가능한 부위(sumolyatable site)에 상응하는 라이신(K) 잔기의 치환을 포함하고, 척추동물이 마우스 또는 인간이 아닌 방법.
  19. 청구항 14에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 변형이 전장 야생형 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 68에 상응하는 아미노산의 변형을 포함하는 방법.
  20. 청구항 14에 있어서,
    EKLF가 LT-HSC에서 비교적 높은 수준으로 발현되고, EKLF의 고갈이 상이한 유형의 조혈/혈액 세포의 집단 변화를 유도하는 방법.
  21. 청구항 14에 있어서,
    EKLF가 LT-HSC 및 조혈 선조세포(예컨대, MPP, CMP, GMP, 및 MEP)에서의 집락 자극인자 2 수용체 서브유닛 Csf2rb의 발현을 음으로 조절하는 방법.
  22. 청구항 14에 있어서,
    세포가 변형된 EKLF 폴리펩티드를 발현시키도록 유전적으로 변경되는 동물로부터 얻어지는 방법.
  23. 청구항 14에 있어서,
    종양이 간암, 결장암, 유방암, 전립선암, 간세포 암종, 흑색종, 폐암, 교모세포종(glioblastoma), 뇌 종양, 조혈 악성종양(hematopoietic malignancies), 망막모세포종(retinoblastoma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 두경부암(head and neck cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 식도암(esophageal cancer), 또는 편평세포 암종(squama cell carcinoma)이고, 한 가지 바람직한 예로, 세포 증식성 질환이 흑색종인 방법.
  24. 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는, EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자에 의해서 조작된 세포로서,
    세포가 ESC, iPSC, CBSC, HSC, HSPC 또는 BMMNC이고, 하나 이상의 아미노산 변형이 전장 야생형 인간 EKLF의 위치 54 또는 전장 야생형 마우스 EKLF 폴리펩티드의 위치 74에 상응하는 아미노산의 변형을 포함하고, 위치 54 또는 74에 상응하는 아미노산의 변형이 Arg (K54R 또는 K74R) 또는 종양 저항성 및 건강 장수를 부여하는 또 다른 아미노산에 의한 Lys의 치환이고, 척추동물이 마우스 또는 인간이 아닌, 세포.
  25. 하나 이상의 변형된 EKLF 유전자를 지니며 이를 발현하는 HSC 및/또는 HSPC를 얻는 시험관내 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 EKLF 유전자를 보유하도록 ESC, iPSC 및/또는 CBSC를 유전적으로 조작하고; (b) 하나 이상의 변형된 EKLF 유전자를 지니며 이를 발현하는 HSC 및/또는 HSPC를 얻기 위해서 유전자 조작 ESC, iPSC, 및/또는 CSBC를 분화시킴을 포함하고, HSC 및/또는 HSPC가 건강 장수 및/또는 종양 저항성 또는 전이 저항성을 부여하는, 시험관내 방법.
  26. 종양 저항성 및 건강 장수 특성을 갖는 하나 이상의 변형된 적혈구 Kruppel-유사 인자(eklf) 유전자를 발현시키는 HSC 및/또는 HSPC를 얻기 위한 시험관내 방법으로서, (a) 야생형 EKLF 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EKLF 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 변형된 EKLF 유전자를 보유하도록 골수 단핵 세포(BMMNC)를 유전적으로 조작하고; (b) 하나 이상의 변형된 EKLF 유전자를 지니는 HSC 및/또는 HSPC를 분리함을 포함하는, 시험관내 방법.
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