ES2307521T3 - Retrovirus endogeno humano. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN aislado, que comprende: a) Un fragmento de ADN que tiene una identidad de al menos el 99% con la longitud completa de las SEC ID Nº 2, 3, 4, 5, 7, 8, 21, 25 ó 27, en las que dicho fragmento de ADN se encuentra en tejido no canceroso; o b) Un fragmento de ADN idéntico a uno o más de los siguientes: al menos 340 bases contiguas de la SEC ID Nº 2; al menos 150 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 3; al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-400 de la SEC ID Nº 4, al menos 130 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-360 de la SEC ID Nº 5; al menos 130 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 6, al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 7, al menos 210 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 20-462 de la SEC ID Nº 8, al menos 160 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 97-462 de la SEC ID Nº 21, al menos 170 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 23, al menos 100 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 337-462 de la SEC ID Nº 25, al menos 300 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 85-462 de la SEC ID Nº 27, o al menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 29.

Description

Retrovirus endógeno humano.

Antecedentes de la invención

La presente solicitud tiene prioridad sobre la solicitud provisional de patente de EE.UU. número 60/141.626 presentada el 30 de junio de 1999, la totalidad de cuyo texto se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva por referencia.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para la detección, evaluación pronóstica y tratamiento de trastornos oncogénicos, en particular del cáncer de mama.

Específicamente, La presente invención proporciona composiciones útiles para identificar y tratar trastornos relacionados con retrovirus endógenos recientemente identificados que están presentes en una subpoblación de seres humanos, gatos y primates no humanos.

2. Problema técnico abordado por la invención Mutaciones en genes de susceptibilidad conocidos no explican todos los cáncer de mama

El cáncer de mama (CM) es una de las principales causas de muerte por cáncer entre las mujeres. Se piensa que la inducción del CM implica la interacción de varios factores, incluidos los estados hormonal, inmunológico y fisiológico del huésped, así como hábitos relacionados con la dieta y exposiciones a productos químicos, radiación o agentes infecciosos. En la actualidad está claro que variaciones en diversos genes, incluidos el BRCA-1 y el BRCA-2, pueden tener como resultado riesgos marcadamente aumentados de desarrollo de CM. No obstante, defectos en genes conocidos de susceptibilidad a CM sólo representan aproximadamente un 5% del CM, los casos denominados familiares (Armstrong y col., 2000; Gayther y col., 1998).

Como ocurre con otros tipos de cáncer, no se ha eliminado la posibilidad de que un virus esté implicado etiológicamente en el CM esporádico. En consecuencia, durante mucho tiempo ha existido la necesidad de determinar que virus, si hay alguno, están relacionados causalmente con el desarrollo del CM. La identificación de tal virus proporcionaría una inestimable ayuda en las siguientes áreas de la medicina del CM: prevención, diagnóstico, determinación del pronóstico y tratamiento.

3. Descripción de la técnica relacionada Inducción con retrovirus de cáncer de mama en ratones

Durante estudios de cáncer hereditario en ratones en los Jackson Laboratories en la década de 1930 (Bittner, 1936) se descubrió el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), un retrovirus de tipo B. Como prototipo de retrovirus de transformación lenta, se ha demostrado claramente que el MMTV causa CM en ratones. En estudios previos se ha establecido que el MMTV se transmite en la línea germinal como provirus endógeno y por vía exógena a través de la leche. Como elementos endógenos, los provirus de MMTV siguen patrones de herencia mendeliana, como otras secuencias del genoma (Cohen y col., Cell), 1979; Cohen y Varmus, 1979, 1980; Traina y col., 1981; Traina-Dorge y Cohen, 1983; Traina-Dorge y col., 1985; Varmus y col, 1978). Normalmente, la transmisión horizontal del MMTV se produce mediante infección de los cachorros de ratón con viriones de MMTV presentes en la leche de las hembras infectadas. Por tanto, es posible transmitir el MMTV a ratones mediante alimentación facilitada. Se han identificado 30 o más sitios únicos de integración del provirus. No obstante, algunos ratones salvajes no portan ningún provirus del MMTV endógeno (Cohen y Varmus, 1979; Cohen y col., 1982). Este resultado sugiere que muchos provirus del MMTV endógenos son adiciones relativamente recientes en el genoma de ratón. La explicación más probable es que el MMTV entró en la línea germinal de ciertos ratones (pero no de otros) muchas veces tras las divisiones de la evolución entre las diversas especies y subespecies del género Mus. Ciertos MMTV endógenos pueden ser activados por hormonas para formar viriones infecciosos capaces de inducir carcinomas mamarios tras largos periodos de latencia. La mayoría de los provirus de MMTV endógenos son defectivos y no codifican viriones infecciosos.

