ES2397627T3

ES2397627T3 - Retrovirus endógenos regulados por aumento en el cáncer de próstata

Info

Publication number: ES2397627T3
Application number: ES01996222T
Authority: ES
Inventors: Pablo Garcia; Stephen F. Hardy; Lewis T. Williams; Jaime Escobedo
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2013-03-08
Anticipated expiration: 2021-12-07
Also published as: CA2430379A1; AU2002227365A1; US20110020352A1; EP1415005A2; EP2339035A1; EP1415005B1; US7776523B2; JP2008212152A; EP2336368A1; WO2002046477A3; JP2012125260A; JP2013165722A; JP2004535765A; WO2002046477A2; US20100136522A1

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar cáncer de próstata, en el que el procedimiento comprende la etapa dedetectar la presencia o ausencia de un producto de expresión de un retrovirus endógeno HML-2 en una muestra deun paciente, en el que la muestra del paciente contiene células de próstata y/o en el que se sospecha que elpaciente tiene cáncer de próstata en el que la regulación por aumento de la expresión de al menos 150 % respecto aun control negativo es indicativa de cáncer de próstata.

Description

Retrovirus endógenos regulados por aumento en el cáncer de próstata

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al diagnóstico de cáncer, particularmente cáncer de próstata. En concreto, se refiere 5 a un subgrupo de retrovirus endógenos humanos (HERV) que muestran regulación por aumento de la expresión en tumores, en particular en tumores de próstata.

Técnica anterior

El cáncer de próstata es el tipo más frecuente de cáncer en varones en EE.UU. La hiperplasia prostática benigna (HPB) es el crecimiento anormal de células prostáticas benignas en el que la próstata crece y presiona contra la

10 uretra y la vejiga urinaria, bloqueando el flujo normal de orina. Más de la mitad de los varones en EE.UU. con edades comprendidas entre 60-70 y hasta el 90% con edades comprendidas entre 70-90 tienen síntomas de HPB. Aunque esta afección rara vez es una amenaza para la vida puede requerir tratamiento para aliviar los síntomas.

El cáncer que comienza en la próstata se denomina cáncer prostático primario (o cáncer prostático). El cáncer de próstata puede permanecer en la glándula prostática o se puede diseminar a los ganglios linfáticos cercanos y 15 también puede diseminarse a los huesos, la vejiga urinaria, el recto y otros órganos. El cáncer de próstata se diagnostica midiendo los niveles de antígeno específico de la próstata (PSA) y de la fosfatasa ácida prostática (PAP) en sangre. El nivel de PSA en sangre puede elevarse en varones que tienen cáncer de próstata, HPB, o una infección en la próstata. El nivel de PAP se eleva por encima de lo normal en muchos pacientes de cáncer de próstata, especialmente si el cáncer se ha diseminado más allá de la próstata. No obstante, no se puede

20 diagnosticar el cáncer de próstata con estos ensayos únicamente debido a que los niveles elevados de PSA o PAP pueden indicar también otros problemas no cancerosos.

Con el fin de ayudar a determina si las afecciones de la próstata son benignas o malignas normalmente se realizan otros ensayos, tales como ultrasonografía transrectal, pielograma intravenoso, y citoscopia. Si los resultados de estos ensayos sugieren que puede haber cáncer, el paciente debe someterse a una biopsia como único medio

25 seguro de diagnóstico del cáncer de próstata. En consecuencia, es deseable proporcionar un ensayo sencillo y directo para la detección y el diagnóstico precoz del cáncer de próstata sin tener que experimentar múltiples sesiones de incómodos procedimientos de ensayo. También es deseable y necesario proporcionar composiciones y procedimientos para la prevención y/o el tratamiento del cáncer de próstata.

Es un objeto de la invención proporcionar materiales que se pueden usar en la prevención, tratamiento y diagnóstico

30 del cáncer de próstata. Es otro objeto proporcionar mejoras en la prevención, tratamiento y diagnóstico del cáncer de próstata.

Divulgación de la invención

Se ha descubierto que los retrovirus endógenos humanos (HERV) del subgrupo de HML-2 de la familia HERV-K muestran aumento de la expresión en tumores prostáticos. Este hallazgo se puede usar en la detección selectiva,

35 diagnóstico y terapia del cáncer de próstata.

La invención proporciona un procedimiento para diagnosticar cáncer, especialmente cáncer de próstata, en el que el procedimiento comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia de un producto de expresión de un retrovirus endógeno HML-2 en una muestra de un paciente, en el que la muestra del paciente contiene células de próstata y para el que se sospecha que el paciente tiene cáncer de próstata en el que la regulación por aumento de la

40 expresión de al menos 150 % respecto a un control negativo es indicativa de cáncer de próstata.

La expresión del producto de HML-2 que se detectar es un tránscrito de ARNm o un polipéptido traducido de dicho tránscrito. Estos productos de expresión se pueden detectar directa o indirectamente. Un ensayo directo usa un ensayo que detecta ARN o polipéptido de de HML-2 en una muestra de paciente. Un ensayo indirecto usa un ensayo que detecta biomoléculas que no se expresan directamente in vivo a partir de HML-2, por ejemplo un ensayo

45 para detector ADNc que se ha transcrito de forma inversa a partir de un ARNm de HML-2 o un ensayo para detector un anticuerpo que se ha elevado en respuesta a un polipéptido de HML-2.

A – La muestra del paciente

Cuando el procedimiento de diagnóstico de la invención está basado en la detección de ARNm de HML-2, la muestra del paciente comprenderá generalmente células, preferentemente células de próstata. Estas pueden estar

50 presentes en una muestra de tejido, preferentemente tejido de la próstata, o pueden ser células, preferentemente células de próstata, que han escapado en la circulación (por ejemplo, durante la metástasis). En vez de, o así como, comprende células de próstata, la muestra puede comprender viriones que contienen ARNm de HML-2.

Cuando el procedimiento de diagnóstico de la invención está basado en la detección de polipéptidos de HML-2, la muestra del paciente puede comprender células, preferentemente células de próstata, y/o viriones (como se ha

descrito anteriormente para el ARNm) o pueden comprender anticuerpos que reconocen los polipéptidos de HML-2. Típicamente, dichos anticuerpos estarán presentes en la circulación.

Por tanto, en general, la muestra del paciente es muestra de tejido (p. ej., una biopsia), preferentemente una muestra de próstata (p. ej., una biopsia) o una muestra de sangre.

Generalmente, el paciente es un ser humano, preferentemente un varón humano y, más preferentemente, un varón humano adulto.

Los productos de expresión se pueden detectar en la propia muestra del paciente o se pueden detectar en material derivado de la muestra (p. ej., el sobrenadante de un lisado celular o un extracto de ARN o ADNc generado a partir de un extracto de ARN o polipéptidos traducidos de un extracto de ARN o células derivadas del cultivo de células extraídas de un paciente etc.). Estas todavía se consideran “muestras de paciente” dentro del significado de la presente invención.

Los procedimientos de la invención se pueden realizar in vitro o in vivo.

Otras posibles fuentes de muestras del paciente incluyen células aisladas, tejidos completos o fluidos corporales (p. ej., sangre, plasma, suero, orina, derrames pleurales, líquido cefalorraquídeo etc.).

B – Producto de expresión del ARNm

Cuando el procedimiento de diagnóstico de la invención está basado en la detección de ARNm normalmente implica la detección de un ARN que comprende seis regiones básicas. De 5’ a 3’ estas son:

1.: Una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 155 (p.ej., identidad del 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %); o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 50 % con la SEC ID 155 (p.ej., identidad del 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 50, etc., veces) el nivel mayor con respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con al menos un nivel de confianza del 95 %; o una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleotídicos contiguos (p.ej., 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, etc., nucleótidos contiguos) de la SEC ID 155; o una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 % (p.ej., una identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleotídicos contiguos (p.ej., 25,30,35,40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, etc., nucleotídicos contiguos) de la SEC ID 155 y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 50, etc., veces) el nivel más alto respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %. Típicamente, esta secuencia estará en el extremo 5' del ARN. La SEC ID 155 es la secuencia de nucleótidos del inicio de la región R en el LTR del virus ’ERVK6’ HML-2 [ref. 1]. Esta porción de la región R se encuentra en todos los tránscritos de HML-2 de longitud completa.

2.: Una región cadena abajo que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 156 (p.ej., una identidad del 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %); o una secuencia que tiene una identidad de al menos 50 % con la SEC ID 156 (p.ej., identidad del 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 30, etc., veces) el nivel mayor respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un intervalo de confianza del 95 %; o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos (p.ej., 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155,160, 165,170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, etc., nucleótidos contiguos) de la SEQ ID 156; o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos (p.ej., 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,165,170,175,180,185,190, 195, 200, 245, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, etc., nucleótidos contiguos) de la SEQ ID 156 y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 50, etc., veces) el nivel más alto con respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no

cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %. La SEC ID 156 es la secuencia de nucleótidos de la región RU5 cadena debajo de la SEC ID 155 en la LTR de ERVK6. Esta región se encuentra en los tránscritos de HML-2 de longitud completa, pero puede no estar presente en todos los ARNm transcritos a partir de un promotor de LTR HML-2.

3.: Una región cadena abajo que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 6 (p.ej., una identidad del 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %); o una secuencia que tiene una identidad de al menos 50 % con la SEC ID 6 (p.ej., identidad del 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 50, etc., veces) el nivel mayor respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un intervalo de confianza del 95 %; o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos (p.ej., 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, etc., nucleótidos contiguos) de la SEQ ID 6; o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos (p.ej., 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, etc., nucleótidos contiguos) de la SEQ ID 156 y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 50, etc., veces) el nivel más alto con respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %. La SEC ID 6 es la secuencia de nucleótidos de la región del virus ERVK6 entre la región U5 y el primer sitio de corte y empalme en 5’. Esta región se encuentra en los tránscritos de HML-2 de longitud completa, pero algunas variantes la han perdido y, como la región 2 anterior, puede no estar presente en todos los ARNm transcritos a partir de un promotor de LTR HML-2.

4.: Una región cadena abajo que comprende cualquier secuencia de ARN. Típicamente, esta región comprenderá la secuencia de codificación de uno o más polipéptidos de HML-2, pero, como alternativa, puede comprender: una secuencia de codificación viral mutante; una secuencia no codificante viral o no viral; o una secuencia de codificación no viral. La transcripción de cualquiera de estas secuencias puede entrar bajo el control de una LTR de HML-2.

5.: Una región cadena abajo que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 5 (p.ej., una identidad del 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %); o una secuencia que tiene una identidad de al menos 50 % con la SEC ID 5 (p.ej., identidad del 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 30, etc., veces) el nivel mayor respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un intervalo de confianza del 95 %; o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos (p.ej., 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, etc., nucleótidos contiguos) de la SEQ ID 5; o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80 % (p.ej., identidad del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 100 %) con un fragmento de al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 etc., nucleótidos contiguos) de la SEQ ID 156 y se expresa al menos 1,5 veces (p.ej., 2, 2,5, 5, 10, 20, 50, etc., veces) el nivel más alto con respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %. La SEC ID 5 es la secuencia de nucleótidos de la región U3R en el extremo 3’ de ERVK6. Típicamente, esta secuencia estará cerca del extremo 3' del ARN, inmediatamente antes de cualquier cola de poliA.

6.: Una cola de poliA en 3.

El porcentaje de identidad de las secuencias descrito anteriormente se determina mediante el algoritmo de Smith-Waterman usando los parámetros por defecto. Penalización por apertura de hueco = -20 y penalización por extensión = = -5.

Más adelante se hace referencia a estas moléculas de ARNm como moléculas “PCA-ARNm" (“ARNm asociado al cáncer de próstata” y los virus endógenos que expresan estos PCA-ARNm se denominan PCAV (“virus asociados

con el cáncer de próstata”). No obstante, dichos PCAV pueden también estar asociados con otros tipos de cáncer.

Aunque algunos PCA-ARNm incluyen estas seis regiones, la mayoría de los HERV son defectivos en cuanto a que tienen acumulación de múltiples codones de terminación, desplazamientos de marcos o deleciones más grandes etc. Esto significa que muchos PCA-ARNm no incluyen las seis regiones. Todos los PCA-ARNm se transcriben bajo el control del mismo grupo de LTR, no obstante, la transcripción de todos los PCA-ARNm está regulada por aumento en los tumores de próstata aún cuando el ARNm pueda no codificar polipéptidos funcionales.

Cuando un ARNm que se va a detectar está dirigido por 5’ LTR del HML-2 en ADN genómico, la primera de estas regiones siempre estará presentes, pero las otras cinco son opcionales. Por el contrario, cuando un ARNm que se va a detectar está controlado por 3’ LTR del HML-2, la quinta de estas regiones siempre estará presente, pero las otras cinco son opcionales.

Por tanto, en general, el ARNm que se va a detectar tiene la fórmula N1-N2-N3-N4-N5-poliA, en la que:

-: N1 tiene una identidad de secuencia del 75 % con la SEC ID 155; o tiene una identidad de al menos el 50 % con la SEC ID 155 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 155; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 155 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %;

-: N2 tiene una identidad de secuencia del 75 % con la SEC ID 156; o tiene una identidad de al menos el 50 % con la SEC ID 156 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 156; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 156 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %;

-: N3 tiene una identidad de secuencia del 75 % con la SEC ID 6; o tiene una identidad de al menos el 50 % con la SEC ID 6 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 6; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 6 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %;

-: N4 comprende cualquier secuencia de ARN;

-: N5tiene una identidad de secuencia del 75 % con la SEC ID 5; o tiene una identidad de al menos el 50 % con la SEC ID 5 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 5; tiene una identidad de al menos 80 % con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEC ID 5 y se expresa al menos 1,5 veces más respecto a la expresión en una célula normal (es decir, no cancerosa) con un nivel de confianza de al menos un 95 %; y

-: al menos uno de N1, N2, N3, N4 o N5 está presente, pero la poliA es opcional.

Aunque solo al menos uno de N1, N2, N3, N4 o N5 tiene que estar presente, se prefiere que estén presentes dos, tres, cuatro o cinco de estas regiones. Se prefiere que esté presente al menos uno de N1 y/o N5.

N1 está presente, preferentemente, en el ARNm que se va a detectar (es decir, la invención está basada preferentemente en la detección del ARNm dirigida por una 5’ LTR). Más preferentemente está presente al menos N1-N2.

Cuando está presente N1, lo está preferentemente en el extremo 5’ del ARNm (es decir, 5’- N1-...).

Cuando está presente N5, está preferentemente inmediatamente antes de una cola de poliA en 3’ (es decir, … -N5poliA-3’).

Cuando está presente N4, preferentemente comprende una secuencia de codificación de polipéptidos (p. ej., que codifica un polipéptido de HML-2). Ejemplos de secuencias de codificación de polipéptidos de HML-2 se describen más adelante.

Generalmente, el ARN tendrá un capuchón en 5’.

B.1 –Enriquecimiento de ARN en una muestra

Cuando el diagnóstico se basa en la detección de ARNm, el procedimiento de la invención comprende, preferentemente, una etapa inicial de: (a) extraer el ARN (p. ej., ARNm) de la muestra de un paciente; (b) eliminar el

ADN de una muestra del paciente sin eliminar el Arnim y/o (c) eliminar o romper el ADN que comprende la SEC ID N4, pero no el ARN que comprende la SEC ID 4, de la muestra de un paciente. Esto es necesario porque los genomas de las células de próstata tanto normales como cancerosas contienen múltiples moldes de ADN de PCAV, mientras que niveles aumentados de PCA-ARNm solo se encuentran en las células cancerosas. Como alternativa, se puede usar un ensayo específico de ARN que no se vea afectado por la presencia de ADN homólogo.

Se conocen bien los procedimientos para extraer ARN procedente de muestras biológicas [por ejemplo, referencias 2 y 8] e incluyen procedimientos basados en tampones de guanidinio, cloruro de litio, SDS/acetato potásico etc. Una vez que se ha extraído el ARN celular total, el ARNm se puede enriquecer usando, por ejemplo, técnicas de oligodT.

Se conocen bien los procedimientos para eliminar el ADN de las muestras biológicas sin eliminar el ARNm [por ejemplo, apéndice C de la referencia 2] e incluyen la digestión con DNasa.

Los procedimientos para eliminar ADN pero no ARN, que comprende secuencias de PCA-ARNm, usarán un reactivo que sea específico de una secuencia dentro de un PCA-ARNm, por ejemplo una enzima de restricción que reconoce una secuencia de ADN dentro de la SEC ID 4, pero que no escinde la correspondiente secuencia de ARN.

También se pueden usar procedimientos para purificar específicamente PCA-ARNm procedente de una muestra. Uno de estos procedimientos usa un soporte de afinidad que se une a los PCA-ARNm. El soporte de afinidad puede incluir una secuencia polipeptídica que se une al PCAV-ARNm, por ejemplo el polipéptido de cORF que se une a la LTR de los ARNm de HERV-K de un modo específico de secuencia, o la proteína Rev del VIH, que se ha demostrado que reconoce la LTR de HERV-K [3].

B.2 –Detección directa de ARN

Se dispone de varias técnicas para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ARN concreta en una muestra [p. ej., ref. 2 y 8]. Si una muestra contiene ADN de PCAV, la técnica de detección será, en general, específica de ARN; si la muestra no contiene ADN de PCAV, la técnica de detección puede o no ser específica de ARN.

Se pueden usar técnicas de detección basadas en hibridación, en las que una sonda polinucleotídica complementaria con una región de PCA-ARNm se pone en contacto con una muestra que contiene ARN en condiciones de hibridación. La detección de hibridación indica que hay presente el ácido nucleico complementario de la sonda. Las técnicas de hibridación para usar con el ARN incluyen transferencias de tipo Northern, hibridación in situ y matrices.

También se puede usar secuenciación, mediante la que se obtienen la o las secuencias de moléculas de ARN. Estas técnicas revelan directamente si una secuencia de interés está presente en una muestra. Generalmente será adecuada la determinación de la secuencia del extremo 5’ de un ARN correspondiente a N1.

También se pueden usar técnicas basadas en amplificación. Estas incluyen amplificación por PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, T7 etc. La técnica proporciona, preferentemente, amplificación exponencial. Una técnica preferida para usar con el ARN es RT-PCR [p. ej., véase el capítulo 15 de la ref. 2]. La RT-PCR del ARNm de las células de próstata se establece en las referencias 4, 5, 6 y 7.

B3 –Detección indirecta de ARN

En lugar de detectar el ARN directamente, puede ser preferible detectar moléculas que derivan del ARN (es decir, detección indirecta de ARN). Un procedimiento indirecto típico para detectar ARNm es preparar ADNc mediante transcripción inversa y, después, detectar directamente el ADNc. La detección directa del ADNc usará, generalmente, las mismas técnicas que se ha descrito en lo que antecede para la detección directa del ARN (pero se apreciará que procedimientos tales como RT-PCR no son adecuadas para la detección de ADN y que el ADNc es bicatenario, de modo que las técnicas de detección se basan en una secuencia, en su complementaria o en la molécula bicatenaria).

C – PRODUCTO DE EXPRESIÓN POLIPEPTÍDICO

Cuando el procedimiento se basa en la detección de polipéptidos, implicará detectar la expresión de un polipéptido codificado por un PCAV-ARNm. Esto implicará típicamente detectar uno o más de los siguientes polipéptidos de HML-2: gag, prt, pol, env, cORF. Aunque algunos PCA-ARNm codifican todos estos polipéptidos (p. ej., ERVK6 [1]), las regiones codificadores de polipéptidos de la mayoría de los HERV (incluidos los PCAV) contienen mutaciones que significan que una o más regiones de codificación en el tránscrito de ARNm están mutadas o ausentes. Por tanto, no todos los PCAV tienen la capacidad de codificar todos los polipéptidos de HML-2.

Los tránscritos que codifican los polipéptidos de HML-2 se generan mediante corte y empalme alternativo de la copia del ARNm de longitud completa del genoma endógeno [p. ej., Figura 4 de la ref. 143].

El polipéptido de gag de HML-2 está codificado por el primer ORF largo en un genoma de HML-2 completo [140]. El

polipéptido de gag de longitud completa se escinde proteolíticamente.

Ejemplos de secuencias nucleotídicas de gag son: SEC ID 7, 8, 9 y 11 [HERV-K(CH)]; SEC ID 85 [HERV-K108]; SEC ID 91 [HERV-K(C7)]; SEC ID 97 [BFRV-K(II)]; SEC ID 102 [HERV-K10]. Ejemplos de secuencias polipeptídicas de gag son: SEC ID 46, 47, 48, 49, 56 y 57 [HERV-K(CH)]; SEC ID 92

[HERV-K(C7)]; SEC ID 98 [HERV-K(II)]; SEC ID 103 y 104 [HERV-K10]; SEC ID 146 [‘ERVK66’]. Una alineación de las secuencias de polipéptidos gag muestra en la Figura 7. El polipéptido prt de HML-2 está codificado por el segundo ORF largo en un genoma de HML-2 completo. Se traduce

como un polipéptido de fusión gag-prt. El polipéptido de fusión se escinde proteolíticamente para dar una proteasa.

