CN114269363A - 用于hiv疫苗应用的复制缺陷型腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明包括产生黑猩猩来源的腺病毒血清型AdC6或AdC7载体疫苗的组合物和方法，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含含有与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子序列的表达盒，其中异源蛋白质为选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质，其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝，和其中Gag来自中国HIV进化枝B。此外，本发明涵盖为哺乳动物接种疫苗的药物组合物以及蛋白质表达系统。

Description

用于HIV疫苗应用的复制缺陷型腺病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年4月17日提交的美国临时申请专利号62/835,108的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
背景技术
HIV感染在世界范围内很普遍，促使人们寻求开发有效的疫苗来治疗或预防HIV感染。中国和亚洲的情况也是如此。接种疫苗被广泛认为是预防或改善传染病的发病率的最有效方法。病毒载体疫苗，诸如基于腺病毒载体的疫苗，可用于抵抗各种传染性和恶性疾病(Small and Ertl,Curr Opin Virol.2011,October 1；1(4)：241–245)。
本领域需要生产用于治疗或预防HIV感染的更有效的腺病毒载体疫苗系统的方法。中国和亚洲其他国家的需求尤为迫切。本发明满足了这一需求。
发明内容
提供了包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含表达盒，表达盒包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；
其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和
其中Gag来自中国HIV进化枝B。
在一些实施方式中，表达盒位于早期基因E1基因组区中。在一些实施方式中，表达盒包含嵌合内含子和/或CMV增强子。在一些实施方式中，由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。在进一步实施方式中，整个早期基因E3基因组区被缺失。
在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在进一步实施方式中，启动子是巨细胞病毒即时早期启动子(CMV)。
在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
提供了包含前述实施方式中任一项的组合物的蛋白质表达系统，其中核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
还提供了包含前述实施方式中任一项的组合物的蛋白质表达系统，其中表达盒编码的异源蛋白质包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
提供了包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含含有与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的组成型启动子的表达盒，其中表达盒位于早期基因E1基因组中，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；
其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和
其中Gag来自中国HIV进化枝B。
在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
提供了包含前述实施方式中任一项的组合物的蛋白质表达系统，其中表达盒编码的异源蛋白质包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
提供了引发哺乳动物中针对异源蛋白质的免疫应答的方法，方法包括向哺乳动物施用包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含含有与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子的表达盒，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；
其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和
其中Gag来自中国HIV进化枝B。
在一些实施方式中，表达盒位于早期基因E1区中。在一些实施方式中，表达盒包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
在一些实施方式中，由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。在进一步实施方式中，整个早期基因E3基因组区被缺失。
在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在进一步实施方式中，启动子是巨细胞病毒即时早期启动子(CMV)。
在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
提供了治疗和/或预防哺乳动物中HIV的方法，方法包括施用治疗有效量的由包含SEQ ID NO:6或7的核酸序列编码的组合物。
还提供了针对HIV感染为哺乳动物接种疫苗的方法，方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的前述实施方式中任一项的组合物，其中组合物的施用引发哺乳动物的免疫应答。在一些实施方式中，为哺乳动物预防性施用组合物。在进一步实施方式中，为哺乳动动物治疗性施用组合物。在仍进一步实施方式中，组合物与佐剂组合施用。
提供了产生对哺乳动物中异源蛋白质的效应和记忆T细胞免疫应答的方法，方法包括以下步骤：(a)以有效引发哺乳动物中免疫应答的量向哺乳动物施用前述实施方式中任一项的组合物；(b)在第二随后的时间段施用第二有效量的前述实施方式中任一项的组合物，其中针对异源蛋白质的T记忆细胞在哺乳动物中被重新活化。在一些实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物包括选自gp140和Gag的相同或不同的HIV异源蛋白质。在进一步实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物是选自AdC6和AdC7的相同或不同血清型。在仍进一步实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物拥有相同或不同的HIV进化枝。
在一些实施方式中，方法进一步包括向哺乳动物施用免疫原的步骤。在一些实施方式中，免疫原包含异源蛋白质，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和其中Gag来自中国HIV进化枝B，其中B细胞免疫应答被进一步扩大。
提供了产生对哺乳动物中异源蛋白质的适应性B细胞免疫应答的方法，方法包括以下步骤：(a)以有效引发哺乳动物中免疫应答的量向哺乳动物施用前述实施方式中任一项的组合物；(b)在第二随后的时间段施用第二有效量的前述实施方式中任一项的组合物，其中针对异源蛋白质的B记忆细胞在哺乳动物中被重新活化。在一些实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物包括选自gp140和Gag的相同或不同的HIV异源蛋白质。在进一步实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物是选自AdC6和AdC7的相同或不同血清型。在仍进一步实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物拥有相同或不同的HIV进化枝。
在一些实施方式中，方法进一步包括向哺乳动物施用免疫原的步骤。在一些实施方式中，免疫原包含异源蛋白质，其中异源蛋白质是选自任意来源的任何进化枝的至少一种HIV env蛋白质，其中B细胞免疫应答被进一步扩大。
在一些实施方式中，哺乳动物是人。
可以组合方面或实施方式的任意和全部特征以实现新的实施方式。
附图说明
出于说明发明的目的，在附图中描绘了发明的某些实施方式。然而，发明不限于附图中描绘的实施方式的精确布置和工具。
图1A是图解来自应答于gag肽释放细胞因子的血液的所有CD8+CD44+细胞中CD8+CD44+细胞的百分比的一系列图表。没有gag肽的背景应答被减去。线表示平均应答±SD。上方具有星号的线指示显著性差异(p<0.01)。图1B是图解来自14天前用AdC6gag或AdC7gag载体的1011个病毒颗粒(vp)免疫的小鼠的汇集血液的所有CD8+CD44+细胞中CD8+CD44+细胞的百分比的一系列图表，AdC6gag或AdC7gag载体应答于携带gag的优势免疫表位的肽产生细胞因子。没有gag肽的背景应答被减去。
图2是图解来自用AdC6gag或AdC7gag载体的1011个病毒颗粒(vp)免疫18天后个体小鼠的脾脏的测试的所有CD8+CD44+细胞中特异性CD8+CD44+细胞的百分比的一系列图表，AdC6gag或AdC7gag载体应答于gag肽产生指示的细胞因子。和反映基于布尔门控(Booleangating)计算的总应答。没有gag肽的背景应答被减去。
图3A-3B是显示来自用AdC6gag载体的1010或109vp免疫14天后汇集血液的测试的T细胞应答的一系列图表。图表布局与图1的成镜像。图3A显示CD8+T细胞应答，图3B显示CD4+T细胞应答。
图4显示了在涂覆有进化枝C、AE或BC的gp140蛋白质的平板上用所指示载体的1011vp初免后收集和测试的血清样品获得的ELISA结果。圆圈–用AdC6载体免疫的小鼠。方块–用AdC7载体免疫的小鼠。利用来自幼稚小鼠的血清获得的值被减去。线显示了中位数。nt–未测试。
图5显示了在涂覆有进化枝C、AE或BC的gp140蛋白质的平板上用指示载体的1011vp初免然后用表达相同插入物的异源载体的109vp加强(boost)后收集和测试的血清样品获得的ELISA结果。圆圈–用AdC6和AdC7载体免疫的小鼠。方块–用AdC7载体免疫然后用AdC6载体加强的小鼠。利用来自幼稚小鼠的血清获得的值被减去。线显示了中位数。nt–未测试。
图6显示了在涂覆有进化枝C、AE或BC的gp140蛋白质的平板上用AdC6载体的1011vp初免然后用表达相同插入物的AdC7载体的109vp加强并随后用明矾中进化枝C蛋白第二加强后收集和测试的血清样品获得的ELISA结果。利用来自幼稚小鼠的血清获得的值被减去。线显示了中位数。
图7显示了在涂覆有进化枝C、AE或BC的gp140蛋白质的平板上用AdC6载体的1011vp初免(圆圈)和之后用表达相同插入物的AdC7载体的109vp加强(方块)后收集和测试的血清样品获得的ELISA结果。利用来自幼稚小鼠的血清获得的值被减去。线显示了中位数。这些数据类似于图4和5中的数据，但是对2个时间点的试验同时进行以允许直接比较。
图8显示了用在涂覆有进化枝C、AE或BC的gp140蛋白质的平板上用AdC7载体的1011vp初免(圆圈)和之后用表达相同插入物的AdC6载体的109vp加强(方块)后收集和测试的血清样品获得的ELISA结果。利用来自幼稚小鼠的血清获得的值被减去。线显示了中位数。这些数据类似于图4和5中的数据，但是对2个时间点的试验同时进行以允许直接比较。
图9显示了在涂覆有进化枝C、AE或BC的gp140蛋白质的平板上用AdC6载体的1011vp初免(圆圈)然后用表达相同插入物的AdC7载体的109vp加强(方块)并随后用明矾中进化枝C蛋白质第二加强后收集和测试的血清样品获得的ELISA结果。利用来自幼稚小鼠的血清获得的值被减去。线显示了中位数。上方具有星号的线指示通过2向方差分析的显著性差异。这些数据类似于图5和6中的数据，但是对2个时间点的试验同时进行以允许直接比较。
图10显示了图6-8中所示数据的组合。
图11显示了根据用于针对测试的三种不同进化枝(C、AE和BC)进行免疫的插入物相关联的来自单个小鼠组的不同血清的吸收值。图显示了r-值。显著值通过柱上方的星号指示。
图12显示了在用汇集血液测试的AdC6gag或AdC7gag载体初免后2周(左)和使用来自个体小鼠的PBMC测试2周后的异源载体加强后的gag-特异性CD8+T细胞的频率。使用来自幼稚小鼠的PBMC作为实验的对照。结果显示了基于布尔门控计算的所有细胞因子(IFN-γ、IL-2、粒酶B和TNF-α)的和。
图13显示了在用AdC6gag初免2周后(左)和在用AdC7gag载体加强4周后gag-特异性CD8+T细胞的频率。结果显示了基于布尔门控计算的所有细胞因子(IFN-γ、IL-2、粒酶B和TNF-α)的和。
图14显示了用不同AdC6gp140载体的混合物(每种以109或1010vp给予)初免BALB/c小鼠，随后6周后用以相同剂量给予AdC7gp140载体加强，随后6周用进化枝C env蛋白加强后，针对进化枝C env作为吸附量的抗体应答。使用来自幼稚BALB/c小鼠的血清作为实验的对照。
图15显示了用不同AdC6gp140或AdC7gp140载体的混合物(每种以1010vp给予)初免ICR小鼠，随后8周后用以相同剂量给予异源载体加强后，针对进化枝C、AE和BC env作为吸附量的抗体应答。使用来自幼稚ICR小鼠的血清作为实验的对照。
具体实施方式
本发明涉及用于产生黑猩猩来源的腺病毒载体的组合物和方法，黑猩猩来源的腺病毒载体包括核酸序列和启动子序列，核酸序列包括在一些腺病毒早期基因中的缺失(即，其中早期基因E1区被缺失，和其中在一些实施方式中，来自早期基因E3的ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7或整个E3基因也被缺失)，启动子序列与编码异源蛋白质的序列连接，在某些实施方式中，异源蛋白质包含选自gp140和Gag的HIV蛋白质；其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和其中Gag来自中国HIV进化枝B。另外，本发明包括治疗和/或预防或免疫具体疾病或障碍的组合物和方法，以及在施用本发明的黑猩猩来源的腺病毒载体的哺乳动物中诱导效应和记忆T细胞和B细胞免疫应答的方法。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于测试本发明的实践中，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并不旨在是限制性的。
如本文所使用，冠词“一(a,an)”用于指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一要素”意思是一个要素或多于一个要素。
如本文所使用的术语“抗体”或“Ab”是指衍生自免疫球蛋白质分子的蛋白质或多肽序列，其特异性结合抗原上的特定表位。抗体可以是衍生自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白质，并且可以是完整免疫球蛋白质的免疫反应性部分。在本发明中使用的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv，Fab和F(ab)2，以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow et al.,1998,UsingAntibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlowet al.,1989,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。抗体可以衍生自天然来源或来自重组来源。抗体通常是免疫球蛋白质分子的四聚体。
术语“改善(ameliorating)”或“治疗”是指由于所进行的动作而减轻了与疾病相关的临床体征和/或症状。待监测的体征或症状对于熟练的临床医生来说是熟知的。
如本文所使用，当提及可测量值比如量、时间持续长度等时，术语“约”是指包括从规定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选±1％，和仍更优选地±0.1％的变化，由此这些变化适合于进行所公开的方法。
术语“生物”或“生物样品”是指从生物体或从生物体的组分(例如细胞)获得的样品。样品可以是任何生物组织或流体。通常地，样品将是“临床样品”，其为源自患者的样品。这样的样品包括但不限于骨髓、心脏组织、痰液、血液、淋巴液、血细胞(例如白细胞)、组织或细针活检样品、尿液、腹膜液和胸膜液、或来自其的细胞。生物样品还可以包括组织切片，例如用于组织学目的获取的冷冻切片。
如本文所使用，“更大”是指高于对照至少10％或更多，例如高于对照20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多，和/或高于对照1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更多，以及其间的任何和所有全增量和部分增量的表达水平。
如本文所使用，术语“对照”或“参照”可以互换地使用，并且指用作比较标准的值。
如本文所使用的术语“免疫原性”是指当将抗原或生物体施用到动物时，抗原或生物体引发动物中的免疫应答的先天能力。因此，“加强免疫原性”是指当将抗原或生物体施用到动物时，增加抗原或生物体引发动物中的免疫应答的能力。抗原或生物体引发免疫应答的增加的能力可以通过以下衡量：结合至抗原或生物体的更多数量的抗体、抗原或生物体的抗体的更大的多样性、对抗原或生物体特异性的更多数量的T细胞、对抗原或生物体的更大的细胞毒性或辅助T细胞应答、响应于抗原的细胞因子的更高表达等。
如本文所使用，术语“引发免疫应答”或“免疫”是指针对异源蛋白质产生B细胞和/或T细胞应答的过程。
如本文所使用，术语“活化”是指在充分的细胞表面部分连接后诱导显著的生化或形态变化的细胞状态。在T细胞的背景下，这种活化是指已被充分刺激以诱导细胞增殖的T细胞的状态。T细胞的活化还可以诱导细胞因子产生和进行调节效应子或细胞溶解效应子功能。在其他细胞的背景下，该术语推断具体物理化学过程的上调或下调。
术语“活化的T细胞”是指目前正在经历细胞分裂、细胞因子产生、进行调节效应子或细胞溶解效应子功能和/或最近经历“活化”过程的T细胞。
如本文所使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。该免疫应答可包括抗体产生或特异性免疫感受态细胞的活化，或两者。技术人员将理解，包括几乎所有的蛋白质或肽在内的任何大分子都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。因此，技术人员将理解，任何DNA——其包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列——编码“抗原”，该术语如在本文所使用的。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要唯一地由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于多于一种基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以源自生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
本文使用的“异源抗原”是指对包括或表达抗原的生物体非内源的抗原。作为实例，包含或表达病毒或肿瘤抗原的病毒疫苗载体包括异源抗原。本文所使用的术语“异源蛋白质”是指在受试者(即哺乳动物)中引起有益的免疫应答的蛋白质，不论其来源如何。
本文所使用的术语“人体免疫缺陷病毒”或“HIV”是指本领域已知的或迄今未知的任何HIV毒株或变体，其包括但不限于HIV-1和HIV-2。在本文公开的某些实施方式中示例了HIV-1。
术语“特异性结合”、“选择性结合”或“结合特异性”是指本发明的人源化抗体或结合化合物以比当结合至非靶标表位时产生的亲和力更高的亲和力结合至靶标表位的能力。在某些实施方式中，特异性结合是指以高于非靶标表位的亲和力至少10、50、100、250、500或1000倍的亲和力结合至靶标。
如本文所使用，“组合疗法”是指第一药剂与另一种药剂联合施用。“与……组合”或“与……结合”是指施用除了另一种治疗方式之外的一种治疗方式。因此，“与……组合”是指在向个体递送其他治疗方式之前、期间或之后施用一种治疗方式。这种组合被认为是单一治疗方式或方案的一部分。
“体液免疫”或“体液免疫应答”二者均指B细胞介导的免疫，并由B淋巴细胞(B细胞)产生和分泌的高度特异性抗体介导。
“预防”是指药物组合物用于针对紊乱接种疫苗的用途。
“佐剂”是指能够加强抗原的免疫原性的物质。佐剂可以是一种物质或多种物质的混合物，并通过直接作用于免疫系统或通过提供抗原的缓慢释放起作用。佐剂的实例是铝盐、聚阴离子、细菌糖肽和作为弗氏不完全佐剂的缓释剂。
“递送载体(Delivery vehicle)”是指有助于将抗原靶向特定细胞并促进抗原被免疫系统有效识别的组合物。最公知的递送载体是脂质体、病毒体、包括微球和纳米球在内的微粒、复合神经节、菌影、细菌多糖、减毒细菌、病毒样颗粒、减毒病毒和ISCOMS。。
如本文所使用，术语“表达盒”意思是能够引导异源编码序列转录和/或翻译的核酸序列。在一些实施方式中，表达盒包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子序列。在一些实施方式中，表达盒进一步包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的至少一个调节序列。
