NO332692B1 - Rekombinant adenovirus, sammensetning inneholdende denne, isolert vertscelle samt anvendelse for fremstilling av et medikament - Google Patents

Abstract

Det beskrives en rekombinant vektor omfattende simianadenovirussekvenser og heterologt gen under kontroll av regulatoriske sekvenser. Det beskrives videre en cellelinje som uttrykker ett eller flere simianadenovirusgener. Det beskrives fremgangsmåter for anvendelse av vektorene og cellelinjene.

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Adenovirus er et dobbeltrådet DNA-virus med genomstørrelse på rundt 36 kilobaser (kb), som har funnet utstrakt anvendelse for genoverføringsapplikasjoner pga. dets evne til å oppnå meget effektiv genoverføring i en varietet av målvev, og har stor transgenkapasitet. Konvensjonelt blir El-gener av adenovirus deletert og erstattet med en transgenkassett bestående av den valgte promoter, cDNA-sekvensen fra genet av interesse og et poly-A-signal, som resulterer i et replikasjonsdefekt, rekombinant virus. Adenovirus har en karakteristisk morfologi med et icosahedralkapsid bestående av tre hovedproteiner, hexon (II), pentonbaser (III) og en knoppet (knobbed) fiber (IV), sammen med et antall andre mindre proteiner, VI, VIII, IX, Illa og IVa2 [W. C. Russel, J. Gen. Virol, F81: 2573-2604 (Nov. 2000)]. Virusgenomet er et lineært, dobbeltrådet DNA med et terminalprotein festet kovalent ved 5' ende, som har inverterte terminalrepetisjoner (ITR). Virus-DNA er tett assosiert med det sterkt basiske protein-VII og et lite peptid kalt mu. Et annet protein, V, er pakket med dette DNA-proteinkompleks og gir en strukturell forbindelse til kapsidet via protein-VI. Viruset inneholder også en viruskodet protease, som er nødvendig for prosessering av noen av de strukturelle proteiner for å gi modent, infeksiøst virus.

Rekombinante adenovirus er beskrevet for avlevering til molekyler hos vertsceller. Se U.S. patent nr. 6 083 716, som beskriver genomet av to sjimpanse-adenovirus.

Det er et behov innen teknikken for mer effektive vektorer, som unngår effekten av tidligere eksisterende immunitet mot valgte adenovirusserotyper i populasjonen, og/eller som er brukbare for gjentatt administrering og for titerforsterkning ved den andre vaksinasjonen, om dette er nødvendig.

O ppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante adenovirus og isolerte nukleinsyresekvenser og aminosyresekvenser av simianadenovirus, og cellelinjer som uttrykker adenovirusgener. Tilveiebrakt er også anvendelse av rekombinante adenovirus ifølge foreliggende oppfinnelse.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan involvere avlevering av ett eller flere utvalgte heterologe gener til en pattedyrpasient ved tilførsel av en vektor ifølge oppfinnelsen. Fordi de forskjellige vektorkonstruksjoner er avledet fra simian-adenovirus og ikke fra humant adenovirus, blir immunsystemet hos den ikke-simian humane- eller veterinærpasient ikke primet til å respondere umiddelbart på vektoren som et fremmed antigen. Anvendelsen av preparatene ifølge oppfinnelsen tillater således mer stabil ekspresjon av det valgte transgen, når dette tilføres til en ikke-simian pasient. Ifølge oppfinnelsen tillater anvendelsen av preparatene for vaksinasjon, presentasjon av et utvalgt antigen for å frembringe beskyttende immunresponser. Uten ønske om å være bundet av noen teori, er adenovirusenes evner ifølge oppfinnelsen til å transdusere humandendrittiske celler i det minste delvis ansvarlig for evnen hos de rekombinante konstruksjoner ifølge oppfinnelsen til å indusere en immunrespons. De rekombinante simianadenovirus ifølge oppfinnelsen kan også anvendes for produksjon av heterologe genprodukter in vitro. Slike genprodukter er i seg selv anvendelige i et antall formål, som beskrevet her.

Disse og andre utførelsesformer og fordeler ved oppfinnelsen er beskrevet mer detaljert nedenfor.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser en oppstilling av aminosyresekvensene av LI- og en del av L2-løkkene i kapsidproteinhexon av sjimpanseadenovirus Cl [SEKV. ID nr. 13], sjimpanseadenovirus C68 (Pan9) [SEKV. ID nr. 14], og de nye Pan5 [SEKV. ID nr. 15], Pan6 [SEKV. ID nr. 16] og Pan7 [SEKV. ID nr. 17]

sjimpanseadenovirussekvensene. Det intervenerende bevarte området er en del av pidestall-doménet som er bevart mellom adenovirusserotypene.

Figur 2 viser en oppstilling av aminosyresekvensene av fiberknoppdoménene av sjimpanse-C68 (Pan-9) [SEKV. ID nr. 18], Pan6 [SEKV. ID nr. 19], Pan7 [SEKV. ID nr. 20] og Pan5 [SEKV. ID nr. 21], og de humane adenovirusserotypene 2 [SEKV. ID nr. 22] og 5 [SEKV. ID nr. 23].

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse omfatter rekombinant adenovirus, kjennetegnet ved at det har et kapsid som omfatter AdPan7 hexon protein som har aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 11, et fiber protein og et penton protein, der nevnte fiber og penton protein er individuelt avledet fra human eller simian opprinnelse, hvor adenoviruset ytterligere omfatter adenovirussekvenser funksjonelt deletert i Ela og/eller Elb genene, 5' og 3' adenovirus cis-elemeter nødvendig for replikasjon og "encapsidation" og en transgen heterolog til adenoviruset og operativt koblet til sekvenser som styrer ekspresjon av nevnte gen i en vertscelle.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også isolert vertcelle, kjennetegnet ved at den omfatter et rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 9.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter et rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helt av kravene 1 til 9 og én farmasøytisk akseptabel bærer.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også anvendelse av en rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av et medikament formulert for å fremkalle en immunrespons mot et infeksiøst agens i en pattedyrsvert, hvori nevnte transgene eller heterologe sekvens koder for et antigen til det infeksiøse middelet.

Utførelsesformer av rekombinant adenovirus i følge foreliggende oppfinnelse kan omfatte: Rekombinant adenovirus i følge krav 1, der fiber proteinet er AdPan7 fiber proteinfragmentet fra SEQ ID NO: 20.

Rekombinant adenovirus i følge krav 1, der fiber proteinet er AdPan7 fiber proteinet fra SEQ ID NO: 12.

Rekombinant adenovirus i følge krav et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der penton proteinet er etAdPan7 penton protein.

Rekombinant adenovirus i følge krav et hvilket som helst av kravene 1 til 4, der kapsidet er et AdPan7 kapsid.

Rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1-5, der nevnte rekombinante adenovirus er et pseudotype adenovirus omfattende 5' og 3' adenovirus cis-elementer nødvendige for replikasjon og "encapsidation ", hvor nevnte cis-elementer omfatter et adenovirus 5' invertert terminal repetisjon og en adenovirus 3' invertert terminal repetisjon fra en adenovirus heterologt til AdPan7.

Rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene ltil 6, der kapsidet som omfatter et hexon som inneholder et fragment av AdPan7 hexon protein, et fiber protein, og et penton protein, hvor nevnte fiber og penton protein er avledet fra human eller simian opprinnelse, der adenoviruset ytterligere omfatter adenovirus sekvenser funksjonelt deletert i Ela og/eller Elb genene, og en nukleinsyre sekvens heterolog til AdPan7, hvori fragmentet av AdPan7 hexon proteinet er et N-terminalt eller C-terminalt avkortet protein på omtrent 50 aminosyrers lengde av AdPan7 hexon protein sekvens fra SEQ ID NO: 11.

Rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, der adenovirusets cis elementer omfatter 5' invertert terminal repetisjon (ITR) sekvenser og 3' ITR, fra Pan7 SEQ ID NO:9 eller en sekvens som er komplementær dertil.

Adenovirus i følge krav 7, som omfatter minst et apekapsid protein valgt fra: pentonproteinet fra Pan7 SEQ ID NO:6 og fiberproteinet fra Pan7 SEQ ID NO: 12.

Det er også frembrakt nye nukleinsyre- og aminosyresekvenser fra Ad-Pan5 [SEKV. ID nr. 1-4,15 og 21], Ad-Pan6 [SEKV. ID nr. 5-8, 16,19], og Ad-serotype Pan7 [SEKV. ID nr. 9-12, 17,20], som opprinnelig ble isolert fra sjimpanselymfeknuter. I flere tilfeller gjennom beskrivelsen er disse adenovirus alternativt angitt som C5, C6 henholdsvis Cl. Det tilveiebringes videre sekvenser fra adenovirus SV-1 [SEKV. ID nr. 24-28], som opprinnelig ble isolert fra cynomolgusapenyreceller. Oppfinnelsen tilveiebringer også sekvenser fra adenovirus SV-25 [SEKV. ID nr. 29-33] og SV-39 [SEKV. ID nr. 34-37], som opprinnelig ble isolert fra rhesusapenyreceller.

Det tilveiebringes nye adenovirusvektorer og pakking av cellelinjer for tilveiebringelse av disse vektorer for anvendelse ved in v/7ro-produksjon av rekombinante proteiner eller fragmenter eller andre reagenser. Oppfinnelsen tilveiebringer preparater for anvendelse ved avlevering av et heterologt molekyl for terapeutisk- eller vaksineformål. Slike terapeutiske eller vaksinepreparater kan inneholde de adenovirale vektorer som bærer et innskutt, heterologt molekyl. I tillegg er de nye sekvensene ifølge oppfinnelsen anvendelige ved tilveiebringelse av de essensielle hjelperfunksjoner nødvendige for fremstilling av rekombinante adenoassosierte virale (AAV) vektorer. Det er således mulig å skaffe tilveie hjelperkonstruksjoner, fremgangsmåter og cellelinjer som anvender disse sekvenser i slike produksjonsfremgangsmåter.

Uttrykket "vesentlig homologi" eller "vesentlig likhet" anvendt under henvisning til en nukleinsyre eller et fragment derav, indikerer at det er nukleotidsekvensidentitet i det minste i omkring 95 % til 99 % av de oppstilte sekvensene, når optimalt oppstilt med egnete nukleotidinnskudd eller -delesjoner med en annen nukleinsyre (eller dens komplementære tråd).

Uttrykket "vesentlig homologi" eller "vesentlig likhet" under henvisning til aminosyrer eller fragmenter derav, indikerer at det er nukleotidsekvensidentitet i det minste i omkring 95 % til 99 % av de oppstilte sekvensene, når optimalt oppstilt med egnete aminosyreinnskudd eller -delesjoner med en annen aminosyre (eller dens komplementære tråd). Fortrinnsvis er homologien over fullengdesekvens eller et protein derav, eller et fragment derav som minst er 8 aminosyrer, eller mer ønskelig minst 15 aminosyrer i lengde. Eksempler på egnete fragmenter er beskrevet heri.

Uttrykket "prosent sekvensidentitet" eller "identisk" innenfor konteksten nukleinsyresekvenser, henviser til restene i de to sekvensene som er de samme når de oppstilles for maksimal overensstemmelse. Sekvenslengdeidentitetsammenlikning kan være over hele genomets lengde (for eksempel omkring 36 kbp), hele lengden av en åpen leseramme av et gen, protein, subenhet eller enzym (se for eksempel tabellene som viser de adenovirale kodende regioner), eller et fragment på minst 500 til 5000 nukleotider, om ønskelig. Imidlertid kan identitet blant mindre fragmenter, for eksempel på minst omkring 9 nukleotider, vanligvis på minst omkring 20 til 24 nukleotider, minst omkring 28 til 32 nukleotider, minst omkring 36 eller flere nukleotider, kan også være ønskelig. På tilsvarende måte kan "prosent sekvensidentitet" lett bestemmes for aminosyresekvenser over hele proteinlengden eller et fragment derav. Hensiktsmessig er et fragment minst omkring 8 aminosyrer i lengde og kan være opptil omkring 700 aminosyrer. Eksempler på egnete fragmenter er beskrevet heri.

Identitet bestemmes enkelt ved anvendelse av slike algoritmer og dataprogrammer som er definert heri ved standard parameterinnstillinger. Fortrinnsvis er en slik identitet over hele lengden av proteinet, enzymet, subenheten eller over et fragment på minst 8 aminosyrer i lengde. Imidlertid kan identiteten være basert på kortere områder, der dette er hensiktsmessig for anvendelsen av de identiske genprodukter.

Som beskrevet heri, gjennomføres oppstillinger ved anvendelse av et antall offentlige eller kommersielt tilgjengelige "Multiple Sequence Alignment Programs", som "Clustal W", tilgjengelig via web-servere på internett. Alternativt benyttes også vektor NTI- elementer. Det foreligger også et antall algoritmer som er kjente i teknikken og som kan anvendes for måling av nukleotidsekvensidentitet, inkludert de som er som finnes i programmene beskrevet ovenfor. Som et annet eksempel kan polynukleotidsekvenser sammenliknes ved anvendelse av FASTA, et program i GCG-versjon 6.1. FASTA tilveiebringer oppstillinger og prosentidentitet for områdene som gir best overlapping mellom sekvensene som finnes og de sekvenser som ønskes bestemt. For eksempel kan prosent sekvensidentitet mellom nukleinsyresekvens bestemmes ved anvendelse av FASTA med dennes standard parametre (en ordstørrelse på 6 og NOPAM-faktoren for bedømmelsesmatrisen) som er tilveiebrakt i GCG-versjon 6.1. Tilsvarende programmer er tilgjengelige for gjennomføring aminosyreoppstillinger. Generelt er disse programmene benyttet ved standardinnstillinger, selv om fagmannen på området kan endre disse etter behov. Alternativt kan fagmannen på området benytte en annen algoritme, eller et annet dataprogram som gir i det minste det nivå av identitet eller oppstilling som tilveiebringes heri ved de nevnte algoritmer eller programmer.

Som benyttet ifølge foreliggende oppfinnelses beskrivelse og krav, skal uttrykket "omfatte" og varianten "omfatter" og "omfattende", blant andre varianter inkludere andre komponenter, elementer, integere, trinn og liknende. Uttrykket "består av" eller "bestående av" utelukker andre komponenter, elementer, integere, trinn og liknende.

I. Simian- adenovirussekvenser

Det er skaffet til veie nukleinsyresekvenser og aminosyresekvenser av Pan5, Pan6, Pan7, SVI, SV25 og SV39, som er isolerte fra det andre virale materialet de er assosiert med i naturen.

A. Nukleinsyresekvenser

Pan5 nukleinsyresekvensene inkluderer nukleotidene 1 til 36462 av SEKV. ID nr. 1. Pan6 nukleinsyresekvensene inkluderer nukleotidene 1 til 36604 av SEKV. ID nr. 5. Pan7 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen inkluderer nukleotidene 1 til 36535 av SEKV. ID nr. 9. SVI-nukleinsyresekvensene inkluderer nukleotidene 1 til 34264 av SEKV. ID nr. 24. SV25-nukleinsyresekvensene inkluderer nukleotidene 1 til 31044 av SEKV. ID nr. 29. SV39-nukleinsyresekvensene inkluderer nukleotidene 1 til 34115 av SEKV. ID nr. 34. Se sekvensopplistingen, som er inkorporert ved referanse heri.

Nukleinsyresekvensene omfatter videre tråden som er komplementær til sekvensene i SEKV. ID nr. 5,9,24,29 og 34, så vel som de korresponderende RNA- og cDNA-sekvensene til sekvensene av disse sekvenstall og deres komplementære tråder. Inkludert er nukleinsyresekvenser som er mer enn 95 % til 98 %, og mer foretrukket omkring 99 % til 99,9 % homologe eller identiske til sekvensopplistingen til sekvensene i følge foreliggende oppfinnelse. Inkludert i nukleinsyresekvensene kan naturlige varianter og konstruerte modifikasjoner av sekvensene tilveiebrakt i SEKV. ID nr. 5, 9, 24,29 og 34, og deres komplementære tråder inngå. Slike modifikasjoner inkluderer for eksempel merkelapper kjent innen teknikken, metylering og substituering av én eller flere av de naturlig forekommende nukleotider med et degenerert nukleotid.

Sekvensfragmenter av Pan5, Pan6, Pan7, SVI, SV25 og SV39, kan omfatte deres komplementære tråd, cDNA og RNA som er komplementære dertil. Egnete fragmenter har en lengde på minst 15 nukleotider og omfatter tradisjonelle fragmenter, dvs. fragmenter som er av biologisk interesse. For eksempel kan et funksjonelt fragment uttrykke et ønsket, adenoviralt produkt eller kan være anvendelig i fremstilling av rekombinante, virale vektorer. Slike fragmenter inkluderer gensekvensene og fragmentene som er opplistet i tabellen nedenfor.

De påfølgende tabellene viser transkriptområdene og åpne leserammer i simian-adenovirussekvensene. For visse gener er transkriptene og de åpne leserammene (ORFer) lokalisert på tråden som er komplementær til den presentert i SEKV. ID nr. 5, 9, 24, 29 og 34. Se for eksempel E2b, E4 og E2a. De kalkulerte molekylvektene for de kodete proteiner er også vist. Merk at den åpne leserammen Ela Pan5 [nt 576-1436 av SEKV. ID nr. 1], pan6 [nt 576 til 1437 av SEKV. ID nr. 5] og Pan7 [nt 576 til 1437 av SEKV. ID nr. 9] inneholder interne spleiseseter. Disse spleisesetene er angitt i de påfølgende tabellene.

Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- og SV39-adenovirale nukleinsyresekvenser er nyttige som terapeutiske midler og ved konstruksjon av et antall vektorsystemer og vertsceller. Som anvendt heri inkluderer en vektor ethvert egnet nukleinsyremolekyl, inkluderende nakent DNA, et plasmid, et virus, et kosmid eller en episom. Disse sekvenser og produkter kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre adenovirale sekvenser eller fragmenter, eller i kombinasjon med elementer fra andre adenovirale eller ikke-adenovirale sekvenser. De adenovirale sekvenser ifølge oppfinnelsen er også nyttige som antisens-avleveringsvektorer, genterapivektorer eller vaksinevektorer. Oppfinnelsen tilveiebringer således i tillegg nukleinsyremolekyler, vertsceller inneholdende Ad-sekvensene ifølge oppfinnelsen. Genavlevingsvektorer er også mulig å tilveiebringe.

For eksempel omfatter oppfinnelsen et nukleinsyremolekyl inneholdende simian-Ad-ITR-sekvenser ifølge oppfinnelsen. I et annet eksempel tilveiebringer oppfinnelsen et nukleinsyremolekyl inneholdende simian-Ad-sekvenser ifølge oppfinnelsen, som koder et ønsket Ad-genprodukt. Ytterligere andre nukleinsyremolekyler som konstrueres ved anvendelse av sekvensene ifølge oppfinnelsen, vil være åpenbare for fagmannen i lys av de her gitte informasjoner.

Simian-Ad-genområdene som identifiseres her, kan benyttes i et antall vektorer for

avlevering av et heterologt molekyl til en celle. For eksempel genereres det vektorer for ekspresjon av et adenoviralt kapsidprotein (eller et fragment derav) for generering av en viralvektor i en pakket vertscelle. Slike vektorer kan konstrueres for ekspresjon in trans. Alternativt konstrueres slike vektorer for å gi celler som stabilt inneholder sekvenser

som uttrykker ønskete adenovirale funksjoner, for eksempel én eller flere av Ela, Elb, de terminalrepeterende sekvenser, E2a, E2b, E4, E40RF6-området.

I tillegg er de adenovirale gensekvenser og fragmenter derav nyttige for å tilveiebringe de hjelperfunksjoner nødvendige for fremstilling av hjelperavhengige virus (for eksempel adenovirale vektorer der vesentlige funksjoner eller adenoassosierte virus (AAV)) er fjernet. For slike produksjonsfremgangsmåter benyttes simian-adenovirale sekvenser ifølge oppfinnelsen med en fremgangsmåte tilsvarende det som er beskrevet for humant Ad. På grunn av forskjeller i sekvensene mellom de simian-adenovirale sekvensene ifølge oppfinnelsen og de av humant Ad, eliminerer imidlertid bruken av sekvensene ifølge oppfinnelsen den vesentlige muligheten for homolog rekombinering med hjelperfunksjoner i vertscelle som bærer humant Ad El-funksjoner, for eksempel 293-celler, som kan produsere infeksiøs, adenoviral forurensing under rAAV-produksjon.