Ejemplos de secuencias nucleotídicas de prt son: SEC ID 86 [HERV-K(108)]; SEC ID 99 [HERV-K(II)]; SEC ID 105 [HERV-K10]. Ejemplos de secuencias polipeptídicas de prt son: SEC ID 106 [HERV-K10]; SEC ID 147 [’ERVK6’]. El polipéptido pol de HML-2 está codificado por el tercer ORF largo en un genoma de HML-2 completo. Se traduce

como un polipéptido de fusión gag-prt-pol. El polipéptido de fusión se escinde proteolíticamente para dar tres

productos pol de la transcriptasa inversa, endonucleasa e integrasa [14]. Ejemplos de secuencias nucleotídicas pol son: SEC ID 87 [HERV-K(108)]; SEC ID 93 [HERV-K(C7)]; SEC ID 100 [HERV-K(II)]; SEC ID 107 [HERV-K10].

Ejemplos de secuencias polinucleotídicas pol son: SEC ID 94 [HERV-K(C7)]; SEC ID 108 [HERV-K10]; SEC ID 148 [’ERVK6’].

Una alineación de las secuencias de polipéptidos pol se muestra en la Figura 8. El polipéptido env de HML-2 está codificado por el cuarto ORF largo en un genoma de HML-2 completo. El polipéptido traducido se escinde proteolíticamente.

Ejemplos de secuencias nucleotídicas env son: SEC ID 88 [HERV-K(108)]; SEC ID 95 [HERV-K(C7)]; SEC ID 101

[HERV-K(II)]; SEC ID 107 [HERV-K10]. Ejemplos de secuencias polipeptídicas de env son: SEC ID 96 [HERV-K(C7)]; SEC ID 108 [HERV-K10]; SEC ID 149 [’ERVK6’].

Alineaciones de las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos env se muestra en las Figuras 6 y 9.

El polipéptido Corp. de HML-2 está codificado por un ORF que comparte la misma región en 5’ y el codón de iniciación que env. Tras el aminoácido 87, un acontecimiento de corte y empalme elimina las secuencias de codificación de env y la

secuencia de codificación de cORF continua en el marco de lectura +1 respecto a la de env [15,16; véase más adelante]. El cORF también se ha denominado Rec [17]. Ejemplos de secuencias nucleotídicas de cORF son: SEC ID 89 y SEC ID 90 [HERV-K(108)] Ejemplos de secuencias polipeptídicas de cORF son la SEC ID 109.

C.1 –Detección directa de polipéptidos de HML-2

Se dispone de varias técnicas para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido concreto en una muestra. Estas son, en general, técnicas de inmunoensayo que se basan en la interacción específica entre un anticuerpo y una secuencia de aminoácido antigénico en el polipéptido. Técnicas adecuadas incluyen procedimientos inmunohistológicos estándar, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, ELISA, RIA, FIA etc.

Por tanto, en general, la invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia y/o medir un nivel de un polipéptido en una muestra biológica, en el que el procedimiento usa un anticuerpo específico del polipéptido. El procedimiento comprende generalmente las etapas de: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo específico para el polipéptido; y b) detectar la unión entre el anticuerpo y los polipéptidos en la muestra.

Los polipéptidos también se pueden detectar mediante ensayos funcionales, por ejemplo ensayos para detectar la actividad de unión o la actividad enzimática. Por ejemplo, un ensayo funcional para cORF se divulga en las referencias 16, 129 y 130. Un ensayo funcional para la proteasa se divulga en la referencia 140.

Otro modo de detectar polipéptidos es usar técnicas proteómicas estándar, por ejemplo purificar o separar polipéptidos y, después, usar secuenciación peptídica. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden separar usando 2D

PAGE y los puntos polipeptídicos se pueden secuenciar (p. ej., mediante espectroscopia de masas) con el fin de identificar si una secuencia está presente en un polipéptido diana.

Los procedimientos de detección se pueden adaptar para usar in vivo (p. ej., localizar o identificar sitios donde hay células cancerosas). En estas realizaciones se administra a un individuo un anticuerpo específico de un polipéptido diana (p. ej., mediante inyección) y el anticuerpo se localiza usando técnicas de imagen convencionales (p. ej., imagen por resonancia magnética, tomografía computerizada etc.). Se usarán marcadores adecuados (p. ej., marcadores de espín etc.). Usando estas técnicas se marcan diferencialmente estas células.

Un ensayo de inmunofluorescencia se puede realizar fácilmente con las células sin necesidad de purificar el polipéptido diana. Las células se fijan primero sobre un soporte sólido, como un portaobjetos de microscopio o un pocillo de microtitulación. Las membranas de las células se permeabilizan después con el fin de permitir la entrada del anticuerpo específico del polipéptido (NB: la fijación y la permeabilización se pueden realizar juntos). Después, las células fijadas se exponen a un anticuerpo que es específico del polipéptido codificado y que se marca con fluorescencia. La presencia de este marcador (p. ej., visualizado con un microscopio) identifica células que expresan el polipéptido diana de PCAV. Para aumentar la sensibilidad del ensayo es posible usar un segundo anticuerpo para unirse al anticuerpo anti-PCAV siendo el segundo anticuerpo el portador del marcador. [18]

C.2 –Detección indirecta de polipéptidos de HML-2

En lugar de detectar polipéptidos directamente, puede ser preferible detectar moléculas producidas por el organismo en respuesta a un polipéptido (es decir, detección indirecta de un polipéptido). Esto implicará típicamente la detección de anticuerpos de modo que la muestra de paciente será, en general, una muestra de sangre. Los anticuerpos se pueden detectar mediante técnicas de inmunoensayo convencionales, por ejemplo usando polipéptidos de PCAV que normalmente se inmovilizarán.

Se han detectado anticuerpos contra los polipéptidos HERV-K en seres humanos [143].

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, que el porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 11. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en la referencia 32.

El término “polipéptido” se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo formación de puentes disulfuro, glicosilación, lapidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos se pueden producir en forma de cadenas sencillas o cadenas asociadas. Los polipéptidos de la invención pueden estar glicosilados naturalmente o de forma no natural (es decir, el polipéptido tiene un patrón de glicosilación que difiere del patrón de glicosilación hallado en el correspondiente polipéptido natural).

Los mutantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales de modo que alteran un sitio de glicosilación, un sitio de fosforilación o un sitio de acetilación, o para minimizar el plegamiento erróneo mediante sustitución o deleción de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para el funcionamiento. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquéllas que conservan la carga general, la hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o el volumen estérico del aminoácido sustituido. Se pueden diseñar variantes de modo que conserven o tengan mayor actividad biológica de una región concreta del polipéptido (p. ej., un dominio funcional y/o, cuando el polipéptido es un miembro de una familia de polipéptidos, una región asociada con una secuencia consenso). La selección de alteraciones para la producción de variantes se puede basar en la accesibilidad (interior frente a exterior) del aminoácido (p. ej., ref. 33), la termoestabilidad del polipéptido variante (p. ej., ref. 34), los sitios de glicosilación deseados (p. ej., la ref. 35), los puentes disulfuro deseados (p. ej., ref. 36 y 37), los sitios de unión metálica deseados (p. ej., ref. 38 y 39) y las sustituciones deseadas en los bucles de prolina

(p. ej., ref. 40). Las muteínas sin cisteína se pueden producir como se divulga en la referencia 41.

C.4 – Materiales de anticuerpos

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y se pueden producir por cualquier medio adecuado (p. ej., mediante expresión recombinante).

Los anticuerpos pueden incluir un marcador. El marcador puede ser detectable directamente, tal como un marcador radioactivo o fluorescente.

Como alternativa, el marcador puede ser detectable indirectamente, tal como una enzima cuyos productos son detectables (p. ej., luciferasa, ß-galactosidasa, peroxidasa etc.).

Los anticuerpos se pueden fijar a un soporte sólido.

Los anticuerpos se preparan administrando (p. ej., inyectando) a un animal adecuado (p. ej., un conejo, un hámster un ratón u otro roedor) un polipéptido de la invención.

Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos incluyen de Fv, scFv, Fc, Fab, F(ab’)2 etc.

Para aumentar la compatibilidad con el sistema inmunitario humano, los anticuerpos pueden ser quiméricos o humanizados [p. ej., referencias 42 y 43], o se pueden usar anticuerpos completamente humanos. Dado que los anticuerpos humanizados son mucho menos inmunogénicos en seres humanos que los anticuerpos monoclonales no humanos originales, se pueden usar para el tratamiento de seres humanos con un riesgo mucho menor de anafilaxia. Por tanto, estos anticuerpos pueden ser preferibles en aplicaciones terapéuticas que implican administración in vivo a un ser humano, tal como el uso como sensibilizadores de radiación para el tratamiento de la enfermedad neoplásica o uso en procedimientos para reducir los efectos secundarios del tratamiento para el cáncer.

Los anticuerpos humanizados se pueden conseguir mediante diversos procedimientos, incluidos, por ejemplo:

(1) injertar regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas sobre una estructura y una región constante humanas (“humanizar”) con la transferencia opcional de uno o más restos estructurales del anticuerpo no humano (2) transplantar todos los dominios variables no humanos pero “cubriéndolos" con una superficie de tipo humano mediante la sustitución de residuos superficiales ("inactivado"). En la presente invención, los anticuerpos humanizados incluirán anticuerpos tanto “humanizados” como “inactivados”. [44, 45, 46, 47, 48, 49, 50].

Las CDR son secuencias de aminoácidos que, en conjunto, definen la afinidad de unión y la especificidad de una región Fv de un sitio de unión de la inmunoglobulina nativa [p.ej. referencias 51 y 52].

El término “región constante” se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. En los anticuerpos quiméricos, las regiones constantes de ratón están sustituidas por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de anticuerpos humanizados derivan de inmunoglobulinas humanas. La región constante de la cadena pesada se puede seleccionar de cualquiera de los 5 isotipos: alfa, delta, epsilon, gamma o mu.

Un procedimiento de humanizar anticuerpos comprende alinear las secuencias de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo no humano con las secuencias de las cadenas pesada y ligera humanas, sustituyendo los residuos estructurales no humanos con residuos estructurales humanos en base a dicho alineamiento, modelado molecular de la conformación de la secuencia humanizada en comparación con la conformación del anticuerpo parental no humano y retromutación repetida de residuos en la región estructural que altera la estructura de los CDR no humanos hasta que la conformación predicha de las CDR en el modelo de secuencia humanizada se aproxima a la conformación de las CDR no humanas del anticuerpo parental no humano. Dichos anticuerpos humanizados pueden derivarse además para facilitar la captación y aclaramiento, por ejemplo mediante receptores de Ashwell. [referencias 53 y 54]

También se pueden producir anticuerpos humanizados o completamente humanos usando animales transgénicos que se someten a ingeniería genética para introducir loci de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, la referencia 55 divulga animales transgénicos que tienen un locus de Ig humana en el que los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de loci de las cadenas pesada y ligera. La Ref. 56 también divulga huéspedes de mamíferos no primates transgénicos capaces de generar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, en el que los anticuerpos tienen regiones variables y/o constantes de primates y en el que los loci de codificación de inmunoglobulinas endógenas están sustituidos o inactivados. La Ref. 57 divulga huéspedes mamíferos no humanos que tienen loci de Ig endógenas inactivados y loci de Ig humanas funcionales. La Ref. 59 divulga procedimientos de producir ratones transgénicos en los que los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas y expresan un locus de inmunoglobulina exógena que comprende una o más regiones constantes xenogeneicas.

Usando un animal transgénico descrito en lo que antecede se puede producir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de PCAV y se puede extraer del animal las células productoras de anticuerpos y usarlas para producir hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales humanos. En la técnica se conocen los protocolos de inmunización, adyuvantes y similares, y se usan en la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en la referencia 60. Los anticuerpos monoclonales se pueden someter a ensayo para determinar la capacidad para inhibir o neutralizar la actividad biológica o el efecto fisiológico del correspondiente polipéptido.

D – COMPARACIÓN CON LAS MUESTRAS CONTROL D.1 – El control

Los tránscritos de HLM-2 están regulados por aumento en los tumores, incluidos los tumores de próstata. Para detectar dicha regulación por aumento se necesita un punto de referencia, es decir un control. El análisis de la muestra control proporciona un nivel estándar de expresión de ARN y/o de la proteína frente a la que se puede comparar una muestra del paciente.

Un control negativo proporciona un nivel de fondo o basal de expresión frente a la cual se puede comparar la muestra del paciente. Niveles mayores del producto de expresión en relación con un control negativo indican que el paciente del que se extrajo la muestra tiene, por ejemplo, cáncer de próstata. Típicamente, para el cáncer de próstata, por ejemplo, los controles negativos incluirían niveles basales durante toda la vida de expresión o el nivel de expresión observado en los pacientes normales. Por el contrario, niveles equivalentes de producto de expresión indican que el paciente no tiene un cáncer relacionado con HML-2.

Un control negativo proporciona un nivel de expresión frente a la cual se puede comparar la muestra del paciente. Niveles equivalentes o mayores del producto de expresión en relación con un control positivo indican que el paciente del que se extrajo la muestra tiene cáncer, tal como cáncer de próstata. Por el contrario, niveles menores del producto de expresión indican que el paciente no tiene un cáncer relacionado con HML-2, tal como cáncer de próstata.

Para la medición directa o indirecta de ARN o para la medición directa del polipéptido, un control negativo comprenderá, generalmente, células que no proceden de una célula tumoral, por ejemplo una célula de tumor de próstata. Para la medición indirecta del polipéptido, un control negativo será, generalmente, una muestra de sangre de un paciente que no tenga un tumor de próstata El control negativo podría ser una muestra del mismo paciente que la muestra del paciente, pero de un tejido en el que la expresión de HML-2 no está regulada por aumento, por ejemplo una célula no tumoral no prostática. El control negativo podría ser una célula de próstata del mismo paciente que la muestra del paciente pero tomada en un estadio anterior de la vida del paciente. El control negativo podría ser una célula de un paciente sin un tumor de próstata. Esta célula puede ser o no una célula de próstata. La célula control negativo podría ser una célula de próstata de un paciente con HPB.

Para la medición directa o indirecta de ARN o para la medición directa del polipéptido, un control positivo comprenderá, generalmente, células de una célula tumoral, por ejemplo de un tumor de próstata. Para la medición indirecta del polipéptido, un control negativo será, generalmente, una muestra de sangre de un paciente que tenga un tumor de próstata El control positivo podría ser una célula tumoral de próstata del mismo paciente que la muestra del paciente pero tomada en un estadio anterior de la vida del paciente (p. ej., para monitorizar la remisión). El control positivo podría ser una célula de otro paciente con un tumor de próstata. El control positivo podría ser una línea celular de próstata.

Otros controles positivos y negativos adecuados serán evidentes para el experto en la técnica.

La expresión de HML-2 en el control se puede evaluar al mismo tiempo como la expresión en la muestra del paciente. Como alternativa, la expresión de HML-2 en el control se puede evaluar por separado (antes o después).

En lugar de comparar realmente dos muestras, el control puede ser un valor absoluto (es decir, un nivel de expresión que se ha determinado empíricamente a partir de muestras tomadas de pacientes con tumor de próstata

(p. ej, en condiciones estándar.

D.2 – Grado de regulación por aumento

La regulación por aumento en relación con el control (100 %) será, normalmente, de al menos el 150 % (p. ej., . 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 % mayor).

D.3 - Diagnóstico

La invención proporciona un procedimiento para diagnosticar el cáncer de próstata. Se apreciará que “diagnóstico” de acuerdo con la invención puede variar desde un diagnóstico clínico definitivo de la enfermedad hasta una indicación de que el paciente deberá someterse a más pruebas que puedan conducir a un diagnóstico definitivo. Por ejemplo, el procedimiento de la invención se puede usar como parte de un proceso de detección selectiva, sometiéndose las muestras positivas a análisis adicionales.

Además, el diagnóstico incluye monitorizar la progresión del cáncer en un paciente que ya se sabe que tiene el cáncer. También se puede determinar la etapa del cáncer mediante los procedimientos de la invención. El cáncer es cáncer de próstata.

La eficacia de un régimen de tratamiento (teramétrica) de un cáncer asociado también se puede monitorizar mediante el procedimiento de la invención, por ejemplo para determinar su eficacia.

La susceptibilidad a un cáncer también se puede detectar, por ejemplo cuando se ha producido regulación por aumento de la expresión, pero antes de que se desarrolle el cáncer. También se abarcan procedimientos pronósticos.

Todas estas técnicas entran dentro del significado general de “diagnóstico” en la presente invención.

G – LA FAMILIA DE HML-2 DE RETROVIRUS ENDÓGENOS HUMANOS

Los genomas de todos los eucariotas contienen múltiples copias de secuencias relacionadas con retrovirus infecciosos. Estos retrovirus endógenos se han estudiado bien en ratones, en los que existen formas infecciosas verdaderas y miles de elementos de tipo retrovirus defectivos (p. Ej., las familias de secuencias IAP y Etn). Algunos miembros de las familias IAP y Etn son retrotransposones “activos”, ya que se han documentado inserciones de estos elementos que producen mutaciones en la línea germinal o transformación oncogénica.

Los retrovirus endógenos se identificaron en el ADN genómico humano por su homología con los retrovirus de otros vertebrados [131, 132]. Se cree que el genoma humano contiene probablemente numerosas copias de ADN proviral endógeno, pero se sabe poco sobre su función. La mayoría de las familias de HERV tienen relativamente pocos miembros (1-50), pero una familia (HERV-H) consiste en � 1.000 copias por genoma haploide distribuido en todos los cromosomas. El gran número y la actividad transcripcional general de los HERV en las líneas celulares embrionarias y tumorales sugieren que podrían actuar como mutágenos de inserción causantes de enfermedad o afectar a la expresión del gen adyacente de un modo neutro o beneficioso.

La familia K de los retrovirus endógenos humanos (HERV-K) se conoce bien [133]. Está Relacionada con el virus del tumor de mama en ratones (MMTV) y está presente en los genomas de seres humanos, simios y monos del viejo mundo, pero varios provirus de HERV-K humanos son únicos de los seres humanos [134]. La familia de HERV-K está presente en 30-50 copias de longitud completa por genoma humano haploide y posee marcos de lectura abierta largos que potencialmente se traducen en proteínas víricas [135, 136]. Se conocen dos tipos de genomas provirales que difieren por la presencia (tipo 2) o ausencia (tipo 1) de una tira de 292 nucleótidos en el límite de solapamiento de los genes pol y env [137]. Se sabe que algunos miembros de la familia de HERV-K codifican la proteína gag y partículas retrovirales, ambos detectables en tumores de células germinales y líneas celulares derivadas [138]. El análisis del patrón de expresión del ARN de HERV-K de longitud completa también se ha identificado un ARN sometido a doble corte y empalme codifica una proteína de 105 aminoácidos denominada ORF central (’cORF’) que es un factor de exportación del ARN nuclear específico de secuencia que es funcionalmente equivalente a la proteína Rev del VIH [139]. Se ha demostrado que HERV-K10 codifica una proteína de 73 kDa homóloga de gag de longitud completa y una proteasa funcional [140].

Los pacientes que sufren tumores de células germinales muestran títulos de anticuerpos elevados contra las proteínas gag y env de HERV-K en el momento de la detección del tumor [141]. En testículos normales y tumores testiculares, la proteína de la cubierta transmembrana de HERV-K se ha detectado tanto en células germinales como en células tumorales, pero no en el tejido circundante. En el caso del tumor testicular se han comunicado correlaciones entre la expresión del ARNm específico de env, la presencia de la env transmembrana, las proteínas cORF y gag y los anticuerpos contra péptidos específicos HERV-K en el suero de los pacientes. La referencia 142 notifica que las proteínas gag y/o env de HERV-K10 se sintetizan en células de seminoma y que los pacientes con dichos tumores exhiben títulos de anticuerpos relativamente altos contra gag y/o env.

Las proteínas gag liberadas en forma de partículas de HERV-K se han identificado en el sobrenadante de cultivos celulares de la línea celular derivada de teratocarcinoma Tera 1. Se ha demostrado que estas partículas de tipo retrovirus (denominado virus derivados de teratocarcinoma humano” o HTDV) tienen una homología de secuencia del 90 % con el genoma de HERV-K10 [138, 143].

Aunque la familia de HERV-K está presente en el genoma de cada célula humana, un nivel elevado de expresión de ARNm, proteínas y partículas se observa únicamente en líneas celulares de teratocarcinoma humano [144]. En otros tejidos y líneas celulares solo se ha demostrado un nivel basal de expresión de ARNm incluso usando procedimientos muy sensibles. La expresión de provirus retrovirales está regulada, en general, por elementos de la repetición terminal larga en 5’ (LTR). Además, la activación de la expresión de un retrovirus endógeno puede desencadenar la expresión de un gen cadena abajo que desencadena un efecto neoplásico.

Se ha descrito la secuencia de HERV-K(II), que se localiza en el cromosoma 3 [145].