“并入……中”或“包封在……中”是指抗原肽在递送载体，比如微粒、菌影、减毒细菌、病毒样颗粒、减毒病毒、ISCOM、脂质体和优选的病毒体内。
如本文所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换地使用，并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用，该术语是指短链和较长的链，短链在本领域中通常也被称为肽、寡肽和寡聚体，较长的链在本领域中通常被称为具有多种类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白质等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所使用的“融合蛋白质”是指如此蛋白质，其中该蛋白质包括通过肽键或其他化学键连接在一起的两个或更多个蛋白质。蛋白质可以通过肽键或其他化学键直接连接在一起，或者在两个或更多个蛋白质之间具有一个或多个氨基酸，该一个或多个氨基酸在本文中被称为间隔区。
在本发明的上下文中，使用常见的核酸碱基的下列缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。
如本文所使用的术语“RNA”被定义为核糖核酸。
“转化(transform,transforming,transformation)”在本文中用于指将分离的核酸引入生物体内部的过程。
在本发明的上下文中使用的术语“治疗(treatment)”意思是指包括疾病或紊乱的治疗性治疗以及预防或抑制措施。如本文所使用，术语“治疗(treatment)”和相关术语比如“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指病情或其至少一种症状的进展、严重性和/或持续时间的降低。因此，术语“治疗(treatment)”是指可使受试者受益的任何方案。治疗可以是针对现有病症，或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以包括治愈、缓解或预防效果。本文提及的“治疗性”和“预防性”治疗应在其最广泛的背景下考虑。术语“治疗性”并不必然意味着治疗受试者直至完全康复。类似地，“预防性”并不必然意味着受试者最终不会感染病情。因此，例如，术语治疗包括在疾病或紊乱发作之前或之后施用药剂，从而预防或消除疾病或紊乱的所有症候。作为另一个例子，在疾病的临床表现之后施用药剂以对抗疾病的症状构成疾病的“治疗”。
当术语“等价的”关于核苷酸序列使用时，应理解为是指编码功能上等同的多肽的核苷酸序列。等价核苷酸序列将包括通过一个或多个核苷酸取代、添加或缺失区别的序列，比如等位基因变体；并且因此由于遗传密码的简并性，将包括与本文所述核酸的核苷酸序列不同的序列。
如本文中关于核酸比如DNA或RNA使用的术语“分离的”是指分别与存在于大分子的天然来源中的其他DNA或RNA分离的分子。如本文所使用，术语分离还指如此核酸或肽，当其通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”是指包括核酸片段，其不会作为片段天然出现并且不会以天然状态被发现。术语“分离的”在本文中也用于指多肽，其与其他细胞蛋白质分离并且意思是包括纯化多肽和重组多肽二者。“分离的细胞”或“分离的细胞群”是在其天然环境中不存在的细胞或细胞群。
如本文使用的“突变”是导致由其天然状态改变的DNA序列的变化。突变可以包括至少一个脱氧核糖核酸碱基比如嘌呤(腺嘌呤和/或胸腺嘧啶)和/或嘧啶(鸟嘌呤和/或胞嘧啶)的缺失和/或插入和/或复制和/或取代。突变可能会或可能不会产生在生物体的可观察特征(表型)中的可辨别的变化。
如本文所使用，术语“核酸”是指多核苷酸，比如脱氧核糖核酸(DNA)，和在合适的情况下指核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物作为等价物，并且如适用于描述的实施方式，包括单链多核苷酸(有义或反义)和双链多核苷酸。EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA是可以被称为核酸的分子的代表性实例。
如本文所使用，“可操作地连接的”序列包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列和反式或在一定距离处起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，比如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；加强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，加强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列——包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子——在本领域是已知的并且可用于本发明的组合物中。除了DNA表达和控制序列之外，“可操作地连接”还应该被解释为包括RNA表达和控制序列。
本文所使用的术语“启动子”被定义为由细胞合成机器或引入的合成机器识别的启动多核苷酸序列特异性转录所需的DNA序列。
如本文所使用，术语“启动子/调节序列”意思指对于表达可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，和在其他情况下，该序列还可以包括对于表达基因产物所需的增强子序列和其他调节元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的一种启动子/调节序列。
“组成型”启动子是核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下，该核苷酸序列引起基因产物在细胞中产生。
“诱导型”启动子是核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，该核苷酸序列引起基因产物在细胞中产生。
如本文所使用，术语“药物组合物”是指本发明中有用的至少一种化合物与其他化学组分的混合物，所述化学组分比如运载体、稳定剂、稀释剂、佐剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。药物组合物有助于将化合物施用到生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，其包括但不限于：静脉内、口服、气溶胶、肠胃外、眼内、肺部和外用施用。
语言“药学上可接受的运载体”包括药学上可接受的盐、药学上可接受的材料、组合物或运载体，比如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与在受试者内或向受试者运送或运输本发明的化合物(一种或多种)，使得它可以执行其期望的功能。通常地，这类化合物从一个器官或身体的一部分运送或运输到另一个器官或身体的一部分。在与制剂的其他成分相容的意义上，每种盐或运载体必须是“可接受的”，并且对受试者是无害的。可用作药学上可接受的运载体的材料的一些实例包括：糖，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，比如，可可脂和栓剂蜡；油，比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，比如丙二醇；多元醇，比如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液(Ringer’s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；稀释剂；成粒剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；润湿剂；乳化剂；着色剂；脱模剂；涂层剂；甜味剂；调味剂；加香剂；防腐剂；抗氧化剂；增塑剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；沉降剂；悬浮剂；表面活性剂；保湿剂；运载体；稳定剂；和药物制剂中使用的其他无毒相容物质，或其任何组合。如本文所使用，“药学上可接受的运载体”还包括与化合物的活性相容的并且对于受试者是生理学上可接受的任何和所有包衣、抗细菌剂和抗真菌剂，以及吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以并入组合物中。
如本文所使用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指从本发明的载体产生的病毒样颗粒的量，其是对于预防具体病情所需的，或者降低病情或其至少一种症状或与其相关的病症的严重性和/或改善病情或其至少一种症状或与其相关的病症。
如本文使用的“受试者”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，比如绵羊、牛科、猪科、犬科、猫科和鼠科哺乳动物。优选地，受试者是人。
“效价”是与参考样品相比的病毒或病毒载体浓度的数值量度，其中浓度通过病毒的活性或通过测量单位体积的缓冲溶液中的病毒数量来确定。例如，通过使用软琼脂方法测量病毒的溶液(一种或多种)(通常是连续稀释)对例如HeLa细胞的感染性(参见，Graham&van der Eb(1973)Virology 52：456-467)，或通过监测赋予细胞的抗性，例如由病毒或载体编码的G418抗性，或通过UV分光光度法定量病毒(参见Chardonnet&Dales(1970)Virology 40：462-477)来确定病毒原液的效价。
“载体”是包括分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。本领域已知许多载体，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。在本公开内容中，术语“载体”包括自主复制的病毒。
范围：贯穿本公开内容，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本发明范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已明确地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围比如从1至6的描述应当被认为明确公开了子范围，比如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论该范围的广度如何，这都适用。
描述
提供了包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含表达盒，表达盒包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和其中Gag来自中国HIV进化枝B。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的至少一个调节序列。
在一些实施方式中，表达盒位于早期基因E1基因组区中。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
在一些实施方式中，由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。
在一些实施方式中，整个早期基因E3基因组区被缺失。
在进一步实施方式中，启动子是组成型启动子。在仍进一步实施方式中，启动子是巨细胞病毒即时早期启动子(CMV)。
在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。在一些实施方式中，核酸序列由SEQ ID NO:6或7组成。
提供了包含前述实施方式中任一项的组合物的蛋白质表达系统，其中核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。还提供了包含前述实施方式中任一项的组合物的蛋白质表达系统，其中核酸序列由SEQ ID NO:6或7组成。还提供了包含前述实施方式中任一项的组合物的蛋白质表达系统，其中表达盒编码的异源蛋白质包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
还提供了引发哺乳动物中针对异源蛋白质的免疫应答的方法，方法包括向哺乳动物施用包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸进一步包含含有与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子的表达盒，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和其中Gag来自中国HIV进化枝B。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的至少一个调节序列。
在一些实施方式中，表达盒位于早期基因E1基因组区中。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
在一些实施方式中，由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。
在一些实施方式中，整个早期基因E3基因组区被缺失。
在进一步实施方式中，启动子是组成型启动子。在仍进一步实施方式中，启动子是巨细胞病毒即时早期启动子(CMV)。
提供了治疗和/或预防哺乳动物中HIV的方法，方法包括施用治疗有效量的由包含SEQ ID NO:6或7的核酸序列编码的组合物。在一些实施方式中，核酸序列由SEQ ID NO:6或7组成。
提供了针对HIV感染为哺乳动物接种疫苗的方法，方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的前述实施方式中任一项的组合物，其中组合物的施用引发哺乳动物的免疫应答。在一些实施方式中，为哺乳动物预防性施用组合物。在进一步实施方式中，为哺乳动动物治疗性施用组合物。在仍进一步实施方式中，组合物与佐剂组合施用。
提供了产生对哺乳动物中异源蛋白质的效应和记忆T细胞免疫应答的方法，方法包括以下步骤：(a)以有效引发哺乳动物中免疫应答的量向哺乳动物施用前述实施方式中任一项的组合物；(b)在第二随后的时间段施用第二有效量的前述实施方式中任一项的组合物，其中针对异源蛋白质的T记忆细胞在哺乳动物中被重新活化。在一些实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物包括选自gp140和Gag的相同或不同的HIV异源蛋白质，其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和其中Gag来自中国HIV进化枝B。在进一步实施方式中，在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物是选自AdC6和AdC7的相同或不同血清型。
提供了产生对哺乳动物中异源蛋白质的适应性B细胞免疫应答的方法，方法包括以下步骤：(a)以有效引发哺乳动物中免疫应答的量向哺乳动物施用前述实施方式中任一项的组合物；(b)在第二随后的时间段施用第二有效量的前述实施方式中任一项的组合物，其中针对异源蛋白质的B记忆细胞在哺乳动物中被重新活化。
在一些实施方式中，方法进一步包括向哺乳动物施用免疫原的步骤。在进一步实施方式中，免疫原包含异源蛋白质，其中异源蛋白质是选自源于任意来源的任何进化枝的gp140的至少一种HIV蛋白质，其中B细胞免疫应答被进一步扩大。在一些实施方式中，异源蛋白质来自中国进化枝或来自非洲进化枝。在一些实施方式中，如此施用的异源蛋白质是与在前述实施方案中任一项的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列中表达的异源蛋白质相同的异源蛋白质。在一些实施方式中，如此施用的异源蛋白质是与前述方法中任一项的步骤(a)和/或步骤(b)中施用的异源蛋白质相同的异源蛋白质。在一些实施方式中，免疫原进一步包含佐剂，例如明矾。
在一些实施方式中，在步骤(a)和(b)后向哺乳动物施用免疫原。
在一些实施方式中，哺乳动物是人。
包含E1和/或E3中缺失的腺病毒载体在国际申请PCT/US2017/043315(WO 2018/026547)中公开，其以其全部并入本文。
包含使用本文公开的腺病毒载体制备的腺病毒颗粒的疫苗组合物可用于诱导哺乳动物中针对一种或多种编码的异源蛋白质或其抗原部分的免疫性。使用所公开的疫苗组合物或剂量单位可以诱导免疫性。可以使用本领域已知的合适方法来评估免疫应答，例如WO2012/02483中所公开的。
异源基因表达
在一个方面中，尽管巨细胞病毒即时早期启动子在本文中被示例为驱动HIV蛋白质表达的启动子，但本发明不应被解释为限于该启动子序列。可用于本发明的启动子序列包括诱导高水平的基因表达的任何启动子。这种启动子可以包括但不限于本文其他地方公开的那些。
在一个实施方式中，合适的启动子是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强的组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平的表达。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人体免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃巴病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，比如，但不限于肌动蛋白质启动子、肌球蛋白质启动子、血红蛋白质启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当需要这种表达时它被可操作地连接，能够启动多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白质启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方式中，本发明还包括使用驱动给定异源基因在一种或多种特定类型的细胞中表达的组织特异性启动子(例如，肌红蛋白质启动子、肌肉肌酸激酶启动子、结蛋白质启动子、哺乳动物肌钙蛋白质1启动子和骨骼α-作用启动子)。此外，本领域已知的任何人工合成的启动子可用于本发明中，因为这些启动子可提供用于异源基因的最佳效率和稳定性。另外，增强子序列调节载体内包含的基因的表达。通常，增强子与蛋白质因子结合以加强基因的转录。增强子可位于它调节的基因的上游或下游。增强子也可以是组织特异性的，以加强在特定细胞或组织类型中的转录。
为了评估感兴趣的异源基因的表达，待导入细胞的表达载体还可包含选择标记基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过杂交病毒载体感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其他方面中，选择标记可以在单独的DNA片段上携带并用于共感染/转染过程。选择标记和报告基因二者都可以侧接合适的调节序列以能够实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，例如新霉素抗性基因等。
报告基因用于鉴定潜在感染的细胞和评估调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由受体生物体或组织表达并且编码多肽的基因，该多肽的表达通过一些可容易检测的性质例如酶活性来表现。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白质基因(例如，Ui-Tei et al.,2000FEBS Letters 479：79-82)。
对于本领域技术人员显而易见的是，本发明不限于由本发明的腺病毒载体表达的异源基因的性质。可以使用任何合适的异源基因，其中基因的表达为哺乳动物提供益处。例如，异源基因可以是病毒蛋白质，其在哺乳动物中的表达赋予对病毒感染的免疫力。类似地，异源基因可以是细菌抗原、寄生虫抗原、真菌抗原、癌抗原，参与有害自身免疫反应的抗原，或其中针对其的免疫应答提供益处的任何其他蛋白质。
异源蛋白质
在本发明中，本发明的腺病毒载体可以编码异源蛋白质，其中异源蛋白质为选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质，其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝，和其中Gag来自中国HIV进化枝B。通常，异源蛋白质是肽片段、多肽、蛋白质或融合蛋白质。任选地，合适的异源蛋白质使得在向哺乳动物施用载体后在哺乳动物中诱导针对其的细胞介导的免疫和体液应答。
本发明的方法
本发明的载体在可用于使哺乳动物免疫疾病，和/或治疗、预防或降低哺乳动物疾病的风险的多种应用中是有用的。
因此本发明包括使哺乳动物免疫异源蛋白质的方法。方法包括向哺乳动物施用组合物，该组合物包含含有血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含表达盒，表达盒包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子序列，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质，其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝，和其中Gag来自中国HIV进化枝B，和其中异源蛋白质的表达诱导哺乳动物的免疫应答。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的至少一个调节序列.
