JP4934258B2

JP4934258B2 - 乳癌のヒト内在性レトロウイルス

Info

Publication number: JP4934258B2
Application number: JP2001518660A
Authority: JP
Inventors: ロバートエフゲイリー
Original assignee: ザアドミニストレイターズオブザテューレインエデュケイショナルファンド
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2020-06-30
Also published as: CA2369848C; ATE399204T1; EP1190055A2; JP2003507050A; WO2001000829A2; NO20016296D0; HK1046535B; DK1190055T3; WO2001000829A3; HK1046535A1; WO2001000829A9; DE60039295D1; CA2369848A1; ES2307521T3; MXPA01013388A; AU778027B2; EP1190055B1; US6670466B1; PT1190055E; NO331637B1

Description

【０００１】
（発明の背景）
本出願は1999年６月30日に出願された米国仮特許出願番号60/141,626の優先権を得ており、この仮出願の全文は参照によって本明細書に明確に取り込まれる。
１．発明の分野
本発明は、発癌性障害、特に乳癌の検出、予後評価、及び治療のための組成物及び方法に関する。
詳細には、本発明は、ヒト、ネコ、及び非ヒト霊長類のサブセット中に存在する新規に同定された内在性レトロウイルスに関連する障害を同定及び治療するのに有用な組成物を提供する。
【０００２】
２．本発明で提言される技術的課題
公知の感受性遺伝子の変異が、すべての乳癌の理由とはならない
乳癌（ＢＣ）は、女性の癌死亡の主な理由の１つである。ＢＣの誘発は、宿主の遺伝的、ホルモンの、免疫学的及び生理的状態、並びに食生活及び化学薬品、放射性又は感染性物質への曝露を含むいくつかの因子の相互作用に関わると考えられる。現在、ＢＲＣＡ-１及びＢＲＣＡ-２を含むいくつかの遺伝子の変異が、ＢＣの発生の非常に高いリスクをもたらし得ることは明らかである。しかし、公知のＢＣ感受性遺伝子の欠陥は、ＢＣ、いわゆる家族性症例のたった約５％の理由でしかない（Armstrongら,2000；Gaytherら,1998）。
他のタイプの癌におけると同様に、散発的に生じるＢＣにウイルスが病原学的に関与する可能性は取り除かれていない。その結果、何らかのウイルスがＢＣの発生に時折つながるとしたら、それを決定することが長い間要望されている。このようなウイルスの同定は、おそらくＢＣ医学における次の分野：予防、診断、予後の判定、及び治療に貴重な助けを与えるだろう。
【０００３】
３．関連技術の説明
マウスにおける乳癌のレトロウイルス誘発
マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｂ型レトロウイルスは、1930年代にジャクソン研究所でマウスの遺伝性癌の研究中に発見された（Bittner,1936）。遅発性癌化レトロウイルスのプロトタイプのように、ＭＭＴＶはマウス内でＢＣを生じさせることが決定的に示された。先行研究は、ＭＭＴＶが内在性プロウイルスとして生殖系列内で、また乳汁を介して外因的に、両方で伝播されることを確証した。内在性要素として、ＭＭＴＶプロウイルスはゲノム中の他の配列と同様にメンデル遺伝のパターンに従う（Cohenら,Cell,1979；Cohen及びVarmus,1979,1980；Trainaら,1981；Traina-Dorge及びCohen,1983；Traina-Dorgeら,1985；Varmusら,1978）。ＭＭＴＶの水平伝播は、典型的には感染ダムの乳汁中に存在するＭＭＴＶビリオンによるマウスの子の感染によって起こる。このように、授乳によってマウスにＭＭＴＶを伝播できる。内在性ＭＭＴＶの３０以上の特異的プロウイルス組込み部位が同定されている。しかし、いずれの内在性ＭＭＴＶプロウイルスも運ばない野生マウスもいる（Cohen及びVarmus,1979；Cohenら,1982）。この結果は、多くの内在性ＭＭＴＶプロウイルスが比較的最近マウスゲノムに加わったことを示唆している。最も有望な説明は、Mus属のいろいろな種及び亜種間の進化的分割後の複数機会にＭＭＴＶが特定のマウス（他のマウスではなく）の生殖系列に入ったということである。特定の内在性ＭＭＴＶはホルモンによって活性化され、長い潜伏期間後に乳癌を誘発できる感染性ビリオンを形成することができる。ほとんどの内在性ＭＭＴＶプロウイルスは不完全で、感染性ビリオンをコードしない。
【０００４】
ＭＭＴＶ遺伝子と発癌性の細胞性遺伝子の役割
ＭＭＴＶＯｒｆタンパク質は、スーパー抗原（ＳＡ）として機能しうる。胎児性／初期発生の際に胸腺内で発現されると、それはＳＡ反応性のＴ細胞の完全又は不完全な欠失を媒介できる。ＳＡ発現は、育児している子の腸関連リンパ系組織内でＭＭＴＶのＢ細胞標的を活性化するために必要である。従って、ＳＡ応答性クローンの完全な欠失はマウスに腸内ＭＭＴＶ感染に対する抵抗性を与え、ひいてはＭＭＴＶ誘発型腫瘍の発生率を低くする。他方、リンパ系細胞の部分的にのみ欠失された応答性クローンを有するマウスでは、ＳＡ活性化は標的の拡大及びＭＭＴＶの伝播を刺激する。雌の感染動物が思春期に達すると、エストロゲンホルモンがそのホルモン応答性要素（ＨＲＥ）を通じてＭＭＴＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）を発現させる。これは、ＭＭＴＶの生産と構築及び乳房及び卵巣を含む他のホルモン感受性組織へのウイルスの伝播を可能にする。ＭＭＴＶＬＴＲｓをプロト癌遺伝子Int、Wnt及びFgfのような特定の細胞性遺伝子に隣接して組込むと、これら遺伝子の発現を増大し、その結果ＢＣ及び他の癌になりうる。
【０００５】
ＭＭＴＶ間の分子遺伝相互作用、そのマウス宿主の免疫系、及びこのレトロウイルスによって悪性に形質転換された乳房や他のホルモン感受性細胞について広範に研究されている。ＭＭＴＶは、挿入突然変異誘発によってマウスの乳腺癌の成長を促進する（Varmusら,1978；Varmusら,1985）。ＭＭＴＶプロウイルスＬＴＲ要素は、Wnt、Fgf及びIntを含む種々の細胞性発癌遺伝子のステロイドホルモン依存性トランス活性化を方向づけし、それによって腫瘍細胞のクローン拡大を促進する（Shackleford及びVarmus,1987,Shacklefordら,1993；Jakobovitsら,1986；Nusse,1991；Nusseら,1985）。生産的な持続性感染及びその複製サイクルの完成のため、ＭＭＴＶはスーパー抗原を含み、かつ機能的な宿主免疫系と相互作用しなければならない（Golovkinaら,1995；Luther及びAcha-Orbea,1996；Coffin,1992）。
【０００６】
ヒト乳癌ウイルスの検索
発癌遺伝子ＭＭＴＶの発見は、多くの研究者がヒトのＢＣに対するレトロウイルス病因学を探求するのを促した（Sarkar,1980）。過去５０年にわたって収集されたデータは、ＭＭＴＶのヒト相同体の存在を示唆している。1971年、Mooreと共同研究者らは、一般的集団の５％と比較してＢＣ患者由来のヒト乳汁試料の60％が電子顕微鏡でＭＭＴＶと識別不能なＢ型粒子を含有していることを報告した（Mooreら,1971）。この研究者らは、インドの39％のParsi女性、すなわちＢＣの発生率が２倍多い近交系集団が彼女たちの乳汁中にＢ型粒子を有することをも報告した（Dasら,1972；Moore,1971）。いくつかの研究によって、ＢＣ細胞は、すべてのレトロウイルスに付随する酵素である逆転写酵素（ＲＴ）をも含有するが、正常組織由来の細胞は含有しないことが示された。正常組織由来でない細胞を除き、多くの研究者は、ＭＭＴＶと反応性の抗体の存在について血清及び母乳を調査した。これら研究のほとんどが、プレＡＩＤＳ段階で、献血中のＨＩＶ抗体の検出に必要とされる抗レトロウイルス抗体を検出するための高感度かつ特有な技術が出現する前に行われた。
【０００７】
