CN104419717A - 逃避预存免疫的重组腺病毒及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒及其构建方法和应用。具体涉及一种易于包装、免疫水平较高且能很好的避免人体针对5型腺病毒预存免疫的重组腺病毒载体及其构建方法和应用。

Description

逃避预存免疫的重组腺病毒及其构建方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及一种用于基因治疗和疫苗载体重组腺病毒及其构建方法和应用。

背景技术

重组腺病毒(recombinant adenovirus，rAd)以携带外源基因片段大、滴度高、易于操作、不会整合到宿主基因组等优点成为一种良好的基因治疗和疫苗载体。目前，已知的人腺病毒（Ad）有57种血清型，分为7个亚属(A-G)，已经在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，特别是C亚属的血清2和5型（Ad2和Ad5）已被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。目前，应用最广的腺病毒载体(adenovirus vector,Adv)是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

例如，在基因治疗的应用方面：2003年10月我国国家食品药品监督管理局（SFDA）正式批准了世界第一个抗肿瘤基因治疗药物——重组人P53腺病毒注射液（深圳赛百诺基因公司）上市，随后在2005年11月，SFDA又批准了全球首个溶瘤病毒类新药——重组人5型腺病毒注射液（上海三维生物技术有限公司）上市。而在疫苗载体的研究方面：重组5型腺病毒(rAd5)的强免疫原性也已被大量的临床前研究所证实。Shiver和Emini（默克公司）等人在以重组腺病毒类，痘病毒类，甲病毒类，分支杆菌以及质粒DNA疫苗均表达猴免疫缺陷病毒(SIV)Gag抗原的一些免疫原性比较实验中，重组5型腺病毒载体引发了最强抗原特异的CTL反应(Shiver and Emini,2004;Shiver et al.,2002)。因此艾滋病疫苗的大规模临床研究就使用了rAd5载体（WO01/02607，WO02/22080）。

然而，重组5型腺病毒(rAd5)应用中的一个主要问题是人体针对载体本身存在十分普遍的预存免疫，人体内较高的针对Ad5的抗体水平会显著地降低病毒载体的转导效率和转基因表达水平。例如，艾滋病疫苗的临床研究显示：预存免疫的存在使得rAd5疫苗在小鼠、恒河猴以及人体内的免疫原性都显著地下降。而且，Ad5特异中和抗体在人体内的广泛存在还有可能导致不相容的和难以预知的免疫反应和毒性(Barouch and Nabel,2005)，这就严重限制了重组腺病毒载体的应用。然而，相关的调查却显示：目前西方国家Ad5的血清阳性率已经接近70％，而在非洲的撒哈拉和东南亚的部分地区有报道显示Ad5的血清阳性率甚至高于90％。除了预存免疫问题，rAd5可以说是一种几乎完美的基因治疗和疫苗载体。

目前尝试解决Ad5预存免疫问题的策略主要有以下几种：①利用新方法来运载rAd5载体；②从其它人体腺病毒血清型甚至其它动物种属中开发新的重组腺病毒载体；③对rAd5载体进行基因工程改造，这一方法与其他方法相比更安全也更具有应用性。该法方具体是以源于人体安全性较好的人体稀有血清型腺病毒如Ad35、Ad11、Ad26、Ad48以及Ad49等的抗原决定簇基因来替换rAd5载体的相应基因以希望获得既保留rAd5载体的免疫原性，又带有稀有腺病毒亚型血清学性质的嵌合型载体（WO2006/040330）。Dan H.Barouch等以替换了人腺病毒血清48型全部7个HVR的rAd5载体表达SIV的结构蛋白Gag基因。小鼠和猴子体内试验显示，在较高水平针对rAd5的预存免疫条件下，Gag的表达不被明显抑制，其相关试验也说明腺病毒中和抗体主要针对六邻体HVR。然而该载体的包装效率以及免疫小鼠产生针对Gag抗体滴度仅约为rAd5的1/3(Robertset al.,2006)。

如前所述，rAd5载体的应用受限于被野生型Ad5感染后人体内已经存在的较高滴度的中和抗体水平。尽管病毒外壳上不同的衣壳蛋白均能诱导宿主产生抗体，但实验显示Ad5特异的中和抗体主要针对的是病毒六邻体蛋白(Sumida et al.,2005)。另外，腺病毒的免疫是血清型特异的，这就提示我们可以使用在人体内感染极低的腺病毒六邻体来替换Ad5，从而可以逃避Ad5的预存免疫。但是六邻体的替换并不容易，自1998年以来，研究人员用人其他血清型的腺病毒六邻体来替换5型腺病毒的相应基因，然而由于受株型限制除与Ad5同亚属的且人感染率也较高的个别血清型外大多难以成功包装(Gall,Crystal,andFalck-Pedersen,1998;Youil et al.,2002)。对六邻体蛋白更为深入的结构和功能研究发现，每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，有一个五面体的基底和三角形的塔尖，基底包含P1和P2两个区，塔区由3个环构成Loop1、Loop2和Loop4。单克隆抗体检测不同亚型纯化后的六邻体蛋白表明，在六邻体表面有许多的抗原决定簇存在于Loop1、Loop2和Loop4这几个环上。而对15个不同型的腺病毒的六邻体蛋白的核酸序列研究显示，基底的P1、P2区是保守的，变化区主要集中在Loop1、Loop2区。Loop1、Loop2对应1419-1428个氨基酸，有7个独特的超变区(hypervariable region，HVR)，在这7个HVR中，HVR1-HVR6出现在Loop1中，HVR7在Loop2上(Rux and Burnett,2000)。其中，HVR1、HVR2、HVR4、HVR5和HVR7中含有中和抗原决定簇的一部分，包括大于99%的六邻体型特异性残基。由于这5个HVR位于Loop1、Loop2，所以Loop1、Loop2会是较好的中和抗原决定簇。Dan H.Barouch等以人腺病毒血清48型全部7个HVR替换rAd5表达SIV Gag基因的相关实验结果，就证实了这一点。然而这种从局部地区稀有血清型随意选择并替换其全部7个HVR的方法仍然面临病毒包装率以及诱发体液免疫水平不足的问题。