在一些实施方式中，表达盒位于早期基因E1基因组区中。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
在一些实施方式中，由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。
在一些实施方式中，整个早期基因E3基因组区被缺失。
在一个实施方式中，黑猩猩来源的Ad载体是AdC6。在一个实施方式中，AdC6具有Genbank登录号AY530877。在一个实施方式中，黑猩猩来源的Ad载体是AdC7。在一个实施方式中，AdC7具有Genbank登录号AY530878。
本发明进一步包括治疗有需要的哺乳动物的方法，其中方法施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:6或7的核酸序列的黑猩猩来源的腺病毒载体编码的组合物，其中异源基因的表达对哺乳动物有益。在一个方面，本发明包括产生对哺乳动物中异源蛋白质的效应和记忆T细胞免疫应答的方法。在一些实施方式中，核酸序列由SEQ ID NO:6或7组成。在另一方面，本发明包括产生对哺乳动物中异源蛋白质的适应性B细胞免疫应答的方法。
本发明中另外包括了降低哺乳动物将发展疾病的风险的方法。方法包括向哺乳动物施用包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中核酸序列进一步包含表达盒，表达盒包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子序列，其中异源蛋白质是选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质，其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝，和其中Gag来自中国HIV进化枝B。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的至少一个调节序列。
在一些实施方式中，表达盒位于早期基因E1基因组区中。
在一些实施方式中，表达盒进一步包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
在一些实施方式中，由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。
在一些实施方式中，整个早期基因E3基因组区被缺失。
异源基因的表达诱导对哺乳动物中由此编码的异源蛋白质的免疫应答，由此降低哺乳动物将发展与异源蛋白质相关的疾病(如，HIV-1)的风险。
腺病毒载体生产
在本文的实验实施例部分和美国申请号14/190,787(美国专利号9,624,510)中详细描述了制备本发明的腺病毒载体的方法，该美国申请通过引用并入本文。通常，在本领域中已经很好地建立了腺病毒载体的生产、纯化和质量控制程序。一旦产生载体骨架，则分子克隆可用于产生包括抗原异源蛋白质的编码序列的腺病毒质粒。在一些实施方式中，可以将质粒转染到包装细胞中，包装细胞以反式提供合适的腺病毒血清型的E1。包装细胞在本领域中是熟知的，并且细胞系比如HEK293或PERC6可用于此目的。然后一旦斑块变得可见，收获病毒颗粒。然后可以感染新鲜细胞以确保腺病毒的连续复制。可以使用DNA印迹或其他方法，比如限制酶作图、测序和PCR来评估质量，以确认转基因的存在并且不存在基因重排或不期望的缺失。
包含使用本文公开的腺病毒载体制备的腺病毒颗粒的疫苗组合物可用于诱导针对编码的抗原蛋白质的免疫。疫苗可以使用标准技术配制，并且除了编码所需蛋白质的无复制能力的腺病毒载体以外，还可以包括药学上可接受的载体，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其他缓冲溶液，以及其他组分，比如抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、佐剂等。在一些实施方式中，疫苗组合物与一种或多种其他疫苗组合施用。可以提供疫苗组合物的剂量单位。这种剂量单位通常包括108至1011个腺病毒颗粒(如，108、5×108、109、5×109、1010、5×1010、1011)。在一些实施方式中，选择5×1010个病毒颗粒的剂量。具体地，该剂量(5×1010)在临床试验中最适合人类。
药物组合物和制剂
本发明的载体可以配制为药物组合物。
这种药物组合物可以是适于施用到受试者(即哺乳动物)的形式，或者药物组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的运载体、一种或多种另外的成分、或这些的一些组合。如本领域所熟知的，药物组合物的各种组分可以以生理学上可接受的盐的形式存在，比如与生理学上可接受的阳离子或阴离子组合。
在一个实施方式中，可以施用可用于实践本发明的方法的药物组合物以递送106和1012VP之间的剂量。
在一个实施方式中，可用于实践本发明的方法的药物组合物可以包括佐剂。合适的非限制性实例是弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOM或角鲨烯。
可用于本发明的方法的药物组合物可以被合适地开发用于吸入、口服、直肠、阴道、肠胃外、外用、经皮、肺、鼻内、口腔、眼内、鞘内、静脉内或另外的施用途径。其他考虑的制剂包括预计的纳米颗粒、脂质体制品、包含活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。施用途径(一种或多种)对于技术人员来说是容易显而易见的，并且取决于很多因素，包括所治疗疾病的类型和严重程度、所治疗的兽或人类患者的类型和年龄等。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于合乎伦理施用至人的药物组合物，但本领域技术人员应理解，这种组合物通常适合施用于各种动物。修改适合于施用至人的药物组合物以便使组合物适合于施用至各种动物是很好理解的，并且一般熟练的兽医药理学家可以仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和进行这种修改。考虑向其施用本发明的药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类动物、哺乳动物，其包括商业上相关的哺乳动物，比如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
本发明的组合物可以包括按组合物的总重量计从约0.005％至2.0％的防腐剂。在暴露于环境中的污染物的情况下，防腐剂用于防止变质。
施用/给药
施用方案可以影响什么构成有效量。例如，本发明的腺病毒载体可以以单一药剂、若干分开的剂量以及交错剂量施用至受试者(即哺乳动物)，其可以每天或顺序施用，或者药剂可以连续输注，或者可能是推注(bolus injection)。此外，如治疗或预防情况的紧急情况所指示的，剂量可以按比例增加或减少。
将本发明的组合物施用至受试者，优选地哺乳动物，更优选地人，可以使用已知的程序，以有效地治疗受试者的疾病的剂量和时间段进行。实现预期结果所需的组合物的有效量将变化，并且取决于因素，比如待治疗或预防的疾病，正在治疗的受试者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史等，和医学领域众所周知的类似因素。在具体实施方式中，特别有利的是以剂量单位形式配制组合物以便于剂量的施用和均匀性。如本文所使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含预定量的治疗化合物，其经计算可产生与所需药物载体相关的期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式由(a)组合物和待表达的异源蛋白质的独特特征，以及待实现的具体治疗效果决定，并直接取决于(a)组合物和待表达的异源蛋白质的独特特征，以及待实现的具体治疗效果。
施用途径
本领域技术人员将认识到，尽管可以使用多于一种途径进行施用，但是具体途径可以提供比另一种途径更即时和更有效的反应。本发明的任何组合物的施用途径包括吸入、口服、鼻腔、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和外用施用。
试剂盒
在一些实施方式中，提供了用于治疗、预防或改善给定疾病、紊乱或病症或其症状的试剂盒，如本文所描述，其中试剂盒包含：a)如本文所描述的化合物或组合物；和任选地b)如本文所描述的另外的药剂或疗法。试剂盒可以进一步包括使用试剂盒治疗、预防或改善疾病、紊乱或病症的说明书或标签。在又其他实施方式中，本发明延伸至对于如本文所描述的给定疾病、紊乱或病症或其症状的试剂盒测试。例如，这种试剂盒可以包含来自PCR或其他核酸杂交技术(微阵列)的试剂或用于基于免疫学的检测技术(例如，ELISpot、ELISA)的试剂。
实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且本发明决不应被解释为限于这些实施例，而应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，使用前述描述和以下说明性实施例，认为本领域普通技术人员可以制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，并且不应解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
现在在以下实施例中描述实验结果。
方法：
根据Los Alamos数据库，在中国HIV-1最流行的进化枝是A/E(29.2％)、以07_B/C(18.7％)为主的不同类型的B/C(30.1％)、B(23.1％)和C(14.7％)。进行了广泛的数据库搜索，并组装了一组包膜(env)序列以诱导抗体，这些抗体可能是为中国开发综合HIV-1疫苗的候选抗体。在这些搜索中，关注可获得全长序列的较新的中国分离株。优先选择如此的Env序列，其携带169位的K和172位的V，这对结合广泛中和V2特异性抗体和其ADCC活性是重要的。对于Gag，选择含有如此表位的进化枝B，该表位对筛选实验动物中CD8+T细胞应答是重要的。
实施例1：载体构建和初始免疫原性测试
第一代载体
在E1和部分E3缺失的载体内使用没有内含子和增强子的表达盒产生表达HIV进化枝B的gag和HIV进化枝B、AE、BC和C的gp140的AdC6和AdC7。滴定载体的病毒含量。载体显示具有基因完整性并在系列培养后是基因稳定的。仅AdC7gp140BC载体诱导gp140-特异性B细胞应答。(图1A)
第二代载体
使用相同的AdC主链(但对于AdC7gp140BC)和插入物构建第二组载体，但通过在表达盒中包括内含子和增强子来改变表达盒。在拯救后，滴定载体，并建立基因完整性。发现如下所示的这些载体是免疫原性的。
对gag载体进行蛋白质印迹。第一代gag载体无法表达可检测量的gag蛋白。第二代gag载体显示出良好的表达。由于缺乏特异性抗体的Env载体给出了模棱两可的结果。质谱法可用于确定独立于抗体的表达，如通过使用第二代载体之一所确定的。
实施例2：第二代gag载体的免疫原性
用1011vp的第二代gag载体免疫BALB/c小鼠组。2周后，通过在利用携带gag优势免疫表位的肽刺激后或如上所述的假刺激后进行细胞内细胞因子染色，测试它们汇集血液中的CD8+T细胞应答(图1B)。用任一种载体免疫的小鼠均显示阳性应答。
3天后测试来自单个小鼠的脾细胞，包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-2和粒酶B(GrmB)的染色(图2)。接种疫苗后，小鼠对多种细胞因子表现出阳性应答。使用109和1010vp的AdC6gag载体的较低剂量重复该实验，然后以这些剂量的载体再次诱导可检测到的CD8+T细胞应答，而对于腺病毒载体而言，典型的情况是更适度的CD4+T细胞应答(图3)。
实施例3：第一代gp140载体
向ICR小鼠注射1011vp的gp140表达载体。4周后，为它们放血，并在杆状病毒来源的gp140(进化枝C)上或BSA涂覆的板上通过ELISA测试血清，并与来自幼稚小鼠(阴性对照)或来自注射已经建立的gp140载体的小鼠(阳性对照)的血清进行比较。用AdC7BC免疫的小鼠发展可检测的抗体应答(图4)。一些但不是全部免疫的小鼠发展了gp140-特异性抗体，而用其他载体免疫的小鼠没有血清转化。
实施例4：第二代gp140载体
使用带有内含子和增强子的表达盒产生表达gp140(AdC6gp140AE、AdC6gp140B、AdC6gp140C、AdC6gp140BC、AdC7gp140AE、AdC7gp140B、AdC7gp140C)的载体。滴定后，以1011vp向ICR小鼠注射载体，连同第一代AdC7gp140BC载体。4周后，在涂覆来自早期非洲HIV-1进化枝C分离株、中国HIV-1进化枝AE分离株和中国HIV-1进化枝BC分离株(后两个匹配AdC插入物的序列)的杆状病毒来源的gp140蛋白质的板上通过ELISA测试它们的血清中对gp140的抗体。即使不是所有小鼠应答，但是所有载体都诱导对3env蛋白质的抗体应答(图4)。5周后，施用109vp/小鼠的载体剂量，用表达相同插入物的异源载体初免后，小鼠被加强。4周后，在进化枝C、AE和BC gp140蛋白质上测试个体血清。如图5所示，加强后，一些无应答者变为血清阳性，这对于加强初免(如，进化枝C蛋白质上AdC6BC或所有蛋白质上AdC7AE后)后很低的应答最为有效。在一些组中，加强相对无效(图8)，这可能归因于用于初免的高载体剂量和用于进行加强的100倍低剂量。
用AdC6载体初免并用AdC7载体加强的小鼠再次用在明矾中以1:1稀释的来自AIDS试剂项目(蛋白质CN54)2μg/小鼠的重组进化枝C gp140蛋白质进行加强。如图6和9所示，在加强载体初免的抗体应答方面蛋白质是非常有效的，以致在该加强后5周，AE组中除了一只小鼠外都对来自中国分离株的两种gp140表现出强大的抗体应答。为了比较，用明矾中相同蛋白免疫幼稚小鼠；这些小鼠中一些发展了gp140-特异性抗体应答，但是在载体初免的小鼠中观察到远低于这些的效价(图9)。比较了3种不同进化枝的gp140上测量的抗体效价。如图10中所示，应答取决于在其上测试他们的蛋白质不同而不同。已经对一种进化枝的gp140具有高抗体效价的小鼠不一定对其他进化枝的gp140具有高效价。出于同样的原因，在涂覆来自3中不同进化枝的gp140的板上获得的数据显示相对差的关联性(图11)。
实施例5：初免-加强方案
用AdCgag载体进行了多种初免加强方案。在第一组实验中，用AdC6gag或AdC7gag以109或1010vp进行初免并在6周后用异源载体以相同剂量给予进行加强。在后续实验中，施用gag和env载体的混合物。在初免后6周给予加强。在两个实验中，在初免后获得对gag的CD8+T细胞应答，这在加强后反常地下降。在图12中显示了第一个实验的结果。这样的结果在先前用其它载体获得，指示了CD8+T细胞在初免后高度保持了活化并因此易于在加强后再次遇到它们的抗原后而凋亡。使用1010vp的Ad6gag进行初免和1010vp的AdC7进行加强来重复实验。在后续实验中，初免和加强之间存在2个月的间隔。结果更加有希望，因为观察到gag-特异性CD8+T细胞的频率增加(图13)。然而，频率依然远在用US起源进化枝B gag初免-加强后常规观察到的那些以下，指示使用这种特定插入物，很可能需要在初免和加强之间更长的等待时间。
在BALB/c小鼠中用载体混合物进行实验，从而评估抗体应答。已经在ICR小鼠中进行了全部其他抗体实验。当测试针对进化枝AE和BC的血清时，幼稚小鼠中背景应答是非常高的。针对进化枝C的背景应答不是很高，但仍然实质上使得其几乎无法评估是否确实已经实现应答(图14)。
在ICR小鼠中测试了表达gp140的载体的混合物。以1010vp/载体向小鼠注射AdC6gP140进化枝C、B、AE和BC载体的混合物或对应AdC7载体的混合物。2周和8周后为小鼠放血，然后用异源载体(即，AdC6gp140进化枝B、C、AE、BC)进行加强，免疫小鼠用对应AdC7进行加强，反之亦然。2周后为小鼠放血。如本文其他地方所描述，通过ELISA确定对进化枝C、BC和AE的gp140的抗体。虽然在一些小鼠中观察到抗体应答，但是不如用仅表达一个进化枝的gp140的载体免疫后强。此外，在加强免疫后没有看到增加。在图15中示出了结果。
序列:
Gp140进化枝AE1：登录号，JX112804.SEQ ID NO:1
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Gp140进化枝B：登录号，HM215399.SEQ ID NO:2
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Gp140进化枝C：登录号，KF835515.SEQ ID NO:3
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Gp140进化枝BC：登录号，KC492738.SEQ ID NO:4
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HIVgag进化枝B：登录号，JF932500.SEQ ID NO:5
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1,C6 020CMV-HIVgp140 AE1.SEQ ID NO:6
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2,C7 010 CMV-HIVgp140 AE1.SEQ ID NO:7
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实施例6：基因稳定性和蛋白质表达
基因稳定性：如通过限制酶消化分析纯化的病毒DNA，然后在HEK 293细胞上连续12次传代进行凝胶电泳所确定的，所有载体都是基因稳定的。
蛋白质表达：用不同载体将HEK 293细胞感染48小时。制备细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离蛋白质。从凝胶上切下约110-160kD大小的跨越蛋白质的条带，洗脱蛋白质并通过质谱法进行分析。结果(如下所示)表明，对于每种细胞裂解物，可以检测到源自gp140的肽。
从两个腺病毒载体血清型表达的3种不同的HIV进化枝的gp140内的细胞裂解物中检测到的序列用下划线标记并以粗体显示。结果表明，AdC7载体最有可能仅表达低水平的进化枝B gp140蛋白质。
Gp140进化枝BC：登录号，KC492738(SEQ ID NO:4)
AdC6 gp140 BC
Figure BDA0003411380980000401
AdC7 gp140 BC
Figure BDA0003411380980000402
Figure BDA0003411380980000411
Gp140进化枝B：登录号，HM215399(SEQ ID NO:2)
AdC6 GP140 B
Figure BDA0003411380980000412
AdC7 GP140 B
Figure BDA0003411380980000413
Gp140进化枝C：登录号，KF835515(SEQ ID NO:3)
AdC6 GP140 C
Figure BDA0003411380980000414
Figure BDA0003411380980000421
AdC7 GP140 C
Figure BDA0003411380980000422
Gp140进化枝BC：登录号，KC492738(SEQ ID NO:4)AdC6 GP140 BC
Figure BDA0003411380980000423
AdC7 GP140 BC
Figure BDA0003411380980000424
Figure BDA0003411380980000431
参考文献:
Carnathan DG,Wetzel KS,Yu J,Lee ST,Johnson BA,Paiardini M,Yan J,Morrow MP,Sardesai NY,Weiner DB,Ertl HC,Silvestri G.Activated CD4+CCR5+Tcells in the rectum predict increased SIV acquisition in SIVGag/Tat-vaccinated rhesus macaques.Proc Natl Acad Sci U S A.2015Jan 13；112(2):518-23。
Tuyishime S,Haut LH,Kurupati RK,Billingsley JM,Carnathan D,GangaharaS,Styles TM,Xiang Z,Li Y,Zopfs M,Liu Q,Zhou X,Lewis MG,Amara RR,Bosinger S,Silvestri G,Ertl HCJ.Correlates of Protection Against SIVmac251 Infection inRhesus Macaques Immunized With Chimpanzee-Derived AdenovirusVectors.EBioMedicine.2018May；31:25-35。
Cervasi B,Carnathan DG,Sheehan KM,Micci L,Paiardini M,Kurupati R,Tuyishime S,Zhou XY,Else JG,Ratcliffe SJ,Ertl HC,Silvestri G.Immunologicaland virological analyses of rhesus macaques immunized with chimpanzeeadenoviruses expressing the simian immunodeficiency virus Gag/Tat fusionprotein and challenged intrarectally with repeated low doses of SIVmac.JVirol.2013Sep；87(17):9420-30。
Lasaro MO,Haut LH,Zhou X,Xiang Z,Zhou D,Li Y,Giles-Davis W,Li H,Engram JC,Dimenna LJ,Bian A,Sazanovich M,Parzych EM,Kurupati R,Small JC,WuTL,Leskowitz RM,Klatt NR,Brenchley JM,Garber DA,Lewis M,Ratcliffe SJ,BettsMR,Silvestri G,Ertl HC.Vaccine-induced T cells provide partial protectionagainst high-dose rectal SIVmac239challenge of rhesus macaques.MolTher.2011Feb；19(2):417-26。
Tatsis N,Lasaro MO,Lin SW,Haut LH,Xiang ZQ,Zhou D,Dimenna L,Li H,BianA,Abdulla S,Li Y,Giles-Davis W,Engram J,Ratcliffe SJ,Silvestri G,Ertl HC,Betts MR.Adenovirus vector-induced immune responses in nonhuman primates:responses to prime boost regimens.J Immunol.2009May 15；182(10):6587-99。
其他实施方式
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用以其整体并入本文。
虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设想本发明的其他实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。
序列表
<110> 威斯达研究所
旷宇博捷医药科技有限公司
H·C·J·艾尔特
周向阳
罗小平
<120> 用于HIV疫苗应用的复制缺陷型腺病毒载体
<130> 368530-7021WO1(00098)
<150> 美国临时专利申请号62/835,108
<151> 2019-04-17
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 643
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达的蛋白
<220>
<223> Gp140进化枝AE1
<400> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达的蛋白
<220>
<223> Gp140进化枝B HM215399
<400> 2
Met Arg Val Lys Gly Ile Arg Lys Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp
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<210> 3
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达的蛋白
<220>
<223> Gp140进化枝C
<400> 3
Met Arg Val Arg Gly Thr Gln Arg Asn Tyr Pro Gln Trp Trp Ile Trp
1 5 10 15
Gly Ile Leu Gly Phe Trp Met Leu Met Ile Cys Asn Val Gly Gly Asn
20 25 30
Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr
35 40 45
Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Asn Glu Val
50 55 60
His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro
65 70 75 80
Gln Glu Met Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys
85 90 95
Asn Glu Met Val Asn Gln Met His Glu Asp Val Ile Ser Leu Trp Asp
100 105 110
Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
115 120 125
Lys Cys Ser Asn Val Thr Leu Lys Asn Asn Thr Val Asn Ser Asn Glu
130 135 140
Thr Gln Tyr Arg Lys Asn Cys Thr Phe Asn Thr Thr Thr Glu Leu Lys
145 150 155 160
Asn Arg Lys Gln Lys Val Ser Ala Ile Phe Tyr Arg Ile Asp Ile Val
165 170 175
Pro Leu Gly Asn Glu Ser Ser Gly Asn Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn
180 185 190
Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Asp Pro Ile
