CN115916986A - 修饰的腺相关病毒5衣壳及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了突变的血清5型腺相关病毒(AAV5)，其表现出衣壳特性的改变，例如，在人肝细胞中的感染性增加和/或与人类中和抗体的结合最小。本发明还提供了在衣壳基因中包含一种或更多种突变的突变AAV5库。本发明还提供了产生突变AAV5和突变AAV5库的方法，以及包含所述突变AAV5的组合物。本发明还提供了包含突变衣壳蛋白的重组AAV5(rAAV5)病毒粒子。本发明还提供了包含编码突变衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸。

Description

修饰的腺相关病毒5衣壳及其用途
优先权声明
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2020年5月5日提交的美国临时申请序号63/020,139的权益，其所述的全部内容通过引用并入本文。
关于序列表电子提交的声明
按37C.F.R.§1.821提交的ASCII文本格式的序列表被提供以替代纸质副本，其标题为5470-881_ST25.txt，大小为56,036字节，于2021年4月26日生成，并通过EFS-Web提交。本序列表在此通过引用并入本说明书以将其公开。
技术领域
本发明属于重组腺相关病毒载体领域。
发明背景
腺相关病毒(AAV)是一种4.7kb的单链DNA病毒，其基因组由两个开放阅读框rep和cap组成，其两端有反向末端重复序列(ITR)。rep基因编码病毒DNA复制和包装所必需的四种rep蛋白，且cap基因编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，它们以1:1:10的比例相互作用形成衣壳。迄今为止，已经发现了许多AAV血清型，所有血清型都对人体细胞和器官具有不同的嗜性。
在过去的几十年里，基于AAV的基因疗法取得了实质性进展，导致许多具有里程碑意义的临床试验和在治疗各种遗传性疾病方面引人注目的成功。大量的临床试验结果表明，基于AAV的疗法是安全和有效的。此外，基于AAV的基因疗法能够在人体的许多器官和组织中进行有效的基因递送和持久的基因表达。尤其是，基于AAV的基因疗法已被证明对于治疗肝脏遗传病，如血友病非常有前途，因为多种AAV血清型能够有效感染肝脏，并提供所需转基因的稳定表达。
尽管基于AAV的基因疗法取得了成功，但阻碍基因疗法平台发挥其全部潜力的许多问题仍未解决。特别的一个问题是，普通人类群体中明显存在针对重组AAV病毒(rAAV)衣壳的预先存在的中和抗体(Nab)。极大一部分人类群体以前接触过各种AAV血清型，并产生了与血流中存在的rAAV结合的中和抗体(Boutin et al,Human Gene Therapy 2010)。由这些抗体结合的病毒通常被中和并且不能将其治疗基因递送到其靶细胞。中和因子的存在率主要取决于所用AAV的血清型及其整体感染性；感染性更强的AAV衣壳通常具有更高的存在率。目前用于临床试验的大多数AAV血清型和变体在人类群体中具有中至高的中和因子存在率，且因此必须采用严格的筛选工艺来过滤出不具有针对所用衣壳的已有抗体的患者。因此，很大一部分需要基于AAV疗法的患者由于存在nAb而无法接受可能挽救生命的治疗。因此，需要能够有效感染肝细胞并且与已有的中和抗体具有最小结合的rAAV载体，以扩大能够接受基于AAV的肝病疗法的患者群体。
本发明通过提供突变的AAV5衣壳克服了现有AAV载体的所述缺点，增加了对人肝细胞的感染性，同时保留了野生型(wt)AAV5所提供的低血清反应性的优势。
发明概述
本发明部分基于对修饰的AAV5衣壳蛋白的开发，该修饰的AAV5衣壳蛋白表现出与人肝细胞的结合和/或被人肝细胞内化增加。同样重要的是，修饰的衣壳蛋白显示出与野生型AAV5衣壳蛋白大致相同或更低的血清反应性水平。修饰的衣壳蛋白可有利地被用于实现蛋白质或功能性核酸在受试者肝脏中的递送和表达。
因此，本发明的一个方面涉及修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的G257R突变。衣壳蛋白还可以包含选自Q179R、F417L、S705G或其任意组合的突变。
本发明的另一个方面涉及修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的突变P200S、M469I和A579T。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的修饰AAV5衣壳蛋白的核酸和包含该核酸的载体、细胞或病毒颗粒。
本发明的另一个方面涉及AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和本发明的修饰的AAV5衣壳蛋白，其中该AAV衣壳包裹AAV载体基因组。
本发明的另一个方面涉及产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，该方法包括在向体外细胞提供根据本发明的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生有效的AAV感染的辅助功能元件；并允许包含AAV衣壳和包裹AAV载体基因组的重组AAV颗粒组装。
本发明的另一个方面涉及药物制剂，其在药学上可接受的载体中包含本发明的修饰的AAV5衣壳蛋白、核酸、病毒颗粒或AAV颗粒。
本发明的另一个方面涉及将目的核酸递送至肝细胞的方法，该方法包括使细胞与本发明的AAV颗粒接触。
本发明的另一方面涉及将目的核酸递送至哺乳动物受试者的肝细胞的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂。
本发明的另一方面涉及治疗需要其的哺乳动物受试者的病症的方法，其中该病症可通过在受试者的肝脏中表达一种产物来治疗，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂。
将在下面的发明描述中更详细阐述本发明的这些方面和其他方面。
附图简要说明
图1描述了使用易错PCR和交错延伸方案随机突变AAV5并生成AAV5突变体库。
图2描述了在Huh7细胞上筛选AAV5突变体库以获得具有增强的肝嗜性的变体。
图3描述了在Huh7细胞上进行的第五轮和第七轮选择中携带Loop1R突变的测序变体的百分比。
图4描述了野生型AAV5的编码VP1的核苷酸序列和在人肝细胞转导时具有最显著增加的AAV5突变体的编码VP1的核苷酸序列(SEQ ID NO:11、1、3、5、7、9)的比对。与野生型AAV5和其他突变体序列相比，白色字体的黑色突出部分指示核苷酸序列的变化。
图5描述了野生型AAV5的编码VP1的氨基酸序列和在人肝细胞转导时具有最显著增加的AAV5突变体的编码VP1的氨基酸序列(SEQ ID NOS:12、2、4、6、8、10)的比对。与野生型AAV5和其他突变体序列相比，白色字体的黑色高亮部分指示氨基酸序列的变化。
图6描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后，Huh7细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的比较。用1x105个载体基因组/细胞的MOI感染Huh7细胞。使用荧光显微镜在感染后72小时拍摄图像。
图7A-图7B描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后Huh7细胞中GFP表达的定量比较。用1x105个载体基因组/细胞的MOI感染Huh7细胞。细胞在感染后72小时裂解，并用来自Cell Bio Labs的荧光GFP定量试剂盒进行定量。图7A描述了Huh7细胞中GFP定量表达的总体值，而图7B显示了AAV5突变体相对于野生型AAV5的GFP表达的倍数增加。
图8描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后HepG2细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的比较。用1x105个载体基因组/细胞的MOI感染HepG2细胞。使用荧光显微镜在感染后72小时拍摄图像。
图9A-图9B描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后HepG2细胞中GFP表达的定量比较。用1x105个载体基因组/细胞的MOI感染HepG2细胞。细胞在感染后72小时裂解，并用来自Cell Bio Labs的荧光GFP定量试剂盒进行定量。图9A描述了Huh7细胞中GFP定量表达的总体值，而图9B显示了AAV5突变体相对于野生型AAV5的GFP表达的倍数增加。
图10描述了野生型AAV5、MV18和MV20之间与细胞表面结合的定量比较。通过RT-PCR对与细胞表面结合的病毒衣壳内的载体基因组定量来确定结合。
图11描述了AAV5、MV18和MV20之间被内化的结合的AAV颗粒的百分比的定量比较。通过将细胞内载体基因组的总量除以细胞表面上结合的病毒粒子的总数来确定内化的结合的病毒粒子的百分比。RT-PCR用于定量细胞内的载体基因组。
图12描述了AAV5、MV18和MV20之间被细胞内化的AAV颗粒总量的定量比较。通过RT-PCR对细胞内的病毒衣壳内的载体基因组定量来测量内化。
图13描述了野生型MV18、MV1、MV50和MV53之间与细胞表面结合的定量比较。通过RT-PCR对与细胞表面结合的病毒衣壳内的载体基因组定量来确定结合。
图14描述了MV18、MV1、MV50和MV53之间被内化的结合的AAV颗粒的百分比的定量比较。通过将细胞内载体基因组的总量除以细胞表面上结合的病毒粒子的总数来确定内化的结合的病毒粒子的百分比。RT-PCR用于对细胞内的载体基因组定量。
图15描述了MV18、MV1、MV50和MV53之间被细胞内化的AAV颗粒总量的定量比较。通过RT-PCR对细胞内的病毒衣壳内的载体基因组定量来测量内化。
图16描述了wt-AAV5和AAV5突变体对静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的血清反应性的比较。血清反应性曲线是通过绘制每种病毒的最大GFP表达百分比(与用PBS而不是IVIG孵育的病毒相比)相对于所用稀释度倒数的对数来生成的。对所绘制点的非线性曲线拟合生成指数曲线，其可用于比较每种病毒针对IVIG的血清反应性。
图17描述了从图16中的曲线计算出的EC50的比较。每种病毒的EC50被确定为抑制50％病毒转导的IVIG稀释度的倒数。
图18描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后，原代人肝细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的比较。用5x105个载体基因组/细胞的MOI感染人原代肝细胞。使用荧光显微镜在感染后72小时拍摄图像。
图19描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后，原代人肝细胞细胞中GFP表达的定量比较。用5x105个载体基因组/细胞的MOI感染人原代肝细胞。细胞在感染后72小时裂解，并用来自Cell Bio Labs的荧光GFP定量试剂盒进行定量。
图20描述了在Huh7细胞和原代人肝细胞中，AAV5突变体的感染性相对于AAV5的倍数增加的对比。
发明详述
本发明部分基于能够在体内和体外转导肝细胞的合成AAV衣壳序列的开发。使用合成的衣壳创建AAV载体，用于在研究或其中需要肝特异性基因转移而没有向其他器官的广泛载体生物分布的治疗性应用中使用。
下面将更详细地解释本发明。该描述并不旨在详细列举本发明可以实施的所有不同方式或者可以添加到本发明中的所有特征。例如，关于一种实施方案说明的特征可以并入到其他实施方案中，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。此外，鉴于本发明的公开内容，，对本文所建议的各种实施方案的许多不脱离本发明的变化和添加对本领域的技术人员来说应是明显的。因此，以下说明书旨在说明本发明的一些特定实施方案，且不是详尽地说明其所有排列、组合和变化。
除非上下文另有规定，否则本文所描述的本发明的各种特征可以任意组合使用。此外，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。举例来说，如果说明书说明复合物包含组分A、B和C，那么具体期望的是，A、B或C中的任何一种或其组合可单独或以任何组合形式省略和放弃。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文对本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，并不旨在限制本发明。
核苷酸序列在本文中仅以单链呈现，以5'到3'方向，从左到右，另外特别说明除外。根据37C.F.R.§1.822和既定惯例，本文中核苷酸和氨基酸以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的方式表示，或(对于氨基酸)以单字母代码或三字母代码表示。
除非另有说明，否则本领域技术人员已知的标准方法可用于生产重组和合成的多肽、抗体或其抗原结合片段、操作核酸序列、生产转化细胞、构建rAAV构建体、修饰的衣壳蛋白、表达AAV rep和/或cap序列的包装载体以及瞬时和稳定转染的包装细胞。此类技术对本领域技术人员是已知的。参见，例如，SAMBROOK et al.，MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL 4th Ed.(Cold Spring Harbor,NY,2013)；F.M.AUSUBEL et al.CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.and JohnWiley&Sons,Inc.,纽约)。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其他参考文献在此均通过引用以其整体并入。
定义
如在本发明和所附权利要求书的描述中所使用的，单数形式“一个/种(a，an)”和“所述/该(the)”也包括复数形式，上下文另有明确指示除外。
如本文使用的，“和/或”是指并包括一种或更多种相关所列项目的任一种和所有可能的组合，以及当在替代物(“或”)中解释时不组合。
此外，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。
此外，当指可测量的值如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度等时，本文所用的术语“约”意指包括指定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
本文所用的与核酸、蛋白质或衣壳结构有关的术语“主要由……组成”意指核酸、蛋白质或衣壳结构不包含除所述要素以外的显著改变(例如，超过约1％、5％或10％)核酸、蛋白质或衣壳结构目的功能的任何要素，例如蛋白质或衣壳或由核酸编码的蛋白质或衣壳的嗜性特征。
在本发明说明书和所附权利要求书中，AAV衣壳亚基中所有氨基酸位置的指定是相对于VP1衣壳亚基编号而言的。
本发明上下文中的术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV3型(包括3A和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV以及目前已知或以后发现的任何其他AAV。参见，例如BERNARD N.FIELDS et al.，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。已鉴定了许多其他AAV血清型和分支(参见，例如Gao et al.，(2004)J.Virol.78:6381-6388和表1)，其也被包含在术语“AAV”中。
各种AAV和自主细小病毒的基因组序列，以及ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这些序列可以在文献或公共数据库，如
Figure GDA0004114087460000081
数据库中找到。参见，例如
Figure GDA0004114087460000082