Papeles de los genes de MMTV y de los genes celulares en la oncogénesis

La proteína Orf del MMTV puede funcionar como superantígeno (SA). Cuando se expresa en el timo durante el la etapa fetal/desarrollo temprano, puede medicar en la deleción completa o incompleta de células T reactivas a SA. La expresión del SA es necesaria para activar las células B dianas del MMTV en el tejido linfoide asociado con el intestino de los cachorros lactantes. La deleción completa de los clones respondedores a SA hace que los ratones sean resistentes a la infección por MMTV en el intestino y, de este modo, conlleva una baja incidencia de tumores inducidos por MMTV. Por otro lado, en ratones con clones respondedores sólo parcialmente delecionados de células linfoides, la activación de SA estimula la expansión de las dianas y la diseminación del MMTV. Cuando los animales hembra infectados alcanzan la pubertad, las hormonas estrogénicas dirigen la expresión de la repetición terminal larga del MMTV (LTR) a través de su elemento de respuesta a hormonas (HRE). Esto permite la producción y el ensamblaje del MMTV y la diseminación del virus a otros tejidos sensibles a hormonas, incluidos las mamas y los ovarios. La integración de las LTR del MMTV adyacente a ciertos genes celulares, tales como los proto-oncogenes, Int, Wnt y Fgt, puede incrementar la expresión de estos genes y dar como resultado CM y otros tipos de cáncer.

Las interacciones genéticas moleculares entre el MMTV, el sistema inmunitario de su huésped murino y la mama y otras células sensibles a hormonas transformadas en malignas por este retrovirus se ha estudiado ampliamente. El MMTV estimula el cáncer de glándulas mamarias en ratones mediante mutagénesis por inserción (Varmus y col., 1978; Varmus, 1985). Los elementos LTR provirales del MMTV dirigen la transactivación dependiente de hormonas esteroideas de varios oncogenes celulares, incluidos Wnt, Fgf e Int, de modo que se estimula la expansión clonal de las células tumorales (Shackleford y Varmus, 1987; Shackleford y col., 1993; Jakobovits y col., 1996; Nusse, 1991; Nusse y col., 1985). Para una infección productiva, persistente y la realización de su ciclo de replicación, el MMTV debe contener un superantígeno e interaccionar con un sistema inmunitario funcional del huésped (Golovkina y col., 1995; Luther y Acha-Orbea, 1996; Coffin, 1992).

La búsqueda de un virus del cáncer de mama humano

El descubrimiento del MMTV oncogénico ha lanzado a muchos investigadores a explorar la existencia de una etiología retroviral del CM en seres humanos (Sarkar, 1980). Los datos recogidos en las últimas cinco décadas han sugerido la existencia de un homólogo humano del MMTV. En 1971, Moore y colaboradores comunicaron que el 60% de las muestras de leche humana de pacientes con CM contenían partículas de tipo B indistinguibles del MMTV mediante microscopia electrónica, en comparación con el 5% de la población general (Moore y col., 1971). Estos investigadores también comunicaron que el 39% de las mujeres Parsi de Indica, una población endogámica con una incidencia dos veces mayor de CM, presentaba partículas de tipo B en su leche (Das y col., 1972; Moore, 1971). Varios estudios han demostrado que las células de CM, pero no las células de tejidos normales, también contienen transcriptasa inversa (TI), una enzima asociada con todos los retrovirus. Numerosos investigadores han investigado el suero y la leche de mama para detectar la presencia de anticuerpos reactivos al MMTV. La mayoría de estos estudios se realizó en la era anterior al SIDA, antes del advenimiento de técnicas altamente sensibles y específicas para detectar anticuerpos anti-retrovirales necesarias para la detección de los anticuerpos frente al VIH en sangre de donantes.

A pesar de los numerosos estudios con microscopia electrónica, bioquímicos e inmunológicos sobre tejido de carcinoma de mama humano, leche, sueros de pacientes y líneas celulares de carcinoma de mama que sugieren la existencia de un homólogo humano del MMTV, la prueba de que tal agente existe ha permanecido esquiva (Andersson y col., 1996; Ziegler, 1997). La mayoría de los autores han desechado la importancia de los estudios anteriores que han intentado mostrar pruebas de un homólogo humano del MMTV por la presencia de numerosos retrovirus endógenos humanos (HERV) (Larsson y col., 1004; Li y col.; 1996; Lower y col., 1996; Meese y col., 1006; Ono, 1986; Patience y col., 1996; Faff y col., 1992). Existen aproximadamente 50.000 HERV o secuencias relacionadas con HERV en el genoma humano, algunas de las cuales se ha mostrado que tienen una homología de hasta el 60% con el MMTV. A este respecto, es importante observar que la seroreactividad a HERV-K10, en estos momentos el HERV que se considerad más estrechamente relacionado con el MMTV, no puede justificar todos los anticuerpos reactivos al MMTV presentes en el suero de pacientes con cáncer de mama y el menor número de individuos sanos (Vogetseder y col., 1995). Además, los autores creen que la presencia de secuencias relacionadas con el MMTV es precisamente la razón por la cual homólogos humanos del MMTV no se han demostrado de un modo concluyente antes mediante técnicas moleculares. La presencia de estas secuencias relacionadas, aunque distintas, podría haber enmascarado la detección de secuencias más estrechamente relacionadas por investigadores anteriores que usaron técnicas menos sensibles, tales como la transferencia de tipo southern.