因此，目前在该领域仍然需要通过基因工程技术进一步改造腺病毒载体以获得一种易于包装、免疫水平较高且能很好的避免预存免疫的重组腺病毒载体。本发明就是为了满足此种需求并提供相关优点，这必将有利于肿瘤的基因治疗和人类免疫缺陷病毒(HIV)、结核、以及疟疾等引发的传播性疾病疫苗的发展。

发明内容

本发明提供了一种重组腺病毒载体，其特点是能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，即该载体的免疫原性几乎不受人体内广泛存在的Ad5中和抗体干扰。同时该载体包装水平接近rAd5，并且在具有较高水平针对rAd5的预存免疫条件下仍然能针对其表达的外源基因引发较强的免疫反应，几乎与改造前rAd5载体在无预存免疫条件下的免疫水平相当。本发明的实现是基于以人体稀有血清型腺病毒如Ad43、Ad37的抗原决定簇基因替换rAd5的相应部分。而用于替换的稀有血清型腺病毒以及替换基因的选择是基于有利于改造后病毒载体的包装和不影响原病毒载体免疫水平考虑的。

本发明提供了一种rAd5载体，为HVR5、7被其他人腺病毒血清型的HVR5、7替换的rAd5载体，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一个优选的实施方案中，提供了一种rAd5载体，为HVR1-7被其他人腺病毒血清型的HVR1-7替换的rAd5载体，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一个优选的实施方案中，所述载体的Loop4被所述其他人腺病毒血清型的Loop4的替换。在一个更优选的实施方案中，其中所述rAd5载体的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:1-8，所述人腺病毒血清型Ad43的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID No:17-24，所述人腺病毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID No:9-16。

本发明还提供了制备上述rAd5载体的方法。所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR5、7替换rAd5载体的HVR5、7，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR1-7替换rAd5载体的HVR1-7，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一个更优选的实施方案中，所述方法还包括还以所述其他人腺病毒血清型的Loop4替换所述rAd5载体的Loop4。在一个最优选的实施方案中，所述rAd5载体的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:1-8，所述人腺病毒血清型Ad43的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:17-24，所述人腺病毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:9-16。

本发明还提供了本发明的rAd5载体用于制备疫苗或基因治疗药物的用途。

本发明的载体既保留rAd5载体的强免疫原性，又带有稀有血清型腺病毒血清学性质。

附图说明

图1.显示了Ad37、Ad43和Ad5在中国人群中的中和抗体血清阳性率差异。以496个中国健康人群的血样进行了抗Ad5、Ad37和Ad43病毒中和活性的检测。y轴表示的是不同血清型病毒中和抗体为阳性人群的百分比。

图2.腺病毒载体示意图和构建流程图。

图3.腺病毒载体克隆及限制性内切酶鉴定电泳图。

图4.包含Ad37和Ad43的HVR1-7和Loop4的腺病毒载体结构示意图。

图5.表达人类免疫缺陷病毒(HIV)1型Gag基因的穿梭质粒的构建及体外表达示意图。

图6.病毒载体包装示意图。

图7.rAd5、Ad5-37HVR(5,7)、Ad5-37HVR(1-7)、Ad5-37HVR(1-7)L4、Ad5-43HVR(5,7)、Ad5-43HVR(1-7)、Ad5-43HVR(1-7)L4病毒重组效率对比图。

图8.IFN-ELISPOT试验检测Ad5阴性和阳性小鼠HIV-1Gag特异的CD8^﹢T淋巴细胞反应结果图。

图9.rAd5、Ad5-37HVR(1-7)、Ad5-HVR(1-7)L4、Ad5-43HVR(1-7)、Ad5-43HVR(1-7)L4在小鼠体内的体液免疫反应与相关文献结果对比。

图10.rAd5、Ad5-HVR(1-7)、Ad5-HVR(1-7)L4、Ad5-43HVR(1-7)、Ad5-43HVR(1-7)L4中和抗体在中国人群血清中的阳性率。

具体实施方式

本发明的腺病毒载体高表达了改造后的中国流行株的人类免疫缺陷病毒(HIV)1型Gag（gag基因编码HIV的核心蛋白）基因，以考察载体逃避预存免疫的能力和免疫水平。该基因已经用于艾滋病疫苗的临床研究。因此，本发明的载体特别适合用作疫苗载体，同时也可以很好地应用于基因治疗，所以本发明还提供了本发明的腺病毒载体用于制备疫苗或基因治疗药物的用途。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1rAd5载体和表达人类免疫缺陷病毒(HIV)1型Gag基因的穿梭质粒的构建