ヒト乳癌組織、乳汁、患者の血清、及びＭＭＴＶのヒト相同体の存在を示唆する乳癌細胞系に関する多くの電子顕微鏡、生化学及び免疫学的研究にもかかわらず、このような物質が存在するという証拠は依然として排他的なままである（Anderssonら,1996；Ziegler,1997）。ほとんどの著者は、多くのヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶｓ）の存在という理由からＭＭＴＶのヒト相同体の証拠を示すことを主張する先行研究の重要性を退けた（Larssonら,1994；Liら,1996；Lowerら,1996；Meeseら,1996；Ono,1986；Patienceら,1996；Faffら,1992）。ヒトゲノムには約50,000のＨＥＲＶｓ又はＨＥＲＶ関連配列があり、そのいくつかがＭＭＴＶに対して60％までの相同性を有することがわかっている。このことについては、ＨＥＲＶ-Ｋ１０に対する当該血清反応性に注目することは重要であり、この点で、ＭＭＴＶに最も親密に関連すると考えられるＨＥＲＶは、乳癌患者の血清及び健康な個体の少数に存在するＭＭＴＶ反応性抗体の理由とはなりえない（Vogetsederら,1995）。さらに、我々は、これらＭＭＴＶ関連配列の存在がＭＭＴＶのヒト相同体が分子技法によって確証的に以前には示されなかったまさにその理由であると考える。これら関連するが異なる配列の存在が、サザンブロット法のようなあまり感受性でない技法を用いていた以前の研究者による、より密接に関連した配列の検出を世に埋もれさせたのだろう。
【０００８】
最近になってＭＭＴＶの配列に対してかなり高度な相同性（＞90％）を有する配列がヒトＢＣ組織から単離された（Wangら,1995,1998；）。ＭＭＴＶ envと95〜99％同様の配列がＰＣＲによって314個の非選択性乳癌腫瘍試料の121個（38.5％）で増幅された。ＭＭＴＶ様の配列は、整復乳房形成由来の107個の検体のたった２個だけで（1.8％）検出され、また正常組織又は非乳房腫瘍由来の試料では０／80だった。ＭＭＴＶ-env様ＲＮＡは（ＲＴ-ＰＣＲによって決定されるように）66％のＤＮＡＰＣＲ陽性の乳房腫瘍で発現された（Wangら,1998）。ＭＭＴＶに対して94％の類似性を有する完全な9.9kbプロウイルスが２個の乳房腫瘍内で検出された。ＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリッド形成法）は、ＢＣ腫瘍由来のＤＮＡの数部位における組込みを明らかにしたが、正常の乳房細胞では見られなかった（Wangら,1999 ＡＣＲ mtg. アブストラクツ#2933,2944）。Wangらは、感染の内在性ルートで伝播される（水平伝播）ヒト乳癌ウイルス（ＨＭＴＶ）の存在を示唆した。これら及び他の研究者らによるＭＭＴＶ関連ウイルスの他の領域を、ＢＣを持っていない被検者のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから増幅するという試みは、ＭＭＴＶに対して約60％の相同性しか有していないＨＥＲＶ配列（ＨＥＲＶ-Ｋ１０のような）を与えた。このように、ＢＣ組織は、ＭＭＴＶの配列と高度に類似する配列が今までに見出されている唯一の組織である。従って、正常な乳房組織及び他の組織はＭＭＴＶに高度な相同性を有するウイルスの発現に対して陰性であると考えられる。
【０００９】
ＭＭＴＶは水平に或いは垂直に伝達されうる
レトロウイルス複製サイクルは、ビリオン関連逆転写酵素（ＲＴ）の多酵素活性による一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの二本鎖プロウイルスＤＮＡへの転換を特徴とする。他のレトロウイルスの場合と同様に、ウイルスタンパク質の発現及び感染子孫の産生のため、ＭＭＴＶプロウイルスＤＮＡを宿主細胞のゲノムへ組込む必要がある。感染マウス乳腺のみならず異種細胞の両方で、ＭＭＴＶプロウイルスＤＮＡは多数の明らかにランダムな部位に組み込まれる。Int、Wnt、及びFgfのようないくつかの細胞性遺伝子（プロト−発癌遺伝子）の近傍に転写的に活性なＬＴＲを含有するＭＭＴＶプロウイルスを組込むと、その結果、これら遺伝子の過剰発現、細胞形質転換及び腫瘍細胞のクローン拡大となりうる（Varmus,1985；Shacklefordら,1993；Jackobovitsら,1986；Cohen,1980；Breznik及びCohen,1982）。ＭＭＴＶ誘発発癌の長い潜伏は、部分的にはプロウイルスのこれら特定部位への組込みの必要性によって説明される。
【００１０】
ＭＭＴＶのウイルス株間の遺伝的相違は、部分的にはマウスの多種多様な株でＢＣの発生率が変わることで説明できる。Ｃ３Ｈ系統のマウスは、ＢＡＬＢ/ｃマウスのＢＣ発生率が＜１％であるのに比し、90％より多いＢＣ発生率を有する。Ｃ３Ｈの雌に授乳されたＢＡＬＢ/ｃマウスは、高いＢＣ発生率を有し、Ｃ３Ｈの腫瘍化ＭＭＴＶが乳汁内で水平に伝達されうることを示唆している（Bittner,1936）。逆に、Ｃ３ＨマウスがＢＡＬＢ/ｃの雌に授乳された場合、ＢＣの発生率は顕著に低減するが（22〜55％）、低発生率のマウス系統ほど低くはない。この後者の観察は、高発生率系統の水平伝播される乳汁由来ウイルスの重要性を強調しているが、内在性ＭＭＴＶプロウイルス間の腫瘍化の可能性における実質的な相違をも示している。高低の腫瘍発生率を有する種々のマウスのプロウイルスは、溶液ハイブリダイゼーション反応速度論及び制限エンドヌクレアーゼ消化パターンの相違によって区別できるだろう（Cohenら,Cell,1979；Cohen及びVarmus,1979,1980；Traina-Dorge及びCohen,1983；Breznikら,1984）。低メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡとを区別する制限酵素を用いて、ほとんどの内在性プロウイルスが大量の５-メチルシトシンを含有するのに対して、乳汁由来ＭＭＴＶのプロウイルスが低メチルであることも示された（Cohen,1980；Breznik及びCohen,1982；Breznikら,1984）。低メチル化は遺伝子発現の増加と関連するので、この観察はＢＣの高発生率を有するマウス系統中の水平伝播される乳汁由来ＭＭＴＶの重要性を説明できる。内在性ＭＭＴＶプロウイルス特有の低メチル化は、ＢＡＬＢ/ｃマウスの授乳中乳腺の1.6kb転写物の発現に関連していた（Traina-Dorgeら,1985）。
【００１１】
他の研究では、内在性ＭＭＴＶプロウイルスは、同系交配時に安定な遺伝ユニットとして分離し、特定のこれら内在性プロウイルスが転写的に活性であることが示された（Cohenら,Cell,1979；Cohen及びVarmus,1979,1980；Trainaら,1981；Traina-Dorge及びCohen,1983；Traina-Dorgeら,1985；Varmusら,1978）。組換え型近交（ＲＩ）系統のマウスを使用してＭＭＴＶプロウイルス組成物及び染色体位置を定義した（Trainaら,1981；Traina-Dorge及びCohen,1983）。ＲＩ系統は、２匹の高度な近交系由来マウスを交雑し、ランダムにそのＦ２世代の兄弟と姉妹を番わせて別個の系としてそれぞれ維持することによって発生された。多くの遺伝子座はこれら系統の特異的な染色体に配置された。これら遺伝的マーカーを有する種々のＭＭＴＶプロウイルスの分離パターンを制限エンドヌクレアーゼ解析及びサザンブロット法で解析することによって、これら系統の多数のＭＭＴＶプロウイルスの染色体位置を決定し、かつメンデル遺伝の法則によってこれらプロウイルスが分離することを確証することができる。これら及び他の解析によって、これら動物内のいくつかは全長でいくつかは不完全な１０の別個のＭＭＴＶユニット（プロウイルス）が定義された。ほとんどのＭＭＴＶプロウイルスについての遺伝の割合は単純な単一遺伝子遺伝と一致したが、３つのＭＭＴＶユニットはいくつかの変化を示した。最も注目すべきは、解析された26種のＲＩ系統のうち23種に存在していた１匹の親に寄与するユニットの存在だった。転写的に活性かつ腫瘍産生の増加に関連する特有のプロウイルスユニットが同定された（Traina-Dorgeら,1985）。重要なことに、病気が進行している宿主遺伝子の関与を示すウイルス発現にかなり関連している細胞性遺伝子が同定された（Traina-Dorgeら,1985）。
【００１２】
いくつかの系の証拠は、比較的最近に種々の系統のマウスの生殖系列で内在性ＭＭＴＶプロウイルスが組込まれたことを示している（Cohen及びVarmus,1979；Varmusら,1978）。ＭＭＴＶがハツカネズミ（実験マウス）の前駆体に存在する要素から進化されたとすれば、すべての個々のマウスは同様のＭＭＴＶプロウイルスを有すると予想されるだろう。しかし、実験マウスと野生マウスの両方ともＭＭＴＶプロウイルスに対してかなり変化する数と分布の生殖系列組込み部位を有するいくつかの場所で捕捉した（Cohen及びVarmus,1979）。これら結果で最も衝撃的な発見は、内在性ＭＭＴＶプロウイルスを何も含有しない野生動物が存在することだった。これら結果の最も可能性のある説明は、内在性ＭＭＴＶプロウイルスが、マウスの進化した前駆体中に存在する遺伝的要素から生じるのではなく、むしろMus属の特異化後に胚芽細胞のＤＮＡ中への多数の独立した組込みによって生じたということである。
