CN114736930A - 一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用 - Google Patents
一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用，构建病毒蛋白的随机突变文库，并将所述的随机突变文库导入慢病毒质粒载体获得慢病毒质粒文库；将所述的慢病毒质粒文库包装假病毒，并与中和抗体中和后，感染表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的细胞，筛选出表达绿色荧光的细胞，并提取DNA进行序列分析，即可筛选出能逃逸中和抗体的病毒序列。本发明的筛选体系可用于预测逃逸中和抗体的病毒序列，简便，高效，为病毒蛋白与宿主的研究提供新的平台。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用。
背景技术
2019年新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是继2002年暴发严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)疫情及2012年暴发中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)疫情之后的第三种高致病的冠状病毒。目前为止，新冠肺炎全球确诊数量累计超1亿，累计死亡病例250万以上，给人类社会带来前所未有的灾难。
随着SARS-CoV-2世界范围内的大规模传播，使得传统漫长的疫苗开发进程空前加快，而与此同时，SARS-CoV-2也处于变异之中。最近的研究发现，在过去的1年里，已经在全球各地患者体内采集的新冠病毒样本中发现了接近30000个突变并且其中超过75个可以遗传，预测未来1年内可能产生传染性和致病性更强的新冠病毒毒株，新冠病毒变异株的出现给疫苗预防和中和抗体治疗带来了巨大挑战。
研究表明，SARS-CoV-2入侵机体细胞主要依靠的是其表面的特殊结构刺突蛋白(spikeprotein，Sprotein)。S蛋白可以特异性识别人类血管紧张素转化酶2(humanangiotensinconvertingenzyme 2，hACE2)，并促进病毒膜与细胞膜融合，从而最终介导冠状病毒进入宿主细胞，引发感染。S蛋白合成过程中，被蛋白酶水解成S1和S2两个亚单位。其中S1中的受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)直接与ACE-2的肽酶区(peptidase domain，PD)结合，是病毒细胞嗜性及病毒入侵的决定区域。
目前，新冠康复者血清和中和抗体治疗是临床有效的抗新冠病毒疗法之一。新冠中和抗体主要靶向病毒S蛋白的RBD区，竞争性地与ACE-2受体结合，从而达到阻滞病毒感染的目的，并且靶向RBD的抗体通常在自然感染引起的多克隆抗体反应的中和活性中起着关键性作用。然而已有文献报道，即使利用SARS-CoV-2的S蛋白假病毒体系，在RBD中和抗体存在的条件下，S蛋白也会产生逃逸突变体，这给病毒疫苗推广应用和中和抗体治疗带来了巨大挑战。在WHO公布的初代新冠疫苗中，包括mRNA疫苗、DNA疫苗、载体类疫苗、亚单位蛋白疫苗、VLP疫苗等，多选用全长S蛋白或S蛋白的RBD作为抗原靶标。且新一代新冠基因工程疫苗概念设计采用了RBD和NTD(氨基末端结构域)双组分亚单位新冠疫苗，在兔子和猕猴实验中验证了该疫苗诱导产生的中和抗体水平，显著高于初代新冠疫苗。
研究发现SARS-CoV-2的有些突变株增强了刺突蛋白的结构稳定性[武汉、深圳、法国出现的三种突变体类型(V367F，W436R和D364Y)]显示出更高的ACE2亲和力，并且可能具有更高的感染力。最近报道的英国突变体B.1.1.7除D614G外还包含8个S蛋白突变，包括NTD中的两个缺失(69-70del和144del)，RBD中的一个突变(N501Y)和前蛋白转化酶——弗林蛋白酶切割位点附近的一个突变(P681H)。B.1.1.7难以被大多数单克隆抗体 (monoclonalantibody，mAb)结合到S蛋白的N末端域(NTD)，但它对恢复期病人的血浆及接种过疫苗的血清没有太大的抵抗力。同时，南非突变体B.1.351的发现更令人担忧。 B.1.351除了D614G之外还包含9个S蛋白突变，包括NTD中的一簇突变(例如242-244del 和R246I)，RBD中的3个突变(K417N，E484K和N501Y)和靠近DBD的一个突变 (A701V)。由于RBD上E484K的突变，突变体的弗林蛋白酶裂解位点不仅难以被大多数 NTD mAb所中和，而且不易被RBD上受体结合基序的多个单独的mAb所中和。此外， B.1.351对恢复期病人的血浆及接种过疫苗的血清的中和作用也具有明显的抗性。B.1.351 和具有相似S蛋白突变的突变体对mAb治疗提出了新的挑战，并威胁到当前疫苗的保护功效，从而对新冠病毒的预防和疫苗开发带来了很大的困难。
综上所述，目前对SARS-CoV-2的突变机制及突变位点的研究显得尤为重要。虽然许多针对S蛋白RBD的抗体目前得到了批准使用，但RBD的潜在逃逸突变对现阶段的疫苗研发及抗体治疗产生了不确定的影响。单抗的免疫逃逸研究表明，即使是高效的中和作用也不能遏止病毒逃逸突变体的快速产生。因此，通过对S蛋白RBD的基因进行高通量随机突变，开发能够对逃避抗体结合的SARS-CoV-2RBD突变体进行检测的体系，并预测可能的抗原进化，为抗体治疗剂以及抗体组合的设计提供依据，从而辅助下一阶段的抗体治疗及疫苗研发进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法，该方法便捷，可用于对病毒可能会出现的逃逸突变进行预判。
本发明的另一目的在于提供上述筛选方法在筛选能逃逸中和抗体的病毒突变体序列中的应用。