1）嵌合Ad5骨架质粒的构建。

第一步是基因合成：Ad5、Ad37和Ad43的DNA和氨基酸序列从GenBank获得，它们的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列分别见表1、表2和表3。确定各型别的基因序列后，根据克隆需要首先合成了其中相应序列被Ad37、Ad43的HVR5和7、HVR1-7和Loop4的DNA序列替换的部分Ad5六邻体序列，即SEQ ID NO:25-30表示的序列（见下文）：Ad5-37HVR(1-7)，为其HVR1-7被Ad37的HVR1-7替换的rAd5载体六邻体部分序列（SEQ ID NO:25）；Ad5-37Loop4，为其Loop4被Ad37的Loop4替换的rAd5载体六邻体部分序列（SEQ ID NO:26）；Ad5-43HVR(1-7)，为其HVR1-7被Ad43的HVR1-7替换的rAd5载体六邻体部分序列（SEQ ID NO:27）；Ad5-43Loop4，为其Loop4被Ad43的Loop4替换的rAd5载体六邻体部分序列（SEQID NO:28）；Ad5-37HVR(5,7)，为其HVR5,7被Ad37的HVR5,7替换的rAd5载体六邻体部分序列（SEQ ID NO:29）；Ad5-43HVR(5,7)，为其HVR5,7被Ad43的HVR5,7替换的rAd5载体六邻体部分序列（SEQ ID NO:30）。由于任何DNA序列的改变均可能对于病毒载体的包装能力产生影响，因此合成了带有原始载体酶切位点的替换核苷酸序列。上述6条用于替换的基因序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

第二步是中间载体改造，利用（普洛麦格公司），通过聚合酶链式反应（PCR）删除其多克隆酶切位点ApaI和AatII，同时引入AscI，获得中间载体GTeasy。利用PCRTopo2.1载体（美国Invitrogen），PCR删除HpaI并引入AatII，获得另一中间载体GTopoH。克隆使用的限制性内切酶均购自于NEB公司。PCR的具体步骤如下

A）载体改造引物设计：

GTeasy：

上游：5’-AGTACTCAACCAAGTCATTCTG-3’（SEQ ID NO:31）

下游：5’-CCATGGGGCGCGCCAATTCGCCCTATAGTGAGTC-3’（SEQ IDNO:32）

GTopoH：

上游：5’-TCTAGAGACGTCAATTCGCCCTATAGTGAGTC-3’（SEQ IDNO:33）

下游：5’-AGATCTTGATCCCCTGCG-3’（SEQ ID NO:34）

B)PCR反应：

PCR的反应体系（50μl）：

灭菌水：34.5μl

10×buffer（美国Invitrogen公司）：5μl

MgSO₄（25mM）:2μl

dNTP(各2mM)：5μl

引物混合物：1.5μl(混合物为：100mM的上游引物1μl+100mM的下游引物1μl+8μl灭菌水)

模板（浓度为10ng/μl；或PCRTopo2.1，浓度为10ng/ul）：1μl高保真Taq酶(美国Invitrogen公司，1单位/μl)：1μl

PCR反应程序：

预变性：94℃，3min；

30个循环：

变性：94℃，30s，

退火：54℃，30s，

延伸：72℃，1min；

再延伸：72℃，10min。

第三步是病毒载体构建，通过多步克隆构建在rAd5载体包含六邻体区域的限制性内切酶AscI（载体内仅2个该位点）之间替换合成的替换基因，即替换HVR5和7；替换HVR1-7；或者替换HVR1-7和Loop4。

所述通过多步克隆构建的具体步骤如下（参见图2所示意的质粒构建流程图中的步骤A-F）：

A）原始Ad5骨架质粒即AdMax系统的pBHGloxΔE1,3Cre质粒(购自上海白泽生物科技有限公司)，用AscI单酶切回收9620bp的目的基因片段，同时AscI单酶切GTeasy载体，回收3157bp目的基因片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒9620-GTeasy。

B)将质粒9620-GTeasy和GTopoH进行HindIII/AatII双酶切后，将9620-GTeasy质粒切出目的片段5620bp和GTopoH片段的3840bp分别进行胶DNA琼脂糖凝胶回收、连接、转化，提取质粒得到5620-GTopoH。该质粒是构建过程中非常重要的一个中间过渡质粒，在此基础上分别替换上述步骤一中合成的其中相应序列被Ad37和43型的HVR5和7；HVR1-7；Loop4的DNA序列替换的部分Ad5六邻体序列。

C)利用ApaI和HpaI将合成的其中相应序列被Ad37和43型的HVR5和7；HVR1-7的DNA序列替换的部分Ad5六邻体序列（即SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30）替换5620-GTopoH中的相应序列。对于得到的产物，分别以AatII和HindIII进行单酶切鉴定，切成线性条带，电泳出现在约9620bp处；同时HpaI和HindIII双酶切鉴定，得到出现在约2243bp和7377bp处电泳条带，证明此单克隆为阳性克隆。

D)用NheI和BamHI双酶切将其中相应序列被Ad37或43型的Loop4的DNA序列替换的部分Ad5六邻体序列（即SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28）替换至上述步骤C）中得到的含相应HVR(1-7)的DNA序列的N5620-GTopoH，构建出替换了Loop4基因的NL5620-GTopoH。

E)在构建正确的重组质粒上，用HindIII/AatII双酶切NL5620-GTopoH回收5620bp的目的片段，再与质粒9620-GTeasy回收的约8000bp的目的条带进一步连接，构建完成基因替换的质粒N9620-GTeasy。

F)在质粒N9620-GTeasy的基础上，AscI单酶切质粒N9620-GTeasy回收9620bp的片段，同时AscI单酶切原始质粒pBHGloxΔE1,3Cre，将这两部分进行连接以获得目的质粒。