Sólo ha sido recientemente cuando se han aislado en tejido de CM humano secuencias con una homología relativamente alta (> 90%) con las de MMTV (Wang y col., 1005; 1998;). Secuencias con una similitud del 95-99% al env del MMTV se amplificaron mediante PCR en 121 (38,5%) de 314 muestras de tumor de cáncer de mama no seleccionadas. Es pertinente destacar que las secuencias similares al MMTV sólo se detectaron en 2 (1,8%) de 107 muestras de mama procedentes de mamoplastias de reducción y en 0/80 muestras de tejidos normales o de tumores que no son de mama. El ARN similar al env de MMTV se expresó (determinado mediante RT-PCR) en el 66% de los tumores de mama con ADN positivo por PCR (Wang y col.,1998). En 2 tumores de mama se detectó un provirus completo de 9,9 kb con una similitud del 94% con el MMTV. La FISH (hibridación in situ con fluorescencia) reveló la integración en diversos sitios del ADN derivado de tumores de CM, pero no en células de mama normal (Wang y col.,1999 ACR mtg. Abstracts nº 2933, 2944). Wang y col.,sugirieron la existencia de un virus de tumor mamario humano (HMTV) que se extiende por vía de infección exógena (transmisión horizontal). Los intentos de estos y otros investigadores de amplificar otras regiones de los virus relacionados con el MMTV a partir del ADN genómico o del ADNc de sujetos que no tenían CM dio secuencias HERV (tale como la HERV-K10), con una homología de únicamente alrededor del 60% con el MMTV. Por tanto, los tejidos de CM son los únicos tejidos que se han encontrado hasta este momento en los que las secuencias que son muy similares a las del MMTV. En consecuencia, parecía que el tejido de mama normal y otros tejidos eran negativos para la expresión de virus con una homología elevada con el MMTV.

El MMTV se puede transmitir horizontalmente o verticalmente

El ciclo de replicación de los retrovirus se caracteriza por la conversión del genoma viral ARN monocatenario a ADN bicatenario proviral a través de las múltiples actividades enzimáticas de la transcriptasa inversa (TI) asociada con el virión. Como es el caso con otros retrovirus, es necesaria la integración del ADN del provirus del MMTV en el genoma de las células huésped para la expresión de proteínas virales y la producción de progenie infecciosa. Tanto en glándulas mamarias de ratón infectado como el células heterólogas, el ADN del provirus del MMTV se integra dentro de un gran número de sitios aparentemente aleatorios. La integración de los provirus de MMTV que contienen LTR transcripcionalmente activas cerca de algunos genes celulares (proto-oncogenes), como Int, Wnt y Fgf, puede tener como resultado la sobreexpresión de estos genes, la transformación celular y la expansión clonal de las células tumorales (Varmus, 1985; Shackleford y col., 1993; Jakobovits y col., 1986; Cohen, 1980, Breznik y Cohen, 1982). La prolongada latencia de la carcinogénesis inducida por MMTV se explica, en parte, por la necesidad que tienen los provirus de integrarse en estos sitios concretos.

Las diferencias genéticas entre cepas virales de MMTV pueden justificar en parte la incidencia variable del CM en diversas cepas de ratones. Los ratones de la cepa C3H tienen una incidencia de CM superior al 90% en comparación con una incidencia <1% de CM en ratones BALB/c. Los ratones BALB/c amamantados con hembras C3H tienen una incidencia elevada de CM, lo que sugirió que el MMTV tumorigénico de C3H puede transmitirse horizontalmente en la leche (Bittner, 1936). Por el contrario, cuando los ratones C3H se amamantan con una hembra BALB/c, la incidencia de CM es significativamente menor (22-55%), pero no tan baja como en las cepas de ratón de incidencia baja. Esta última observación subraya la importancia de los virus transmitidos horizontalmente por la leche en las cepas de incidencia elevada, pero también indica las considerables diferencias en el potencial tumorigénico entre los provirus de MMTV endógeno. Los provirus de varios ratones con incidencia tumoral alta t baja se pudieron distinguir por las diferencias en la cinética de hibridación en solución y los patrones de digestión con endonucleasas de restricción (Cohen y col., Cell, 1979; Cohen y Varmus, 1979, 1980; Traina-Dorge y Cohen, 1983; Breznik y col., 1984). Usando enzimas de restricción que diferencian entre ADN hipometilado y metilado, también se demostró que los provirus del MMTV transmitido por la leche estaban hipometilados, mientras que la mayoría de los provirus endógenos contienen abundante 5-metilcitosina (Cohen, 1989; Breznik y Cohen, 1982; Breznik y col., 1984). Dado que la hipometilación está relacionada con un incremento de la expresión génica, esta observación podría explicar la importancia del MMTV de transmisión por la leche de transmisión horizontal en cepas de ratones con una incidencia elevada de CM. La hipometilación específica de un provirus de MMTV endógeno se relacionó con la expresión de un transcrito de 1,6 kb de la glándula mamaria en lactación del ratón BALB/c (Traina-Dorge y col., 1985).