登录号NC 002077、NC001401、NC 001729、NC 001863、NC 001829、NC 001862、NC 000883、NC 001701、NC 001510、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC 001358、NC001540、AF513851、AF513852、AY530579、AY631965、AY631966；其公开内容以其整体并入本文。还参见，例如Srivistava et al.,(1983)J.Virol.45:555；Chiorini et al.,(1998)J.Virol.71:6823；Chiorini et al.,(1999)J.Virol.73:1309；Bantel-Schaal et al.,(1999)J.Virol.73:939；Xiao et al.,(1999)J.Virol.73:3994；Muramatsu et al.,(1996)Virology 221:208；Shade et al.,(1986)J.Virol.58:921；Gao et al.,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；国际专利公开号WO 00/28061、WO 99/61601、WO98/11244；美国专利号6156303；其公开内容以其整体并入本文。还见表1。Xiao，X.(1996)，宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学博士论文“Characterization of Adeno-associated virus(AAV)DNA replication and integration”(其整体被并入本文)中提供了AAV1、AAV2和AAV3末端重复序列的早期描述。
“嵌合”AAV核酸衣壳编码序列或AAV衣壳蛋白是一种结合了两种或更多种衣壳序列的多个部分的序列。“嵌合”AAV病毒粒子或颗粒包含嵌合AAV衣壳蛋白。
表1.AAV基因组
Figure GDA0004114087460000091
Figure GDA0004114087460000101
本文使用的术语“嗜性”是指病毒优先进入特定细胞或组织类型和/或优先与所述细胞表面相互作用，这有助于进入特定细胞或组织类型，任选地并且优选地随后表达(例如转录和任选地翻译)该细胞内病毒基因组携带的序列，例如，对于重组病毒，表达异源核苷酸序列。本领域技术人员将理解，在不存在反式作用因子的情况下，来自病毒基因组的异源核酸序列的转录可能无法启动，例如，对于诱导型启动子或其他受调控的核酸序列。在rAAV基因组的情况下，来自病毒基因组的基因表达可以来自稳定整合的前病毒和/或未整合的游离体，以及病毒核酸在细胞内可能采取的任何其他形式。
术语“嗜性特征”是指一种或更多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。合成AAV衣壳的代表性实例具有以有效转导肝脏细胞而仅低转导其他器官为特征的嗜性特征。
本文所用的术语“肝细胞特异性”是指病毒载体，当被体内施用时，优先转导肝细胞，而对肝外细胞的转导极少。在一些实施方案中，至少约80％的转导细胞是肝细胞，例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的肝细胞。
本文所用术语“病症可通过在肝脏中表达产物来治疗”是指此类疾病、病症或损伤，其中肝脏中产物(如蛋白质或多核苷酸)的表达提供病症的有效治疗或预防。
如本文所用，病毒载体(例如AAV载体)对细胞的“转导”是指载体进入细胞，且通过将核酸掺入病毒载体并随后通过病毒载体转移到细胞中而将遗传物质转移到细胞中。
除非另有说明，否则“有效转导”或“有效嗜性”或类似术语可通过参考合适的阳性或阴性对照(例如，分别为阳性对照的转导或嗜性的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多，或分别为阴性对照的转导或嗜性的至少约110％、120％、150％、200％、300％、500％、1000％或更多)来确定。
类似地，通过参考合适的对照，可以确定病毒对靶组织是否“未有效地转导”或“不具有有效嗜性”，或类似的术语。在特定实施方案中，病毒载体未有效转导(即，不具有有效嗜性)肝外的组织，例如肌肉、肾、生殖腺和/或生殖细胞。在特定的实施方案中，组织(例如，肝脏)的不良转导为所需靶组织(例如，肝细胞)的转导水平的20％或更低、10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.1％或更低。
如本文所用，术语“多肽”包括肽和蛋白质，另有说明除外。
“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但优选单链或双链DNA序列。
如本文使用的，“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分的核酸或核苷酸序列，例如细胞或病毒的结构组分，或通常发现的与所述核酸或核苷酸序列相关的其他多肽或核酸。
同样，“分离的”多肽是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他成分分离或基本上不含天然存在的生物体或病毒的至少一些其他成分的多肽，例如，细胞或病毒的结构成分或通常发现的与所述多肽相关的其他多肽或核酸。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”(或语法等价术语)是指受试者病情的严重程度有所减轻，或至少部分改善或减轻，和/或至少一种临床症状得到某种缓解、减轻或减少和/或病情进展有所延缓和/或预防或延缓疾病或病症的发作。
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(prevents)”或“预防(prevention)”(和其语法等价术语)是指延迟疾病或病症发作或减轻疾病或病症发作时的症状。这些术语并不意味着完全消除疾病，而是包括任何类型的减少病情的发生或延迟病情的发作和/或进展的预防性治疗。
本文所用的“有效”或“治疗有效”量是足以给受试者提供一些改善或益处的量。换句话说,“有效”或“治疗有效”量是对受试者的至少一种临床症状提供某种缓解、减轻、或减少的量。本领域技术人员应理解，只要向受试者提供一些益处，治疗效果不必是完全的或治愈性的。
“异源核苷酸序列”或“异源核酸”是病毒中非天然存在的序列。通常，异源核酸或核苷酸序列包括编码多肽和/或非翻译RNA的开放阅读框。
“治疗性多肽”可以是多肽，其可减轻或减少因细胞或受试者中的蛋白缺乏或缺陷而引起的症状。另外，“治疗性多肽”可以是以其它方式赋予受试者益处的多肽，例如抗癌作用或移植物存活性的改善。
如本文所用，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)通常指用作核酸递送媒介物的病毒颗粒，且其包含包装在病毒粒子内的病毒核酸(即载体基因组)。根据本发明的病毒载体包括根据本发明的合成AAV衣壳，并可以包装AAV或rAAV基因组或包括病毒核酸在内的任何其他核酸。或者，在一些上下文中，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)可用于指在不存在病毒粒子的情况下的载体基因组(例如，vDNA)和/或指充当转运体以递送拴系到衣壳或包装在衣壳内的分子的病毒衣壳。
“重组AAV载体基因组”或“rAAV基因组”是AAV基因组(即vDNA)，其包含至少一个反向末端重复序列(例如，一个、两个或三个反向末端重复序列)和一个或更多个异源核苷酸序列。rAAV载体通常保留145个顺式碱基末端重复序列(TR)，以产生病毒；但是，修饰的AAVTR和非AAV TR(包括部分或完全合成的序列)也可用于此目的。所有其他病毒序列是不必要的，并且可以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158:97)。rAAV载体任选包含两个TR(例如，AAV TR)，其通常位于异源核苷酸序列的5’端和3’端，但不必与其邻接。TR可以彼此相同或不同。载体基因组也可以在其3’或5’末端包含单个ITR。
术语“末端重复序列”或“TR”包括任何病毒末端重复或合成序列，其形成发夹结构并起反向末端重复序列作用(即，介导所需功能，如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等)。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列，例如其他细小病毒(例如，犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的非AAV TR序列或作为SV40复制起点的SV40发夹结构可用作TR，其可通过截短、取代、缺失、插入和/或添加进一步修饰。此外，TR可以是部分或完全合成的，如Samulski等人的美国专利号5,478,745中所述的“双D序列”。
“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或目前已知或以后发现的任何其他AAV(参见，例如，表1)。AAV末端重复无需具有天然末端重复序列(例如，天然AAV TR序列可通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变)，只要末端重复序列介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等即可。
术语“rAAV颗粒”和“rAAV病毒粒子”在此可互换使用。“rAAV颗粒”或“rAAV病毒粒子”包含包装在AAV衣壳内的rAAV载体基因组。
AAV衣壳结构在BERNARD N.FIELDS et al.,VIROLOGY,第2卷,第69章和第70章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)中有更详细的描述。
所谓“基本上保留”一种特性(例如，活性或其他可测量特性)，其是指至少保留该特性的约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
修饰的AAV5衣壳蛋白
本发明人已经鉴定了修饰的AAV5衣壳蛋白，其能够在体内和体外提供对人类和其他哺乳动物肝细胞的增强转导，具有与野生型AAV5衣壳蛋白相似或更低的血清反应性。因此，本发明的一个方面涉及修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于具有氨基酸序列SEQ IDNO:12的野生型AAV5衣壳蛋白的G257R突变。G257R修饰的AAV5衣壳具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白还包含选自Q179R、F417L、S705G或其任意组合的突变。在一个实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白包含突变G257R和Q179R(SEQ IDNO:10)。在一个实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白包含突变G257R和F417L(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白包含突变G257R和S705G(SEQ ID NO:8)。
本发明的另一方面涉及修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于具有氨基酸序列SEQID NO:12的野生型AAV5衣壳蛋白的突变P200S、M469I和A579T。该修饰的AAV5衣壳具有SEQID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个的氨基酸序列至少90％相同(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％相同)的氨基酸序列、主要由该氨基酸序列组成或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白包含SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个的氨基酸序列、主要由该氨基酸序列组成或由该氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白包含SEQ ID NOS:2、4、6、8或10中任一个所示的氨基酸序列、主要由该氨基酸序列组成或由该氨基酸序列组成，其中1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、50个或更少的氨基酸被另一氨基酸(天然存在的、修饰的和/或合成的)取代，任选地为保守氨基酸取代，和/或1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、50个或更少的氨基酸被缺失，和/或存在1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、或50个或更少的氨基酸插入(包括N-末端和C-末端延伸)或取代、缺失和/或插入的任何组合，其中所述取代、缺失和/或插入没有过度地损害包含变异衣壳蛋白或衣壳的病毒粒子(例如AAV病毒粒子)的结构和/或功能。例如，在本发明的代表性实施方案中，包含修饰的AAV5衣壳蛋白的AAV病毒粒子基本上保留了包含修饰的AAV5衣壳蛋白(如SEQ ID NO:2、4、6、8或10中所示)的合成病毒粒子的至少一种特性。例如，包含修饰的AAV5衣壳蛋白的病毒粒子可能基本保留包含修饰AAV5衣壳蛋白(如SEQ ID NO:2、4、6、8或10中所示)的病毒粒子的嗜肝特征。评估生物学特性如病毒转导的方法是本领域熟知的(参见，例如，实施例)。
在本发明说明书和所附权利要求书中，所有氨基酸位置的指定是相对于VP1编号而言的。本领域技术人员将理解，AAV衣壳通常也包含较小的VP2和VP3衣壳蛋白。由于AAV衣壳蛋白编码序列重叠，VP2和VP3衣壳蛋白的核酸编码序列和氨基酸序列根据所公开序列中所示的VP1序列将是明显的。在某些实施方案中，考虑了包含本发明序列的分离的VP2和VP3衣壳蛋白以及编码VP2或VP3蛋白或两者的分离的核酸。还考虑了包含本发明的VP2或VP3序列的嵌合衣壳蛋白。
保守的氨基酸取代是本领域已知的。在特定的实施方案中，保守氨基酸取代包括下组中的一种或更多种取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和/或苯丙氨酸、酪氨酸。
对本领域技术人员明显的是，可以进一步修饰SEQ ID NO:2、4、6、8或10的修饰的AAV5 AAV衣壳蛋白的氨基酸序列，以掺入本领域已知的其他修饰赋予所需的特性。作为非限制性的可能性，可以修饰衣壳蛋白以掺入靶向序列(例如RGD)或便于纯化和/或检测的序列。例如，衣壳蛋白可以与全部或部分的谷胱甘肽-s-转移酶、麦芽糖结合蛋白、肝素/硫酸乙酰肝素结合域、poly-His、配体和/或报告蛋白(如绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等)、免疫球蛋白Fc片段、单链抗体、血凝素、c-myc、FLAG表位等融合形成融合蛋白。将靶向肽插入AAV衣壳的方法是本领域已知的(参见，例如，国际专利公开号WO00/28004；Nicklin et al.,(2001)Mol.Ther.474-181；White et al.,(2004)Circulation109:513-319；Muller et al.,(2003)Nature Biotech.21:1040-1046)。
本发明的病毒可能还包含国际专利公开号WO 01/92551和美国专利号7,465,583中所述的双链病毒基因组。
本发明还提供了包含本发明修饰的AAV5衣壳蛋白的AAV衣壳和包含其的病毒颗粒(即病毒粒子)，其中该病毒颗粒包装(即包裹)载体基因组，任选地AAV载体基因组。在特定的实施方案中，本发明提供了包含AAV衣壳的AAV颗粒，所述AAV衣壳包括本发明的AAV衣壳蛋白，其中该AAV衣壳包装AAV载体基因组。本发明还提供了AAV颗粒，其包含由本发明的合成核酸衣壳编码序列编码的AAV衣壳或AAV衣壳蛋白。
例如，在特定的实施方案中，病毒粒子是包含目的异源核酸的重组载体，用于递送至细胞。因此，本发明可用于在体外、离体和体内向细胞递送核酸。在代表性的实施方案中，本发明的重组载体可有利地用于向动物(例如，哺乳动物)细胞递送或转移核酸。
任何异源核苷酸序列可由本发明的病毒载体递送。目的核酸包括编码多肽，任选地治疗性(例如，用于医学或兽医用途)和/或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽的核酸。