本发明的又一目的在于提供上述能逃逸中和抗体的病毒突变体序列在制备病毒抗体治疗剂或疫苗中的应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法，该筛选方法为：构建病毒蛋白的随机突变文库，并将所述的随机突变文库导入慢病毒质粒载体获得慢病毒质粒文库；将所述的慢病毒质粒文库包装成假病毒，并与中和抗体中和，将未被中和抗体中和的假病毒感染表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的细胞，筛选出表达绿色荧光蛋白的细胞，并提取DNA进行序列分析，即可筛选出能逃逸中和抗体的病毒序列。
作为一种优选技术方案：构建病毒蛋白的随机突变文库时，所针对的病毒为新冠病毒、流感病毒、艾滋病毒和呼吸道合胞病毒中的至少一种，但不限于此。
作为一种优选技术方案：所述的病毒蛋白为S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白中的至少一种，但不限于此。
作为一种优选技术方案：所述随机突变的随机突变区为：S蛋白的RBD区、S1区、S2区或去除RBD的S1区，但不限于此。
最优选的：构建新冠病毒S蛋白RBD区随机突变文库。
作为一种优选技术方案：所述的慢病毒质粒载体为表达绿色荧光蛋白的S蛋白慢病毒质粒载体。
作为一种优选技术方案：所述的表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的细胞为表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的293T细胞。
上述的方法在筛选能逃逸中和抗体的病毒突变体序列中的应用。
采用上述的方法筛选出的能逃逸中和抗体的病毒突变体序列。
上述能逃逸中和抗体的病毒突变体序列在制备病毒抗体治疗剂或疫苗中的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建的病毒蛋白逃逸中和抗体筛选体系能够快速有效的筛选出能逃逸中和抗体的病毒序列。本发明的筛选体系用于预测逃逸中和抗体的病毒序列，简便，高效，为病毒蛋白与宿主的研究提供新的平台。
附图说明
图1是本发明实施例1中lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体示意图。
图2是本发明实施例1中S(△RBD)片段构建示意图。
图3是本发明实施例1中核酸电泳验证S1、S2及S(△RBD)片段扩增结果。
图4是本发明实施例1中菌落PCR验证RBD片段缺失的S蛋白载体构建结果。
图5是本发明实施例2中含有RBD片段的S蛋白基因图谱。
图6是本发明实施例2中核酸电泳验证RBD片段扩增情况。
图7是本发明实施例2中菌落PCR验证RBD片段插入载体效率。
图8是本发明实施例4中显微镜下观察转染和感染效率。
图9是本发明实施例5中显微镜下观察野生型和突变体慢病毒感染效果。
图10是本发明实施例6中核酸电泳检测从提取的细胞DNA中扩增出RBD区域片段。
图11是本发明实施例6中核酸电泳检测RBD片段是否插入lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体中。
图12是本发明实施例7中四个突变体与野生型相比，氨基酸突变位点；
其中，图12a为第一个突变体与野生型相比，氨基酸突变位点；图12b为第二个突变体与野生型相比，氨基酸突变位点；图12c为第三个突变体与野生型相比，氨基酸突变位点；图12d为第四个突变体与野生型相比，氨基酸突变位点。
图13是本发明实施例中针对于实施例7中筛选的突变体，随机选取两个突变体进行免疫逃逸效应验证：倒置显微镜观察野生型、第二个突变体(12b)、第三个突变体(12c)分别与对照小鼠血清和含中和抗体的小鼠血清结合后的感染效果。
图14是本发明实施例8中使用Pacbio DNA三代测序技术对对照血清组和实验组中从感染细胞DNA中扩增出的RBD区域进行测序，然后根据测序结果统计分析突变位点情况。
图15是本发明病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法流程图。
具体实施方式
鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是通过核酸随机突变、分子克隆及慢病毒包装等技术，将SARS-CoV-2的S蛋白中RBD区随机突变，构建RBD突变慢病毒文库，筛选能够逃逸中和抗体的突变株，分析其序列及应用研究。
以下结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
实施例1 RBD片段缺失的S蛋白表达载体的构建
在这里，我们对实验室现有的SARS-CoV-2S蛋白质粒为模板(S蛋白序列见附录，本质粒详细信息参见https://doi.org/10.1038/s41467-020-15562-9)进行改造，通过设计两对不同的PCR上下游引物SNheIF和S929ecorvR、S1729ecorF和SBamHR(引物序列见附录)来完成，首先使用PCR技术(本实验室在此使用的产品为诺唯赞Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，本实施例中PCR技术所用的产品均为此产品，具体反应条件及操作参考产品说明书)将RBD片段两端的S蛋白部分分别扩增出来，这里面我们针对RBD左侧部分扩增采用的引物为SNheIF和S929ecorvR，RBD右侧区域扩增采用的引物为S1729ecorF和 SBamHR。然后通过PCR拼接技术，以上述的RBD区域左侧和右侧经过PCR技术扩增后的产物为模板，将经过PCR技术扩增后的RBD片段两端S蛋白部分再次通过PCR技术拼接在一起，这一步我们采用的引物为SNheIF和SBamHR，PCR完成后会构成一段缺失RBD 片段的S蛋白结构，通过在两端引入NheⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点，放入实验室原有的lenticmv-EGFP载体中，菌落PCR技术(诺唯赞2×Taq Master Mix(Dye Plus)，具体操作参考说明书，菌落PCR所用引物见附录)，菌落PCR所用引物为S 691F和 EGFPBamR，验证lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体是否构建成功，具体见图1-4。