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、ＭＭＴＶの配列に対して相同性の内在性レトロウイルスである１種以上の乳癌ウイルス由来の組換えＤＮＡ分子を提供する。詳細には、本発明の配列は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、２１、２３、２５、２７、若しくは２９の全部若しくは一部と少なくとも99％の同一性、又は配列番号１０と少なくとも92％の同一性を有する。
また、本発明は上述のＤＮＡの転写によって生成されるＲＮＡ分子を提供する。さらに、本発明は本発明のＭＴＶＤＮＡから転写されたＲＮＡのインフレーム翻訳の結果生じるポリペプチドを提供する。本発明により、限定するものではないが、ヒト、ネコ、及びアカゲザルを含むソースのようないずれかの適切なソースから、関連ＤＮＡ配列が誘導できる。
【００１４】
本発明は、乳癌ウイルス（ＭＴＶ）ＤＮＡ、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、２１、２３、２５、２７、若しくは２９の配列、又はそれらと少なくとも99％の同一性を有する配列を含む組換えＤＮＡプラスミド（ベクター）をも提供する。すなわち、前記ＤＮＡ配列がベクターに取り込まれる。
本発明の一実施形態では、ベクターはさらにＭＴＶ配列に作用可能に連結される（すなわち、機能性ＭＴＶＲＮＡ及び／又はタンパク質のインビボ及びインビトロ生成が可能なように適切な読み枠に結合される）異種プロモーターを含む。本発明のこの実施形態の一局面では、ＭＴＶＤＮＡを含むベクターは、以下の細胞型の少なくとも１種内でエピソーム複製又は染色体組込みが可能である：細菌細胞、イースト細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、及び哺乳類細胞（この細胞型のリストは代表であり、網羅されていると考えるべきでない）。本発明のこの実施形態の別の局面では、異種プロモーターが１種以上の細胞型内でＭＴＶＤＮＡ配列を発現させる。本発明のこの局面の一部として有用と考えられる細胞型としては、限定するものではないが、細菌細胞、イースト細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、及び哺乳類細胞が挙げられる。
【００１５】
本発明の別の実施形態により、上述のＭＴＶＤＮＡ配列を使用して、（血清その他のような生物学的起源の）試料中のＭＴＶＤＮＡ又はＲＮＡの存在を検出する方法を提供できる。
本発明の別の実施形態は、試料が上記ＭＴＶＤＮＡ配列（例えば、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、２１、２３、２５、２７、若しくは２９の転写及び翻訳から誘導されるポリペプチド配列）由来のタンパク質を認識する抗体を含むかどうかを決定する方法を提供する。この局面に対する結果として、本発明は本発明の１種以上のポリペプチドを特異的に検出する抗体をも提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、生物学的又は他タイプの試料中の乳癌ウイルス由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、又はポリペプチドを検出するのに有用な診断用キットを提供する。
本発明の別の実施形態は、宿主動物内のＭＴＶの活性を弱め又は取り除く方法を提供する。この実施形態の種々の局面によって、ＭＴＶ逆転写酵素、プロテアーゼ、又はインテグラーゼ酵素の活性を破壊する物質を含む医薬組成物が提供される。この実施形態の別の局面によって、宿主動物内の免疫応答を誘発可能な医薬組成物が提供される。
【００１７】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、かつ本発明の特定の局面をさらに説明することを意図している。本発明は、本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と共にこれら図面の１つ以上を参照することにより、さらに良く理解することができる。
図１は、ヒト乳癌組織由来のＭＭＴＶに関連する配列の増幅結果を示す。パネルＡ：ＤＮＡはヒト乳癌（Michael Press,M.D.,USC,Los Angeles又はDerrick Beech M.D.,TMC/UT Memphisの好意によって提供された）から抽出され、該ヒトＭＭＴＶ env−関連遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。ブロット法によってＰＣＲ生成物をニトロセルロースに伝達し、ＭＭＴＶ関連生成物を1.8kbのＭＭＴＶ envプローブへのハイブリダイゼーションによって検出した。レーンａ：非放射性マーカー、示さず；レーンｂ〜ｄ、ｆ〜ｈ、ｊ：乳癌ＤＮＡ；レーンｅ及びｉ：ＤＮＡなし；レーンｋ：水の対照；レーンｌ正の対照：pBluescript^TM内でクローン化されたＭＭＴＶ env断片。パネルＢ：臨床試料由来のＤＮＡの組込みの試験として、Griffithsら（1997）によって開発されたＰＣＲ条件を用いてＨＥＲＶ-３プロウイルスＤＮＡ、単一コピーヒト内在性レトロウイルスを増幅した。臭化エチジウム検出（マーカーはレーンａに見える）。レーン１以外パネルＡと同一試料：正の対照、pBluescript^TM（Stratagene）内でクローン化されたＨＥＲＶ３ pol断片。可視バンドがレーンｃとｇに存在したが、うまく複製しない。
【００１８】
図２は、健康な対照の血液由来のＭＭＴＶに関連する配列の増幅の例を示す。パネルＡ：ＤＮＡは健康な対照被験者の全血から抽出し、ヒトＭＭＴＶ env関連遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行って、ＰＣＲ生成物をサザンハイブリダイゼーション法によって検出した。レーンａ：マーカー；レーンｂ〜ｋ：健康な対照の全血由来のＤＮＡ；レーンｌ：水の対照；レーンｍ正の対照：pBluescript^TM（Stratagene）内のＭＭＴＶ env断片。パネルＢ：ＨＥＲＶ-３のＰＣＲ増幅。臭化エチジウム検出（マーカーはレーンａに見える）。レーンｍ：正の対照、pBluescript^TM（Stratagene）内のＨＥＲＶ３ pol断片以外はパネルＡと同一試料。
【００１９】
図３は、ＨＭＴＶｍＲＮＡのリボヌクレアーゼ保護アッセイによる検出の例を示す。ＲＮＡは３種のＨＭＴＶＰＣＲ陽性乳癌腫瘍又はイースト細胞から抽出し、ＨＭＴＶに特異的な189塩基プローブか、β-アクチン用の245塩基プローブのどちらかにハイブリダイズした。そして、試料をＲＮアーゼ A/T1で消化した。ハイブリダイズされたＲＮＡによって検出された標識プローブの断片を可視化し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離後解析した。３つの腫瘍試料のうち２つは、ＨＭＴＶプローブで予期した大きさのの保護断片を与えたが（矢印）（レーン１〜３）、β−アクチンプローブですべての３つの腫瘍ＲＮＡｓが保護断片を与えた（レーン５〜７）。予想どおり、どのプローブもイーストＲＮＡによっては特異的に保護されなかった（レーン４、８）。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、マウス乳癌ウイルスに高度の配列相同性のウイルスである乳癌ウイルス（ＭＴＶ）由来の単離ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドを提供する。さらに、本発明はこれら巨大分子を用いた診断方法を提供する。また、本発明は、この開示された方法に従って使用可能なＭＴＶＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はポリペプチドを含む医薬組成物及び診断キットをも提供する。
【００２１】
本発明の種々の実施形態は、少なくとも以下の１つに対応するＭＴＶ核酸を提供する：以下の１つと少なくとも99％の同一性を有するＤＮＡ配列：
ａ）配列番号２、３、４、５、７、８、２１、２５、若しくは２７と少なくとも99％の同一性；又は