通过以上步骤可实现在Ad5骨架载体中替换了Ad37和Ad43的HVR5和7；HVR1-7；或者HVR1-7和Loop4的，分别命名为pAd5-37HVR(5,7)、pAd5-37HVR(1-7)、pAd5-37HVR(1-7)L4、pAd5-43HVR(5,7)、pAd5-43HVR(1-7)、pAd5-43HVR(1-7)L4。其中，pAd5-37HVR(5,7)是指其HVR5和7被Ad37的HVR5和7替换的Ad5骨架载体；pAd5-37HVR(1-7)是指其HVR1-7被Ad37的HVR1-7替换的Ad5骨架载体；pAd5-37HVR(1-7)L4是指其HVR1-7和Loop4被Ad37的HVR1-7和Loop4替换的Ad5骨架载体；pAd5-43HVR(5,7)是指其HVR5和7被Ad43的HVR5和7替换的Ad5骨架载体；pAd5-43HVR(1-7)是指其HVR1-7被Ad43的HVR1-7替换的Ad5骨架载体；pAd5-43HVR(1-7)L4是指其HVR1-7和Loop4被Ad43的HVR1-7和Loop4替换的Ad5骨架载体。

第四步是上述重组腺病毒载体的验证。由于骨架质粒没有进行回收纯化，又是单酶切，可能导致骨架质粒自连，或者目的片段连接出现反向结果，这就需要大量提取质粒DNA，全方位系统鉴定。以替换了Ad37HVR(1-7)的质粒为例，结果如图3所示，具体步骤如下：

A）电泳实验：以原始Ad5骨架载体为对照进行琼脂糖凝胶电泳，在1%的凝胶、125V电压电泳30分钟后，正确大小的质粒条带位于在1kb DNA Marker（NEB公司）最高条带之上。

B）酶切鉴定：在电泳鉴定质粒大小后，先用HindIII单酶切鉴定质粒完整性，根据质粒序列图谱，HindIII酶切后电泳会产生大小约1200bp、2500bp、3100bp、4000bp、5000bp、8000bp的六条带；再以BglII单酶切鉴定质粒的方向性，若是正向质粒有4000bp、5000bp、6000bp三条带，若是反向替换，则只有5000bp一条带；还要用KpnI等酶切鉴定合成基因是否成功替换到该质粒。通过上述几种酶切鉴定，证明质粒构建正确。

C）PCR鉴定：酶切鉴定正确后，对目的质粒再进行PCR鉴定，分别用Ad5和Ad37的HVR引物及Loop4引物，PCR改造的质粒和原始骨架Ad5质粒，分别获得相应的特异目的条带说明质粒替换成功。

D）测序鉴定：获得的质粒经过PCR和酶切鉴定正确后，我们又设计引物对改造的区域以及对于病毒包装和复制的关键区域进行测序鉴定。克隆筛选的质粒测序结果经计算机软件Vector NTI分析正确无误后，即可用于后面病毒包装实验。

引物设计以及目的如下：

Asc-PVII  鉴定以AscI连接的方向是否正确

5’-GCCTTCAACTCATCCGCCA-3’（SEQ ID NO:35）

JD-HVR  鉴定是否序列是否替换成功

5’-AAGGGTGCCCCAAATCCT-3’（SEQ ID NO:36）

ITR-34054  鉴定包装信号区域是否完整

5’-CATCGGTCAGTGCTAAAAAG-3’（SEQ ID NO:37）

100K-25443  鉴定病毒装配关键蛋白是否缺失或突变

5’-GATCATGGAGTCAGTCGAGA-3’（SEQ ID NO:38）

33K-27577  鉴定病毒复制调控蛋白是否缺失或突变

5’-AGGATGGCACCCAAAAAG-3’（SEQ ID NO:39）

Knob-5  鉴定病毒结构蛋白是否缺失或突变

5’-TCGGTCAGTGCTAGTCGA-3’（SEQ ID NO:40）

表1.Ad5的HVR1-7和Loop4氨基酸序列。

表2.Ad37的HVR1-7和Loop4氨基酸序列

表3.Ad43的HVR1-7和Loop4氨基酸序列

以下是SEQ ID NO:25（1426bp）：合成的Ad5-37HVR(1-7)序列(ApaI-HpaI)。TACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGACTACCAAAGAAAAGCAAAACGGAGGAACTGGAGCAGAAAA AGATGTTACAAAGACATTTGGACTTACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTACTGACAAAACAGCAAATGCTGAAAAACCAAT CTATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGCAGGATAAT GATGAATATTATGGCGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGCTAAATTGAAAGAAACACCCAATG GTACCGATCCTCAAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCGACTCAAGCACTATAAATAT ACCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCGGCAAAGAGGATGACAGTTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGACGGTGTTCAAACTAATTCAGCC TATCAAGGTGTTAAACTAAAGCCTGATCAAACAGGAGGCGGAGTTAATGGAGATTGGGTA AAGGATAATGACATTTCAGCCCATAATCAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGAT

注：单下划线为Ad37的HVR1-7序列，双下划线为限制性酶切位点。

以下是SEQ ID NO:26（417bp）：合成的Ad5-37Loop4序列(NheI-BamHI)。TAACTATAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCAGGCAGGTGGTCGATGAGATCAACTAC AAGGACTACAAGGCAGTCACCCTGCCCTTCCAGCACAACAACTCTGGCTTCACCGGCTACC TGGCACCCACCATGCGTCAGGGGCAGCCCTACCCCGCCAACTTCCCCTACCCGCTCATCGG CTCCACCGCAGTGCCATCCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGT

注：单下划线为Ad37的Loop4序列，双下划线为限制性酶切位点。

以下是SEQ ID NO:27(1429bp)：合成的Ad5-43HVR(1-7)序列(ApaI-HpaI)。TACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGAAACAAAAGAAAAGCAAAATGGGGGTAGCGGAGCTCAGAT AGAAAAAAATGTTACAAAAACATTTGGAGTGACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTTGAAGAAATTAATAATGTAGAAG AAGAAGTTTATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGCA AGAAACTTTTAATTTCTACGGAGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGCTAAACTTAAAACTGGA GAGAATGTCGACCCAACGAAAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCGATCTTAAGCAA ACAGACACTGGAACAACGCAAAATCAGCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCGGCAAGGAAGATGCAAGTTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGATGGCATGGGTTCAAATGCGGCCTACCAAGGTGTTAAGCCAAAAACTGGCAACGGAT GGGATCCAAATACAGATGTTGCTGCCCAGAATCAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGAT

注：单下划线为Ad43的HVR1-7序列，双下划线为限制性酶切位点。

以下是SEQ ID NO:28(417bp)：合成的Ad5-43Loop4序列(NheI-BamHI)。TAACTATAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCAGGCAGGTGGTCGATGAGATCAACTAC AAGGACTACAAGGCCGTCACCCTGCCCTTCCAGCACAACAACTCGGGCTTCACCGGCTACC TCGCACCCACCATGCGTCAGGGGCAGCCCTACCCCGCCAACTTCCCCTACCCGCTCATCGG CCAGACAGCCGTGCCCTCCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGT

注：单下划线为Ad43的Loop4序列，双下划线为限制性酶切位点。

以下是SEQ ID NO:29(1435bp)：合成的Ad5-37HVR(5,7)序列(ApaI-HpaI)。TACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCGACTCAAGC ACTATAAATATACCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGACGGTGTTCAAAC TAATTCAGCCTATCAAGGTGTTAAACTAAAGCCTGATCAAACAGGAGGCGGAGTTAATGG AGATTGGGTAAAGGATAATGACATTTCAGCCCATAATCAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGAT

注：单下划线为Ad37的HVR5和HVR7序列，双下划线为限制性酶切位点。

以下是SEQ ID NO:30(1432bp)：合成的Ad5-43HVR(5,7)序列(ApaI-HpaI)。TACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCGATCTTAAG CAAACAGACACTGGAACAACGCAAAATCAGCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGATGGCATGGGTTCAAATGCGGCCTACCAAGGTGTTAAGCCAAAAACTGGCAACG GATGGGATCCAAATACAGATGTTGCTGCCCAGAATCAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGAT

注：单下划线为Ad43的HVR5和HVR7序列，双下划线为限制性酶切位点。

2）表达人类免疫缺陷病毒(HIV)1型Gag基因的穿梭质粒的构建和蛋白质印迹检测Gag基因的表达如图5。

第一步，利用BamHI和XhoI酶切位点，将PCR获得的HIV-1Gag基因（模板为pSC11-GPE质粒；序列参见本单位专利：CN1631440A）克隆到真核表达载体pDC316（同时也是重组腺病毒载体系统的穿梭载体；购自上海白泽生物科技有限公司）上。反应步骤、试剂、条件如下：

A）PCR引物设计：

上游：5’-GGATCCATGGGCGCCCGGGCCAGCA-3’（SEQ ID NO:41）

下游：5’-CTCGAGTTGAGACAAGGGGTCGCT-3’（SEQ ID NO:42）

PCR的反应体系（50μl）：

灭菌水：34.5μl

10×buffer：5μl

MgSO4（25mM）:2μl

dNTP(2mM)：5μl

引物混合物：各0.5μl(20mM)

模板（D-GPEi）：1μl

高保真Taq酶(1单位/μl)：1μl

PCR反应程序：

预变性：94℃，3min；

30个循环：

变性：94℃，30s，

退火：54℃，30s，

延伸：72℃，2min；

再延伸：72℃，10min。

B)PCR获得目的基因后，以BamHI和XhoI分别双酶切PCR产物和pDC316载体，回收目的片段后16℃连接过夜、转化、提取质粒，称为pDC316-Gag。

C）BamHI和XhoI双酶切pDC316-Gag质粒，切出1500bp和3900bp两条带，验证该pDC316-Gag质粒为正确连接的质粒。

第二步，克隆成功后瞬时转染人胚肾293（HEK293）细胞和非洲绿猴肾（cos-7）细胞，以感染HIV的人血清（美国NIH赠送）为一抗，蛋白质印迹检测到了Gag蛋白的表达。步骤、试剂、条件如下：

A）将HEK293细胞或Cos-7细胞以5×10⁵个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85%-90%时，将4μg pDC316-Gag质粒转染进细胞，转染试剂为lipofectamine2000（美国Invitrogen），转染操作参见试剂说明书。

B)表达产物收获：转染后72小时，吸出培养基，细胞刮收集细胞离心弃上清，直接制样或冻存于-20℃。

C）蛋白质印迹检测：每个样品以30μl RIPA（1×PBS，1%NP40，0.5%Sodiumdeoxycholate，0.1%SDS，1mM PMSF）裂解30分钟后加入30μl2×上样Buffer（50mmol/L Tris.cl（PH6.8），2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，5%巯基乙醇）混匀，煮沸30分钟，12000rpm离心15分钟，吸取15ul上清至10%SDS-PAGE凝胶中，160V电泳1小时。