En otros estudios, se ha demostrado que los provirus de MMTV endógeno se segregan en forma de unidades genéticas estables durante la endogamia y que ciertos de estos provirus endógenos son activos en la transcripción (Cohen y col., Cell, 1979; Cohen y Varmus, 1979, 1980; Traina y col., 1981; Traina-Dorge y Cohen, 1983; Traina-Dorge y col., 1985; Varmus y col., 1978). Se han usado cepas endogámicas recombinantes (ER) de ratones para definir la composición de los provirus de MMTV y las localizaciones cromosómicas (Traina y col., 1981; Traina-Dorge y Cohen, 1983). Las cepas ER se desarrollaron mediante el cruzamiento de ratones de dos líneas altamente endogámicas, el apareamiento aleatorio de los hermanos y hermanas de la generación F2 y manteniéndolos como líneas separadas. Se cartografiaron muchos loci genéticos de cromosomas específicos en estas cepas. Mediante el análisis de los patrones de segregación de los diversos provirus de MMTV con estos marcadores genéticos mediante análisis con endonucleasas de restricción y transferencia de tipo southern, fue posible determinar las localizaciones en el cromosoma de numerosos provirus de MMTV en estas cepas y establecer que estos provirus se segregan siguiendo la norma de la herencia mendeliana. Estos y otros análisis definieron 10 unidades (provirus) distintas de MMTV en estos animales, algunas de longitud completa y otras fragmentadas. Los índices de herencia para la mayoría de los provirus de MMTV fueron consistentes con una herencia sencilla de un único gen, aunque tres de las unidades de MMTV demostraron alguna variación. Más destacable fue la presencia de una unidad a la que contribuyó un padre que estaba presente en 23 de las 26 cepas ER analizadas. Se identificaron unidades provirales específicas que eran activas en la transcripción y asociadas con un incremento de la producción del tumor (Traina-Dorge y col., 1985).Es importante le hecho de que se identificaron genes celulares que estaban significativamente asociados con la expresión del virus, lo que demuestra la participación de la genética del huésped en la progresión de la enfermedad (Traina-Dorge y col., 1985).

Varias líneas de pruebas indican que los provirus de MMTV endógenos se han integrado relativamente recientemente en la línea germinal de varias cepas de ratones (Cogen y Varmus, 1979; Varmus y col., 1978). Si MMTV se desarrolló a partir de elementos presentes en un progenitor de Mus musculus (ratón de laboratorio), cabría esperar que todos los ratones individuales tuvieran provirus de MMTV similares. No obstante, tanto los ratones de laboratorio como los ratones de la cepa salvaje atrapados en varias localizaciones tienen un número y distribuciones bastante variables de los sitios de integración en la línea germinal para sus provirus de MMTV (Cohen y Varmus, 1979). El hallazgo más sorprendente entre estos resultados fue la presencia de algunos animales salvajes atrapados que no contenían provirus de MMTV endógenos. La interpretación más probable de estos resultados es que los provirus de MMTV endógenos surgieron por múltiples integraciones independientes en el ADN de las células germinales tras la especiación del género Mus, en lugar de surgir a partir de elementos genéticos presentes en los progenitores en evolución de los ratones.

La presente invención proporciona moléculas de ADN recombinante derivadas de uno o más virus de tumor de mama que son retrovirus endógenos con homología con las secuencias de MMTV. En particular, en el primer aspecto de la presente invención se proporciona una molécula de ADN aislado, que comprende:

a)

Un fragmento de ADN que tiene una identidad de al menos el 99% con la longitud completa de las SEC ID Nº 2, 3, 4, 5, 7, 8, 21, 25 ó 27, en las que dicho fragmento de ADN se encuentra en tejido no canceroso; o

b)

Un fragmento de ADN idéntico con uno o más de los siguientes: al menos 340 bases contiguas de la SEC ID Nº 2; al menos 150 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 3; al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-400 de la SEC ID Nº 4, al menos 130 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-360 de la SEC ID Nº 5; al menos 130 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 6, al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 7, al menos 210 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 20-462 de la SEC ID Nº 8, al menos 150 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 97-462 de la SEC ID Nº 21, al menos 170 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 23, al menos 100 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 337-462 de la SEC ID Nº 25, al menos 300 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 85-462 de la SEC ID Nº 27, o al menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 29.