然后将核酸电泳检测阳性的克隆进行DNA序列检测，以确保S(△RBD)片段未发生DNA碱基突变。图1为本次所构建的lenticmv-S(△RBD)-EGFP质粒图谱，图2为lenticmv-S(无 RBD)-EGFP质粒的大致构建过程，图3是我们在对RBD片段进行PCR技术改造后，通过核酸电泳对PCR结果进行初步鉴定的结果图，图4为菌落PCR后，通过核酸电泳检测以判定S(△RBD)片段是否顺利插入lenticmv-EGFP载体中。同时我们也构建了Lenticmv- S(WT)-EGFP质粒，具体做法为使用引物SNheIF和SBamHR，通过PCR技术将S蛋白片段从实验室现有的SARS-CoV-2S蛋白质粒中扩增出来，通过在扩增出的S蛋白片段两端引入 NheI和BamHI酶切位点，将S蛋白片段放入Lenticmv-EGFP载体中，以构成Lenticmv- S(WT)-EGFP质粒。
lenticmv-EGFP载体为本实验室自行改造，具体方法为对现有的lentiCRISPRV2质粒进行改造，首先我们通过设计引物plenticrisp 8644pacF和plenticrisp 1986PacR(引物序列见附录)对lentiCRISPRV2质粒进行PCR扩增，以去除质粒中含有的U6 promoter、BindingSite、gRNA scaffold、EF-1αcore promoter以及Cas9部分，同时我们对现有的PCDNA 3.1(-)质粒进行改造，同样设计引物pcDNA 253pacF和pcDNA 959PacR(引物序列见附录)采用PCR技术将pcDNA3.1(-)质粒中的cmvenhancer及cmvpromoter扩增出来，我们在PCR扩增的时候对两部分扩增出的片段都引入了PacI限制性内切酶位点，所以在PCR扩增后可以同时对lentiCRISPRV2和pcDNA 3.1(-)质粒经过PCR技术扩增出的片段进行酶切，然后通过DNA连接酶将二者连接在一起，构成lenticmv质粒，然后我们设计引物EGFPF1、EGFPBamF2、EGFPBamR(引物序列见附录)对EGFP荧光蛋白基因进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增的引物为EGFPF1和EGFPBamR，然后以第一次PCR扩增后的产物为模板进行第二次PCR扩增，所用引物为EGFPBamF2和EGFPBamR，目的是在 EGFP荧光蛋白基因两端引入BamHI限制性内切酶位点，然后通过DNA连接酶将EGFP荧光蛋白基因插入构建的lenticmv质粒中，构成本项目所使用的lenticmv-EGFP质粒载体。
实施例2 RBD片段导入不含RBD片段的S蛋白载体中
采用Error-PCR技术，使用Quick-Mutation基因随机突变试剂盒(碧云天D0219S)，设计一组引物S966ecorvF和S1713ecorR(引物序列见附录)采用RCR技术对RBD区域进行随机突变(具体操作参考上述基因随机突变试剂产品说明书)，然后通过EcoRV和EcoRI限制性内切酶对随机突变后的RBD片段进行酶切，同时对实施例1中的lenticmv-S(△RBD)- EGFP载体质粒也采用EcoRV和EcoRI限制性内切酶酶切，酶切后使用DNA连接酶将RBD 片段与lenticmv-S(△RBD)-EGFP质粒连接，将酶连产物进行转化，铺在含有氨苄抗生素抗性的LB平板上过夜生长，次日菌落PCR(诺唯赞2×Taq Master Mix(Dye Plus)，具体操作参考说明书，菌落PCR所用引物序列见附录)检测插入效率，本次所用引物为S 1411F和SBamHR具体参阅图5-7。图5为本项目构建的lenticmv-S-EGFP慢病毒质粒文库图谱；图6为我们经过Error-PCR技术对RBD片段进行扩增后，核酸电泳检测RBD片段是否顺利扩增；图7为我们通过核酸电泳方法对RBD插入lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体的效率进行检测，本次共挑8个菌落，阳性克隆为4个，推测连接效率约为50％，便于后续判断我们质粒文库中所含有的有效基因数目。
实施例3构建含有RBD突变区域的S蛋白慢病毒质粒文库
为了扩大我们的S蛋白慢病毒质粒文库容量，我们根据实施例2中操作，将RBD片段扩增出来，然后对扩增后的RBD片段和实施例1中构建的lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体质粒分别使用EcoRV和EcoRI限制性内切酶酶切，再用DNA连接酶将RBD片段与已构建的lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体(实施例1中构建)进行连接，然后将酶连产物加入DH5α感受态中，冰上放置30min，然后42℃热激30s,热激后将感受态放在冰上冷却1-2分钟，然后加入500ul LB培养基，在摇床上37℃、200r摇30分钟，将含有酶连产物的感受态铺在含有氨苄抗生素的LB板上。本实验共铺10块板，次日观察LB板上菌落生长情况，每块板上约有800-1000个菌落不等，共约8000-10000个菌落，根据实施例2中所检测的连接率推断，本次实验中有效克隆数为4000-5000个。将十块板上所有菌落用LB培养基吹下，收集在锥形瓶中，加入LB培养基和氨苄抗生素摇菌扩大培养，次日收菌大提质粒。
实施例4含有RBD突变区域的S蛋白慢病毒质粒文库感染能力验证