电泳结束后，将蛋白质转移至PVDF膜（颇尔公司，Pall Corporation）上，以含3%脱脂奶粉的PBS溶液（135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH₂PO4,and8mM K2HPO4，pH7.2）封闭1小时，以感染HIV的人血清为一抗4℃孵育过夜，再与碱性磷酸酶标记的人二抗（109-055-003，Jackon公司）于37℃孵育1小时，最后以NBT/BCIP（北京鼎国昌盛生物技术公司）碱性磷酸酶显色液（100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl，pH9.5）显色15分钟。

结果如图5右图所示，构建的穿梭载体转染HEK293和Cos-7细胞后，蛋白质印迹均能产生约为55Kd的Gag蛋白特异条带。

实施例2病毒的包装和纯化

1）病毒的包装和分离

以构建好的重组腺病毒载体pAd5-37HVR(5,7)、pAd5-37HVR(1-7)、pAd5-37HVR(1-7)L4、pAd5-43HVR(5,7)、pAd5-43HVR(1-7)、pAd5-43HVR(1-7)L4和腺病毒载体Ad5分别与表达人类免疫缺陷病毒(HIV)1型Gag基因的穿梭质粒通过lipofectamine2000试剂共转染至293细胞，使共转染到293细胞中的穿梭质粒和腺病毒载体在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。结果显示构建的六个腺病毒载体与原始腺病毒载体（即Ad5）均包装成功初步获得了病毒。实验步骤、试剂、条件和操作方法如下：

在6孔培养板中每孔接种3×10⁵个HEK293细胞，将携带目的基因的腺病毒穿梭质粒与腺病毒载体各2μg，用lipofectamine2000（美国Invitrogen）20μL共转染人胚肾293细胞，隔2-3天换液1次，约7-14天细胞出现细胞病变效应，即细胞变大变圆，脱落并成葡萄串珠状聚集。细胞病变脱落后，收集细胞，经液氮-37℃水浴反复冻融3次后，4000rpm离心30分钟去除细胞碎片，病毒上清液0.2μm滤膜过滤，-70℃保存备用。

2）病毒的纯化

病毒包装成功后以氯化铯密度梯度离心进行初步纯化各种重组腺病毒载体，氯化铯（CsCl₂）密度梯度离心法纯化重组腺病毒载体。实验步骤、试剂、条件和步骤如下：

细胞经液氮和37℃水浴反复冻融3次后离心，在4℃下以12000g离心10min，取上清；20ml上清中加入10ml20%PEG8000/2.5M NaCl，混匀后冰浴1hr，在4℃下以12500g离心30min，弃上清；收集沉淀，溶于5ml1.1g/ml CsCl中，在4℃下以8000g离心5min；取上清制备不连续CsCl₂密度梯度：在15ml离心管中依次加入2ml1.4g/ml CsCl₂、3ml1.3g/mlCsCl₂、5ml上清，在4℃下以60000g离心3hr，吸出病毒带（1.3-1.4g/ml密度之间，即第2条白色带，用1ml注射器）；转入透析卡（Slide-A-LyzerTMDialysis Cassettes/66425），在4℃下透析缓冲液（500uMMgCl₂，10%甘油100ml，1×PBS）中透析过夜，分成小份保存于-80℃。

3）滴度检测

以微量全细胞病变法（TCID50）检测病毒滴度。实验步骤、试剂、条件和步骤如下：

取96孔板，每孔加入10⁴个人胚肾293细胞，每孔培养液为10%DMEM100μl，置37℃，5%CO₂培养24hr。然后，用2%DMEM换液，100μl/孔。待测病毒用2%DMEM稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7等稀释度。在上述换完液的板中分别加入每个稀释度的病毒液体，每孔100μl，每个样本均作10复孔，同时设培养基对照(不含腺病毒)2复孔，于37℃5%CO₂继续培养36-48hr。镜检观察细胞病变效应（CPE）记录各稀释度出现全病变的复孔数，按下列公式计算病毒滴度。

实施例3嵌合载体重组效率检测

实验步骤、试剂、条件和步骤如下：

复苏低代次人胚肾293细胞（30代以内），传至培养皿中（1个75cm²的瓶传3个培养皿）。待细胞覆盖至70%-75%，用2%血清无抗生素DMEM(孵育到37℃)15ml换液。此时，细胞无任何漂起，只有轻微回缩。然后，进行转染，lipo2000用9μl，腺病毒骨架质粒用2.5μg，表达绿色荧光蛋白报告基因的穿梭质粒pDC316-GFP（构建方法同pDC316-Gag）用0.5μg，其余操作遵照lipofectamine2000（美国Invitrogen）说明书进行，在5%CO₂37℃培养箱培养6h。用2ml4%血清加2%青霉素和链霉素双抗（华北制药）的2×DMEM培养基与2%灭菌的琼脂糖1:1混合，制备琼脂糖/DMEM混合物(孵育到42℃)。移去培养液，每个培养皿加入琼脂糖/DMEM混合物10ml,自然冷却到室温后放置于5%CO₂37℃培养箱培养。每天观察细胞变化，7-12天，转染孔与对照孔相比出现由细胞病变产生的噬斑现象，同时在噬斑附近产生大量荧光，多簇聚团。用200μl枪头挑取荧光噬斑感染24孔板人胚肾293细胞进行验证。相同天数时在荧光显微镜下观察并记录不同重组腺病毒载体出现荧光噬斑的数量，以第12天时计数为准，并以3次重复实验结果计算载体的包装效率。