ｂ）以下の１つ以上と少なくとも99％の同一性：配列番号２の少なくとも340個の相接塩基、配列番号３のヌクレオチド１〜380で表される配列の少なくとも150個の相接ヌクレオチド、配列番号４のヌクレオチド１〜400で表される配列の少なくとも140個の相接ヌクレオチド、配列番号５のヌクレオチド１〜360で表される配列の少なくとも130個の相接ヌクレオチド、配列番号６の少なくとも130個の相接ヌクレオチド、配列番号７のヌクレオチド１〜380で表される配列の少なくとも140個の相接ヌクレオチド、配列番号８のヌクレオチド20〜462で表される配列の少なくとも210個の相接ヌクレオチド、配列番号２１のヌクレオチド97〜462で表される配列の少なくとも160個の相接ヌクレオチド、配列番号２３の少なくとも170個の相接ヌクレオチド、配列番号２５のヌクレオチド337〜462で表される配列の少なくとも100個の相接ヌクレオチド、配列番号２７のヌクレオチド85〜462で表される配列の少なくとも300個の相接ヌクレオチド、若しくは配列番号２９の少なくとも200個の相接ヌクレオチド；又は
ｃ）配列番号１０と少なくとも92％の同一性。
【００２２】
好ましくは、配列は配列番号２、３、４、５、６、７、８、２１、２３、２５、２７、若しくは２９の200、250、300、350若しくは400個より多くのヌクレオチドと99％より高い同一性を有する。別の好ましい実施形態では、配列は配列番号１０と93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％より高い同一性を有する。さらに好ましくは、これら核酸はヒト、ネコ、又はアカゲザルＭＴＶの核酸由来である。最も好ましくは、ＤＮＡは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、２１、２３、２５、２７、若しくは２９の全部又は一部と同一である。
本発明のこの実施形態の一局面では、上述のＭＴＶＤＮＡ配列はベクターに組み込まれる。本発明の種々の関連した局面では、ＭＴＶ配列は、異種プロモーターの転写調節下にある。本発明に有用と考えられるベクターは、以下の細胞型の少なくとも１種内でＭＴＶＤＮＡ配列を発現できる：昆虫細胞、細菌細胞、鳥類細胞、イースト細胞、又は哺乳類細胞。さらに、本発明のこの局面のベクターは、リストされた細胞型の少なくとも１種内でエピソーム複製及び／又は染色体組込みが可能である。
【００２３】
この実施形態の別の局面では、ＤＮＡ配列は１つ以上の検出部分を含む。本発明に好適と考えられる検出部分としては、限定するものではないが、蛍光染料、及び亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、若しくは水素の放射性同位体が挙げられる。
本発明のこの実施形態のさらに別の局面では、単離ＤＮＡ分子が本発明に適合する希釈剤に懸濁又は溶解される。好適な希釈剤は本発明の種々の実施形態によるＤＮＡの使用を妨げない。本発明のこの実施形態により有用な希釈剤は当業者には周知である。それらは、限定するものではないが、緩衝水溶液を含む。これらは本発明と適合するいずれの化合物とも緩衝させることができる。例示的な緩衝剤としては、ホスフェート緩衝液及びトリスヒドロキシアミノメタン（Tris）を含む緩衝液が挙げられる。このような緩衝水溶液は、さらに本発明の実施を妨げない塩化ナトリウムのようないずれの他の化合物をも含んでよい。本発明のこの局面により、ＭＴＶＤＮＡはいずれの適切な濃度でも存在しうる。約0.1ng/μl〜100μg/μlの濃度が好ましい。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、上述の核酸によってコードされるＲＮＡ転写物及び／又はポリペプチドを提供する。この実施形態の種々の局面で、これらＲＮＡ転写物及びポリペプチドは上記ＤＮＡ配列のいずれによってもコードされる。これらＲＮＡ転写物及びポリペプチドはＭＭＴＶ env、gag、又はpol遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写物及びポリペプチドの相同体である。この実施形態の一局面では、ＲＮＡ転写物は上述のＤＮＡ配列によってコードされる。このようなＲＮＡ転写物は該ＲＮＡがチミジンの代わりにウリジンを含有すること以外開示されたＤＮＡ配列と同一の配列を有する。この実施形態の別の好ましい局面では、精製ポリペプチドは、ヒト、ネコ、又はアカゲザル乳癌ウイルス由来のタンパク質生成物であるenv、gag、又はproの全部又は一部と配列で一致する。ペプチドは精製されたポリペプチドであることが好ましい。本発明の好ましい局面では、精製ポリペプチドは、上述のいずれのＭＴＶＤＮＡ配列のインフレーム転写及び翻訳から生じる配列の全部又は一部からも構成される。本発明のさらに好ましい局面では、ポリペプチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、２１、２３、２５、２７、若しくは２９のインフレーム翻訳の生成物に配列で一致する。最も好ましくは、本発明のポリペプチド配列は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２４、２６、若しくは２８の全部又は少なくとも８０個のアミノ酸に一致する。用語「ＭＴＶＤＮＡに由来する」とは、該ＲＮＡ又はペプチドが、それぞれＭＴＶＤＮＡの転写によって、又は転写とインフレーム翻訳によって産生されたＲＮＡ又はペプチドに配列で一致することを表す意である。
【００２５】
「精製ポリペプチド」とは、試料中のポリペプチドの過半数（50％より多く）がＭＴＶポリペプチドであることを意味する。好ましくは、ＭＴＶポリペプチドが精製ポリペプチド試料中の70％より多くのポリペプチドを構成する。さらに好ましくは、ＭＴＶポリペプチドが試料中のポリペプチドの90％より多くを構成する。さらにもっと好ましくは、ＭＴＶポリペプチドが試料中のポリペプチドの95％より多くを構成する。さらに、用語「精製ポリペプチド」は、試料が本発明の実施を妨げる物質を含有しないことを示す。本発明によって得られる精製ポリペプチドは、本発明に適合するいずれの適切なソース由来でもよい。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、上述のようなＭＴＶポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のこの局面による抗体は、１種以上の本発明のポリペプチドを抗原性物質として使用して生成される。このような抗体は事実上モノクロナール又はポリクロナールのどちらかでよい。好ましくは、抗体はモノクロナールである。一旦ＭＴＶが供給されると、本発明のこの局面の抗体は当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、ポリクロナール抗体は、一般に抗原性物質を（完全なフロイントのアジュバントのような免疫応答促進剤の存在下で）ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、又はウサギのような動物に注射することによって産生される。
【００２７】
本発明のこの局面のモノクロナール抗体は、ハイブリドーマ融合法又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を利用する技術−ここで述べるように改変された当業者には周知であるような不死化技術（ヒトmAbsを生成するための）によって調製することができる。本発明の方法において、これら技法は、当該動物内で所望の免疫応答を誘発する（すなわち、抗体の産生）ように免疫原、この場合精製ＭＴＶポリペプチドを注射することを含む。実験動物（例えば、マウス）は同一の不死化細胞系の反復注射（ブースト）を投与される。最終段階で、動物は選択された細胞型の一次細胞の注射が投与される。
【００２８】
ここで、巨核球細胞に対するアゴニストモノクロナール抗体の生産についての説明用実施例では、ＣＭＫ細胞調製品及びＣＭＳ細胞調製品を第１免疫原として使用した；しかし、Ｍｏ７ｅ又はＤＡＭＩ細胞のような別の不死化巨核球細胞を使用することができる。本発明のアゴニスト抗体に類似する別のモノクロナール抗体ＢＡＨ-１は、特異的にＣ-Ｍｐｌレセプターを認識するが、免疫原として膜結合ｃ-Ｍｐｌレセプタータンパク質を用いて生成できる。他の細胞型に対するアゴニストモノクロナール抗体を生成するため、造血性系列の他の細胞、例えば幹細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞が選択される。第１免疫化段階では、幹細胞は、例えば不死化細胞系ＣＴＳによって表すことができ；不死化細胞系ＡＲＨ-77、ＳＢ又はＮａｌ-６によってＢ細胞；また不死化細胞系ジャーカット細胞又はＨ９によってＴ細胞を表すことができる。
【００２９】