采用三质粒包装系统，首先对实验室现有的包装质粒pCMV-VSV-G-Rsv-Rev(科研常规慢病毒包装质粒载体)进行改造，设计一组引物pCMVVSVG3152F和pCMVVSVG1490R (引物序列见附录)将其中VSV-G部分去除以排除VSV-G在病毒感染过程中产生假阳性干扰，我们在引物上引入EcoRV限制性内切酶位点，PCR扩增后对PCR产物进行酶切，然后通过PCR产物自连的方式形成新的包装质粒PCMV-RSV-REV。然后用PCAG-HIV-gp(市场上常规慢病毒包装质粒载体)、PCMV-RSV-REV(新构建)和目的基因质粒lenticmv-S- EGFP(实施例3构建的S蛋白慢病毒质粒文库)三种质粒按照一定的比例(质量比为 1:1:4)在正常293T细胞中进行转染以产生病毒颗粒(含有随机突变基因的S蛋白病毒颗粒)，转染72h后显微镜观察转染效率，然后收集上清，离心去除上清中细胞碎片，将去除细胞碎片的上清液高速离心，用来浓缩病毒粒子。将浓缩后的病毒粒子用1640(无抗生素无血清)培养基重悬病毒粒子，然后将慢病毒感染293T细胞(293T细胞提前外源性转染 hACE2和TMPRSS2基因，以利于SARS-CoV-2S慢病毒进行感染)，感染24h后显微镜下观察感染效果，具体参阅图8。图8为我们在倒置荧光显微镜下观察的lenticmv-S-EGFP慢病毒效果图，首先我们观察了72h的转染情况以确定病毒粒子是否产生，接着通过观察感染情况证明了我们构建的SARS-CoV-2S蛋白假病毒系统的可行性。
实施例5中和抗体中和病毒实验
首先分别用Lenticmv-S(WT)-EGFP和lenticmv-S-EGFP(实施例3构建的S蛋白慢病毒质粒文库)质粒与包装质粒PCAG-HIV-gp和PCMV-RSV-REV共转293T细胞产生慢病毒，然后分别将WT和MUT(实施例3构建的S蛋白慢病毒质粒文库)两种慢病毒颗粒浓缩 (具体操作过程参考实施例4)，1640(无三抗无血清)培养基重悬，然后将每种慢病毒平均分成两份，每种慢病毒中一份加入对照血清，另一份加入中和抗体血清(参考之前实验结果将中和抗体血清按1:2比例稀释后加入)，然后37℃10r慢摇1h，1h后将慢病毒分别加入 293T细胞中(外源性表达hACE2和TMPRSS2蛋白)，24h后检测感染效果，具体参阅图 9。图9为我们对中和抗体中和病毒实验的结果检测，在对照血清组我们可以观察到野生型 S蛋白慢病毒可以有效地对细胞进行感染，而在中和抗体血清组，由于中和抗体对病毒的中和作用，我们可以发现野生型S蛋白慢病毒无法感染细胞，由此验证了我们中和抗体的有效性。在实施例3构建的含有突变体的S蛋白慢病毒质粒文库的结果中我们可以发现，在对照血清组，含有突变体的S蛋白慢病毒质粒文库可以有效地感染细胞，而在中和抗体的作用性，相对于对照组而言，感染效率有所下降，但仍有部分慢病毒可以感染细胞。这与野生型中的实验组相比，证明在含有突变体的S蛋白慢病毒质粒文库中存在能够逃逸本实验所用的 S蛋白中和抗体的突变体。
实施例6免疫逃逸的S蛋白突变体筛选
从实施例5抗体中和抗体实验组S蛋白慢病毒质粒文库感染组中收取细胞沉淀，提取细胞DNA(天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，具体操作参考说明书)，然后通过PCR技术(诺唯赞Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，具体反应条件参考产品说明书)以提取的细胞DNA为模板，使用RBD区域两端的引物S 966ecorvF和S1713ecorR(引物序列见附录)将RBD片段扩增出来，采用实施例2中同样的方法将RBD 片段放入之前构建的lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体(实施例1中构建)中，菌落PCR验证是否插入，然后进行基因序列检测，具体参阅图10-11。图10为我们对提取的DNA进行 PCR扩增后，核酸电泳检测RBD片段的表达情况。图11为核酸电泳检测经过菌落PCR技术后，RBD片段是否插入lenticmv-S(△RBD)-EGFP载体中，以确保我们进行DNA测序的克隆为完整的质粒。
实施例7测序结果分析
对进行DNA序列检测的样品进行结果分析，筛选相关的突变位置，本实验根据前期进行测序的几组样品进行分析，具体参阅图12a-d。图12a-d是本次DNA测序所发现的四个突变体的碱基及氨基酸突变情况，本次共送测序6个样品，均产生碱基突变，由于其中两个样品虽然产生碱基突变，但为同义突变，其氨基酸并未发生改变，因此在此图中并未展示，其余几个样品均发生氨基酸突变，由此可以证明我们系统的可行性。
实施例8突变体免疫逃逸效果验证
我们从实施例7中所得到的突变体中随机挑选两个突变体，重新进行免疫逃逸效应检测，以验证我们系统的可行性。在这里，我们挑选第二个突变体(实施例12b,以下简称12b)和第三个突变体(实施例12c,以下简称12c)，用我们的RBD中和抗体进行免疫逃逸筛选(具体操作同实施例6)，具体结果参阅图13，图13是我们在倒置显微镜下观察野生型、12b和12c的对照血清组和中和抗体组(中和抗体稀释比为1:2)的慢病毒感染效果，观察结果显示野生型无法对本项目所用中和抗体进行免疫逃逸，而12b和12c突变体均能对本项目所用的中和抗体进行有效地免疫逃逸，从而进一步证明我们系统的可行性。
实施例9 PacbioDNA三代测序技术检测
为了进一步确定我们的筛选体系所筛选出的S蛋白突变位点情况，我们将实施例5中S 蛋白慢病毒质粒文库所进行的中和实验对照组和实验组感染细胞分别提取细胞基因组 DNA，然后分别以提取出的细胞基因组DNA为模板，使用PCR技术，将对照组合实验组 RBD片段重新扩增出来(具体做法参考实施例6)，由于我们针对于RBD区域进行随机突变改造，所以使用Pacbio DNA三代测序技术对对照组和实验组RBD片段进行测序，以确定对照组和实验组中所有的RBD序列情况，结果发现在对照组RBD片段共存在21848条 DNA序列，而在实验组RBD片段中存在8410条DNA序列，这也说明我们的中和抗体血清中和了大部分S蛋白突变体假病毒。分别对对照组和实验组测序结果进行统计分析，结果发现与对照组相比，在实验组中存在几个突变频率较高的位点(图14Pacbio DNA三代测序技术检测对照血清组和中和抗体组序列Manhattan plot统计分析两组RBD区域碱基突变情况)，分别为RBD区域320位G突变为C、471位T突变为C、551位T突变为C、611位 T突变为C，经过对比320位、471位、551位这些频率较高的位点也存在于我们之前DNA 一代测序技术所检测到的突变体中，而611位T突变为C导致同义突变，所以在本实验中不予考虑。总之，三代测序结果进一步说明本筛选系统的可行性。