结果如图7所示，替换Ad37的HVR1-7和Loop4基因后，载体的包装效率明显下降，约为原始载体的1/3。同时，替换Ad37的HVR5,7以及替换Ad43HVR1-7和Loop4基因的载体包装效率也出现了一定程度的下降。出乎意料的是当仅替换为Ad43的HVR5,7基因后，载体的包装效率却显著地增加。这说明六邻体的HVR区对于病毒的包装能力有明显的影响，通过对该区域的修饰或许可以调控其包装和复制能力。同时说明以不同血清型腺病毒HVR基因替换Ad5，对载体的包装和产率的影响不同。另外，同时替换同型病毒的HVR1-7和Loop4基因并不能增加重组腺病毒载体的包装和复制能力。

实施例4病毒载体逃避预存免疫及体液免疫水平检测

1）小鼠的Ad5预存免疫和新载体的细胞免疫应答水平检测

间隔4周，以10¹⁰病毒颗粒（VP）的rAd5空载体（Ad5骨架质粒与无外源基因的pDC316质粒重组获得；病毒的包装、纯化按实施例2进行）两次肌肉免疫6-8周的C57/BL6小鼠（购于吉林大学基础医学院动物实验中心）每组免疫6只小鼠，获得具有合适水平的针对Ad5预存免疫的动物模型-Ad5阳性组，八周后再分别以10⁹病毒颗粒（VP）表达Gag的各种重组病毒载体免疫Ad5阳性组和正常的Ad5阴性组小鼠（免疫同剂量PBS）。第十二周尾静脉取血后，处死小鼠取出小鼠脾脏，分离脾细胞，将同组小鼠的脾细胞混合后，进行干扰素-γ酶联免疫斑点试验(IFN-γELISPOT assays)检测Gag表位特异的CD8+T淋巴细胞反应(Smith et al.,2001)。

干扰素-γ酶联免疫斑点试验的实验步骤、试剂、条件和步骤如下：

A）抗体包被：

按实验分组计算所需包被板孔数，用纯化的IFN-γ抗体包被ElISPOT96孔板（美国BD公司）。在5ml稀释液中加入1mg/ml的IFNr-γ抗体（美国BD公司）25μl，使浓度达5μg/ml，每孔加入50μl。4℃过夜。

B）杀鼠取脾

取酒精浸泡的小鼠，剥皮取脾并研磨，纱网过滤后收集细胞，以红细胞裂解液裂解红细胞后以无酚红1640完全培养基重悬细胞并计数。

C）封闭

弃去包被抗体，用含10%血清的完全培养基（R-10）洗涤一次，每孔加入200μl R-10，加盖于室温封闭2小时或37℃1小时，弃去培养基。

D）细胞激活

①每个组分设3个稀释度（1×106，3.3×105，1×105）在第一稀释度2个孔中分别加入150μl的1×10⁷淋巴细胞，在剩余三个稀释度平行孔中分别加入100μl的R-5无酚红培养基。从第一稀释度中取出50μl加入到第二稀释度。再将第二稀释度混匀取出50μl到下一稀释度，按此法逐级稀释，使每孔体积为100μl。

②实验组每孔加入100μl的Gag抗原表位肽P7G（终浓度为1μg/ml，浓度1μg/μl，应为1：500稀释)或纯化腺病毒（2×10⁵vp/细胞）。

③对照组每孔加入100μl培养基。

④阳性对照每孔加入小鼠IFN-γ（美国BD公司）。

将各孔混匀于37℃，5%CO₂培养箱中培养24小时。

E）加生物素标记的一抗

①无菌水洗板2次，用1×洗涤缓冲液（2‰吐温20，1×PBS）洗涤6次，每次洗涤时浸洗1-2min。

②将单克隆抗体（biotinylated mAb for IFN-γ）（美国BD公司）加至12ml（10组量）的稀释缓冲液1中，终浓度为2μg/ml。

③每孔加入50μl上步混合液。

④4℃过夜或室温2小时。

F）加辣根标记的抗生物素的二抗

①用1×洗涤缓冲液或PBST洗涤3次。

②将二抗Streptavidin-HRP concentratio A（美国BD公司）加至稀释缓冲液比值为1∶100。每孔加入50μl混合液。

③室温培养2小时，或4℃过夜。

G）洗涤显色

①用PBST洗涤4次。

②用PBS洗涤2次

③每孔加50μl Elispot染色液（AEC substratio set，cat no:551951,20μl的chronogen加入到1ml的AEC substratio溶液中)。

④避光室温放置5-60分钟。弃去染色液，用蒸馏水洗涤室温空气干燥2小时或过夜干燥，保存数据。

该部分结果如图8A所示。结果显示，在阴性小鼠体内重组腺病毒载体的T细胞免疫与Ad5载体相比，除Ad5-43HVR(1-7)外均略有下降，这可能与病毒在体内的感染和表达能力有关，然而在预存免疫了Ad5空载体的模型小鼠体内，重组腺病毒载体均保持了与阴性组相当的细胞免疫能力，而Ad5载体的免疫反应则完全被抑制。同时，我们也获得了一个能保持Ad5载体高水平细胞免疫原性的重组腺病毒载体Ad5-43HVR(1-7)。

如图8B所示，替换了Ad37和Ad43HVR(5,7)基因的重组载体在空白小鼠体内的免疫原性与Ad5基本一致，然而在预先免疫了Ad5空载体的阳性组，两种重组载体的T细胞免疫水平明显被抑制，然而当以另一种重组载体进行加强后，又出现了一定程度的Gag特异的免疫反应。这说明替换了HVR(5,7)的重组载体同样具有一定的逃避预存的高低度中和抗体的中和作用，也说明HVR5,7仅具有腺病毒六邻体的部分中和抗原表位。