HML-2 es un subgrupo de la familia HERV-K [146]. Los aislados de HERV que son miembros del subgrupo HML-2 incluyen HERV-K10 [137,142], los 27 virus HML-2 mostrados en la Figura 4 de la referencia 147, HERV-K(C7) [148], HERV-K

(II) [145], HERV-K(CH) La Tabla 11 proporciona una lista de todos los miembros conocidos del subgrupo HML-2 de la familia HERV-K determinado mediante la búsqueda en la base de datos DoubleTwist que contiene todos los cóntigos genómicos con la secuencia AF074086 usando el algoritmo de Smith-Waterman con los parámetros por defecto: Penalización por apertura de hueco = -20 y penalización por extensión = = -5.

La invención se basa en el hallazgo de que la expresión de ARNm de HML-2 está regulada por aumento en tumores de próstata. Dado que HML-2 es una familia bien reconocida, el experto podrá determinar sin dificultades si cualquier retrovirus endógenos concretos es o no un HML-2. Los miembros preferidos de la familia HML-2 para usar de acuerdo con la presente invención son aquellos cuyo genoma proviral tiene un LTR que tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 150 (la secuencia LTR de HML-2.HOM [1]). LTR de ejemplo incluyen las SEC ID 151-154.

H - HERV-K(CH)

La presente invención se basa en el descubrimiento de niveles elevados de múltiples polinucleótidos de HML-2 en muestras de tumor de próstata en comparación con el tejido prostático normal. Un HML-2 concreto cuyo ARNm se ha descubierto que está regulado por aumento se designa en el presente documento ‘HERV-K(CH)’.

Las secuencias de HERV-K(CH) se muestran en las SEC ID 14-39 y se han depositado en la ATCC (véase la Tabla 7). El experto podrá clasificar cualquier HERV adicional como HERV-K(CH) o no en base a la identidad de secuencia con estos polinucleótidos de HERV-K(CH). Preferentemente, dicha comparación es con una o más, o todas, las secuencias de polinucleótidos divulgadas en el presente documento o de los insertos de polinucleótidos en los aislados depositados en la ATCC. Como alternativa, el experto en la técnica puede determinar la identidad de secuencia en base a una comparación con uno cualquiera o más, o todas, las secuencias en las SEC ID 7-10 y las SEC ID 14.39 teniendo en cuenta la tasa de mutación espontánea con replicación retroviral. Por tanto, será evidente cuando las diferencias en las secuencias son consistentes con un asilamiento de HERV-K(CH) o consistente con otro HERV.

Por tanto, HERV-K(CH) es un miembro específico del subgrupo HML-2 que se puede usar en la invención como se ha descrito con anterioridad. También se puede usar en procedimientos descritos anteriormente en relación con HERV-K, por ejemplo el diagnóstico de cáncer testicular [142], enfermedades autoinmunitarias, esclerosis múltiple [149], diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) [150] etc.

H.1-Ácidos nucleicos de HERV-K(CH)

H.1.1-Secuencias genómicas de HMV-K(CH)

La divulgación proporciona un polinucleótido aislado, que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos de cualquier SEC ID 7-10; (b) la secuencia de nucleótidos de cualquier SEC ID 27-39; (c) la complementaria de una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEC ID 7-10; o (d) la complementaria de una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEC ID 27-39.

H.1.2 –Fragmentos de HERV-K(CH)

La divulgación proporciona también un polinucleótido aislado, que comprende un fragmento de: (a) una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; (b) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39; (c) la complementaria de una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; o (d) la complementaria de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39.

El fragmento tiene, preferentemente, una longitud de al menos x nucleótidos, en el que x es al menos 7 (p. ej., al menos 8, 9, 10,11, 12, 13, 14,15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 90,100 etc.). El valor de x puede estar entre aproximadamente 150 y aproximadamente 200 o estar entre aproximadamente 250 y aproximadamente 300. El valor de x puede ser de aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 550. aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700 o aproximadamente 750. El valor de x puede ser menos de 2.000 (p. ej., menos de 1000, 500, 100, o 50).

El fragmento no es, preferentemente, ninguna de las secuencias siguientes ni un fragmento de una de las secuencias siguientes: (i) la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID 42; (II) la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID 43; (iii) la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID 44; (iv) la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID 45; (v) un polinucleótido conocido; o (vi) un polinucleótido conocido desde el 7 de diciembre de 2000 (p. ej., un polinucleótido disponible en una base de datos pública, tal como GenBank of GeneSeq antes del 7 de diciembre de 2000).

El fragmento es, preferentemente, una secuencia contigua de uno de los polinucleótidos de (a), (b), (c) o (d) que permanece sin enmascarar tras la aplicación de un programa de enmascaramiento para enmascarar la baja complejidad (p. ej., XBLAST) con la secuencia (es decir, se seleccionará una región no enmascarada, como indican los polinucleótidos fuera de las tiras de poli-n de la secuencia enmascarada producida por el programa de enmascaramiento).

Estos polinucleótidos son particularmente útiles como sondas. En general, una sonda en la que x= 15 representa una secuencia suficiente para una identificación única. Las sondas se pueden usar para, por ejemplo, determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de la invención (o variantes del mismo) en una muestra. Usando sondas, particularmente sondas marcadas de secuencias de ADN, se pueden aislar genes homólogos o relacionados. La

fuente de genes homólogos puede ser cualquier especie, por ejemplo especies de primate, particularmente seres humanos; roedores, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; levaduras; nematodos; etc.

Las sondas de más de una secuencia de polinucleótidos de la divulgación pueden hibridar con el mismo ácido nucleico si el ácido nucleico del que derivaron corresponde a una única secuencia (p. ej., más de una pueden hibridar con un ADNc sencillo derivado del mismo ARNm).

Fragmentos preferidos (p. ej., para la identificación de polinucleótidos de HERV-K(CH) asociados con cáncer) que no corresponden de forma idéntica en su totalidad a ninguna porción de la(s) secuencia(s) mostradas en las SEC ID 42-45 son: SEC ID 59 (de la región gag), SEC ID 60-70 (de la región pol) y SEC ID 71-82 (de la región 3’ pol).

Fragmentos preferidos (p. ej., para la identificación simultánea de polinucleótidos de HERV-K(CH), polinucleótidos HERV-KII y/o polinucleótidos HERV-K10 ) que no corresponden de forma idéntica en su totalidad a ninguna porción de la(s) secuencia(s) mostradas en las SEC ID 44 y 45 son las SEC ID 83 y 84 (de la región gag).

En la Tabla 1 se proporcionan sondas polinucleotídicas únicas de las regiones gag de HERV-K(CH), HERV-KII y HERV-K10; en la Tabla 2 se proporcionan sondas polinucleotídicas únicas de las regiones proteasa 3’ y polimerasa 5’ de HERV-K(CH), HERV-KII y HERV-K10; en la Tabla 3 se proporcionan sondas polinucleotídicas únicas de solo las regiones 3’ pol de HERV-K(CH), HERV-KII y HERV-K10.

H.1.3 –Fragmentos de HERV-K(CH) más secuencias heterólogas

La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que comprende (a) un segmento que es un fragmento de la secuencia mostrada en las SEC ID 7-10 o las SEC ID 27-39, en el que (i) dicho fragmento tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos y (ii) corresponde de forma idéntica en su totalidad a una porción de la SEC ID 44 y/o 45; y, opcionalmente, (b) uno o más segmentos que flanquean al segmento definido en (a), en el que la presencia de dicho(s) segmento(s) opcional(es) hace que dicho polinucleótido no corresponda de forma idéntica a ninguna porción de una secuencia mostrada en las SEC ID 7-10 o las SEC ID 27-39. En algunas realizaciones, los segmentos flanqueantes opcionales comparten menos del 40 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico mostradas en las SEC ID 7-10, SEC ID 44 y/o SEC ID 45. En otras realizaciones, los segmentos flanqueantes opcionales no tienen secuencia contigua de 10, 12, 15 o 20 nucleótidos en común con las SEC ID SEC ID 7-10, SEC ID 44 y/o SEC ID 45. En otras realizaciones más, el segmento flanqueante opcional no está presente. En realizaciones adicionales, un fragmento de la secuencia polinucleotídica tiene una longitud de hasta 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000 o 1.500 nucleótidos.

La divulgación proporciona también un polinucleótido aislado que tiene la fórmula 5’-A-B-C-3’, en la que: A es una secuencia de nucleótidos que consiste en a nucleótidos; B es una secuencia de nucleótidos que consiste en un fragmento de b nucleótidos de (i) la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; (ii) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39, (iii) la complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10, o (iv) la complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39; C es una secuencia de nucleótidos que consiste en c nucleótidos; y en el que dicho polinucleótido no es un fragmento de (i) la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10, (ii) secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39, (iii) la complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10, o (iv) la complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39.

En este polinucleótido, a+c es al menos 1 (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.) y b es al menos 7 (p. ej., al menos , 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). Se prefiere que el valor de a+b+c sea al menos 9 (p. ej., al menos 10, 11,12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). Se prefiere que el valor de a+b+c sea como máximo 200 (p. ej., como máximo 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9).

A y/o C pueden comprender una secuencia promotora (o su complementaria).

H.1.4 –Secuencias homólogas

También se proporciona un polinucleótido que tiene una identidad de al menos s % con; (a) SEC ID 7-10; (b) un fragmento de x nucleótidos de las SEC ID 7-10; (c) SEC ID 11-13; (b) un fragmento de x nucleótidos de las SEC ID 11-13. El valor de s es al menos 50 (p. ej., al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 9S, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 etc.). El valor de x es al menos 7 (p. ej., 8, 9, 10,11, 12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.).

Estos polinucleótidos incluyen variantes naturales (p. ej., variantes degeneradas, variantes alélicas etc.), homólogos, ortólogos y mutantes funcionales.

Las variantes se pueden identificar mediante hibridación de supuestas variantes con las secuencias de

polinucleótidos divulgadas en las SEC ID 14-39 en el presente documento, preferentemente mediante hibridación en condiciones rigurosas. Por ejemplo, usando condiciones de lavado adecuadas, las variantes se pueden identificar cuando la variante alélicas exhibe como máximo aproximadamente un 25-30 % de apareamientos erróneos de pares de bases (pb) respecto a la sonda polinucleotídica seleccionada. En general, las variantes alélicas contienen un 1525 % de apareamientos erróneos de pb y pueden contener tan poco como incluso un 5-15 % o 2-5 % o 1-2 % de apareamientos erróneos de pb, así como un único apareamiento erróneo de pb.

La divulgación también abarca homólogos correspondientes a una cualquiera de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento, cuando la fuente de genes homólogos puede ser cualquier especie de mamífero (p. ej., especie de primate, en particular un ser humano; roedores, tales como ratas, etc.). Entre las especies de mamífero (p. ej., ser humano y primate), los homólogos generalmente tienen una similitud de secuencia sustancial (p. ej., una identidad de secuencia de al menos un 75 %, normalmente de al menos un 90 %, más normalmente de al menos un 95 %) entre secuencias nucleotídicas. La similitud de secuencia se calcula en base a una secuencia de referencia, que puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, tal como un motivo conservado, una región de codificación, región flanqueante, dominio etc. Normalmente, una secuencia de referencia tendrá una longitud de 18 nucleótidos contiguos, más normalmente una longitud de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, y se puede extender a la secuencia completa que se está comparando. En la técnica se conocen algoritmos para el análisis de la secuencia.

Un aislado preferido de HERV-K(CH) es una secuencia del aislado que se muestra en las SEC ID 7-10. Otra clase preferida de aislados de HERV-K(CH) son los que tienen una identidad de secuencia nucleotídica de al menos 90 %, preferentemente al menos 95 % con la región de 3’ polimerasa mostrada en la SEC ID 13 que se relaciona con la integrasa, medido mediante el programa de alineación GCG Gap (Suite Versión 10.1) usando los parámetros por defecto: Apertura de hueco= 3 y extensión de hueco = 1. Otra clase preferida de aislados de HERV-K(CH) son los que tienen una identidad de secuencia nucleotídica de al menos 98 %, más preferentemente de al menos 99 % con la región de 5’ polimerasa mostrada en la SEC ID 12 que se relaciona con la transcriptasa inversa, medido mediante el programa de alineación GCG Gap (Suite Versión 10.1) usando los parámetros por defecto: Apertura de hueco= 3 y extensión de hueco= 1. Otra clasificación típica de la relación de los retrovirus se basa en las similitudes de la secuencias de aminoácidos en la proteína transcriptasa inversa. Por tanto, una clase todavía más preferida de aislados de HERV-K(CH) son los que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 90 %, más preferentemente 95 % con la región 5’ polimerasa codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID 12, determinado mediante el algoritmo de búsqueda de homologías de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de apertura de 2, matriz BLOSUM de 62. Por tanto, estas secuencias de polinucleótidos asociadas con el cáncer de próstata definen una clase de retrovirus endógenos humanos designados en el presente documento HERV-K(CH), cuyos miembros comprenden variaciones que, sin desear quedar ligado a teoría alguna, se pueden deber a la presencia de polimorfismos o variaciones alélicas.

H.1.5 –Secuencias hibridables de HERV-K(H)

Se divulga un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que hibrida de forma selectiva, respecto a un polinucleótido conocido, con: (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; (b) la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 27-39; (c) la complementaria de la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; (d) la complementaria de la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 27-39; (e) un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; (f) un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID 27-39; (g) la complementaria de un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 7-10; (h) la complementaria de un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquier de las SEC ID 27-39; (j) una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEC ID 14-39; o (k) polinucleótidos encontrados en los depósitos de la ATCC que tienen números de registro en la ATCC proporcionados en la Tabla 7. El fragmento de (e), (f), (g) o (h) tiene, preferentemente, una longitud de al menos x nucleótidos, en el que x es como se ha definido en H.1.2 anteriormente y preferentemente no es una de las secuencias (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi) como se ha definido en H.1.2 anteriormente H.1.2.

Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de “rigurosidad” diferentes, como se ha descrito en

B.4 anteriormente. En algunas realizaciones, el polinucleótido hibrida en condiciones de rigurosidad baja; en otras realizaciones hibrida en condiciones de rigurosidad intermedia; en otras realizaciones hibrida en condiciones de rigurosidad alta.

H.1.6 –Secuencias de HERV-K depositadas

También se divulga un polinucleótido aislado, que comprende: (a) un inserto de ADNc de HERV-K(CH) como se ha depositado en la ATCC y que tiene un número de registro ATCC proporcionado en la Tabla 7; (b) una secuencia de HERV-K(CH) como se muestra en una cualquiera de las SEC ID 14-26; (c) una secuencia HERV-K(CH) como se muestra en una cualquiera de las SEC ID 27-39; o (d) un fragmento de (a), (b) o (c). El fragmento de (d) tiene, preferentemente, una longitud de al menos x nucleótidos, en el que x es al menos 7 (p. ej., al menos , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.).

H.1.7 –Secuencias de HERV-K(CH) preferidas

Los polinucleótidos preferidos son aquellos que tienen una secuencia expuesta en una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos SEC ID 7-10 y las SEC ID 14-39 proporcionadas en el presente documento; los polinucleótidos obtenidos de los materiales biológicos descritos en el presente documento, en particular las secuencias de polinucleótidos presentes en los aislados depositados en la ATCC y que tienen los números de registro en la ATCC proporcionados en la Tabla 7 u otras fuentes biológicas (particularmente fuentes humanas) o mediante hibridación con las secuencias mencionadas anteriormente en condiciones rigurosas (particularmente condiciones de rigurosidad alta); genes correspondientes a los polinucleótidos proporcionados; variantes de los polinucleótidos proporcionados y sus correspondientes genes, particularmente las variantes que conservan una actividad biológica del producto génico codificado (p. ej., una actividad biológica atribuida a un producto génico correspondiente a los polinucleótidos proporcionados como resultado de la asignación del producto génico a una(s) familia(s) de proteínas y/o la identificación de un dominio funcional presente en el producto génico). Otros polinucleótidos y composiciones de polinucleótidos contempladas por y dentro del alcance de la divulgación serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica cuando se proporcionan con la divulgación del presente documento.

H.1.8 –Características generales de polinucleótidos

Las características generales de los polinucleótidos descritos en esta sección H.1 son las mismas que las descritas en la sección B.4 anterior.

Los polinucleótidos aislados comprenden, preferentemente, un polinucleótido que tiene una secuencia de HERV-K(CH).

Un polinucleótido puede codificar todo o parte de un polipéptido, tal como la región gag, región 5’ pol o región 3’ pol de un retrovirus endógeno humano. Se pueden obtener fragmentos de una o de dos hebras a partir de la secuencia de ADN mediante síntesis química de oligonucleótidos de acuerdo con procedimientos convencionales, mediante digestión con enzimas de restricción, mediante amplificación por PCR etc.

Los polinucleótidos pueden ser ADNc o ADN genómicos, así como fragmentos de los mismos, en particular fragmentos que codifican un producto génico biológicamente activo y/o son útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento (p. ej., en el diagnóstico como identificador único de un gen de interés expresado de forma diferencial etc.). El término “ADNc”, como se usa en el presente documento, se pretende que incluya todos los ácidos nucleicos que comparten la organización de los elementos de secuencia encontrados en la especie de ARNm madura nativa, en la que los elementos de secuencia son exones y regiones 3’ y 5’ no codificantes. Normalmente, las especies de ARNm tienen exones contiguos, con los intrones intermedios, cuando están presentes, que s eliminan mediante corte y empalme del ARN nuclear, para crear un marco de lectura abierto continuo que codifica un polipéptido. También pueden existir especies de ARNm con exones e intrones, en la que los intrones se pueden eliminar mediante corte y empalme alternativos. Además, cabe destacar que diferentes especies de ARNm codificado por la misma secuencia genómica pueden existir a niveles variables en una célula y la detección de estos diversos niveles de especies de ARNm puede ser indicativa de una expresión diferencial del producto génico codificado en la célula.

Una secuencia genómica de interés comprende el ácido nucleico presente entre el codón de iniciación y el codón de terminación como se define en las secuencias enumeradas, incluidos todos los intrones que normalmente están presentes en un cromosoma nativo. También puede incluir las regiones 3’ y 5’ no traducidas que se encuentran en el ARNm maduro. Puede además incluir secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción, tales como promotores, potenciadores, etc., incluidos aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, del ADN genómico flanqueante en cualquiera de los extremos 5’ y 3’ de la región transcrita. El ADN genómico se puede aislar como un fragmento de 100 kpb o menor, y sustancialmente libre de una secuencia cromosómica flanqueante. El ADN genómico que flanquea la región de codificación, cualquiera en 3’ y 5’, o las secuencias reguladoras internas como en ocasiones se encuentran en los intrones, contiene secuencias necesarias para la adecuada expresión específica de tejido, específica de estadio o específica de estadio de la enfermedad.

Los polinucleótidos se pueden proporcionar como moléculas lineales o dentro de moléculas circulares y se pueden proporcionar dentro de moléculas de replicación autónoma (vectores) o dentro de moléculas sin secuencias de replicación. La expresión de los polinucleótidos puede estar regulada por ellos mismos o por otras secuencias reguladoras conocidas en la técnica. Los polinucleótidos se pueden introducir en células huésped adecuados usando diversas técnicas disponibles en la materia, tales como transferencia de ADN mediada por policationes transferrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, transferencia de ADN mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas con ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, pistola génica, transfección mediada por fosfato cálcico y similares.

Una secuencia de polinucleótidos que se “muestra” o “representa” en una SEC ID Nº o Figura significa que la secuencia está presente como secuencia contigua idéntica en la SEC ID Nº o Figura. El término abarca porciones o regiones de la SEC ID Nº o la Figura, así como toda la secuencia contenida dentro de la SEC ID Nº o la Figura.

H.2 –Polipéptidos de HERV-K(CH)

H.2.1-Marcos de lectura abiertos de HERV-K(CH)

Se divulga un polipéptido aislado: (a) codificado dentro de un marco de lectura abierto de HEPV-K(CH); (b) codificado por un polinucleótido mostrado en las SEC ID 11, 12 o 13; o (c) que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de las SEC ID 46-49, 50-55, 56-57 o 58.

Los polipéptidos deducidos codificados por los polinucleótidos de HERV-K(CH) incluyen las traducciones de gaga mostradas en las SEC ID 46-49 y las traducciones de 3’ pol mostradas en las SEC ID 50-55. Una secuencia polipeptídica codificada por el polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID 15 se proporciona en la SEC ID 56; una secuencia polipeptídica codificada por el polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID 14 se muestra en la SEC ID 57. Una secuencia consenso del polipéptido 3’ pol codificada por los polinucleótidos que tienen la secuencia mostrada en las SEC ID 21-27, incluidas, se proporciona en la SEC ID 58.

Los polipéptidos abarcados por la presente divulgación incluyen los codificados por los polinucleótidos de la divulgación, por ejemplo las SEC ID 7-10 y las SEC ID 14-39, así como los polinucleótidos depositados en la ATCC como se divulga en el presente documento, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no tienen una secuencia idéntica a los polinucleótidos divulgados y codifican los polipéptidos. Por tanto, la divulgación incluye dentro de su alcance un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de una cualquiera de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento, o una variante de la misma.

Aunque se observa sobreexpresión de los polinucleótidos asociados con el tumor de próstata, niveles elevados de expresión de los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos pueden, probablemente, desempeñar un papel en los tumores de próstata.