十分な時間の後、動物は犠牲にされ、体細胞性の抗体産生細胞が初回刺激を受けた動物のリンパ節、脾臓及び末梢血液から得られる。脾臓細胞が好ましい。マウスリンパ球は、後述するマウス骨髄腫との安定融合を高パーセンテージで与える。ラット、ウサギ、カエル、ヒツジ及び他の哺乳類の体細胞性細胞を使用することもできる。所望の免疫グロブリンをコードする脾臓細胞染色体は、脾臓を骨髄腫細胞と、通常ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような融合剤の存在下で融合することによって不死化される。標準法の融合相手として多くの骨髄腫細胞系のいずれも使用できる；例えば、P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653又はSp2/O-Ag14骨髄腫系。これら骨髄腫系は、American Type Culture Collection(ＡＴＣＣ),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209から入手可能である。
【００３０】
その結果の細胞は所望のハイブリドーマを含んでおり、ＨＡＴ培地のような選択培地で成長し、融合されない親の骨髄腫又はリンパ球細胞は最終的に死ぬ。ハイブリドーマ細胞だけが生き残り、限界希釈条件下で成長して単離クローンを得ることができる。このハイブリドーマの上清を所望の特異性の抗体が存在するかについて、例えば本明細書で述べるようなイムノアッセイ法によって、免疫原用に使用されている抗原を用いてスクリーニングする。そして、陽性クローンを限界希釈条件下でサブクローニングし、産生されたモノクロナール抗体を単離することができる。他のタンパク質や他の混入物を無くすようにモノクロナール抗体を単離及び精製するために種々の慣習的な方法がある。モノクロナール抗体の精製に一般に使用される方法としては、硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。これら方法によって生成されるハイブリドーマは、技術的に公知の技法によってインビトロ又はインビボ（腹水中で）増殖させることができる（一般的には、Harlowら,Antibodies.実験室マニュアル，Cold Spring Harbor Laboratory,pp.1-726,1988参照）。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、生物学的及び／又は他のタイプの試料中のＭＴＶからＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を検出する方法を提供する。
本発明のこの実施形態の一局面は、以下の工程を含む、試料中のＭＴＶＤＮＡの検出方法を提供する：
i）１種以上の上記ＭＴＶＤＮＡ配列を含有する疑いのある試料を得る工程； ii）工程ｉ）で定義されるようなＤＮＡ配列を増幅するためにポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程；及び
iii）工程ii）で生成されたアンプリコン（amplicon）（ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ）の配列を決定するか、又はそうでなくても特徴づけて、前記試料中に工程ｉ）で定義されるようなＤＮＡ配列が存在するか否かを決定する工程。
【００３２】
この実施形態の別の局面は、以下の工程を含む、試料中のＭＴＶＲＮＡの検出方法を提供する：
i）１種以上の上記ＭＴＶＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡを含有する疑いのある試料を得る工程；
ii）ＲＮアーゼタンパク質アッセイ（ＲＰＡ）を行う工程；及び
iii）前記ＲＰＡの結果を解析して、前記試料中に工程ｉ）で定義されるようなＲＮＡが存在するかを決定し、任意に前記ＲＮＡを定量化する工程。
これら方法の工程を最適化するために必要なパラメータの選択は、十分に当業者の能力内であることは当業者によって認められるだろう。これらパラメータ、例えば、ＰＣＲ条件（例えば、アニーリング温度、伸長時間、及びプライマーの選択）及びＤＮＡ配列決定法は、このような分子生物学法が利用される研究室で日常的に決定される。
【００３３】
本発明のこの実施形態の別の局面は、試料がＭＴＶポリペプチドを認識する抗体を含有するかどうかを決定するために試料を解析する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：
i）乳癌ウイルス抗体に特異的な抗体を含有する疑いのある試料を得る工程；
ii）少なくとも１種の精製ＭＴＶポリペプチドを得る工程；
iii）工程i）の試料と工程ii）のポリペプチドとを用いて、ウェスタンイムノブロット解析を行う工程；及び
iv）工程iii）の結果を解析して、前記試料中に工程ii）のポリペプチドと特異的に相互作用する抗体が存在するか否かを決定する工程。
【００３４】
本発明のこの実施形態の別の局面は、試料がＭＴＶタンパク質を含有するかを決定するために１種以上の免疫組織化学的方法によって細胞培養又は組織試料を解析する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：
i）乳癌ウイルスタンパク質を含有する疑いのある試料を得る工程；
ii）工程i）の試料を免疫化学的解析用に調製する工程；
iii）工程ii）の試料を、１種以上の上記ＭＴＶＤＮＡ配列によってコードされるＭＴＶポリペプチドに特異的なモノクロナール又はポリクロナール抗体の１種又は２種以上の組合せとインキュベートする工程であって、前記抗体が任意にそれらの特異的検出を可能にする部分を有する工程；
iv）前記試料を洗浄して、特異的に結合されない抗体を除去する工程；
v）前記試料を選択された検出法に適するように加工する工程；及び
vi）工程v）の結果を解析して、前記試料中にＭＴＶタンパク質が存在するか否かを決定する工程。
【００３５】
免疫化学的解析は、限定するものではないが、ウェスタンブロッティング又はエンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイによる解析が含まれると考えられる。これら方法の実施を最適化するために必要なパラメータの選択は当業者の能力内であることが認められる。解析は直接的な免疫化学（抗体が検出可能な部分で標識されている場合）又は間接的な免疫化学によって行うことができる。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、上述のＭＴＶＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を含有する医薬組成物を提供する。これら組成物は、さらに製薬的に許容される賦形剤、キャリヤー、又は希釈剤を含んでよく、いかなる生物学的に有害な物質も含まない。本発明の医薬組成物は、当業者によって処方されうる。好適な製薬的処方は、本分野の標準テキストであるReimington's Pharmaceutical Sciencesに記載されており、これは参照によって本明細書に取り込まれる。
【００３７】
医薬組成物は、さらに着色若しくは安定剤、浸透圧剤、抗菌剤、又は該組成物の機能を妨げない限りいずれの他の物質も含んでよい。本発明の医薬組成物は、製薬的に許容される非経口的媒体と共に、例えば溶液、懸濁液、又はエマルジョンとして調製することができる。このような媒体の例は、水、食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、及び５％ヒトアルブミンである。リポソームも使用できる。媒体は等張性（例えば、塩化ナトリウム又はマンニトール）を及び化学的安定性（例えば、緩衝液及び保存剤）を維持する添加剤を含有してよい。内毒素コンタミネーションは安全レベル、例えば0.5ng/mgタンパク質未満に保持されるべきであることは明らかである。さらにヒト投与のためには、調製品は、生物学標準の米国食品医薬品局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度基準に応じるべきである。製剤はろ過のような一般的に使用される技法で無菌にすることができる。
【００３８】
フレーズ「製薬的に許容される」とは、動物、又はヒトに適切に投与された場合、有害な、アレルギー性の、又はそうでなくても都合の悪い反応を生じない物質及び組成物を意味する。これら有害な効果を引き起こす物質は、本発明の範囲内で「生物学的に有害」として分類される。製薬的に許容される物質及び組成物としては、限定するものではないが、溶剤、分散媒、被覆物、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤が挙げられる。本発明に不適合でない限り、いずれの通常成分の使用も考慮される。さらに、いくつかの他の製薬的に都合のよい目的に役立つ補助活性成分も本組成物に取り入れることができる。
【００３９】