Además, la presente invención proporciona moléculas de ARN producidas mediante transcripción del ADN de la presente invención descrito antes. Además, proporciona los polipéptidos resultantes de la traducción dentro del macro del ARN transpiro a partir del ADN del MTV de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, las secuencias de ADN a las que se hace referencia pueden derivar de cualquier fuente adecuada, fuentes que pueden incluir, entre otros, seres humanos, gatos y macaco rhesus.

La presente invención también proporciona un plásmido de ADN recombinante (un vector), que comprende secuencias de ADN del virus de tumor mamario (MTV) de la presente invención. Es decir, dicha secuencia de ADN de la presente invención se incorpora en el vector.

En una forma de realización de la presente invención, los vectores además comprenden un promotor heterólogo operablemente unido a la secuencia de MTV (es decir, unido en el marco de lectura adecuado de forma que pueda producir ARN y/o proteínas funcionales del MTV in vivo e in vitro). En un aspecto de esta forma de realización de la invención, el vector, que comprende el ADN de MTV, es capaz de realizar replicación episomal o integración cromosómica en al menos uno de los siguientes tipos celulares: células bacterianas, células de levaduras, células de insectos, células de aves y células de mamíferos (esta lista de tipos celulares es representativa y no debe considerarse exhaustiva). En otro aspecto de esta forma de realización de la invención, el promotor heterólogo proporciona la expresión de la secuencia de ADN del MTV en uno o más tipos celulares. Los tipos de células que se consideran útiles como parte de este aspecto de la invención incluyen, entre otros, los siguientes: células bacterianas, células de levaduras, células de insectos, células de aves y células de mamíferos.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, las secuencias de ADN de MTV descritas en lo que antecede pueden usarse para proporcionar un procedimiento para detectar la presencia de ADN o ARN de MTV en una muestras (de origen biológico, como suero, o de otro cualquiera).

Otra forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si una muestra contiene anticuerpos que reconocen proteínas derivadas de las secuencias de ADN de MTV descritas en lo que antecede (p. ej., secuencias polipeptídicas derivadas de la transcripción y traducción de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 21, 23, 25, 27 ó 29). Como corolario de este aspecto, la presente descripción también proporciona anticuerpos que detectan específicamente uno o más de los polipéptidos de la presente invención.

Otra forma de realización de la invención proporciona kit diagnósticos útiles para detectar ADN, ARN o polipéptidos de un virus de tumor mamario, en una muestra biológica o de otro tipo.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar más a fondo ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas que se presentan en la presente memoria descriptiva.

La Figura 1 muestra los resultados de la amplificación de secuencias relacionadas con el MMTV de tejido de cáncer de mama humano. Panel A: El ADN se extrajo de tumores de mama humanos (amablemente proporcionados por Michael Press, MD, USC; Los Ángeles o Derrick Beech MD, TMC/UT Memphis) y la PCR se realizó usando cebadores específicos del gen humano relacionado con el env de MMTV. Los productos de la PCR se transfirieron a nitrocelulosa mediante transferencia y los productos relacionados con el MMTV se detectaron mediante hibridación a una sonda de env de MMTV de 1,8 kb. Calle a: marcadores no radioactivos, no mostrados; calles b-d, f-h, j: ADN de tumor de mama; calles e e i: no hay ADN; calle k: agua control; calle 1 control positivo: fragmento de env de MMTV clonado en pBluescript^{TM}. Panel B: como prueba de la integridad del ADN de las muestras clínicas, los autores amplificaron el ADN proviral de HERV-3, una única copia del retrovirus endógeno humano usando condiciones de PCR desarrolladas por Griffiths y col. (1997). Detección con bromuro de etidio (los marcadores son visibles en la calle a). Mismas muestras que en el Panel A a excepción de la calle 1: control positivo, fragmento pol de HERV3 clonado en pBluescript^{TM} (Stratagene). Había bandas visibles en las calles c y g, pero no se copian bien.

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La figura 2 muestra un ejemplo de la amplificación de secuencias relacionadas con el MMTV de la sangre de controles sanos. Panel A: el ADN se extrajo de sangre entera de sujetos control sanos y la PCR se realizó usando cebadores específicos del gen humano relacionado con el env de MMTV y los productos de la PCR se detectaron mediante hibridación de tipo southern. Calle : marcadores; calles b-k: ADN de sangre entera de controles sanos; calle 1: agua control; calle me control positivo: fragmento de env de MMTV clonado en pBluescript^{TM} (Stratagene). Panel B: Amplificación por PCR de HERV-3. Detección con bromuro de etidio (los marcadores están visibles en la calle a). Mismas mues-
tras que en el Panel A a excepción de la calle m: control positivo, fragmento pol de HERV3 en pBluescript^{TM}.