Típicamente, en retrovirus, se sintetiza un único polipéptido gag grande (p. ej., una proteína gag de 73 kDa en HERVK10) que después se escinde en múltiples péptidos funcionales mediante una proteasa funcional codificada por la región pol o proteasa del genoma. La sobreexpresión de secuencias correspondientes a los dominios gag y pol del HERVK(CH) sugiere dicho mecanismo. Las secuencias correspondientes a la región cORF de la proteína de transporte de ARN nuclear y env del genoma de HERV-K(CH) también se pueden sobreexpresar. Los polipéptidos codificados por los marcos de lectura abiertos dentro de las secuencias de polinucleótidos sobreexpresadas pueden desempeñar un papel significativo en la progresión de los tumores de próstata.

La detección de estos polipéptidos mediante anticuerpos u otros reactivos que los reconocen específicamente pueden ayudar al diagnóstico precoz del tumor de próstata o de cualquier otro cáncer asociado con la sobreexpresión de estas secuencias de HERV-K(CH).

H.2.2 –Fragmentos de HERV-K(CH)

Se divulga un polipéptido aislado que comprende un fragmento de: (a) una secuencia polipeptídica codificada dentro de un marco de lectura abierto de HEPV-K(CH); (b) una secuencia polipeptídica codificada por un polinucleótido mostrado en las SEC ID 11, 12 o 13; o (c) una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de las SEC ID 46-49, 50-55, 56-57 o 58.

El fragmento tiene, preferentemente, una longitud de al menos x aminoácidos, en el que x es al menos 5 (p. ej., al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500 o más etc.). El valor de x típicamente no superará 1.000. El fragmento puede incluir un epítopo, por ejemplo un epítopo de la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID 56, 57 o 58.

Las SEC ID 46 - 49 proporcionan una traducción de los polinucleótidos de HERV - K(CH) que tienen una secuencia mostrada en las SEC ID 14, 15, 16 y 40 (la secuencia de la SEC ID 40 es de un polinucleótido encontrado en una biblioteca prostática normal) correspondiente a los polinucleótidos que codifican la región gag. Las SEC ID 50-55 proporcionan una traducción de los polinucleótidos de HERV - K(CH) que tienen una secuencia mostrada en las SEC ID 21-26, incluidas, correspondiente a la región 3’ de pol. Las SEC ID 56 y 57 proporcionan traducciones del polinucleótido del HERV - K(CH) de SEC ID 15 y la SEC ID 14, respectivamente. La SEC ID 58 proporciona una traducción consenso del polinucleótido de la región 3’ pol (SEC ID 21-26, incluidas). Abarcados dentro de la presente divulgación están fragmentos polipeptídicos, tales como, epítopos, de al menos 5 aminoácidos, al menos 6 aminoácidos, al menos 8 aminoácidos, al menos 10 aminoácidos, al menos 11 aminoácidos, al menos 12 aminoácidos, al menos 13 aminoácidos, al menos 14 aminoácidos y al menos 15 aminoácidos de las traducciones mostradas en las SEC ID 46 – 49 y 50 – 55. En una realización preferida, los epítopos de HERV - K(CH) de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEC ID 56 – 58 se determinaron mediante el índice antigénico de Jameson – Wolf.

Mediante el algoritmo de Jameson - Wolf se determinó que las regiones siguientes en 3’ pol (SEC ID 58) eran antigénicas: Aminoácidos: 1 - 10; 15 - 35; 45 - 55; 60 - 85; 100 - 115; 125 - 140; 170 - 190; 195 - 215; 230 - 268. Fragmentos adicionales que contienen epítopos incluyen los aminoácidos 1 - 8; 2 - 10; 1 - 15; 5 - 15; 7 - 15; 10 - 20;

12 - 20; 15 - 23; 20 - 28; 28 - 35; 15 - 30; 15 - 40; 20 - 30; 45 - 52; 48 - 55; 60 - 68; 60 - 70; 65 - 73; 70 - 78; 75 - 83; 70 - 80;65 - 75; 68 - 75; 75 - 85; 78 - 85; 65 - 85; 60 - 75; 100 - 108; 103 - 110; 105 - 113; 108 - 115; 125 - 133; 128 135; 132 - 140; 170 - 178; 175 - 182; 180 - 187; 182 - 190; 195 - 202; 200 - 208; 205 - 212; 208 - 215; 230 - 237; 235

-: 242; 240 - 247; 245 - 252; 250 - 257; 255 - 262; 260 - 268; 230 - 250; 235 - 255; 240 - 260; 245 - 268; 230 - 245; 235 - 245; 235 - 250; 240 - 255; 245 - 260; 250 - 268; 15 - 55; 170 - 215; 45 - 85.

Mediante el algoritmo de Jameson - Wolf se determinó que las regiones siguientes en gag (SEC ID 56) eran antigénicas: aminoácidos: 1-40; 45-60; 80-105; 130-145; 147-183; 186-220; 245-253; 255-288. Fragmentos adicionales que contienen epítopos incluyen los aminoácidos 1 - 8; 2 - 10; 1 - 15; 5 - 15; 7 - 15; 10 - 20; 12 - 20; 15 23; 20 - 28; 28 - 35; 30 - 37; 33 - 40; 1 - 20; 20 - 40; 1 - 15; 15 - 30; 15 - 40; 45 - 52; 50 - 57; 55 - 62; 50 - 60; 1 - 60; 80 - 87; 85 - 92; 80 - 90; 90 - 97; 95 - 102; 98 - 105; 85 - 100; 90 - 105; 80 - 100; 85 - 105; 130 - 137; 135 - 142; 140 147; 145 - 152; 150 - 157; 155 - 162; 160 - 167; 165 - 172; 170 - 177; 175 - 183; 180 - 187; 185 - 192; 190 - 197; 195

-: 202; 200 - 207; 205 - 212; 210 - 217; 213 - 220; 185 - 220; 190 - 220; 195 - 220; 200 - 220; 205 - 220; 255 - 262; 260 - 267; 265 - 272; 270 - 277; 275 - 282; 280 - 288; 245 - 288; 250 - 288; 260 - 288; 265 - 288; 270 - 288.

Mediante el algoritmo de Jameson - Wolf se determinó que las regiones siguientes en gag (SEC ID 57) eran antigénicas: aminoácidos: 1 - 40; 80 - 105; 145 - 180; 185 - 225; 240 - 335. Fragmentos adicionales que contienen epítopos incluyen los aminoácidos 1 - 8; 2 - 10; 1 - 15; 5 - 15; 7 - 15; 10 - 20; 12 - 20; 15 - 23; 20 - 28; 28 - 35; 30 - 37; 33 - 40; 1 - 20; 20 - 40; 1 - 15; 15 - 30; 15 - 40; 80 - 87; 85 - 92; 80 - 90; 90 - 97; 95 - 102; 98 - 105; 85 - 100; 90 105; 80 - 100; 85 - 105; 145 - 152; 150 - 157; 155 - 162; 160 - 167; 165 - 172; 170 - 177; 175 - 182; 180 - 187; 185 192; 190 - 197; 195 - 202; 200 - 207; 205 - 212; 210 - 217; 215 - 212; 218 - 225; 145 - 160; 150 - 165; 155 - 170; 160

-: 175; 170 - 185; 180 - 225; 185 - 225; 190 - 225; 195 - 225; 200 - 225; 205 - 225; 210 - 225; 215 - 225; 240 - 247; 245 - 252; 250 - 257; 255 - 262; 260 - 267; 265 - 272; 270 - 277; 275 - 282; 280 - 287; 285 - 292; 290 - 297; 295 - 302; 300 - 307; 305 - 312; 310 - 317; 315 - 322; 320 - 327; 325 - 332; 328 - 335; 245 - 285; 250 - 285; 260 - 285; 265

-: 285; 270 - 295; 275 - 300; 280 - 305; 285 - 310; 295 - 315; 300 - 320; 305 - 325; 325 - 335; 245 - 335; 250 - 335; 255 - 335; 260 - 335; 270 - 335; 275 - 335; 280 - 335; 285 - 335; 290 - 335; 295 - 335; 305 - 335; 310 - 335; 315 - 335; 320 - 335.

H.2.3 –Fragmentos de HERV-K(CH) más secuencias heterólogas

También se divulga un polipéptido aislado que tiene la fórmula 5’-A-B-C-3’, en la que: A es una secuencia de aminoácidos que consiste en aminoácidos a; B es una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de aminoácidos b de (i) la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido mostrado en las SEC ID 11, 12 o 13; (ii) una cualquiera de las SEC ID 46-49, 50-55, 56-57 o 58; C es una secuencia de aminoácidos que consiste en aminoácidos c; y en la que dicho polipéptido no es un fragmento de la secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii).

En este polipéptido, a+c es al menos 1 (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11, 12,13,14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.) y b es al menos 7 (p. ej., al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). Se prefiere que el valor de a+b+c sea al menos 9 (p. ej., al menos 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). Se prefiere que el valor de a+b+c sea como máximo 200 (p. ej., como máximo 190, 180, 170, 160.150, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9).

H.2.4 –Secuencias homólogas

También se divulga un polipéptido que tiene una identidad de al menos s % con: (a) las secuencias polipeptídicas codificadas por las SEC ID 7-45; (b) un fragmento de x aminoácidos de las secuencias polipeptídicas codificadas por las SEC ID 7-45; (c) las secuencias polipeptídicas SEC ID 46-58; (d) un fragmento de x aminoácidos de las secuencias polipeptídicas SEC ID 46-58. El valor de s es al menos 35 (p. ej., al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 etc.). El valor de x es al menos 7 (p. ej., 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100.

Estos polipéptidos incluyen variantes naturales (p. ej., variantes alélicas etc.), homólogos, ortólogos y mutantes funcionales.

Variantes de los polipéptidos naturales, en las que dichas variantes son homólogas o sustancialmente similares al polipéptido natural, pueden ser de un origen de la misma especie o de una diferente que el polipéptido natural (p. ej., humano, murino o alguna otra especie que exprese de forma natural el polipéptido citado, normalmente una especie de mamífero). Estas variantes polipeptídicas están codificadas por polinucleótidos y el código genético se puede usar para seleccionar los codones adecuados para construir las correspondientes variantes.

H.2.5 –Secuencias de HERV-K(CH) preferidas

Los polipéptidos, como los mostrados en las SEC ID 46-58, codificados por los polinucleótidos de HERV-K(CH) se expresan de forma diferencial en células de cáncer de próstata. Dichos polipéptidos se denominan en el presente documento “polipéptidos asociados con cáncer de próstata” o “polipéptidos de HERV-K(CH)”. Los polipéptidos se pueden usar para generar anticuerpos específicos de un polipéptido asociado con cáncer de próstata, anticuerpos

que a su vez son útiles en procedimientos diagnósticos, procedimientos pronósticos, procedimientos teramétricos y similares, como se trata con más detalle en el presente documento. Los polipéptidos también son útiles como dianas para intervención terapéutica, como se trata con más detalle en el presente documento.

H.2.6 –Características generales de los polipéptidos

Las características generales de los polipéptidos descritos en esta sección H.2 son las mismas que las descritas en la sección C.3 anterior.

Los polipéptidos aislados comprenden, preferentemente, un polipéptido que tiene una secuencia de HERV-K(CH).

Los polipéptidos, tales como los polipéptidos de las regiones gag o los polipéptidos de las regiones pol, codificados por los polinucleótidos divulgados en el presente documento, tal como los polinucleótidos que tienen las secuencias como se muestra en las SEC ID 7-10 y las SEC ID 14-39 y en los aislados depositados con la ATCC y que tienen números de registro en la ATCC proporcionados en la Tabla 7 y/o sus correspondientes genes de longitud completa, se pueden usar para cribar bibliotecas peptídicas para identificar las parejas de unión, tales como receptores, de entre los polipéptidos codificados. Las bibliotecas peptídicas se pueden sintetizar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica (p. ej., véase, las referencias 151 y 152).

En general, el término “polipéptido”, como se usa en el presente documento, se refiere al polipéptido de longitud completa codificado por el polinucleótido citado, el polipéptido codificado por el gen representado por el polinucleótido citado, así como porciones o fragmentos de los mismos.

Una secuencia polipeptídica que se “muestra en” o “representa en” una SEC ID Nº o Figura significa que la secuencia está presente como secuencia contigua idéntica en la SEC ID Nº o Figura. El término abarca porciones o regiones de la SEC ID Nº o la Figura, así como toda la secuencia contenida dentro de la SEC ID Nº o la Figura.

H.3 –Anticuerpos anti-HERV-K(CH)

La presente divulgación también proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un polipéptido divulgado en el presente documento. La presente divulgación también proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un polipéptido codificado por un polinucleótido divulgado en el presente documento. La presente divulgación también proporciona anticuerpos aislados que se unen a un polipéptido, un fragmento de unión a antígeno de los mismos, codificados por un polinucleótido fabricado mediante el procedimiento que comprende las etapas siguientes i) inmunizar un animal huésped co una composición que comprende dicho polipéptido, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y ii) recolectar las células de dicho huésped que expresa anticuerpos contra el antígeno o fragmento de unión a antígeno de los mismos. También se proporcionan anticuerpos aislados que se unen a un polipéptido, o fragmento de unión a antígeno de los mismos, codificados por un polinucleótido divulgado en el presente documento fabricados mediante el procedimiento que comprende las etapas siguientes: proporcionar una línea celular que produce un anticuerpo, en el que dicho anticuerpo se une a un polipéptido, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, codificado por un polinucleótido divulgado en el presente documento y cultivar dicha línea celular en condiciones en las que se producen dichos anticuerpos. En realizaciones adicionales, los anticuerpos se recolectan y los anticuerpos monoclonales se producen usando las células huésped recolectadas o el material genético derivado de las células huésped recolectadas. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En una realización adicional, el anticuerpo se une a una superficie sólida o comprende además un marcador detectable.

Los anticuerpos, pueden ser anticuerpos aislados, que se unen a un polipéptido codificado por un polinucleótido descrito en el presente documento. Los anticuerpos se pueden proporcionar en una composición que comprende el anticuerpo y un tampón y/o un s excipiente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos específicos de un polipéptido asociado con cáncer son útiles en diversos procedimientos diagnósticos y terapéuticos, como se trata con detalle en el presente documento.

Los productos de expresión de un polinucleótido descrito en el presente documento, así como el correspondiente ARNm (particularmente ARNm que tienen distintas estructuras secundarias y/o terciarias), el ADNc, o el gen completo, o fragmentos de dichos productos de expresión, se pueden preparar y usar para producir anticuerpos con fines experimentales, diagnósticos y terapéuticos. Para los polinucleótidos a los que no se ha asignado un gen correspondiente, esto proporciona un procedimiento adicional de identificación del correspondiente gen. El polinucleótido o ADNc relacionado se expresa como se ha descrito anteriormente y se preparan los anticuerpos. Estos anticuerpos son específicos de un epítopo sobre el polipéptido codificado por el polinucleótido y pueden precipitar o unirse al correspondiente polipéptido nativo en una preparación celular o tisular o en un extracto acelular de un sistema de expresión in vitro.

Los anticuerpos policlonales o monoclonales frente a los polipéptidos de HERV -K(CH) o un epítopo de los mismos se pueden fabricar para usar en inmunoensayos mediante cualquiera de una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Con epítopo se hace referencia a un determinante antigénico de un polipéptido. La presencia de un epítopo se demuestra mediante la capacidad de un anticuerpo para unirse a un polipéptido con especificidad. Se considera que dos anticuerpos están dirigidos al mismo epítopo si bloquean de forma cruzada la unión del otro al

mismo polipéptido.

Un enfoque para preparar anticuerpos frente a un polipéptido es la selección y preparación de una secuencia de aminoácidos de todo o parte del polipéptido, sintetizando químicamente la secuencia e inyectándola en un animal adecuado, normalmente un conejo, un hámster o un ratón.

Los oligopéptidos se pueden seleccionar como candidatos para la producción de un anticuerpo frente al polipéptido de HERV-K(CH) en base a los oligopéptidos que residen en las regiones hidrófilas, que, por tanto, es probable que estén expuestas en el polipéptido maduro. Se pueden determinar oligopéptidos adicionales usando, por ejemplo, el índice de antigenicidad [30].

En otras realizaciones se proporcionan anticuerpos monoclonales humanizados, en los que los anticuerpos son específicos de los polipéptidos de HERV-K(CH) y no se unen de forma apreciable a otros polipéptidos de HERV. La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, normalmente un anticuerpo monoclonal de ratón. Como alternativa, un anticuerpo humanizado puede derivar de un anticuerpo quimérico que conserve o conserve sustancialmente las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo parental no humano pero que exhiben una inmunogenicidad disminuida en seres humanos en comparación con el anticuerpo parental. La expresión “anticuerpo quimérico”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que contiene la secuencia derivada de dos anticuerpos diferentes ´(véase, por ejemplo, la referencia 153), que típicamente se origina de especies diferentes. Más típicamente, los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpos murinos, generalmente las regiones variable de ratón y constante humana.

Los procedimientos para la preparación de HERV-K(CH) humano o de primate o un epítopo del mismos incluyen, entre otros, síntesis química, técnicas de ADN recombinante o aislado de muestras biológicas. La síntesis química de un péptido se puede realizar mediante, por ejemplo, el procedimiento clásico de Merrifeld de síntesis peptídica en fase sólida 154] o la estrategia FMOC en un sistema Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis E.I. du Pont de Nemours Company, Wilmington, DE) [155].

Los anticuerpos policlonales se pueden preparar inmunizando conejos u otros animales inyectando antígeno seguido de refuerzos posteriores a intervalos adecuados. Se extrae sangre de los animales y el suero se analiza contra HERV-K(CH) purificado normalmente mediante ELISA o mediante bioensayo basado en la capacidad de bloquear la acción de HERV-K(CH). Cuando se usa aves, por ejemplo pollo, pavo y similares, el anticuerpo se puede aislar de la yema del huevo. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar con el método de Milstein y Kohler fusionando esplenocitos de ratones inmunizados con células tumorales en continua replicación, tales como células de mieloma

o de linfoma. [156, 157, 158]. Las células de hibridoma formadas de este modo se clonan después mediante procedimientos de dilución límite y los sobrenadantes se someten a ensayo para determinar la producción de anticuerpos mediante ELISA, RIA o bioensayo.

La capacidad única de los anticuerpos para reconocer y unirse específicamente a los polipéptidos diana proporciona un abordaje del tratamiento de la sobreexpresión del polipéptido.

Anticuerpos específicos, bien policlonales o monoclonales, frente a los polipéptidos de HERV-K(CH) se pueden producir mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, como se ha tratado con anterioridad. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales murinos o humanos mediante tecnología del hibridoma o, como alternativa, los polipéptidos de HERV-K(CH), o un fragmento inmunológicamente activo de los mismos, o un anticuerpo antiidiotípico o un fragmento del mismo se pueden administrar a un animal para provocar la producción de anticuerpos capaces de reconocer y unirse a los polipéptidos de HERV-K(CH). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de anticuerpos incluiros, entre otos, IgG, IgA, IgM, IgD, y IgE, o, en el caso de especies de aves, IgY y de cualquier subclase de anticuerpos.

H.6- Procedimientos diagnósticos basados en HERV-K(CH)

La invención proporciona procedimientos para diagnosticar la presencia de cáncer de próstata en una muestra de ensayo asociada con la expresión de un polinucleótido en una muestra de célula de ensayo, que comprende las etapas de: i) detectar un nivel de expresión de al menos un polinucleótido de la invención, o un fragmento del mismo, o al menos un polinucleótido encontrado en un aislado seleccionado del grupo que consiste en los números de registro de la ATCC proporcionados en la Tabla 7, o un fragmento del mismo; y ii) comparar dicho nivel de expresión del polinucleótido en la muestra de ensayo con un nivel de expresión del polinucleótido en la muestra de células control, en las que la expresión diferencial del polinucleótido en la muestra de células de ensayo respecto al nivel de expresión del polinucleótido en la muestra de células control es indicativa de la presencia de cáncer en la muestra de células de ensayo.

En otras realizaciones más de la presente invención, la detección es medir el nivel de un tránscrito de ARN; medir el nivel de un polinucleótido o medir mediante un procedimiento que incluye PCR, TMA, bDNA, NAT o Nasba. En otras realizaciones, el polinucleótido está fijado a un soporte sólido.

También se divulgan composiciones que comprenden una muestra de células de ensayo y un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento. La presente invención proporciona además procedimientos para detectar

cáncer de próstata asociado con la expresión de un polipéptido en una muestra de célula de ensayo, que comprende las etapas de: i) detectar un nivel de expresión de al menos un polipéptido divulgado en el presente documento, o un fragmento del mismo o un fragmento del mismo; y ii) comparar dicho nivel de expresión del polipéptido en la muestra de ensayo con un nivel de expresión del polipéptido en la muestra de células control, en las que un nivel alterado de la expresión del polipéptido en la muestra de células de ensayo respecto al nivel de expresión del polipéptido en la muestra de células control es indicativa de la presencia de cáncer en la muestra de células de ensayo. La presente divulgación también proporciona procedimientos para detectar cáncer de próstata asociado con la presencia de un anticuerpo en una muestra de células de ensayo, que comprende las etapas de: i) detectar un nivel de un anticuerpo; y ii) comparar dicho nivel de dicho en la muestra de ensayo con un nivel de dicho anticuerpo en la muestra de células control, en las que un nivel alterado del anticuerpo en dicha muestra de células de ensayo respecto al nivel del anticuerpo en la muestra de células control es indicativo de la presencia de cáncer en la muestra de células de ensayo.