治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、抗肌萎缩蛋白(包括抗肌萎缩蛋白小基因(mini-gene)或微基因(micro-gene)的蛋白产物，参见，例如，Vincentet al.,(1993)Nature Genetics 5:130；美国专利公开号2003017131；Wang et al.,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13714-9[小抗肌萎缩蛋白(mini-dystrophin)]；Harper et al.,(2002)Nature Med.8:253-61[微抗肌萎缩蛋白(micro-dystrophin)])；小集聚蛋白(mini-agrin)、层粘连蛋白-α2、肌聚糖蛋白(α、β、γ或δ)、Fukutin相关蛋白、肌生成抑制蛋白前肽、卵泡抑素、显性失活肌生成抑制蛋白、血管生成因子(例如VEGF、血管生成素1或2)、抗凋亡因子(例如血红素加氧酶1、TGF-β、促凋亡信号的抑制剂，如半胱天冬氨酸蛋白酶、蛋白酶、激酶、死亡受体[例如CD-095]、细胞色素C释放的调节剂、线粒体孔开放和膨胀的抑制剂)；激活素Ⅱ型可溶性受体、抗炎多肽，如Ikappa B显性突变体、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)、小抗肌萎缩蛋白相关蛋白(mini-utrophin)、针对肌生成抑制蛋白或肌生成抑制蛋白前肽的抗体或抗体片段、细胞周期调节剂、Rho激酶调节剂，如Cethrin(这是一种改良的细菌C3胞外酶[获自BioAxone Therapeutics,Inc.,Saint-Lauren,Quebec,Canada]、BCL-xL、BCL2、XIAP、FLICEc-s、显性失活胱天蛋白酶-8、显性失活胱天蛋白酶-9、SPI-6(参见，例如美国专利申请号20070026076)、转录因子PGC-α1、Pinch基因、ILK基因和胸腺素β4基因)、凝血因子(例如因子Ⅷ、因子Ⅸ、因子Ⅹ等)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、细胞内和/或细胞外超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受体、脑啡肽酶、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、β球蛋白、α球蛋白、血影蛋白、α1抗胰蛋白酶、甲基胞嘧啶结合蛋白2、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶A、支链酮酸脱氢酶、RP65蛋白、细胞因子(例如，α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白介素1至14、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素类(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子，包括IGF-1和IGF-2、GLP-1、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子3和神经营养因子4、脑源性神经营养因子、胶质细胞衍生生长因子和转化生长因子α和转化生长因子β等)、骨形态发生蛋白(包括RANKL和VEGF)、溶酶体蛋白、谷氨酸受体、淋巴因子、可溶性CD4、Fc受体、T细胞受体、ApoE、ApoC、蛋白磷酸酶抑制剂1的抑制剂1(I-1)、受磷蛋白、serca2a、溶酶体酸性环境α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、Barkct、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、calsarcin、受体(例如，肿瘤坏死生长因子-α可溶性受体)、抗炎因子如IRAP、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、ECF-SOD、激肽释放酶、胸腺素-β4、缺氧诱导型转录因子[HIF]、血管生成因子、S100A1、细小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲除的分子，如截短的组成型活性bARKct；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，如受磷蛋白S16E、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体)或自杀基因产物(如胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子如TNF-α)以及在需要其的受试者中具有治疗效果的任何其它多肽。
编码多肽的异源核苷酸序列包括编码报告多肽(例如酶)的序列。报告多肽是本领域已知的，包括但不限于荧光蛋白(例如，EGFP、GFP、RFP、BFP、YFP或dsRED2)、产生可检测产物的酶，例如荧光素酶(例如，来自Gaussia、Renilla或Photinus)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶和氯霉素乙酰转移酶基因或可直接检测的蛋白质。实际上，任何蛋白质都可以通过使用，例如，针对蛋白质的特异性抗体来直接检测。Sambrook and Russell(2001),Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.(1992),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons公开了适用于真核细胞阳性或阴性选择的其他标记物(和相关抗生素)，包括定期更新。
或者，异源核酸可以编码功能性RNA，例如反义寡核苷酸、核酶(例如，如美国专利号5,877,022中所述)、实现剪接体介导的反式剪接的RNA(参见Puttaraju et al.,(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702)、包括介导基因沉默的小干扰RNA(siRNA)在内的干扰RNA(RNAi)(参见Sharp et al.,(2000)Science 287:2431)、microRNA或其他非翻译的“功能性”RNA，例如“向导”RNA(Gorman et al.,(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:4929；Yuan等人的美国专利号5,869,248)等。示例性的非翻译RNA包括针对多重耐药性(MDR)基因产物的RNAi或反义RNA(例如，治疗肿瘤和/或对心脏施用以防止化疗造成的损害)、针对肌生成抑制蛋白的RNAi或反义RNA(Duchenne或Becker肌营养不良症)、针对VEGF或肿瘤免疫原(包括但不限于本文特别描述的那些肿瘤免疫原)的RNAi或反义RNA(用于治疗肿瘤)、靶向突变型抗肌萎缩蛋白的RNAi或反义寡核苷酸(Duchenne或Becker肌营养不良症)、针对乙型肝炎表面抗原基因的RNAi或反义RNA(用于预防和/或治疗乙型肝炎感染)、针对HIV tat和/或rev基因的RNAi或反义RNA(用于预防和/或治疗HIV)和/或针对来自病原体(保护受试者免受病原体感染)或缺陷基因产物(用于预防或治疗疾病)的任何其他免疫原的RNAi或反义RNA。针对上述靶标或任何其他靶标的RNAi或反义RNA也可用作研究试剂。
如本领域所知，反义核酸(如DNA或RNA)和抑制性RNA(如microRNA和RNAi如siRNA或shRNA)序列可用于在具有因抗肌萎缩蛋白基因缺陷引起的诱导肌营养不良症患者中诱导“外显子跳跃”。因此，异源核酸可以编码诱导适当外显子跳跃的反义核酸或抑制性RNA。本领域技术人员将理解，外显子跳跃的特定方法取决于抗肌萎缩蛋白基因中潜在缺陷的性质，并且许多这样的策略在本领域中是已知的。示例性反义核酸和抑制性RNA序列靶向一个或更多个抗肌萎缩蛋白外显子(例如，外显子19或23)的上游分支点和/或下游供体剪接位点和/或内部剪接增强子序列。例如，在特定的实施方案中，异源核酸编码直接针对抗肌萎缩蛋白基因外显子19或23的上游分支点和下游剪接供体位点的反义核酸或抑制性RNA。这种序列可以被掺入递送修饰的U7 snRNA和反义核酸或抑制性RNA的AAV载体中(参见，例如，Goyenvalle et al.,(2004)Science 306:1796-1799)。作为另一种策略，可将修饰的U1snRNA与互补于抗肌萎缩蛋白基因外显子(例如外显子19或23)的上游和下游剪接位点的siRNA、microRNA或反义RNA一起掺入到AAV载体中(参见，例如，Denti et al.,(2006)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:3758-3763)。此外，反义核酸和抑制性RNA可以靶向外显子19、43、45或53内的剪接增强子序列(参见，例如，美国专利号6,653,467；美国专利号6,727,355；和美国专利号6,653,466)。
重组病毒载体还可包含与宿主染色体上的基因座具有同源性并与之重组的异源核苷酸序列。这种方法可用于纠正宿主细胞中的遗传缺陷。
本发明还提供表达免疫原性多肽的重组病毒载体，例如用于疫苗接种。异源核酸可编码本领域已知的目的免疫原，包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。或者，免疫原可存在于病毒衣壳中(例如，掺入其中)或拴系于病毒衣壳上(例如，通过共价修饰)。
细小病毒作为疫苗的用途是本领域已知的(参见，例如，Miyamura et al.,(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:8507；Young等人的美国专利号5,916,563、Mazzara等人的美国专利号5,905,040、Samulski等人的美国专利号5,882,652、美国专利号5,863,541；其公开内容通过引用以其整体并入本文)。抗原可存在于病毒衣壳中。或者，抗原可由引入重组载体基因组的异源核酸表达。
免疫原性多肽或免疫原可以是适于保护受试者抵抗疾病(包括但不限于微生物疾病、细菌性疾病、原虫病、寄生虫病、真菌性疾病和病毒性疾病)的任何多肽。例如，免疫原可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因，或马流感病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如,马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，例如HIV或SIV包膜GP160蛋白、HIV或SIV基质/衣壳蛋白以及HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原也可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒免疫原，如拉沙热病毒核衣壳蛋白基因和拉沙热包膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如，牛痘，如牛痘L1或L8基因)、黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，如NP和GP基因)、布尼亚病毒免疫原(例如，RVFV、CCHF和SFS病毒)或冠状病毒免疫原(例如，传染性人冠状病毒免疫原，如人冠状病毒包膜糖蛋白基因，或猪传染性胃肠炎病毒免疫原，或禽传染性支气管炎病毒免疫原或严重急性呼吸综合征(SARS)免疫原，如S[S1或S2]、M、E或N蛋白或其免疫原性片段)。免疫原还可以是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)免疫原或本领域已知的任何其他疫苗免疫原。
或者，免疫原可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌症抗原在癌细胞的表面表达。示例性癌症和肿瘤细胞抗原在S.A.Rosenberg,(1999)Immunity 10:281)中描述。示例性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑色素瘤肿瘤抗原(Kawakami et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515；Kawakami et al.,(1994)J.Exp.Med.,180:347；Kawakami et al.,(1994)Cancer Res.54:3124)包括MART-1(Coulie et al.,(1991)J.Exp.Med.180:35)、gp100(Wick et al.,(1988)J.Cutan.Pathol.4:201)和MAGE抗原(MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3)(Van der Bruggen et al.,(1991)Science,254:1643)、CEA、TRP-1；TRP-2；P-15和酪氨酸酶(Brichard et al.,(1993)J.Exp.Med.178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利号4,968,603)；CA 125；HE4；LK26；FB5(内皮唾酸蛋白)；TAG 72；AFP；CA19-9；NSE；DU-PAN-2；CA50；Span-1；CA72-4；HCG；STN(唾液酸Tn抗原)；c-erbB-2蛋白；PSA；L-CanAg；雌激素受体；乳脂球蛋白；p53肿瘤抑制蛋白(Levine,(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)；粘蛋白抗原(国际专利公开WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头瘤病毒抗原；以及与下列癌症相关的抗原：黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌、食管癌、头颈癌和其他(参见，例如，Rosenberg,(1996)Annu.Rev.Med.47:481-91)。
或者，异源核苷酸序列可以编码期望在体外、离体或体内细胞中产生的任何多肽。例如，可以将病毒载体导入培养的细胞中，并从中分离表达的蛋白质产物。
本领域技术人员应当理解，目的异源核酸可操作地与适当的控制序列相关联。例如，异源核酸可操作地与表达控制元件相关联，例如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。
本领域技术人员应进一步理解，根据所需的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。启动子/增强子可以是组成型或诱导型的，这取决于所需的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外源的，并且可以是天然的或合成的序列。就外源而言，其意指在导入转录起始区的野生型宿主中不存在该转录起始区。
启动子/增强子元件可以是对待处理的靶细胞或受试者天然的和/或对异源核酸序列是天然的。通常选择启动子/增强子元件，使其在目的靶细胞中发挥作用。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强元件可以是基于RNA聚合酶Ⅱ的启动子或基于RNA聚合酶Ⅲ的启动子。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常用于需要对异源核酸序列表达提供调控的那些应用中。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或组织优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性的)、眼(包括视网膜特异性和角膜特异性的)、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的和肺特异性或优选的启动子/增强子元件。在一个实施方案中，使用肝细胞特异性或肝细胞优选的启动子。肝细胞特异性或优选的启动子的实例包括但不限于载脂蛋白AII、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、甲状腺素结合球蛋白、细胞色素P450 CYP3A4或microRNA122或合成的肝特异性调控序列。通过进一步将异源核酸的表达局限于肝脏，使用肝细胞特异性或优选的启动子可以增加由合成AAV载体实现的特异性。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型元件和金属诱导型元件。示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在实施方案中，其中所述异源核酸序列在靶细胞中被转录且然后被翻译，特异性起始信号通常用于插入蛋白编码序列的有效翻译。这些可能包括ATG起始密码子和相邻序列的外源性翻译控制序列可以有多种来源，天然的和合成的。