2）小鼠血清中产生Gag特异抗体水平的检测

取前一步骤中获得的各免疫组小鼠血以2000g离心5min，吸取上层血清作为第一抗体，以P24蛋白（北京万达因公司）为抗原，酶联免疫印迹试验（ELISA）检测Ad5阳性组和阴性组小鼠血清中Gag特异的抗体反应。ELISA检测的实验步骤、试剂、条件和步骤如下：

A)包被：用pH9.6的抗原包被液（Na₂CO₃：15mM；NaHCO₃：35mM；NaCl：0.2M）将抗原稀释至适当浓度。在聚苯乙烯板的每个反应孔中加100μl(200ng/孔)，4℃过夜。

洗涤：次日，弃去孔内溶液，用PBST漂洗3次，每次3分钟。

B)封闭：每孔加入200μl5%的脱脂奶粉封闭液，于37℃孵育2h，洗涤。

C)加一抗：每孔加入100μl稀释好的血清，37℃孵育1h，洗涤。

D)加酶标二抗：每孔加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记二抗（109-035-088，Jackson公司）100μl，37℃孵育1h，洗涤。

E)加底物显色液：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，37℃避光反应15min。

F)终止反应：每孔中加入2M硫酸50μl。

G)测OD值：在酶标仪（美国伯乐公司680型全自动酶标仪）上，于450nm下测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

其结果如图9所示。结果显示，Ad5-43HVR(1-7)同样产生了高水平的体液免疫反应，而其余3种重组腺病毒载体的体液免疫反应能力则分别下降了3-5倍，这与文献中48型的替换结果一致。这说明，通过序列选择和优化，以合适的血清型HVR基因替换Ad5载体可以获得包装能力以及免疫原性强且能够逃避预存免疫的新型重组腺病毒载体。

3）人体血清学试验

分别以rAd5、Ad5-37HVR(1-7)、Ad5-37HVR(1-7)L4、Ad5-43HVR(1-7)、Ad5-43HVR(1-7)L4进行病毒中和试验检测健康人体血清样本中各种载体特异的中和抗体滴度，以考察人体内针对改造后载体的抗体水平。

病毒中和实验：前一步骤中获得的血清于55℃下热灭活15分钟，按1：100稀释后取100μl悬于96孔板，每孔加入50μl感染复数（MOI）为200的原始及改造的腺病毒载体储液（实施例2制备），于37℃5%CO₂培养箱中放置一小时后加入50μl(6×10⁵/ml)人胚肾293细胞悬液培养过夜，更换新鲜培养基再培养4天，在第5-6天进行噻唑蓝比色试验（MTT试验）检测细胞病变的抑制率(Vogels et al.,2003)。细胞病变保护大于90﹪时记录为该病毒的阳性血清。MTT试验的实验步骤、试剂、条件和步骤如下：

A）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至1000-10000/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

B)5%CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，细胞贴壁后即可加药，每孔100μl，设3-5个复孔。

C)5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

D)每孔加入20μl MTT(噻唑蓝,购自Sigma公司)溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

E)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪（美国伯乐公司680型全自动酶标仪）测量490nm下各孔的OD值。

其结果如图10所示。结果显示，重组腺病毒载体的血清阳性率与Ad5载体相比大大降低，这说明我们改造的重组腺病毒载体同样可以逃避人血清中的Ad5中和抗体。

参考文献

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Sumida,S.M.,Truitt,D.M.,Lemckert,A.A.,Vogels,R.,Custers,J.H.,Addo,M.M.,Lockman,S.,Peter,T.,Peyerl,F.W.,Kishko,M.G.,Jackson,S.S.,Gorgone,D.A.,Lifton,M.A.,Essex,M.,Walker,B.D.,Goudsmit,J.,Havenga,M.J.,and Barouch,D.H.(2005).Neutralizingantibodies to adenovirus serotype5vaccine vectors are directed primarily against theadenovirus hexon protein.J Immunol174(11),7179-85.

Vogels,R.,Zuijdgeest,D.,van Rijnsoever,R.,Hartkoorn,E.,Damen,I.,de Bethune,M.P.,Kostense,S.,Penders,G.,Helmus,N.,Koudstaal,W.,Cecchini,M.,Wetterwald,A.,Sprangers,M.,Lemckert,A.,Ophorst,O.,Koel,B.,van Meerendonk,M.,Quax,P.,Panitti,L.,Grimbergen,J.,Bout,A.,Goudsmit,J.,and Havenga,M.(2003).Replication-deficient human adenovirustype35vectors for gene transfer and vaccination:efficient human cell infection and bypass ofpreexisting adenovirus immunity.J Virol77(15),8263-71.

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Claims (9)

1.一种构建重组腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR5、7替换rAd5载体的HVR5、7，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。

2.一种构建重组腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR1-7替换rAd5载体的HVR1-7，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。

3.权利要求1或2的方法，还包括还以所述其他人腺病毒血清型的Loop4替换所述rAd5载体的Loop4。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述rAd5载体的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:1-8，所述人腺病毒血清型Ad43的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:17-24，所述人腺病毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:9-16。

5.一种rAd5载体，为HVR5、7被其他人腺病毒血清型的HVR5、7替换的rAd5载体，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。

6.一种rAd5载体，为HVR1-7被其他人腺病毒血清型的HVR1-7替换的rAd5载体，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。

7.权利要求5或6的rAd5载体，所述载体的Loop4被所述其他人腺病毒血清型的Loop4的替换。

8.权利要求5-7任一项的rAd5载体，其中所述rAd5载体的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:1-8，所述人腺病毒血清型Ad43的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:17-24，所述人腺病毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:9-16。

9.权利要求5-8任一项的rAd5载体用于制备疫苗或基因治疗药物的用途。