Fremgangsmåter for produksjon av rAAV ved anvendelse av adenovirale hjelperfunksjoner er utstrakt beskrevet i litteraturen med humane adenovirale serotyper. Se for eksempel U.S. patent nr. 6 258 595 og referansene sitert deri. Se også U.S. patent nr. 5 871 982; WO 99/14354; WO 99/15685; WO 99/47691. Disse fremgangsmåtene kan også anvendes ved fremstilling av ikke-humant AAV, inkludert ikke-humane primat AAV-serotyper. Simian-adenovirale gensekvenser ifølge oppfinnelsen som tilveiebringer de nødvendige hjelperfunksjoner (for eksempel Ela, Elb, E2a og/eller E40RF6) kan være særlig nyttig for å gi den nødvendige adenovirale funksjon, mens muligheten for rekombinasjon med et hvilket som helst annet adenovirus til stede i rAAV-pakkende celle, som typisk er av human opprinnelse, minimaliseres eller elimineres. Valgte gener eller åpne leserammer av de adenovirale sekvenser ifølge oppfinnelsen kan således benyttes i disse rAAV-produksjonsfremgangsmåter. Alternativt kan rekombinante adenovirale simian-vektorer ifølge oppfinnelsen anvendes i disse fremgangsmåtene. Slike rekombinante adenovirale simian-vektorer kan for eksempel inkludere et hybrid sjimp Ad/AAV der sjimp Ad-sekvensene flankerer en rAAV-ekspresjonskassett bestående for eksempel av AAV 3' og/eller 5' ITRer og et transgen under kontroll av regulatoriske sekvenser som kontrollerer dens ekspresjon. Fagmannen på området vil erkjenne at også andre simian-adenovirale vektorer og/eller gensekvenser ifølge oppfinnelsen vil være nyttige for fremstilling av rAAV og andre virus, avhengig av adenoviral hjelper.

I nok en annen utførelsesform konstrueres nukleinsyremolekyler for avlevering og ekspresjon av valgte adenovirale genprodukter i en vertscelle, for å oppnå en ønsket fysiologisk effekt. For eksempel kan et nukleinsyremolekyl inneholdende sekvenser som koder et adenovirus Ela-protein ifølge oppfinnelsen, avleveres til et individ for anvendelse som cancerterapeutikum. Eventuelt formuleres et slikt molekyl i en lipidbasebærer og har fortrinnsvis cancerceller som mål. En slik formulering kan kombineres med andre cancerterapeutika (for eksempel cisplatin, taxol eller liknende). Ytterligere andre anvendelser for adenovirale sekvenser som er gitt her, vil være åpenbare for fagmannen.

I tillegg vil fagmannen lett forstå at Ad-sekvensene ifølge oppfinnelsen lett kan tilpasses for anvendelse i et antall virale og ikke-virale vektorsystemer for in vitro-, ex vivo- eller in v/vo-avlevering av terapeutiske og immunogene molekyler. For eksempel kan Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- og/eller SV39-simian-Ad-genomene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i et antall rAd- og ikke-rAd-vektorsystemer. Slike vektorsystemer kan for eksempel inkludere plasmider, lentivirus, retrovirus, poxvirus, vaksinevirus og adenoassosierte virale systemer, blant andre. Valg av disse vektorsystemene er ingen begrensning.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre molekyler nyttige for produksjon av simian-proteiner og simian-avledete proteiner ifølge oppfinnelsen. Slike molekyler som bærer polynukleotider som inkluderer simian-Ad-DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen, kan foreligge i form av nakent DNA, et plasmid, et virus eller et hvilket som helst annet genetisk element.

B. Simian-adenovirale proteiner

Videre er det mulig å tilveiebringe genprodukter av de ovenfor beskrevne adenovirus som proteiner, enzymer og fragmenter derav, og som kodes av de adenovirale nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen. Det beskrives videre Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- og/eller SV39-proteiner, enzymer og fragmenter derav, med den aminosyresekvens som kodes av disse nukleinsyresekvenser som er generert ved andre fremgangsmåter. Slike proteiner inkluderer de som er kodet av den åpne leseramme som er identifisert i tabellene ovenfor, i figurene 1 og 2, og fragmentene derav.

Det er mulig å tilveiebringe unike simian-adenovirale proteiner som i det vesentlige er rene, dvs. frie for andre virale eller proteinøse proteiner. Fortrinnsvis er disse proteiner minst 10 % homogene, mer foretrukket 60 % homogene, og mest foretrukket 95 % homogene.

Det er videre mulig å tilveiebringe unike simian-avledete kapsidproteiner. Som anvendt heri inkluderer et simian-avledet kapsidprotein et hvilket som helst adenoviralt kapsidprotein inneholdende et Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-kapsidprotein eller et fragment derav, som definert ovenfor, uten begrensning omfattende kimære kapsidproteiner, fusjonsproteiner, kunstige kapsidproteiner, syntetiske kapsidproteiner og rekombinerte kapsidproteiner, uten begrensning av midler for å generere disse produktene.

Hensiktsmessig inneholder disse simian-avledete kapsidproteiner ett eller flere Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-områder eller fragmenter derav (for eksempel hexon, penton, fiber eller et fragment derav) i kombinasjon med kapsidområder eller fragmenter derav av forskjellige adenovirale serotyper, eller modifiserte simian-kapsidproteiner eller fragmenter, som beskrevet heri. En "modifikasjon av et kapsidprotein forbundet med endret tropisme" som anvendt heri, inkluderer et endret kapsidprotein, for eksempel et penton, et hexon eller et fiberproteinområde, eller et fragment derav som knoppdoméne av fiberområdet, eller et polynukleotid som koder dette, slik at spesifisiteten endres. Det simian-avledete kapsidet kan konstrueres med én eller flere simian-Ad'ene ifølge oppfinnelsen, eller andre Ad-serotyper som kan være av human eller ikke-human opprinnelse. Slik Ad kan oppnås fra et antall kilder inkludert ATCC, kommersielle og akademiske kilder, eller Ad-sekvensene kan oppnås fra GenBank eller andre hensiktsmessige kilder.

Aminosyresekvensene av simian-adenoviruspentonproteinene ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også. AdPan5-pentonproteinet tilveiebringes i SEKV. ID nr. 2. AdPan7-pentonproteinet tilveiebringes i SEKV. ID nr. 6. AdPan6-pentonproteinet tilveiebringes i SEKV. ID nr. 10. SVl-pentonproteinet tilveiebringes i SEKV. ID nr. 23. SV25- pentonproteinet tilveiebringes i SEKV. ID nr. 30. SV39-pentonproteinet tilveiebringes i SEKV. ID nr. 35. Ethvert av disse pentonproteinene eller unike fragmenter derav, kan hensiktsmessig anvendes for et antall formål. Eksempler på egnete fragmenter inkluderer pentonet som har N-terminal- og/eller C-terminalavkortninger på omkring 50,100,150 eller 200 aminosyrer, basert på aminosyrenummereringen tilveiebrakt ovenfor, og i SEKV. ID nr. 2, SEKV. ID nr. 6, SEKV. ID nr. 25, SEKV. ID nr. 30 eller SEKV. ID nr. 35. Andre hensiktsmessige fragmenter inkluderer kortere indre C- eller N-terminale fragmenter. Pentonproteinet kan videre modifiseres for en rekke forskjellige formål kjent for dem øvet i faget.

Det er videre mulig å skaffe tiveie aminosyresekvenser av hexonproteinet av Pan5 [SEKV. ID nr. 3], Pan6 [SEKV. ID nr. 7], Pan7 [SEKV. ID nr. 11], SVI [SEKV. ID nr. 26], SV25 [SEKV. ID nr. 31] og/eller SV39 [SEKV. ID nr. 36]. Dette hexonprotein, eller unike fragmenter derav, kan hensiktsmessig anvendes for en rekke forskjellige formål. Eksempler på egnete fragmenter inkluderer hexoner med N-terminale og/eller C-terminale avkortninger på omkring 50,100,150, 200, 300, 400 eller 500 aminosyrer, basert på aminosyrenummereringen tilveiebrakt ovenfor, og i SEKV. ID nr. 3,7,11,26, 31 og 36. Andre hensiktsmessige fragmenter inkluderer kortere interne C- eller N-terminale fragmenter. For eksempel er et egnet fragment løkkeområdet (doménet) av hexonproteinet, angitt som DEI og FG1 eller et hypervariabelt område derav. Slike fragmenter inkluderer områdene som overspenner aminosyrerestene omkring 125 til 443; omkring 138 til 441, eller mindre fragmenter, slik som de som spenner over restene 138 til rest 163; omkring 170 til omkring 176; omkring 195 til omkring 203; omkring 233 til omkring 246; omkring 253 til omkring 264; omkring 287 til omkring 297; og omkring 404 til omkring 430 av simian-hexonproteinene, under henvisning til SEKV. ID nr. 3, 7, 11, 26, 31 eller 36. Andre egnete fragmenter kan lett identifiseres av fagmannen. Hexonproteinet kan videre være modifisert for et antall formål, som velkjent for fagmannen. På grunn av at hexonproteinet er determinant for en adenovirusserotype, vil slike kunstige hexonproteiner resultere i adenovirus med kunstige serotyper. Andre kunstige kapsidproteiner kan også konstrueres ved anvendelse av sjimp-Ad-pentonsekvenser og/eller fibersekvenser ifølge oppfinnelsen og/eller fragmenter derav.

I et eksempel kan det være ønskelig å generere et adenovirus med endret hexonprotein ved anvendelse av en hexonproteinsekvens ifølge oppfinnelsen. En egnet fremgangsmåte for å endre hexonproteiner er beskrevet i U.S. patent nr. 5 922 315, som det henvises til vedrørende detaljer. I denne fremgangsmåten blir minst ett adenovirushexonløkkeområde byttet ut med minst ett løkkeområde av en annen adenovirusserotype. Ved minst ett løkkeområde av et slikt endret adenovirus, er således hexonproteinet et simian-Ad-hexonløkkeområde ifølge oppfinnelsen (for eksempel Pan7). Det er mulig å erstatte et løkkeområde av Pan7 hexonproteinet med et løkkeområde fra en annen adenovirusserotype eller benytte løkkeområdet av Pan7-hexoner til å erstatte et løkkeområde fra en annen adenovirusserotype. Egnete adenovirusserotyper kan lett velges blant humane og ikke-humane serotyper, som beskrevet her. Pan7 velges kun som illustrasjon; andre simian-Ad-hexonproteiner kan endres på tilsvarende måte eller benyttes for å endre et annet Ad-hexon. Valget av en egnet serotype er ingen begrensning for oppfinnelsen. Ytterligere andre anvendelser for hexonproteinsekvensene ifølge oppfinnelsen vil lett fremgå for fagmannen.

Oppfinnelsen omfatter videre fiberproteinene av simian-adenovirus ifølge oppfinnelsen. Fiberproteinet av Ad-Pan5 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 4. Fiberproteinet Ad-Pan6 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 8. Fiberproteinet Ad-Pan7 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 12. SV-1 har to fiberproteiner; fiber 2 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 27 og fiber 1 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 28. SV-25 har også to fiberproteiner; fiber 2 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 32, og fiber 1 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 33. Fiberproteinet av SV-39 har aminosyresekvens SEKV. ID nr. 37.

Dette fiberproteinet, eller unike fragmenter derav, kan hensiktsmessig anvendes for en rekke forskjellige formål. Et egnet fragment er fiberknoppen som spenner over aminosyrene 247 til 425 av SEKV. ID nr. 4, 8, 12,28, 32, 33 og 37. Se figur 2. Eksempler på andre egnete fragmenter inkluderer fiberen med N-terminale og/eller C-terminale avkortninger på omkring 50, 100, 150 eller 200 aminosyrer, basert på aminosyrenummereringen tilveiebrakt ovenfor, og i SEKV. ID nr. 4, 8,12, 28, 32, 33 og 37. Andre hensiktsmessige fragmenter inkluderer indre fragmenter. Fiberproteinet kan være modifisert ved anvendelse av et antall teknikker velkjente for fagmannen.

Oppfinnelsen omfatter videre unike fragmenter av proteinene ifølge oppfinnelsen, som er minst 8 aminosyrer lange. Fragmenter med andre ønskete lengder kan imidlertid lett benyttes. I tillegg omfatter oppfinnelsen slike modifikasjoner som kan innføres for å øke utbyttet og/eller ekspresjonen av et Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-genprodukt, for eksempel konstruksjon av et fusjonsmolekyl der hele eller et fragment av Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-genproduktet er fusert (enten direkte eller via en linker) til en fusjonspartner for å øke utbyttet. Andre egnete modifikasjoner inkluderer, uten begrensning, avkortning av et kodende område (for eksempel et protein eller enzym) for å eliminere et pre- eller pro-protein som vanligvis spaltes, og for å gi det modne protein eller enzym og/eller mutasjon av et kodende område for å gi et utskillbart genprodukt. Ytterligere andre modifikasjoner vil lett fremgå for fagmannen. Oppfinnelsen omfatter videre proteiner med minst 95 % til 99 % identitet med de her tilveiebrakte Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-proteiner.

Som beskrevet heri, er vektorer inneholdende de adenovirale kapsidproteiner ifølge oppfinnelsen, spesielt godt egnet for anvendelse der de nøytraliserende antistoffer reduserer effektiviteten for andre Ad-serotypebaserte vektorer, så vel som andre virale vektorer. rAd-vektorene er spesielt fordelaktige ved readministrering for gjentatt genterapi eller for forsterking av immunresponsen (vaksinetitere).

Under visse omstendigheter kan det være ønskelig å benytte ett eller flere av Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- og/eller SV39-genproduktene (for eksempel et kapsidprotein eller et fragment derav) for å generere et antistoff. Uttrykket "antistoff slik det benyttes her, henviser til et immunglobulinmolekyl som spesifikt er i stand til å binde til en epitop. Antistoffene binder således fortrinnsvis spesifikt og uten kryssreaktivitet til en Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- og/eller SV39-epitop. Antistoffene foreligger i et antall former inkludert for eksempel høyaffinitets-polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, syntetiske antistoffer, kimære antistoffer, rekombinante antistoffer og humaniserte antistoffer. Slike antistoffer stammer fra immunglobulinklassene IgG, IgM, IgA, IgD og IgE.

Slike antistoffer kan genereres ved anvendelse av et antall fremgangsmåter som er velkjente i teknikken. Egnete antistoffer kan genereres ved velkjente, konvensjonelle teknikker, for eksempel ved Kohler og Milstein, og mange kjente modifikasjoner derav. Tilsvarende ønskelige høytiterantistoffer genereres ved anvendelse av kjente rekombinante teknikker på de monoklonale eller polyklonale antistoffer som er avledet fra disse antigener (se for eksempel PCT patent søknad nr. PCT/GB85/00392; britisk patentsøknadspublikasjon nr. GB2188638A; Amit et al., 1986 Science, 233:747-753; Queen et al, 1989 Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:10029-10033; WO 90/07861; og Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Huse et al, 1988a Science, 246:1275-1281). Alternativt kan antistoffer fremstilles ved å manipulere de komplementaritets-bestemmende områder av animalske eller humane antistoffer mot antigenet ifølge oppfinnelsen. (Se for eksempel E. Mark og Padlin, Humanization of Monoclonal Antibodies, kapitel 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, bind 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag (juni 1994); Harlow et al, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al, 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; og Bird et al, 1988, Science 242:423-426. Videre er det mulig å fremskaffe anti-idiotype antistoffer (Ab2) og anti-anti-idiotype antistoffer (Ab3). Se for eksempel M. Wettendorff et al., Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies. In Idiotypic Network and Diseases, red. ved J. Cerny og J. Hiernaux, 1990 J. Am. Soc. Microbiol, Washington DC: s. 203-229). Disse anti-idiotype- og anti-anti-idiotype-antistoffer fremstilles ved bruk av teknikker velkjente for fagmannen. Disse antistoffer kan benyttes for et antall formål, inkludert diagnostiske og kliniske fremgangsmåter og sett. Under visse omstendigheter kan det være ønskelig å innføre en påvisbar merkelapp eller en tag på et Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-genprodukt, -antistoff eller en annen konstruksjon. Som benyttet heri er en påvisbar merkelapp et molekyl i stand til, alene eller i interaksjon med andre molekyler, å gi et påvisbart signal. Helst er merkelappen visuelt påvisbar, for eksempel ved fluorescens, for lett anvendelse i immunohistokjemisk analyse eller immunfluorescensmikroskopi. For eksempel inkluderer hensiktsmessige merkelapper fluorescein isotiocyanat (FITC), fyeoerytrin (PE), allofycocyanin (APC), corifosfin-0 (CPO) eller tandemfargestoffer, PE-cyanin-5 (PC5), og PE-Texasrødt (ECD). Alle disse fluorescente fargestoffer er kommersielt tilgjengelige, og deres anvendelser er velkjente i teknikken. Andre nyttige merkelapper inkluderer en kolloid gullmerkelapp. Ytterligere andre nyttige merkelapper inkluderer radioaktive forbindelser eller elementer. I tillegg inkluderer merkelapper et antall enzymsystemer som virker ved frigivelse av et kollorimetrisk signal i en analyse, for eksempel glukoseoksidase (som benytter glukose som substrat) frigir peroksid som et produkt som i nærvær av peroksidase og en hydrogendonor som tetrametylbenzidin (TMB), gir et oksidert TMB som ses som blå farge. Andre eksempler inkluderer pepperotperoksidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP), og hexokinase i forbindelse med glukose-6-fosfatdehydrogenase som reagerer med ATP, glukose og NAD<+>, og gir blant andre produkter, NADH som påvises som øket absorbans ved 340 nm bølgelengde.

Andre merkelappsystemer som anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, kan påvises på annen måte, ved for eksempel farget lateks mikropartikler (Bang Laboratories, Indiana) hvori et innleiret fargestoff benyttes i stedet for enzymer for å gi konjugater med målsekvensen, og gir et visuelt signal som indikerer nærvær av det resulterende kompleks i anvendelige analyser.

Fremgangsmåter for kobling eller assosiering av merkelappen med et ønsket molekyl er også konvensjonelle, og velkjente for fagmannen. Kjente fremgangsmåter for merkelappfesting er beskrevet. (Se for eksempel Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals, 6. utg., R. P. M. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 1996; Pierce Catalog and Handbook, Life Science and Analytical Research Products, Pierce Chemicals Company, Rockford, IL, 1994/1995). Valget av merkelapp og koblingsfremgangsmåte er således ingen begrensning for foreliggende oppfinnelse.

Sekvensene, proteinene og fragmentene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på en hvilken som helst hensiktsmessig måte, inkludert rekombinant produksjon, kjemisk syntese eller andre syntetiske midler. Egnete produksjonsteknikker er velkjente for fagmannen. Se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Alternativt kan peptider også syntetiseres ved den velkjente fastfasepeptidsyntesefremgangsmåten, (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1969), s. 27-62). Disse og andre hensiktsmessige produksjonsfremgangsmåter ligger innenfor fagmannens kunnskapsområde, og er ingen begrensning for oppfinnelsen.

I tillegg vil fagmannen på området lett forstå at Ad-sekvensene ifølge oppfinnelsen lett kan tilpasses for bruk i et antall virale eller ikke-virale vektorsystemer for in vitro-, ex vivo- eller in vz'vø-avlevering av terapeutiske og immunogene molekyler. Simian-Ad-kapsidproteinene og andre simian-adenovirusproteiner, som beskrevet heri, kan benyttes for eksempel til ikke-viral, proteinbasert avlevering av gener, proteiner og andre ønskelige diagnostiske, terapeutiske og immunogene molekyler. Proteinet er da direkte eller indirekte forbundet med et molekyl målrettet for celler med en reseptor for adenovirus. For slik målretting velges fortrinnsvis et kapsidprotein, slik som et hexon, penton, en fiber eller et fragment derav ved en ligand for celleoverflatereseptorer. Egnete molekyler for avlevering velges blant terapeutiske molekyler og deres genprodukter, som beskrevet heri. Et utvalg av linkere inkludert lipid, polyLys og liknende kan benyttes som linkere. For eksempel kan simian-pentonprotein lett benyttes for et slikt formål ved fremstilling av et fusjonsprotein ved anvendelse av simian-pentonsekvensen på en måte analog til det som er beskrevet av Medina-Kauwe LK, et al, Gene Ther., des. 2001; 8(23): 1753-1761. Alternativt kan aminosyresekvensene av simian-Ad-protein-IX benyttes for målrettete vektorer på en celleflatereseptor, som beskrevet i U.S. søknad nummer 20 010 047 081. Egnete Ugandere inkluderer et CD40-antigen, en RGD-inneholdende eller polylysininneholdende sekvens, og liknende. Ytterligere andre simian-Ad-proteiner inkluderer for eksempel hexonproteinet og/eller fiberproteinet, kan anvendes for disse og tilsvarende formål.

Ytterligere andre adenovirale proteiner kan benyttes alene eller i kombinasjon med andre adenovirale proteiner for et antall formål som lett vil være åpenbare for fagmannen. I tillegg kan ytterligere andre anvendelser for de adenovirale proteiner lett være åpenbare for fagmannen.

II. Rekombinante adenoviralvektorer

Sammensetningene kan inkludere vektorer som avgir et heterologt molekyl til celler, enten for terapeutiske eller for vaksineformål. Som anvendt heri, kan en vektor inkludere et hvilket som helst genetisk element inkludert, uten begrensning, nakent DNA, en phag, et transposon, et kosmid, et episom, et plasmid eller et virus. Slike vektorer inneholder simian-adenovirus-DNA av Pan5, Pan6, Pan7, SVI, SV25 og/eller SV39 og et minigen. Med "minigen" menes kombinasjonen av et valgt, heterologt gen og de andre regulatoriske elementer nødvendige for å drive translasjonen, transkripsjonen og/eller ekspresjonen av genproduktet i en vertscelle.