本发明还提供了包含AAV衣壳和AAV基因组的合成AAV颗粒，其中所述AAV基因组“对应于”(即编码)AAV衣壳。还提供了这种嵌合AAV颗粒的集合或库，其中该集合或库包含2个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、1000个或更多个、104个或更多个、105个或更多个、或106个或更多个不同序列。
本发明还包括“空”衣壳颗粒(即，不存在载体基因组)，其包含本发明的修饰AAV5衣壳蛋白、由或主要由本发明的修饰AAV5衣壳蛋白组成。本发明的合成AAV衣壳可用作“衣壳媒介物”，如美国专利号5,863,541中所述。能够共价连接、结合或被病毒衣壳包装并转移到细胞中的分子包括DNA、RNA、脂质、碳水化合物、多肽、小有机分子或其组合。此外，分子可以与病毒衣壳的外部相关联(例如，“拴系到病毒衣壳的外部”)，以将分子转移到宿主靶细胞中。在本发明的一个实施方案中，分子与衣壳蛋白共价连接(即，偶联或化学结合)。共价连接分子的方法是本领域技术人员已知的。
本发明的病毒衣壳还可用于产生针对新衣壳结构的抗体。作为另一种替代方法，可将外源性氨基酸序列插入病毒衣壳中，以便向细胞呈递抗原，例如，对受试者施用以产生对外源性氨基酸序列的免疫反应。
本发明还提供了编码本发明的修饰AAV5衣壳蛋白的核酸(例如，分离的核酸)。还提供了包含核酸的载体，以及包含本发明的核酸和/或载体的细胞(体内或在培养物中)。例如，这些核酸、载体和细胞可作为试剂(例如，辅助构建体或包装细胞)用于生产本文所述的病毒载体。
在示例性实施方案中，本发明提供编码修饰的SEQ ID NO:2、4、6、8或10的AAV5衣壳或与其至少90％相同的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ IDNOS:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少90％相同，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％相同的核苷酸序列，主要由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NOS:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列、主要由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。本发明还提供了编码上述衣壳蛋白变体和融合蛋白的核酸。在特定的实施方案中，核酸在本领域技术人员已知的标准条件下与本文具体公开的核酸序列的互补序列杂交，并编码变体衣壳和/或衣壳蛋白。任选地，变体衣壳或衣壳蛋白基本保留所述衣壳和/或由SEQ ID NO:1、3、5、7或9的核酸序列编码的衣壳或衣壳蛋白的至少一种特性。例如，包含变体衣壳或变体衣壳蛋白的病毒颗粒可以基本上保留包含由SEQ ID NO:1、3、5、7或9的核酸编码序列编码的衣壳或衣壳蛋白的病毒颗粒的嗜肝性特征。
例如，这些序列的杂交可在降低严格、中等严格或甚至严格条件下进行。降低的严格性杂交、中等严格杂交和严格杂交的示例性条件如下：例如，分别在37℃，具有5xDenhardt's溶液、0.5％ SDS和1xSSPE的35-40％甲酰胺的洗涤严格性所表示的条件；在42℃，具有5xDenhardt's溶液、0.5％SDS和1xSSPE的40-45％甲酰胺的洗涤严格性所表示的条件；和在42℃，具有5xDenhardt's溶液、0.5％SDS和1xSSPE的50％甲酰胺的洗涤严格性所表示的条件)。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第4版2013)(Cold Spring Harbor Laboratory)。
在其他实施方案中，编码本发明的变体衣壳或衣壳蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7或9的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％或更高的序列同一性，并任选地编码基本上保留由SEQ ID NO:1、3、5、7或9的核酸编码的衣壳或衣壳蛋白的至少一种特性的变体衣壳或衣壳蛋白。
如本领域所知，许多不同的程序可用于鉴定核酸或多肽是否与已知序列具有序列同一性。本文所用的同一性百分比是指当使用BLASTN与另一种核酸(或其互补链)进行最佳比对(具有适当的核苷酸插入或缺失)时，一种核酸或其片段与另一种核酸具有指定的同一性百分比。为了确定两种不同核酸之间的同一性百分比，将使用BLASTN程序“BLAST 2序列”来确定同一性百分比。该程序可通过互联网从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得供公众使用(Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402)。要使用的参数是使用括号中显示的默认参数得出最高计算的同一性百分比(计算如下)的以下各项的任意组合：程序--blastn矩阵--0BLOSUM62匹配奖励—0或1(1)错配罚分--0,-1,-2或-3(-2)开放空位罚分--0,1,2,3,4或5(5)延伸空位罚分—0或1(1)空位x_下降(Gap x_dropoff)—0或50(50)预期--10。
当提及多肽时，同一性或相似性百分比指示使用BLASTP确定的所讨论的多肽当与另一蛋白质或其部分蛋白质在共同长度上相比时显示指定的同一性或相似性百分比。该程序也可通过互联网从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得供公众使用(Altschul etal.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402)。多肽的同一性或相似性百分比通常使用序列分析软件来测量。参见，例如，遗传学计算机组的序列分析软件包，University ofWisconsin Biotechnology Center,910University Avenue,Madison,Wis.53705。蛋白质分析软件使用对各种取代、缺失和其它修饰指定的同源性措施来匹配相似的序列。保守取代通常包括下列组中的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
在特定的实施方案中，核酸可包含如下的载体、主要由该载体组成或由该载体组成，所述载体包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体(例如，AAV载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体)、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)组成。例如，核酸可以包含含有5’和/或3’末端重复序列(例如，5’和/或3’AAV末端重复序列)的AAV载体、由或主要由该AAV载体组成。
在一些实施方案中，编码合成的AAV衣壳蛋白的核酸还包含AAV rep编码序列。例如，核酸可以是用于产生病毒原液的辅助构建体。
本发明还提供稳定包含本发明核酸的包装细胞。例如，核酸可以稳定整合入细胞的基因组中，或者可以稳定保持游离形式(例如，“基于EBV的核游离体”)。
可以将核酸整合到递送载体，例如病毒递送载体中。为了说明，本发明的核酸可以包装在AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒、杆状病毒颗粒或任何其他合适的病毒颗粒中。
此外，核酸可以与启动子元件可操作地结合。启动子元件在本文中有更详细的描述。
本发明还提供了生产本发明的病毒载体的方法。在代表性的实施方案中，本发明提供了生产重组病毒载体的方法，该方法包括在体外向细胞提供(a)模板，该模板包含(ⅰ)异源核酸，和(ⅱ)足以将AAV模板包裹成病毒颗粒的包装信号序列(例如，一个或更多个(例如，两个)末端重复序列，例如AAV末端重复序列)，和(b)足以将模板复制并包裹成病毒颗粒的AAV序列(例如，编码本发明AAV衣壳的AAV rep和AAV cap序列)。在使得在细胞中产生包含模板包装在衣壳内的重组病毒颗粒的条件下提供模板和AAV复制序列和衣壳序列。该方法还可以包括从细胞中收集病毒颗粒的步骤。病毒颗粒可从培养基和/或通过裂解细胞收集。
在一个说明性实施方案中，本发明提供生产包含AAV衣壳的rAAV颗粒的方法，该方法包括向体外细胞提供编码本发明的修饰的AAV5衣壳的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生有效AAV感染的辅助功能元件；和允许包含AAV衣壳并包裹AAV载体基因组的AAV颗粒组装。
该细胞通常是允许AAV病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适的细胞，例如哺乳动物细胞。提供复制缺陷辅助病毒的功能缺失的反式互补包装细胞系也是合适的，如293细胞或其他E1a反式互补细胞。
AAV复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能很方便。AAV rep和/或cap序列可以由任何病毒载体或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可由杂交腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺失腺病毒载体的E1a或E3区)。EBV载体也可用于表达AAV cap和rep基因。该方法的一个优点是，EBV载体是游离型，但在整个连续细胞分裂过程中将保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定整合到细胞中，称为基于EBV的核游离体。
作为另一种选择，rep/cap序列可以在细胞内被稳定携带(游离型或整合的)。
通常，AAV rep/cap序列两侧没有AAV包装序列(例如，AAV ITR)，以防止这些序列的拯救和/或包装。
可以使用本领域已知的任何方法将模板(例如，rAAV载体基因组)提供给细胞。例如，模板可以由非病毒载体(例如质粒)或病毒载体提供。在特定的实施方案中，模板由疱疹病毒载体或腺病毒载体(例如，插入腺病毒缺失的E1a或E3区域)提供。作为另一个示例(Palombo et al.,(1998)J.Virol.72:5025)描述了杆状病毒载体，其携带两侧有AAV ITR的报告基因。EBV载体也可用于递送模板，如上文关于rep/cap基因所述。
在另一个代表性的实施方案中，模板由复制型rAAV病毒提供。在其它实施方案中，AAV前病毒被稳定整合到细胞的染色体中。
为了获得最大的病毒滴度，通常向细胞提供有效AAV感染所必需的辅助病毒功能元件(例如，腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可由另一种非病毒载体或病毒载体提供，例如携带有效AAV生产所需的所有辅助基因的非感染性腺病毒小质粒，如Ferrari et al.,(1997)Nature Med.3:1295和美国专利号6,040,183和6,093,570所述。
此外，辅助病毒功能可由具有整合在染色体中的辅助基因的包装细胞提供，或作为稳定的染色体外元件被维持。在代表性的实施方案中，辅助病毒序列不能被包装到AAV病毒粒子中，例如，因两侧没有AAV ITR。
本领域技术人员将理解，在单个辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如,腺病毒序列)可能是有利的。该辅助构建体可以是非病毒构建体或病毒构建体，但任选地是包含AAV rep/cap基因的杂交腺病毒或杂交疱疹病毒。
在一个特定的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该载体还包含rAAV模板。可以将AAV rep/cap序列和/或AAV模板插入腺病毒缺失的区域(例如E1a或E3区)。
在另一个实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。将rAAV模板作为质粒模板提供。
在另一个说明性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板作为前病毒被整合到细胞中。或者，rAAV模板由EBV载体提供，该载体作为染色体外元件(例如，作为“基于EBV的核游离体”，见Margolski,(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67)保持在细胞内。
在另一个示例性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个辅助腺病毒提供。rAAV模板作为单独的复制型病毒载体提供。例如，rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，杂交腺病毒载体通常包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即腺病毒末端重复序列和PAC序列)。AAV rep/cap序列和(如果存在的话)AAV模板被嵌入腺病毒骨架中，并且两侧有5'和3'顺式序列，使得这些序列可被包装到腺病毒衣壳中。如上所述，在代表性的实施方案中，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列的两侧没有AAV包装序列(例如，AAV ITR)，使得这些序列无法包装到AAV病毒粒子中。
疱疹病毒也可在AAV包装方法中用作辅助病毒。编码AAV rep蛋白的杂交疱疹病毒可有利地促进更可扩展的AAV载体生产方案。表达AAV-2rep和cap基因的杂交单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体已被描述(Conway et al.,(1999)Gene Therapy 6:986和WO 00/17377，其公开内容通过引用以其整体并入本文)。
作为另一种选择，本发明的病毒载体可以在昆虫细胞中使用杆状病毒载体产生，以递送rep/cap基因和rAAV模板，如Urabe et al.,(2002)Human Gene Therapy 13:1935-43所述。
其他产生AAV的方法使用稳定转化的包装细胞(参见，例如，美国专利号5,658,785)。
不含污染性辅助病毒的AAV载体原液可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，AAV和辅助病毒可以很容易根据大小进行区分。基于对肝素底物的亲和力，也可以将AAV从辅助病毒中分离出来(Zolotukhin et al.,(1999)Gene Therapy 6:973)。在代表性实施方案中，可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染的辅助病毒都不能复制。作为另一种选择，可以使用缺乏晚期基因表达的辅助腺病毒，因为仅需要腺病毒早期基因表达来介导AAV病毒的包装。晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突变体)。
本发明的包装方法可用于生产高滴度的病毒颗粒原液。在特定的实施方案中，病毒原液具有至少约105转导单位(tu)/ml、至少约106tu/ml、至少约107tu/ml、至少约108tu/ml、至少约109tu/ml或至少约1010tu/ml的滴度。
新的衣壳蛋白和衣壳结构可用于产生抗体，例如，用于诊断或治疗用途或作为研究试剂的抗体。因此，本发明还提供了针对本发明的新衣壳蛋白和衣壳的抗体。
本文所用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以是任何来源的物种，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或人，或者可以是嵌合抗体。参见，例如，Walker et al.,Mol.Immunol.26,403-11(1989)。抗体可以是重组单克隆抗体，例如，根据美国专利号4,474,893或美国专利号4,816,567中公开的方法生产。抗体也可以是化学构建的，例如根据美国专利号4,676,980中公开的方法。