应当理解，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
附录(实施例中所用引物序列)
| pCMVVSVG3152F | TGCAGATATCCAGCACAGTG |
| pCMVVSVG1490R | acagatatcAGTGTCAGAATTCTTTG |
| S NhelF | acagctagccaccATGTTCCTGC |
| S BamHR | acaggatcccttgtcgtcatcgtctttg |
| EGFP F1 | TGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAGG |
| EGFP BamF2 | aagggatccggcgcaacaaacttctctcTGCTGAAACAAGCCGG |
| EGFP BamR | acaggatccttacttgtacagctcg |
| S966 ecorvF | ACAGATATCactgttgaaaaaggcatttac |
| S929 ecorvR | GAATTCTGCGATATCaaagctcttcagggtg |
| S1729 ecorF | gctttGATATCGCAGAATTCcagcagttcggaagag |
| S1713 ecorR | acaGAATTCgaagggcaagaacttc |
| S 691F | agggattctctgctctggag |
| S 1411F | agtcaaacctgaagcctttc |
| plenticrisp1986pacR | accttaattaaccaaactg |
| plenticrisp8644pacF | acattaattaaagattacaaagacgatg |
| pcDNA253pacF | acattaattaaGACATTGATTATTGAC |
| pcDNA959pacR | acattaattaaGAATTCTGCAGATATCCAG |
S蛋白序列(WT型)：
ATGTTCCTGCTGACCACCAAGCGGACCATGTTCGTTTTCCTTGTTCTGTTGCCTCTCGTTAGTAGCCAATGCGTCAACCT TACTACTAGAACCCAGCTCCCTCCAGCATATACCAACTCTTTCACCAGGGGCGTATATTACCCGGACAAAGTGTTCCGCT CAAGTGTGCTGCATTCTACGCAGGACCTTTTCTTGCCCTTTTTCAGTAATGTTACTTGGTTTCATGCTATCCATGTGTCT GGAACTAACGGAACCAAGCGCTTTGACAACCCCGTCCTCCCTTTCAACGATGGCGTGTACTTCGCTTCCACGGAAAAGTC AAACATAATTCGCGGCTGGATCTTTGGTACAACACTCGACTCAAAGACGCAGAGCCTGCTGATCGTTAATAACGCTACAA ATGTTGTGATAAAGGTGTGTGAATTTCAGTTCTGCAATGATCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCATAAGAATAACAAGAGC TGGATGGAATCCGAATTTAGGGTTTACAGTTCCGCTAACAACTGCACATTCGAATACGTAAGCCAGCCATTTCTTATGGA TCTTGAGGGCAAGCAAGGAAACTTCAAGAACTTGAGGGAGTTCGTGTTCAAAAATATCGACGGCTATTTTAAGATATATA GCAAGCACACTCCAATAAACTTGGTGCGCGACCTGCCCCAGGGATTCTCTGCTCTGGAGCCCCTGGTGGATCTGCCCATT GGAATAAACATAACTCGCTTTCAAACACTGCTCGCCCTGCATCGCAGTTACCTCACCCCTGGTGATAGTAGTTCAGGATG GACAGCAGGAGCCGCCGCATACTACGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCTTGCTGAAGTACAACGAGAACGGTACAA TAACTGACGCTGTGGACTGCGCTCTGGACCCTCTGTCCGAGACGAAGTGCACCCTGAAGAGCTTTACTGTTGAAAAAGGC ATTTACCAAACCAGCAACTTCCGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTT CGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGC TTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGAT CGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGG TCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAA ATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCA GCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTAT GCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTCAATTTCAATGGCCTCACTGGAACTGGAGTG CTGACCGAATCCAATAAGAAGTTCTTGCCCTTCCAGCAGTTCGGAAGAGACATTGCTGACACAACCGACGCGGTGCGCGA TCCTCAGACTCTGGAGATATTGGACATTACACCATGTTCTTTCGGCGGTGTGTCTGTCATTACTCCGGGCACGAATACTA GCAACCAGGTAGCCGTGCTGTACCAAGACGTGAATTGCACAGAGGTTCCCGTCGCAATTCACGCTGACCAGCTGACCCCC ACGTGGAGGGTTTACAGCACTGGTAGTAACGTCTTCCAGACGAGAGCCGGTTGCTTGATCGGAGCGGAACATGTGAATAA CTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGTATATGCGCCTCTTATCAGACACAAACTAACTCACCCAGGAGAGCCC GCAGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCA ATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTG CACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACC GCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACA CCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCAT TGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTG CTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCT CAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTT CGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTA ACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTG GTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAA CGACATCCTGAGTCGCCTTGATAAGGTGGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGC AGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAA TGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCA CGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACG GTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAG CCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTA CGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGG ACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAG AACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTT GGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGA AGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAACTGCAC TACACA。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3846
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttcctgc tgaccaccaa gcggaccatg ttcgttttcc ttgttctgtt gcctctcgtt 60
agtagccaat gcgtcaacct tactactaga acccagctcc ctccagcata taccaactct 120
ttcaccaggg gcgtatatta cccggacaaa gtgttccgct caagtgtgct gcattctacg 180
caggaccttt tcttgccctt tttcagtaat gttacttggt ttcatgctat ccatgtgtct 240
ggaactaacg gaaccaagcg ctttgacaac cccgtcctcc ctttcaacga tggcgtgtac 300
ttcgcttcca cggaaaagtc aaacataatt cgcggctgga tctttggtac aacactcgac 360
tcaaagacgc agagcctgct gatcgttaat aacgctacaa atgttgtgat aaaggtgtgt 420
gaatttcagt tctgcaatga tcccttcctg ggtgtgtact accataagaa taacaagagc 480
tggatggaat ccgaatttag ggtttacagt tccgctaaca actgcacatt cgaatacgta 540