Typisk blir en adenoviral vektor konstruert slik at minigenet er lokalisert i et nukleinsyremolekyl inneholdende andre adenovirale sekvenser i området nativt til et valgt adenoviralt gen. Minigenet kan skytes inn i et foreliggende genområde for å bryte opp funksjonen i dette området, dersom dette er ønskelig. Alternativt kan minigenet innføres på setet for et partielt eller fullt deletert, adenoviralt gen. For eksempel kan minigenet være lokalisert på setet for et slikt, som setet for en funksjonell El-delesjon eller funksjonell E3-delesjon, blant andre som kan velges. Uttrykkes "funksjonelt deletert" eller "funksjonell delesjon" betyr at en tilstrekkelig mengde av genområdet er fjernet eller på annen måte skadet, for eksempel ved mutasjon eller modifikasjon, slik at genområdet ikke lenger er i stand til å gi funksjonelle produkter av genekspresjon. Dersom ønskelig kan hele genområdet fjernes. Andre egnete seter for genoppbryting eller delesjon er diskutert på annet sted i foreliggende beskrivelse.

For eksempel kan en produksjonsvektor som er nyttig for generering av et rekombinant virus, inneholde minigenet og enten den 5' og 3' ende av det adenovirale genomet, eller både 5' og 3' ende av dette adenovirale genom. Det adenovirale genomets 5' ende inneholder de 5' cis-elementene som er nødvendige for pakking og replikering; dvs. de 5' inverterte repetisjonsterminal (ITR) sekvensene (som virker som replikasjonsopprinnelser) og de native 5' pakkingsforbedringsdoméner (som inneholder sekvensene nødvendige for pakking av lineære Ad-genomer og enhancerelementene for El-promoteren). Den 3' ende av det adenovirale genom inkluderer de 3' cis-elementene (inkludert ITRene) som er nødvendige for pakking og enkapsidering. Hensiktsmessig er et rekombinant adenovirus inneholdende både de 5'- og 3'-adenovirale cis-elementene og minigenet, lokalisert mellom de 5'- og 3'-adenovirale sekvensene. En hvilken som helst adenoviral vektor ifølge oppfinnelsen kan også inneholde ytterligere adenovirale sekvenser.

Hensiktsmessig inneholder disse adenovirale vektorer ett eller flere adenovirale elementer avledet fra et adenoviralt genom, ifølge oppfinnelsen. Vektorene kan inneholde adenovirale ITRer fra Pan5, Pan6, Pan7, SVI, SV25 eller SV39 og ytterligere adenovirale sekvenser fra den samme adenovirale serotype. Vektorene kan også inneholde adenovirale sekvenser avledet fra en annen adenoviral serotype enn den som gir ITRene. Som definert heri, henviser en pseudotypet adenovirus til en adenovirus der kapsidproteinet av adenoviruset er fra en annen serotype enn den serotype som gir ITRene. Valget av serotype for ITRene og serotypen for en hvilken som helst annen adenoviral sekvens som er til stede i vektoren, er ingen begrensning for oppfinnelsen. Et antall adenovirusstammer er tilgjengelige fra "American Type Culture Collection", Manassas, Virginia, eller tilgjengelig på forespørsel fra et antall kommersielle og institusjonelle kilder. Videre er sekvensene for mange slike stammer tilgjengelige fra et antall databaser, inkludert for eksempel PubMed og GenBank. Homologe adenovirusvektorer fremstilt fra andre simian- eller fra humant adenovirus er beskrevet i publisert litteratur. Se for eksempel U.S. patent nr. 5 240 846. DNA-sekvensene for et antall adenovirustyper er tilgjengelige fra GenBank inkludert type Ad5 (GenBank tilgangsnr. M73260). Adenovirussekvensene kan være oppnådd fra en hvilken som helst kjent adenovirusserotype, som serotypene 2, 3, 4, 7, 12 og 40, og videre inkludert en hvilken som helst av de i dag identifiserte humane typer. Tilsvarende adenovirus kjent for å infektere ikke-humane dyr (for eksempel aper), kan også benyttes i vektorkonstruksjonene. Se for eksempel U.S. patent nr. 6 083 716.

De virale sekvensene, hjelpervirus, hvis nødvendig, og rekombinante virale partikler, og andre vektorkomponenter og sekvenser anvendt i vektorkonstruksj onen beskrevet heri, oppnås, som beskrevet ovenfor. DNA-sekvensene for Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25-og/eller SV39-simian-adenovirussekvensene ifølge oppfinnelsen anvendes for vektorkonstruksjoner og cellelinjer nyttige i fremstillingen av slike vektorer. Modifikasjoner av nukleinsyresekvenser som danner vektorene ifølge oppfinnelsen inkludert sekvensdelesjoner, innskudd eller andre mutasjoner, kan genereres ved anvendelse av standard molekylbiologiteknikker, og ligger innenfor oppfinnelsens ramme.

A. " Minigenet"

Fremgangsmåtene som benyttes for valg av transgenet, kloningen og konstruksjonen av "minigenet" og dets innføring i den virale vektor, ligger innenfor teknikkens kunnskapsområder gitt den heri beskrevne lære.

1. Transgenet

Transgenet er en nukleinsyresekvens, heterolog til vektorsekvensen som flankerer transgenet, som koder et polypeptid, protein eller et annet produkt av interesse. Nukleinsyrekodingssekvensen er operativt forbundet til regulatoriske komponenter på en måte som tillater transgen transkripsjon, translasjon og/eller ekspresjon i en vertscelle.

Sammensetningen av transgensekvensen vil avhenge av den tilsiktete anvendelse for den resulterende vektor. For eksempel inkluderer én type transgensekvens en rapportørsekvens som ved ekspresjon gir et påvisbart signal. En slik rapportørsekvens inkluderer, uten begrensning, DNA-sekvenser som koder p-lactamase, P-galactosidase (LacZ), alkalisk fosfatase, tymidinkinase, grønn fluorescent protein (GFP), kloramfenikolacetyltransferase (CAT), luciferase, membranbundne proteiner som inkluderer for eksempel CD2, CD4, CD8, influensahemagglutininproteinet og andre velkjente i teknikken, mot hvilke det eksisterer høyaffinitetsantistoffer rettet mot disse, eller slike kan fremstilles ved konvensjonelle midler, og fusjonsproteiner omfattende et membranbundet protein, hensiktsmessig fusert til et antigen tag-doméne fra blant annet hemagglutinin eller Mye. Når disse kodende sekvensene er assosiert med regulatoriske elementer som driver deres ekspresjon, gir påvisbare signaler ved konvensjonelle midler, inkludert enzymatisk, radiografisk, kollorimetrisk, fluorescens eller andre spektrografiske analyser, fluorescentaktiverende celler sorterende analyser og immunologiske analyser, inkludert enzymforbundet immunosorbentanalyse (ELISA), radioimmunoanalyse (RIA) og immunohistokjemi. Der for eksempel markørsekvensene er LacZ-genet, blir nærværet av vektoren som bærer signalet påvist ved analyse på P-galaktosidaseaktivitet. Der transgenet er GFP eller luciferase, kan vektoren som bærer signalet måles visuelt ved farge- eller lysproduksjon i et luminometer.

Transgenet er imidlertid ønskelig en ikke-markørsekvens som koder et produkt som er nyttig i biologi og medisin, slik som proteiner, peptider, RNA, enzymer eller katalytiske RNAer. Ønskelige RNA-molekyler inkluderer tRNA, dsRNA, ribosomalt RNA, katalytiske RNAer og antisens RNAer. Ett eksempel på nyttig RNA-sekvens er en sekvens som utvisker ekspresjonen av en målrettet nukleinsyresekvens i det behandlete dyret.

Transgenet kan benyttes for behandling, for eksempel for genetiske defekter, som et cancerterapeutikum eller en vaksine, for induksjon av en immunrespons, og/eller for profylaktiske vaksineformål. Som anvendt heri, henviser induksjon av en immunrespons til et molekyls evne (for eksempel et genprodukt) til å indusere en T-celle- og/eller en humoral immunrespons til molekylet. Oppfinnelsen inkluderer videre anvendelse av flere transgener, for eksempel for å korrigere eller forbedre en tilstand forårsaket av et multisubenhetsprotein. I visse situasjoner kan forskjellige transgener benyttes for å kode hver proteinsubenhet eller å kode forskjellige peptider eller proteiner. Det er ønskelig når størrelsen av det DNA som koder proteinsubenheten er stor, for eksempel for et immunglobulin, den plateavledete vekstfaktoren eller et dystrofinprotein. For at cellen skal kunne produsere multisubenhetproteinet blir en celle infisert med det rekombinante virus inneholdende alle de forskjellige subenheter. Alternativt kan forskjellige subenheter av et protein kodes ved det samme transgen. I dette tilfellet inkluderer et enkelt transgen det DNA som koder hver av subenhetene, der DNA for hver subenhet er separert av et internt ribozyminngangssete (IRES). Dette er ønskelig når størrelsen av det DNA som koder hver av subenheten er lite, for eksempel den totale størrelsen av det DNA som koder subenheten og IRES er mindre enn 5 kilobaser. Som et alternativ til en IRES kan det angjeldende DNA være separert ved sekvenser som koder et 2A-peptid, som spalter seg selv i en posttranslasjonal hendelse. Se for eksempel M. L. Donnelly et al, J. Gen. Virol 78(Pt 1): 13-21 (jan. 1997); Furier, S., et al, Gene Ther., 8(11):864-873 (juni 2001); Klump, H., et al, Gene Ther. 8(10):811-817 (mai 2001). Dette 2A-peptidet er betydelig mindre enn et IRES, som gjør det velegnet for anvendelse når rommet er en begrensende faktor. Imidlertid kan det valgte transgen kode et hvilket som helst biologisk aktivt produkt eller annet produkt, for eksempel et produkt som er ønskelig for studie.

Egnete transgener kan lett velges av fagmannen. Valget av transgenet anses ikke som begrensende for oppfinnelsen.

2. Regulatoriske elementer

I tillegg til hovedelementene som er definert ovenfor for minigenet, inkluderer vektoren også konvensjonelle kontrollelementer nødvendige, og som er operativt forbundet med transgenet på en måte som tillater dets transkripsjon, translasjon og/eller ekspresjon i en celle transfektert med plasmidvektoren eller infisert med det virus som produseres ifølge oppfinnelsen. Som anvendt heri inkluderer "operativt forbundet" sekvenser, både ekspresjonskontrollsekvenser som er sammenfallende med genet av interesse og ekspresjonskontrollsekvenser som virker i trans eller på en avstand for å kontrollere genet av interesse.

Ekspresjonskontrollsekvenser inkluderer egnete transkripsjonsoppstart, terminering, promoter og enhancersekvenser; effektiv RNA-prosesseringssignaler som spleise- og polyadenylerings (polyA)signaler; sekvenser som stabiliserer cytoplasmisk mRNA; sekvenser som forbedrer translasjonseffektiviteten (dvs. Kozak konsensussekvens); sekvenser som forbedrer proteinstabilitet; og hvis ønskelig sekvenser som forbedrer sekresjon av det kodete produktet. Et stort antall ekspresjonskontrollsekvenser inkludert native promotere, konstitutive, induserbare og/eller vevsspesifikke, er velkjente i teknikken og kan anvendes.

Eksempler på konstitutive promotere inkluderer uten begrensning det retrovirale Rous sarkomvirus (RSV) LTR-promoteren (eventuelt med RSV-enhanceren), cytomegalovirus (CMV) promoteren (eventuelt med CMV-enhanceren), (se for eksempel Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), SV40-promoteren, dihydrofolatreduktasepromoteren, P-aktin-promoteren, fosfoglyserolkinase (PGK) promoteren og EFla-promoteren (Invitrogen).

Induserbare promotere tillater regulering av genekspresjon og kan reguleres ved eksogent tilførte forbindelser, omgivelsesfaktorer som temperatur eller nærvær av en spesifikk, fysiologisk tilstand, for eksempel en akutt fase, en spesiell differensieringstilstand for cellen, eller kun ved replikering av celler. Induserbare promotere og systemer er tilgjengelige fra et antall kommersielle kilder som uten begrensning inkluderer Invitrogen, Clontech og Ariad. Mange andre systemer er beskrevet og kan lett velges av fagmannen. For eksempel inkluderer induserbare promotere den sink-induserbare saue-metalltionin (MT) promoter og det deksametason (Dex) induserbare musebrysttumorvirus (MMTV) promoter. Andre induserbare systemer inkluderer T7-polymerasepromotersystemet (WO 98/10088); ecdyson-insektpromoteren (No et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA, 93:3346-3351 (1996)), det tetrasyklinrepressive systemet (Gossen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5547-5551

(1992)), det tetrasyklininduserbare systemet (Gossen et al., Science, 268:1766-1769

(1995)), se også Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol, 2:512-518 (1998)). Andre systemer inkluderer FK506-dimeren, VP 16 eller p65 som benytter castradiol, difenol murisleron, det RU486-induserbare systemet (Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243

(1997) og Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)), og det rapamycininduserbare systemet (Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Noen induserbare promotere øker sin effektivitet med tiden. I slike tilfeller kan effektiviteten forbedres i slike systemer ved innføring av flere repressorer i tandem, for eksempel TetR forbundet med en TetR via en IRES. Alternativt kan man vente minst tre dager før man avsøker det hele for den ønskete funksjon. Ekspresjon av ønskete proteiner kan forbedres ved kjente midler for å bedre effektiviteten av dette systemet. For eksempel ved anvendelse av Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE).

Den native promoter for transgenet kan også benyttes. Den native promoter kan være foretrukket når det er ønskelig at ekspresjonen av transgenet etterlikner den native ekspresjonen. Den native promoteren kan benyttes når ekspresjonen av transgenet må reguleres midlertidig eller utviklingsmessig, eller på en vevsspesifikk måte, eller som respons på spesifikk transkripsjonsstimulering. I en ytterligere utførelsesform kan andre native ekspresjonskontrollelementer som enhancerelementer, polyadenyleringsseter eller Kozaks konsensussekvenser også anvendes for å etterlikne den native ekspresjonen.

Andre utførelsesformer av transgenet inkluderer et transgen, operativt forbundet med en vevsspesifikk promoter. Hvis ekspresjon i skjelettmuskelen er ønskelig, bør det for eksempel benyttes en promoter som er aktiv i muskelen. Disse inkluderer promotere fra gener som koder skjelett P-aktin, myosin lettkjede 2A, dystrofin, muskelkreatinkinase så vel som syntetiske muskelpromotere, som aktiverer høyere enn naturlig forekommende promotere (se Li et al, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)). Eksempler på promotere som virker vevs-spesifikt er kjent for lever (albumin, Miyatake et al, J. Virol, 71:5124-32

(1997); hepatitt-B viruskjernepromoter, Sandig et al, Gene Ther., 3:1002-9 (1996); a-fetoprotein (AFP), Arbuthnot et al, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), benosteokalsin (Stein et al, Mol Biol Rep., 24:185-96 (1997)); bensialoprotein (Chen et al, J. Bone Miner. Res., 11:654-65 (1996)), lymfocytter (CD2, Hansal et al, J. Immunol, 161:1063-8 (1998)); immunoglobulin tungkjede; T-celle reseptorkjede), neuronal som neuronspesifikk enolase (NSE) promoteren (Andersen et al, Cell. Mol. Neurobiol, 13:503-15 (1993)), neurofilament lettkjedegen (Piccioli et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:5611-5 (1991)), og det neuronspesifikke vgf-genet (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), blant andre.

Eventuelt kan vektorer som bærer transgener som koder terapeutisk nyttige eller immunogene produkter også inkludere valgbare markører eller rapportørgener som kan inkludere sekvenser som koder geneticin, hygromicin- eller purimycinresistens, blant andre. Slike valgbare rapportører eller markørgener (fortrinnsvis lokalisert utenfor det virale genom som skal pakkes til en viral pakke), kan anvendes for å signalisere nærvær av plasmidet i bakterieceller, som ampicillinresistens. Andre vektorkomponenter kan inkludere replikasjonsopprinnelse. Valg av disse og andre promotere og vektorelementer er konvensjonelle og mange slike sekvenser er tilgjengelige (se for eksempel Sambrook et al., og referanser sitert deri).

Disse vektorer genereres ved anvendelse av teknikker og sekvenser som gis her, i forbindelse med teknikker, som er velkjente for fagfolk på området. Slike teknikker inkluderer konvensjonelle kloningsteknikker av cDNA, som de som er beskrevet i litteraturen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), ved anvendelse av overlappende oligonukleotidsekvenser av adenovirusgenomene, polymerasekjedereaksjon, og enhver egnet fremgangsmåte som gir den ønskete nukleotidsekvens.

III. Fremstilling av den rekombinante viralpartikkel

I en utførelsesform anvendes simian-adenoviralplasmidene (eller andre vektorer) for fremstilling av rekombinante adenovirale partikler. I en utførelsesform er de rekombinante adenovirus funksjonelt deletert i Ela- eller Elb-genene og bærer eventuelt andre mutasjoner, for eksempel temperaturfølsomme mutasjoner eller delesjoner i andre gener. Det kan imidlertid også være ønskelig å beholde et intakt Ela- og/eller Elb-område i de rekombinante adenovirus. Et slikt intakt El-område kan være lokalisert i sin native plassering i det adenovirale genom, eller plassert på setet for en delesjon i det native adenovirale genom (for eksempel i E3-regionen).

Ved konstruksjon av nyttige simian-adenovirusvektorer for avlevering av et gen til den humane (eller annet pattedyr) celle, kan et spektrum av adenovirusnukleinsyresekvenser anvendes i vektorene. For eksempel kan hele eller en del av det adenovirusforsinkete tidlige gen E3 være eliminert fra simian-adenovirussekvensene som utgjør en del av det rekombinante virus. Funksjonen av simian-E3 antas å være irrelevant for funksjonen og fremstillingen av den rekombinante viruspartikkelen. Simian-adenovirusvektorer kan også konstrueres til å ha en delesjon av minst ORF6-området av E4-genet, og mer ønskelig på grunn av funksjonsoverskuddet i dette området: hele E4-området. Ytterligere en annen vektor ifølge oppfinnelsen inneholder en delesjon i det forsinkete tidlig-gen E2a. Delesjoner kan også foretas i et hvilket som helst av de sene gener LI til og med L5 i simian-adenovirusgenomet. Tilsvarende kan delesjoner i de mellomliggende gener IX og IV& 2 være nyttige for visse formål. Andre delesjoner kan foretas i andre strukturelle eller ikke-strukturelle adenovirusgener. De ovenfor diskuterte delesjoner kan anvendes individuelt, dvs. at en adenovirussekvens for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan inneholde delesjoner i kun ett enkelt område. Alternativt kan delesjonen av hele gener eller deler derav, effektive for å ødelegge deres biologiske aktivitet, anvendes i en hvilken som helst kombinasjon. For eksempel kan i ett eksempel på en vektor, adenovirussekvensen ha delesjoner av El-genene og E4-genet, eller El-, E2a- og E3-genene, eller El- og E3-genene, eller El-, E2a- og E4-genene, med eller uten delesjon av E3, osv. Som diskutert ovenfor, kan slike delesjoner anvendes i kombinasjon med andre mutasjoner som temperaturfølsomme mutasjoner for å oppnå et ønsket resultat.

En adenoviral vektor som mangler en hvilken som helst vesentlig adenoviral sekvens (for eksempel Ela, Elb, E2a, E2b, E4 ORF6, LI, L2, L3. L4 og L5) kan dyrkes i nærvær av de manglende adenovirale genprodukter som kreves for viral infektivitet og propagering av en adenoviral partikkel. Disse hjelperfunksjoner kan tilveiebringes ved å dyrke den adenovirale vektor i nærvær av én eller flere hjelperkonstruksjoner (for eksempel et plasmid eller et virus) eller en pakkende vertscelle. Se for eksempel teknikkene beskrevet for fremstilling av en "minimal" human Ad-vektor i W096/13597, publisert 9. mai 1996, hvortil det vises for detaljer.

1. Hjelpervirus

Avhengig av simian-adenovirusgeninneholdet i de virale vektorer som anvendes for å bære minigenet, kan et hjelperadenovirus eller et ikke-replikerende virusfragment være nødvendig for å gi tilstrekkelige simian-adenovirusgensekvenser som er nødvendige for å gi en infeksiøs, rekombinant viral partikkel inneholdende minigenet. Nyttige hjelpervirus inneholder utvalgte adenovirusgensekvenser som ikke er til stede i adenovirusvektorkonstruksjonen og/eller ikke uttrykkes av den pakkende cellelinjen hvori vektoren er transfektert. I en utførelsesform er hjelpervirusene replikasjonsdefekte og inneholder et antall adenovirusgener i tillegg til sekvensene beskrevet ovenfor. Et slikt hjelpervirus benyttes helst i kombinasjon med en El-uttrykkende cellelinje. Hjelpervirus kan også tilformes til polykationkonjugater som beskrevet av Wu et al., J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989); K. J. Fisher og J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1. april 1994). Hjelpervirus kan evt. inneholde et andre rapportør-minigen. Et antall slike rapportørgener er kjente i teknikken. Nærvær av et rapportørgen på et hjelpervirus som er forskjellig fra transgenene på adenovirusvektorene, tillater både Ad-vektoren og hjelperviruset uavhengig kan overvåkes. Dette andre rapportørgenet benyttes for å muliggjøre separering mellom det resulterende rekombinante virus og hjelperviruset ved rensing.