包括在本发明范围内的抗体片段包括，例如Fab、F(ab')2和Fc片段，以及从IgG以外的抗体中获得的相应片段。这些片段可以通过已知的技术产生。例如，F(ab′)2片段可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，且Fab片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生。或者，可构建Fab表达库，以快速、简便地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse etal.,(1989)Science 254,1275-1281)。
多克隆抗体可通过以下方式产生：按照已知程序，用针对靶标的单克隆抗体结合的抗原免疫合适的动物(例如，兔、山羊等)，从动物中收集免疫血清，并从免疫血清分离多克隆抗体。
根据Kohler and Milstein,(1975)Nature 265,495-97的技术，单克隆抗体可以在杂交瘤细胞系中产生。例如，可以将含有适当抗原的溶液注射到小鼠体内，且在足够的时间后，处死小鼠并获得脾细胞。然后，将脾细胞通过与骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞融合(通常在聚乙二醇存在下)永生化，以产生杂交瘤细胞。然后使杂交瘤细胞在合适的培养基中生长，并从上清液中筛选具有所需特异性的单克隆抗体。单克隆Fab片段可通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌(E.coli)中产生。参见，例如W.Huse,(1989)Science 246,1275-81。
对靶多肽具有特异性的抗体也可以通过本领域已知的噬菌体展示技术获得。
各种免疫测定法可用于筛查以鉴定具有所需特异性的抗体。许多使用具有确定特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测定的方案在本领域是公知的。这些免疫测定通常涉及测量抗原及其特异性抗体之间的复合物形成(例如，抗原/抗体复合物形成)。可以使用利用对两个非干扰表位反应的单克隆抗体的双位点、基于单克隆的免疫测定，也可以使用竞争性结合测定。
根据已知技术，抗体可以偶联到固体支持物(例如，由诸如乳胶或聚苯乙烯的材料形成的珠、板、载玻片或孔)上。根据已知技术，抗体同样可以直接或间接偶联到可检测基团，例如放射性标记(例如，35S、125I、131I)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)和荧光标记(例如，荧光素)。在本发明方法中确定抗体/抗原复合物的形成可以通过例如本领域所公知的沉淀、凝集、絮凝、放射性、显色或变色、荧光、发光等的检测来进行。
使用修饰的AAV5衣壳的方法
本发明还涉及以增强的效率和低血清反应性将异源核苷酸序列递送到肝脏中，同时最大限度地减少向其他器官递送的方法。例如，本发明的病毒载体可用于在体外将目的核苷酸序列递送至肝细胞或其他细胞，以在体外产生多肽或核酸或用于离体基因疗法。例如，载体还可用于将核苷酸序列递送至需要其的受试者的方法中以表达治疗性或免疫原性多肽或核酸。以此方式，多肽或核酸因此可在受试者体内产生。因为受试者缺乏多肽，或者因为受试者中多肽或核酸的产生可赋予一些治疗效果，因此受试者可能需要多肽或核酸作为治疗方法或其他方案，且如下文进一步解释。
在特定的实施方案中，载体可用于表达通常大体上对受试者提供有益效果的多肽或核酸。在其他实施方案中，载体可用于表达对肝脏中的细胞(例如肝细胞)提供有益作用的多肽或核酸。
因此，本发明的一个方面涉及将目的核酸递送至肝细胞的方法，该方法包括使肝细胞与本发明的AAV颗粒接触。
在另一方面，本发明涉及将目的核酸递送至哺乳动物受试者的肝细胞的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂，从而将目的核酸递送至哺乳动物受试者的肝细胞。
本发明的另一方面涉及治疗需要其的哺乳动物受试者的病症的方法，其中该病症可通过在受试者的肝脏中表达产物来治疗，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的AAV颗粒，其中所述产物被表达，从而治疗病症。
总体而言，本发明的病毒载体可用于递送任何具有生物效应的外源核酸，以治疗或改善与基因表达有关的任何病症相关的症状。此外，本发明可用于治疗任何递送治疗多肽有利的疾病状态。示例性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和其他肺部疾病、A型血友病(因子Ⅷ)、B型血友病(因子Ⅸ)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(促红细胞生成素)和其他血液疾病、阿尔茨海默病(GDF；脑啡肽酶)、多发性硬化(β-干扰素)、帕金森病(胶质细胞系源性神经营养因子[GDNF])、享廷顿病(抑制性RNA包括但不限于RNAi，如siRNA或shRNA、反义RNA或microRNA，以去除重复序列)、肌萎缩侧索硬化、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其他神经类疾病、癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配体、细胞因子(包括干扰素)；抑制性RNA包括但不限于RNAi(如siRNA或shRNA)、反义RNA和microRNA(包括针对VEGF的抑制性RNA)、多重耐药性基因产物或癌症免疫原)、糖尿病(胰岛素、PGC-α1、GLP-1、肌生成抑制蛋白前肽、葡萄糖转运蛋白4)、肌营养不良(包括Duchenne和Becker(例如，抗肌萎缩蛋白、小抗肌萎缩蛋白、微抗肌萎缩蛋白)、胰岛素样生长因子I、肌聚糖蛋白[例如，α、β、γ]、针对肌生成抑制蛋白或肌生成抑制蛋白前肽的抑制性RNA[例如RNAi、反义RNA或microRNA]、层粘连蛋白α2、Fukutin相关蛋白、显性失活肌生成抑制蛋白、卵泡抑素、激活素Ⅱ型可溶性受体、抗炎多肽，如Ikappa B显性突变体、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、小抗肌萎缩蛋白相关蛋白、针对抗肌萎缩蛋白基因中的接头连接的抑制性RNA[例如RNAi、反义RNA或microRNA]以诱导外显子跳跃[参见，例如，WO/2003/095647]、针对U7snRNA的抑制性RNA[例如RNAi、反义RNA或microRNA]以诱导外显子跳跃[参见，例如，WO/2006/021724]以及针对肌生成抑制蛋白或肌生成抑制蛋白前肽的抗体或抗体片段)、高雪氏病(葡萄糖脑苷脂酶)、胡尔勒病(α-L-艾杜糖苷酸酶)、腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)、糖原沉积病(例如，法布里病[α-半乳糖苷酶]和庞贝病[溶酶体酸性环境α-葡糖苷酶])和其他代谢缺陷，包括其他溶酶体贮积症和糖原贮积症、先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)、莱施-尼罕综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)、尼曼-匹克氏病(鞘磷脂酶)、枫糖尿病(支链酮酸脱氢酶)、视网膜变性疾病(及其他眼部和视网膜疾病；例如PDGF、内皮抑素和/或血管抑素(对于黄斑变性))、实体器官疾病，例如脑病(包括帕金森病[GDNF]、星形细胞瘤[针对内皮抑素、血管抑素和/或VEGF的RNAi]、成胶质细胞瘤[针对内皮抑素、血管抑素和/或VEGF的RNAi]、肝病(针对乙型肝炎和/或丙型肝炎基因的RNAi如siRNA或shRNA、microRNA或反义RNA)、肾病、心脏病，包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD)(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I[I-1]、受磷蛋白、肌浆内质网Ca2+-ATP酶[serca2a]、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、ECF-SOD、激肽释放酶、胸腺素β4、缺氧诱导型转录因子[HIF]、βarkct、β2肾上腺素能受体、β2肾上腺素能受体激酶[βARK]、磷酸肌醇-3激酶[PI3激酶]、calsarcin、血管生成因子、S100A1、细小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响G-蛋白偶联受体激酶2型敲除的分子如截短的组成型活性bARKct、针对受磷蛋白的抑制性RNA[例如，RNAi、反义RNA或microRNA]；受磷蛋白抑制性或显性失活分子如受磷蛋白S16E等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节疾病(胰岛素样生长因子)、内膜增生(例如，通过递送enos、inos)、提高心脏移植物存活率(超氧化物歧化酶)、AIDS(可溶性CD4)、肌肉萎缩(胰岛素样生长因子I、肌生成抑制蛋白前肽、抗凋亡因子、卵泡抑素)、肢体缺血(VEGF、FGF、PGC-1α、EC-SOD、HIF)、肾虚(促红细胞生成素)、贫血(促红细胞生成素)、关节炎(抗炎因子，如IRAP和TNFα可溶性受体)、肝炎(α-干扰素)、LDL受体缺乏症(LDL受体)、高氨血症(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、包括SCA1、SCA2和SCA3的脊髓脑共济失调、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病等。本发明还可以在器官移植后使用，以增加移植的成功率和/或减少器官移植或辅助治疗的不良副作用(例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸来阻断细胞因子的产生)。作为另一个实例，骨形态发生蛋白(包括RANKL和/或VEGF)可与骨同种异体移植物一起施用，例如，在癌症患者休息或手术切除之后。
可根据本发明治疗的示例性溶酶体贮积病包括但不限于：胡尔勒氏综合症(MPSIH)、Scheie综合征(MPS IS)和Hurler-Scheie综合征(MPS IH/S)(α-L-艾杜糖苷酸酶)；亨特氏综合征(MPS II)(硫酸艾杜糖醛酸硫酸酯酶)；A型圣菲利波综合征(MPS IIIA)(硫酸乙酰肝素磺胺酶)、B型圣菲利波综合征(MPS IIIB)(N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶)、C型圣菲利波综合征(MPS IIIC)(乙酰辅酶A-氨基葡萄糖N-乙酰转移酶)、D型圣菲利波综合征(MPSIIID)(N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸硫酸酯酶)；Morquio A病(MPS IVA)(半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶)，Morquio B病(MPS IV B)(β-半乳糖苷酶)；Maroteaux-lmay病(MPS VI)(芳基硫酸酯酶B)；Sly综合征(MPS VII)(β-葡萄糖醛酸酶)；透明质酸酶缺乏症(MPS IX)(透明质酸酶)；唾液酸沉积症(黏脂贮积症I)、黏脂贮积症II(I-Cell病)(N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶催化亚基)、黏脂贮积症III(假性Hurler多发性营养不良)N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶；IIIA型[催化亚基]和IIIC型[底物识别亚基])；GM1神经节苷脂贮积症(神经节苷脂β-半乳糖苷酶)、GM2神经节苷脂贮积症I型(泰-萨克斯病)(β-己糖胺酶A)、GM2神经节苷脂贮积症II型(山德霍夫氏病)(β-己糖胺酶B)；尼曼-皮克病(A型和B型)(鞘磷脂酶)；高雪氏病(葡萄糖脑苷脂酶)；法伯氏病(神经酰胺酶)；法布里病(α-半乳糖苷酶A)；克拉伯病(半乳糖神经酰胺β-半乳糖苷酶)；异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A)；溶酶体酸性环境脂酶缺乏症，包括Wolman氏病(溶酶体酸性环境脂酶)；Batten病(幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症)(溶酶体跨膜CLN3蛋白)唾液酸沉积症(神经氨酸酶1)；半乳糖唾液酸沉积症(戈尔伯杰综合征)(保护性蛋白/组织蛋白酶A)；α-甘露糖苷贮积症(α-D-甘露糖苷酶)；β-甘露糖苷贮积症(β-D-甘露糖苷贮积症)；岩藻糖沉积症(α-D-岩藻糖苷酶)；天冬氨酰基葡萄糖胺尿症(N-天冬氨酰氨基葡糖苷酶)；和唾液酸尿症(钠磷协同转运子)。
可根据本发明治疗的示例性糖原沉积病包括但不限于Ia型GSD(冯吉尔克病)(葡萄糖-6-磷酸酶)、Ib型GSD(葡萄糖-6-磷酸移位酶)、Ic型GSD(微粒体磷酸盐或焦磷酸盐转运蛋白)、Id型GSD(微粒体葡萄糖转运蛋白)、II型GSD包括庞贝病或婴儿IIa型GSD(溶酶体酸性环境α-葡萄糖苷酶)和IIb型(Danon)(溶酶体膜蛋白2)、IIIa型和IIIb型GSD(脱支酶；淀粉葡萄糖苷酶和低葡聚糖转移酶)、IV型GSD(安德森氏症)(分支酶)、V型GSD(麦卡德尔氏病)(肌肉磷酸化酶)、VI型GSD(赫斯氏病)(肝脏磷酸化酶)、VII型GSD(Tarui病)(磷酸果糖激酶)、VIII/IXa型GSD(X连锁磷酸化酶激酶)、IXb型GSD(肝脏和肌肉磷酸化酶激酶)、IXc型GSD(肝脏磷酸化酶激酶)、IXd型GSD(肌肉磷酸化酶激酶)、GSD O型(糖原合成酶)、Fanconi-Bickel综合征(葡萄糖转运蛋白2)、磷酸葡萄糖异构酶缺乏症、肌肉磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、果糖1,6-二磷酸酶缺乏症、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶缺乏症和乳酸脱氢酶缺乏症。
基因转移在理解和提供疾病状态治疗方面具有巨大的潜在用途。有许多遗传性疾病的缺陷基因是已知的，并已被克隆。总体而言，上述疾病状态分为两类：通常为酶的缺陷状态，通常以隐性方式遗传；以及失衡状态，其可能涉及调节蛋白或结构蛋白，且通常以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病，基因转移可用于将正常基因带入受影响的组织进行替代治疗，以及使用如RNAi(如siRNA或shRNA)、microRNA或反义RNA等抑制性RNA创建该疾病的动物模型。对于失衡的疾病状态，基因转移可用于在模型系统中创建疾病状态，然后该模型系统可以用于对抗疾病状态的努力中。因此，根据本发明的病毒载体允许治疗遗传性疾病。如本文所用，通过部分或全部纠正引起疾病或使其更严重的缺陷或失衡来治疗疾病状态。使用核酸序列的位点特异性重组来引起突变或纠正缺陷也是可能的。
根据本发明的病毒载体也可用于在体外或体内向细胞提供反义核酸或抑制性RNA(例如，microRNA或RNAi，如siRNA或shRNA)。靶细胞中抑制性RNA的表达降低细胞对特定蛋白的表达。因此，可施用抑制性RNA以降低需要其的受试者中特定蛋白的表达。抑制性RNA也可在体外被施用于细胞以调节细胞生理学，例如，优化细胞或组织培养系统。
作为另一方面，本发明的病毒载体可用于在受试者中产生免疫应答。根据该实施方案，可向受试者施用包含编码免疫原的核酸的病毒载体，并且受试者针对免疫原产生主动免疫应答(任选地，保护性免疫应答)。免疫原如上所述。
或者，可将病毒载体施用于离体细胞，并将改变的细胞施用于受试者。将异源核酸引入细胞中，并将细胞施用于受试者，其中编码免疫原的异源核酸任选地在受试者中表达并诱导针对免疫原的免疫应答。在特定的实施方案中，细胞是抗原递呈细胞(例如，树突状细胞)。
“主动免疫应答”或“主动免疫”通过“遇到免疫原后宿主组织和细胞的参与来表征。它涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化和增殖，这导致抗体的合成或细胞介导反应性的发展，或两者兼有。”Herbert B.Herscowitz,Immunophysiology:Cell Functionand Cellular Interactions in Antibody Formation,in IMMUNOLOGY:BASIC PROCESSES117(Joseph A.Bellanti编辑,1985)。换句话说，在通过感染或通过疫苗接种暴露于免疫原后，宿主产生主动免疫应答。主动免疫可与被动免疫形成对比，被动免疫是通过“将预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2)从主动免疫的宿主转移到未免疫的宿主”而获得的。同上。