195 200 205
Pro Ile His Tyr Cys Thr Pro Ala Gly Tyr Ala Leu Leu Lys Cys Asn
210 215 220
Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Asn Asn Val Ser Thr Val
225 230 235 240
Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu
245 250 255
Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu
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Thr Asn Asn Val Lys Thr Ile Ile Val His Leu Asn Glu Ser Val Glu
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325 330 335
Gln Gly Val Gly Lys Lys Leu Ala Glu His Phe Pro Asn Lys Thr Ile
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Lys Phe Lys Pro Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Thr Thr His Ser
355 360 365
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370 375 380
Asn Ser Thr Tyr Asn Ser Thr Tyr Val Pro Asn Gly Thr Glu Ser Lys
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Thr Cys Lys Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Val Arg Asp Gly Gly
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Glu Ala Lys Leu Thr Val Gln Ala Arg
485 490 495
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500 505 510
Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys
515 520 525
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530 535 540
Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Thr Asn Thr Ile Tyr Ser Leu Leu Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu
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610 615 620
Asn Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp
625 630
<210> 4
<211> 647
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达的蛋白
<220>
<223> Gp140进化枝BC
<400> 4
Met Arg Val Met Gly Ile Arg Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg Trp
1 5 10 15
Gly Ile Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Val Val Gly Asn
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Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr
35 40 45
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50 55 60
His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro
65 70 75 80
Gln Glu Met Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys
85 90 95
Asn Glu Met Val Asn Gln Met Gln Glu Asp Val Ile Ser Leu Trp Asp
100 105 110
Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
115 120 125
Lys Cys Lys Asn Val Ser Ser Asn Ser Thr Glu Thr Pro Lys Leu Arg
130 135 140
Gly Asn Ser Ser Glu Thr Tyr Lys Asp Glu Glu Met Lys Asn Cys Ser
145 150 155 160
Phe Asn Ala Thr Thr Ile Leu Arg Asp Lys Lys Gln Glu Val Tyr Ala
165 170 175
Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Ala Pro Leu Leu Leu Asn Ser Ser Glu
180 185 190
Asn Ser Ser Ala Tyr Tyr Ser Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser Ala Ile
195 200 205
Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Asp Pro Ile Pro Ile His Tyr
210 215 220
Cys Thr Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys Lys Phe
225 230 235 240
Asn Gly Thr Gly Pro Cys Ser Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His
245 250 255
Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu
260 265 270
Ala Glu Gly Glu Val Ile Ile Arg Ser Lys Asn Leu Thr Asp Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Arg Ser Val Glu Ile Val Cys Thr
290 295 300
Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln
305 310 315 320
Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His
325 330 335
Cys Asn Ile Ser Glu Asp Met Trp Asn Glu Thr Leu His Trp Val Ser
340 345 350
Arg Lys Leu Ala Glu His Phe Pro Asn Arg Thr Ile Asn Phe Thr Ser
355 360 365
Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Ile Ala Thr His Ser Phe Asn Cys Arg
370 375 380
Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Arg Leu Phe Asn Gly Thr Tyr
385 390 395 400
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Ile Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Gln Val Gly
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435 440 445
Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Val Arg Asp Gly Gly Asp Asn Thr Asn
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Lys Thr Glu Ile Phe Arg Pro Gln Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp
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485 490 495
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530 535 540
Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu
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Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro
565 570 575
Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Lys Thr Gln Asp Glu Ile Trp Asn Asn
580 585 590
Leu Thr Trp Met Gln Trp Asp Lys Glu Ile Ser Asn Tyr Thr Asp Thr
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Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp
645
<210> 5
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达的蛋白
<220>
<223> Gp140进化枝B JF932500
<400> 5
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp
1 5 10 15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys
20 25 30
His Val Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Glu Gln Leu
50 55 60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Thr Ile Ala Val Leu Tyr Cys Val His Gln Lys Ile Glu Ile Lys Asp
85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys
100 105 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly Asn Asn Ser Gln Val
115 120 125
Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Arg Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His
130 135 140
Gln Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
165 170 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
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Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Pro Gln Ala Gly Pro Ile Ala
210 215 220
Pro Gly Gln Ile Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Asn Leu Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
245 250 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
260 265 270
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gln Gly
275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305 310 315 320
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
340 345 350
Val Gly Gly Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ala Met Ser
355 360 365
Gln Val Thr Asn Ser Ala Ser Val Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg
370 375 380
Asn Gln Arg Lys Pro Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
385 390 395 400
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
405 410 415
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
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Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe
435 440 445
Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg
450 455 460
Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Gln Ile Asp
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Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Lys Ser Leu Phe Gly Asn Asp
485 490 495
Pro Ser Ser Gln
500
<210> 6
<211> 34406
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 运载体
<220>
<223> C6 020 CMV-HIV gp140 AE1
<400> 6
catcatcaat aatatacctc aaacttttgg tgcgcgttaa tatgcaaatg agctgtttga 60
atttggggag ggaggaaggt gattggctgc gggagcggcg accgttaggg gcggggcggg 120
tgacgttttg atgacgtggc tatgaggcgg agccggtttg caagttctcg tgggaaaagt 180
gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg aaatactcaa ttttcccgcg ctctctgaca 240
ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag tgaaaacggg ccattttcgc gcgaaaactg 300
aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg cgtttatggc agggaggagt atttgccgag 360
ggccgagtag actttgaccg attacgtggg ggtttcgatt accgtatttt tcacctaaat 420
ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt ttacgtacga tatcatttcc ccgaaagtgc 480
cacctgaccg taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctcc cgatccccta 540
tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tctgctccct 600
gcttgtgtgt tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa 660
ggcttgaccg acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc 720
gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 780
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 840
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gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 1080
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 1140
cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 1200
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 1260
aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 1320
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 1380
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcaga 1440
agttggtcgt gaggcactgg gcaggtaagt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 1500
caatagaaac tgggcttgtc gagacagaga agactcttgc gtttctgata ggcacctatt 1560
ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca gttcaattac 1620
agctcttaaa aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg agagtgaagg 1680
ggacacagat gaattggcca aacttgtgga aatgggggac tttgatcctt gggttggtga 1740
tcatgtgtag tgcctcagac aacttgtggg ttacagttta ttatggagtt cctgtgtgga 1800
gagatgcaaa taccacccta ttttgtgcat cagatgccaa agcacatgag acagaagtgc 1860
acaatgtctg ggccacatat gcctgtgtac ccacagatcc caacccacaa gaaataccca 1920
tggaaaatgt gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaataa catggtagag caaatgcagg 1980
aggatgtaat cagtttatgg gatcaaagtc taaagccatg tgtaaagtta actcctctct 2040
gcgttacttt aatttgtacc aatgctaact tgaccaagat caacagtacc aatagcgggc 2100
ctaaagtaat aggaaatgta acagatgaag taagaaactg ttcttttaat atgaccacat 2160
tactaacaga taagaagcaa aaggtttatg cactttttta taagcttgat atagtaccaa 2220
ttgataatag taatagtagt gagtatagat taataaattg taatacttca gtcattaagc 2280
aggcttgtcc aaagatatcc tttgatccaa ttcctataca ttattgtact ccagctggtt 2340
atgcgatttt aaaatgtaat gataagaatt tcaatgggac agggccatgt aaaaatgtca 2400
gctcagtaca gtgcacacat ggaattaagc cagtggtctc aactcaatta ctgttaaatg 2460
gcagtctagc agaagaagag ataataatca gatctgaaaa tctcacaaac aatgccaaaa 2520
ccataatagt gcaccttaat aaggctgtag aaatcaattg taccagaccc tccaacaata 2580
caagaacaag tataagaata ggaccaggac aaatatttta tagaacagga gacataatag 2640
gagatataag acaagcatat tgtgaaatta atggaacaaa atggaatgaa actttaagac 2700
aggtagcaaa aaaattaaaa gagcaattta ataacacaat aaaattccag ccaccctcag 2760
gaggagatct agaaattaca atgcttcatt ttaattgtag aggggaattt ttctattgca 2820
atacaacaaa actgttcaat agtacttggg aaagaaatga gaccataaaa gggggtaatg 2880
gcaatggcaa tgacactatc atacttccat gcaggataaa gcaaatcata aacatgtggc 2940
aaggagcagg acaagcaatg tatgctcctc ccatcagtgg aataattaac tgtgtatcaa 3000
atattacagg aatactattg acaagagatg gtggtaatac taatgaaact gccgagatct 3060
tcagacctgg aggaggaaat ataaaggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag 3120
tagtacaaat tgaaccacta ggagtagcac ccaccaaggc aaagctgacg gtacaggcca 3180
gacaattatt gtctggtata gtgcaacagc aaagcaattt gctgagggct atagaggcgc 3240
agcagcatat gttgcaactc acagtctggg gcattaaaca gctccaggca agaatcctgg 3300
ctgtggaaag ctacctaaag catcaacagt tcctaggact ttggggctgc tctaacaaaa 3360
ttatctgcac cactgctgta ccctggaatt cctcttggag taataaatct tatgatgaga 3420
tttgggaaaa tatgacatgg atagaatggg agagagaaat tggcaattac acaaaccaaa 3480
tatatgatat acttacaaaa tcgcaggaac agcaggacaa aaatgaaaag gaactgttgg 3540
aattggatca atgggcaagt ctgtggaatt ggtttagcat aacaaaatgg ctgtggtaat 3600
gtacaagtaa agcggccgcc actgtgctgg atgatccgag ctcggtacct ctagagtcga 3660
cccgggcggc caaaccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 3720
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 3780
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 3840
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 3900
gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagca gatctgcaga tctgaattca 3960
tctatgtcgg gtgcggagaa agaggtaatg aaatggcatt atgggtatta tgggtctgca 4020
ttaatgaatc ggtcagatat cgacatatgc tggccaccgt gcatgtggcc tcgcaccccc 4080
gcaagacatg gcccgagttc gagcacaacg tcatgacccg ctgcaatgtg cacctgggct 4140
cccgccgagg catgttcatg ccctaccagt gcaacatgca atttgtgaag gtgctgctgg 4200
agcccgatgc catgtccaga gtgagcctga cgggggtgtt tgacatgaat gtggagctgt 4260
ggaaaattct gagatatgat gaatccaaga ccaggtgccg ggcctgcgaa tgcggaggca 4320
agcacgccag gcttcagccc gtgtgtgtgg aggtgacgga ggacctgcga cccgatcatt 4380