2. Kompletteringscellelinjer

For å generere rekombinante simian-adenovirus (Ad) som er deletert i et hvilket som helst av genene som beskrevet ovenfor, må funksjonen av det deleterte genområdet, hvis det er vesentlig for replikasjonen og infektiviteten for viruset, tilføres det rekombinante virus via et hjelpervirus eller en cellelinje, dvs. en kompletterings- eller pakkingscellelinje. I mange tilfeller kan en cellelinje som uttrykker den humane El benyttes for å transkomplettere sjimp-Ad-vektoren. Dette er spesielt fordelaktig fordi, pga. forskjellen mellom sjimp-Ad-sekvensene ifølge oppfinnelsen og de humane AdEl-sekvensene funnet i dagens tilgjengelige pakkingsceller, forhindrer bruk av de vanlige humane El-inneholdende celler generering av replikasjonskompetente adenovirus under replikerings- og fremstillingsprosessen. Imidlertid vil det under visse omstendigheter være ønskelig å benytte en cellelinje som uttrykker El-genproduktene som kan benyttes for fremstilling av et El-deletert simian-adenovirus. Slike cellelinjer er beskrevet. Se for eksempel U.S. patent nr. 6 083 716.

Hvis ønskelig kan sekvensene som er gitt her anvendes for å generere en pakkende celle eller cellelinje som i det minste uttrykker adenovirus-El-genet fra Pan5, Pan6, Pan7, SVI, SV25 eller SV39 under den transkripsjonale kontroll av en promoter for ekspresjonen i en utvalgt opphavscellelinje. Induserbare eller konstitutive promotere kan anvendes til dette formål. Eksempler på slike promotere er beskrevet i detalj annet sted i foreliggende beskrivelse. En opphavscelle velges for generering av en ny cellelinje som uttrykker et hvilket som helst ønsket AdPan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-gen. Uten begrensning kan en slik opphavscellelinje være HeLa (ATCC aksessnr. CCL2), A549 (ATCC aksessnr. CCL 185), HEK 293, KB (CCL 17), Detroit (for eksempel Detroit 510, CCL 72) og WI-38 (CCL 75) celler, blant andre. Disse cellelinjer er alle tilgjengelige fra "American Type Culture Collection", Manassas, Virginia 20110-2209. Andre egnete opphavscellelinjer kan oppnås fra andre kilder.

Slike El-uttrykkende cellelinjer er nyttige ved generering av rekombinante simian-adenovirus-El-deleterte vektorer. I tillegg, eller alternativt tilveiebringer oppfinnelsen cellelinjer som uttrykker ett eller flere simian-adenovirale genprodukter, for eksempel kan Ela, Elb, E2a og/eller E4 ORF6 konstrueres ved anvendelse av i det vesentligste de samme prosedyrer for anvendelse ved generering av rekombinante simian-virale vektorer. Slike cellelinjer kan anvendes for transkomplettering av adenovirusvektorer som er deleterte i de essensielle gener som koder disse produkter, eller for å tilveiebringe hjelperfunksjoner nødvendige for pakking av et hjelperavhengig virus (for eksempel adenoassosiert virus). Fremstillingen av en vertscelle ifølge oppfinnelsen involverer teknikker som sammensetning av valgte DNA-sekvenser. Denne sammensetningen kan gjennomføres ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. Slike teknikker inkluderer cDNA- og genomisk kloning, alt velkjent og beskrevet av Sambrook et al, supra, ved bruk av overlappende oligonukleotidsekvenser fra adenovirale genomer kombinert med polymerasekjedereaksjon, syntetiske fremgangsmåter og hvilke som helst andre egnete fremgangsmåter som vil gi den ønskete nukleotidsekvens.

I nok et annet alternativ tilveiebringes de essensielle adenovirale genprodukter intrans ved adenovirale vektor og/eller hjelpervirus. I et slikt tilfelle kan en egnet vertscelle velges fra en hvilken som helst biologisk organisme inkludert prokaryote (for eksempel bakterielle) celler, og eukaryote celler inkludert insektceller, gjærceller og pattedyrceller. Spesielt ønskelige vertsceller er valgt blant hvilke som helst pattedyrearter, inkludert, men uten begrensning, celler som A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK293-celler eller PERC6 (av hvilke begge uttrykker funksjonelt adenoviralt El)

(Fallaux, F. J. et al, (1998), Hum. Gene Ther., 9:1909-1917), Saos, C2C12, L-celler, HT1080, HepG2 og primære fibroblast-, hepatocyt- og myoblastceller avledet fra pattedyr, inkludert menneske, ape, mus, rotte, kanin og hamster. Valget av pattedyrspesier for å tilveiebringe cellene er ingen begrensning ved oppfinnelsen; ei heller pattedyrcelletype, dvs. fibroblast-, hepatocyt-, tumorcelle, osv.

3. Sammensetning av viralpartikkel og transfeksjon av en cellelinje Ved avlevering av vektoren som omfatter minigenet ved transfeksjon blir vektoren generelt avlevert i mengde på fra omkring 5 ug til 100 ug DNA, og fortrinnsvis omkring 10 til 50 ug DNA til omkring lxl0<4>celler til omkring

lxlO<13>celler, og fortrinnsvis omkring 10<5>celler. Imidlertid kan disse relative mengder av vektor-DNA til vertscellen justeres, tatt i betraktning faktorer som den valgte vektor, avleveringsmetoder og de valgte vertsceller.

Vektoren kan være en hvilken som helst vektor som er kjent i teknikken eller beskrevet ovenfor, inkludert nakent DNA, et plasmid, en phag, et transposon, kosmider, episomer, virus, osv. Innføring i vektorens vertscelle kan oppnås på enhver måte som kjent i teknikken, eller som beskrevet ovenfor inkludert transfeksjon og infeksjon. Ett eller flere av de adenovirale gener kan stabilt integreres i vertscellens genom, stabilt uttrykkes som episomer eller uttrykkes transient. Genproduktene kan alle uttrykkes transgent, på et episom eller integreres stabilt, eller noen av genproduktene kan uttrykkes stabilt, mens andre uttrykkes transient. Videre kan promoterne for hvert av de virale gener velges uavhengig fra en konstitutiv promoter, en induserbar promoter eller en nativ, adenoviral promoter. Disse promoterne kan reguleres ved en spesifikk fysiologisk tilstand for organismen eller cellen (dvs. ved differensieringstilstander eller i replikerende eller hvilende celler) eller ved for eksempel eksogent tilsatte faktorer.

Innføring av molekylene (som plasmider eller virus) i vertscellen kan også gjennomføres ved anvendelse av teknikker som er kjent av fagmannen, og som diskutert her i beskrivelsen. I en foretrukket utførelsesform benyttes standard transfeksjonsteknikker, for eksempel CaPCvtransfeksjon eller elektroporering.

Sammensetning av de valgte adenovirus-DNA-sekvenser (så vel som transgenet) og andre vektorelementer til forskjellige mellomplasmider, og anvendelse av plasmidene og vektorene for fremstilling av en rekombinant, viral partikkel, oppnås ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. Slike teknikker inkluderer konvensjonelle kloningsteknikker og cDNA, slik som dem som er beskrevet i litteraturen (Sambrook et al., suprd), bruk av overlappende oligonukleotidsekvenser av adenovirusgenomene, polymerasekjedereaksjon, og en hvilken som helst egnet fremgangsmåte som gir den ønskete nukleotidsekvens. Standard transfeksjons- og kotransfeksjonsteknikker benyttes, for eksempel CaP04-presipiteringsteknikker. Andre konvensjonelle metoder som benyttes inkluderer homolog rekombinering av de virale genomer, plakkdannelse av virus i agaroversjikt, fremgangsmåter for måling av signalgenerering, og liknende.

Etter konstruksjon og sammensetning av den ønskete minigenholdige, virale vektor, transfekteres for eksempel vektoren in vitro i nærvær av et hjelpervirus inn i den pakkende cellelinjen. Homolog rekombinasjon inntrer mellom hjelper- og vektorsekvensene, noe som tillater at adenovirus-transgen-sekvensene i vektorene replikeres og pakkes til virionkapsider, noe som resulterer i de rekombinante, virale vektorpartikler. Den gjengse metode for fremstilling av slike viruspartikler er transfeksjonsbasert. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til slike metoder.

De resulterende rekombinante simianadenovirus er nyttige ved overføring av et valgt transgen til en valgt celle. I in v/vo-forsøk med de rekombinante virus dyrket i de pakkende cellelinjer demonstrerer de El-deleterte, rekombinante simianadenovirale vektorer ifølge oppfinnelsen anvendelighet ved overføring av et transgen til en ikke-simian og fortrinnsvis en human celle.

IV. Anvendelse av de rekombinante adenovirusvektorene

De rekombinante simianadenovirusvektorer er nyttige for genoverføring til en human eller ikke-simian veterinærpasient in vitro, ex vivo og in vivo.

De rekombinante adenovirusvektorer som er beskrevet her, kan anvendes som ekspresjonsvektorer for fremstilling av produktene som kodes av de heterologe gener in vitro. For eksempel kan de rekombinante adenovirus som inneholder et gen innskutt i plasseringen av en El-delesjon, transfekteres inn i en El-uttrykkende cellelinje, som beskrevet ovenfor. Alternativt kan replikasjonskompetente adenovirus benyttes i en annen valgt cellelinje. De transfekterte celler dyrkes så på konvensjonell måte og tillater det rekombinante adenovirus å uttrykke genproduktet fra promotere. Genproduktet kan så gjenvinnes fra kulturmediet ved kjente, konvensjonelle fremgangsmåter som proteinisolering og gjenvinning fra kultur.

En Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-avledet rekombinant simianadenoviral vektor en effektiv genoverføringstransportør som kan avlevere et valgt transgen til en

valgt vertscelle in vivo eller ex vivo, selv når organismen har nøytraliserende antistoffer mot én eller flere AAV-serotyper. I en utførelsesform blandes rAAV og cellene ex vivo; de infiserte celler dyrkes ved konvensjonelle fremgangsmåter; og de transduserte celler reinfuseres i pasienten. Disse sammensetningene er spesielt egnet for genavlevering for terapeutiske formål og for immunisering inkludert indusering av beskyttende immunitet.

Mer vanlig vil Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-rekombinante adenovirale vektorer anvendes for avlevering av terapeutiske eller immunogene molekyler, som beskrevet ovenfor. Det vil lett forstås for begge anvendelse at de rekombinante, adenovirale vektorer er spesielt godt egnet for anvendelse i regimer som involverer gjentatt avlevering av de rekombinante, adenovirale vektorer. Slike regimer involverer karakteristisk avlevering av en serie virale vektorer hvori de virale kapsider er endret. De virale kapsider kan forandres for hver etterfølgende tilførsel, om det på forhånd er valgt et antall tilførsler av et spesielt serotypekapsid (for eksempel en, to, tre, fire eller flere). Således kan et regime involvere avlevering av en rAd med et første simiankapsid, avlevering av en rAd med et andre simiankapsid, og avlevering med et tredje simiankapsid. Et antall andre regimer som benytter Ad-kapsider ifølge oppfinnelsen alene, i kombinasjon med et annet, eller i kombinasjon med andre Ad-serotyper, vil være åpenbart for fagmannen. Eventuelt kan et slikt regime involvere tilførsel av rAd med kapsider av andre, ikke-humane primatadenovirus, humant adenovirus eller kunstige serotyper, som beskrevet her. Hver fase av regimet kan involvere tilførsel av en serie injeksjoner (eller andre avleveringsruter) med et enkelt Ad-serotypekapsid, fulgt av en serie med et annet Ad-serotypekapsid. Alternativt kan de rekombinante Ad-vektorer ifølge oppfinnelsen benyttes i regimer som involverer andre ikke-adenoviralmedierte avleveringssystemer, inkludert andre virale systemer, ikke-virale avleveringssystemer, protein, peptider og andre biologisk aktive molekyler.

De påfølgende avsnitt vil fokusere på eksempler på molekyler som kan avleveres via de adenovirale vektorer.

A. Ad-mediert avlevering av terapeutiske molekyler

I en utførelsesform tilføres de ovenfor beskrevne rekombinante vektorer til mennesker i henhold til publiserte fremgangsmåter for genterapi. En simianviral vektor som bærer det valgte transgen, kan tilføres til en pasient, fortrinnsvis suspendert i en biologisk kompatibel oppløsning, eller en farmasøytisk akseptabel avleveringsbærer. En egnet bærer inkluderer steril saltoppløsning. Andre vandige eller ikke-vandige isotoniske, sterile injeksjonsoppløsninger og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som er kjent for å være farmasøytisk akseptable bærere, og som er velkjente for fagmannen, kan anvendes for dette formål. De simianadenovirale vektorer tilføres i tilstrekkelige mengder til å transdusere målcellen, og å gi tilstrekkelig nivå for genoverføring og ekspresjon for å tilveiebringe en terapeutisk fordel uten urimelige, ugunstige elementer, eller med medisinsk akseptable, fysiologiske effekter, som lett kan bestemmes av fagmannen på området. Konvensjonelle og farmasøytisk akseptable tilførselsruter inkluderer, men er ikke begrenset til direkte avlevering til retina og andre intraokkulære avleveringsmetoder, direkte avlevering til lever, inhalering, intranasal, intravenøs, intramuskulær, intratrakeal, subkutan, intradermal, rektal, oral eller andre parenterale veier for tilførsel. Tilførselsveier kan kombineres dersom ønskelig, eller justeres avhengig av transgenet eller betingelsene. Tilførselsveien vil primært avhenge av tilstanden som behandles.

Doseringene av den virale vektor vil avhenge av faktorer som tilstanden som behandles, alder, vekt og pasientens helse, og kan således variere blant pasienter. For eksempel er en terapeutisk effektiv voksen, human- eller veterinærdose av den virale vektor, generelt i området omkring 100 fil til omkring 100 ml bærer inneholdende konsentrasjoner fra omkring lxlO<6>til omkring lxlO<15>partikler, omkring lxlO<n>til lxlO13 partikler eller omkring lxlO<9>til lxlO12 partikkelvirus. Doseringer vil avhenge av dyrets størrelse og administreringsmodus. For eksempel vil en egnet human- eller veterinærdose (for et dyr på omkring 80 kg) for intramuskulær injeksjon ligge i området omkring lxlO<9>til 5xl0<12>partikler/ml for et enkelt sete. Eventuelt kan flere administreringsseter anvendes. I et annet eksempel kan en egnet human- eller veterinærdose ligge i området omkring lxlO<11>til omkring lxlO<15>partikler for oral formulering. Fagmannen på området kan justere disse doser avhengig av administreringsvei, og den terapeutiske eller vaksinesammensetningen der den rekombinante vektor benyttes. Ekspresjonsnivåene for transgenet, eller for et immunogen, nivået for sirkulerende antistoff kan overvåkes for bestemmelse av frekvensen av doseadministrering. Ytterligere andre fremgangsmåter for bestemmelse av tidsforløpet for administreringsfrekvens, vil være lett å se for fagmannen.

En eventuell fremgangsmåte involverer samtidig tilførsel til pasienten, enten samtidig med, før eller etter tilførsel av den virale vektor av en egnet mengde av en kortvirkende immunmodulator. Den valgte immunmodulator defineres her som et middel i stand til å inhibere dannelse av nøytraliserende antistoffer rettet mot den rekombinante vektor ifølge oppfinnelsen, eller som er i stand til å inhibere cytolytisk T-lymfocytt (CTL) eliminering av vektoren. Immunmodulatoren kan interferere med interaksjonene mellom T-hjelper sub-settene (THieller TH2) og B-celler for å inhibere nøytralisering av antistoffdannelse. Alternativt kan immunmodulatorer inhibere interaksjoner mellom Thi-celler og CTLer for å redusere opptreden av CTL-eliminering av vektoren. Et antall nyttige immunmodulatorer og doseringer for anvendelse av disse, er for eksempel beskrevet av Yang et al, J. Virol, 70(9) (september 1996); WO96/12406, publisert 2. mai 1996; samt PCT/US96/03035, idet det vises til alle disse vedrørende detaljer.

1. Terapeutiske transgener

Nyttige terapeutiske produkter som kodes av transgenet, inkluderer hormoner og vekst-og differensieringsfaktorer som uten begrensning inkluderer insulin, glukagon, veksthormon (GH), paratyroid hormon (PTH), veksthormonfrigivende faktor (GRF), follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), humant korionisk gonadotropin (hCG), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), angiopoietiner, angiostatin, granulocyt kolonistimulerende faktor (GCSF), erytropoietin (EPO), konnektiv vev-vekstfaktor (CTGF), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), sur fibroblast vekstfaktor (aFGF), epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor (TGF), plateavledet vekstfaktor (PDGF), insulin vekstfaktor I og II (IGF-I og IGF-II), enhver av den transformerende vekstfaktor superfamilie, inkludert TGF, aktiviner, inhibiner, eller ethvert av de benmorfogene proteiner (BMP) BMPene 1-15, enhver av heregluin/neuregulin/ARIA/neu differensierings faktor (NDF) familie av vekstfaktorer, nervevekstfaktor (NGF), hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofiner NT-3 og NT-4/5, siliær neurotrofisk faktor (CNTF), glialcellelinjeavledet neurotrofisk faktor (GDNF), neurturin, agrin, enhver fra familien av semaforiner/collapsiner, netrin-I og netrin-2, hepatocytt vekstfaktor (HOF), efriner, noggin, sonisk hedgehog og tyrosinhydroksylase.

Andre nyttige transgene produkter inkluderer proteiner som regulerer immunsystemet og inkluderer uten begrensning cytokiner og lymfokiner som trombopoietin (TPO), interleukiner (IL) IL-1 til IL-25 (inkludert for eksempel IL-2, IL-4, IL-12 og IL-18), monocytkemoattrakterende protein, leukemiinhibitorisk faktor, granulocytmakrofagkolonistimulerende faktor, Fas-ligand, tumornekrosefaktorer og interferoner, og stamcellefaktor, flk-2/flt3-ligand. Genprodukter som fremstilles ved immunsystemet er også nyttige ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer uten begrensning immunglobuliner IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, kimære immunglobuliner, humaniserte antistoffer, enkelkjedeantistoffer, T-celle reseptorer, kimære T-celle reseptorer, enkelkjede T-celle reseptorer, klasse I- og klasse II-MHC-molekyler, så vel som konstruerte immunglobuliner og MHC-molekyler. Nyttige genprodukter inkluderer også komplementregulatoriske proteiner som komplementregulatoriske proteiner, membran-kofaktorprotein (MCP), nedbrytningsakselererende faktor (DAF), CR1, CR2 og CD59.

Ytterligere andre nyttige genprodukter inkluderer enhver reseptor for hormoner, vekstfaktorer, cytokiner, lymfokiner, regulatoriske proteiner og immunsystemproteiner. Oppfinnelsen omfatter reseptorer for kolesterolregulering, inkludert lavtetthets lipoprotein (LDL) reseptor, høytetthets lipoprotein (HDL)reseptor, meget lavtetthets lipoprotein (VLDL) reseptor, og scavenger reseptoren. Oppfinnelsen omfatter også genprodukter som medlemmer av steroid hormonreseptorsuperfamilien inkludert glukokortikoidreseptorer og østrogenreseptorer, Vitamin D reseptorer og andre nukleære reseptorer. I tillegg inkluderer nyttige genprodukter transkripsjonsfaktorer som jun, fos, max, mad, serumresponsfaktor (SRF), API, AP2, myb, MyoD og myogenin, ETS-boksinneholdende proteiner, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-boksbindende proteiner, interferonreguleringsfaktor (IRF-1), Wilms tumorprotein, ETS-bindende protein, STAT, GATA-boksbindende proteiner, for eksempel GATA-3 og gaffelhodefamilien av vingete heliksproteiner.

Andre nyttige genprodukter inkluderer karbamoyl syntetase I, ornitintranskarbamylase, arginosuksinatsyntetase, arginosuksinatlyase, arginase, fumarylacetacetathydrolase, fenylalaninhydroksylase, a-1 antitrypsin, glukose-6fosfatase, porfobilinogen deaminase, faktor-VIII, faktor-IX, cystation p-syntase, forgrenet kjedeketosyredekarboksylase, albumin, isovaleryl-coA dehydrogenase, propionyl CoA karboksylase, metylmalonyl CoA mutase, glutaryl CoA dehydrogenase, insulin, P-glukosidase, pyruvatkarboksylat, hepatisk fosforylase, fosforylase kinase, glysindekarboksylase, H-protein, T-protein, en cystisk fibrose transmembranregulator (CFTR) sekvens og en dystrofin cDNA-sekvens.

Andre nyttige genprodukter inkluderer ikke-naturlig forekommende polypeptider som kimære eller hybride polypeptider med en ikke-naturlig opptredende aminosyresekvens inneholdende innskudd, delesjoner eller aminosyresubstitusjoner. For eksempel kunne enkelkjedekonstruerte immunglobuliner være nyttige hos visse immunkompromitterte pasienter. Andre typer ikke-naturlig forekommende gensekvenser inkluderer antisensmolekyler og katalytiske nukleinsyrer som ribozymer, som ville kunne benyttes for å redusere overekspresjon av et mål.