本文所用的“保护性”免疫应答或“保护性”免疫指免疫应答赋予受试者一些益处，因为其预防或减少疾病的发生。或者，保护性免疫应答或保护性免疫可用于治疗疾病，尤其是癌症或肿瘤(例如，通过引起癌症或肿瘤消退和/或通过防止转移和/或通过防止转移结节生长)。保护作用可以是完全或部分的，只要治疗的益处超过其任何缺点。
也可以通过施用表达癌细胞抗原(或免疫学上类似的分子)的病毒载体或产生针对癌细胞免疫应答的任何其他免疫原施用本发明的病毒载体以用于癌症免疫治疗。举例来说，通过施用包含编码癌细胞抗原的异源核苷酸序列的病毒载体，可以在受试者中产生针对癌细胞抗原的免疫应答，以例如治疗癌症患者。如本文所述，病毒载体可以在体内或通过使用离体方法施用于受试者。
如本文所用，术语“癌症”包括形成肿瘤的癌症。同样，术语“癌组织”包括肿瘤。“癌细胞抗原”包括肿瘤抗原。
术语“癌症”具有本领域已理解的含义，例如，组织的不受控生长，其有可能扩散到身体的远处部位(即，转移)。示例性癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌(例如，神经胶质瘤和成胶质细胞瘤)、骨癌、肉瘤、黑色素瘤、头颈癌、食道癌、甲状腺癌等。在本发明的实施方案中，实施本发明以治疗和/或预防形成肿瘤的癌症。
术语“肿瘤”在本领域中也被理解为，例如，多细胞生物体内未分化细胞的异常肿块。肿瘤可以是恶性的或良性的。在代表性实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。
癌细胞抗原已在上文中描述。术语“治疗癌症”或“癌症治疗”旨在降低癌症的严重程度或预防或至少部分消除癌症。例如，在特定的上下文中，这些术语表示癌症的转移被预防或减少或至少部分被消除。在进一步的代表性实施方案中，这些术语指示转移结节的生长(例如，在手术切除原发肿瘤之后)被阻止或减少或至少部分被消除。术语“癌症预防”或“预防癌症”旨在使该方法至少部分消除或减少癌症的发生或发作。换句话说，受试者中癌症的发作或进展可能会减缓、控制、可能性或概率降低或延迟。
在特定的实施方案中，细胞可以取自患有癌症的受试者，并与本发明的病毒载体接触。然后将修饰的细胞施用于受试者，由此引发针对癌细胞抗原的免疫应答。该方法特别适用于无法在体内建立足够免疫应答的免疫力受损受试者(即，不能产生足够量的增强抗体)。
本领域已知免疫应答可以通过免疫调节细胞因子(例如，干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素τ、白介素1α、白介素1β、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素13、白介素14、白介素18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、单核细胞趋化蛋白1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素)来增强。因此，免疫调节细胞因子(例如，CTL诱导性细胞因子)可与病毒载体一起施用于受试者。
细胞因子可通过本领域已知的任何方法施用。可将外源性细胞因子施用于受试者，或者可选择地，可使用合适的载体将编码细胞因子的核苷酸序列递送至受试者，并在体内产生细胞因子。
病毒载体还可用于靶向肝细胞用于研究目的，例如用于体外研究或肝功能或用于动物研究以创建和/或研究疾病的动物模型。例如，载体可用于将异源核酸递送至肝损伤(例如，纤维化或肝硬化)动物模型或肝脏疾病例如病毒感染(例如，肝炎病毒)动物模型中的肝细胞。
此外，根据本发明的病毒载体还可在诊断和筛选方法中使用，从而使目的基因在细胞培养系统或转基因动物模型中瞬时或稳定表达。还可以实施本发明以递送核酸用于蛋白质生产的目的，例如用于实验室、工业或商业目的。
根据本发明的重组病毒载体可在兽医和医疗应用中使用。合适的受试者包括鸟类和哺乳动物。本文所用术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉、长尾鹦鹉。本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类、非人灵长类(例如，猴和狒狒)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、犬、兔、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠等)等。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。任选地，受试者“需要”本发明的方法，例如，因为受试者具有或被认为处于包括本文所述的病症的风险，或者受益于包括本文所述的核酸的递送。作为进一步的选择，受试者可以是实验动物和/或疾病动物模型。
在特定实施方案中，本发明提供了药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含本发明的病毒载体和任选的其它药用剂、药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，载体通常是液体。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体。对于吸入施用，载体是可吸入的，并且将优选为固体或液体颗粒形式。
“药学上可接受的”是指无毒或在其他方面不是不期望的材料，即该材料可以对受试者施用，而不会引起任何不想要的生物学效应。
本发明的一个方面是将核酸转移至体外细胞的方法。根据适用于特定靶细胞的标准转导方法，可将病毒载体以适当的感染复数导入细胞。待施用的病毒载体或衣壳的滴度可根据靶细胞类型和数量以及特定病毒载体或衣壳而变化，并且可由本领域技术人员在没有过度实验的情况下确定。在特定实施方案中，将至少约103个感染单位，更优选至少约105个感染单位导入细胞。
可导入病毒载体的细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，例如神经元、少突胶质细胞、胶质细胞、星形胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、骨骼肌细胞(包括成肌细胞、肌管和肌纤维)、膈肌细胞、树突细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、胃肠道细胞(包括平滑肌细胞、上皮细胞)、心脏细胞(包括心肌细胞)、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、关节细胞(包括例如软骨、半月板、滑膜和骨髓)、生殖细胞等。或者，细胞可以是任何祖细胞。作为另一种选择，细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝干细胞)。还作为另一种选择，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞(癌症和肿瘤如上所述)。此外，如上所述，细胞可以来自任何来源的物种。
病毒载体可以在体外导入细胞中，以便将修饰的细胞施用于受试者。在特定实施方案中，已经从受试者中取出细胞，将病毒载体导入其中，然后将细胞放回受试者体内。从受试者体内取出细胞进行离体治疗，然后导回受试者体内的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,399,346)。或者，将重组病毒载体导入来自另一受试者的细胞，导入培养的细胞，或导入来自任何其它合适来源的细胞，并将细胞施用于需要其的受试者。
用于体外基因疗法的合适细胞如上所述。施用于受试者的细胞剂量将根据受试者的年龄、病情和物种、细胞类型、由细胞表达的核酸、施用方式等而变化。通常，在药学上可接受的载体中施用每剂量至少约102至约108或约103至约106个细胞。在特定的实施方案中，将用病毒载体转导的细胞以有效量与药物载体联合施用于受试者。
在一些实施方案中，可以施用已经用病毒载体转导的细胞以引发针对递送的多肽(例如，作为转基因表达或在衣壳中)的免疫原性应答。通常，施用一定量的表达有效量的多肽的细胞和药学上可接受的载体。任选地，剂量足以产生保护性免疫应答(如上定义)。所赋予的保护程度不必是完全或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任何缺点。
本发明的另一方面是向受试者施用本发明的病毒载体或衣壳的方法。在特定的实施方案中，该方法包括将目的核酸递送至动物受试者的方法，该方法包括：向动物受试者施用有效量的根据本发明的病毒载体。可以通过本领域已知的任何方式将本发明的病毒载体施用于需要其的人类受试者或动物。任选地，将病毒载体以有效剂量在药学上可接受的载体中递送。
本发明的病毒载体可进一步施用于受试者以引发免疫原性应答(例如，作为疫苗)。通常，本发明的疫苗包含有效量的病毒与药学上可接受的载体的组合。任选地，剂量足以产生保护性免疫应答(如上定义)。所赋予的保护程度不必是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任何缺点。受试者和免疫原如上所述。
待施用于受试者的病毒载体的剂量将取决于施用模式、待治疗的疾病或病情、个体受试者的情况、特定病毒载体和待递送的核酸，并且可以以常规方式确定。实现治疗效果的示例性剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018转导单位(TU)或更多，优选地约107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015转导单位，但更优选地约1012–1014转导单位的病毒滴度。
在特定实施方案中，可以在各种时间间隔(例如，每天、每周、每月、每年等)采用一次以上的施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以实现期望的基因表达水平。
示例性施用方式包括口服、直肠、透粘膜、外用、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、含服(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内)[包括施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、外用(如皮肤和粘膜表面，包括气道表面和透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。也可以向肿瘤施用(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)。在任何给定的情况下，最合适的途径将取决于所治疗病情的性质和严重程度以及所用特定载体的性质。
在一些实施方案中，将病毒载体直接施用于肝脏。直接施用可导致肝细胞转导的高特异性，例如，其中至少80％、85％、90％、95％或更多的转导细胞是肝细胞。可以使用本领域已知的将载体直接施用于肝脏的任一方法。可以通过直接注射到肝脏中或注射到供给肝脏的动脉或静脉中(例如门静脉内递送)引入载体。
通常，将通过全身递送或直接注射至肝脏中的所需区域或隔室以液体制剂施用病毒载体。在一些实施方案中，载体可以通过储库和/或泵递送。在其他实施方案中，载体可以通过局部施用到所需区域或通过经鼻内施用气溶胶制剂来提供。对眼睛或耳朵的施用可以通过局部施用液滴。作为另一种选择，载体可以固态缓释制剂形式施用。国际专利公开号WO01/91803描述了细小病毒和AAV载体的控释片。
也可以通过递送包含病毒载体的贮库来实现对这些组织的任一种的递送，所述贮库可以被植入到组织中，或者可以使组织与包含病毒载体的膜或其他基质接触。这种可植入基质或基底的实例如在美国专利号7,201,898中所述)。
注射剂可以以常规形式制备，要么是液体溶液或悬浮液，要么是适于注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或者是乳剂。或者，可以以局部而非全身方式施用病毒载体，例如以贮库或缓释制剂形式。此外，可以将干燥的病毒载体干燥递送至可手术植入的基质，例如骨移植替代物、缝合线、支架等(例如，如美国专利7,201,898中所述)。
适用于口腔施用的药物组合物可以以分散单元存在，如胶囊、扁囊、含片或片剂，每种含有预定量的本发明组合物；以粉末或颗粒的形式存在；以在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式存在；以水包油乳剂或油包水乳剂的形式存在。口腔递送可以通过将本发明的病毒载体与能够耐受动物肠道中消化酶降解的载体络合来进行。此类载体的实例包括本领域已知的塑料胶囊或片剂。此类制剂通过任何合适的药学方法制备，其包括使组合物与合适载体(其可包含一种或更多种如上所述的辅助成分)结合的步骤。一般来说，根据本发明实施方案的药物组合物是通过将组合物与液体或细碎的固体载体或两者均匀和紧密地混合，然后，如果需要，将所产生的混合物成形来制备。例如，片剂可通过压制或模制含有组合物的粉末或颗粒来制备，任选地具有一种或更多种辅助成分。压制片剂是通过在合适的机器中压制自由流动形式的组合物(例如与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂任选混合的粉末或颗粒)来制备。模制片是通过在合适的机器中模制用惰性液体粘合剂润湿的粉末状化合物制成的。
适用于含服(舌下)施用的药物组合物包括将本发明组合物包含在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的含片；以及在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中含有组合物的锭剂。
适用于肠胃外施用的药物组合物可包含本发明组合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂任选地与预期受体的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使组合物与预期接受者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳液可以包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。还可能存在防腐剂和其他添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
组合物可以在单位剂量或多剂量容器中提供，例如，在密封的安瓿和小瓶中，并可储存在冻干条件下，其仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如盐水或注射用水。
临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的可注射的、稳定的、无菌的单位剂型的本发明组合物。该组合物可以冻干物的形式提供，其可以用合适的药学上可接受的载体复溶以形成适合注射到受试者中的液体组合物。单位剂型可以是约1μg至约10g的本发明组合物。当组合物基本上不溶于水时，可以包括足够量的生理上可接受的乳化剂，以使该组合物在水性载体中乳化。磷脂酰胆碱就是这样一种有用的乳化剂。
适用于直肠施用的药物组合物可以单位剂量栓剂形式存在。这些可以通过将组合物与一种或更多种常规固体载体(例如可可脂)混合，然后将所得混合物成形来制备。
适用于皮肤局部应用的本发明药物组合物可以采用软膏、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可以使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促进剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，局部递送可以通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂性试剂(例如，DMSO)混合来进行。
适用于透皮施用的药物组合物可以是离散贴剂的形式，其适于长时间与受试者的表皮保持紧密接触。适用于透皮施用的组合物也可以通过离子电渗递送(参见，例如Pharm.Res.3:318(1986))且通常采用本发明组合物的任选缓冲水溶液形式。合适的制剂可包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水，并可含有0.1M至0.2M的活性成分。