La figura 3 muestra un ejemplo de la detección del ARNm de HMTV mediante ensayo de protección de ribonucleasa. El ARN se extrajo de tres tumores de cáncer de mama positivos por PCR de HMTV o de células de levadura y se hibridó con una sonda de 189 bases específica de HMTV o con una sonda de 245 bases para \beta-actina. A continuación, las muestras se digirieron con ARNsa A/T1. Los fragmentos de las sondas marcadas protegidas mediante AN hibridado se visualizaron y analizaron tras separación en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Dos de las tres muestras de tumor dieron fragmentos protegidos del tamaño esperado con la sonda de HMTV (flecha) (calles 1-3), Mientras que los tres ARN de tumor dieron fragmentos protegidos en la sonda de \beta-actina (calles 5-7). Como cabía esperar, ninguna de las sondas estaba específicamente protegida por ARN de levadura (calles 4, 8).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona ADN, ARN y polipéptidos aislados derivados de virus de tumor mamario (MTV), que es un virus con una elevada homología de secuencia con el virus de tumor mamario de ratón como se expone en las reivindicaciones. La presente invención proporciona además procedimientos diagnósticos de uso de estas macromoléculas. Además, la presente invención proporciona composiciones reactivas farmacéuticas y kit diagnósticos, que comprenden ADN, ARN y/o polipéptido de MTV, que se pueden usar de acuerdo con los procedimientos descritos.

Varias formas de realización de la presente invención proporcionan ácido nucleico de MTV correspondiente a al menos uno de las siguientes: secuencias de ADN con una identidad de al menos un 99% con una de las siguientes:

a)

una identidad de al menos 99% con las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 21, 25 ó 27; o

b)

al menos 340 bases contiguas de la SEC ID Nº 2; al menos 150 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 3; al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-400 de la SEC ID Nº 4, al menos 130 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-360 de la SEC ID Nº 5; al menos 130 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 6, al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 7, al menos 210 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 20-462 de la SEC ID Nº 8, al menos 160 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 97-462 de la SEC ID Nº 21, al menos 170 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 23, al menos 100 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 337-462 de la SEC ID Nº 25, al menos 300 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 85-462 de la SEC ID Nº 27, o al menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 29.

Incluso más preferentemente, estos ácidos nucleicos derivan de MTV de ser humano, de gato o de macaco rhesus. Más preferentemente, el ADN es idéntico al de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 21, 23, 25, 27 ó 29.

En un aspecto de esta forma de realización de la invención, las secuencias de ADN del MTV descritas antes se incorporan en un vector. En varios aspectos relacionados de la invención, las secuencias del MTV están bajo el control transcripcional de un promotor heterólogo. Los vectores contemplados como útiles de acuerdo con la presente invención son capaces de expresar las secuencias de ADN del MTV en al menos uno de los siguientes tipos celulares: células de insectos, células bacterianas, células de ave, células de levadura o células de mamíferos. Además, los vectores de este aspecto de la invención también son capaces de realizar replicación episomal y/o integración cromosómica en al menos uno de los tipos celulares enumerados.

En otro aspecto de esta forma de realización, las secuencias de ADN comprenden uno o más restos de detección. Los restos de detección contemplados como adecuados para la presente invención incluyen, entre otros, colorantes fluorescentes e isótopos radioactivos de fósforo, azufre, oxígeno, carbono o hidrógeno.

En otro aspecto más de esta forma de realización de la invención, la molécula de ADN aislada se suspende o disuelve en un diluyente compatible con la invención. Los diluyentes adecuados no interfieren con el uso del ADN de acuerdo con las diversas formas de realización de la presente invención. Diluyentes útiles de acuerdo con esta forma de realización de la invención son bien conocidos para los expertos en la técnica. Incluyen, entre otros, soluciones acuosas tamponadas. Estas pueden tamponarse con cualquier compuesto compatible con la presente invención. Ejemplos de agentes tampón incluyen tampones de fosfato y tampones que comprenden trishidroxiaminometano (Tris). Tales soluciones acuosas tamponadas pueden además comprender cualquier otro compuesto, tal como cloruro sódico, que no interfiera en la operación de la presente invención. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, el ADN del MTV puede estar presente en cualquier concentración adecuada. Preferentemente, la concentración de aproximadamente 0,1 ng/\mul a 100 \mug/\mul.