Reduksjon og/eller modulering av en genekspresjon er spesielt ønskelig for behandling av hyperproliferative tilstander som karakteriseres ved hyperprolifererende celler, slik som cancere og psoriasis er. Målpolypeptider inkluderer disse polypeptider som fremstilles utelukkende eller ved høyere nivåer i hyperproliferative celler, sammenliknet med normale celler. Målantigener inkluderer polypeptider kodet av onkogener som myb, mye, fyn og translokasjongenet bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk og EGRF. I tillegg til onkogenprodukter som målantigener, inkluderer målpolypeptider for anticancerbehandling og beskyttende regimer variable områder av antistoffer dannet av B-cellelymfomer og variable områder av T-cellereseptorer av T-cellelymfomer, som i visse utførelsesformer også benyttes som målantigener for autoimmune sykdommer. Andre tumorassosierte polypeptider kan benyttes som målpolypeptider, for eksempel polypeptider som finnes i høyere nivåer i tumorceller inkludert polypeptider som gjenkjennes av monoklonalt antistoff 17-1A og folatbindingspolypeptider.

Andre egnete terapeutiske polypeptider og proteiner inkluderer dem som kan være nyttige for behandling av individer som lider av autoimmune sykdommer og lidelser ved å tilveiebringe en bred basert, beskyttende immunrespons mot mål assosiert med autoimmunitet, inkludert cellereseptorer og celler som gir cellerettete antistoffer. T-cellemedierte autoimmune sykdommer inkluderer reumatoid artritt (RA), multippel sklerose (MS), Sjogrens syndrom, sarkoidose, insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), autoimmun tyroiditt, reaktiv artritt, ankyloserende spondylitt, skleroderma, polymyositt, dermatomyositt, psoriasis, vaskulitt, Wegeners granulomatose, Crohns sykdom og ulserativ kolitt. Hver av disse sykdommer karakteriseres ved T-cellereseptorer (TCR) som binder til endogene antigener og starter den inflammatoriske kaskade som assosieres med autoimmune sykdommer.

Simianadenoviralvektorene er spesielt velegnet for terapeutiske regimer hvori flere adenoviralmedierte avleveringer av transgener er ønskelig, for eksempel i regimer som involverer ny avlevering av det samme transgen, eller i kombinasjonsregimer som involverer avlevering av andre transgener. Slike regimer kan involvere administrering av en Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-simianadenoviral vektor, fulgt av readministrering med en vektor fra det samme serotypeadenovirus. Spesielt egnete regimer involverer administrering av en Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-simianadenoviral vektor, hvori serotypen av den virale vektor som avleveres ved den første tilførselen, skiller seg fra serotypen av den virale vektor som anvendes i én eller flere av de påfølgende tilførsler. For eksempel involverer et terapeutisk regime administrering av en Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-vektor og gjentatt tilførsel med én eller flere adenovirale vektorer av den samme eller ulike serotyper. I et annet eksempel involverer et terapeutisk regime tilførsel av en adenoviral vektor, etterfulgt av gjentatt tilførsel med en Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-vektor, som skiller seg fra serotypen av den først avleverte adenovirale vektor, og eventuell ytterligere tilførsel med en annen vektor som er den samme, eller fortrinnsvis skiller seg når det gjelder serotype fra vektoren i de forutgående administreringstrinn. Disse regimer er ikke begrenset til avlevering av adenovirale vektorer konstruert ved anvendelse av Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-simianserotypene . Tvert imot kan disse regimer lett benytte vektorer av andre adenovirale serotyper, inkludert uten begrensning, andre simianadenovirale serotyper, for eksempel Pan9 eller C68, Cl, osv.), eller ikke-human primatadenovirale serotyper, eller humane adenovirale serotyper, i kombinasjon med én eller flere av Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- eller SV39-vektorene ifølge oppfinnelsen. Eksempler på slike simian-, andre ikke-humane primat- og humanadenovirale serotyper er diskutert annet sted i denne beskrivelsen. Videre kan disse terapeutiske regimer involvere enten samtidig eller sekvensielt, avlevering av Pan5-, Pan6-, Pan7-, SVI-, SV25- og/eller SV39-adenovirale vektorer ifølge oppfinnelsen, i kombinasjon med ikke-adenovirale vektorer, ikke-virale vektorer, og/eller et antall andre terapeutisk nyttige forbindelser eller molekyler. Oppfinnelsen er ikke begrenset til disse terapeutiske regimer, et spektrum av slike vil lett være åpenbart for fagmannen på området.

B. Ad-formidlet avlevering av immunogene transgener

De rekombinante simianadenovirus kan også anvendes som immunogene preparater. Som anvendt heri er et immunogent preparat et preparat der et humoralt (for eksempel antistoff) eller cellulært (for eksempel en cytotoksisk T-celle) respons er reist mot et transgenprodukt avlevert av det immunogene preparat etter avlevering til et pattedyr, og fortrinnsvis en primat. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et rekombinant simian-Ad som i enhver av sine adenovirussekvensdelesjoner kan inneholde et gen som koder et ønsket immunogen. Simianadenovirus vil sannsynligvis være bedre egnet for anvendelse som levende, rekombinant virusvaksine i forskjellige animalske arter, sammenliknet med adenovirus av human opprinnelse, men er ikke begrenset til en sådan anvendelse. De rekombinante adenovirus kan anvendes som profylaktiske eller terapeutiske vaksiner mot ethvert patogen, for hvilke antigenet eller antigenene er identifisert(e), som er avgjørende for induksjon av en immunrespons og i stand til å begrense spredning av patogenet, og for hvilken den angjeldende cDNA er tilgjengelig.

Slike vaksine- (eller immunogene) sammensetninger formuleres i en egnet avleveringsbærer som beskrevet ovenfor. Generelt ligger dosene for de immunogene preparatene i de områder definert ovenfor for terapeutiske preparater. Immunitetsnivå for det valgte gen kan overvåkes for bestemmelse av behov for forsterkere, om dette er nødvendig. Etter bedømmelse av antistofftitere i serum, kan det evt. være ønskelig ned forsterket immunisering.

Eventuelt kan et vaksinepreparat ifølge oppfinnelsen formuleres til å inneholde andre komponenter, inkludert for eksempel adjuvanser, stabilisatorer, pH-justerere, preserveirngsmidler og liknende. Slike komponenter er velkjente på vaksineområdet. Eksempler på egnete adjuvanser inkluderer uten begrensning, liposomer, alum, monofosforyl lipid A og enhver biologisk aktiv faktor som cytokin, interleukin, kemokin, ligander og evt. kombinasjoner derav. Visse av disse biologisk aktive faktorer kan uttrykkes in vivo, for eksempel via et plasmid eller en viral vektor. En slik adjuvans kan for eksempel administreres med en primer DNA-vaksine som koder et antigen for å øke den antigenspesifikke immunrespons sammenliknet med den immunrespons som genereres ved priming med en DNA-vaksine som kun koder antigenet.

De rekombinante adenovirus kan administreres i en "immunogenisk mengde", dvs. en mengde rekombinant adenovirus som er effektiv i en administreringsvei for å transfektere de ønskete celler og gi tilstrekkelige nivåer av ekspresjon av det valgte gen for å indusere en immunrespons. Der beskyttende immunitet er til stede, blir de rekombinante adenovirus betraktet som vaksinepreparater nyttige for prevensjon av infeksjon og/eller gjenopptredende sykdom.

Alternativt eller i tillegg kan vektorene inneholde et transgen som koder et peptid, polypeptid eller protein som induserer en immunrespons mot et valgt immunogen. De rekombinante adenovirus ifølge oppfinnelsen er ventet å være meget effektive i indusering av cytolytiske T-celler og antistoffer mot det innførte, heterologe antigeniske protein som uttrykkes av vektoren.

For eksempel kan immunogener være valgt fira et antall virale familier. Eksempler på ønskelige, virale familier mot hvilke en immunrespons ville være ønskelig, inkluderer picornavirusfamilien, som inkluderer genera rhinovirus som er ansvarlige for omkring 50 % av tilfellene av vanlig forkjølelse; genera enterovirus som inkluderer poliovirus, coxsackievirus, echovirus, og humant enterovirus som hepatitt-A-virus; og genera aptovirus, som er ansvarlige for munn- og klovsyke, primært i ikke-humane dyr. Innen picornavirusfamilien av virus inkluderer målantigenene VP1, VP2, VP3, VP4 og VPG. En annen viral familie inkluderer calsivirusfamilien, som omfatter Norwalk-gruppen av virus som er et viktig kausativt middel ved epidemisk gastroenteritt. Ytterligere en viralfamilie som er ønskelig for anvendelse ved målrettete antigener for indusering av immunresponer hos mennesker og ikke-humane dyr er togavirusfamilien, som inkluderer genera alfavirus, som inkluderer Sindbisvirus, RossRiver virus, og venezuelisk, østlig og vestlig Equine encefalitt, og rubivirus, inkludert Rubellavirus. Flaviviridae-familien inkluderer denguefeber, gulfeber, japansk encefalitt, St. Louis encefalitt og flåttbåret encefalittvirus. Andre målantigener kan genereres fra hepatitt-C eller coronavirus-familien som inkluderer et antall ikke-humane virus som infeksiøst bronkittvirus (fjærfe), porcin transmitterbar gastroenterisk virus (gris), porcin hemagglutinerende encefalomyelittvirus (gris), felin infeksiøs peritonittvirus (katter), felin enterisk koronavirus (katter), valpekoronavirus

(hunder), og humant respiratorisk koronavirus, som kan forårsake vanlig forkjølelse og/eller ikke-A-, B- eller C-hepatitt. Innen koronavirusfamilien inkluderer målantigenene El (også benevnt M- eller matriksprotein), E2 (også benevnt S- eller Spikeprotein), E3 (også benevnt HE- eller hemagglutinelterose) glykoprotein (ikke til stede i alle koronavirus) eller N (nukleokapsid). Ytterligere andre antigener kan

målrettes mot rabdovirusfamilien, som inkluderer genera vesiculovirus (for eksempel vesiculært stomatittvirus), og den generelle lyssavirus (for eksempel rabies). Innen rabdovirusfamilien kan egnete antigener avledes fra G-proteinet eller N-proteinet. Familien filoviridae som inkluderer hemorragisk febervirus, slik som Marburg- og Ebolavirus, kan være en egnet kilde for antigener. Paramyxovirusfamilien inkluderer parainfluensavirus type-1, parainfluensavirus type-3, bovint parainfluensavirus type-3, rubulavirus (kusmavirus), parainfluensavirus type-2, parainfluensavirus type-4, Newcastle sykdomsvirus (kylling), kvegpest, morbillivirus som inkluderer meslinger og canine distemper, og pneumovirus som inkluderer respiratorisk syncytialvirus. Influensaviruset er klassifisert innen familien ortomyxovirus og er en egnet kilde for antigener (for eksempel HA-proteinet, NI-proteinet). Bunyavirusfamilien inkluderer genera bunyavirus (California encefalitt, La Crosse), flebovirus (Rift Valley feber), hantavirus (puremala er et hemahagin-febervirus), nairovirus (Nairobi sauesykdom) og forskjellige ikke-betegnete bungavirus. Arenavirusfamilien tilveiebringer en kilde for antigener mot LCM og Lassa febervirus. Reovirusfamilien inkluderer genera reovirus, rotavirus (som forårsaker akutt gastroenteritt hos barn), orbivirus, og cultivirus (Colorado fiåttfeber, Lebombo (mennesker), ekvin encefalose, blåtunge). Retrovirusfamilien inkluderer subfamilien oncorivirinal som omfatter slike human- og veterinærsykdommer som felin leukemivirus, HTL-VI og HTL-VII, lentivirinal (som inkluderer humant immunodefektvirus (HIV), simian immunodefektvirus (SIV), felin immunodefektvirus (FIV), ekvin infeksiøst anemivirus og spumavirinal). Blant lentivirus er mange egnete antigener beskrevet og kan lett velges. Eksempler på egnete HIV- og SIV-antigener inkluderer uten begrensning gag-, pol-, Vif-, Vpx-, VPR-, Env-, Tat-, Nef- og Rev-proteiner, så vel som forskjellige fragmenter derav. For eksempel kan egnete fragmenter av Env-proteinet inkludere enhver av dets subenheter som gpl20, gpl60, gp41 eller mindre fragmenter derav, for eksempel med en lengde på minst omkring 8 aminosyrer. Tilsvarende kan fragmenter av tat-proteinet velges. (Se for eksempel U.S. patent nr. 5 891 994 og U.S. patent nr. 6 193 981). Se også HIV- og SIV-proteinene som beskrevet av D. H. Barouch et al, J. Virol, 75(5):2462-2467 (mars 2001), og R. R. Amara et al, Science, 292:69-74 (6. april 2001). I et annet eksempel kan HIV- og/eller SIV-immunogene proteiner eller peptider benyttes for å danne fusjonsproteiner eller andre immunogene molekyler. Se for eksempel HIV-1 Tat-og/eller -Nef fusjonsproteiner og immuniseringsregimene beskrevet i WO 01/54719, publisert 2. august 2001, samt WO 99/16884, publisert 8. april 1999. Oppfinnelsen er ikke begrenset til de HIV- og/eller SIV-immunogene proteiner eller -peptider som er beskrevet heri. I tillegg er en varietet av modifikasjoner av disse proteiner beskrevet eller kan lett oppnås av fagmannen. Se for eksempel det modifiserte gag-protein beskrevet i U.S. patent nr. 5 972 596. Videre kan ethvert HIV- og/eller SIV-immunogen avleveres alene eller i kombinasjon. Slike kombinasjoner kan inkludere ekspresjon fra en eller flere vektorer. Eventuelt kan andre kombinasjoner involvere avlevering av ett eller flere uttrykte immunogener ved avlevering av ett eller flere av immunogenene i proteinform. Slike kombinasjoner er diskutert i større detalj nedenfor.

Papovavirusfamilien inkluderer subfamilien polyomavirus (BKU- og JCU-virus), og subfamilien papillomavirus (assosiert med cancere eller malign progresjon av papilloma). Adenovirusfamilien inkluderer virus (EX, AD7, ARD, O.B.) som forårsaker respiratorisk sykdom og/eller enteritt. Parvovirusfamilien inkluderer felint parvovirus (felint enteritt), felint panleucopeniavirus, valpeparvovirus og porcint parvovirus. Herpesvirusfamilien inkluderer subfamilien a-herpesvirinae, som omfatter genera simpleksvirus (HSV-I, HSV-II), varicellovirus (pseudorabies, varicella zoster) og subfamilien P-herpesvirinae, som inkluderer genera cytomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) og subfamilien y-herpesvirinae, som inkluderer genera lymphocryptovirus, EBV (Burkitts lymfom), infeksiøs rhinotracheitis, Mareks sykdomsvirus og radinovirus. Poxvirusfamilien inkluderer subfamilien kordopoxvirinae, som omfatter genera ortopoxvirus (Variola (småkopper) og vaccinia (kukopper)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus og subfamilien entomopoxvirinae. Hepadnavirusfamilien inkluderer Hepatitt-B-virus. Et ikke-klassifisert virus som kan være en egnet kilde for antigener er hepatitt 5-virus. Ytterligere andre virale kilder kan inkludere avianinfeksiøst, bursalt sykdomsvirus og porcin respiratorisk- og reproduktivt syndromvirus. A-virusfamilien inkluderer ekvin arteritt virus og forskjellige encefalittvirus.

Immunogener er nyttige for immunisering av et menneske eller ikke-humant dyr mot andre patogener, inkludert bakterier, sopp, parasittmikroorganismer eller multicellulære parasitter som infiserer human- og ikke-human vertebrater, eller fra en cancercelle eller tumorcelle. Eksempler på bakterielle patogener inkluderer patogeniske grampositive cocci, inkludert pneumokokker; stafylokokker; og streptokokker. Patogene gramnegative cocci inkluderer meningokokker; gonokokker. Patogene enteriske gramnegative bacilli inkluderer enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria og eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (som forårsaker sjanker); brucella; Franisella tularensis (som forårsaker tularemi); yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis and spirillum; grampositive bacilli inkluderer listeria monocytogener; erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (difteri); cholera; B. anthracis (antrax); donovanosis (granuloma inguinale); og bartonellose. Sykdommer forårsaket av patogene anaerobe bakterier inkluderer tetanus; botulisme; andre klostridia; tuberkulose; lepra; og andre mycobakterier. Patogene spirochetale sykdommer inkluderer syfilis; treponematoser; yaws, pinta og endemisk syfilis; og leptospirose. Andre infeksjoner som forårsakes av høyere patogene bakterier og patogenisk sopp inkluderer actinomycosis; nocardiosis; cryptococcosis, blastomycosis, histoplasmosis og coccidioidomycosis; candidiasis, aspergillosis og mucormycosis; sporotrichosis; paracoccidiodomycosis, petriellidiosis, torulopsosis, mycetoma og chromomycosis; og dermatophytosis. Rickettsiale infeksjoner inkluderer tyfusfeber, Rocky Mountain flekkfeber, Q-feber og rickettsiale kopper. Eksempler på mykoplasma og klamydisk infeksjon inkluderer: mykoplasma pneumoniae; lymphogranuloma venereum; psittacosis; og perinatalklamydial infeksjoner. Patogene eukaryoter omfatter patogene protozoer og helminter og infeksjoner dannet av disse inkluderer: amebiasis; malaria; leishmaniasis; trypanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; trichinosis; filariasis; schistosomiasis; nematodes; trematodes eller flukes; og cestode (bendelorm) infeksjoner.

Mange av disse organismer og/eller toksiner som fremstilles av disse er identifisert av "Centers for Disease Control" [(CDC), Department of Health and Human Services, USA], som midler som har et potensiale for anvendelse ved biologiske angrep. For eksempel inkluderer noen av disse biologiske midler Bacillus anthracis (antrax), Clostridium botulinum og dettes toksin (botulisme), Yersiniapestis (pest), variola major (småkopper), Francisella tularensis (tularemi), og viral hemorrhagisk feber [filovirus (for eksempel Ebola, Marburg], og arenavirus [for eksempel Lassa, Machupo]), der alle i dag er klassifisert som midler kategori A; Coxiella burnetti (Q-feber); Brucella specier (brucellose), Burkholderia mallei (snive), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), vicinus communis og dennes toksin (ricintoksin), Clostridium perfringens og dennes toksin (epsilontoksin), Staphylococcus species og deres toksiner (enterotoksin B), Chlamydia psittaci (psittacosis), vannsikkerhetstrusler (for eksempel Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), tyfusfeber ( Richettsia powozekil), og viral encefalitt (a-virus, for eksempel Venezuelansk ekvin encefalitt; østlig ekvin encefalitt; vestlig ekvin encefalitt); alle i dag klassifisert som midler kategori B; og nipanvirus og hantavirus som i dag er klassifisert som midler kategori C. I tillegg kan andre organismer som er klassifisert slik eller på annen måte identifiseres og/eller benyttes for et slikt formål i fremtiden. Det vil være lett forståelig at de virale vektorer og andre konstruksjoner som er beskrevet her er nyttige for å avgi antigener fra disse organismer, virus, deres toksiner eller andre biprodukter, som vil forhindre og/eller behandle infeksjoner eller andre ugunstige reaksjoner med disse biologiske midler.

Tilførsel av vektorene for avlevering av immunogener mot det variable området av T-cellene, utløser en immunrespons inkludert CTL for å eliminere disse T-celler. I RA er flere spesifikt variable områder av TCR som er involvert i sykdommen,karakterisert. Disse TCR inkluderer V-3, V-14, V-17 og Va-17. Avlevering av en nukleinsyresekvens vil således som koder minst ett av disse polypeptider, utløse en immunrespons målrettet mot T-celler involvert i RA. Ved MS er flere spesifikt variable områder av TCR som er involvert i sykdommenkarakterisert. Disse TCR inkluderer V-7 og Va-10. Avlevering av en nukleinsyresekvens som koder minst ett av disse polypeptider, vil således utløse en immunrespons målrettet mot T-celler involvert i MS. I skleroderma er detkarakterisertflere spesifikt variable områder av TCR involvert i sykdommen. Disse TCR inkluderer V-6, V-8, V-14 og Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va28 og Va-12. Avlevering av en rekombinant simianadenovirus som koder minst ett av disse polypeptider vil således utløse en immunrespons målrettet mot T-celler involvert i skleroderma.

C. Ad-formidlete avleveringsfremgangsmåter

De terapeutiske nivå eller immunitetsnivå for det valgte gen kan overvåkes for bestemmelse av behov for forsterkere om nødvendig. Etter en bedømmelse av CD8<+>T-cellerespons eller eventuelt antistofftitrene i serum, kan eventuelle forsterkerimmuniseringer være ønskelig. De rekombinante simianadenovirale vektorer kan eventuelt avleveres i en enkelt tilførsel eller i forskjellige kombinasjonsregimer, for eksempel i kombinasjon med et regime eller et behandlingsforløp som involverer andre aktive bestanddeler, eller i et prime-boost regime. Et antall slike regimer er beskrevet i teknikken og kan lett velges.