agccagccat ttcttatgga tcttgagggc aagcaaggaa acttcaagaa cttgagggag 600
ttcgtgttca aaaatatcga cggctatttt aagatatata gcaagcacac tccaataaac 660
ttggtgcgcg acctgcccca gggattctct gctctggagc ccctggtgga tctgcccatt 720
ggaataaaca taactcgctt tcaaacactg ctcgccctgc atcgcagtta cctcacccct 780
ggtgatagta gttcaggatg gacagcagga gccgccgcat actacgtcgg ctacctgcag 840
cctaggacct tcttgctgaa gtacaacgag aacggtacaa taactgacgc tgtggactgc 900
gctctggacc ctctgtccga gacgaagtgc accctgaaga gctttactgt tgaaaaaggc 960
atttaccaaa ccagcaactt ccgcgtccag ccaaccgaga gcatcgtcag atttcccaac 1020
attacaaatc tgtgtccctt cggcgaggtg ttcaacgcca cacgcttcgc ttcagtgtac 1080
gcatggaacc gcaagcgcat atctaactgc gtcgcggatt attctgtcct ctacaactcc 1140
gcctctttct ccaccttcaa gtgctacgga gtgtcaccga ctaagctgaa cgatctctgc 1200
tttaccaacg tctacgcgga ctccttcgtg ataagaggtg atgaagtgag acaaatagcc 1260
ccaggtcaga ctggtaagat cgcagattac aactacaaat tgcctgatga tttcactggt 1320
tgcgttatcg cgtggaactc taataacctc gattctaagg tcggtggtaa ctacaattac 1380
ctgtaccgct tgtttaggaa gtcaaacctg aagcctttcg agagggatat ttcaaccgaa 1440
atctatcaag cgggttcaac accgtgtaac ggtgtggaag gatttaactg ctacttcccc 1500
ctgcagtctt acggattcca gccaaccaat ggcgtgggtt accaacctta tcgcgtggtg 1560
gttctgagtt tcgaactgtt gcacgctccc gccacggtat gcggtcccaa gaagagcact 1620
aacttggtga agaataagtg cgtgaatttc aatttcaatg gcctcactgg aactggagtg 1680
ctgaccgaat ccaataagaa gttcttgccc ttccagcagt tcggaagaga cattgctgac 1740
acaaccgacg cggtgcgcga tcctcagact ctggagatat tggacattac accatgttct 1800
ttcggcggtg tgtctgtcat tactccgggc acgaatacta gcaaccaggt agccgtgctg 1860
taccaagacg tgaattgcac agaggttccc gtcgcaattc acgctgacca gctgaccccc 1920
acgtggaggg tttacagcac tggtagtaac gtcttccaga cgagagccgg ttgcttgatc 1980
ggagcggaac atgtgaataa ctcctacgag tgcgacatcc ccatcggagc cggtatatgc 2040
gcctcttatc agacacaaac taactcaccc aggagagccc gcagtgtggc ttctcaaagc 2100
attatagcat acactatgtc tcttggtgcc gaaaattccg tggcctattc taacaattca 2160
atcgccatcc caaccaactt cacaattagc gtgactaccg aaatactgcc tgtgagcatg 2220
acgaaaacca gcgtagactg cactatgtat atctgtggag actccactga gtgctccaac 2280
cttctcctgc agtacggtag cttctgtacc caattgaacc gcgcccttac aggcatcgct 2340
gttgagcaag ataagaatac ccaggaagtt tttgcccagg ttaagcagat atacaaaaca 2400
ccgcccatta aggacttcgg aggcttcaac ttctctcaga tactgcctga cccctccaag 2460
ccatcaaaac gcagcttcat tgaggacctc ttgttcaaca aagtgactct ggctgatgct 2520
ggcttcatta agcagtacgg agattgcctg ggagatattg ctgccaggga cctcatctgc 2580
gcccagaagt ttaatggcct gacagtcttg cccccacttc tgacagacga gatgattgct 2640
cagtacacat ctgccctcct cgctggcacc ataacatccg gatggacatt tggtgctggt 2700
gctgccctcc agattccctt cgcaatgcag atggcgtatc gctttaacgg catcggtgtc 2760