本文公开的病毒载体可通过任何合适的手段施用于受试者的肺部，例如，通过施用包含病毒载体的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液(受试者吸入)。可吸入颗粒可以是液体或固体。如本领域技术人员所知，包含病毒载体的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方式产生，例如使用压力驱动的气溶胶雾化器或超声波雾化器。参见，例如美国专利号4,501,729。包含病毒载体的固体颗粒的气溶胶同样可以通过制药领域中已知的技术使用任何固体颗粒药物气溶胶发生器产生。
虽已经描述了本发明，但将在以下实施例中更详细地说明本发明，本文包含的实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明。
实施例1
AAV5衣壳突变体库的构建
如Zhao等人(Nat.Biotechnology，1998)所述，通过随机诱变和交错延伸重组(stEP)产生了由突变体AAV5衣壳组成的多样化病毒库，其中点突变分布在整个VP3区域(图1)。具体而言，使用易错PCR和一套包括VP3基因的相应引物对WT-AAV5衣壳基因(来自XR5包装质粒)进行随机突变。正向引物(SEQ ID NO:13)与VP3基因上游RSRII限制性酶切位点重叠，而反向引物(SEQ ID NO:14)与VP3基因下游NotI酶切位点重叠，以便于将PCR产物克隆到“感染性”或野生型AAV5质粒中。使用易错DNA聚合酶将约10ng模板DNA扩增30个周期，以实现每个PCR片段在VP3基因中2个至17个突变的范围。为了进一步使突变体AAV5库多样化，使用stEP对易错PCR产生的点突变进行重排，其中使用之前所述相同引物对约100ng突变AAV5 VP3 DNA进行100个极短的变性(约20s)、退火(约5s)和延伸(约10s)循环。
然后纯化突变体VP3 stEP PCR产物，并使用RSRII/NotI限制性内切酶消化至完全。使用琼脂糖凝胶纯化分离消化的DNA，并克隆到含有AAV2REP基因和两侧为AAV2 ITR序列的部分AAV5衣壳基因的骨架中，以产生“感染性”质粒或能复制的AAV质粒。将所得混合物电穿孔至DH10B电感受态细菌中，并平铺在两个含氨苄西林的10cm LB琼脂平板上。如通过定量细菌转化后的菌落数所测定的，生成了5×105个独立克隆的病毒质粒库。为了证实库的多样性，从平板中挑选20个菌落用于微量制备和测序。测序结果显示，AAV5 VP3突变体具有不同数量和类型的点突变，每个VP3区域有4个至22个突变。通过用极品肉汤培养基洗涤LB琼脂平板，将单个细菌菌落混合在一起，然后在4升TB培养基中培养。然后使用增殖的细菌通过CsCl-溴化乙锭梯度超速离心进行质粒DNA库的大规模纯化。
使用质粒库，产生AAV5病毒突变体库，且然后通过CsCl离心纯化。具体而言，通过磷酸钙转染法将质粒库和辅助质粒以1∶1的比例转染至人胚肾(HEK293)细胞中。转染60小时至72小时后，收集转染细胞和培养基。通过冻融法释放病毒颗粒，并使用CsCl密度离心法纯化。对于所有纯化的AAV的实验，通过斑点印迹法测定AAV滴度。
实施例2
使用Huh7细胞选择AAV5库
然后通过图2中汇总的过程针对肝细胞来源的癌细胞系Huh7选择AAV5突变体病毒库。将Huh7细胞用作筛选在人肝细胞中感染性增加的变体的选择模型，因为之前该细胞系被描述为人肝细胞感染性的可靠预测因子(Li et al，Molecular Therapy，2015)。将AAV5病毒库以5000载体基因组/细胞的MOI加入至Huh7细胞，并与100vg/细胞的MOI的野生型5型腺病毒(wt-ad)共感染。wt-ad的添加使得成功感染Huh7细胞的变体复制，并提供额外的选择性压力以更有效地彻底富集感染huh7细胞的变体群。感染72小时后，收集细胞并用干冰和乙醇混合物通过三次冻融循环裂解。然后将细胞裂解物在56℃孵育1小时，以灭活裂解物中存在的wt-ad。然后以15000rpm离心细胞裂解物5min，并收集含有突变体病毒颗粒的上清液。通过使用SYBR-Green染料的实时PCR对上清液中的病毒进行滴定。再用来自前一轮选择的病毒以5000vg/细胞的MOI感染Huh7细胞。
总共对Huh7细胞进行了7轮选择。对于最后一轮选择，用PBS洗涤感染细胞两次，以去除未能感染细胞的任何病毒。然后如Arad等人所述(Biotechniques 1998)，通过改良的Hirt提取法从细胞中提取病毒DNA。简而言之，将细胞悬浮于含100μg/ml RNase A的250μlTris-HCl/EDTA溶液中。加入1.2％十二烷基硫酸钠溶液裂解细胞，并在室温下孵育5min。加入氯化铯、乙酸钾和乙酸溶液沉淀染色体DNA和细胞碎片，并在冰上孵育15min。然后将混合物在4℃离心15min，并将上清液加载到Qiagen Qiaprep离心柱上。然后洗涤结合的DNA，洗脱，并使用用于易错PCR的相同引物通过PCR进行扩增。将所得PCR扩增子纯化，随后用RSRII和NotI消化，并连接到含有AAV2 Rep和部分AAV5 Cap基因的包装质粒中。将连接混合物转化到细菌中，并铺在含有氨苄西林的琼脂平板上。过夜孵育后，挑取单个菌落通过微量制备进行质粒扩增。将扩增的质粒DNA与RNASE A一起培养并测序。
对来自第五轮和第七轮选择的总共145个菌落的约60个至70个质粒进行测序。使用跨AAV5 cap基因的四个引物对每个微量制备的质粒的完整cap基因进行精确测序。测序结果显示，第五轮选择的测序突变体中约有一半(65个中的31个)在AAV5 VP3蛋白Loop1区含有常见突变。在第7轮选择后，观察到对携带Loop1突变的突变体的进一步富集。在测序的第7轮突变体中，75个变体中有73个携带Loop1突变(图3)。大部分变体仅携带Loop1区的单个突变而没有其他突变，而其余部分包含遍及整个VP3区的一种或两种额外突变。其余两个突变体含有Loop1突变体中未发现的突变，这包括VP2/VP3连接区和Loop 8区等区域。发现的许多突变位于被认为是AAV5衣壳表面的区域，考虑到受体参与和结合的变化最有可能导致感染性的变化，这并不奇怪。值得注意的是，在任何一轮测序中均未检测到野生型AAV5衣壳序列。从这些测序结果中，我们得出结论，7轮选择特异性富集了Loop1突变变体，这可能是因为其感染性与库中的所有其他突变相比显著增加。在测序的200个突变体中，约25个是独特的，且被用于包装和生产双链GFP载体以评估收率和感染性。使用粗裂解物中未纯化的病毒,通过RT-PCR对含有突变GFP载体的粗裂解物进行滴定，并且仅选择能够产生可接受滴度的突变体(使用GFP报告基因在Huh7细胞中进行快速筛选)。五个突变体MV1、MV18、MV20、MV50和MV53表现出最佳的收率和转导能力，并选择它们用于更大规模的生产和纯化以进一步表征。图4提供了各种突变体和wt-AAV5的VP1编码核苷酸序列的比对。图5提供了各种突变体和wt-AAV5的VP1氨基酸序列的比对。
实施例3
使用体外测定和蛋白质建模表征AAV5突变体
采用体外感染性测定和蛋白质建模对AAV5突变体进行进一步表征。首先，通过三重转染和氯化铯密度超速离心法产生纯化的病毒。简而言之，用辅助质粒、自互补GFP(sc-GFP)载体质粒和含有突变体AAV5衣壳基因和AAV2 rep基因的包装质粒转染HEK293细胞。转染后72小时收获细胞，并通过离心分离。收集并储存培养基，同时重悬细胞沉淀并进行三次冻融循环。将所得细胞裂解物与Dnase I和Rnase A在37℃孵育，且离心并收集上清液。然后在两轮氯化铯(CsCl)密度超速离心后，通过PEG沉淀浓缩上清液和培养基中的病毒。通过DNA斑点印迹法测定含病毒的CsCl部分，并混合和用PBS中的5％山梨醇透析。再次使用DNA斑点印迹法对透析的病毒制剂进行滴定。在同一斑点印迹中对所有检测的病毒进行滴定，以能够一致地测量病毒滴度。病毒制剂的斑点印迹显示，与AAV5相比，AAV5突变体具有相似的病毒收率，指示在收率方面，筛选过程中选择的突变对生产没有显著影响且因此可用于临床环境。
检测了所选五种突变体的纯化病毒制剂在Huh7细胞中的转导。以100，000病毒基因组(vg)/细胞的MOI的AAV5病毒和突变体自互补(sc)-GFP编码病毒感染Huh7细胞，并与5000vg/细胞的wt-ad共感染，以加速AAV基因组表达过程。感染后48小时，取细胞进行成像并定量GFP表达。GFP表达成像显示，与AAV5相比，所有五种突变体具有显著增加的GFP表达(图6、图7A)。变体MV50是表现最佳的变体，在Huh7细胞的转导方面是AAV5的12倍(图7B)。第二和第三最佳变体是MV53和MV1，分别是AAV5的11倍和10倍(图7B)。所有三个表现最佳的变体在Loop1区均有甘氨酸至精氨酸的突变，将其命名为“Loop1R”。与Loop1R一起，MV1、MV50和MV53还携带了每个变体都不同的额外突变。第四表现最佳的突变体是MV18，其是AAV5的大约7倍，并且仅包含Loop1R突变。这些结果证实了先前记录的测序数据，这些数据表明筛选期间Loop1R突变在Huh7细胞中被特异性富集。因此，Loop1R突变对增加在Huh7细胞中的感染性贡献最大，而额外的突变是对Loop1R突变的补充并增添了转导小幅增加。最后一个突变体MV20不携带Loop1R突变，但与AAV5相比，仍显示出感染性增加了6倍。这表明MV20增加感染性的机制可能与其他突变体不同。
接下来，在HepG2细胞(一种人肝癌细胞系)中相对于AAV5测试了这五种变体，以评估在Huh7细胞中观察到的转导增加是否是细胞系特异性的。与之前的结果相似，与AAV5相比，这些变体显示在HepG2细胞中的转导显著增加，但是与Huh7细胞中的增加相比幅度较低(图8、图9A)。MV50再次是表现最佳的变体，与AAV5相比，GFP表达7倍增加，而其他变体显示转导增加略低，根据变体的不同，在约4倍至6倍的范围内(图9B)。与Huh7细胞相比，HepG2细胞增加幅度略低的一个潜在原因可能是因为HepG2细胞倾向于成簇生长，从而使AAV更难结合到细胞表面并促进进入。此外，由于癌细胞系的性质，细胞表面上各种进入受体的表达水平在Huh7和HepG2之间也有可能变化，从而导致取决于AAV5和变体所利用的受体而变化的不同水平的转导。无论如何，两种肝癌细胞系中转导的增加指示这些突变体AAV5不是Huh7特异性的，并且转移到成人肝细胞的可能性更高。
分析五种选定变体中的突变并将其映射到AAV5 Vp3蛋白源自x射线晶体学的蛋白结构上为了解突变在增加肝脏转导中的作用提供更多见解。表2总结了各种突变体和wt-AAV5之间氨基酸差异的位置及其增加肝细胞感染性的最可能机制。
表2
Figure GDA0004114087460000461
Figure GDA0004114087460000471
如前所述，四种突变体(MV1、MV18、MV50和MV53)在VP1蛋白的氨基酸257处含有甘氨酸至精氨酸的突变。这种特殊的突变位于可变区I(VRI)，或称为Loop1，其部分暴露在完整的60mer AAV衣壳的表面。从AAV5的晶体结构来看，氨基酸257据称是VRI区域内暴露于表面的氨基酸。通过将病毒与细胞于4℃孵育并通过RT-PCR定量已结合的载体基因组进行结合测定，表明与WT-AAV5相比，Loop1突变使与细胞表面的结合增加到2.2倍(图10)。随后的内化测定使用与结合测定相同的程序，并且增加在37℃孵育1小时的步骤显示了与WT-AAV5相比，Loop1突变内化的结合病毒粒子的百分比增加到3.1倍(图11)。内化测定还指示AAV5和Loop1突变体之间内化的总病毒中总体7倍差异(图12)，这与之前报告的GFP表达差异一致。这些结果表明Loop1突变增加了受体结合和内化，但不能具体确定内化的哪个方面受到影响，因为内化测定仅测量进入细胞的病毒，而不考虑细胞内的位置。Loop1突变在VRI区的位置表明，它在内体逃逸中应该没有任何作用，因为VP1蛋白的VP1u区负责内体逃逸。此外，由于内化病毒总量的倍数变化和GFP表达的倍数变化是一致的，我们认为这表明GFP表达的变化主要是由于进入细胞的病毒总量的增加，且不太可能是由于内体逃逸或细胞转运的增加。如果感染性的主要增加是由于内体逃逸或细胞转运增加所致，则与GFP表达的倍数增加相比，整体内化病毒的倍数增加可能会明显更小。由于这些原因，我们认为Loop1突变主要负责增加与受体的结合，与AAV5使用的其他受体相比，该受体更快内化，从而增加内化病毒的总量和速度。尚不清楚Loop1突变是增加了与现有受体的结合，还是允许与AAV5之前未靶向的不同受体结合。
次要突变(非Loop1R突变)的映射和MV1、MV20、MV50和MV53相对于MV18的结合和内化的比较提供了对其可能功能的更多了解。MV1的次要突变位于不存在于AAV5的表面的氨基酸417(F至L)处；相反，它位于衣壳内部。因此，该突变不太可能影响受体结合、内体逃逸或细胞转运，而是一个更深层的过程，如病毒衣壳的脱壳。病毒衣壳的脱壳已由Thomas等人(Journal of Virology 2004)报导，是肝细胞中基因表达的限速步骤，且因此脱壳效率的潜在增加可能导致更高的基因表达。有趣的是，含有F至L突变的变体的收率具有与其他变体相比明显较低的收率，指示衣壳的稳定性可能下降，这可能有助于在细胞核中脱壳。比较MV18和MV1的结合和内化测定证实了先前的理论，即当F417L突变与Loop1突变一起加入时，病毒的结合或内化没有显著差异(图13、图14、图15)，证实与MV18相比，F417L不影响结合或内化的病毒量。由于F417L突变不影响结合或内化，但仍增加病毒的整体感染性，因此该突变最可能影响更下游的工艺，并且由于其位于衣壳内部，最可能影响衣壳的脱壳。总之，这些数据表明，F417L突变的可能机制是增强病毒衣壳的脱壳，其增加细胞核中之后被转录成RNA的载体基因组的总量。
MV20是唯一不含Loop1R突变的分离的变体；而与WT-AAV5相比，仍存在三个氨基酸的差异。值得注意的是，MV20在579位含有丙氨酸到苏氨酸的突变，其位于包含对唾液酸结合至关重要的氨基酸的可变区VIII(VR-VIII)。有趣的是，MV20表现出与MV18相当的结合，与AAV5相比增加到其大约2.2倍(图10)。然而，与AAV5相比，A579T突变仅将内化的结合病毒粒子百分比增加到约2倍(图11)。因此，A579T突变似乎增加了结合，但与Loop1突变相比，在增加内化方面没有那么有效。这指示MV18和MV20所接合的受体是不同的，并且可能对于MV20而言，结合的增加是针对附着因子(例如唾液酸)，但是仍然依赖于不同的受体进行内化，并且因此导致与Loop1突变相比较低的内化。Excoffon等人(PNAS，2009年)通过定向演化发现了类似的突变，该突变位于氨基酸581处，并且类似地是丙氨酸至苏氨酸的突变，据报道该突变在唾液酸识别和结合中起作用。因此，氨基酸579处的丙氨酸到苏氨酸突变似乎与ExCoffon等人发现的氨基酸581处的相同突变发挥相似的增加唾液酸结合的功能。
除了Loop1R突变之外，MV50含有705位处丝氨酸到甘氨酸的突变。氨基酸705周围区域的确切功能尚不清楚，但已报道邻近氨基酸711的一个基团参与唾液酸结合(Afioneet al.,Journal of Virology,2014)。此外，还显示该区域是抗体识别的抗原位点。利用AAV5衣壳的蛋白质晶体结构，我们发现氨基酸705暴露于衣壳的表面，并且因此可能涉及病毒与细胞的结合。比较MV18和MV50的结合测定证实，S705G突变进一步增加了与细胞表面的结合，约为单独Loop1突变的2倍(图13)。有趣的是，当比较MV50和MV18时，内化的结合病毒粒子百分比显著降低，指示增加的结合与内化病毒百分比增加无关(图14)。此外，在MV50和MV18之间未观察到内化病毒总量的差异，表明Loop1突变及其受体可能是内化的结合病毒增加的主要驱动力，而通过S705G突变增加的结合不影响内化率(图15)。因此，我们可以得出结论，S705G可能通过仅增加与附着因子的结合来增加感染性，该附着因子允许更多的病毒与细胞表面结合，并随后通过Loop1突变途径内化。这也可以解释为什么内化的结合病毒百分比降低，因为Loop1突变主要负责内化。由于结合和内化测定的静态环境(其中未考虑受体转换和随后的新病毒粒子结合)，因此内化病毒的总量可能没有差异。
最后，MV53的次要突变是位于VP2和VP3连接处附近的氨基酸179处的谷氨酰胺到精氨酸突变(Q179R)。由于该区域的晶体结构难以解析，该区域在文献中没有得到很好的描述。该区域的确切功能尚未确定，但是在VP2蛋白的其他位置有核定位信号。然而，我们认为VP2/VP3区域的连接存在于AAV衣壳表面，并且确实在AAV转导中起作用。为了增加对该理论的支持，我们进行了比较MV18和MV53的结合和内化测定，并且发现与MV18相比，Q179R突变增加了结合到细胞表面的病毒粒子的数量(图13)。然而，与MV50相似，结合病毒粒子的百分比显著降低，并且内化病毒的总量与MV18保持一致(图14、图15)，表明MV53与MV50相似，其中Q179R突变可能仅影响与细胞表面上的附着因子的结合，而不影响内化。此外，这些数据还表明，尽管x射线晶体学无法解析VP2/VP3，但其结构可能位于衣壳表面或其附近，并在与细胞膜结合中发挥作用。