tggtgttgtc ctgcaacggg acggagttcg gctccagcgg ggaagaatct gactagagtg 4440
agtagtgttt ggggctgggt gtgagcctgc atgaggggca gaatgactaa aatctgtggt 4500
tttctgtgtg ttgcagcagc atgagcggaa gcgcctcctt tgagggaggg gtattcagcc 4560
cttatctgac ggggcgtctc ccctcctggg cgggagtgcg tcagaatgtg atgggatcca 4620
cggtggacgg ccggcccgtg cagcccgcga actcttcaac cctgacctac gcgaccctga 4680
gctcctcgtc cgtggacgca gctgccgccg cagctgctgc ttccgccgcc agcgccgtgc 4740
gcggaatggc cctgggcgcc ggctactaca gctctctggt ggccaactcg agttccacca 4800
ataatcccgc cagcctgaac gaggagaagc tgctgctgct gatggcccag ctcgaggccc 4860
tgacccagcg cctgggcgag ctgacccagc aggtggctca gctgcaggcg gagacgcggg 4920
ccgcggttgc cacggtgaaa accaaataaa aaatgaatca ataaataaac ggagacggtt 4980
gttgatttta acacagagtc ttgaatcttt atttgatttt tcgcgcgcgg taggccctgg 5040
accaccggtc tcgatcattg agcacccggt ggatcttttc caggacccgg tagaggtggg 5100
cttggatgtt gaggtacatg ggcatgagcc cgtcccgggg gtggaggtag ctccattgca 5160
gggcctcgtg ctcggggatg gtgttgtaaa tcacccagtc atagcagggg cgcagggcgt 5220
ggtgctgcac gatgtccttg aggaggagac tgatggccac gggcagcccc ttggtgtagg 5280
tgttgacgaa cctgttgagc tgggagggat gcatgcgggg ggagatgaga tgcatcttgg 5340
cctggatctt gagattggcg atgttcccgc ccagatcccg ccgggggttc atgttgtgca 5400
ggaccaccag cacggtgtat ccggtgcact tggggaattt gtcatgcaac ttggaaggga 5460
aggcgtgaaa gaatttggag acgcccttgt gaccgcccag gttttccatg cactcatcca 5520
tgatgatggc gatgggcccg tgggcggcgg cctgggcaaa gacgtttcgg gggtcggaca 5580
catcgtagtt gtggtcctgg gtgagctcgt cataggccat tttaatgaat ttggggcgga 5640
gggtgcccga ctgggggacg aaggtgccct cgatcccggg ggcgtagttg ccctcgcaga 5700
tctgcatctc ccaggccttg agctcggagg gggggatcat gtccacctgc ggggcgatga 5760
aaaaaacggt ttccggggcg ggggagatga gctgggccga aagcaggttc cggagcagct 5820
gggacttgcc gcaaccggtg gggccgtaga tgaccccgat gaccggctgc aggtggtagt 5880
tgagggagag acagctgccg tcctcgcgga ggaggggggc cacctcgttc atcatctcgc 5940
gcacatgcat gttctcgcgc acgagttccg ccaggaggcg ctcgcccccc agcgagagga 6000
gctcttgcag cgaggcgaag tttttcagcg gcttgagtcc gtcggccatg ggcattttgg 6060
agagggtctg ttgcaagagt tccagacggt cccagagctc ggtgatgtgc tctagggcat 6120
ctcgatccag cagacctcct cgtttcgcgg gttggggcga ctgcgggagt agggcaccag 6180
gcgatgggcg tccagcgagg ccagggtccg gtccttccag ggccgcaggg tccgcgtcag 6240
cgtggtctcc gtcacggtga aggggtgcgc gccgggctgg gcgcttgcga gggtgcgctt 6300
caggctcatc cggctggtcg agaaccgctc ccggtcggcg ccctgcgcgt cggccaggta 6360
gcaattgagc atgagttcgt agttgagcgc ctcggccgcg tggcccttgg cgcggagctt 6420
acctttggaa gtgtgtccgc agacgggaca gaggagggac ttgagggcgt agagcttggg 6480
ggcgaggaag acggactcgg gggcgtaggc gtccgcgccg cagctggcgc agacggtctc 6540
gcactccacg agccaggtga ggtcggggcg gttggggtca aaaacgaggt ttcctccgtg 6600
ctttttgatg cgtttcttac ctctggtctc catgagctcg tgtccccgct gggtgacaaa 6660
gaggctgtcc gtgtccccgt agaccgactt tatgggccgg tcctcgagcg gggtgccgcg 6720
gtcctcgtcg tagaggaacc ccgcccactc cgagacgaag gcccgggtcc aggccagcac 6780
gaaggaggcc acgtgggagg ggtagcggtc gttgtccacc agcgggtcca ccttctccag 6840
ggtatgcaag cacatgtccc cctcgtccac atccaggaag gtgattggct tgtaagtgta 6900
ggccacgtga ccgggggtcc cggccggggg ggtataaaag ggggcgggcc cctgctcgtc 6960
ctcactgtct tccggatcgc tgtccaggag cgccagctgt tggggtaggt attccctctc 7020
gaaggcgggc atgacctcgg cactcaggtt gtcagtttct agaaacgagg aggatttgat 7080
attgacggtg ccgttggaga cgcctttcat gagcccctcg tccatttggt cagaaaagac 7140
gatctttttg ttgtcgagct tggtggcgaa ggagccgtag agggcgttgg agagcagctt 7200
ggcgatggag cgcatggtct ggttcttttc cttgtcggcg cgctccttgg cggcgatgtt 7260
gagctgcacg tactcgcgcg ccacgcactt ccattcgggg aagacggtgg tgagctcgtc 7320
gggcacgatt ctgacccgcc agccgcggtt gtgcagggtg atgaggtcca cgctggtggc 7380
cacctcgccg cgcaggggct cgttggtcca gcagaggcgc ccgcccttgc gcgagcagaa 7440
ggggggcagc gggtccagca tgagctcgtc gggggggtcg gcgtccacgg tgaagatgcc 7500
gggcaggagc tcggggtcga agtagctgat gcaggtgccc agattgtcca gcgccgcttg 7560
ccagtcgcgc acggccagcg cgcgctcgta ggggctgagg ggcgtgcccc agggcatggg 7620
gtgcgtgagc gcggaggcgt acatgccgca gatgtcgtag acgtagaggg gctcctcgag 7680
gacgccgatg taggtggggt agcagcgccc cccgcggatg ctggcgcgca cgtagtcgta 7740
cagctcgtgc gagggcgcga ggagccccgt gccgaggttg gagcgttgcg gcttttcggc 7800
gcggtagacg atctggcgga agatggcgtg ggagttggag gagatggtgg gcctttggaa 7860
gatgttgaag tgggcgtggg gcaggccgac cgagtccctg atgaagtggg cgtaggagtc 7920
ctgcagcttg gcgacgagct cggcggtgac gaggacgtcc agggcgcagt agtcgagggt 7980
ctcttggatg atgtcatact tgagctggcc cttctgcttc cacagctcgc ggttgagaag 8040
gaactcttcg cggtccttcc agtactcttc gagggggaac ccgtcctgat cggcacggta 8100
agagcccacc atgtagaact ggttgacggc cttgtaggcg cagcagccct tctccacggg 8160
gagggcgtaa gcttgcgcgg ccttgcgcag ggaggtgtgg gtgagggcga aggtgtcgcg 8220
caccatgacc ttgaggaact ggtgcttgaa gtcgaggtcg tcgcagccgc cctgctccca 8280
gagttggaag tccgtgcgct tcttgtaggc ggggttaggc aaagcgaaag taacatcgtt 8340
gaagaggatc ttgcccgcgc ggggcatgaa gttgcgagtg atgcggaaag gctggggcac 8400
ctcggcccgg ttgttgatga cctgggcggc gaggacgatc tcgtcgaagc cgttgatgtt 8460
gtgcccgacg atgtagagtt ccacgaatcg cgggcggccc ttgacgtggg gcagcttctt 8520
gagctcgtcg taggtgagct cggcggggtc gctgagcccg tgctgctcga gggcccagtc 8580
ggcgacgtgg gggttggcgc tgaggaagga agtccagaga tccacggcca gggcggtctg 8640
caagcggtcc cggtactgac ggaactgttg gcccacggcc attttttcgg gggtgacgca 8700
gtagaaggtg cgggggtcgc cgtgccagcg gtcccacttg agctggaggg cgaggtcgtg 8760
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ctgcttgccg aaggacccca tccaggtgta ggtttccaca tcgtaggtga ggaagagcct 8880
ttcggtgcga ggatgcgagc cgatggggaa gaactggatc tcctgccacc agttggagga 8940
atggctgttg atgtgatgga agtagaaatg ccgacggcgc gccgagcact cgtgcttgtg 9000
tttatacaag cgtccgcagt gctcgcaacg ctgcacggga tgcacgtgct gcacgagctg 9060
tacctgggtt cctttggcga ggaatttcag tgggcagtgg agcgctggcg gctgcatctc 9120
gtgctgtact acgtcttggc catcggcgtg gccatcgtct gcctcgatgg tggtcatgct 9180
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gagggcgcgc aggccggagc tgtccagggt cctgagacgc tgcggagtca ggtcagtggg 9300
cagcggcggc gcgcggttga cttgcaggag cttttccagg gcgcgcggga ggtccagatg 9360
gtacttgatc tccacggcgc cgttggtggc tacgtccacg gcttgcaggg tgccgtgccc 9420
ctggggcgcc accaccgtgc cccgtttctt cttgggcgct gcttccatgt cggtcagaag 9480
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aggggcacgt cggcgccgcg cgcgggcagg ttctggtact gcgcccggag aagactggcg 9600
tgagcgacga cgcgacggtt gacgtcctgg atctgacgcc tctgggtgaa ggccacggga 9660
cccgtgagtt tgaacctgaa agagagttcg acagaatcaa tctcggtatc gttgacggcg 9720
gcctgccgca ggatctcttg cacgtcgccc gagttgtcct ggtaggcgat ctcggtcatg 9780
aactgctcga tctcctcctc ctgaaggtct ccgcggccgg cgcgctcgac ggtggccgcg 9840
aggtcgttgg agatgcggcc catgagctgc gagaaggcgt tcatgccggc ctcgttccag 9900
acgcggctgt agaccacggc tccgtcgggg tcgcgcgcgc gcatgaccac ctgggcgagg 9960
ttgagctcga cgtggcgcgt gaagaccgcg tagttgcaga ggcgctggta gaggtagttg 10020
agcgtggtgg cgatgtgctc ggtgacgaag aagtacatga tccagcggcg gagcggcatc 10080
tcgctgacgt cgcccagggc ttccaagcgt tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag 10140
ttgaaaaact gggagttgcg cgccgagacg gtcaactcct cctccagaag acggatgagc 10200
tcggcgatgg tggcgcgcac ctcgcgctcg aaggccccgg ggggctcctc ttccatctcc 10260
tcctcttcct cctccactaa catctcttct acttcctcct caggaggcgg tggcggggga 10320
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gcgctgacga tgcatcttat caattgaccc gtagggactc cgcgcaagga cctgagcgtc 10560
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ccgacgagga agtgcggcgg cggctggcgg tagagcggcc atcgctcggt ggcgggggcg 11220
ccgggcgcga ggtcctcgag catgaggcgg tggtagccgt agatgtacct ggacatccag 11280
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cgcagcggca ggaagtagtt catggtggcc gcggtctggc ccgtgaggcg cgcgcagtcg 11400
tggatgctct agacatacgg gcaaaaacga aagcggtcag cggctcgact ccgtggcctg 11460
gaggctaagc gaacgggttg ggctgcgcgt gtaccccggt tcgaatctcg aatcaggctg 11520
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ccaggatacg gaggcgggtc gttttttggc cttggtcgct ggtcatgaaa aactagtaag 11640
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tacggagcga gcccctcttt ttttttcttg tgtttttgcc agatgcatcc cgtactgcgg 11880
cagatgcgcc cccaccctcc accacaaccg cccctaccgc agcagcagca acagccggcg 11940
cttctgcccc cgccccagca gcagccagcc actaccgcgg cggccgccgt gagcggagcc 12000
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ttccacgcgg ggcgggagct gcggcgcggc ctggaccgaa agcgggtgct gagggacgag 12240
gatttcgagg cggacgagct gacggggatc agccccgcgc gcgcgcacgt ggccgcggcc 12300
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tttctggtgg tgcagcacag tcgggacaac gagacgttca gggaggcgct gctgaatatc 12540
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gaagctgccg gcggttcccc ctacgtggag gaggtggacg atgaggagga ggagggcgag 13020
tacctggaag actgatggcg cgaccgtatt tttgctagat gcagcaacag ccaccgccgc 13080
cgcctcctga tcccgcgatg cgggcggcgc tgcagagcca gccgtccggc attaactcct 13140
cggacgattg gacccaggcc atgcaacgca tcatggcgct gacgacccgc aatcccgaag 13200
cctttagaca gcagcctcag gccaaccggc tctcggccat cctggaggcc gtggtgccct 13260
cgcgctcgaa ccccacgcac gagaaggtgc tggccatcgt gaacgcgctg gtggagaaca 13320
aggccatccg cggtgacgag gccgggctgg tgtacaacgc gctgctggag cgcgtggccc 13380
gctacaacag caccaacgtg cagacgaacc tggaccgcat ggtgaccgac gtgcgcgagg 13440
cggtgtcgca gcgcgagcgg ttccaccgcg agtcgaacct gggctccatg gtggcgctga 13500
acgccttcct gagcacgcag cccgccaacg tgccccgggg ccaggaggac tacaccaact 13560
tcatcagcgc gctgcggctg atggtggccg aggtgcccca gagcgaggtg taccagtcgg 13620
ggccggacta cttcttccag accagtcgcc agggcttgca gaccgtgaac ctgagccagg 13680
ctttcaagaa cttgcaggga ctgtggggcg tgcaggcccc ggtcggggac cgcgcgacgg 13740
tgtcgagcct gctgacgccg aactcgcgcc tgctgctgct gctggtggcg cccttcacgg 13800
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ccatcggaca ggcgcacgtg gacgagcaga cctaccagga gatcacccac gtgagccgcg 13920
cgctgggcca ggaggacccg ggcaacctgg aggccaccct gaacttcctg ctgaccaacc 13980
ggtcgcagaa gatcccgccc cagtacgcgc tgagcaccga ggaggagcgc atcctgcgct 14040
acgtgcagca gagcgtgggg ctgttcctga tgcaggaggg ggccacgccc agcgcggcgc 14100
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ccgaccccaa cgacgggttc ctgtgggacg acgtggacag cagcgtgttc tcgccgcgtc 14340
caggaaccaa tgccgtgtgg aagaaagagg gcggggaccg gcggccgtcc tcggcgctgt 14400
ccggtcgcgc gggtgctgcc gcggcggtgc ccgaggccgc cagccccttc ccgagcctgc 14460
ccttttcgct gaacagcgtg cgcagcagcg agctgggtcg gctgacgcga ccgcgcctgc 14520
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ccaataacgg gatagagagc ctggtggaca agatgagccg ctggaagacg tacgcgcacg 14640
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tctctgttgt ttgtagtagt atgatgaggc gcgtgtaccc ggagggtcct cctccctcgt 14940
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gcaacaagtt caaggcgcgg gtgatggtct cgcgcaagac ccccaacggg gtggatgatg 15360
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tcctgtacga ggacctggag gggggcaaca tccccgcgct cttggatgtc gaagcctacg 15780
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aggtgcgggg cgataatttt gctagcgctg cggcagcggc cgaggcggct gaaaccgaaa 15900
gtaagatagt catccagccg gtggagaagg acagcaagga caggagctac aacgtgctcg 15960
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gaccaacacc aacacctacg attacatgaa tggcagagtg acacctccct cgctggtaga 20820
cgcctacctc aacatcgggg cgcgctggtc gctggacccc atggacaacg tcaacccctt 20880
caaccaccac cgcaacgcgg gcctgcgcta ccgctccatg ctcctgggca acgggcgcta 20940
cgtgcccttc cacatccagg tgccccaaaa gtttttcgcc atcaagagcc tcctgctcct 21000
gcccgggtcc tacacctacg agtggaactt ccgcaaggac gtcaacatga tcctgcagag 21060
ctccctaggc aacgacctgc gcacggacgg ggcctccatc gccttcacca gcatcaacct 21120
ctacgccacc ttcttcccca tggcgcacaa caccgcctcc acgctcgagg ccatgctgcg 21180
caacgacacc aacgaccagt ccttcaacga ctacctctcg gcggccaaca tgctctaccc 21240
catcccggcc aacgccacca acgtgcccat ctccatcccc tcgcgcaact gggccgcctt 21300
ccgcggatgg tccttcacgc gcctgaagac ccgcgagacg ccctcgctcg gctccgggtt 21360
cgacccctac ttcgtctact cgggctccat cccctaccta gacggcacct tctacctcaa 21420
ccacaccttc aagaaggtct ccatcacctt cgactcctcc gtcagctggc ccggcaacga 21480
ccgcctcctg acgcccaacg agttcgaaat caagcgcacc gtcgacggag agggatacaa 21540
cgtggcccag tgcaacatga ccaaggactg gttcctggtc cagatgctgg cccactacaa 21600
catcggctac cagggcttct acgtgcccga gggctacaag gaccgcatgt actccttctt 21660
ccgcaacttc cagcccatga gccgccaggt cgtggacgag gtcaactaca aggactacca 21720
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catgcgccag ggccagccct accccgccaa ctacccctac ccgctcatcg gcaagagcgc 21840
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caactccgcc cacgcgctag acatgaattt cgaagtcgac cccatggatg agtccaccct 22020