上述の方法及び組成物は、患者の組織内にＭＴＶ又はＭＴＶウイルス成分が存在するか否かの決定を助けるのに甚大な利益を与えると考えられる。この知見は、病原学的にＭＴＶに由来する癌に対する患者の罹患率を予測する助けになるだろう。本方法は、患者のウイルス負荷（その人の組織に存在するウイルスの量）を決定する手段を提供する。この点で、本明細書で述べる方法を一般集団の広範囲のスクリーニング、特にすべての成人した女性のスクリーニングに採用することによって莫大な利益がもたらされると予想される。
本発明の種々の実施形態の一部として考えられる他の組成物は、ヒト又は他の動物に存在するウイルスの量を安定化又は低減する手段を提供する。
【００４０】
上述の種々の方法は、ＭＴＶＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はポリペプチドの存在を検出するための診断用キットを調製するのに容易に適応可能である。結果として、本発明の臨床プラクティスのため、本発明のさらなる別の実施形態が考慮され、診断用キットが提供される。このようなキットは試料中に存在するＭＴＶＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はポリペプチドを検出し、かつできればその量を決定するために試料を定性及び定量分析するのに有用である。本発明のこの実施形態の一局面では、キットはその成分の一部として、１種以上の上記ＭＴＶＤＮＡ配列を含む１種以上の組換えＤＮＡ分子を含有する。また本発明のこの局面に従い、キットは組換えＭＴＶＤＮＡに加え（又はそれに代えて）、これらＭＴＶＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に有用な１種以上の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含むことができる。
【００４１】
本発明のこの実施形態の別の局面は、乳癌ウイルスタンパク質を特異的に認識する抗体を検出するためのキットを提供する。その成分の一部として、このキットは、上記ＭＴＶＤＮＡ配列によってコードされる１種以上のポリペプチドを含む試薬を含有する。
また、免疫細胞化学によって、少なくとも１種のＭＴＶポリペプチドに特異的である１種以上の抗体（モノクロナール又はポリクロナールのどちらか）を含むＭＴＶタンパク質の存在を検出するのに有用なキットが考慮される。任意に、これら抗体は検出部分（例えば、蛍光染料又は³⁵Ｓのような放射性同位体）を含むように修飾してよい。
【００４２】
本発明のこれら実施形態のキットは、パッケージを含み、それぞれ個々の診断試験を行うのに必要な１種以上のいろいろな試薬（典型的には濃縮形態で）を含有することができる。本発明のこれら実施形態のキットは、生物学的（又は他のタイプの）試料中のＭＴＶＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質を検出及び／又は定量するのに役立つように考慮される。このような試料は、限定するものではないが、以下から選択することができる：血漿又は血清、全血、尿、痰、結腸流出液、脳脊髄液、リンパ液、骨髄、組織試料（直視下生検由来のような）、又はこれら生物学的分子を含有する疑いのある他の試料。
さらに、キットは１種以上の基準(fiduciary)結果を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「基準結果」は、ある試験結果を比較して定性及び／又は定量の面から該結果を判断する参考基準を指す。「基準系列」は、定性又は定量スケールに沿う点を表すような複数の基準である。この点で、結果を解釈するための基準系列を包含するキットが好ましい。基準は１つ以上の写真の形態でよく、又は文書の説明書を含む他の方法で示されてもよい。
【００４３】
このように、本発明のこの局面に従い、基準はキットの一部として開発され、結果の解釈を導くことができる。この点で、生体試料由来のＲＮＡ又はポリペプチド濃度は前述のとおりに特徴づけられる。試料は、病気のいろいろな段階（無症候性又は本質的に病気でない状態を含む）の患者の代表的な断面から採取して基準系列を調製することができる。この点についての特徴づけは、患者が診断、治療を受け、その後も続けるとき、患者の新生物発達の実際の経過に従うことによって、後になって利益を得ることができる。上述したように、公知の乳癌状態のいろいろな患者と最終結果、及びこれら値の結果として起こる連関についてのウイルス負荷の決定は（ＭＴＶＤＮＡ、ＲＮＡ、又はポリペプチドの量によって決定されるような）、計り知れない予後の値である。これは、患者により正確な予知を与えるのに役立ち、かつそれはこのような処置が必要な場合、治療的処置の最良のコースを決定するのに患者及び腫瘍学者を助ける。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、動物内でＭＴＶに対する免疫応答を誘発する組成物を提供する。この発明の特に熟考した局面は、ヒト内でヒト乳癌ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘発する組成物である（実施例７参照）。このように誘発された免疫は、ホルモン感受性組織に対するウイルスの拡散を遮断することによって、内在性ＭＴＶを保有する個体内の乳癌を阻止することができる。
動物内でウイルスＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対する免疫応答を引き起こす方法も公知であり、例えば参照によって本明細書に取り込まれる、米国特許第5,990,091号及び第6,004,799号を参照されたい。
【００４５】
他の実施形態は、ヒト乳癌ウイルスの活性及び存在を減少させる治療組成物を提供する。全レトロウイルスの一般的な特徴は、ウイルス複製サイクルの種々の段階に関与する３つの酵素、逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、及びインテグラーゼ（ＩＮ）の存在である。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、すなわちＭＴＶと離れた関係のレトロウイルスのＲＴ及びＰＲを標的にする種々の医薬品が開発されている。さらに、選択的にＨＩＶＩＮを阻害する薬品が同定され、この酵素を標的にするプロトタイプ薬が開発中である（Hongら,1998；Mathe,1999；Robinson,1998；Singhら,2000）。本発明の一局面により、１種又は２種以上のレトロウイルスインヒビターを本発明のＭＴＶのレトロウイルスの活性又は拡散を阻害するのに有効量で含有する医薬組成物が提供される。
【００４６】
この実施形態の医薬組成物用の薬剤又は複数薬剤の同定は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。プロテアーゼと逆転写酵素インヒビター及びレトロウイルスとしてのこのような薬剤の有効性を決定する方法の例については、米国特許第5,858,738号、第6,017,928号及び第6,046,228号を参照されたい。これら特許は参照によって本明細書に取り込まれる。本発明のこの実施形態の種々の組成物は、例えば、現在公知のＨＩＶインテグラーゼ、プロテアーゼ、又は逆転写酵素インヒビターを含み；代わりに、このようなインヒビターを修飾してＭＴＶウイルスに対する特異性を高めることができる。同様に、膜貫通糖タンパク質の類似体であるペプチドのような別分類のＨＩＶインヒビターは、プロドラッグとして役立ち、ヒト及び他の種内でＭＴＶの活性及び存在を低減する特異的な薬剤を開発できる。これら組成物は、内在性遺伝的要素としてこれらウイルスを保有するヒト及び他の種内におけるＭＴＶの活性及び拡散を阻害するのに有用であると考えられる。このような薬剤を使用してＭＴＶに冒された乳癌患者を治療でき、また病気の重大度を寛解させ、かつ再発を減少させることが期待される。さらに、このような薬剤を予防的に使用して、病気を発生する高い危険性のある個体の出現を予防することができるだろう。
【００４７】
【実施例】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を説明するために挙げられる。以下の実施例で開示される方法は、本発明の実施でうまく機能するように本発明者らによって発見された方法を表し、従って本発明の実施に好適な態様を構成するとみなすことができることは、当業者に理解されるべきである。しかし、本発明の開示に照らし、開示された特定の実施形態に多くの変更を為すことができ、なおかつ本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同等又は同様の結果を得ることができることを当業者は認めるべきである。
【００４８】
実施例１：ヒトのＭＭＴＶ関連配列