acacaaaacg tgttgtatga gaaccaaaag ctcatcgcta accagtttaa ttctgctatt 2820
ggtaagattc aggacagcct gtcatcaacc gcgtctgccc ttggtaagtt gcaggacgtg 2880
gtgaaccaga atgctcaggc tttgaatact ctggtgaagc aactctcttc aaatttcggc 2940
gctatctctt ctgtgttgaa cgacatcctg agtcgccttg ataaggtgga agctgaagtt 3000
caaattgata gattgattac tggcaggctc cagtctttgc agacctacgt tacacagcag 3060
ctgattaggg cggctgaaat tagagcttcc gccaatctgg ctgcaaccaa gatgtccgaa 3120
tgcgtcctgg gtcagtcaaa gcgcgttgac ttttgtggta aaggctacca cctcatgtca 3180
tttccccagt cagcacctca cggagtagtg ttcctccacg tcacctacgt tccagcacag 3240
gaaaagaatt ttaccactgc gccggcaatc tgtcacgacg gtaaggcaca cttcccccgc 3300
gagggcgtat tcgtgtctaa cggaactcat tggttcgtca cacagagaaa cttctatgag 3360
cctcagatca ttaccaccga caatacattt gtgtccggta actgcgacgt tgtgattgga 3420
atcgtcaaca acactgtgta cgatccactt cagccagaac tggatagctt caaggaagaa 3480
ttggacaaat atttcaaaaa tcacacttca cccgatgtgg acctgggtga cattagtggt 3540
atcaatgcgt ccgtggtcaa tattcaaaaa gagattgaca ggctcaacga agtggccaag 3600
aacctgaacg aaagtcttat cgatctgcaa gaattgggaa agtatgagca gtacatcaag 3660
tggccgtggt acatttggtt gggttttatc gccggtctga tcgccatcgt tatggttacc 3720
attatgcttt gctgcatgac gagctgttgc tcctgtctga agggatgctg ctcttgcgga 3780
tcatgttgca agttcgacga ggacgattct gagcccgtgc tgaagggcgt gaaactgcac 3840
tacaca 3846
Claims (10)
1.一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法，其特征在于，该筛选方法为：构建病毒蛋白的随机突变文库，并将所述的随机突变文库导入慢病毒质粒载体获得慢病毒质粒文库；将所述的慢病毒质粒文库包装成假病毒，并与中和抗体中和，将未被中和抗体中和的假病毒感染表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的细胞，筛选出表达绿色荧光蛋白的细胞，并提取DNA进行序列分析，即可筛选出能逃逸中和抗体的病毒序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：构建病毒蛋白的随机突变文库时，所针对的病毒为新冠病毒、流感病毒、艾滋病毒和呼吸道合胞病毒中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒蛋白为S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述随机突变的随机突变区为：S蛋白的RBD区、S1区、S2区或去除RBD的S1区。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于：构建新冠病毒S蛋白RBD区随机突变文库。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的慢病毒质粒载体为表达绿色荧光蛋白的S蛋白慢病毒质粒载体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的细胞为表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的293T细胞。
8.权利要求1～7中任意一种所述的方法在筛选能逃逸中和抗体的病毒突变体序列中的应用。
9.采用权利要求1～7中任意一种所述的方法筛选出的能逃逸中和抗体的病毒突变体序列。
10.根据权利要求9所述的病毒突变体序列在制备病毒抗体治疗剂或疫苗中的应用。
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-
2022
- 2022-04-30 CN CN202210469132.3A patent/CN114736930A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FRANCINO-URDANIZ等: "One-shot identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening", CELL REPORTS, vol. 36, pages 1 - 25 * |
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