tctctatgtt gtcttcgaag tcttcgacgt cgtccgagtg caccagcccc accgcggcgt 22080
catcgaagcc gtctacctgc gcacgccctt ctcggccggc aacgccacca cctaagccgc 22140
tcttgcttct tgcaagatga cggcgggctc cggcgagcag gagctcaggg ccatcctccg 22200
cgacctgggc tgcgggccct gcttcctggg caccttcgac aagcgcttcc ctggattcat 22260
ggccccgcac aagctggcct gcgccatcgt gaacacggcc ggccgcgaga ccgggggcga 22320
gcactggctg gccttcgcct ggaacccgcg ctcccacaca tgctacctct tcgacccctt 22380
cgggttctcg gacgagcgcc tcaagcagat ctaccagttc gagtacgagg gcctgctgcg 22440
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gcagggtccg cgctcggccg cctgcgggct cttctgctgc atgttcctgc acgccttcgt 22560
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caacggcatg ctccagtcgc cccaggtgga acccaccctg cgccgcaacc aggaagcgct 22680
ctaccgcttc ctcaatgccc actccgccta ctttcgctcc caccgcgcgc gcatcgagaa 22740
ggccaccgcc ttcgaccgca tgaatcaaga catgtaaaaa accggtgtgt gtatgtgaat 22800
gctttattca taataaacag cacatgttta tgccaccttc tctgaggctc tgactttatt 22860
tagaaatcga aggggttctg ccggctctcg gcatggcccg cgggcaggga tacgttgcgg 22920
aactggtact tgggcagcca cttgaactcg gggatcagca gcttgggcac ggggaggtcg 22980
gggaacgagt cgctccacag cttgcgcgtg agttgcaggg cgcccagcag gtcgggcgcg 23040
gagatcttga aatcgcagtt gggacccgcg ttctgcgcgc gagagttgcg gtacacgggg 23100
ttgcagcact ggaacaccat cagggccggg tgcttcacgc ttgccagcac cgtcgcgtcg 23160
gtgatgccct ccacgtccag atcctcggcg ttggccatcc cgaagggggt catcttgcag 23220
gtctgccgcc ccatgctggg cacgcagccg ggcttgtggt tgcaatcgca gtgcaggggg 23280
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tccagctggc ggaaggcctg ctgcgccttg ccgccctcgg tgaagaagac cccgcaggac 23400
ttgctagaga actggttggt ggcgcagccg gcgtcgtgca cgcagcagcg cgcgtcgttg 23460
ttggccagct gcaccacgct gcgcccccag cggttctggg tgatcttggc ccggttgggg 23520
ttctccttca gcgcgcgctg cccgttctcg ctcgccacat ccatctcgat agtgtgctcc 23580
ttctggatca tcacggtccc gtgcaggcac cgcagcttgc cctcggcttc ggtgcagccg 23640
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gtcagcggga tgccgcggtg ctcctcgttc acatacaggt ggcagatgcg gcggtacacc 23820
tcgccctgct cgggcatcag ctggaaggcg gacttcaggt cgctctccac gcggtaccgg 23880
tccatcagca gcgtcatcac ttccatgccc ttctcccagg ccgaaacgat cggcaggctc 23940
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tcgtccaggg tctcaaacac tcgcttgccg tccttctcga tgatgcgcac ggggggaaag 24060
ctgaagccca cggccgccag ctcctcctcg gcctgccttt cgtcctcgct gtcctggctg 24120
atgtcttgca aaggcacatg cttggtcttg cggggtttct ttttgggcgg cagaggcggc 24180
ggcgatgtgc tgggagagcg cgagttctcg ttcaccacga ctatttcttc ttcttggccg 24240
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cggcgctgct ctgactgact tcctccgcgg ccggccattg tgttctccta gggagcaaca 24420
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gtcaaggacg cgctgctcga ccgcgccgag gtgcccctca gcgtggcgga gctcagccgc 24840
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tgtgagccca acccgcgcct caacttctac ccggtcttcg cggtgcccga ggccctggcc 24960
acctaccacc tctttttcaa gaaccaaagg atccccgtct cctgccgcgc caaccgcacc 25020
cgcgccgacg ccctgctcaa cctgggcccc ggcgcccgcc tacctgatat cacctccttg 25080
gaagaggttc ccaagatctt cgagggtctg ggcagcgacg agactcgggc cgcgaacgct 25140
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gtcagcgacg agcagctggc gcgctggctg ggagcgagta gcacccccca gagcctggaa 25440
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cgcttctttg ccgacgcgga gaccctgcgc aaggtcgagg agaacctgca ctacctcttc 25560
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tcctacatgg gcatcctgca cgagaaccgc ctggggcaaa acgtgctgca caccaccctg 25680
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tgcaagctcc tgcagaagaa cctcaaggcc ctgtggaccg ggttcgacga gcgtaccacc 25860
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ctgaaactca ccccggggct gtggacctcg gcctacttgc gcaagttcgt gcccgaggac 26340
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tcggcctgcg tcatcaccca gggggccatc ctggcccaat tgcaagccat ccagaaatcc 26460
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gctgccgccg ccggaggatt tggaggaaga ctgggagagc agtcaggcag aggaggagga 26640
gatggaagac tgggacagca ctcaggcaga ggaggacagc ctgcaagaca gtctggagga 26700
ggaagacgag gtggaggagg cagaggaaga agcagccgcc gccagaccgt cgtcctcggc 26760
ggagaaagca agcagcacgg ataccatctc cgctccgggt cggggtcgcg gcggccgggc 26820
ccacagtagg tgggacgaga ccgggcgctt cccgaacccc accacccaga ccggtaagaa 26880
ggagcggcag ggatacaagt cctggcgggg gcacaaaaac gccatcgtct cctgcttgca 26940
agcctgcggg ggcaacatct ccttcacccg gcgctacctg ctcttccacc gcggggtgaa 27000
cttcccccgc aacatcttgc attactaccg tcacctccac agcccctact actgtttcca 27060
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ggaaccggat ctttcccacc ctctatgcca tcttccagca gagtcggggg caggagcagg 27240
aactgaaagt caagaaccgt tctctgcgct cgctcacccg cagttgtctg tatcacaaga 27300
gcgaagacca acttcagcgc actctcgagg acgccgaggc tctcttcaac aagtactgcg 27360
cgctcactct taaagagtag cccgcgcccg cccacacacg gaaaaaggcg ggaattacgt 27420
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gaactggctc agtgccgggc ccgcgatgat ctcacgggtg aatgacatcc gcgcccaccg 27600
aaaccagata ctcctagaac agtcagcgat caccgccacg ccccgccatc accttaatcc 27660
gcgtaattgg cccgccgccc tggtgtacca ggaaattccc cagcccacga ccgtactact 27720
tccgcgagac gcccaggccg aagtccagct gactaactca ggtgtccagc tggccggcgg 27780
cgccgccctg tgtcgtcacc gccccgctca gggtataaag cggctggtga tccgaggcag 27840
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cttccaactc gccggatcgg ggagatcttc cttcacgcct cgtcaggccg tcctgacttt 27960
ggagagttcg tcctcgcagc cccgctcggg cggcatcggc actctccagt tcgtggagga 28020
gttcactccc tcggtctact tcaacccctt ctccggctcc cccggccact acccggacga 28080
gttcatcccg aacttcgacg ccatcagcga gtcggtggac ggctacgatt gaatgtccca 28140
tggtggcgca gctgacctag ctcggcttcg acacctggac cactgccgcc gcttccgctg 28200
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cttcagccag cgaccgatcc tggtcgagcg cgaacaagga cagacccttc ttactttgta 28380
ctgcatctgc aaccaccccg gcctgcatga aagtctttgt tgtctgctgt gtactgagta 28440
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ccttccacct gatcccgaat accacagcgc cgctccccgc tactaacaac caaactaccc 28800
accaacgcca ccgtcgcgac ctttcctctg aatctaatac cactaccgga ggtggcttct 28860
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ctcctttgtg atttacccct gctttgactt tggttggaac tcgccagagg cgctctatct 29100
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gctccccgct attagttact tcaatctaac cggcggagat gactgaccca ctggccaata 29280
acaacgtcaa cgaccttctc ctggacatgg acggccgcgc ctcggagcag cgactcgccc 29340
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tccaccagtg caagagaggc atcttctgcc tggtgaaaca ggccaagatc tcctacgagg 29460
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tccactgctc ctgcgactcc cccgactgcg tccacactct gatcaagacc ctctgcggcc 29640
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gatgatgatt taaataaaaa aaataatcat ttgatttgaa ataaagatac aatcatattg 29760
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tccatgtttt ctgccaacac cacctcactc ccctcttccc agctctggta ctgcaggccc 29880
cggcgggctg caaacttcct ccacacgctg aaggggatgt caaattcctc ctgtccctca 29940
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cgtctccgaa atttttagcc ataggacccc caggaataag agaagggcaa gccacattac 33360
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ggctagaccc ggtgatatct tccagataac tggacagaaa atcgggtaag caatttttaa 33480
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taaaaaatgt aattactccc ctcctgcaca ggcagcgaag ctcccgatcc ctccagatac 33960
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aattccgtcg accgttaaaa acatcacccg ccccgcccct aacggtcgcc gctcccgcag 34320
ccaatcacct tcctccctcc ccaaattcaa acagctcatt tgcatattaa cgcgcaccaa 34380
aagtttgagg tatattattg atgatg 34406
<210> 7
<211> 34058
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 运载体
<220>
<223> C7 010 CMV-HIV gp140 AE1
<400> 7
catcatcaat aatatacctc aaacttttgg tgcgcgttaa tatgcaaatg agctgtttga 60
atttggggag ggaggaaggt gattggccga gagacgggcg accgttaggg gcggggcggg 120
tgacgttttg atgacgtggc cgtgaggcgg agccggtttg caagttctcg tgggaaaagt 180
gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg aaatactcaa ttttcccgcg ctctctgaca 240
ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag tgaaaacggg ccattttcgc gcgaaaactg 300
aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg cgtttatggc agggaggagt atttgccgag 360
ggccgagtag actttgaccg attacgtggg ggtttcgatt accgtatttt tcacctaaat 420
ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt ttacgtacga tatcatttcc ccgaaagtgc 480
cacctgaccg taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctcc cgatccccta 540
tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tctgctccct 600
gcttgtgtgt tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa 660
ggcttgaccg acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc 720
gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 780
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 840
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 900
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 960
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 1020
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 1080
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 1140
cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 1200
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 1260
aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 1320
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 1380
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcaga 1440
agttggtcgt gaggcactgg gcaggtaagt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 1500
caatagaaac tgggcttgtc gagacagaga agactcttgc gtttctgata ggcacctatt 1560
ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca gttcaattac 1620
agctcttaaa aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg agagtgaagg 1680
ggacacagat gaattggcca aacttgtgga aatgggggac tttgatcctt gggttggtga 1740
tcatgtgtag tgcctcagac aacttgtggg ttacagttta ttatggagtt cctgtgtgga 1800
gagatgcaaa taccacccta ttttgtgcat cagatgccaa agcacatgag acagaagtgc 1860
acaatgtctg ggccacatat gcctgtgtac ccacagatcc caacccacaa gaaataccca 1920
tggaaaatgt gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaataa catggtagag caaatgcagg 1980
aggatgtaat cagtttatgg gatcaaagtc taaagccatg tgtaaagtta actcctctct 2040
gcgttacttt aatttgtacc aatgctaact tgaccaagat caacagtacc aatagcgggc 2100
ctaaagtaat aggaaatgta acagatgaag taagaaactg ttcttttaat atgaccacat 2160
tactaacaga taagaagcaa aaggtttatg cactttttta taagcttgat atagtaccaa 2220
ttgataatag taatagtagt gagtatagat taataaattg taatacttca gtcattaagc 2280
aggcttgtcc aaagatatcc tttgatccaa ttcctataca ttattgtact ccagctggtt 2340
atgcgatttt aaaatgtaat gataagaatt tcaatgggac agggccatgt aaaaatgtca 2400
gctcagtaca gtgcacacat ggaattaagc cagtggtctc aactcaatta ctgttaaatg 2460
gcagtctagc agaagaagag ataataatca gatctgaaaa tctcacaaac aatgccaaaa 2520
ccataatagt gcaccttaat aaggctgtag aaatcaattg taccagaccc tccaacaata 2580
caagaacaag tataagaata ggaccaggac aaatatttta tagaacagga gacataatag 2640
gagatataag acaagcatat tgtgaaatta atggaacaaa atggaatgaa actttaagac 2700
aggtagcaaa aaaattaaaa gagcaattta ataacacaat aaaattccag ccaccctcag 2760
gaggagatct agaaattaca atgcttcatt ttaattgtag aggggaattt ttctattgca 2820
atacaacaaa actgttcaat agtacttggg aaagaaatga gaccataaaa gggggtaatg 2880
gcaatggcaa tgacactatc atacttccat gcaggataaa gcaaatcata aacatgtggc 2940
aaggagcagg acaagcaatg tatgctcctc ccatcagtgg aataattaac tgtgtatcaa 3000
atattacagg aatactattg acaagagatg gtggtaatac taatgaaact gccgagatct 3060
tcagacctgg aggaggaaat ataaaggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag 3120
tagtacaaat tgaaccacta ggagtagcac ccaccaaggc aaagctgacg gtacaggcca 3180
gacaattatt gtctggtata gtgcaacagc aaagcaattt gctgagggct atagaggcgc 3240
agcagcatat gttgcaactc acagtctggg gcattaaaca gctccaggca agaatcctgg 3300
ctgtggaaag ctacctaaag catcaacagt tcctaggact ttggggctgc tctaacaaaa 3360
ttatctgcac cactgctgta ccctggaatt cctcttggag taataaatct tatgatgaga 3420
tttgggaaaa tatgacatgg atagaatggg agagagaaat tggcaattac acaaaccaaa 3480
tatatgatat acttacaaaa tcgcaggaac agcaggacaa aaatgaaaag gaactgttgg 3540
aattggatca atgggcaagt ctgtggaatt ggtttagcat aacaaaatgg ctgtggtaat 3600
gtacaagtaa agcggccgcc actgtgctgg atgatccgag ctcggtacct ctagagtcga 3660
cccgggcggc caaaccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 3720