Otras formas de realización de la presente invención proporcionan transcritos de ARN y/o polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos descritos en lo que antecede. En varios aspectos de esta forma de realización, estos transcritos de ARN o polipéptidos están codificados por cualquiera de las secuencias de ADN descritas en lo que antecede. Estos transcritos de ARN y polipéptidos son homólogos a los transcritos de ARN y polipéptidos codificados por los genes env, gag o pol del MMTV. En un aspecto de esta forma de realización, los transcritos de ARN están codificados por las secuencias de ADN descritas en lo que antecede. Tales transcritos de ARN tienen una secuencia idéntica a la secuencia de ADN descrita excepto porque el ARN contiene uridina en lugar de timidina. En otro aspecto preferido de esta forma de realización, el polipéptido purificado corresponde, en secuencia, a todo o parte de un producto proteico de env, gag o pro del virus de tumor mamario de ser humano, gato o de macaco rhesus. Se prefiere que los péptidos sean polipéptidos purificados. En un aspecto preferido de la presente invención, los polipéptidos purificados están compuestos por toda o parte de la secuencia resultante de una transcripción y traducción dentro del marco de cualquiera de las secuencias de ADN del MTV descritas en lo que antecede. En un aspecto todavía más preferido de la presente invención, los polipéptidos corresponden en secuencia al producto de una traducción dentro del marco de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 21, 23, 25, 27 ó 29. Más preferentemente, las secuencias polipeptídicas de la presente invención corresponden a todos o a al menos 80 aminoácidos de las SEC ID Nº: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26 ó 28. Con el término "derivado de ADN de MTV" se pretende expresar que el ARN o el péptido corresponde, en secuencia, al ARN o el péptido producido, respectivamente, por la transcripción o la transcripción y la traducción dentro del marco del ADN de MTV.

Por "polipéptidos purificados" se quiere decir que la mayoría (más del 50%) de los polipéptidos en la muestra son los polipéptidos del MTV. Preferentemente, los polipéptidos del MTV constituyen más del 70% del polipéptido en la muestra de polipéptidos purificada. Más preferentemente, el polipéptido del MTV constituye más del 90% del polipéptido en la muestra. Incluso más preferentemente, el polipéptido del MTV constituye más del 95% del polipéptido en la muestra. Además, el término "polipéptido purificado" indica que la muestra no contiene sustancias que interfieren en la operación de la presente invención. Los polipéptidos purificados obtenidos de acuerdo con la presente invención pueden proceder de cualquier fuente adecuada que sea compatible con la presente invención.

Otra forma de realización de la presente descripción proporciona un anticuerpo contra un polipéptido de MTV tal y como se ha descrito en lo que antecede. También se proporciona el uso de uno o más de los polipéptidos de la presente invención como el agente antigénico para generar anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden se naturaleza monoclonal o policlonal. Preferentemente, los anticuerpos son monoclonales. Una vez que se ha proporcionado el MTV, los anticuerpos producidos por este aspecto de la invención se pueden preparar de acuerdo con procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales normalmente se producen inyectando el agente antigénico (en presencia de un agente potenciador de la respuesta inmunitaria como, por ejemplo, adyuvante de Freunds) en un animal como una oveja, ganado bovino, equinos, cabras o conejos.

Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con este aspecto de la presente invención se pueden preparar mediante técnicas de fusión de hibridoma o mediante técnicas que utilizan tecnologías de inmortalización con el virus de Epstein Barr (EBV) (para producir AcMo humanos), tales como las bien conocidas para los expertos en la técnicas, modificadas tal y como se describe en la presente memora descriptiva. En el procedimiento de la invención, estas técnicas implican la inyección de un inmunógeno, en este caso un polipéptido de MTV purificado, para provocar una respuesta inmunitaria deseada en dicho animal (es decir, producción de anticuerpos). El animal experimental (p. ej., un ratón) recibe repetidas inyecciones (refuerzos) de la misma línea celular inmortalizada. En una última etapa, el animal recibe una inyección de células primarias del tipo celular escogido.

En el ejemplo ilustrativo en la presente memoria descriptiva para la producción de anticuerpos monoclonales agonistas frente a células megacariocíticas, como los primeros inmunógenos se usaron una preparación de células CMK y una preparación de células CMS; no obstante, se podrían haber usado otras células megacariocíticas inmortalizadas, tales como células Mo7e o DAMI. Otros anticuerpos monoclonales análogos al anticuerpo agonista de la invención BAH-1, que específicamente reconoce el receptor C-Mpl, se pueden generar usando proteína del receptor c-Mpl unida a la membrana como inmunógeno. Para generar anticuerpos monoclonales agonistas contra otros tipos celulares se escogen otras células de linaje hematopoyético, por ejemplo células madre, células B o células T. En la primera etapa de inmunización, las células madre pueden estar representadas, por ejemplo, por la línea celular inmortalizada CTS; las células B por las líneas celulares inmortalizadas ARH-77, SB o Nal-6; y las células T por las líneas celulares inmortalizadas Jurkat o H9.

Después de un tiempo suficiente, se sacrifica al animal y se pueden obtener las células somáticas productoras de anticuerpos de los ganglios linfáticos, los bazos y la sangre periférica de los animales preparados. Se prefieren las células del bazo. Los linfocitos de ratón dan un mayor porcentaje de fusiones estables con los mielomas de ratón que se describen a continuación. También es posible el uso de células somáticas de rata, conejo, rana, oveja y otros mamíferos. Los cromosomas de las células de bazo que codifican las inmunoglobulinas deseadas se inmortalizan fusionando las células de bazo con células de mieloma, normalmente en presencia de un agente de fusión tal como polietilenglicol (PEG). Cualquier número de líneas celulares de mieloma se puede usar como pareja de fusión de acuerdo con las técnicas estándar; por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209.