For eksempel kan prime-boost regimer involvere tilførsel av en DNA (for eksempel plasmid) basert vektor for å prime immunsystemet for en andre boostertilførsel med et tradisjonelt antigen, for eksempel et protein eller et rekombinant virus som bærer sekvensene som koder et slikt antigen. Se for eksempel WO 00/11140, publisert 2. mars 2000 for detaljer. Alternativt kan et immuniseirngsregime involvere tilførsel av en rekombinant simianadenoviralvektor ifølge oppfinnelsen for å forsterke immunresponsen mot en vektor (enten viral eller DNA-basert) som bærer et antigen eller et protein. I nok et alternativ involverer et immuniseringsregime tilførsel av et protein, fulgt av forsterkning med en vektor som koder antigenet.

Det er mulig å skaffe til veie en fremgangsmåte for priming og forsterkning av en immunrespons mot et valgt antigen ved å avlevere en plasmid-DNA-vektor som bærer nevnte antigen, fulgt av forsterkning med en simianadenoviral vektor. I en utførelsesform involverer prime-boost regimet ekspresjon av flere proteiner fra prime-og/eller boost-bæreren. Se for eksempel R. R. Amara, Science, 292:69-74 (6. april 2001) som beskriver et multiproteinregime for å uttrykke proteinsubenhetene som kan anvendes for å generere en immunrespons mot HIV og SIV. For eksempel kan en DNA-prime avgi Gag, Pol, Vif, VPX, Vpr, Env, Tat og Rev fra et enkelt transkript. Alternativt blir SIV Gag, Pol og HIV-1 Env avgitt i en rekombinant adenoviruskonstruksjon ifølge oppfinnelsen. Ytterligere andre regimer er beskrevet i WO 99/16884 og WO 01/54719.

Prime-boost regimer er imidlertid ikke begrenset til immunisering mot HIV eller avlevering av disse antigener. For eksempel kan priming involvere avlevering med en første sjimpvektor, fulgt av forsterkning med en andre sjimpvektor, eller med et preparat inneholdende antigenet selv i proteinform. I et eksempel kan prime-boost regimet tilveiebringe en beskyttende immunrespons mot viruset, bakterien eller andre organismer, hvorfra antigenet er avledet. Det er mulig å tilveiebringe prime-boost regimet en terapeutisk effekt som kan måles ved anvendelse av konvensjonelle analyser for påvisning av nærværet av tilstanden, mot hvilken terapi administreres.

Primingpreparatet kan administreres ved forskjellige seter i kroppen på doseavhengig måte, som avhenger av antigenet, som den ønskete immunresponsen målrettes mot. Den behøver imidlertid ikke være begrenset til mengde eller sete for en eller flere injeksjoner eller den farmasøytiske bærer. Tvert imot kan regimet involvere et priming-og/eller forsterkertrinn, der hvert trinn kan inkludere en enkelt dose eller en dosering som administreres hver time, daglig, ukentlig, månedlig eller årlig. Som et eksempel kan pattedyr motta en eller flere doser inneholdende mellom omkring 10 ug til omkring 50 ug plasmid i bærer. En ønskelig mengde av et DNA-preparat ligger mellom omkring 1 ug til 10000 ug av DNA-vektoren. Doser kan variere fra omkring 1 ug til 1000 ug DNA/kg individkroppsvekt. Mengde eller sete for avlevering velges helst basert på pattedyrets identitet og tilstand.

Vektorens doseringsenhet som er egnet for avlevering av antigenet til pattedyret, er beskrevet heri. Vektoren tilpasses for tilførsel ved suspendering eller oppløsning i en farmasøytisk eller fysiologisk akseptabel bærer som isotonisk saltoppløsning, oppløsning av isotoniske salter eller andre formuleringer som vil være åpenbare for fagmannen. Den egnete bærer vil være åpenbar for fagmannen, og vil i stor del avhenge av tilførselsvei. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et pattedyr i henhold til de veier beskrevet ovenfor, i en formulering med opprettholdt frigivelse ved anvendelse av en bionedbrytbar, biokompatibel polymer, eller ved på-stedet-avlevering ved anvendelse av misceller, geler og liposomer. Eventuelt inkluderer primingstrinnet ifølge oppfinnelsen også tilførsel med primingspreparat av en egnet adjuvansmengde, som definert heri.

Fortrinnsvis blir forsterkerpreparatet tilført omkring 2 til 27 uker etter tilførsel av primingspreparatet til pattedyrindividet. Administreringen av forsterkerpreparatet gjennomføres ved anvendelse av en effektiv mengde av et forsterkerpreparat, inneholdende eller i stand til å avlevere det samme antigen som ble tilført ved priming DNA-vaksinen. Forsterkingspreparatet kan bestå av en rekombinant viral vektor, avledet fra den samme virale kilde (for eksempel adenovirale sekvenser ifølge oppfinnelsen) eller fra en annen kilde. Alternativt kan "forsterkerpreparatet" være et preparat inneholdende det samme antigen som kodet i priming-DNA-vaksinen, men i form av et protein eller peptid, der preparatet induserer en immunrespons hos verten. I en annen utførelsesform inneholder forsterkerpreparatet en DNA-sekvens som koder antigenet under kontroll av en regulatorisk sekvens som styrer ekspresjonen i en pattedyrcelle, for eksempel vektorer som velkjente bakterievektorer eller virale vektorer. Primærkravene for forsterkerpreparatet er at preparatets antigen er det samme antigen, eller et kryssreaktivt antigen som det som kodes av primingpreparatet.

Simianadenoviralvektorene kan også være velegnete for anvendelse i et antall andre immuniseringer og terapeutiske regimer. Slike regimer kan involvere avlevering av simianadenovirale vektorer ifølge oppfinnelsen, samtidig eller sekvensielt med Ad-vektorer eller forskjellige serotypekapsider, regimer der de adenovirale vektorer avgis samtidig eller sekvensielt med ikke Ad-vektorer, regimer der de adenovirale vektorene avgis samtidig eller sekvensielt med proteiner, peptider og/eller andre biologisk nyttige terapeutiske eller immunogene forbindelser. Slike anvendelser vil være åpenbare for fagmannen.

De følgende eksempler illustrerer kloning av simianadenovirus og konstruksjonen av eksempler på rekombinante adenovirusvektorer.

Eksempel 1 - Viral propagering

Pan5 (ATCC aksessnr. VR-591)-, Pan6 (ATCC aksessnr. VR-592)- og Pan7 (ATCC aksessnr. VR-593)-virus, opprinnelig isolert fra sjimpanse lymfeknuter, ble propagert i 293-celler (ATCC CRL1573). Typisk ble disse celler dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO), supplert med 10 % føtalt kalveserum (FCS) (Sigma eller Hyclone, Logan, UT) og 1 % penicillin-streptomycin (Sigma). Infeksjon av 293-celler gjennomføres i DMEM supplert med 2 % FCS de første 24 timer, hvoretter FCS tilsettes for å bringe sluttkonsentrasjonen til 10 %. Infiserte celler høstet når 100 % av cellene viser virusindusert, cytopatisk effekt (CPE), og de samles deretter og konsentreres ved sentrifugering. Cellepelletts resuspenderes i 10 mM Tris (pH 8,0) og lyseres ved tre sykluser av frysing/tining. Virusprepareringen oppnås etter to ultrasentrifugeringstrinn på cesiumkloridtetthetsgradienter, og virusforråd fortynnes til 1 til 5x1012 partikler/ml i 10 mM Tris/100 mM NaCl/50 % glyserol og lagres ved -70

°C.

293-cellenes evne til å propagere disse adenovirus overskred forventningene som var basert på kunnskap om andre ikke-humane adenovirusserotyper.

Eksempel 2 - Karakterisering av viralgenomisk- DNA

Genomisk DNA ble isolert fra rensete viruspreparater fra eksempel 1 og fordøyd med HindlU- eller Æa/wHl-restriksjonsenzymer i henhold til produsentenes anbefalinger. Resultatene (ikke vist) viste at Pan5-, Pan6-, Pan7-genomene ifølge oppfinnelsen og det publiserte Pan9 (C68) genomet viste forskjellige restriksjonsrnønstre og derfor er distinkte fra hverandre.

Nukleotidsekvensene for Pan5, Pan6 og Pan7 ble bestemt. Nukleotidsekvensen for topptråden av Pan5 DNA er angitt i SEKV. ID nr. 1. Nukleotidsekvensen for topptråden av Pan6 DNA er angitt i SEKV. ID nr. 5. Nukleotidsekvensen for topptråden av Pan7 DNA er angitt i SEKV. ID nr. 9.

Regulatoriske, kodende områder i de virale DNA-sekvenser ble identifisert ved homologi til kjente adenovirale sekvenser ved anvendelse av "Clustal W"-programmet som beskrevet ovenfor ved konvensjonelle innstillinger. Se tabellene ovenfor som gir de adenovirale sekvenser. Åpne leserammer ble translaterte og de predikterte aminosyresekvenser undersøkt for homologi med tidligere beskrevne adenovirale proteinsekvenser, Ad4, Ad5, Ad7, Adl2 og Ad40.

Analyse av sekvensen viste en genomorganisering tilsvarende den til stede i humant adenovirus med den største likhet overfor humant Ad4. Imidlertid ble vesentlige forskjeller i de hexonhypervariable områder registrert mellom sjimpanseadenovirus og andre kjente adenovirus inkludert AdHu4. Disse forskjeller passer godt inn i de serologiske kryssreaktivitetsdata som er oppnådd (se nedenfor).

En oppstilling av en del av hexonsekvensene er vist i figur 1. Delen som vises er fra området av hexon som tilsvarer de utover anordnete forlengete løkker DEI og FG1, der den største variabiliteten mellom serotypene observeres.

En intervenerende del som bidrar til hexonbasen (tilsvarende residier 308-368 av den publiserte AdC68-sekvens; U.S. patent nr. 6 083 716), og er høyt bevart mellom serotypene, er også til stede. Den påfølgende tabell oppsummerer parvise sammenlikninger av aminosyrene i hexonproteinene.

Analyse av fiberknoppdoménet (som er ansvarlig for reseptorbindingen) i sjimpanseadenovirus, viser en total likhet i struktur (figur 2).

Graden av sekvenslikhet mellom El-proteinene av HuAd5 og C68 (se tabellene nedenfor) er lik dem mellom HuAd5 og Pan5, Pan6 og Pan7.

Replikasjonsdefekte versjoner av AdC5, AdC6 og AdC7 ble skapt ved molekylære kloningsmetoder som beskrives i de påfølgende eksempler, hvori minigenkassetter ble innskutt i stedet for Ela- og Elb-genene. De molekylære kloner av de rekombinante virus ble ivaretatt og dyrket i 293-celler for storskalarensing ved anvendelse av den publiserte cesiumklorid (CsCl) sedimenteringsmetode (K. Fisher et al., J. ViroL, 70:520

(1996)). Vektorutbyttene var basert på 50 plate (150 mm) preps hvor omkring

lxlO<9>293-celler ble infisert med de tilsvarende virus. Utbytter ble bestemt ved å måle viralpartikkelkonsentrasjonene spektrofotometrisk. Etter å ha konstruert El-deleterte

vektorer, ble det bestemt at HEK293-celler (som uttrykker humant adenovirusserotype 5E1-funksjoner) transkompletterer El-delesjonene av de nye virale vektorer og tillater produksjon av høytiterforråd. Eksempler på virusutbytter for noen av disse rekombinante virus er vist i tabellen nedenfor.

Transgenene for disse vektorene, p-galaktosidase (LacZ), grønt fluorescentprotein (GFP), a-l-antitrypsin (Al AT), ebola glykoprotein (ebo), et løselig ebola-glykoproteinvariant som mangler transmembrane og cytoplasmiske doméner (sEbo), og tre delesjonsmutanter av ebola glykoproteinet (EboA2, EboA3 og EboA4), ble uttrykt av cytomegaloviruspromoteren (CMV).

Evnen hos humant adenovirus El til og transkomplettere de El-deleterte sjimpansevirus ifølge oppfinnelsen, er meget fordelaktig da dette tillater produksjon av El-deleterte sjimpanseadenovirale vektorer ifølge oppfinnelsen, mens risikoen for homolog rekombinering pga. sekvensforskjellene mellom humant Ad og det her beskrevne sjimpanseadenovirus reduseres eller elimineres.

Eksempel 3 - Serologiske studier av Pan5-, Pan6- og Pan7- virus

På grunn av forskjellene i det hexonhypervariable området, ble det antatt C5-, C6- og C7-virus ville være serologisk distinkte fra humant adenovirus inkludert AdHu4.

1. Kryssreaktivitet av villtypevirus

Replikasjonskompetente virus ble anvendt for avsøking av villtypevirus for å bestemmelse av antistoff kryssreaktivitet, og inhibering av cytopatiske defekter (CPE) ble målt. Kort sagt ble preparater av adenovirus (AdHu5, Pan5, Pan6, Pan7 og AdC68) lagret ved 5xl0<12>partikler/ml, fortynnet 1/600 for analysene. Denne konsentrasjonen av virus ble valgt fordi den resulterte i 100 % CPE innen 48 timer i fravær av nøytralisering. Før tilsetting av virus til 293-celler (4x10<4>celler/brønn i en 96 brønners plate) ble det tilsatt 1:20 fortynninger av serum. Analysene avleses som nærvær eller fravær av CPE; full nøytralisering avleses som ingen cytopatisk effekt. Resultatene er oppsummert i tabellen nedenfor. Det faktum at 9/36 humant serum nøytralisert AdHu5 induserte CPE, er konsistent med tidligere beregninger for nøytraliserende antistoffer i den humane populasjon. Tallene antyder det totale antall individer som viser nøytralisering (numerator) versus det totale antall avsøkt (denominator). ND = ikke bestemt.

Av alle avsøkte humane sera var 35/36 negative for nøytralisering mot AdC68, mens 36/36 var negative for nøytralisering mot Pan5, Pan6 og Pan7. Av 52 rhesusaper som ble avsøkt, viste ingen nøytralisering mot noe sjimpanseadenovirus; rhesusapen er den foretrukne prekliniske modell for evaluering av HIV-vaksine. Mellom 9 og 12 av 20 sjimpanser hadde vesentlig nøytralisering mot én eller en annen av sjimpanseadenoviruser, er konsistent med det faktum at disse i realiteten er endemisk sjimpansespesifikke patogener. Interessant er at det er sjimpanser med nøytraliserende antistoffer kun mot Pan5, Pan6 eller AdC68, noe som støtter hypotesen at flere av disse sjimpanseadenovirale vektorer ikke vil kryssnøytralisere hverandre, og er distinkte serotyper.

Den samme analyse ble gjennomført for 20 sjimpanseserumprøver. Femti prosent (50 %) av prøvene reagerte serologt, i forskjellig grad mot Pan5; 40 % mot Pan6; 55 % mot Pan7 og 60 % mot C68. Blant de positive serumprøver hadde én av dem sterk nøytraliserende aktivitet mot alle fire sjimpvirus.

2. Kryssnøytralisering med rekombinante virus

Høytiterpolyklonale antistoffer ble oppnådd mot hver av simianadenovirusene for mer nøyaktig måling av graden av kryssnøytralisering blant de forskjellige serotyper. Dette ble gjort ved intramuskulær immunisering av kaniner ved anvendelse av rekombinant virus inneholdende GFP basert på det tidligere beskrevne C68-sjimpanseadenovirus som en adjuvans. Dette serum ble så anvendt for å analysere på nøytraliserende aktivitet mot hver av de tre sjimpanseadenoviruser ifølge oppfinnelsen, AdC5, AdC6 og AdC7. En kanin ble injisert med 5x10<12>viralpartikler pr. kg med C68CMVGFP-vektor intramuskulært og forsterket fem uker senere ved anvendelse av den samme dosen. En blodtapping samlet den niende uke viste ekstremt potent nøytraliserende aktivitet mot C68 så vel som Pan5 og Pan7, men ikke mot Pan6 (se tabellen nedenfor), noe som antyder at administreringen av en C68 (eller Pan5- eller Pan7-) basert vaksine kunne være effektiv, etterfulgt av anvendelse av en vektorbasert forsterkning på Pan6. Imidlertid er det funnet at dette nivå av inter-sammenheng ikke nødvendigvis er forhindrende for readministrering i en innstilling der antivirale antistofftitere ikke var så høye som det ble oppnådd i denne kaninen. I den påfølgende tabellen indikerer + 33 % CPE; ++ 66 % CPE; +++ 100 % CPE.

3. Kvantitativ analyse for påvisning av nøytraliserende antistoff Resultatene ble vurdert ved en mer kvantitativt basert analyse for å påvise nøytraliserende antistoff, og som er basert på transduksjon av en GFP-vektor. Kort sagt ble grupper av C57BL76-mus immunisert intramuskulært eller intravenøst med 5,0x10<10>partikler/ml Pan5, Pan6, Pan7 eller C68. Sera fra tappinger på dag 28 ble testet på kryssnøytraliserende aktivitet mot C68CMVEGFP ved fortynninger på 1:20 og 1:80. Som en oppsummering og når et farmasøytisk preparat av human immunglobulin ble testet på serologiske reaksjoner mot Pan5, Pan6, Pan7 og C68, ble det påvist noen lave nivå av nøytraliserende aktiviteter mot Pan7 og C68. Det ble ikke påvist noen nøytraliserende aktivitet mot Pan5 eller Pan6. Serumprøver fra 36 humane individer ble kjørt gjennom den samme analyse. Serumprøvene ble testet i en fortynning på 1:20. Resultatene antydet at kun ett individ hadde klar nøytraliserende aktivitet mot C68. Det ble ikke påvist nøytraliserende aktivitet for Pan5, Pan6 eller Pan7.

4. In vitro kryssnøytralisering

Kryssnøytralisering av simianadenovirusene ved høytiterkaninpolyklonale antistoff mot hver av adenovirusene Pan5, Pan6, Pan7 og C68, ble undersøkt.

Kaninene ble immunisert med intramuskulære injeksjoner av 10<13>partikler av hver av sjimpanseadenovirusene og forsterket 40 dager senere med den samme dose med ufullstendig Freunds adjuvans. Sera ble analysert på nærvær av nøytraliserende antistoff ved inkubering av to ganger seriefortynninger med IO<9>genomkopier av hver av de egnete sjimpanseadenovirusvektorer som uttrykte GFP og testet på forminskning av GFP-ekspresjon anvendt på 293-celler. Serumfortynningen som produserte en 50 % reduksjon av GFP-ekspresjon, ble bedømt som den nøytraliserende antistofftiter mot det spesielle virus.

Resultatene er oppsummert i tabellen. Disse data er konsistente med forventningen fra sekvensanalyse av hexonaminosyresekvensene som antydet at Ad-Pan6 sannsynligvis ville være den mest serologt distinkte, sammenliknet med de andre sj impanseadenovirus.

For bestemmelse av hvorvidt antistoffer som kryssreagerer med simianadenovirus sannsynlig ville være av lav prevalens i mennesker, ble simianadenovirus SVI, SV39 og SV25 testet for evnen til å motstå nøytralisering når de var inkubert med kommersielt tilgjengelige sammenslåtte immunglobuliner (lg). Den samme analyse ble også gjennomført med AdHu5 og sjimpanseadenovirus Pan5, Pan6, Pan7 og C68.1 en videre studie ble sera fra mus immunisert med en av sjimpanse virusene C5, C6, C7 og C68, og deres evne til å kryssnøytralisere simianadenovirusene SV15, SV23, SA17 og bavianadenovirus ble testet. Det ble ikke observert noen kryssreaktivitet i noen av disse tilfeller.

Eksempel 4 - Generering av rekombinant El- deletert Pan5- vektor

Et modifisert pX-plasmid ble fremstilt ved å ødelegge Fspl-setet i bla-genområdet av pX (Clontech) ved seterettet mutagenese. Det resulterende modifiserte plasmid, benevnt pX', er et sirkulært plasmid på 3000 bp inneholdende et fl-ori og et ampicillinresistensgen (AmpR-cds).

A. Fremstilling av Pan5 adenovirusplasmid

En polylinker for sekvensiell kloning av Pan5-DNA-fragmenter i pX' skapes. Polylinkeren innsettes i stedet for den eksisterende pX'-polylinkeren etter fordøying

med Mlul og EcoRI. Det butte FseMragmentet av Pan5 innføres i Smal- og Fsel- setene av polylinkeren. Fragmentet inneholder den 5' ende av det adenovirale genomet (bp 1 til 3606, SEKV. ID nr. 1). SnaBI- FspI- fmgmentet av Pan5 (bp 455 til 3484, SEKV. ID nr. 1) erstattes med en kort sekvens flankert av I- Ceu- og Pl- Sce- setene fra pShuttle (Clontech), for å eliminere El-området av det adenovirale genomet. Det butte EcoRI-fragmentet av Pan5 (bp 28658 til 36462, SEKV. ID nr. 1), innføres i EcoRI- og EcoRV-setene av polylinkeren (for å gi den 3' ende av det adenovirale genomet); Fsel- Mlul-fragment (bp 3606 til 15135, SEKV. ID nr. 1) innføres i polylinkeren; og MluI- EcoRI-fragmentet innføres i polylinkeren (bp 15135 til 28568, SEKV. ID nr. 1). Eventuelt innføres et ønsket transgen i I- Ceul- og Pl- Scel- setene i den nylig skapte pX'Pan5AEl-vektoren.