Esta divulgación también proporciona procedimientos para detectar cáncer de próstata asociado con niveles elevados de polinucleótidos de HERVK(CH), por medio de (i) detectar polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 100 % con el polinucleótido mostrado en las SEC ID 7-10 o con polinucleótidos en aislados depositados en la ATCC y que tienen números de registro en la ATCC PTA-2561, PTA2572, PTA-2566, PTA-2571, PTA-2562, PTA-2573, PTA-2560, PTA-2565, PTA-2568, PTA-2564, PTA-2569, PTA-2567, PTA-2559, PTA-2563, PTA-2570, medido mediante el programa de alineación GCG Gap (Suite Versión 10.1) usando los parámetros por defecto: Apertura de hueco = 3 y extensión de hueco = 1 o polinucleótidos que hibridan en condiciones de rigurosidad alta con el polinucleótido mostrado en las SEC ID 7-10; (ii) detectar polipéptidos, o fragmentos de los mismos, codificados por las secuencias de (i); y (iii) detectar anticuerpos específicos de uno o más de los polipéptidos. Adicionalmente, (iv) la detección de partículas asociadas con la sobreexpresión de polinucleótidos de HERV-K(CH) también se puede usar en el diagnóstico del cáncer de próstata y monitorizar su progresión.

El régimen de tratamiento de un cáncer de próstata asociado con niveles elevados de polinucleótidos de HERV-K(CH) puede también monitorizarse mediante detección de los niveles de los polinucleótidos y polipéptidos con el fin de evaluar la estadificación del cáncer y/o la eficacia de terapias concretas contra el cáncer.

La presente invención proporciona procedimientos de usar los polinucleótidos descritos en el presente documento para detectar células de cáncer de próstata, lo que facilita el diagnóstico del cáncer de próstata y la gravedad del cáncer (p. ej., el grado del tumor, la carga tumoral y similares) en un sujeto, lo que facilita una determinación del pronóstico de un sujeto, y evaluar la capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento (p. ej., proporcionando una medida del efecto terapéutico a través de, por ejemplo, evaluación de la carga tumoral durante o después de un régimen quimioterapéutico). La detección se puede basar en la detección de un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata y/o la detección de un polipéptido codificado por un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata. Los procedimientos de detección de la invención se pueden realizar in vitro o in vivo en células aisladas o en tejidos completos o un fluido corporal, por ejemplo sangre, plasma, suero, orina y similares.

Los procedimientos de detección se pueden proporcionar como parte de un kit. Por tanto, la divulgación proporciona además kits para detectar la presencia y/o un nivel de un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula cancerosa (p. ej., mediante la detección de un ARNm codificado por el gen de interés expresado de forma diferencial) y/o un polipéptido codificado en el mismo, en una muestra biológica. Los procedimientos con estos kits se pueden realizar en laboratorios clínicos, laboratorios de experimentación, practicantes médicos o individuos privados. Los kits de la divulgación para detectar un polipéptido codificado por un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata pueden comprender un resto que se une específicamente al polipéptido, que puede ser un anticuerpo que se une al polipéptido o fragmento del mismo. Los kits de la divulgación usados para detectar un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata pueden comprender un resto que hibrida específicamente con dicho polinucleótido. El kit puede proporcionar, opcionalmente, componentes adicionales que son útiles en el procedimiento, incluidos, entre otros, tampones, reactivos de desarrollo, marcadores, superficies de reacción, medios de detección, muestras control, patrones, instrucciones e información de interpretación.

De acuerdo con esto, la presente divulgación proporciona kits parra detectar cáncer de próstata, que comprenden al menos uno de los polinucleótidos que tienen la secuencia como se muestra en las SEC ID 14-39, o fragmentos de los mismos, o que tienen la secuencia que se encuentra en un aislado depositado en la ATCC y que tiene los números de registro en la ATCC PTA-2561, PTA-2572, PTA-2566, PTA-2571, PTA-2562, PTA-2573, PTA-2560, PTA-2565, PTA-2568, PTA-2564, PTA-2569, PTA-2567, PTA2559, PTA-2563, PTA-2570, o fragmentos de los mismos.

En algunas realizaciones se proporcionan procedimientos para detectar un polipéptido codificado por un gen que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata. Para la detección se puede usar cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos, incluidos, entre otros, inmunoensayo, usando anticuerpos que se unen al polipéptido, por ejemplo mediante ensayo de inmunosorción unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y similares; y ensayos funcionales para el polipéptido codificado, por ejemplo actividad de unión o actividad enzimática.

Como será fácilmente evidente para el experto en la técnica tras la lectura de la presente memoria, los procedimientos de detección y otros procedimientos descritos en el presente documento se pueden variar fácilmente. Dichas variaciones están dentro del alcance previsto de la invención. Por ejemplo, en el esquema de detección anterior, la sonda para usar en la detección se puede inmovilizar sobre un soporte sólido y la muestra de ensayo en contacto con la sonda inmovilizada. La unión de la muestra de ensayo a la sonda se puede detectar después de diversos modos, por ejemplo detectando un marcador detectable unido a la muestra de ensayo para facilitar la detección de complejos muestra de ensayo - sonda inmovilizada.

La presente invención proporciona además procedimientos para detectar la presencia y/o medir un nivel de un polipéptido en una muestra biológica, polipéptido que está codificado por un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata usando un anticuerpo específico para el polipéptido codificado. Los procedimientos generalmente comprenden: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo específico para un polipéptido codificado por un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata; y b) detectar la unión entre el anticuerpo y las moléculas de la muestra.

La detección de unión específica del anticuerpo específico del polipéptido asociado con cáncer de próstata codificado, cuando se compara con un control adecuado es una indicación de que el polipéptido codificado está presente en la muestra. Controles adecuados incluyen una muestra que se sabe que no contiene el polipéptido codificado o que se sabe que no contiene niveles elevados del polipéptido; tales como tejido prostático normal, y una muestra en contacto con un anticuerpo no específico del polipéptido codificado, por ejemplo un anticuerpo antiidiotipo. En la técnica se conocen diversos procedimientos para detectar interacciones anticuerpo-antígeno y se pueden usar en el procedimiento, incluidos, entre otros, procedimientos inmunohistológicos estándar, inmunoprecipitación, un inmunoensayo enzimático y un radioinmunoensayo. En general, el anticuerpo específico se marcará de forma detectable, directa o indirectamente. Los marcadores directos incluyen radioisótopos, enzimas cuyos productos son detectables (p. ej., luciferasa, 1-galatosidasa y similares); marcadores fluorescentes (p. ej., fluoresceína isotiocianato, rodamina, ficoeritrina y similares), metales emisores de fluorescencia, por ejemplo 152Eu u otros de la serie del lantano, unidos al anticuerpo a través de grupos quelantes de metales tales como EDTA; compuestos quimioluminiscentes, por ejemplo luminol, isoluminol, sales de acridinio y similares; compuestos bioluminiscentes, por ejemplo luciferina, acuorina (proteína fluorescente verde) y similares. El anticuerpo se puede unir (acoplar) a un soporte insoluble, tal como una placa de poliestireno o una perla. Los marcadores indirectos incluyen segundos anticuerpos específicos de anticuerpos específicos para el polipéptido codificado (“primer anticuerpo específico”, en el que el segundo anticuerpo está marcado como se ha descrito anteriormente; y miembros de pares de unión específicos, por ejemplo biotina-avidina y similares. La muestra biológica se puede poner en contacto con e inmovilizarse sobre un soporte o vehículo sólido, tal como nitrocelulosa, que es capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. Después, el soporte se puede lavar con tampones adecuados, seguido del contacto con el primer anticuerpo específico marcado de forma detectable. Los procedimientos de detección se conocen en la técnica y se elegirán según sea adecuado a la señal emitida por el marcador detectable. Generalmente la detección se realiza en comparación con controles adecuados y con patrones adecuados.

En algunas realizaciones, los procedimientos se adaptan para usar in vivo, por ejemplo para localizar o identificar sitios donde hay células cancerosas, tales como células de cáncer de próstata.

En algunas realizaciones se proporcionan procedimientos para detectar una célula cancerosa detectando la expresión en la célula de un tránscrito que se expresa de forma diferencial en una célula cancerosa. Cualquiera de varios procedimientos conocidos se puede usar para la detección, incluidos, entre otros, detección de un transcrito mediante hibridación con un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata; detección de un transcrito mediante una reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores oligonucleótidos específicos; hibridación in situ de una célula usando como sonda un polinucleótido que hibrida con un gen que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata. Los procedimientos se pueden usar para detectar y/o medir niveles de ARNm de un gen que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden: a) poner en contacto una muestra con un polinucleótido que corresponda a un gen que se expresa de forma diferencial descrito en el presente documento en condiciones que permitan la hibridación; y b) detectar la hibridación, si existe.

La detección de hibridación diferencial, cuando se compara con un control adecuado, es una indicación de la presencia en la muestra de un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer. Los controles adecuados incluyen, por ejemplo, una muestra que se sabe que no contiene un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer y el uso de un polinucleótido marcado del mismo “sentido” que el polinucleótido que se expresa de forma diferencial en la célula de cáncer. La célula de cáncer es una célula de

cáncer de próstata. En la técnica se conocen las condiciones que permiten la hibridación y se han descrito con más detalle anteriormente. La detección también se puede conseguir mediante cualquier procedimiento conocido, incluidos, entre otros, hibridación in situ, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), RT-PCR (transcripción inversa-PCR), TMA, ADNb y Nasba y transferencia de tipo “Northern” o ARN o combinaciones de estas técnicas, usando un polinucleótido marcado adecuadamente. En la técnica se conocen varios marcadores y procedimientos de marcaje para nucleótidos y se pueden usar en el ensayo. La hibridación específica se puede determinar mediante comparación con los controles adecuados.

Los polinucleótidos que comprenden generalmente al menos 10 nucleótidos, al menos 12 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos contiguos de un polinucleótido proporcionado en el presente documento, tal como, por ejemplo, los que tienen la secuencia como se representa en las SEC ID 7-10 y 3-28 se usan para diversos fines, tales como sondas para detección de, y/o medición de, los niveles de transcripción de un polinucleótido que se expresa de forma diferencial en una célula de cáncer de próstata. Una sonda que hibrida específicamente con un polinucleótido divulgado en el presente documento deberá proporcionar una señal de detección al menos 5, 0 o 20 veces mayor que la hibridación de fondo proporcionada con otras secuencias no relacionadas. Cabe destacar que con “sonda”, como se usa en el presente documento, se quiere hacer referencia a una secuencia de polinucleótidos usada para detectar un producto génico que se expresa de forma diferencial en una muestra de ensayo. Como apreciará fácilmente el experto en la técnica, la sonda se puede marcar de forma detectable y poner en contacto con, por ejemplo, una matriz que comprenda polinucleótidos inmovilizados obtenidos de una muestra de ensayo (p. ej., ARNm). Como alternativa, la sonda se puede inmovilizar en una matriz y marcar la muestra de ensayo de forma que se pueda detectar. Estas y otras variaciones de los procedimientos descritos de la invención entran dentro de la experiencia en la técnica y dentro del alcance de la invención.

Se usan sondas nucleotídicas para detectar la expresión de un gen correspondiente al polinucleótido proporcionado. En las transferencias de tipo Northern, el ARNm se separa electroforéticamente y se pone en contacto con una sonda. Una sonda se detecta cuando hibrida con una especie de ARNm de un tamaño concreto. La cantidad de hibridación se puede cuantificar para determinar las cantidades relativas de expresión, por ejemplo en una condición concreta. Las sondas se usan para la hibridación in situ con células para detectar expresión. Las sondas también se pueden usar in vivo para la detección diagnóstica de secuencias de hibridación, Las sondas se marcan normalmente con un isótopo radioactivo. Se pueden usar otros tipos de marcadores detectables tales como cromóforos, fluoróforos y enzimas. Otros ejemplos de ensayos de hibridación de nucleótidos se describen en las referencias 185 y 186.

La PCR es otro medio para detectar cantidades pequeñas de ácidos nucleicos diana (véanse, por ejemplo, las referencias 187, 188 y 189). Dos polinucleótidos cebadores que hibridan con los ácidos nucleicos diana se usan para cebar la reacción. Los cebadores pueden estar compuestos de la secuencia dentro o 3’ y 5’ con los polinucleótidos de HERV-K(CH) divulgados en el presente documento. Como alternativa, si los cebadores están en 3’ y 5’ de estos polinucleótidos no tienen que hibridar con ellos o los complementarios. Tras la amplificación de la diana con una polimerasa termoestable, los ácidos nucleicos diana amplificados se pueden detectar mediante procedimientos conocidos en la técnica (p. ej., transferencia de tipo Southern), El ARNm o el ADNc también se puede detectar mediante técnicas de transferencia tradicionales (p. ej., transferencia de tipo Southern, transferencia de tipo Northern etc.) descritas en la referencia 8 (p. ej., sin amplificación por PCR). En general, el ARNm o el ADNc generados a partir del ARNm usando una enzima polimerasa se pueden purificar y separar usando electroforesis en gel y transferir a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda marcada, se lava para eliminar cualquier sonda sin hibridar y se detectan los dúplex que contienen la sonda marcada.

Los procedimientos que usan amplificación por PCR se pueden realizar en el ADN a partir de una sola célula, aunque es conveniente usar al menos aproximadamente 105 células. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en la referencia 190 y se puede encontrar una revisión de las técnicas en las páginas 14.2 a

14.33 de la referencia 8. Se puede incluir un marcador detectable en la reacción de amplificación. Marcadores detectables adecuados incluyen fluorocromos (p. ej., fluoresceína isotiocianato (FITC), rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 2’,7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6carboxifluoresceína, 5-carboxifluoresceína (5-FAM), N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) o 6-carboxi2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (BEX)), marcadores radioactivos (p.ej. 32P, 35S, 3H, etc.), El marcador puede ser un sistema de dos etapas, en el que los polinucleótidos se conjugan con biotina, haptenos etc. que tienen una pareja de unión de alta afinidad, por ejemplo avidina, anticuerpos específicos, en el que la pareja de unión está conjugada con un marcador detectable. El marcador puede estar conjugado con uno o ambos cebadores. Como alternativa, el conjunto de nucleótidos usados en la amplificación está marcado, de modo que incorpora el marcador en el producto de amplificación.

La presente invención se refiere además a procedimientos de detección/diagnóstico de una afección neoplásica o preneoplásica en un mamífero (por ejemplo, un ser humano).

Ejemplos de afecciones que se pueden detectar/diagnosticar de acuerdo con estos procedimientos incluyen, entre otras, cánceres de próstata. Los polinucleótidos correspondientes a los genes que exhiben el patrón de expresión adecuado se pueden usar para detectar cáncer de próstata en un sujeto. En la referencia 191 se revisan los marcadores de cáncer.

Un procedimiento de detección/diagnóstico comprende: (a) obtener una muestra biológica de un mamífero (p. ej., un ser humano), (b) detectar la presencia en la muestra de un polipéptido de HERV-K(CH) y (c) comparar la cantidad de producto presente con la de una muestra control. De acuerdo con este procedimiento, la presencia en la muestra de niveles elevados de un producto génico de HERVK(CH) indica que el sujeto tiene una afección neoplásica o preneoplásica.

El compuesto es, preferentemente, una proteína de unión, por ejemplo un anticuerpo, policlonal o monoclonal, la fragmento de unión a antígeno del mismo, que se puede marcar con un marcador detectable (p. ej., fluoróforo, cromóforo o isótopo etc.). Cuando sea adecuado, el compuesto se puede fijar a un soporte sólido. La determinación de la formación del complejo se puede efectuar poniendo en contacto el complejo con un compuesto adicional (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente al primer compuesto (o complejo). Como el primer compuesto, el compuesto adicional se puede fijar a un soporte sólido y/o se puede marcar con un marcador detectable.

La identificación de niveles elevados del polipéptido de HERV-K(CH) de acuerdo con la presente invención hace posible la identificación de sujetos (pacientes) que es probable que se beneficien de la terapia adyuvante. Por ejemplo, una muestra biológica de un sujeto en terapia posprimaria (p. ej., un sujeto que ha sufrido cirugía) se puede cribar para determinar la presencia de polipéptido de HERV-K(CH) circulante, siendo la presencia de niveles elevados del polipéptido determinados mediante estudios de las poblaciones normales indicativa de tejido tumoral residual. De un modo similar, el tejido del sito cortado de un tumor escindido quirúrgicamente se puede analizar (por ejemplo, mediante inmunofluorescencia, la presencia de niveles elevados del producto (respecto al tejido circundante) es indicativa de la eliminación incompleta del tumor. La capacidad para identificar dichos sujetos hace posible adaptar la terapia a las necesidades del sujeto concreto. También se puede vigilar a los sujetos sometidos a terapia no quirúrgica (p. ej., quimioterapia o radioterapia), siendo la presencia en muestras de estos sujetos de niveles elevados del polipéptido de HERV-K(CH) indicativa de la necesidad de un tratamiento continuado. También se puede efectuar la estadificación de la enfermedad (por ejemplo, a efectos de optimizar los regímenes de tratamiento), por ejemplo mediante biopsia de próstata, por ejemplo con un anticuerpo específico del polipéptido de HERV-K(CH).

Se puede usar un kit en la detección de un polipéptido de HERV-K(CH). El kit puede comprender un compuesto que se une específicamente a un polipéptido de HERV-K(CH), tal como, por ejemplo, proteínas de unión, incluidos anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos (p. ej., fragmentos F(ab’)2 dispuestos dentro de un envase. El kit puede comprender además reactivos auxiliares para procesar el ensayo de unión.

DEFINICIONES

El término “que comprende" significa “que incluye” además de “constituido por”, por ejemplo una composición “que comprende” X puede estar constituido sólo por X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

La expresión “células neoplásicas”, “neoplasia”, “tumor”, “células tumorales", “cáncer” y “células cancerosas” (usadas de forma intercambiable) hacen referencia a células que exhiben un crecimiento relativamente autónomo, de modo que exhiben un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular (es decir, regulación alterada de la división celular). Las células neoplásicas pueden ser malignas o benignas e incluir tejido derivado de cáncer de próstata.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de un retrovirus endógeno humano con una representación de los polinucleótidos de HERV-K(CH) y su posición con respecto al retrovirus.

La Figura 2 es una representación esquemática de marcos de lectura abiertos dentro del genoma de HERV-K(HML-2.HOM (también conocido como ’ERVK6’) [1].

La Figura 3 muestra acontecimientos de corte y empalme en la técnica anterior [16] para ARNm de HERV-K.

La Figura 4 muestra sitios de corte y empalme cerca de los extremos 5’ y 3’ del ORF de env. Los tres marcos de lectura están sombrados de forma diferente.

La Figura 5 muestra análisis de transferencia de tipo Northern de los tránscritos de PCAV en líneas celulares de cáncer. La flecha superior a la izquierda muestra la posición del tránscrito de ARNm genómico. La flecha siguiente muestra la posición del tránscrito de env. Las dos flechas de la parte inferior muestran las posiciones de otros ORF. Las calles contienen ARN de las siguientes líneas celulares: (1) Tera 1; (2) DU145;

(3) PC3; (4) MDA Pca-2b; (5) LNCaP.Tera 1 es la línea celular de teratocarcinoma; las otras son líneas celulares de carcinoma de próstata.

La Figura 6 muestra una alineación de secuencias de ADN genómico de env de 27 virus HERV-K. Una secuencia consenso (SEC ID 157) se muestra en la línea inferior.

Las Figuras 7-9 muestran alineaciones de las secuencias polipeptídicas deducidas para gag (7), pol (8) y env

(9) de varios virus HERVK, junto con las secuencias consenso (SEC ID 158-160).

Modos para realizar la invención

Ciertos aspectos de la presente invención se describen con mayor detalle en los ejemplos no limitantes siguientes. Los ejemplos siguientes se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo se efectúa y usa la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni se pretende que representen que los siguientes experimentos sean todos y los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), pero se permiten algunos errores y desviaciones del experimento. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en ºC y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Fuente de muestras de células de próstata humanas y aislado de polinucleótidos expresados por ellas

Los polinucleótidos candidatos que pueden representar genes expresados de forma diferencial en el cáncer se obtuvieron de fuentes públicamente disponibles y de bibliotecas de ADNc generadas a partir de líneas celulares seleccionadas y de tejidos de pacientes. Se preparó una biblioteca normalizada de ADNc a partir de tejido tumoral de un paciente y a partir de la biblioteca se aislaron los polinucleótidos clonados para imprimir en micromatrices. Se procesaron los tejidos normales y tumorales de 13 pacientes para generar polinucleótidos transcritos mediante la ARN polimerasa de T7 que, a su vez, se evaluaron para determinar la expresión en las micromatrices. Los tejidos que sirvieron como fuentes para estas bibliotecas y polinucleótidos se resumen en la Tabla 4.