接下来，我们通过使用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)或来自数千名捐献者的合并免疫球蛋白G的血清反应性测定确定突变衣壳对人类中和因子的反应性，以呈现整个人类群体中针对特定抗原的中和抗体的总体存在率。我们将我们的突变病毒与两种对照血清型AAV5和AAV9比较；一个具有非常低的中和抗体存在率(5％)，一个具有中等存在率(30％-40％)(Boutin et al.,Human Gene Therapy 2010)。在人类群体中具有较高中和抗体存在率的AAV衣壳将在较高的稀释度倒数或者被较低量的IVIG中和，且反之亦然(对于具有较低中和抗体存在率的AAV衣壳)。将含有GFP报告转基因的突变病毒与稀释度倒数递增的IVIG或IVIG的2倍系列稀释液一起孵育1小时，然后加入96孔板中各个孔中的Huh7细胞。对于IVIG的每个稀释度倒数，病毒浓度保持不变。将MOI 50的野生型腺病毒添加到每个孔中，以促进AAV转基因表达。72小时后，裂解每个孔中的细胞，并测定粗裂解物的GFP活性。针对仅用病毒感染而无IVIG的对照孔测量GFP活性，以获得每种病毒在每个稀释度倒数的最大GFP表达百分比。绘制GFP相对于稀释度倒数的对数的最大百分比的曲线，并使用非线性回归进行曲线拟合，可以比较不同病毒之间的血清反应性。从这些曲线中，我们确定AAV5和MV突变体的血清反应性彼此相当一致，并且所有这些显著移向AAV9的左侧，指示与AAV9相比，AAV5和突变体需要更多的IVIG来中和其感染性(图16)。这意味着IVIG含有更高滴度的抗AAV9中和抗体，并且因此指示与抗AAV5抗体相比，供体人群具有更高的抗AAV9抗体存在率。MV18或仅有Loop1突变的突变体的血清反应性曲线移至AAV5左侧，表明MV18的血清反应性略低于AAV5，并且需要稍多的IVIG才能达到50％的感染性抑制(图16、图17)。就对IVIG的血清反应性而言，MV1与MV18非常相似，而与AAV5相比，MV20和MV53的血清反应性略高(图17)。MV50是与AAV5最接近的变体，其血清反应性与AAV5相比没有差异。尽管突变体对IVIG的血清反应性与AAV5相比似乎略有不同，但与AAV5相比较，人类群体中针对突变体的抗体的存在率不太可能有任何不同。这很大程度上是因为从选择过程中发现的所有突变都是新生突变(denovo mutation)并且不存在于任何其他血清型中。再加上AAV5是遗传差异最大的AAV血清型这一事实，这些突变体极不可能先前感染过任何人且因此产生了特异性靶向新生突变的中和抗体。更可能的是，已经靶向AAV5的现有抗体可能通过突变所在区域的空间位阻干扰突变执行其功能的能力。因此，我们得出结论，与AAV5相比，特别是与其他血清型如AAV9相比，突变型AAV5病毒在对IVIG的血清反应性方面相当一致，并且此外，人类群体中针对突变体的中和因子的总体存在率可能与AAV5非常相似。
实施例4
在原代人肝细胞中表征AAV5突变体
测试了五种AAV5突变体在原代人肝细胞中的转导能力，以证实它们在Huh7细胞中所增加的感染性能够转移到人肝细胞。将原代人肝细胞铺板，并纯化sc-GFP载体以500,000vg/细胞的MOI感染。感染后72小时，取细胞用于GFP表达成像和GFP活性定量。与来自Huh7细胞的结果相似，与wt-AAV5相比，AAV5突变体在感染原代人肝细胞方面都明显更好(图18)。特别是，MV50和MV53是具有最佳转导能力的两种变体，并且这两种变体感染原代人肝细胞与AAV5相比是其大约10倍，这与Huh7细胞中的倍数增加非常一致(图19)。其他三种突变体MV1、MV18和MV20相对于AAV5的感染性增加也与来自Huh7细胞的结果非常一致，即相对于AAV5的倍数增加分别为其约8倍、7倍和5倍(图20)。原代人肝细胞中感染性增加倍数的总体幅度与来自Huh7细胞的结果相比非常一致(图20)，指示Huh7细胞和原代人肝细胞在影响AAV感染性的特征方面非常相似，并且也证明了用Huh7细胞模拟人肝细胞中感染性的可行性。总的来说，这些结果表明，AAV5的定向演化产生的突变体在保留AAV5良好的血清反应性的同时显著增加了在原代人肝细胞中的感染性，并且因此证实了将这些低血清反应性衣壳转化为在人类肝脏疾病中使用的可能性。
前述是对本发明的说明，且不应理解为对其的限制。本发明由以下权利要求限定，其中包括这些权利要求的等效方案。
序列
SEQ ID NO:1-MV1
Figure GDA0004114087460000521
SEQ ID NO:2-MV1
Figure GDA0004114087460000531
SEQ ID NO:3-MV18
Figure GDA0004114087460000532
Figure GDA0004114087460000541
SEQ ID NO:4-MV18
Figure GDA0004114087460000551
SEQ ID NO:5-MV20
Figure GDA0004114087460000552
Figure GDA0004114087460000561
SEQ ID NO:6-MV20
Figure GDA0004114087460000562
SEQ ID NO:7-MV50
Figure GDA0004114087460000571
SEQ ID NO:8-MV50
Figure GDA0004114087460000581
SEQ ID NO:9-MV53
Figure GDA0004114087460000582
Figure GDA0004114087460000591
SEQ ID NO:10-MV53
Figure GDA0004114087460000592
SEQ ID NO:11-野生型AAV5衣壳
Figure GDA0004114087460000601
SEQ ID NO:12-野生型AAV5衣壳
Figure GDA0004114087460000611
SEQ ID NO:13-正向引物
Figure GDA0004114087460000612
SEQ ID NO:14-反向引物
Figure GDA0004114087460000613
序列表
<110> 北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校
肖啸
R·钱
李娟
<120> 修饰的腺相关病毒5衣壳及其用途
<130> 5470.881.WO
<150> US 63/020,139
<151> 2020-05-05
<160> 14
<170> 专利版本 3.5
<210> 1
<211> 2175
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> MV1
<400> 1
atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60
tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120
gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180
ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240
cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300
gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360
aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420
ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480
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ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600
ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660
gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720
agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacag aagcaacgcc 780
aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840
cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900
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ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080
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<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 反向引物
<400> 14
atcgagcggc cgcaagaggc agtattttac 30

Claims (40)

1.一种修饰的腺相关病毒5(AAV5)衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQID NO:12)的G257R突变。
2.根据权利要求1所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其还包含选自Q179R、F417L、S705G或其任意组合的突变。
3.一种修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的突变P200S、M469I和A579T。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个至少95％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个至少99％相同的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个至少99.5％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其共价连接、结合或包裹选自由以下组成的组的化合物：DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质和有机小分子。
9.一种编码权利要求1-8中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白的核酸。
10.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
11.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。
12.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少99％相同的核苷酸序列。
13.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少99.5％相同的核苷酸序列。
14.根据权利要求9所述的核酸，其包含SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列。
15.一种载体，其包含权利要求9-14中任一项所述的核酸。
16.根据权利要求15所述的载体，其为质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体。
18.根据权利要求17所述的载体，其中所述核酸还包含AAV rep编码序列。
19.一种体外细胞，其包含权利要求9-14中任一项所述的核酸或权利要求15-18中任一项所述的载体。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述核酸被稳定整合到所述细胞的基因组中。
21.一种病毒颗粒，其包含权利要求9-14中任一项所述的核酸。
22.根据权利要求21所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或杆状病毒颗粒。
23.一种AAV颗粒，其包含：
AAV载体基因组；和
根据权利要求1-8中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳包裹所述AAV载体基因组。
24.根据权利要求23所述的AAV颗粒，其中所述AAV载体基因组包含异源核酸。
25.根据权利要求24所述的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码反义RNA、microRNA或RNAi。
26.根据权利要求24所述的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码多肽。
27.根据权利要求26所述的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽。
28.根据权利要求26所述的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码报告蛋白。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的AAV颗粒，其中所述异源核酸可操作地连接到基于RNA聚合酶II的启动子或基于RNA聚合酶III的启动子，例如组成型启动子或诱导型启动子。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的AAV颗粒，其中所述异源核酸可操作地连接至肝脏特异性启动子或肝脏优选启动子。
31.根据权利要求30所述的AAV颗粒，其中所述肝脏特异性启动子或肝脏优选启动子是来自载脂蛋白AII、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、甲状腺素结合球蛋白、细胞色素P450 CYP3A4或microRNA122或合成的肝脏特异性调控序列的启动子。
32.一种产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，该方法包括：
向体外细胞提供根据权利要求9-14中任一项的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生有效AAV感染的辅助功能元件；和
允许包含AAV衣壳并包裹AAV载体基因组的重组AAV颗粒组装。
33.通过权利要求32的方法生产的AAV颗粒。
34.一种药物制剂，其在药学上可接受载体中包含权利要求1-8中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白、权利要求9-14中任一项所述的核酸、权利要求15-18中任一项所述的载体、权利要求21或22中任一项所述的病毒颗粒或权利要求23-31或33中任一项所述的AAV颗粒。
35.一种将目的核酸递送至肝细胞的方法，所述方法包括使所述肝细胞与权利要求23-31或33中任一项所述的AAV颗粒接触。
36.一种向哺乳动物受试者的肝细胞递送目的核酸的方法，所述方法包括：
向哺乳动物受试者施用有效量的权利要求23-31或33中任一项所述的AAV颗粒或权利要求34所述的药物制剂，从而将所述目的核酸递送至所述哺乳动物受试者的肝细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述AAV颗粒被递送至肝脏。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述AAV颗粒通过注射至肝脏中、注射至门静脉中或其任何组合而被直接递送至肝脏。
40.一种治疗需要其的哺乳动物受试者的病症的方法，其中所述病症能够通过在所述受试者的肝脏中表达一种产物来治疗，所述方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求23-31或33中任一项所述的AAV颗粒或权利要求34所述的药物制剂，其中所述产物被表达，从而治疗所述病症。
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