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 3780
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 3840
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 3900
gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagca gatctgcaga tctgaattca 3960
tctatgtcgg gtgcggagaa agaggtaatg aaatggcatt atgggtatta tgggtctgca 4020
ttaatgaatc ggccagatat cgatatgctg gccaccgtgc atgtgacctc gcacccccgc 4080
aagacatggc ccgagttcga gcacaacgtc atgacccgat gcaatgtgca cctggggtcc 4140
cgccgaggca tgttcatgcc ctaccagtgc aacatgcaat ttgtgaaggt gctgctggag 4200
cccgatgcca tgtccagagt gagcctgacg ggggtgtttg acatgaatgt ggagctgtgg 4260
aaaattctga gatatgatga atccaagacc aggtgccggg cctgcgaatg cggaggcaag 4320
cacgccaggc ttcagcccgt gtgtgtggag gtgacggagg acctgcgacc cgatcatttg 4380
gtgttgtcct gcaacgggac ggagttcggc tccagcgggg aagaatctga ctagagtgag 4440
tagtgtttgg gggaggtgga gggcttgtat gaggggcaga atgactaaaa tctgtgtttt 4500
tctgtgtgtt gcagcagcat gagcggaagc gcctcctttg agggaggggt attcagccct 4560
tatctgacgg ggcgtctccc ctcctgggcg ggagtgcgtc agaatgtgat gggatccacg 4620
gtggacggcc ggcccgtgca gcccgcgaac tcttcaaccc tgacctacgc gaccctgagc 4680
tcctcgtccg tggacgcagc tgccgccgca gctgctgctt ccgccgccag cgccgtgcgc 4740
ggaatggccc tgggcgccgg ctactacagc tctctggtgg ccaactcgac ttccaccaat 4800
aatcccgcca gcctgaacga ggagaagctg ctgctgctga tggcccagct cgaggccctg 4860
acccagcgcc tgggcgagct gacccagcag gtggctcagc tgcaggcgga gacgcgggcc 4920
gcggttgcca cggtgaaaac caaataaaaa atgaatcaat aaataaacgg agacggttgt 4980
tgattttaac acagagtctt gaatctttat ttgatttttc gcgcgcggta ggccctggac 5040
caccggtctc gatcattgag cacccggtgg attttttcca ggacccggta gaggtgggct 5100
tggatgttga ggtacatggg catgagcccg tcccgggggt ggaggtagct ccattgcagg 5160
gcctcgtgct cgggggtggt gttgtaaatc acccagtcat agcaggggcg cagggcgtgg 5220
tgctgcacga tgtccttgag gaggagactg atggccacgg gcagcccctt ggtgtaggtg 5280
ttgacgaacc tgttgagctg ggagggatgc atgcgggggg agatgagatg catcttggcc 5340
tggatcttga gattggcgat gttcccgccc agatcccgcc gggggttcat gttgtgcagg 5400
accaccagca cggtgtatcc ggcgcacttg gggaatttgt catgcaactt ggaagggaag 5460
gcgtgaaaga atttggagac gcccttgtga ccgcccaggt tttccatgca ctcatccatg 5520
atgatggcga tgggcccgtg ggcggcggcc tgggcaaaga cgtttcgggg gtcggacaca 5580
tcgtagttgt ggtcctgggt gagctcgtca taggccattt taatgaattt ggggcggagg 5640
gtgcccgact gggggacgaa ggtgccctcg atcccggggg cgtagttgcc ctcgcagatc 5700
tgcatctccc aggccttgag ctcggagggg gggatcatgt ccacctgcgg ggcgatgaaa 5760
aaaacggttt ccggggcggg ggagatgagc tgggccgaaa gcaggttccg gagcagctgg 5820
gacttgccgc agccggtggg gccgtagatg accccgatga ccggctgcag gtggtagttg 5880
agggagagac agctgccgtc ctcgcggagg aggggggcca cctcgttcat catctcgcgc 5940
acatgcatgt tctcgcgcac gagttccgcc aggaggcgct cgccccccag cgagaggagc 6000
tcttgcagcg aggcgaagtt tttcagcggc ttgagyccgt cggccatggg cattttggag 6060
agggtctgtt gcaagagttc cagacggtcc cagagctcgg tgatgtgctc tagggcatct 6120
cgatccagca gacctcctcg tttcgcgggt tggggcgact gcgggagtag ggcaccaggc 6180
gatgggcgtc cagcgaggcc agggtccggt ccttccaggg tcgcagggtc cgcgtcagcg 6240
tggtctccgt cacggtgaag gggtgcgcgc cgggctgggc gcttgcgagg gtgcgcttca 6300
ggctcatccg gctggtcgag aaccgctccc ggtcggcgcc ctgcgcgtcg gccaggtagc 6360
aattgagcat gagttcgtag ttgagcgcct cggccgcgtg gcccttggcg cggagcttac 6420
ctttggaagt gtgtccgcag acgggacaga ggagggactt gagggcgtag agcttggggg 6480
cgaggaagac ggactcgggg gcgtaggcgt ccgcgccgca gctggcgcag acggtctcgc 6540
actccacgag ccaggtgagg tcgggccggt tggggtcaaa aacgaggttt cctccgtgct 6600
ttttgatgcg tttcttacct ctggtctcca tgagctcgtg tccccgctgg gtgacaaaga 6660
ggctgtccgt gtccccgtag accgacttta tgggccggtc ctcgagcggg gtgccgcggt 6720
cctcgtcgta gaggaacccc gcccactccg agacgaaggc ccgggtccag gccagcacga 6780
aggaggccac gtgggagggg tagcggtcgt tgtccaccag cgggtccacc ttctccaggg 6840
tatgcaagca catgtccccc tcgtccacat ccaggaaggt gattggcttg taagtgtagg 6900
ccacgtgacc gggggtcccg gccggggggg tataaaaggg ggcgggcccc tgctcgtcct 6960
cactgtcttc cggatcgctg tccaggagcg ccagctgttg gggtaggtat tccctctcga 7020
aggctggcat aacctcggca ctcaggttgt cagtttctag aaacgaggag gatttgatat 7080
tgacggtgcc gttggagacg cctttcatga gcccctcgtc catctggtca gaaaagacga 7140
tctttttgtt gtcgagcttg gtggcgaagg agccgtagag ggcgttggag aggagcttgg 7200
cgatggagcg catggtctgg ttcttttcct tgtcggcgcg ctccttggcg gcgatgttga 7260
gctgcacgta ctcgcgcgcc acgcacttcc attcggggaa gacggtggtg agctcgtcgg 7320
gcacgattct gacccgccag ccgcggttgt gcagggtgat gaggtccacg ctggtggcca 7380
cctcgccgcg caggggctcg ttggtccagc agaggcgccc gcccttgcgc gagcagaagg 7440
ggggcagcgg gtccagcatg agctcgtcgg gggggtcggc gtccacggtg aagatgccgg 7500
gcagaagctc ggggtcgaag tagctgatgc aggtgtccag atcgtccagc gccgcttgcc 7560
agtcgcgcac ggccagcgcg cgctcgtagg ggctgagggg cgtgccccag ggcatggggt 7620
gcgtgagcgc ggaggcgtac atgccgcaga tgtcgtagac gtagaggggc tcctcgagga 7680
cgccgatgta ggtggggtag cagcgccccc cgcggatgct ggcgcgcacg tagtcgtaca 7740
gctcgtgcga gggcgcgagg agccccgtgc cgaggttgga gcgttgcggc ttttcggcgc 7800
ggtagacgat ctggcggaag atggcgtggg agttggagga gatggtgggc ctctggaaga 7860
tgttgaagtg ggcgtggggc aggccgaccg agtccctgat gaagtgggcg taggagtcct 7920
gcagcttggc gacgagctcg gcggtgacga ggacgtccag ggcgcagtag tcgagggtct 7980
cttggatgat gtcgtacttg agctggccct tctgcttcca cagctcgcgg ttgagaagga 8040
actcttcgcg gtccttccag tactcttcga gggggaaccc gtcctgatcg gcacggtaag 8100
agcccaccat gtagaactgg ttgacggcct tgtaggcgca gcagcccttc tccacgggga 8160
gggcgtaagc ttgtgcggcc ttgcgcaggg aggtgtgggt gagggcgaag gtgtcgcgca 8220
ccatgacctt gaggaactgg tgcttgaagt cgaggtcgtc gcagccgccc tgctcccaga 8280
gctggaagtc cgtgcgcttc ttgtaggcgg ggttgggcaa agcgaaagta acatcgttga 8340
agaggatctt gcccgcgcgg ggcatgaagt tgcgagtgat gcggaaaggc tggggcacct 8400
cggcccggtt gttgatgacc tgggcggcga ggacgatctc gtcgaagccg ttgatgttgt 8460
gcccgacgat gtagagttcc acgaatcgcg ggcggccctt aacgtggggc agcttcttga 8520
gctcgtcgta ggtgagctcg gcggggtcgc tgagcccgtg ctgctcgagg gcccagtcgg 8580
cgacgtgggg gttggcgctg aggaaggaag tccagagatc cacggccagg gcggtctgca 8640
agcggtcccg gtactgacgg aactgctggc ccacggccat tttttcgggg gtgacgcagt 8700
agaaggtgcg ggggtcgccg tgccagcggt cccacttgag ctggagggcg aggtcgtggg 8760
cgagctcgac gagcggcggg tccccggaga gtttcatgac cagcatgaag gggacgagct 8820
gcttgccgaa ggaccccatc caggtgtagg tttccacatc gtaggtgagg aagagccttt 8880
cggtgcgagg atgcgagccg atggggaaga actggatctc ctgccaccag ttggaggaat 8940
ggctgttgat gtgatggaag tagaaatgcc gacggcgcgc cgagcactcg tgcttgtgtt 9000
tatacaagcg tccgcagtgc tcgcaacgct gcacgggatg cacgtgctgc acgagctgta 9060
cctgggttcc tttgacgagg aatttcagtg ggcagtggag cgctggcggc tgcatctggt 9120
gctgtactac gtcctggcca tcggcgtggc catcgtctgc ctcgatggtg gtcatgctga 9180
cgagcccgcg cgggaggcag gtccagactt cggctcggac gggtcggaga gcgaggacga 9240
gggcgcgcag gccggagctg tccagggtcc tgagacgctg cggagtcagg tcagtgggca 9300
gcggcggcgc gcggttgact tgcaggagct tttccagggc gcgcgggagg tccagatggt 9360
acttgatctc cacggcgccg ttggtggcga cgtccacggc ttgcagggtc ccgtgcccct 9420
ggggcgccac caccgtgccc cgtttcttct tgggcgctgc ttccatgccg gtcagaagcg 9480
gcggcgagga cgcgcgccgg gcggcagggg cggctcggga cccggaggca ggggcggcag 9540
gggcacgtcg gcgccgcgcg cgggcaggtt ctggtactgc gcccggagaa gactggcgtg 9600
agcgacgacg cgacggttga cgtcctggat ctgacgcctc tgggtgaagg ccacgggacc 9660
cgtgagtttg aacctgaaag agagttcgac agaatcaatc tcggtatcgt tgacggcggc 9720
ctgccgcagg atctcttgca cgtcgcccga gttgtcctgg taggcgatct cggtcatgaa 9780
ctgctcgatc tcctcctcct gaaggtctcc gcggccggcg cgctcgacgg tggccgcgag 9840
gtcgttggag atgcggccca tgagctgcga gaaggcgttc atgccggcct cgttccagac 9900
gcggctgtag accacggctc cgtcggggtc gcgcgcgcgc atgaccacct gggcgaggtt 9960
gagctcgacg tggcgcgtga agaccgcgta gttgcagagg cgctggtaga ggtagttgag 10020
cgtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa gtacatgatc cagcggcgga gcggcatctc 10080
gctgacgtcg cccagggctt ccaagcgctc catggcctcg tagaagtcca cggcgaagtt 10140
gaaaaactgg gagttgcgcg ccgagacggt caactcctcc tccagaagac ggatgagctc 10200
agcgatggtg gcgcgcacct cgcgctcgaa ggccccgggg ggctcctctt cttccatctc 10260
ttcctcctcc actaacatct cttctacttc ctcctcagga ggcggcggcg ggggaggggc 10320
cctgcgtcgc cggcggcgca cgggcagacg gtcgatgaag cgctcgatgg tctccccgcg 10380
ccggcgacgc atggtctcgg tgacggcgcg cccgtcctcg cggggccgca gcgtgaagac 10440
gccgccgcgc atctccaggt ggccgccggg ggggtctccg ttgggcaggg agagggcgct 10500
gacgatgcat cttatcaatt ggcccgtagg gactccgcgc aaggacctga gcgtctcgag 10560
atccacggga tccgaaaacc gctgaacgaa ggcttcgagc cagtcgcagt cgcaaggtag 10620
gctgagcccg gtttcttgtt cttcggggat ttcgggaggc gggcgggcga tgctgctggt 10680
gatgaagttg aagtaggcgg tcctgagacg gcggatggtg gcgaggagca ccaggtcctt 10740
gggcccggct tgctggatgc gcagacggtc ggccatgccc caggcgtggt cctgacacct 10800
ggcgaggtcc ttgtagtagt cctgcatgag ccgctccacg ggcacctcct cctcgcccgc 10860
gcggccgtgc atgcgcgtga gcccgaaccc gcgctggggc tggacgagcg ccaggtcggc 10920
gacgacgcgc tcggcgagga tggcctgctg tatctgggtg agggtggtct ggaagtcgtc 10980
gaagtcgacg aagcggtggt aggctccggt gttgatggta taggagcagt tggccatgac 11040
ggaccagttg acggtctggt ggccgggtcg cacgagctcg tggtacttga ggcgcgagta 11100
ggcgcgcgtg tcgaagatgt agtcgttgca ggtgcgcacg aggtactggt atccgacgag 11160
gaagtgcggc ggcggctggc ggtagagcgg ccatcgctcg gtggcggggg cgccgggcgc 11220
gaggtcctcg agcatgaggc ggtggtagcc gtagatgtac ctggacatcc aggtgatgcc 11280
ggcggcggtg gtggaggcgc gcgggaactc gcggacgcgg ttccagatgt tgcgcagcgg 11340
caggaagtag ttcatggtgg ccgcggtctg gcccgtgagg cgcgcgcagt cgtggatgct 11400
ctagacatac gggcaaaaac gaaagcggtc agcggctcga ctccgtggcc tggaggctaa 11460
gcgaacgggt tgggctgcgc gtgtaccccg gttcgaatct cgaatcaggc tggagccgca 11520
gctaacgtgg tactggcact cccgtctcga cccaagcctg ctaacgaaac ctccaggata 11580
cggaggcggg tcgttttttg gccttggtcg ctggtcatga aaaactagta agcgcggaaa 11640
gcgaccgccc gcgatggctc gctgccgtag tctggagaaa gaatcgccag ggttgcgttg 11700
cggtgtgccc cggttcgagc ctcagcgctc ggcgccggcc ggattccgcg gctaacgtgg 11760
gcgtggctgc cccgtcgttt ccaagacccc ttagccagcc gacttctcca gttacggagc 11820
gagcccctct ttttcttgtg tttttgccag atgcatcccg tactgcggca gatgcgcccc 11880
caccctccac ctcaaccgcc cctaccgccg cagcagcagc aacagccggc gcttctgccc 11940
ccgccccagc agcagccagc cactaccgcg gcggccgccg tgagcggagc cggcgttcag 12000
tatgacctgg ccttggaaga gggcgagggg ctggcgcggc tgggggcgtc gtcgccggag 12060
cggcacccgc gcgtgcagat gaaaagggac gctcgcgagg cctacgtgcc caagcagaac 12120
ctgttcagag acaggagcgg cgaggagccc gaggagatgc gcgcctcccg cttccacgcg 12180
gggcgggagc tgcggcgcgg cctggaccga aagcgggtgc tgagggacga ggatttcgag 12240
gcggacgagc tgacggggat cagccccgcg cgcgcgcacg tggccgcggc caacctggtc 12300
acggcgtacg agcagaccgt gaaggaggag agcaacttcc aaaaatcctt caacaaccac 12360
gtgcgcacgc tgatcgcgcg cgaggaggtg accctgggcc tgatgcacct gtgggacctg 12420
ctggaggcca tcgtgcagaa ccccacgagc aagccgctga cggcgcagct gtttctggtg 12480
gtgcagcaca gtcgggacaa cgagacgttc agggaggcgc tgctgaatat caccgagccc 12540
gagggccgct ggctcctgga cctggtgaac attctgcaga gcatcgtggt gcaggagcgc 12600
gggctgccgc tgtccgagaa gctggcggct atcaacttct cggtgctgag cctgggcaag 12660
tactacgcta ggaagatcta caagaccccg tacgtgccca tagacaagga ggtgaagatc 12720
gacgggtttt acatgcgcat gaccctgaaa gtgctgaccc tgagcgacga tctgggggtg 12780
taccgcaacg acaggatgca ccgcgcggtg agcgccagcc gccggcgcga gctgagcgac 12840
caggagctga tgcacagcct gcagcgggcc ctgaccgggg ccgggaccga gggggagagc 12900
tactttgaca tgggcgcgga cctgcgctgg cagcccagcc gccgggcctt ggaagctgcc 12960
ggcggttccc cctacgtgga ggaggtggac gatgaggagg aggagggcga gtacctggaa 13020
gactgatggc gcgaccgtat ttttgctaga tgcagcaaca gccaccgcct cctgatcccg 13080
cgatgcgggc ggcgctgcag agccagccgt ccggcattaa ctcctcggac gattggaccc 13140
aggccatgca acgcatcatg gcgctgacga cccgcaatcc cgaagccttt agacagcagc 13200
ctcaggccaa ccggctctcg gccatcctgg aggccgtggt gccctcgcgc tcgaacccca 13260
cgcacgagaa ggtgctggcc atcgtgaacg cgctggtgga gaacaaggcc atccgcggcg 13320
acgaggccgg gctggtgtac aacgcgctgc tggagcgcgt ggcccgctac aacagcacca 13380
acgtgcagac gaacctggac cgcatggtga ccgacgtgcg cgaggcggtg tcgcagcgcg 13440
agcggttcca ccgcgagtcg aacctgggct ccatggtggc gctgaacgcc ttcctgagca 13500
cgcagcccgc caacgtgccc cggggccagg aggactacac caacttcatc agcgcgctgc 13560
ggctgatggt ggccgaggtg ccccagagcg aggtgtacca gtcggggccg gactacttct 13620
tccagaccag tcgccagggc ttgcagaccg tgaacctgag ccaggctttc aagaacttgc 13680
agggactgtg gggcgtgcag gccccggtcg gggaccgcgc gacggtgtcg agcctgctga 13740
cgccgaactc gcgcctgctg ctgctgctgg tggcgccctt cacggacagc ggcagcgtga 13800
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cggcgaacga gccggcgcag acccgggagc tgaggaaccg gatctttccc accctctatg 27180