ＢＣ（乳癌）組織と非ＢＣ組織の両方のサブセットを含有するヒトＤＮＡ試料から、ＰＣＲによってＭＭＴＶ env遺伝子に高度に類似する（＞95％）配列を増幅した。ＭＭＴＶ関連配列は、ＰＣＲ及び高感度ブロッティン法によって、乳癌腫瘍内のみならず（図１参照）、健康な対照（図２参照）、及び乳癌ではなく全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の血液サブセット内でも見出された。我々の結果は、Wangと共同研究者らの研究（1995）とは異なっており、彼らはほとんど例外なく、乳房腫瘍内だけでＭＭＴＶ様配列を検出できた。ヒトＤＮＡ由来の配列は、対照として用いたＭＭＴＶ配列とははっきりと識別され、これらのＰＣＲ反応は我々の結果がコンタミネーションのため単純でないことを示している。リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、非ＰＣＲベースの方法でＰＣＲ陽性ＢＣ組織の大多数がｍＲＮＡレベルでこの配列を発現するが、ＰＣＲ陰性組織は何も発現しないことを決定し、これら結果を確認した。これらＰＣＲ反応からの多くの生成物を配列決定した。これら配列の解析は、ＰＣＲコンタミネーションが観察結果について見込みのない説明であるというさらに有力な証拠を与える。同一のＰＣＲ実験で導かれた異なる個体由来のＭＭＴＶ env様配列は、相互に区別された。この結果は、種々の反応チューブ内で同一であるべき（又はほとんど同一であるべき）より一貫性の配列を生成したであろうユービキタスＰＣＲ混入物の欠如を示している。さらに、個々の被験者のＤＮＡは、ＰＣＲ実験ごとに内部的に一貫したＭＭＴＶ env様配列を産生した。所定患者由来のＭＭＴＶ関連配列内の変異は、Taqエラー数が少ないことを示しているかもしれないが、複製レトロウイルスと予想される変異（逆転写酵素エラー）の示唆でもある。
【００４９】
実施例２：ＭＴＶＲＮＡレベルのＲＮアーゼ保護アッセイ決定
リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）はＰＣＲ増幅ではなく特定のＲＮＡ種のレベルを決定するために本技術の当業者によって頻繁に用いられる定量的アッセイである。簡単には、それは本発明の転写物について以下のように行う：均一長さのプローブをクローン化鋳型のインビトロ転写によって合成し、高度に特異的な活性に標識化する。150〜400bp範囲の大きさのクローン化ＭＴＶ断片を含有するプラスミドから^[35]Ｓ標識リボプローブを調製した。そのプローブをハイブリダイズしてＲＮＡを検定し、ハイブリダイズされないままのＲＮＡ断片はＲＮアーゼＡ/Ｔ１による消化から保護されない。ハイブリダイズされたＲＮＡによって保護された標識化リボプローブの断片を可視化し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離後解析した。各試料中のＭＴＶ関連ｍＲＮＡのレベルをβアクチン遺伝子、「ハウスキーピング」遺伝子によって産生されたｍＲＮＡのレベルと比較して、ＲＮＡ試料の統合性を確実にした（すなわち、ＲＮＡは分解されなかった）。ＲＰＡは、３つのＰＣＲ陽性乳房腫瘍のうち２つでＲＮＡを検出した（図３参照）。ＲＰＡは、レアなメッセンジャーＲＮＡの検出用の「ノーザン」解析よりも10〜15倍の感受性である。ＲＰＡ解析は、定量解析にエラーをもたらしうるいずれの前操作もせずに、全ＲＮＡについて直接行われる。
【００５０】
実施例３：ＭＴＶＲＮＡレベルのＲＴ - ＰＣＲ決定
ＭＴＶｍＲＮＡｓは、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ（逆転写酵素連結ポリメラーゼ鎖反応）を用いても検出できる。例えば、Ｉ-Cycler（BioRad）は、蛍光検出設備で、ＰＣＲ反応の対数直線期のＰＣＲ生成物を定量化することによってＰＣＲ増幅生成物のリアルタイム反応速度論を決定することができる。この方法によって、リアルタイム熱サイクルは、再現性のある様式で、少量の公知ヌクレオチド鋳型と確実に比較できる。
【００５１】
実施例４：ウェスタンブロット解析による血液中の抗ＭＴＶ抗体の検出
よく特徴づけられたバキュロウィルス発現系と同様の方法で昆虫細胞内における組換えタンパク質の安定した生産を可能にするInsectSelect^TM系（Invitrogen）を用いて組換えＭＴＶタンパク質を生成できる。これは、持続的に高品質のタンパク質を産生する安定な細胞系の創製を可能にするウイルスの無い系である。約９日で産生される安定な細胞系は、組換えタンパク質の持続的な長期生産に使用できる。InsectSelect^TM発現系は、安定的に発現する昆虫細胞系を選択するための抗生物質抵抗性遺伝子を保有するプラスミドベクターに基づいている。この発現ベクターは、遺伝子発現用のDouglas Fir Tussoc moth OpMNPVバキュロウィルス由来の速効性初期プロモーター、OpIE2を使用する。OpIE2は、蚊及び双翅類細胞系のみならず鱗翅目（Sf9,5121,High Five^TM（Invitrogen））内で強い転写プロモーターである。発現ベクターpIZ/V5-His（Invitrogen）は、複数のクローニング部位と、昆虫細胞内の組換えタンパク質の生産及び解析を単純にするいくつかの特徴とを有する。それは、安定的に形質移入される細胞、Ｖ５エピトープをコードするＣ末端タグ、及びＣ末端ポリヒスチジン（6xHis）配列の迅速な選択を可能にするZeocin抵抗性遺伝子を包含する。これら後者の特徴は、抗Ｖ５抗体（Invitrogen）による迅速なタンパク質検出及びポリヒスチジンに結合する樹脂によるタンパク質精製を容易にする。ＭＭＴＶ関連タンパク質用のこれとは別の真核生物発現系は、インビトロ転写されかつキャップされたｍＲＮＡを有するインビトロウサギ網状赤血球ライセート系（Promega）又はSindbisウイルス発現系（Invitrogen）である。
【００５２】
ＭＭＴＶ関連遺伝子は、ｐＧＥＸベクター（Pharmacia）にクローン化され、かつ細菌内で発現されてイムノブロット研究用グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質で組換え融合タンパク質を構成することもできる。この系は、組換えタンパク質の生産、単離、及び精製の容易さが少しもない、タンパク質発現の他の方法論と比べていくつかの利点を有する。ＧＳＴタンパク質で生成される融合タンパク質は通常可溶性で、細胞ライセートからの回収を可能にする。精製時に変性条件が必要ないので、該タンパク質の抗原及び酵素特性が維持されることが多い。さらに、ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン被覆ビーズ又はカラム上にＧＳＴを固定化することによって効率的かつ迅速に精製し、還元型グルタチオンで溶出することができる。
【００５３】
ウェスタンイムノブロットを行うため、ＭＴＶタンパク質を溶解緩衝液に（0.25Ｍトリス塩基、ｐＨ6.8、４％ドデシル硫酸ナトリウム、10％ジチオスレイトール、20％グリセロール、及び0.01％w/vブロモフェノールブルー含有）に溶解し、３分間100℃に加熱し、10％ポリアクリルアミドゲル上でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）に供する。これらタンパク質を、20％メタノールを有するトリス-グリシン（ｐＨ8.3）緩衝液中のニトロセルロース膜（Protran^TM；Schleicher＆Schuell）に電気泳動的に移動させてよい。ブロットを遮断緩衝液内で（0.02Ｍトリス、0.1ＭＮａＣｌ、熱失活ヤギ血清、0.01チメロサール、及び５％脱脂粉乳）、試験するヒト又は動物由来の血清又は血漿と共に一晩中インキュベートしてよい（１：100希釈又は最適希釈）。第２の抗体、すなわち遮断緩衝液中１：500又は１：1,000希釈されたビオチン化抗ヒト（又は他の種）ＩｇＧヤギ抗体と、アビジン−西洋わさびペルオキシダーゼとのインキュベーションを２時間室温で行ってよい。イムノブロットは、7.8mM 4-クロロ-1-ナフトール及び0.03％過酸化水素で展開させることができる。ＭＴＶタンパク質に相当するバンドを走査して定量化し、かつ画像解析ソフトウェア（NIH Image）で処理する。
【００５４】
実施例５：エンザイムリンクドイムノアッセイによる抗ＭＴＶ抗体の検出