B. Alternativ fremgangsmåte for generering av pX' Pan5AEl

Det opprinneølige plasmid pX er avledet fra pAdX-adenovirusplasmid tilgjengelig fra Clontech, som beskrevet ovenfor. Deretter ble et Pac/-^o/-område av pX' deletert og den butt-endete Pan5-polylinkeren ble innsatt i Fspl- setet for å generere pXTLNK (2994 bp). Det 5' ende Fsef-området av Pan5 (bp 1-3607, SEKV. ID nr. 1), ble innsatt i Smal- og Fsel- setene av pX'LNK for å generere pX'Pan5-5' plasmid (6591 bp). SnaBi-Ndel- området av pX'Pan5-5' ble utskåret og erstattet med Cew/Sce-kassetten, som var PCR-amplifisert fra pRCS for å skape pX'Pan5-5'AEl (4374 bp). I korthet ble en sekvens inneholdende I- Ceul- og Pl- Scel "sjeldne" kutterseter PCR-forsterket fra pRCS (3113 bp). Den 3' PCR-primeren ble innført ved et Ndel- sete i PCR-produktet.

For å forlenge Pan5-DNA i pX'Pan5-5'AEl (4374 bp), ble Fsel- MluI- otaikdet av Pan5 (bp 3607-15135, SEKV. ID nr. 1) tilsatt for å skape pX'Pan5-5'Mlu (15900 bp). Den gjenværende MluI-3' ende av Pan5-sekvensen (bp 15135-36462, SEKV. ID nr. 1), ble tilsatt til vektoren mellom Mlul- og EcoRV-setene av vektorpolylinkeren for å danne pX'Pan5AEl, som inneholder fullengde Pan5-sekvensen inneholdende en delesjon i El-området.

C. Generering av rekombinante virus

For å generere de rekombinante adenovirus fra pX'Pan5AEl, ble plasmidet transfektert med en hjelper som uttrykker El, eller fra en El-uttrykkende pakkende cellelinje, slik som 293-cellelinjen eller en cellelinje fremstilt som beskrevet heri. Ekspresjonen av El i den pakkende cellene tillater replikering og pakking av Pan5AEl i et virionkapsid. I en annen utførelsesform blir den pakkende cellen som er transfektert med pX'Pan5AEl transfektert med en adenovirusvektor, som beskrevet ovenfor, som bærer transgenet av interesse. Homolog rekombinering inntrer mellom hjelperen og plasmidet, noe som tillater adenovirustransgensekvensene i vektoren replikeres og pakkes i virionkapsider, noe som resulterer i det rekombinante adenovirus.

Transfeksjon etterfølges av et agaroverlegg i to uker, hvoretter virusene plakkes, ekspanderes, og avsøkes for ekspresjon av transgenet. Flere ytterligere runder av plakkrensing etterfølges av ytterligere kulturekspansjon. Til slutt høstes cellene, en virusekstrakt fremstilles og det rekombinante sjimpanseadenovirus inneholdende det ønskete transgen renses ved utstrakt tetthetsultrasentrifugering i en CsCi-gradient eller ved alternative midler, velkjente for fagmannen.

Eksempel 5 - Generering av rekombinant El- deletert Pan6- vektor A. Strategi for konstruksjon av Pan6-adenoviralt plasmid

1. Kloning av terminalfragmenter

Pan6-virus deproteineres ved pronase- og proteanase K-behandling og fenolekstrahering. Syntetiske 12 bp Pme-I-linkere ligeres på det virale DNA, som beskrevet av Berkner og Sharp i Nucleic Acids Research, 11:6003 (1983). Det virale DNA fordøyes så vaeåXbal for å isolere et 5' terminalfragment (6043 bp). Ad6^2>al 5' fragmentet ligeres så inn i pX-linken ved Smal- og Xbal- setene for å danne pX-AdPan6-0-16.5. Det virale DNA med Pmel-linkerne fordøyes også med PacI for å isolere 6475 bp 3' terminalfragmentet og klones inn i pX-linken ved PacI- og Smal-setene, noe som resulterer i pXAdPan6-82-100.

2. Delesjon av El fra den 5' klonen

For å deletere El (m.u. 1.2-9), ble BsiWi-X&al-fragmentet i pX-AdPan6-0-16.5 erstattet med et PCR-fragment som spenner over m.u.9-16.7-fragmentet behandlet med BsiWi ogXbal, noe som fører til pX-Ad-Pan6 m.u.0-1, 9-16.5. 3. Fusjon av 5'- og 3 '- klonene og dannelse av et ankersete for å akseptere det midtre Hindlll- fragmentet

Først blir 5' klonen pX-Ad-Pan6 m.u.0-1, 9-16.5 ytterligere ekspandert ved innføring av det andre Xføl-fragment (4350 bp, m.u. 16.5-28) fra Pan6-genomet inn i Xbal- setet i pXAd-Pan6 m.u.0-1, 9-16.5. Denne konstruksjonen kalles pXAd-Pan6-mu 0-1, 9-28.

Deretter blir 3'-klonen også ekspandert ved innføring av 15026 bp Mlul/Pacl-fragmentet som dekker m.u.41-82 fra Pan6-genomet i MluI/PacI-setene av pXAdPan6-82-100, for å generere pXAdPan6-m.u.41-100.

Så blir et 8167 bp HindiWEco 47III Pan6-fragment isolert fra pXAd-Pan6-mu 01, 9-28 og subklonet inn i pXAdPan6-m.u.41-100 ved HinsIII- og JÆal-butt-setene. Denne 5'-og 3'-fusjonsklonen kalles pXAdPan6muO-l, 9-19.5, 64-100. 4. Dropping av det midtre genomfragmentet inn i fusjonsklonen Et 16335 bp HindHI-fragment (m.u. 19.5-64) fra Pan6 innføres i ///«alll-setet av pXAdPan6muO-l, 9-19.5, 64-100 for å danne pXAdPan6-0-l, 9-100. 5. Innføring av en PKGFP- s elektiv markør i det endelige konstrukt for direkte kloning av genet av interesse og grønn/ hvit seleksjon av rekombinante transformanter En minigenkassett som uttrykker GFP under en lac-promoter og som er flankert med gjenkjenningsseter for "sjeldne" intronkodende restriksjonsenzymer, PI-Sce I og I-Ceu I, ble isolert fra pShuttle-pkGFP (bare) ved Sap I- og Dra III-fordøying fulgt av innfyllingsreaksjon. pShuttle-pkGFP (bare) plasmidet er 4126 bp langt, og inneholder et ColEl-Ori, et kanamycinresistensgen, plac, en LacZ-promoter-GFPmut3-l eds (Clontech), og et GFPmut3-l eds (Clontech). Denne kassetten subklones inn i Srf I kuttet og avstumpet pXAdPan6-0-l, 9-100. Dette siste konstrukt kalles pX-Pan6-pkGFP m.u.0-1, 9-100, som er nyttig for generering av rekombinante El-deleterte Pan6-molekylære kloner som bærer gener av interesse ved direkte ligering og grønn/hvit seleksjon i kombinasjon med de generiske pShuttlepkGFP-vektorene.

B. Alternativ strategi for generering av Pan6-plasmid

1. Kloning av 5' terminalfragment

Pan6-viruset deproteineres ved pronase- og proteanase K-behandling og ved fenolekstrahering, som beskrevet ovenfor, og syntetiske 12 bp Pmel-linkere ligeres på det virale DNA, som beskrevet. AdPan6 5' Xbal-fragmentet isoleres og ligeres inn i pX for å danne pX-AdPan6-0-16.5 (9022 bp), som beskrevet i del A ovenfor.

2. Delesjon av El fra den 5' klon

For å deletere El (m.u. 1.2.-9), ble pX-AdPan6-0-16.5 fordøyd med SnaBI og Ndel for å fjerne områdene som koder Ela- og Elb-proteinene (3442-6310 bp). Denne vektor fordøyes deretter med BsiWI for å forberede avstumping med minigenkassetten som bærer en selektiv markør.

3. Innføring av en selektiv markør

En minigenkassett som uttrykker GFP under en lac-promoter og som er flankert med

gjenkjenningsseter for "sjeldne" intronkodende restriksjonsenzymer, PI-XceI og I-Ceul, ble isolert fra pShuttle-pkGFP, som beskrevet ovenfor. DRAIII-SapI-fragmentet ligeres så med den fordøyde pX-AdPan6-0-16.5 for å danne pX-AdPan6 MU 0-16.5AE1 (7749 bp).

4. Forlengelse av Pan6- adenovirale sekvenser

pX-AdPan6 MU 0-16.5AE1 ble underkastet Xbal-fordøying for å tillate innføring av en ^ftal-Rsrll-linker. Et Xbal/ Rsrll fordøyingsfragment fira AdPan6-genomet ble isolert

(mu 28-100,26240 bp) og ligert inn i den Xba/Rsrll-fordøyde pX-AdPan6 MU 0-16.5AE1 for å gi pX-AdPan6 MU 0-1, 9-16.5,28-100. Et andre ^al-fragment fra Pan6-genomet (mu 16.5-28, 4350 bp) ble så legert inn i dette plasmid for å danne pX-AdPan6 MU 0-1, 9-100 (38551 bp).

C. Generering av rekombinante adenovirus

For å generere de rekombinante adenovirus fra et El-deletert Pan6-plasmid, fremstilt som beskrevet i del A eller b, ble plasmidet kotransfektert med en hjelper som uttrykker El, eller fra en El-uttrykkende pakkende cellelinje som en 293-cellelilnje eller en linje fremstilt som beskrevet her. Ekspresjonen av El i den pakkende cellen tillater replikering og pakking av Pan6-pkGFP mu.0-1, 9-100 inn i et virionkapsid. Alternativt blir den pakkende celle som er transfektert med px-Pan6-pkGFP mu.0-1, 9-100, transfektert med en adenovirusvektor, som beskrevet ovenfor og som bærer et annet transgen av interesse.

Eksempel 6 - Generering av rekombinant El- deletert Pan7- vektor

A. Generering av Pan 7- plasmider

En syntetisk linker inneholdende restriksjonssetene PacI-Smal-Fsel-MluI-EcoRV-PacI ble klonet inn i pBR322 som var kuttet med EcoRI og Ndel. Den venstre ende (bpl til 3618) av AdPan7 ble klonet inn i linkeren mellom Smal- og Fsel-setene. Adenoviruset El ble så skåret ut fra den klonete, venstre ende ved kutting med SnaBI og Ndel og innføring av en I-CeuI-GFP-PI-Scel-kassett fra pShuttle (Clontech) i stedet. Det resulterende plasmid ble kuttet med Fsel og Mlul og et AdPan7-fragment Fsel (bp 3618) til Mlul (bp 155114) ble innført for å forlenge den venstre ende. Konstruktet (pPan7pGFP) ble fullført ved innføring av det 21421 bp AdPan7-høyre ende fragment fra Mlul-setet (bp 15114) inn i plasmidet ovenfor mellom Mlul og EcoRV for å generere en fullstendig molekylær klon av El-deletert adenovirus Pan7, egnet for generering av rekombinant adenovirus. Eventuelt innføres et ønsket transgen i I-Ceul-og PI-SceI-setene av det nydannete Pan7-vektorplasmidet.

B. Konstruering av El- deletert Pan 7- viralvektorer

For å generere rekombinante adenovirus fra pPan7AEl, ble plasmidet kotransfektert med en hjelper som uttrykker El, eller fra en El-uttrykkende pakkende cellelinje som en 293-cellelinje eller en cellelinje fremstilt som beskrevet her. Ekspresjonen av El iden pakkende celle tillater replikering og pakking av Pan7AEl inn i et virionkapsid. I andre utførelsesformer blir den pakkende celle som er transfektert med px'-Pan7AEl, transfektert med en adenovirusvektor, som beskrevet ovenfor og som bærer transgenet av interesse. Homolog rekombinering inntrer mellom hjelperen og plasmidet, noe som tillater at adenovirustransgensekvensen i vektoren kan replikeres og pakkes i virionkapsider og derved resultere i det rekombinante adenovirus. Transfeksjon og rensing gjennomføres som beskrevet ovenfor.

Eksempel 7 - Generering av plasmidvektorer som uttrykker El- genene Plasmidvektorer som koder Pan5-El-området konstrueres, og disse plasmider anvendes for å generere stabile cellelinjer som uttrykker virale El-proteiner.

Pan5-El-området klones inn i pX', i det vesentlige som beskrevet i eksempel 4 ovenfor, før erstatning av dette området med fragmentet fra pShuttle (Clontech). Ekspresjonsplasmidet inneholdende den Pan5-adenovirale genomsekvens spenner over minst bp 1 til 3959 i den Pan5-genomiske sekvens. Ekspresjonsplasmidet inneholder således sekvensen som koder Ela og Elb av sjimpanse-Ad-Pan5 under kontroll av en heterolog promoter. Tilsvarende ekspresjonsplasmider kan genereres ved anvendelse av Ad-Pan6- og Ad-Pan7-El-områdene, identifisert i tabellene ovenfor.

Eksempel 8 - Generering av cellelinjer uttrykkende siimpanseadenovirus- El - proteiner Cellelinjer uttrykkende virale El-proteiner genereres ved å transfektere HeLa (ATCC aksess nr. CCL2) med plasmidet fra eksempel 6. Disse cellelinjer er nyttige for fremstilling av El-deleterte, rekombinante sjimpanseadenovirus ved ko-transfeksjon av genomisk viralt DNA og ekspresjonsplasmidene beskrevet ovenfor. Transfeksjon av disse cellelinjer så vel som isolering og rensing av rekombinant sjimpanseadenovirus fra disse utføres ved fremgangsmåter konvensjonelle for adenovirus, dvs. humane adenovirus (se for eksempel Horwitz, supra, og annen standard litteratur).

A. Cellelinjer uttrykkende Pan5- El- proteiner

HeLa-celler i 10 cm skåler transfekteres med 10 ug pX-Pan51-El-DNA ved anvendelse av et "Cellphect" sett (Pharmacia, Uppsala, Sverige) og ved å følge produsentens protokoll. 22 timer etter transfeksjon ble cellene underkastet et treminutters glyserolsjokk (15 % glyserol i Hepes-bufret saltoppløsning, pH 7,5), vasket en gang i DMEM (HeLa) eller F12K (A549; Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) mediasupplert med 10 % FCS, 1 % Pen-Strep, også inkubert i seks timer ved 37 °C i det ovenfor beskrevne media. De transfekterte cellene splittes så til duplikat 15 cm plater i forhold på 1:20,1:40, 1:80,1:160 og 1:320. Etter inkubering ved 37 °C over natten ble disse media supplert med G418 (Life Technologies) i en konsentrasjon på 1 ug/ml. Disse media erstattes hver femte dag og kloner isoleres 20 dager etter transfeksjon.

HeLa-El-cellekloner isoleres og analyseres for evne til å forbedre adenoassosiert virus (AAV) infeksjon og ekspresjon av rekombinant LacZ-protein, som beskrevet nedenfor.

B. AA V- forbedringsanalyse for å avsøke El- uttrykkende cellelinjer

AAV krever adenoviruskodete proteiner for å fullføre sin livssyklus. De adenovirale El-proteiner så vel som det E4-områdekodete ORF6-protein er nødvendig for forbedring av AAV-infeksjonen. En analyse for El-ekspresjon basert på AAV-forbedring anvendes. I korthet omfatter fremgangsmåten for å identifisere adenovirale El-uttrykkende celler trinnene å infektere i separate kulturer av en putativ adenovirus El-uttrykkende celle, og en celle ikke inneholdende noen adenovirussekvens, med både et adenovirusassosiert virus (AAV) som uttrykker et markørgen, og en AAV som uttrykker ORF6 av E4-genet av humant adenovirus i et egnet tidsrom. Markørgenaktiviteten i de resulterende celler måles og cellene med betydelig større målbar markøraktivitet enn kontrollcellene velges som bekreftete El-uttrykkende celler. I det påfølgende forsøk er markørgenet et lacZ-gen og markøraktiviteten er opptreden av blå farge.

For eksempel infekteres cellelinjene beskrevet ovenfor, så vel som ikke-transfekterte kontrollceller (HeLa), med 100 genomer pr. celle av en AAV-vektor som bærer et markørgen, for eksempel AV.LacZ [Fisher et al., J. Virol, 70:520 (1996)], og en AAV-vektor som uttrykker ORF6-området av humant 5 (AV.orf6). Plasmid-DNA-sekvensen genererer en ny, rekombinant adenoassosiert virus (rAAV) inneholdende LacZ-transgenet og Ad-E4-ORF6, som er en åpen leseramme hvis ekspresjonsprodukter letter enkeltrådet (ss) til dobbeltrådet (ds) konvertering av rAAV-genomisk-DNA. Disse vektorene inkuberes i medium inneholdende 2 % FCS og 1 % Pen-Strep ved 37 °C i fire timer, på hvilket tidspunkt et likt mediumvolum inneholdende 10 % FCS tilsettes. Det skal være klart for fagmannen på området at ethvert markørgen (eller rapportørgen) kan anvendes i den første AAV-vektoren i denne analysen, for eksempel alkalisk fosfatase, luciferase og andre. En antistoffenzymanalyse kan også anvendes for mengdebestemmelse av antigennivåene, der markøren uttrykker et antigen. Analysen er ikke begrenset av identiteten av markørgenet. 20 til 24 timer etter infeksjon farges cellene for LacZ-aktivitet ved anvendelse av standard fremgangsmåter. Etter 4 timer observeres cellene mikroskopisk og cellelinjer med betydelig flere blå celler enn De A549- eller HeLa-cellekontrollene anføres som positive.

Eksempel 9 - Avlevering av transgen til vertscelle

Det resulterende, rekombinante sjimpanseadenovirus, som beskrevet i eksempel 4, 5 eller 6 ovenfor, benyttes så for avlevering av transgenet til en mammalsk- og fortrinnsvis human celle. For eksempel, etter rensing av det rekombinante virus, infekteres humane, embryonale nyre-293-celler ved en MOI på 50 partikler/celle. GFP-ekspresjonen ble dokumentert 24 timer etter infeksjon.

A. Genoverføring i musemodeller via Pan6-, Pan7- og Pan9- vektorer Genoverføringseffektiviteter og toksikologiske profiler for rekombinante sjimpanseadenovirus ble sammenliknet ved museleverstyrt genoverføring, muselunge styrt genoverføring og musemuskelstyrt genoverføring.

El-deleterte adenovirale vektorer inneholdende LacZ under kontroll av CMV-promoteren, ble konstruert ved anvendelse av teknikkene her for humant Ad5, sjimpansePan6, sjimpansePan7 og sjimpansePan9 (C68). Vektorene ble avlevert til nakne immunmanglende NCR-mus (80 pr. studie) som følger. For leverstudien ble 100 Hl (lxlO<11>partikler) injisert i halevenen. For lungestudien ble 50 ul (5xl0<10>partikler) avlevert intratrakealt. For muskelstudien ble 25 (il (5xl0<10>partikler) injisert i den bakre tibialis. Mus ble avlivet på dag 3, 7, 14 og 28 etter vektorinjeksjon (5 dyr pr. gruppe på hvert tidspunkt). Ved hver nekropsi ble lever/lunge/muskelvev samlet og tilberedt for kryoblokker og parafininnleiring. Kryoblokkene ble oppskåret for X-gal farging og parafinsnittene ble H&E-farget for histopatisk analyse. På hvert tidspunkt ble det gjennomført terminalblødning. Serumprøver ble underkastet leverfunksjonstester.

I dette forsøk ble det observert at sjimpanseadenovirusene Pan6, Pan7 og Pan9 var mindre effektive enn huAd5 ved genoverføring til lever og lunge. Det kan imidlertid være ønskelig under visse omstendigheter for derved å redusere levertoksisiteten som ble observert for huAd5. Genoverføringseffektiviteten i muskel varierte mindre mellom serotypene.

B. Musestudie på gjennomførbarheten av readministrering av adenovirusvektorer vedserotypeskifting mellom AdHu5-, Pan6-, Pan7- og Pan9- vektorer Mus ble tilført (C57/B16; 4/gruppe) LacZ-vektorer basert på huAd5, Pan6, Pan7 og Pan9 (H5.040CMVLacZ, Pan6.000CMVLacZ, Pan7.000CMVLacZ, Pan9.000CMVLacZ; 10n partikler/injeksjon) via halevenen. 30 dager senere ble musene igjen tilført adenovirusvektorer uttrykkende al-antitrypsin (H5.040CMVhAlAT, Pan6.000CMVhAlAT, lxlO<11>partikler, Pan7.000CMVhAlAT, Pan9.000CMVhAlAT, 10n partikler/injeksjon). Vellykket transduksjon ved den readministrerte vektor ble overvåket ved måling av serum al-antitrypsin på dagene 3 og 7 etter readministrering.

Adenovirusvektorers evne til å transdusere leveren hos mus i nærvær av nøytraliserende antistoffer mot de andre serotyper, basert på henholdsvis huAd5, Pan6, Pan7 og Pan9, ble bestemt. Resultatene er vist i tabellen her.