ccatcttcca gcagagtcgg gggcaagagc aggaactgaa agtcaagaac cgttctctgc 27240
gctcgctcac ccgcagttgt ctgtatcaca agagcgaaga ccaacttcag cgcactctcg 27300
aggacgccga ggctctcttc aacaagtact gcgcgctcac tcttaaagag tagcccgcgc 27360
ccgcccacac acggaaaaag gcgggaatta cgtcaccacc tgcgcccttc gcccgaccat 27420
catcatgagc aaagagattc ccacgcctta catgtggagc taccagcccc agatgggcct 27480
ggccgccggc gccgcccagg actactccac ccgcatgaac tggctcagtg ccgggcccgc 27540
gatgatctca cgggtgaatg acatccgcgc ccaccgaaac cagatactcc tagaacagtc 27600
agcgatcacc gccacgcccc gccatcacct taatccgcgt aattggcccg ccgccctggt 27660
gtaccaggaa attccccagc ccacgaccgt actacttccg cgagacgccc aggccgaagt 27720
ccagctgact aactcaggtg tccagctggc cggcggcgcc gccctgtgtc gtcaccgccc 27780
cgctcagggt ataaagcggc tggtgatccg aggcagaggc acacagctca acgacgaggt 27840
ggtgagctct tcgctgggtc tgcgacctga cggagtcttc caactcgccg gatcggggag 27900
atcttccttc acgcctcgtc aggccgtcct gactttggag agttcgtcct cgcagccccg 27960
ctcgggtggc atcggcactc tccagttcgt ggaggagttc actccctcgg tctacttcaa 28020
ccccttctcc ggctcccccg gccactaccc ggacgagttc atcccgaact tcgacgccat 28080
cagcgagtcg gtggacggct acgattgaat gtcccatggt ggcgcggctg acctagctcg 28140
gcttcgacac ctggaccact gccgccgctt ccgctgcttc gctcgggatc tcgccgagtt 28200
tgcctacttt gagctgcccg aggagcaccc tcagggcccg gcccacggag tgcggatcgt 28260
cgtcgaaggg ggtctcgact cccacctgct tcggatcttc agccagcgtc cgatcctggc 28320
cgagcgcgag caaggacaga cccttctgac cctgtactgc atctgcaacc accccggcct 28380
gcatgaaagt ctttgttgtc tgctgtgtac tgagtataat aaaagctgag atcagcgact 28440
actccggact tccgtgtgtt cctgctatca accagtccct gttcttcacc gggaacgaga 28500
ccgagctcca gctccagtgt aagccccaca agaagtacct cacctggctg ttccagggct 28560
ctccgatcgc cgttgtcaac cactgcgaca acgacggagt cctgctgagc ggccctgcca 28620
accttacttt ttccacccgc agaagcaagc tccagctctt ccaacccttc ctccccggga 28680
cctatcagtg cgtctcggga ccctgccatc acaccttcca cctgatcccg aataccacag 28740
cgtcgctccc cgctactaac aaccaaacta cccaccaacg ccaccgtcgc gaccgcggac 28800
atgtacagag ctcgagaagt actaggccac aatacatgcc catattagac tatgaggccg 28860
agccacagcg acccatgctc cccgctatta gttacttcaa tctaaccggc ggagatgact 28920
gacccactgg ccaacaacaa cgtcaacgac cttctcctgg acatggacgg ccgcgcctcg 28980
gagcagcgac tcgcccaact tcgcattcgc cagcagcagg agagagccgt caaggagctg 29040
caggacggca tagccatcca ccagtgcaag aaaggcatct tctgcctggt gaaacaggcc 29100
aagatctcct acgaggtcac cccgaccgac catcgcctct cctacgagct cctgcagcag 29160
cgccagaagt tcacctgcct ggtcggagtc aaccccatcg tcatcaccca gcagtcgggc 29220
gataccaagg ggtgcatcca ctgctcctgc gactcccccg actgcgtcca cactctgatc 29280
aagaccctct gcggcctccg cgacctcctc cccatgaact aatcaccccc ttatccagtg 29340
aaataaatat catattgatg atgatttaaa taaaaaataa tcatttgatt tgaaataaag 29400
atacaatcat attgatgatt tgagttttaa aaaataaaga atcacttact tgaaatctga 29460
taccaggtct ctgtccatgt tttctgccaa caccacctca ctcccctctt cccagctctg 29520
gtactgcaga ccccggcggg ctgcaaactt cctccacacg ctgaagggga tgtcaaattc 29580
ctcctgtccc tcaatcttca ttttatcttc tatcagatgt ccaaaaagcg cgtccgggtg 29640
gatgatgact tcgaccccgt ctacccctac gatgcagaca acgcaccgac cgtgcccttc 29700
atcaaccccc ccttcgtctc ttcagatgga ttccaagaga agcccctggg ggtgctgtcc 29760
ctgcgactgg ctgaccccgt caccaccaag aacggggaaa tcaccctcaa gctgggagag 29820
ggggtggacc tcgactcctc gggaaaactc atctccaaca cggccaccaa ggccgccgcc 29880
cctctcagtt tttccaacaa caccatttcc cttaacatgg atacccctct ttataccaaa 29940
gatggaaaat tatccttaca agtttctcca ccgttaaaca tattaaaatc aaccattctg 30000
aacacattag ctgtagctta tggatcaggt ttaggactga gtggtggcac tgctcttgca 30060
gtacagttgg cctctccact cacttttgat gaaaaaggaa atattaaaat taacctagcc 30120
agtggtccat taacagttga tgcaagtcga cttagtatca actgcaaaag aggggtcact 30180
gtcactacct caggagatgc aattgaaagc aacataagct ggcctaaagg tataagattt 30240
gaaggtaatg gcatagctgc aaacattggc agaggattgg aatttggaac cactagtaca 30300
gagactgatg tcacagatgc atacccaatt caagttaaat tgggtactgg ccttaccttt 30360
gacagtacag gcgccattgt tgcttggaac aaagaggatg ataaacttac attatggacc 30420
acagccgacc cctcgccaaa ttgcaaaata tactctgaaa aagatgccaa actcacactt 30480
tgcttgacaa agtgtggaag tcaaattctg ggtactgtga ctgtattggc agtgaataat 30540
ggaagtctca acccaatcac aaacacagta agcactgcac tcgtctccct caagtttgat 30600
gcaagtggag ttttgctaag cagctccaca ttagacaaag aatattggaa cttcagaaag 30660
ggagatgtta cacctgctga gccctatact aatgctatag gttttatgcc taacataaag 30720
gcctatccta aaaacacatc tgcagcttca aaaagccata ttgtcagtca agtttatctc 30780
aatggggatg aggccaaacc actgatgctg attattactt ttaatgaaac tgaggatgca 30840
acttgcacct acagtatcac ttttcaatgg aaatgggata gtactaagta cacaggtgaa 30900
acacttgcta ccagctcctt caccttctcc tacatcgccc aagaatgaac actgtatccc 30960
accctgcatg ccaacccttc ccaccccact ctgtctatgg aaaaaactct gaagcacaaa 31020
ataaaataaa gttcaagtgt tttattgatt caacagtttt acaggattcg agcagttatt 31080
tttcctccac cctcccagga catggaatac accaccctct ccccccgcac agccttgaac 31140
atctgaatgc cattggtgat ggacatgctt ttggtctcca cgttccacac agtttcagag 31200
cgagccagtc tcgggtcggt cagggagatg aaaccctccg ggcactcccg catctgcacc 31260
tcacagctca acagctgagg attgtcctcg gtggtcggga tcacggttat ctggaagaag 31320
cagaagagcg gcggtgggaa tcatagtccg cgaacgggat cggccggtgg tgtcgcatca 31380
ggccccgcag cagtcgctgc cgccgccgct ccgtcaagct gctgctcagg gggtccgggt 31440
ccagggactc cctcagcatg atgcccacgg ccctcagcat cagtcgtctg gtgcggcggg 31500
cgcagcagcg catgcggatc tcgctcaggt cgctgcagta cgtgcaacac aggaccacca 31560
ggttgttcaa cagtccatag ttcaacacgc tccagccgaa actcatcgcg ggaaggatgc 31620
tacccacgtg gccgtcgtac cagatcctca ggtaaatcaa gtggcgctcc ctccagaaca 31680
cgctgcccac gtacatgatc tccttgggca tgtggcggtt caccacctcc cggtaccaca 31740
tcaccctctg gttgaacatg cagccccgga tgatcctgcg gaaccacagg gccagcaccg 31800
ccccgcccgc catgcagcga agagaccccg ggtcccggca atggcaatgg aggacccacc 31860
gctcgtaccc gtggatcatc tgggagctga acaagtctat gttggcacag cacaggcata 31920
tgctcatgca tctcttcagc actctcagct cctcgggggt caaaaccata tcccagggca 31980
cggggaactc ttgcaggaca gcgaaccccg cagaacaggg caatcctcgc acataactta 32040
cattgtgcat ggacagggta tcgcaatcag gcagcaccgg gtgatcctcc accagagaag 32100
cgcgggtctc ggtctcctca cagcgtggta agggggccgg ccgatacggg tgatggcggg 32160
acgcggctga tcgtgttcgc gaccgtgtca tgatgcagtt gctttcggac attttcgtac 32220
ttgctgtagc agaacctggt ccgggcgctg cacaccgatc gccggcggcg gtcccggcgc 32280
ttggaacgct cggtgttgaa attgtaaaac agccactctc tcagaccgtg cagcagatct 32340
agggcctcag gagtgatgaa gatcccatca tgcctgatag ctctgatcac atcgaccacc 32400
gtggaatggg ccagacccag ccagatgatg caattttgtt gggtttcggt gacggcgggg 32460
gagggaagaa caggaagaac catgattaac ttttaatcca aacggtctcg gagcacttca 32520
aaatgaaggt cgcggagatg gcacctctcg cccccgctgt gttggtggaa aataacagcc 32580
aggtcaaagg tgatacggtt ctcgagatgt tccacggtgg cttccagcaa agcctccacg 32640
cgcacatcca gaaacaagac aatagcgaaa gcgggagggt tctctaattc ctcaatcatc 32700
atgttacact cctgcaccat ccccagataa ttttcatttt tccagccttg aatgattcga 32760
actagttcct gaggtaaatc caagccagcc atgataaaga gctcgcgcag agcgccctcc 32820
accggcattc ttaagcacac cctcataatt ccaagatatt ctgctcctgg ttcacctgca 32880
gcagattgac aagcggaata tcaaaatctc tgccgcgatc cctaagctcc tccctcagca 32940
ataactgtaa gtactctttc atatcctctc cgaaattttt agccatagga ccaccaggaa 33000
taagattagg gcaagccaca gtacagataa accgaagtcc tccccagtga gcattgccaa 33060
atgcaagact gctataagca tgctggctag acccggtgat atcttccaga taactggaca 33120
gaaaatcacc caggcaattt ttaagaaaat caacaaaaga aaaatcctcc aggtgcacgt 33180
ttagagcctc gggaacaacg atgaagtaaa tgcaagcggt gcgttccagc atggttagtt 33240
agctgatctg taaaaaacaa aaaataaaac attaaaccat gctagcctgg cgaacaggtg 33300
ggtaaatcgt tctctccagc accaggcagg ccacggggtc tccggcgcga ccctcgtaaa 33360
aattgtcgct atgattgaaa accatcacag agagacgttc ccggtggccg gcgtgaatga 33420
ttcgacaaga tgaatacacc cccggaacat tggcgtccgc gagtgaaaaa aagcgcccga 33480
ggaagcaata aggcactaca atgctcagtc tcaagtccag caaagcgatg ccatgcggat 33540
gaagcacaaa atcctcaggt gcgtacaaaa tgtaattact cccctcctgc acaggcagcg 33600
aagcccccga tccctccaga tacacataca aagcctcagc gtccatagct taccgagcag 33660
cagcacacaa caggcgcaag agtcagagaa aggctgagct ctaacctgtc cacccgctct 33720
ctgctcaata tatagcccag atctacactg acgtaaaggc caaagtctaa aaatacccgc 33780
caaataatca cacacgccca gcacacgccc agaaaccggt gacacactca aaaaaatacg 33840
cgcacttcct caaacgccca aactgccgtc atttccgggt tcccacgcta cgtcatcgga 33900
attcgacttt caaattccgt cgaccgttaa aaacgtcacc cgccccgccc ctaacggtcg 33960
cccgtctctc ggccaatcac cttcctccct ccccaaattc aaacagctca tttgcatatt 34020
aacgcgcacc aaaagtttga ggtatattat tgatgatg 34058

Claims (39)

1.包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中所述核酸序列进一步包含含有与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子序列的表达盒，其中所述异源蛋白质为选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；
其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和
其中Gag来自中国HIV进化枝B。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述表达盒位于所述早期基因E1基因组区中。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述表达盒包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中整个早期基因E3基因组区被缺失。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述启动子是组成型启动子。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述启动子是巨细胞病毒即时早期启动子(CMV)。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
9.包含根据权利要求1所述的组合物的蛋白质表达系统，其中所述核酸序列包含SEQID NO:6或7。
10.包含根据权利要求1-7中任一项所述的组合物的蛋白质表达系统，其中所述表达盒编码的所述异源蛋白质包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
11.包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中所述核酸序列进一步包含含有与异源蛋白质的序列可操作地连接的组成型启动子的表达盒，其中所述表达盒位于所述早期基因E1基因组区中，其中所述异源蛋白质为选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；
其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和
其中Gag来自中国HIV进化枝B。
12.根据权利要求所述的组合物11，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
13.包含根据权利要求11-12中任一项所述的组合物的蛋白质表达系统，其中所述表达盒编码的所述异源蛋白质包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
14.引发哺乳动物中针对异源蛋白质的免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用包含血清型AdC6或AdC7的黑猩猩来源的腺病毒载体的核酸序列的组合物，其中早期基因E1基因组区被缺失，和其中所述核酸序列进一步包含含有与编码异源蛋白质的序列可操作地连接的启动子的表达盒，其中所述异源蛋白质为选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；
其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和
其中Gag来自中国HIV进化枝B。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达盒位于所述早期基因E1区中。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达盒包含嵌合内含子和/或CMV增强子。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中由ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、和ORF7组成的早期基因E3基因组区被缺失。
18.根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中整个早期基因E3基因组区被缺失。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
20.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒即时早期启动子(CMV)。
21.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:6或7。
22.治疗和/或预防哺乳动物中HIV的方法，所述方法包括施用治疗有效量的由包含SEQID NO:6或7的核酸序列编码的组合物。
23.针对HIV感染为哺乳动物接种疫苗的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的施用引发所述哺乳动物的免疫应答。
24.根据权利要求23所述的方法，其中为所述哺乳动物预防性施用所述组合物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中为所述哺乳动物治疗性施用所述组合物。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述组合物与佐剂组合施用。
27.产生对哺乳动物中异源蛋白质的效应和记忆T细胞免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：(a)以有效引发哺乳动物中免疫应答的量向所述哺乳动物施用根据权利要求1所述的组合物；(b)在第二随后的时间段施用第二有效量的根据权利要求1所述的组合物，其中针对所述异源蛋白质的T记忆细胞在所述哺乳动物中被重新活化。
28.根据权利要求27所述的方法，其中在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的所述组合物包括选自gp140和Gag的相同或不同的HIV异源蛋白质。
29.根据权利要求27所述的方法，其中在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的所述组合物是选自AdC6和AdC7的相同或不同血清型。
30.根据权利要求27所述的方法，其中在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的所述组合物具有相同或不同的HIV进化枝。
31.根据权利要求27所述的方法，进一步包括向所述哺乳动物施用免疫原的步骤。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫原包含异源蛋白质，其中所述异源蛋白质为选自gp140和Gag的至少一种HIV蛋白质；其中gp140来自选自B、AE、BC和C的中国HIV进化枝；和其中Gag来自中国HIV进化枝B，其中B细胞免疫应答被进一步扩大。
33.产生对哺乳动物中异源蛋白质的适应性B细胞免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：(a)以有效引发哺乳动物中免疫应答的量向所述哺乳动物施用根据权利要求1所述的组合物；(b)在第二随后的时间段施用第二有效量的根据权利要求1所述的组合物，其中针对异源蛋白质的B记忆细胞在哺乳动物中被重新活化。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的所述组合物包括选自gp140和Gag的相同或不同的HIV异源蛋白质。
35.根据权利要求33所述的方法，其中在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的组合物具有选自AdC6和AdC7的相同或不同血清型。
36.根据权利要求33所述的方法，其中在(a)中第一施用和在(b)中第二施用的所述组合物具有相同或不同的HIV进化枝。
37.根据权利要求33所述的方法，进一步包括向所述哺乳动物施用免疫原的步骤。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述免疫原包含异源蛋白质，其中所述异源蛋白质是选自任意来源的任何进化枝的至少一种HIV env蛋白质，其中所述B细胞免疫应答被进一步扩大。
39.根据权利要求14、22、23、27和33中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
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