Normalización: El objetivo de la normalización es generar una biblioteca de ADN en la que todos los transcritos expresados en un tipo de célula o tejido concretos estén representados igualmente [referencias 192 y 193], y, por tanto, el aislado de tan pocos como 30.000 clones recombinantes en una biblioteca normalizada óptimamente puede representar el repertorio completo de expresión génica de una célula, estimado en una cifra de 10.000 por célula. Los materiales de la fuente para generar las bibliotecas normalizadas de próstata se crioconservaron a partir de tejido de tumor de próstata procedente de un paciente con adenocarcinoma de grado 3+3 de Gleason y biopsias normales de próstata a partir de una mezcla de sujetos en riesgo bajo vigilancia médica. Se cosecharon los epitelios de próstata directamente de las secciones congeladas de tejido por microdisección mediante captura por láser (LCM, Arcturus Engineering Inc., Mountain View, CA), se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, referencia 162), para proporcionar muestras de células sustancialmente homogéneas.

El ARN total se extrajo de las células cosechadas mediante LCM usando el kit RNeasy™ Protect Kit (Qiagen, Valencia, CA), siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. El ARN se cuantificó usando el kit de cuantificación RiboGreen® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Un !g del ARN total se retrotranscribió y se amplificó mediante PCR usando el kit de síntesis de ADNc SMART™ PCR (ClonTech, Palo Alto, CA). Los productos del ADNc se seleccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa usando procedimientos convencionales (referencia 8). El ADNc se extrajo usando el kit Bio 101 Geneclean® II (Qbiogene, Carlsbad, CA). La normalización del ADNc se llevó a cabo usando los principios de la cinética de hibridación: Se desnaturalizaron 1,0 !g de ADNc con calor a 100 ºC durante 10 minutos, después se incubaron a 42 ºC durante 42 horas en presencia de NaCl 120 mM, Tris.HCl 10 mM (pH = 8,0), EDTA.Na+ 5 mM y formamida al 50%. El ADNc monocatenario (ADNc “normalizado”) se purificó mediante cromatografía en hidroxiapatita ((#130-0520, BioRad, Hercules, CA) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante, se amplificó y se convirtió en ADNc bicatenario mediante tres ciclos de amplificación por PCR y se clonó en vectores plasmídicos usando procedimientos estándar (referencia 8). El fabricante proporcionó todos los cebadores/adaptadores usados en la normalización y el procedimiento de clonación en el kit de síntesis del ADNc PCR SMARTTM (Clon Tech, Palo Alto, CA). Las células supercompetentes (XL-2 Blue Ultracompetent Cells, Stratagene, California) se transfectaron con las bibliotecas de ADNc normalizadas, se sembraron en placas con medio sólido y se cultivaron durante la noche a 36 ºC.

Caracterización de bibliotecas normalizadas: Las secuencias de 10.000 recombinantes por biblioteca se analizaron mediante secuenciación capilar usando el analizador de ADN ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, California). Para determinar la representación de los tránscritos en una biblioteca se realizó un análisis BLAST con las secuencias de los clones para asignar la identidad del tránscrito a cada clon aislado, es decir las secuencias de los polinucleótidos aislados se enmascararon primero para eliminar las secuencias de baja complejidad usando el programa de enmascaramiento XBLAST (referencias 195. 196 y 197). En general, el enmascaramiento no influye sobre los resultados finales de la búsqueda, excepto para eliminar secuencias de relativamente poco interés por su baja complejidad y para eliminar múltiples "éxitos" en base a la similitud con regiones repetitivas comunes a múltiples secuencias, por ejemplo repeticiones Alu. Las secuencias restantes se usaron después en una búsqueda BLASTN vs. GenBank. Las secuencias también se usaron como secuencia de consulta en una búsqueda en base de datos BLASTX vs. NRP (proteínas no redundantes).

Se llevaron a cabo reacciones automatizadas de secuenciación usando un kit PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit que contiene la ADN polimerasa AmpliTaq, de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. Las reacciones se ciclaron en un sistema GeneAmp PCR System 9600 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que se hibridaron a 20 ºC o 30 ºC durante un minuto. Las reacciones de secuenciación se precipitaron en etanol, los sedimentos se resuspendieron en 8 microlitros de tampón de carba, 1,5 microlitros se cargaron en un gel de secuenciación y los datos se recogieron mediante un secuenciador de ADN ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA).

El número de veces que una secuencia está representada en una biblioteca se determina realizando análisis de identidad de secuencia con secuencias de ADNc clonado y asignando la identidad del tránscrito a cada clon aislado. En primer lugar, se comprobó cada secuencia para ver si era un contaminante mitocondrial, bacteriano o ribosómico. Dichas secuencias se excluyeron del análisis posterior. En segundo lugar, los artefactos de las secuencias (p. ej., vectores y elementos repetitivos) se enmascararon y/o eliminaron de cada secuencia.

Las secuencias restantes se compararon mediante BLAST [198] con las bases de datos GenBank y EST para la identificación génica y se compararon entre sí mediante FastA [199] para calcular la frecuencia de la aparición del ADNc en la biblioteca de ADNc normalizada. También se realizó una búsqueda de las secuencias contra las bases de datos de nucleótidos GenBank y GeneSeq usando el programa BLASTN (BLASTN 1.3MP [198]). En cuarto lugar, las secuencias se analizaron contra una base de datos de proteínas no redundantes (NRP) con el programa BLASTX (BLASTX 1.3MP [198]). Esta base de datos de proteínas es una combinación de las base de datos de proteínas Swiss-Prot, PIR, y NCBI GenPept. El programa BLASTX se ejecutó usando la matriz de sustitución BLOSUM-62 por defecto con el parámetro de filtro: "xnu+seg". El corte de la puntuación usado fue 75.

El ensamblaje de los clones solapantes en cóntigos se realizó usando el programa Sequencher (Gene Codes Corp.; Ann Arbor, Mich.). Los cóntigos ensamblados se analizaron usando los programas en el paquete GCG ((Genetic Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) Suite Versión 10.1.

Resumen de los polinucleótidos descritos en el presente documento. En la Tabla 6 se proporciona un resumen de los polinucleótidos aislados como se ha descrito con anterioridad e identificados como correspondientes a un gen expresado de forma diferencial (véase más adelante). Específicamente, la Tabla 6 proporciona: 1) el ORF de HERVK para cada ID de clon; 2) el ID de clon asignado a cada secuencia ; 3) el % de pacientes que tienen la proporción de expresión de >/= 2X; >/= 2-5X; >/= 5X; y menos de 1/2 X; y la proporción de expresión de ARNm tumoral/normal por paciente “Pac”, por ejemplo el paciente 93, el paciente 95, el paciente 96 etc.

Detección de niveles elevados de ADNc asociados con el cáncer de próstata usando matrices

Las secuencias de ADNc que representan diversos genes candidatos que se van a someter a detección selectiva por la expresión diferencial en cáncer de próstata se analizaron mediante hibridación en matrices de polinucleótidos. Las secuencias de ADNc incluyeron clones de ADNc aislados de líneas celulares o tejidos tal como se ha descrito con anterioridad. Las secuencias de ADNc analizadas también incluyeron polinucleótidos que comprenden solapamiento de secuencia con secuencias en la base de datos Unigen y que codifican varios productos génicos de varios orígenes, funcionalidad y niveles de caracterización. Los ADNc se vieron en portas reflectores (Amersham) de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica a una densidad de 9,216 manchas por porta que representan 4.608 secuencias (incluidos los controles) impresas por duplicado, con aproximadamente 0,8 !l de una disolución de 200 ng/!l de ADNc.

Los productos de la PCR de clones de ADNc seleccionados correspondientes a los productos génicos de interés se prepararon en una solución de DMSO al 50 %. Estos productos de PCR se pasaron a portaobjetos de micromatriz de aluminio de Amersham a una densidad de 9,216 clones por matriz usando el robot de impresión Molecular Dynamics Generation III Los clones se imprimieron por duplicado hasta un total de 4,608 secuencias diferentes por circuito.

Se prepararon sondas de ADNc a partir del ARN total obtenido mediante microdisección mediante captura por láser (LCM, Arcturus Enginering Inc., Mountain View, CA) de muestras de tejidos tumorales y muestras de tejidos normales aisladas de los pacientes descritos en lo que antecede.

Primero, se realizó transcripción inversa del ARN a ADNc usando un cebador que contenía el promotor de la ARN polimerasa de T7, seguido de la síntesis de la segunda hebra del ADN. Después, el ADNc se transcribió in vitro para producir ARN usando expresión mediada por el promotor de T7 (p. ej., referencia 200) y el ARN antisentido se convirtió después en ADNc. El segundo conjunto de ADNc se transcribió de nuevo in Vitro usando el promotor de T7 para proporcionar ARN antisentido. Este ARN antisentido se marcó después con fluorescencia o el ARN se convirtió de nuevo en ADNc, lo que permite que el tercer ciclo de amplificación mediada por T7 produzca más ARN antisentido. Por tanto, el procedimiento proporcionó dos o tres ciclos de transcripción in vitro para producir el ARN final usado para el marcaje fluorescente. Las sondas se marcaron preparando el ADNc marcado con fluorescencia a partir de la muestra de partida de ARN. Los ADNc marcados con fluorescencia preparados a partir de la muestra de ARN tumoral se compararon con los ADNc marcados fluorescencia preparados a partir de la muestra de ARN de células normales. Por ejemplo, las sondas de ADNc de las células normales se marcaron con colorante fluorescente Cy3 (verde) y las sondas de ADNc preparadas a partir de las células tumorales marcaron con colorante fluorescente Cy5 (rojo).

En ensayo de expresión diferencial se realizó mezclando cantidades iguales de sondas de células tumorales y de células normales del mismo paciente. Las matrices se hibridaron previamente mediante incubación durante aproximadamente 2 horas a 60 ºC en 5X SSC/SDS al 0,2 %/EDTA 1 mM y después se lavaron tres veces en agua y dos veces en isopropanol. Tras la hibridación previa de la matriz, la mezcla de sondas se hibridó después con la matriz en condiciones de rigurosidad elevada (durante la noche a 42 ºC en formamida al 50 %, 5X SSC y SDS al 0,2. Tras la hibridación, la matriz se lavó a 55 ºC tres veces del siguiente modo: 1) primer lavado en 1X SSC / SDS al 0,2 %; 2) segundo lavado en 0,1XSSC/SDS al 0,2 %; y 3) tercer lavado en .1X SSC.

Las matrices se escanearon para detectar la fluorescencia verde y roja usando un detector/escáner láser de doble color Molecular Dynamics Generation III. Las imágenes se procesaron usando el software BioDiscovery Autogene y los datos de cada escáner se normalizaron. Se repitió e experimento, esta vez marcando las dos sondas con el color contrario con el fin de realizar el ensayo en ambas “direcciones de color”. Cada experimento se repitió a veces con dos portas más (uno en cada dirección de color). Los datos de cada escáner se normalizaron y el nivel de fluorescencia para cada secuencia sobre la matriz expresada como la proporción de la media geométrica de 8 manchas/genes replicados de las cuatro matrices o 4 manchas/genes replicados de 2 matrices o alguna otra permutación.

En la Tabla 6 se resumen los resultados de productos génicos expresados de forma diferencial en las muestras de tumor de próstata con respecto a las células normales. La proporción de la expresión diferencial se expresa como la señal de hibridación normalizada asociada con la sonda tumoral dividida por la señal de hibridación normalizada con la sonda normal; por tanto, una proporción superior a 1 indica que la expresión del producto génico está aumentada en las células cancerosas con respecto a las células normales, mientras que una proporción inferior a 1 indica lo contrario. Los resultados de cada paciente se identifican por “Pac” con el correspondiente número de identificación de paciente. “Concordancia” indica el % de los pacientes en los que la expresión diferencial del producto génico seleccionado en células tumorales era al menos dos veces diferente de las células normales.

En al menos el 79 % de los pacientes de próstata analizados, 8 de cada 10 genes cuya expresión estaba elevada en al menos un 500 % estaban representados en las secuencias de HERV-K(CH).

La Tabla 6 proporciona dichos productos génicos que se expresaron de forma diferencial y se clasificaron como secuencias relacionadas con gag, 5’-pol (transcriptasa inversa) y 3’-pol (integrasa). Puede ser posible examinar la función de estos productos génicos en el desarrollo del cáncer y la metástasis mediante el uso de inhibidores de molécula pequeña que se sabe que afectan a la actividad de dichas enzimas.

Análisis de las secuencias asociadas con el cáncer de próstata

Con el fin de determinar si había homología con cualquier secuencia conocida, se secuenciaron los productos de PCR d 16 clones diferentes de un paciente con tumor de próstata. Los productos de la PCR de estos y otros clones de la misma biblioteca se imprimieron en micromatrices de ADN. El ARN de 13 pacientes con tumor de próstata se analizó en las micromatrices y después se secuenciaron los insertos completos de algunos de los 16 clones (Tabla 6).

Los 16 aislados se determinaron inicialmente en una reacción de secuenciación de primer paso para tener las secuencias como se muestra en las SEC ID 27-39, ambas incluidas. El aislado del tejido prostático normal se determinó inicialmente en una reacción de secuenciación de primer paso que tenía la secuencia mostrada en la SEC ID 41. Una reacción de secuenciación de primer paso hace referencia a un proceso de alto rendimiento, en el que las reacciones de PCR generan el molde de secuenciación, después se realiza la secuenciación con uno de los cebadores para PCR, en una única dirección. Una búsqueda en bases de datos públicas reveló que estos 16 aislados tienen algún grado de identidad con las regiones de la secuencia del retrovirus endógeno humano HERV-K(II) divulgada en el número de registro de Genbank AB047240 y mostrada en la SEC ID 44, y también con HERVK(10), aunque no son únicas.

Los aislados se sometieron a un segundo ciclo de secuenciación de ácido nucleico se descubrió que tenían las secuencias como se muestra en las SEC ID 14-26, ambas incluidas. El aislado del tejido prostático normal se sometió a un segundo ciclo de secuenciación de ácido nucleico y se descubrió que tenía la secuencia como se muestra en la SEC ID 40. Este segundo ciclo de secuenciación es un proceso adaptado, en el que la secuenciación se realiza en un molde de ADNds purificado en un vector de ADN. La secuenciación se realiza en ambos extremos del molde, directo e inverso, con los cebadores diseñados a partir de las regiones flanqueantes del vector y se sintetizan nuevos cebadores para cada reacción adicional necesaria para abarcar todo el inserto.

La divulgación en Genbank de HERV-K(II) proporciona únicamente una caracterización incompleta de sus características genéticas y ninguna asociación con ninguna enfermedad. La divulgación en Genbank caracteriza HERV-KII como que tiene un gen gag localizado en el nucleótido 2113-4116 y un gen env localizado en el nucleótido 7437-8174. Un análisis detallado de la secuencia de HERV-K(II) notificada indica que el genoma de HERV-K(II) incluye regiones relacionadas con gag, proteasa, extremo 5’ del dominio pol (transcriptasa inversa) y el extremo 3’ del dominio pol (integrasa) de un retrovirus. Específicamente, la localización del gen de la proteasa es de aproximadamente el nucleótido 3917 a aproximadamente 4920 y la localización del dominio polimerasa es de

aproximadamente el nucleótido 4797 a aproximadamente 7468.

Las secuencias polinucleotídicas de HERV-K(CH) compuestas se muestran en las SEC ID 7, 8, 9 y 10, y la Figura 1 proporciona una ilustración esquemática de un retrovirus endógeno humano y la especie HERV-K(CH) dentro de la ilustración esquemática. La SEC ID 7 es una secuencia compuesta de los polinucleótidos SEC ID 14-16, incluidas, y tiene una secuencia consenso como se muestra en la SEC ID 11. Esta región corresponde a la región gaga de un retrovirus endógeno humano. Las SEC ID 8 y 9 son secuencias compuestas de los polinucleótidos que tienen una secuencia como se muestra en la SEC ID 17-20, incluidas, y tiene una secuencia consenso como se muestra en la SEC ID 12. Esta región corresponde a la región 5’ pol de un retrovirus endógeno humano. La SEC ID 10 es una secuencia compuesta de los polinucleótidos que tienen una secuencia como se muestra en la SEC ID 21-26, incluidas, y tiene una secuencia consenso como se muestra en la SEC ID 13. Esta región corresponde a la región 3’ pol de un retrovirus endógeno humano.

La homología con la región gag de HERV-K(II) varió del 87 % al 99 %. La homología con la región5’-pol de HERV-K(II) (transcriptasa inversa) varió del 87 % al 97 %. La homología con la región 3’-pol de HERV-K(II) (integrasa) fue de aproximadamente un 89 %. Cuando se comparó con el provirus endógeno humano HERV-K10, la homología de los clones de la región gag fue de aproximadamente 79 %, la región 5’-pol entre 81 % y 89 % y la región 3’-pol fue de aproximadamente 89 %. La Tabla 5 ilustra la homología de la secuencia de los clones individuales con las correspondientes regiones HERV-K(II) y HERV-K(10). Dado que la presencia de tiras de poliA en las secuencias de HERV-K(CH) (y aislados depositados) puede ser un artefacto de la clonación se determinó el % de identidad mostrado en la Tabla 5 con alineaciones realizadas con polinucleótidos excluyendo la tira poliA terminal.

Las secuencias polinucleotídicas consenso SEC ID 11-13 se generaron con Multiple Sequence Alignment (MSA), una implementación de web de los programas GCG Pileup y Pretty. El programa usa un algoritmo de agrupamiento similar al programa Clustal descrito en la referencia 201. Los valores por defecto para las alineaciones y la extracción consenso fueron 8 para la apertura de hueco y 2 para la extensión de hueco. La pluralidad de agrupamientos o el número mínimo de secuencias similares especificadas para asignar un residuo a la secuencia consenso fue 2.

Las secuencias de polinucleótidos mostradas en las SEC ID 14-16, ambas incluidas, se usaron para la secuencia de polinucleótidos consenso mostrada en la SEC ID 11. Las secuencias de polinucleótidos mostradas en las SEC ID 17-20, incluidas, se usaron para la secuencia de polinucleótidos consenso mostrada en la SEC ID 12. Las secuencias de polinucleótidos mostradas en las SEC ID 21-26, incluidas, se usaron para el polinucleótido consenso mostrado en la SEC ID 13. La “N" representa que no hay una base representativa mínima cualificada, es decir el menos dos secuencias con la misma base en dicho sitio.

La transferencia de tipo Northern de líneas de células cancerosas de próstata usando los nucleótidos 243- final de la SEC ID 150 marcados como sonda indica que expresan tránscritos de PACV de varios tamaños, correspondientes a las secuencias genómicas virales de longitud completa y a los tránscritos subgenómicos de corte y empalme (Figura 5). La expresión de dichos tránscritos también se ha observado en líneas celulares de teratocarcinoma [15], como se muestra en la calle 1 de la figura 14.

Investigación de otros retrovirus endógenos humanos

HERV-K(CH) es un miembro del subgrupo HML-2 de la familia HERV-K. HERV-K(H) y HERV-K(10) también son miembros de este subgrupo.

Las mismas técnicas de micromatriz que se han descrito en lo que antecede se usaron para estudiar la expresión de miembros de la familia HERV-K en los subgrupos HML-2 y HML-6 en tejido de tumor de próstata. También se estudió la expresión de virus HERV-H.

Los resultados de la tabla 9 muestran que el HERV-H no está regulado por aumento en tumores de próstata. El subgrupo HML-6 de HERVK tampoco está regulado por aumento. Los únicos retrovirus endógenos regulados por aumento en los tumores de próstata están en el subgrupo HML-2.

Investigación de tumores distintos a los tumores de próstata

Los retrovirus endógenos HLM-2 están regulados por aumento en los tumores de próstata. Se investigó la regulación por aumento de los virus HERV-K de HML-2 y HML-6 en muestras de tumores obtenidas de pacientes con cáncer de mama y de colon usando las técnicas de micromatrices descritas en lo que antecede.

Los resultados expuestos en la tabla 10 muestran que los virus HML-2 están regulados por aumento en tejidos de tumores de próstata, peor no en tumores de colon o de mama. La expresión de HML-6 no está regulada por aumento en ninguno de los tumores.

Detección de secuencias de HERV-K(CH) en células y tejidos de cáncer de próstata humano

El ADN de tejido de cáncer de próstata y otros tejidos de cáncer humanos, tejidos de colon humano y tejidos

humanos normales, incluida de próstata no cancerosa, y de otras líneas celulares humanas se extraen siguiendo el procedimiento de la referencia 202. El ADN se resuspende en una solución que contiene tampón Tris HCl 0,05M, a pH 7,8 y EDTA 0,1 mM, y la cantidad de ADN recuperado se determina mediante microfluorometría usando el colorante Hoechst 33258 [referencia 203].