ＭＴＶタンパク質に特異的に結合する抗体は、該抗体用標的としてＭＴＶタンパク質又は複数のＭＴＶタンパク質によるエンザイムリンクドイムノアッセイを用いて検出することができる。この方法では、バキュロウィルス／昆虫細胞培養系のような発現系で産生された或いはウイルス調製品から精製されたＭＴＶタンパク質を、複数ウェルのプラスチック製微量定量プレート内のウェル底部に結合する。ヒト又は他の種由来の血清又は血漿を、経験的に決定された最適希釈度に希釈し、かつ１時間から一晩中約25℃（室温）でインキュベートする。Tween(登録商標)20（Aldrich）又はNP-40（Igepal^TM CA-630として容易に入手可能、Sigma）清浄剤を含有する食塩水内で自動化プレートウォッシャーを用いてウェルを３回洗浄する。ＭＴＶタンパク質に結合された抗体は、ウェルを経時的にビオチン化されたヤギの抗ヒト免疫グロブリンを含有する緩衝液、次いで西洋わさびペルオキシダーゼに結合されたアビジン、最後に西洋わさびペルオキシダーゼ用の着色反応生成物を生成する基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンと反応させることによって検出することができる。各工程間に、典型的にTween(登録商標)20又はNP-40清浄剤を含有する食塩水内で自動化プレートウォッシャーを用いてウェルを３回洗浄する。各ウェル内で起こる着色反応は、分光光度計プレートリーダーを用いて定量化される。着色反応生成物の量は、元の試料中に存在するＭＴＶに対する抗体の量に比例する。
【００５５】
実施例６：免疫組織化学を用いたＭＴＶレトロウイルスタンパク質の現場検出
ＭＴＶレトロウイルスタンパク質は、免疫組織化学的アッセイによって組織試料内で検出することができる。この方法では、バキュロウィルス／昆虫細胞培養系のような発現系内で産生され、或いはウイルス調製品から精製されたＭＴＶタンパク質を用いて、本技術の当業者には周知の方法でモノクロナール又はポリクロナール抗体を生成できる。これら抗体をビオチン、フルオレッセイン、西洋わさびペルオキシダーゼ又はこの目的で使用される他の標識のような検出部分で標識化することができる。標識化された抗体調製品を経験的に決定された最適希釈度に希釈し、固定若しくは凍結された薄切片又はＭＴＶタンパク質の存在を試験すべき試料由来の細胞調製品と共にインキュベートする。用いる標識のタイプによって指示されるように試料を処理し、ＭＴＶレトロウイルスタンパク質に対する抗体の結合性は、顕微鏡、オートラジオグラフィー、フローサイトメトリー等によって、この場合もやはり標識部分のアイデンティティによって指示されるように検出することができる。
【００５６】
実施例７：ヒト内でヒト乳癌ウイルスに対する免疫応答を誘発可能な医薬組成物の調製
ヒト又は動物内でＭＴＶタンパク質に対する免疫応答を誘発するために使用される医薬組成物は、以下のように開発することができる。上述のバキュロウィルス／昆虫細胞培養系発現系内で産生され、或いはウイルス調製品から精製されたＭＴＶタンパク質は、カラムクロマトグラフィー及び／又は当業者によって通常利用されるいずれの他の方法論によっても広範囲に精製することができる。精製されたＭＴＶタンパク質は、適宜のアジュバント調製品（現在、ミョウバンがヒト用に承認されている唯一のアジュバントである)と混合し或いはエマルジョンにしてワクチンを製造する。この免疫原性組成物を標的動物中に皮下又は皮内注射することができる。
【００５７】
本明細書で開示及び特許請求の範囲に記載されているすべての組成物及び方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく製造かつ実施することができる。この発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態というかたちで記述されているが、当業者には本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物と方法及び該方法の工程又は工程の順序に変化を加えうることは明らかである。さらに詳細には、同一若しくは同様の結果を達成しながら、本明細書に記載された物質を化学的及び生理学的の両方で関連する特定の物質と置換できることは明白である。本技術の当業者にとって明らかなこのような同様の置換及び変形のすべては、特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神、範囲及び概念内にあると考えられる。
【００５８】
（参考文献）
以下の参考文献は、ここに示した参考文献に、例示的な手続上の又は他の補足的な詳細を提供する範囲に、参照によって明確にここに組み込まれる。
【００５９】

【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト乳癌組織由来のＭＭＴＶに関連する配列の増幅結果を示す。
【図２】健康な対照の血液由来のＭＭＴＶに関連する配列の増幅の例を示す。
【図３】ＨＭＴＶｍＲＮＡのリボヌクレアーゼ保護アッセイによる検出の例を示す。
【配列表】

Claims

配列番号２、３、４、５、６、７、８、２１、２３、２５、２７、若しくは２９を含む単離ＤＮＡ分子。
さらに検出部分を含む請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
希釈剤に懸濁又は溶解されている請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
前記希釈剤が緩衝水溶液である請求項３に記載の単離ＤＮＡ分子。
前記ＤＮＡ分子が0.1ng/μl〜100μg/μlの濃度で存在する請求項３に記載の単離ＤＮＡ分子。
請求項１記載のＤＮＡ分子によってコードされる精製ポリペプチド。
配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２２、２４、２６、２８、若しくは３０である請求項６に記載の精製ポリペプチド。
医薬組成物中に存在する請求項６又は７に記載の精製ポリペプチド。
抗体の調製における抗原として請求項６又は７に記載のポリペプチドの使用。
前記抗体が、モノクロナール抗体である請求項９に記載の使用。
請求項１記載のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ。
ベクターに組み込まれている請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ断片が異種プロモーターの転写調節下にある単離ＤＮＡ分子。
以下の細胞型の少なくとも１種内で前記断片のＤＮＡ配列を発現する請求項１２に記載のベクター：昆虫細胞、細菌細胞、鳥類細胞、イースト細胞、又は哺乳類細胞。
前記ベクターが、以下の細胞型の少なくとも１種内でエピソーム複製又は染色体組込み可能である請求項１２に記載のベクター：昆虫細胞、細菌細胞、鳥類細胞、イースト細胞、又は哺乳類細胞。
以下の工程を含む乳癌ウイルスＤＮＡの存在を検出するインビトロ方法：
i）請求項１記載のＤＮＡ分子を含む疑いのある生体試料を、ポリメラーゼ鎖反応を行いＤＮＡ分子を増幅し、それによりアンプリコンを生成することにより解析する工程、及びii）前記アンプリコンの配列を決定するか、又はそうでなくても特徴づけて、前記試料中に前記ＤＮＡ分子が存在するか否かを決定する工程。
１種以上の乳癌ウイルスポリペプチドを認識する抗体の存在を検出するインビトロ方法であって、以下の工程を含む方法：
i）少なくとも１種の請求項６又は７記載の精製ポリペプチドを得る工程、
ii）前記ポリペプチドと乳癌ウイルスポリペプチドに対して特異的な抗体を含む疑いのある試料を用いて、免疫化学的解析を行う工程、及び
iii）工程ii）の結果を解析して、前記試料中に前記ポリペプチドと特異的に相互作用する抗体が存在するか否かを決定する工程。
工程ii）の免疫化学的解析がウェスタンブロット解析である請求項１６に記載の方法。
工程ii）の免疫化学的解析がエンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である請求項１６に記載の方法。
前記抗体が以下のポリペプチド配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２２、２４、２６、２８、若しくは３０の１種以上に特異的である請求項１６に記載の方法。
乳癌ウイルスからＤＮＡ又はＲＮＡを検出するための診断用キットであって、請求項１記載のＤＮＡ分子を含む試薬を包含する前記キット。
乳癌ウイルスに対する抗体を検出するための診断用キットであって、以下の１つ又は両方を含む試薬を包含する前記キット：
i）１種以上の請求項６又は７記載のポリペプチド、又は
ii）請求項６又は７記載のポリペプチドに特異的な抗体。
以下の工程を含む、試料中の乳癌ウイルスＲＮＡの検出のためのインビトロ方法：
i）請求項１記載の１種以上のＤＮＡ配列によりコードされるＲＮＡを含む疑いのある試料を使用してＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を行う工程、及び
ii）前記ＲＰＡの結果を解析して、前記試料中に工程i）で定義されるようなＲＮＡが存在するかを決定する工程。