Vektorers evne til å transdusere murin lever i nærvær av nøytraliserende antistoffer til andre serotyper.

Immunisering med huAd5 forhindret således ikke readministrering med noen av

sjimpanseadenovirusvektorene Pan6, Pan7 eller Pan9 (C68). Dette forsøket synes også å indikere at Pan7 ligger mellom Pan6 og Pan9 i spekteret for antigenisk sammenheng og kryssreagerer med begge; Pan6 og Pan9 nøytraliserer imidlertid ikke hverandre. Dette er et overraskende resultat basert på homologisammenlikninger, som antyder at Pan6 er heller forskjellig fra Pan7 og Pan9. Evaluering av antisera generert mot Pan9 antydet

ingen kryssnøytralisering mot Pan6, men en viss nøytralisering mot Pan9, noe som skulle argumentere for at Pan6 er distinkt fra de andre.

Eksempel 10 - Generering av rekombinant El- deletert SV25- vektor

Et plasmid ble konstruert som inneholdt det fullstendige SV25-genomet bortsett fra en konstruert El-delesjon. Ved setet for El-delesjonen ble det innført gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymene I-Ceul og Pi-Scel som ville tillate innføring av et transgen fira et shuttleplasmid der transgenekspresjonskassetten er flankert med disse to enzymgjenkjenningsseter.

En syntetisk linker inneholdende restriksjonssetene Swal-SnaBI-Spel-Aflll-EcoRV-Swal ble klonet inn i pBR322 som ble kuttet med EcoRI og Ndel. Dette ble utført ved å annile to syntetiske oligomerer SV25T (5'-AAT TTA AAT ACG TAG CGC ACT AGT CGC GCT AAG CGC GGA TAT CAT TTA AA-3\ SEKV. ID nr. 38) og SV25B (5'-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTA TTT A-3\ SEKV. ID nr. 39) og innføring derav i pBR322 fordøyd med EcoRI og Ndel. Den venstre ende (bp 1 til 1057, SEKV. ID nr. 29) av AdSV25 ble kolonet inn i linkeren ovenfor mellom SnaBI- og Spel-setene. Den høyre ende (bp 28059 til 31042, SEKV. ID nr. 29) av AdSV25 ble klonet inn i linkeren mellom Aflll- og EcoRV-setene. Adenovirus El ble så utskåret mellom ÆcøRI-setet (bp 547) til Xhol (bp 2031) fra den klonete venstre ende som følger. En PCR-generert I-CeuI-PI Scel-kassett fra pShuttle (Clontech) ble innsatt mellom EcoRI- og Spel-setene. 10154 bp Xhol-fragmentet fra AdSV25 (bp 2031 til 12185, SEKV. ID nr. 29) ble så innført i Spel-setet. Det resulterende plasmid ble fordøyd med Hindlll og konstruktet (SV25) ble komplettert ved innføring av 18344 bp Ad SV25 #/«<fflI-fragmentet (bp 11984 til 30328, SEKV. ID nr. 29) for å generere en fullstendig molekylær klon av El-deletert adenovirus SV25, egnet for generering av rekombinante adenovirus. Eventuelt innføres et ønsket transgen i I-Ceul- og PI-SceI-setene av det nydannete pSV25-vektorplasmid.

For å generere et AdSV25 som bærer et markørgen, ble en GFP (grønn fluorescent protein) ekspresjonskassett tidligere klonet inn plasmidet pShuttle (Clontech) utskåret med restriksjonsenzymene I-Ceul og ligert inn i pSV25 (eller et annet av Ad sjimp-plasmidene beskrevet heri) fordøyd med de samme enzymer. Det resulterende plasmid (pSV25GFP) ble fordøyd med Swal for å separere det bakterielle plasmidskjelett, og transfektert inn i den El-kompleterende HEK293-cellelinjen. Omkring 10 dager senere ble en cytopatisk effekt observert, noe som antyder nærvær av replikative virus. Den vellykkete generering av en AdSV25-basert adenoviral vektor som uttrykker GFP, ble bekreftet ved å påføre supernatanten fra den transfekterte kultur på friske cellekulturer. Nærværet av sekundærtinfekterte celler ble bestemt ved observasjon av grønn fluorescens i en populasjon av cellene.

Eksempel 11 - Konstruksjon av E3- deleterte Pan5-. Pan6-. Pan7- og C68- vektorer Forbedring av kloningsegenskapene til de adenovirale vektorene, kan skje ved at E3-området tas ut fordi dette området koder gener som ikke er nødvendige for propageringen av virus i kultur. For dette formål ble det laget E3-deleterte versjoner av Pan5, Pan6, Pan7 og C68 (et 3,5 kb Nru-Avrll-fragment inneholdende E31-9 er deletert).

A. E3- deletert Pan5- basert vektor

El-deletert pPan5-pkGFP-plasmid ble behandlet med Avrll-endonuklease for å isolere et 5,8 kb-fragment inneholdende E3-området og resirkulere pPan5-pkGFP med Avrll-delesjon for å danne konstruktet pPan5-pkGFP-E3-AvrII. Deretter ble 5,8 kb-Avrll-fragmentet subklonet inn i pSL-Pan5-E3-AvrII for en ytterligere delesjon av E3-området ved Nrul-fordøying. Dette førte til en plasmid pSL-Pan5-E3-delesjon. Det endelige konstruktet pPan5-E3-pkGFP ble fremstilt ved fjerning av et 4,3 kb Avrll/Spel-fragment fra pSL-Pan5-E3-delesjonsplasmidet og innføring i pPan5-pkGFP-E3-AvrII-setet. I dette endelige konstrukt var det gjennomført en 3,1 kb-delesjon i E3-området.

B. E3- delesjon i Pan6- basert vektor

El-deletert pPan6-pkGFP-molekylær klon ble fordøyd med Sbfl og Noti for å isolere et 19,3 kb-fragment, og ligert tilbake ved Sbfl-setet. Det resulterende konstruktet pPan6-Sbfl-E3 ble behandlet med Eco47III og Swal, for å generere pPan6-E3. Til slutt ble 21 kb Sbfl-fragmentet fra Sbfl-fordøying av pPan6-pkGFP subklonet inn i pPan6-E3 for å danne pPan6-E3-pkGFP med en 4 kb-delesjon i E3.

C. E3- deletert Pan 7- og Pa9- vektorer

Den samme strategi ble anvendt for å oppnå E3-delesjoner i begge vektorer. Først ble et 5,8 kb Avrll-fragment som spente over E3-området subklonet til pSL-1180, fulgt av delesjon av E3 ved Nrul-fordøying. De resulterende plasmider ble behandlet med Spel og Avrll for å oppnå 4,4 kb-fragmenter, og klonet inn i pPan7-pkGFP og pPan9-pkGFP ved Avrll-setene for å erstatte de opprinnelige E3-holdige Avrll-fragmenter. De endelige pPan7-E3-pkGFP- og pPan9-E3-pkGFP-konstruktene har 3,5 kb E3-delesjoner.

Eksempel 12 - Konstruksjon av E3- og E4- deletert Pan7- vektor

Selv om delesjonen av El-området av adenovirus (første generasjon adenovirusvektorer) gjør dem replikasjonsinkompetente, er ekspresjonen av de adenovirale vektor skjelettgener ikke fullt avskaffet. Delesjon av E4-området forminsker denne gjenværende genekspresjonen betydelig, og kan gi en sikkerhetsfordel. En E4-deletert Pan7-vektor inneholdende en 2,5 kb delesjon (et PvuII-Agel-fragment inneholdende E40RF1-ORF7 er deletert) ble konstruert. Høytiter-forråd av dette virus ble generert ved anvendelse av en HEK 293-basert cellelinje, som i tillegg til El uttrykker et essensielt E4-gen (orf6).

1. E4- delesjon i den molekylære Pan7- klon

Et 19 kb Xtøl-fragment ble deletert fra pPan7-pkGFP for å danne pPanl- Xbal hvorfra et 2,5 kb E4-fragment ble deletert ved partiell Agel- og PvuII-fordøying, noe som resulterte i at pPan7-X6aI-E4.pPan7-E4-pkGFP-plasmid ble generert fra pPan7-^&aI-E4 i to sekvensielle kloningstrinn, tilsetting av 19 kb Xbal og 15 kb I-Ceul/Mlul-fragmenter, der begge kom fira pPan7-pkGFP-konstruktet.

2. Innføring av E3- og E4- delesjoner i Pan9- vektor

Et 11 kb-plasmid, pPan9-.EcoRI inneholdende E4-området, ble dannet ved å hente 11 kb £cøRI-fragmentet fira pPan9-pkGFP etter £cøRI-fordøying og selvligering. E4-området ble deletert fra dette konstrukt ved Agel-fordøying/innfylt og PvuII-partial fordøying og selvligering for å generere pPan9-.EcøRI-E4. Et 23 kb EcoRI-fragment ble isolert fra pPan9-pkGFP og innført i pPan9--EcøRI-E4 ved ÆcøRI-setet, fulgt av tilsetting av 5,8 kb Avrll-fragment fra pPan9-pkGFP, for å danne det endelige produkt pPan9-E3-E4-pkGF. Sammenliknet med genomstørrelse av villtype pPan9, kan denne E1-E3-E4-deleterte vektoren ha en transgen kapasitet opp til 8 kb. 3. Innføring av minigenkassetter med gener av interesse, inkludert rapportørgener, glyko- og nukleære proteiner av Ebo inn i molekylære kloner av Pan- vektorer En meget effektiv, direkte kloning og grønn/hvit seleksjonsprosedyre ble anvendt for å skape molekylære kloner av rekombinante virus. I korthet ble genene av interesse klonet inn pShuttlepkGFP ved avsøking av hvite kolonier for rekombinanter. Deretter ble minigenkassettene overført til sjimpanseadenovirusskjelettplasmider, pPanXpkGFP med forskjellige delesjoner, enkelt ved å bytte med pkGFP-kassett på I-Ceul- og PI-Scel-setene og avsøking av noen få, hvite kolonier for korrekte kombinanter. 4. Gjenvinning av molekylære kloner av Pan- vektorer med flere delesjoner i tidlige områder og viruspropagering

For gjenvinning av El-E3-deleterte molekylære koner av sjimpanseadenovirusvektorer, ble klonene lineariserte med egnete restriksjonsenzymer og transfektert inn i regulære 293-celler. Når først en full cytopatisk effekt (CPE) var observert i de transfekterte celler, ble rålysat høstet og ekspandert i 293-celler til storskala infeksjoner. Virusene ble renset ved CsCl-sedimenteringsfremgangsmåten.

For E1-E4- og El-E3-E4-deleterte Pan-vektorer, ble 10-3 celler, en 293-basert E1-E4-kompleterende cellelinje anvendt for gjenvinning og propagering av vektorer. E4-ORF6-genekspresjon i 10-3 celler ble indusert ved tilsetting av 150 uM ZnSC>4til kulturmediet.

Eksempel 13 - Vaksinering med adenovirusvektorer som uttrykker villtype- og variant-EboZ GP

AdHu5- eller AdC7-vektorer som uttrykker Ebola konvoluttkimærer ble produsert for in vivo immuniseringsforsøk i C57BL/6-mus. Rekombinante virus med forskjellige viralskjeletter, ble skapt ved molekylære kloningsmetoder hvori minigenkassettene ble innført i stedet for El-delesjonen. De molekylære kloner av alle rekombinante virus ble gjenvunnet og dyrket opp i 293-celler for storskalarensing ved anvendelse av CsCl-sedimenteringsfremgangsmåten.

Fem EboZ-varianter kodet av AdHu5 eller AdPan7 (C7), ble selektert og produsert for å evaluere deres relative immunogenisitet etter en intramuskulær Ad-injeksjon. wt-Ebo, en oppløselig Ebo-variant, EboAl, EboA2, EboA3, EboA4, EboA5S, EboA6S, EboA7S og EboA8S ble evaluert i de første vaksinestudier. For de data som er oppsummert i den påfølgende tabell, ble antall virale partikler (pr. ml eller totalt) som var produsert og forsterket fra infekterte 293-celler fastslått ved spektrofotometriavlesninger.

Vektor ble administrert intramuskulært (10n genomkopier/celle) i C57BL76-mus og nærværet av virusnøytraliserende antistoff (VNAO) ble evaluert 28 dager senere som et første mål på en immunrespons generert mot Ebola-konvoluttglykoproteinet. VNA er definert som serumantistoff i stand til å inhibere transduksjon av HeLa-celler formidlet av HIV-basert vektor, pseudotypet med villtype Ebola konvolutten.

VNA til EboZ pseudotypene ble påvist med AdPan7 (C7), som ga høyere titere enn AdHu5. EboZA3 utløste den høyeste VNA uttrykt ved de transgene mål. For de data som er oppsummert i den påfølgende tabell, er nøytraliserende antistofftitere mot HIV-EboZ-GFP-pseudotypene (resiprok fortynning) anført (N = 5 dyr/gruppe).

Eksempel 14 - Pan7 formidlet ekspresjon av Ebolaproteiner

For å evaluere Pan7-vektorer som uttrykker Ebola konvoluttproteiner og det nukleære Ebola antigenet, har det blitt foretatt studier på mus. Disse er rettet mot evaluering av nøytraliserende antistoffer i C57BL/6-mus, injisert intramuskulært (IM) med AdHu5 eller Pan7 som uttrykker hver av fire Ebola env-konstrukter.

A. Evaluering av CTL fra C57BL/ 6- mus injisert IM med AdHu5 eller Pan7 som uttrykker Ebola env- konsfruktene

1. Utfordringsforsøk i mus med Ebola virus

Nøytraliserende antistoff (NAB) responser på Ebola konvolutten ble analysert ved å se på immunisert museserumformidlet nøytralisering av en lentiviral (HIV) vektor pseudotypet med de forskjellige konstruktene (eEbo, NTD2, NTD3, NTD4) av Ebola konvoluttglykoproteinet. C57BL/6- eller BALB/c-mus mottok en enkelt intramuskulær injeksjon på 5xl0<10>partikler/mus av C7 (AdPan7) som koder Ebola konvoluttvarianten. Nøytraliserende antistoff ble bedømt 30 dager etter vaksinering. I korthet ble Ebola Zaire pseudotypet HIV-vektor, som koder for P-galaktosidase (EboZ-HIV-LacZ), inkubert i to timer ved 37 °C med forskjellige fortynninger av varmeinaktivert museserum. Etter inkuberingen med serum, ble EboZ-HIV-LacZ så benyttet for å infektere HeLa-celler i 16 timer ved 37 °C. Infektiviteten ble fastslått ved X-gal farging av transduserte HeLa-celler som var positive for p-galaktosidase. Nøytraliserende titer representerer den serumresiproke fortynning der en 50 % reduksjon i antall P-galaktosidasepositive blå celler ble observert. Sera ble samlet 30 dager etter immunisering, som besto av en enkelt intramuskulær (IM) administrasjon av 5xl0<10>partikler/dyr. Nøytraliserende antistoff mot Ebola pseudotypet HIV kunne påvises fra alle grupper med antistofftitere fra 20 for Ad-EboZ (AdHu5 uttrykkende EboZ), Ad-NTD3 (AdHu5 uttrykkende NTD3) og C7-sEbo (AdPan7 uttrykkende oppløselig EboZ) til over 130 for C7-NTD3 (AdPan7 uttrykkende oppløselig NTD3) og C7-NTD4 (AdPan7 uttrykkende oppløselig NTD3). Den samme immuniseringsstrategi i BALB/c-mus resulterte i lavere nøytraliserende antistofftitere for Ad- og C7-NTD2, og NTD4.

B. Cellulær immunrespons

Den cellulære immunrespons på Ebola konvolutten i C57BL/6-mus ble evaluert 8 dager etter en enkelt IM administrering av 5xl0<10>partikler av C7-LacZ- eller C7-Ebola-konvoluttvariant pr. dyr. Mus ble vaksinert IM med 5xl0<10>partikler Cl, som koder LacZ eller Ebola konvoluttvariant. Spleniske lymfocytter fra immuniserte mus ble samlet 8 dager etter vaksinering og stimulert in vitro med materceller (spleniske lymfocytter fra ikke-behandlete mus infektert med human adenovirusserotype 5 som koder for villtype Ebola konvolutten og så bestrålt). Standard 5-hr CTL-analyser ble utført ved anvendelse av<5I>Cr-merket, syngeniske C57-celler transfektert med en ekspressor av EboZ.

En positiv MHC-begrenset cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) ble observert fra alle Pan7 som koder for Ebola konvoluttvarianter med en høyere respons fra NTD2-, NTD3- eller NTD4-immuniserte mus. Effektorceller fra Cl kodende Ebola konvoluttvariant-immuniserte mus gjenkjente EboZ-transfekterte målceller og ga gjentatte CTL-responser opptil 30 % spesifikk lysering. Mindre enn 5 % lysering ble observert med effektorceller fra naive eller LacZ-immuniserte kontrollmus, som bekrefter at lysering var spesifikk for Ebola konvoluttantigener.

C. Beskyttelsesstudier

De mest direkte midler for å bedømme C7 (AdPan7) som koder for EboZ-variantene som en vellykket vaksine i mus, var å bedømme beskyttelsen mot vekttap og død etter letal utfordring med museadaptert Ebola Zaire-virus. BALB/c-mus ble immunisert med en enkelt dose av 5x10<10>partikler/dyr, som gjennomført tidligere og vaksinerte dyr ble utfordret med 200 LD5omuseadapterte Ebola Zaire 21 dager senere. Alle kontrollmus (bærer og C7-LacZ) døde mellom dag 5 og dag 9 etter utfordring. Derimot overlevde alle musene unntatt én (fra C7-sEbo gruppen), utfordringen med Ebola Zaire.

Vekttap ble observert fra mus vaksinert med C7-sEbo fra dag 4 til dag 7. Sykdomstegn som pilo-ereksjon og fra lett til alvorlig letargi ble også observert hos mus vaksinert med C7-sEbo, NTD2 og NTD3 mellom dag 4 og dag 7. Mus immunisert med C7-EboZ og C7-NTD4 viste ingen tegn på sykdom. Totalt sett beskyttet en enkelt dose av C7-EboZ og C7-NTD4 immuniserte mus fullstendig mot sykdom og død, muligens pga. en signifikant T-celle formidlet immunitet.

Claims (12)

1. Rekombinant adenovirus,karakterisert vedat det har et kapsid som omfatter AdPan7 hexon protein som har aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 11, et fiber protein og et penton protein, der nevnte fiber og penton protein er individuelt avledet fra human eller simian opprinnelse, hvor adenoviruset ytterligere omfatter adenovirussekvenser funksjonelt deletert i Ela og/eller Elb genene, 5' og 3' adenovirus cis-elemeter nødvendig for replikasjon og "encapsidation" og en transgen heterolog til adenoviruset og operativt koblet til sekvenser som styrer ekspresjon av nevnte gen i en vertscelle.

2. Rekombinant adenovirus i følge krav 1, ytterligerekarakterisert vedat fiber proteinet er AdPan7 fiber proteinfragmentet fra SEQ ID NO: 20.

3. Rekombinant adenovirus i følge krav 1,karakterisertved at fiber proteinet er AdPan7 fiber proteinet fra SEQ ID NO: 12.

4. Rekombinant adenovirus i følge krav et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat penton proteinet er etAdPan7 penton protein.

5. Rekombinant adenovirus i følge krav et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat kapsidet er et AdPan7 kapsid.

6. Rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat nevnte rekombinante adenovirus er et pseudotype adenovirus omfattende 5' og 3' adenovirus cis-elementer nødvendige for replikasjon og "encapsidation ", hvor nevnte cis-elementer omfatter et adenovirus 5' invertert terminal repetisjon og en adenovirus 3' invertert terminal repetisjon fra en adenovirus heterologt til AdPan7.

7. Rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat det har et kapsid som omfatter et hexon som inneholder et fragment av AdPan7 hexon protein, et fiber protein, og et penton protein, hvor nevnte fiber og penton protein er avledet fra human eller simian opprinnelse, der adenoviruset ytterligere omfatter adenovirus sekvenser funksjonelt deletert i Ela og/eller Elb genene, og en nukleinsyre sekvens heterolog til AdPan7, hvori fragmentet av AdPan7 hexon proteinet er et N-terminalt eller C-terminalt avkortet protein på omtrent 50 aminosyrers lengde av AdPan7 hexon protein sekvens fra SEQ ID NO: 11.

8. Rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 7,karakterisert vedat adenovirusets cis elementer omfatter 5' invertert terminal repetisjon (ITR) sekvenser og 3' ITR, fra Pan7 SEQ ID NO:9 eller en sekvens som er komplementær dertil.

9. Adenovirus i følge krav 7,karakterisert vedat det omfatter minst et apekapsid protein valgt fra: pentonproteinet fra Pan7 SEQ ID NO:6 og fiberproteinet fra Pan7 SEQ ID NO: 12.

10. Isolert vertcelle,karakterisert vedat den omfatter et rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 9.

11. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helt av kravene 1 til 9 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

12. Anvendelse av et rekombinant adenovirus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av et medikament formulert for å fremkalle en immunrespons mot et infeksiøst agens i en pattedyrsvert, hvori nevnte transgene eller heterologe sekvens koder for et antigen til det infeksiøse middelet.