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza usando la Taq polimerasa siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante (Perkin Elmer Cetus) con respecto al tampón, Mg2+ y concentraciones de nucleótidos. El ciclado térmico se realiza en un ciclador de ADN mediante desnaturalización a 94 ºC durante 3 minutos, seguido de 35 o 50 ciclos de 94 ºC durante 1,5 minutos, 50 ºC durante 2 minutos y 72 ºC durante 3 minutos. La capacidad de la PCR para amplificar las regiones seleccionadas del gen HERV-K(CH) se analiza usando uno o más polinucleótidos de HERV-K(CH) clonados como molde(s) positivo(s). Con estos moldes se determinan las concentraciones óptimas de Mg2+ del cebador y los requisitos para las diferentes temperaturas de ciclado. Se usa la mezcla maestra recomendada por el fabricante. Para detectar la posible contaminación de los componentes de la mezcla maestra se analizan de forma rutinaria las reacciones sin molde.

La transferencia de tipo Southern y la hibridación se realizan como se describe en la referencia 204 usando las secuencias clonadas marcadas mediante el procedimiento del cebador aleatorio [205]. La prehibridación y la hibridación se realizan en una solución que contiene 6xSSPE, solución de Denhardt al 5 %, SDS al 5 %, formamida al 50 %, 100 !g/ml de ADN de testículo de salmón desnaturalizado, incubada durante 18 horas a 42 ºC, seguido de lavados con 2 x SSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente y a 37 ºC y, por último, en 0,1 x SSC con SDS al 0,5 % a 68 ºC durante 30 minutos (referencia 8). Para las secciones de tejido incluidas en parafina, se siguen las condiciones descritas en la referencia 206 usando cebadores diseñados para detectar una secuencia de 250 pb.

Expresión de polinucleótidos clonados en células huésped.

Para estudiar los productos polipeptídicos del ADNc de HERV-K(CH), los fragmentos de restricción del ADNc de HERV-K(CH) se clonan en el vector de expresión pMT2 (páginas 16.17-16.22 de referencia 8) y se transfectan en células COS cultivadas en DMEM suplementado con FCS al 10 %. Las transfecciones se realizan empleando técnicas de fosfato cálcico (páginas 16.32-16.40 de la referencia 8) y los lisados celulares se preparan cuarenta y ocho horas tras la transfección de las células COS tanto transfectadas como no transfectadas. Los lisados se someten a análisis mediante inmunotransferencia usando anticuerpos antipéptidos.

En los experimentos de inmunotransferencia se realiza preparación de lisados celulares y electroforesis de acuerdo con procedimientos estándar. La concentración de proteínas se determina usando soluciones de ensayo de proteínas BioRad. Tras la transferencia electroforética en semisequedad a nitrocelulosa, las membranas se bloquean en NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 7,5, Tween-20 (TTBS) al 0,05 % con 5 % de leche desecada. Tras lavar en TTBS e incubar con anticuerpos secundarios (Amersham), se realizan protocolos de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham) tal como describe el fabricante para facilitar la detección.

Generación de anticuerpos contra polipéptidos.

Los polipéptidos únicos de HERV-K(CH) se sintetizan o aíslan de sistemas de expresión bacteriana o de otro tipo (p. ej., levaduras, baculovirus) y se conjugan con seroalbúmina (RSA) de conejo con N-hidroxisuccinimida éster de ácido m-maleimidobenzoico (MBS) (Pierce, Rockford, Ill.). Los protocolos de inmunización con estos péptidos se realizan de acuerdo con procedimientos estándar. Inicialmente, antes de la inmunización se realiza una preextracción de sangre en los conejos. La primera inmunización incluye adyuvante completo de Freund y 500 !g de péptido conjugado o 100 !g de péptido purificado. Todas las demás inmunizaciones, realizadas cuatro semanas después de la inyección previa, incluyen adyuvante incompleto de Freund con la misma cantidad de proteína. Las extracciones de sangre se realizan de siete a diez días después de las inmunizaciones.

Para purificación por afinidad de los anticuerpos, el correspondiente polipéptido de HERV-K(CH) se conjuga con RSA con MBS y se acopla a sefarosa activada con CNBr (Pharmacia, Suecia). El antisuero se diluye 10 veces en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, y se incuba durante la noche con la matriz de afinidad. Después de lavar se eluyen de la resina los anticuerpos unidos con glicina 100 mM, pH 2,5.

Ensayo ELISA para detectar las secuencias relacionadas con gag y/o pol de HERV-K(CH).

Para analizar las muestras de sangre y detectar anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de HERV-K(CH) producidos de forma recombinante se emplea el siguiente procedimiento. Después de purificar los polipéptidos recombinantes relacionados con pol o gag o env de HERV-K(CH), el polipéptido recombinante se diluye en PBS hasta una concentración de 5 !g/100 !l). A cada pocillo de una placa Immulon 1 de 96 pocillos (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) se añaden 100 microlitros de la solución de antígeno diluido y la placa se incuba después durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ºC y se lava 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. El bloqueo para reducir la unión inespecífica de los anticuerpos se consigue mediante la adición a cada pocillo de 200 !l de una solución al 1 % de seroalbúmina bovina en PBS/Tween 20 e incubación durante 1 hora. Tras la aspiración de la solución de bloqueo se añaden 100 !l de la solución de anticuerpo primario (sangre entera anticoagulada, plasma o suero), diluida en el intervalo de 1/16 a 1/2.048 en solución de bloqueo, y se incuban

durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ºC. Después, los pocillos se lavan 3 veces y a cada pocillo se añaden 100 !l del anticuerpo IgG anti-humano de cabra conjugado con peroxidada de rábano (organon Teknika, Durham, N.C.), diluido a 1/500 o 1/1.000 en PBS/Tween 20, 100 !l de solución de o-fenilendiamina diclorhidrato (OPD, Sigma) y se incuba durante 5-15 minutos. La solución de OPD se prepara disolviendo un comprimido de 5 mg de OPD en 50 ml de metanol al 1 % en H2O y añadiendo 50 !l de H2O2 al 30 % inmediatamente antes de usar. La reacción se detiene añadiendo 25 l de H2SO4 4M. La absorbancia se lee a 490 nm en un lector de microplacas (Bio-Rad).

Preparación de vacunas

La presente invención también se refiere a un procedimiento de estimulación de una respuesta inmunitaria contra células que expresan polipéptidos de HERV-K(CH) en un paciente que usa polipéptidos gag y/o pol de HERV-K(CH) de la invención que actúan como antígenos producidos por o asociados con una célula maligna. Este aspecto de la invención proporciona un procedimiento de estimular una respuesta inmunitaria en un ser humano contra células de próstata o células que expresan polinucleótidos y polipéptidos pol o gag de HERV-K(CH). El procedimiento comprende la etapa de administrar a un ser humano una cantidad inmunogénica de un polipéptido que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de retrovirus endógeno humano HERV-K(CH) o (b) una muteína o variante de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de retrovirus endógeno humano HERV-K(CH).

Generación de animales transgénicos que expresan polipéptidos como medio para probar terapéuticas.

Los ácidos nucleicos de HERV-K(CH) se usan para generar animales no humanos genéticamente modificados o modificaciones génicas de los mismos específicas de sitio, en líneas celulares, para el estudio de la función o regulación de genes relacionados con tumores de próstata o para crear modelos animales de enfermedades, incluida el cáncer de próstata. Con el término “transgénico” se pretenden abarcar animales modificados genéticamente que tienen uno o varios genes exógenos de HERV-K(CH) que se transmite de forma estable en las células huésped en las que el gen o genes pueden tener alterados la secuencia para producir un polipéptido modificado, o que tienen un promotor de LTR de HERV-K(CH) unido operablemente a un gen indicador. Los animales transgénicos pueden prepararse mediante un constructo de ácido nucleico integrado de forma aleatoria en el genoma. Los vectores para integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YAC y similares, Mamíferos transgénicos de interés son, por ejemplo, vacas, cerdos, cabras, caballos, etc. y, particularmente, roedores, por ejemplo ratas, ratones etc.

Las células o animales modificados son útiles en el estudio de la función y la regulación génicas de HERV-K(CH). Por ejemplo, en el gen de HERV-K(CH) se puede realizar una serie de deleciones y/o sustituciones pequeñas para determinar el papel de diferentes dominios en la tumorigénesis de próstata. Los constructos específicos de interés incluyen, entre otros, constructos antisentido para bloquear la expresión génica de HERV-K(CH), la expresión de mutaciones génicas de HERV-K(CH) dominantes negativas y la sobreexpresión de un gen de de HERV-K(CH). Se proporciona la expresión de un gen de HERV-K(CH) o variantes del mismo en células o tejidos en los que no se expresa normalmente o en momentos anómalos del desarrollo. Además, proporcionando la expresión de polipéptidos derivados de HERV-K(CH) en las células en las que de otro modo no se producen con normalidad se pueden inducir cambios en el comportamiento celular.

Los constructos de ADN para la integración aleatoria no tienen que incluir regiones de homología para mediar en la recombinación. De forma conveniente se incluyen marcadores para selección positiva y negativa. Para varias técnicas para transfectar células de mamífero, véase la referencia 207.

Para las células madre embrionarias (ME) se usa una línea celular de ME o se obtienen células embrionarias frescas de un huésped, por ejemplo ratón, rata, cobaya, cerdo etc. Dichas células se cultivan en una capa adecuada alimentadora de fibroblastos o se cultivan en presencia de factores de crecimiento adecuados, tal como el factor inhibidor de la leucemia (LIF). Cuando las células ME se han transformado, se pueden usar para producir animales transgénicos. Tras la transformación, las células se siembran en una capa de alimentación en un medio adecuado. Las células que contienen el constructo se pueden detectar empleando un medio selectivo. Transcurrido tiempo suficiente para que las colonias crezcan, se capturan y se analizan para detectar la aparición de integración del constructor. Las colonias que son positivas pueden usarse después para manipulación embrionaria e inyección en blastocistos. Los blastocistos se obtienen de hembras superovuladas de 4 a 6 semanas de edad. Las células ME se digieren con tripsina y las células modificadas se inyectan en el blastocele del blastocisto. Tras la inyección, los blastocistos se devuelven a cada cavidad uterina de hembras seudopreñadas. Después, se deja que las hembras lleguen a término y los animales quiméricos resultantes se someten a detección selectiva de células portadoras del constructo. Proporcionando un fenotipo diferente del blastocisto y las células ME se puede detectar fácilmente la progenie quimérica.

Los animales quiméricos se someten a detección selectiva para determinar la presencia del ADN del gen modificado y se aparean los machos y las hembras que tienen la modificación con el fin de producir una progenie homocigota. Si las alteraciones génicas son letales en algún momento del desarrollo, los tejidos u órganos se mantienen como injertos o transplantes alogénicos o congénicos o en cultivo in vitro. Los animales transgénicos pueden ser cualquier

mamífero no humano, tal como animales de laboratorio, animales domésticos etc. Los animales transgénicos se usan en estudios funcionales, detección selectiva del fármaco etc., por ejemplo para determinar el efecto de un fármaco candidato en el cáncer de próstata, para probar posibles terapéuticas o regímenes de tratamiento etc.

Obtención de imágenes diagnósticas usando anticuerpos específicos de HERV-K(CH)

5 La presente invención abarca el uso de anticuerpos frente a polipéptidos de HERV-K(CH) para estadificar con precisión pacientes con cáncer de próstata en la presentación inicial y para la detección precoz de la diseminación metastásica del cáncer de próstata. La radioinmunogammagrafía con anticuerpos monoclonales específicos de gag de HERV-K(CH) o pol de HERV-K(CH) o porciones de los mismos u otros polipéptidos de HERV-K(CH) pueden proporcionar una prueba diagnóstica adicional específica de tumor. Los anticuerpos monoclonales de la presente

10 invención se usan para diagnóstico histopatológico de carcinomas de próstata.

Los xenoinjertos humanos subcutáneos de células de cáncer de próstata en ratones atípicos se usan para analizar si un anticuerpo monoclonal marcado con tecnecio-99m (99mTc) de la invención pueden simular con éxito el cáncer de próstata xenoinjertado mediante gammagrafía externa como se ha descrito para las células de seminoma en la referencia 208. Cada anticuerpo monoclonal específico de un polipéptido de HERV-K(CH) se purifica a partir de 15 líquido ascítico de ratones BALB/c portadores de tumores de hibridoma mediante cromatografía de afinidad en polipéptido A-Sefarosa. Los anticuerpos purificados, incluidos los anticuerpos monoclonales control tal como un anticuerpo monoclonal específico de avidina [209] se marcan con 99mTc tras la reducción usando los procedimientos de las referencias 210 y 211.En ratones atímicos portadores de células de cáncer de próstata humano se inyectan por vía intraperitoneal 200-500 !Ci de anticuerpo marcado con 99mTc. Veinticuatro horas después de la inyección se

20 obtienen imágenes de los ratones usando una cámara Siemens ZLC3700 gamma equipada con un colimador estenopeico de 6 mm fijado a aproximadamente 8 cm del animal. Para determinar la biodistribución del anticuerpo monoclonal tras la obtención de imágenes, los órganos normales y los tumores se extraen, se pesan y se miden la radioactividad de los tejidos y una muestra de lo inyectado. Adicionalmente, los anticuerpos específicos de HERV-K(CH) conjugados con compuestos antitumorales se usan como quimioterapia específica de cáncer de próstata.

25 DEPÓSITOS

Los materiales indicados en la Tabla 7 se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo.

La descripción anterior de realizaciones preferidas de la invención se ha presentado a modo de ilustración y ejemplo, a efectos de claridad y comprensión. No se pretende que sea exhaustiva o limite la invención a las formas exactas divulgadas. Se pretende que el alcance de la invención se defina en las reivindicaciones adjuntas y sus

30 equivalentes.

TABLA 1 – Sondas de la proteasa GAG (5’), específicas del aislado

Aislado: Nucleótidos SEC ID Aislado Nucleótidos SEC ID

K(CH): 1224 - 1238 161 K10 1490 - 1510 188

KII: 2098 - 2114 162 1502 - 1520 189

K10: 874 - 890 163 1522 - 1538 190

894 - 908: 164 1561 - 1576 191

910 - 927: 165 1586 - 1605 192

927 - 944: 166 1620 - 1635 193

989 - 1004: 167 1653 - 1669 194

1019 - 1036: 168 1698 - 1723 195

1046 - 1063: 169 1722 - 1743 196

1063 - 1078: 170 1748 - 1762 197

1084 - 1103: 171 1773 - 1788 198

1131 - 1145: 172 1820 - 1834 199

1148 - 1163: 173 1872 - 1887 200

1164 - 1185: 174 1917 - 1935 201

1206 - 1223: 175 1940 - 1955 202

1216 - 1235: 176 1955 - 1969 203

1243 - 1260: 177 1973 - 1995 204

(continuación)

Aislado: Nucleótidos SEC ID Aislado Nucleótidos SEC ID

1258 - 2375: 178 2008 - 2042 205

1277 - 1295: 179 2049 - 2064 206

1300 - 1329: 180 2076 - 2093 207

1347 - 1361: 181 2097 - 2113 208

1367 - 1382: 182 2122 - 2139 209

1392 - 1410: 183 2148 - 2118 210

1412 - 1428: 184 2176 - 2196 211

1426 - 1442: 185 2198 - 2212 212

1445 - 1461: 186 2219 - 2235 213

1463 - 1477: 187 2246 - 2261 214

TABLA 2 – Sondas de la proteasa (3’seg) Polimerasa (5’seq)

Aislado: Nucleótidos SEC ID Aislado Nucleótidos SEC ID

K(CH) consenso: 170 - 188 215 K10 11 - 38 113

205 - 221: 216 37 - 54 114

253 - 268: 217 70 - 90 115

316 - 336: 218 226 - 243 116

401 - 417: 219 249 - 264 117

490 - 504: 220 308 - 324 118

538 - 552: 221 327 - 342 119

872 - 886: 222 381 - 397 120

K(CH): 109 - 125 223 440 - 454 121

1374 - 1388: 224 541 - 557 122

1402 - 1416: 225 678 - 698 123

KII: 140 - 159 110 722 - 741 124

410 - 426: 111 753 - 767 125

1127 - 1141: 112 771 - 785 126

854 - 869: 127

872 - 890: 128

1195 - 1209: 129

1308 - 1323: 130

1335 - 1349: 131

1349 - 1365: 132

TABLA 3 – Solo sondas de 3’ POL

Aislado: Nucleótidos SEC ID

K(CH) consenso: 3 - 17 133

25 - 39: 134

82 - 104: 135

136 - 151: 136

154 - 169: 137

189 - 203: 138

322 - 337: 139

461 - 475: 140

630 - 645: 141

712 - 727: 142

757 - 771: 143

818 - 833: 144

KII: 1636 - 1651 145

TABLA 4 – ORF y fuentes de aislados/clones iniciales de bibliotecas de ADNc de próstata

ORF de HERVK: ID de clon Chiron Fuente del clon

gag: 035JN002.E02 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

gag: 035JN013.H09 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

gag: 035JN023.F12 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

gag: 037XN001.D10 Tejido de próstata normal, mezcla de 10 individuos

po15’: 035JN001.F06 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po15’: 035JN003.E06 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po15’: 035JN013.C11 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po15’: 035JN013.F03 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

pro13’: 035JN003.G09 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN010.A09 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN015.F06 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN020.B12 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN020.D07 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN022.G09 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN015.H02 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

po13’: 035JN016.H02 Tejido de cáncer de próstata, paciente 101, grado 3+3 de Gleason

TABLA 5 –Identidad de los polinucleótidos de HERV-K(CH) con HERV-K(II) y HERV-K(10)

ID del clon: Región % de identidad de HERV-K(II) % de identidad de HERV-K(10)

035JN003.G09: 3’-pol 89,423 89,423

035JN010.A09: 3’-pol 89,663 89,663

035JN015.F06: 3’-pol 89,423 89,423

035JN020.B12: 3’-pol 89,303 89,303

035JN020.D07: 3’-pol 89,614 89,614

035JN022.G09: 3’-pol 89,354 89,354

035JN002.E02: gag 99,524 79,881

035JN013.H09: gag 99,017 79,975

035JN023.F12: gag 98,849 79,335

035XN001.D10: gag 87,383 79,947

035JN001.F06: 5’-pol 97,211 88,844

035JN003.E06: 5’-pol 97,45 86,723

035JN013.C11: 5’-pol 97,156 85,444

035JN013.F03: 5’-pol 87,962 81,521

TABLA 6

Resultados de la micromatriz de ADN: 13 pacientes de tumor frente a próstata normal, expresión de ARN de HERV-K

Porcentaje de pacientes con proporción de la expresión: Proporción de la expresión Tu de ARN, mor/normal

ORF deHERVK: ID del clonChiron Clone >=2x >=2-5x >=5x ’ <=halfx Pac93 Pac95 Pac96 Pac97 Pac151 Pac155 Pac231 Pac232 Pac251 Pac282 Pac286 Pac294 Pac351

gag: 035JN002.E02 57,1 42,9 7,1 0,0 4,8 3,0 2,1 1,0 2,3 2,5 1,9 1,7 6,9 1,5 0,6 2,6 2,9

gag: 035JN013.H09 78,6 78,6 50,0 0,0 9,3 4,5 5,2 1,4 5,5 13,8 4,2 3,5 31,2 4,5 1,0 12,1 8,6

gag: 035JN023.F12 78,6 78,6 57,1 0,0 9,1 4,1 5,1 1,6 5,5 17,0 4,5 3,2 28,2 5,2 1,0 12,7 7,3

qaq: 037XN001.D10 64,3 64,3 14,3 0,0 5,4 3,4 2,5 1,5 3,6 4,6 2,9 1,8 10,0 1,7 1,0 3,5 4,3

pol5prime: 035JN001.F06 42,9 21,4 7,1 0,0 2,0 2,6 1,8 9,5 2,7 1,8 2,0 1,8 7,8 1,2 1,0 1,9 2,3

pol5prime: 035JN003.E06 42,9 21,4 7,1 0,0 2,1 2,6 1,8 1,4 2,6 1,9 2,0 1,7 7,7 1,2 1,0 1,8 2,1

pol5prime: 035JN013.C11 85,7 78,6 57,1 0,0 6,9 5,6 6,9 2,0 7,4 24,0 4,8 4,3 37,4 4,4 1,0 13,1 8,8

pol5prime: 035JN013.F03 85,7 71,4 21,4 0,0 4,6 3,4 3,7 2,2 4,6 8,4 4,1 3,4 21,8 2,3 1,0 5,0 5,8

pol3prime: 035JN003.G09 71,4 57,1 7,1 0,0 4,1 3,3 3,3 1,6 4,9 3,3 2,2 3,5 14,9 1,5 1,0 2,5 3,9

pol3prime: 035JN010.A09 85,7 78,6 71,4 0,0 8,0 4,4 12,6 2,1 12,4 55,9 5,1 9,5 70,0 5,8 1,0 26,3 9,7

pol3prime: 035JN015.F06 85,7 78,6 71,4 0,0 7,6 4,0 12,8 2,2 11,9 53,4 5,1 8,0 69,7 5,9 1,0 25,3 9,1

pol3prime: 035JN020.B12 85,7 78,6 64,3 0,0 7,0 4,0 10,5 2,2 11,9 34,9 5,0 6,8 44,5 5,2 1,0 15,2 8,1

pol3orime: 035JN020.D07 85,7 78,6 57,1 0,0 6,0 3,2 8,7 2,0 13,7 22,9 4,6 8,6 58,2 3,8 1,0 15,0 7,6

pol3prime: 035JN022.G09 78,6 78,6 57,1 0,0 6,6 4,2 6,6 2,0 8,8 12,7 4,5 5,3 28,0 2,6 1,0 5,9 7,8

pol3prime: 035JN015.H02 85,7 78,6 57,1 0,0 7,9 4,2 9,0 2,1 10,7 35,3 4,7 7,5 49,5 4,8 1,0 18,2 8,7

pol3prime: 035JN018.H02 71,4 71,4 14,3 0,0 3,8 3,0 3,4 1,9 4,3 5,0 3,0 3,1 14,1 1,7 1,0 2,6 5,0

TABLA 7 - DEPÓSITOS

ATCC = Colección Americana de Cultivos Tipo CMCC = Colección Chiron de Cultivos Maestros Todos los depósitos realizados el 10 de abril de 2000

Línea celular: Nº de registro en CMCC Nº de registro en ATCC

035JN003G09: 5400 PTA 2561

035JN010A09: 5401 PTA 2572

035JN015F06: 5402 PTA 2566

035JN015H02: 5403 PTA 2571

035JN020B12: 5405 PTA 2562

035JN020D07: 5406 PTA 2573

035JN022G09: 5413 PTA 2560

035JN002E02: 5404 PTA 2565

035JN013H09: 5408 PTA 2568

035JN023F12: 5409 PTA 2564

035XN001D10: 5410 PTA 2569

035JN001F06: 5411 PTA 2567

035JN003E06: 5412 PTA 2559

035JN013C11: 5407 PTA 2563

035JN013F03: 5415 PTA 2570

TABLA 8 – Listado de secuencias

SEC ID: DESCRIPCIÓN

1: Región U5 de herv - k(hml - 2.hom) [GenBank AF074086]

2: Región U3 de herv - k(hml - 2.hom)

3: Región R de herv - k(hml - 2.hom)

4: Región RU5 de herv - k(hml - 2.hom)

5: Región U3R de herv - k(hml - 2.hom)

6: Región no codificante entre U5 y el primer sitio de corte y empalme en 5’ de herv - k(hml - 2.hom)

7: Compuesto de tres polinucleótidos de HERV - K(CH) [SEC ID 14 - 16] localizados en la región gag.

8 & 9: Compuesto de cuatro polinucleótidos de HERV - K(CH) [SEC ID 17 - 20] localizados en la región 5’ pol

10: Compuesto de seis polinucleótidos de HERV - K(CH) [SEC ID 21 - 26] localizados en la región 3’ pol

11: Secuencia consenso de la región gag de HERV-K(CH)

12: Secuencia consenso de la región 5’ pol de HERV-K(CH)

13: Secuencia consenso de la región 3’ pol de HERV-K(CH)

14: Secuencia del clon 035JN002.E02.

15: Secuencia del clon 035JN023.F12.

16: Secuencia del clon 035JN013.H09.

17: Secuencia del clon 035JN013.C11

18: Secuencia del clon 035JN003.E06.

19: Secuencia del clon 35JN001.F06

20: Secuencia del clon 035JN013.F03.

21: Secuencia del clon 035JN020.D07.

22: Secuencia del clon 035JN015.F06.

23: Secuencia del clon 035JN003.G09.

(continuación) (continuación)

SEC ID: DESCRIPCIÓN

24: Secuencia del clon 035JN020.B12.

25: Secuencia del clon 035JN022.G09.

26: Secuencia del clon 035JN010.A09.

27: Secuencia del clon 0353N002.E02.

28: Secuencia del clon 035JN023.F12.

29: Secuencia del clon 035JN013.H09.

30: Secuencia del clon 035JN013.C11.

31: Secuencia del clon 035JN003.E06.

32: Secuencia del clon 035JN001.F06.

33: Secuencia del clon 035JN013.F03.

34: Secuencia del clon 035JN020.D07.

35: Secuencia del clon 035JN015.F06.

36: Secuencia del clon 035JN003.G09.

37: Secuencia del clon 035JN020.B12.

38: Secuencia del clon 035JN022.G09.

39: Secuencia del clon 035JN010.A09.

40: Secuencia del clon 037XN001.D10 y aislado de tejido prostático normal.

41: Secuencia del clon037XN001.D10 y aislado de tejido prostático normal.

42: Secuencia del polinucleótido EST mostrada en el número de registro en GenBank Q60732.

43: Secuencia del polinucleótido SEC ID 407 del documento WO 00/04149

44: Secuencia del polinucleótido para HERV - KII

45: Secuencia del polinucleótido para HERV – K10

46 - 49: Traducción de aminoácidos de las SEC ID 11, 14, 15, 16

50 - 55: Traducción de aminoácidos de las SEC ID 21 – 26 (obsérvense los motivos PSFGK)

56 - 57: Traducción de aminoácidos de las SEC ID 27 y 28

58: Secuencia polipeptídica consenso deducida de las SEC ID 21 - 26

59 - 82: Sondas polinucleotídicas no en las SEC ID 42 - 45

83 & 84: Sondas polinucleotídicas compartidas con las SEC ID 42 - 45

85: gag CDS de HERV - K108

86: prt CDS de HERV - K108

87: pol CDS de HERV - K108

88: env CDS de HERV - K108

89: cORF 5’ CDS de HERV - K108

90: cORF 3’ CDS de HERV - K108

91: gag CDS de HERV - K(C7)

92 93: Secuencia de aminoácidos de gag de HERV - K(C7) pol CDS de HERV - K(C7)

94: Secuencia de aminoácidos de pol de HERV - K(C7)

95: env CDS de HERV - K(C7)

96: Secuencia de aminoácidos de env de HERV - K(C7)

97: gag CDS de HERV - K(II)

98: Secuencia de aminoácidos de gag de HERV - K(H)

SEC ID: DESCRIPCIÓN

99: Prt CDS de HERV - K(II)

100: pol CDS de HERV - K(II)

101: env CDS de BERV - K(II)

102: gag CDS de HERV - K10

103: gag(i) de HERV - K10

104: gag(ii) de HERV - K10

105: prt CDS de HERV - K10

106: Secuencia de aminoácidos de prt de HERV - K10

107: Pol/env CDS de HERV - K10

108: Secuencia de aminoácidos de pol/env de HERV - K10

109: Secuencia de aminoácidos de cORF

110 -132: Tabla 2 – Sondas (cont. En las SEC ID 215-225)

133 -145: Tabla 3 sondas

146: Secuencia de aminoácidos de gag de HML - 2.HOM (’ERVK6’)

147: Secuencia de aminoácidos de prt de HML - 2.HOM (’ERVK6’)

148: Secuencia de aminoácidos de pol de HML - 2.HOM (’ERVK6’)

149: Secuencia de aminoácidos de env de HML - 2.HOM (’ERVK6’)

150: LTR de herv - k(hml - 2.hom)

151 -154: Secuencias LTR de HML-2

155 y 156: Región RU5 de herv - k(hml - 2.hom) (regiones 5’ y 3’, respectivamente)

157: Secuencia consenso de ácido nucleico de env (Figura 6)

158: Secuencia consenso de gag (Figura 7)

159: Secuencia consenso de pol (Figura 8)

160: Secuencia consenso de env (Figura 9)

161 -214: Tabla 1 sondas

215 -225: Tabla 2 – Sondas (cont. de das SEC ID 110-132)

TABLA 9- Expresión de HERV-H y HERV-K en tumores de próstata TABLA 10- Expresión de virus HERV-K en tumores de colon y de mama

La columna “Resultado” da el % de muestras de pacientes que mostraron regulación por aumento de la secuencia en GenBank proporcionadas en la primera columna en el tejido tumoral respecto a un tejido no tumoral.

ID en GENBANK: HERV Subgrupo HML Resultado

AB047240: K HML - 2 65

AF164611: K HML - 2 63

AF164612: K HML - 2 63

AF079797: K HML - 6 3

BC005351: H - 0

XM_054932: H - 0

ID en GENBANK: HERV Subgrupo HML Resultado

Próstata: Mama Colon

AB047240: K HML - 2 65 0 2

AF079797: K HML - 6 3 6 0

AF164611: K HML - 2 63 0 2

AF164612: K HML - 2 63 6 2

REFERENCIAS

1 Mayer y col., (1999) Nat. Genet. 21 (3), 257-258 (1999) 2 Farrell (1998) RNA Methodologies (Academic Press; ISBN 95-7). 3 Yang y col., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(23):13404-8 4 Robbins y col., (1997) Clin Lab Sci 10(5):265-71. 5 Ylikoski y col., (1999) Clin Chem 45(9):1397-407 6 Ylikoski y col., (2001) Biotechniques 30:832-840 7 Shirahata & Pegg (1986) J. Biol. Chem. 261(29):13833-7. 8 Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. NY, Cold Spring Harbor Laboratory 9 Short protocols in molecular biology (4th edition, 1999) Ausubel y col., eds. ISBN 0-471-32938-X. 10 US patent 5,707,829 11 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., eds., 1987) Supplement 30. 12 EP-B-0509612 13 EP-B-0505012 14 Berkhout y col., (1999) J. Virol. 73:2365-2375. 15 Löwer y col., (1995) J. Virol. 69:141-149. 16 Magin y col., (1999) J. Virol. 73:9496-9507. 17 Magin-Lachmann (2001) J. Virol. 75(21):10359-71. 18 Hashido y col., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1241-1248. 19 Geysen y col., (1984) PNAS USA 81:3998-4002. 20 Carter (1994) Methods Mol Biol 36:207-23. 21 Jameson, BA y col., 1988, CABIOS 4(1):181-186. 22 Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89. 23 De Lalla y col., (1999) J. Immunol. 163:1725-29. 24 Brusic y col., (1998) Bioinformatics 14(2):121-30 25 Meister y col., (1995) Vaccine 13(6):581-91. 26 Roberts y col., (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610. 27 Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7. 28 Feller & de la Cruz (1991) Nature 349(6311):720-1. 29 Hopp (1993) Peptide Research 6:183-190. 30 Welling y col., (1985) FEBS Lett. 188:215-218. 31 Davenport y col., (1995) Immunogenetics 42:392-297. 32 Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482-489. 33 Go y col., Int. J. Peptide Protein Res. (1980) 15:211 34 Querol y col., Prot. Eng. (1996) 9:265 35 Olsen y Thomsen, J. Gen. Microbiol. (1991) 137:579 36 Clarke y col., Biochemistry (1993) 32:4322 37 Wakarchuk y col.,, Protein Eng. (1994) 7:1379 38 Toma y col.,, Biochemistry (1991) 30:97 39 Haezerbrouck y col.,, Protein Eng. (1993) 6:643 40 Masul y col.,, Appl. Env. Microbiol. (1994) 60:3579 41 US patent 4,959,314 42 Breedveld (2000) Lancet 355(9205):735-740. 43 Gorman & Clark (1990) Semin. Immuno/. 2:457-466 44 Jones y col.,, Nature 321:522-525 (1986) 45 Morrison y col.,, Proc. Natl. Acad. Sci, US.A., 81:6851-6855 (1984) 46 Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988) 47 Verhoeyer y col.,, Science 239:1534-1536 (1988) 48 Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991) 49 Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994). 50 Kettleborough, C.A. y col.,, Protein Eng. 4(7):773-83 (1991). 51 Chothia y col.,, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 52 Kabat y col.,, U.S. Dept. of Health y Human Services NIH Publication No. 91-3242 (1991) 53 Patente de EE.UU. 5,530,101. 54 Patente de EE.UU. 5,585,089. 55 Documento WO 98/24893 56 Documento WO 91/10741 57 Documento WO 96/30498 58 Documento WO 94/02602 59 Patente de EE.UU. 5,939,598. 60 Documento WO 96/33735 61 Documento WO 93/14778 62 Findeis y col.,, Trends Biotechnol. (1993) 11:202 63 Chiou y col., (1994) Gene Therapeutics: Methods y Applications Of Direct Gene Transfer. ed. Wolff 64 Wu y col.,, J. Biol. Chem. (1988) 263:621

65 Wu y col.,, J. Biol. Chem. (1994) 269:542 66 Zenke y col.,, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655 67 Wu y col.,, J. Biol. Chem. (1991) 266:338 68 Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51 69 Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845 70 Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185 71 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148 72 Documento WO 90/07936 73 Documento WO 94/03622 74 Documento WO 93/25698 75 Documento WO 93/25234 76 Patente de EE.UU. 5,219,740 77 Documento WO 93/11230 78 Documento WO 93/10218 79 Patente de EE.UU. 4,777,127 80 Patente del Reino Unido Nº 2,200,651 81 Documento EP-A- 0 345 242 82 Documento WO 91/02805 83 Documento WO 94/12649 84 Documento WO 93/03769 85 Documento WO 93/19191 86 Documento WO 94/28938 87 Documento WO 95/11984 88 Documento WO 95/00655 89 Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 90 Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985 91 Patente de EE.UU. 5,814,482 92 Documento WO 95/07994 93 Documento WO 96/17072 94 Documento WO 95/30763 95 Documento WO 97/42338 96 Documento WO 90/11092 97 Patente de EE.UU. 5,580,859 98 Patente de EE.UU. 5,422,120 99 Documento WO 95/13796 100 Documento WO 94/23697 101 Documento WO 91/14445 102 Documento EP 0524968 103 Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 104 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:11581 105 Patente de EE.UU. 5,206,152 106 Documento WO 92/11033 107 Patente de EE.UU. 5,149,655 108 Patente de EE.UU. 5,206,152 109 Documento WO 92/11033 110 Documento WO90/14837 111 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach (1995) ed. Powell & Newman 112 Documento WO00/07621 113 Documento GB-2220221 114 Documento EP-A-0689454 115 Documento EP-A-0835318 116 Documento EP-A-0735898 117 Documento EP-A-0761231 118 Documento WO99/52549 119 Documento WO01/21207 120 Documento WO01/21152 121 Documento WO00/62800 122 Documento WO00/23105 123 Documento WO99/11241 124 Documento WO98/57659 125 Documento WO93/13202. 126 Documento McSharry (1999) Antiviral Res 43(1):1-21. 127 Kuhelj y col., (2001) J Biol Chem 276(20):16674-82. 128 Schommer y col., (1996) J Gen Virol 77:375-379. 129 Magin y col., (2000) Virology 274:11-16. 130 Boese y col., (2001) FEBS Lett 493(2-3):117-21.

131 Larsson, E., y col.,, Current Topics in Microbiology and Immunology 148:115 (1989) 132 Mariani-Costantini, y col.,, J. Virol. 63:4982 (1989) and Shih, y col.,, Virology 182:495 (1991) 133 Tönjes y col., (1996) J. AIDS Hum. Retrovir. 13(Suppl 1):S261-S267. 134 Barbulescu y col.,, Curr. Biol. 9:861 (1999) 135 Ono, y col.,, J. Virol. 58:937 (1986) 136 Löwer y col.,, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:4480 (1993) 137 Ono y col.,, (1986) J. Virol. 60:589 138 Boller, y col.,, Virol. 196:349 (1993) 139 Yang y col.,, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:13404 (1999) 140 Mueller- Lantzsch y col.,, AIDS Research and Human Retroviruses 9:343-350 (1993) 141 Herbst y col.,, Amer. J. Pathol. 149:1727 (1996) 142 Patene Estados Unidos 5,858,723 143 Löwer y col.,, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:5177 (1996) 144 Löwer y col.,, Virology 192:501 (1993) 145 Número de acceso al Genbank AB047240 146 Andersson y col., (1999) J. Gen. Virol. 80:255-260. 147 Zsíros y col., (1998) J. Gen. Virol. 79:61-70. 148 Tönjes y col., (1999) J. Virol. 73:9187-9195. 149 Johnston y col., (2001) Ann Neurol 50(4):434-42. 150 Medstrand y col., (1998) J Virol 72(12):9782-7. 151 Patente de EE.UU. 5,010,175 152 Solicitud de patente internacional WO 91/17823. 153 Patente de EE.UU. 4,816,567. 154 Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963 155 Caprino y Han, J. Org. Chem. 37:3404, 1972 156 Milstein y Kohler, Nature 256:495-497, 1975 157 Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46 158 Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981 159 Altschul y col., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402 160 Brutlag y col., Comp. Chem. (1993) 17:203 161 Schena y col., (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93(20):10614-9 162 Schena y col., (1995) Science 270(5235):467-70 163 Shalon y col., (1996) Genome Res. 6(7):639-45 164 Patente de EE.UU. 5,807,522 165 Solicitud de patente europea 0799897 166 Documento WO 97/29212 167 Documento WO 97/27317 168 Solicitud de patente europea 0785280 169 Documento WO 97/02357 170 Patente de EE.UU. 5,593,839 171 Patente de EE.UU. 5,578,832 172 Solicitud de patente europea 0728520 173 Patente de EE.UU. 5,599,695 174 Solicitud de patente europea 0721016. 175 Patente de EE.UU. 5,556,752 176 Documento WO 95/22058 177 Patente de EE.UU. 5,631,734 178 Pappalarado y col.,, Sem. Radiation Oncol. (1998) 8:217 179 Ramsay Nature Biotechnol. (1998) 16:40 180 Patente de EE.UU. 5,134,854 181 Patente de EE.UU. 5,445,934 182 Documento WO 95/35505 183 Patente de EE.UU. 5,631,734 184 Patente de EE.UU. 5,800,992 185 Documento WO92/02526. 186 Patente de EE.UU. 5,124,246. 187 Mullis y col., Meth. Enzymol. (1987) 155:335 188 Patente de EE.UU. 4,683,195 189 Patente de EE.UU. 4,683,202 190 Saiki y col., (1985) Science 239:487 191 Hanahan y col., Cell 100:57-70 (2000) 192 Weissman SM Mol Biol. Med. 4(3),133-143 (1987 193 Patanjali, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 194 Simone y col., Am J Pathol. 156(2):445-52 (2000) 195 Claverie (1996) Meth. Enzymol. 266:212-227. 196 Automated DNA Sequencing y Analysis Techniques Adams y col., eds., Chap. 36, p. 267 Academic

Press, San Diego, 1994 197 Claverie y col., Comput. Chem. (1993) 17:191 198 Altschul y col., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990 199 Pearson y Lipman, PNAS, 85:2444, 1988

5 200 Luo y col., (1999) Nature Med 5:117-122 201 Higgins y Sharp CABIOS 5; 151-153 (1989) 202 Delli Bovi y col., (1986, Cancer Res. 46:6333-6338) 203 Cesarone, C. y col., Anal Biochem 100:188-197 (1979) 204 Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)

10 205 Feinberg, A. P., y col., 1983, Anal. Biochem. 132:6-13 206 Wright y Manos (1990, in "PCR Protocols", Innis y col., eds., Academic Press, pp. 153-158) 207 Keown y col., Methods in Enzymology 185:527-537 (1990) 208 Marks, y col., Brit. J. Urol. 75:225 (1995) 209 Skea, y col., J. Immunol. 151:3557 (1993)

15 210 Mather, y col., J. Nucl. Med. 31:692 (1990) 211 Zhang y col., Nucl. Med. Biol. 19:607 (1992)

Listado de secuencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para diagnosticar cáncer de próstata, en el que el procedimiento comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia de un producto de expresión de un retrovirus endógeno HML-2 en una muestra de un paciente, en el que la muestra del paciente contiene células de próstata y/o en el que se sospecha que el paciente tiene cáncer de próstata en el que la regulación por aumento de la expresión de al menos 150 % respecto a un control negativo es indicativa de cáncer de próstata.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el producto de expresión es un ARN o un polipéptido.
3.

El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la muestra del paciente es una muestra de próstata o una muestra de sangre.
4.

El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el producto de expresión es un ARN que tiene la siguiente fórmula: N1-N2-N3-N4-N5-poliA, en la que: N1 tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 155; N2 tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 156; N3 tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 6; N4 comprende cualquier secuencia de ARN; N5 tiene una identidad de secuencia de al menos un 75 % con la SEC ID 5; y al menos uno de N1 o N5 está presente, pero N2, N3, N4 y poliA son opcionales.
5.

El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el ARN comprende N1.
6.

El procedimiento de la reivindicación 5, en el que N1 está en el extremo 5’ del ARN.
7.

El procedimiento de la reivindicación 4, en el que N4 comprende una secuencia de codificación del polipéptido.
8.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polipéptido está codificado por un ARNm que tiene la siguiente fórmula: N1-N2-N3-N4-N5-poliA, como se define en la reivindicación 4.
9.

El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el ARNm codifica uno o más de los siguientes polipéptidos de HML-2: gag, prt, pol, env, cORF, tat.
10.

El procedimiento de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que el polipéptido se detecta usando un anticuerpo.
11.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha etapa está precedida por una etapa de enriquecer el ARN en la muestra del paciente.
12.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 11, en el que el producto de expresión se detecta usando PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA o NASBA.
13.

El procedimiento de la reivindicación 12, en la que la PCR es RT-PCR.