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Las células resultantes, que incluyen los hibridomas deseados, se cultivan después en un medio selectivo, tal como medio HAT, en que el las células parentales de linfocitos o de mieloma no fusionadas mueren en último término. Sólo las células de hibridoma sobreviven y se pueden cultivar en condiciones de dilución límite para obtener los clones aislados. Los sobrenadantes de los hibridomas se someten a detección selectiva para determinar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, por ejemplo mediante técnicas de inmunoensayo tales como las descritas en la presente memoria descriptiva, usando el antígeno que se ha usado para la inmunización. A continuación, los clones positivos pueden subclonarse en condiciones de dilución límite y el anticuerpo monoclonal producido se puede aislar. Existen varios procedimientos convencionales para el aislamiento y purificación de los anticuerpos monoclonales de modo que se les libere de otras proteínas y otros contaminantes. Los procedimientos de uso habitual para purificar anticuerpos monoclonales incluyen precipitación con sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. Los hibridomas producidos de acuerdo con estos procedimientos se pueden propagar in Vitro o in vivo (en fluido ascítico) usando técnicas conocidas en la materia (véase, en general, Harlow y col., Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 1-726, 1988).

Otras formas de realización de la presente invención proporcionan procedimientos para detectar ADN, ARN y/o proteínas de MTV en muestras biológicas y/o de otros tipos.

Un aspecto de esta forma de realización de la invención proporciona un procedimiento para la detección de ADN de MTV en una muestra, que comprende las etapas siguientes:

i)

obtener una muestra de la que se sospecha que contiene una o más de las secuencias de ADN del MTV descritas antes en la presente invención;

ii)

llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una secuencia de ADN tal y como se ha definido en la etapa i); y

iii)

determinar la secuencia, o si no caracterizar, de los amplicones (el ADN amplificado por PCR) producidos en la etapa ii) para determinar si la secuencia de ADN como se define en la etapa i) está o no presente en la muestra.

Otro aspecto de esta forma de realización proporciona un procedimiento para la detección de ARN de MTV en una muestra, que comprende las etapas siguientes:

i)

obtener una muestra de la que se sospecha que contiene ARN codificado por una o más de las secuencias de ADN del MTV descritas antes en la presente invención;

ii)

llevar a cabo un ensayo de protección con ARNasa (RPA); y

iii)

analizar los resultados del RPA para determinar si el ARN como se define en la etapa i) está presente en la muestra y, opcionalmente, cuantificar dicho ARN.

Los expertos habituales en la técnica reconocerán que la selección de los parámetros necesarios para optimizar las etapas de estos procedimientos se encuentran bien dentro de las capacidades del experto habitual. Estos parámetros, por ejemplo condiciones de PCR (p. ej., selección de la temperatura de hibridación, tiempos de extensión y cebadores) y el procedimiento de secuenciación del ADN se determinan de forma rutinaria en laboratorios en los que se emplean dichas técnicas de biología molecular.

Otro aspecto de esta forma de realización de la invención proporciona un procedimiento para analizar una muestra con el fin de determinar si la muestra contiene anticuerpos que reconocen polipéptidos de MTV. Este procedimiento comprende las etapas de:

i)

obtener una muestra de la que se sospecha que contiene anticuerpos específicos para anticuerpos virales de tumor de mama;

ii)

obtener al menos un polipéptido de MTV purificado:

iii)

realizar análisis de inmunotransferencia de tipo western usando la muestra de la etapa i) y el polipéptido de la etapa ii); y

iv)

analizar los resultados de la etapa iii) para determinar los anticuerpos que interaccionan de forma específica con el péptido de la etapa ii) están presentes o no en la muestra.

Otro aspecto de esta forma de realización de la invención proporciona un procedimiento para analizar un cultivo celular o una muestra de tejido mediante uno o más procedimientos inmunohistológicos, con el fin de determinar si la muestra contiene proteínas del MTV. Este procedimiento comprende las etapas de:

i)

obtener una muestra de la que se sospecha que contiene proteínas virales de tumor de mama;

ii)

preparar la muestra de la etapa i) para análisis inmunoquímico;

iii)

incubar la muestra de la etapa ii) con uno o una combinación de dos o más anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de polipéptidos de MTV codificados por una o más de las secuencias de ADN de MTV descritas en lo que antecede, en la que dichos anticuerpos opcionalmente tienen un resto que permite su detección específica;

iv)

lavar las muestras para eliminar los anticuerpos que no se han unido específicamente;

v)

procesar las muestras como sea adecuado para el procedimiento de detección seleccionado; y

vi)

analizar los resultados de la etapa v) para determinar si hay proteínas de MTV o no en la muestra.

Está previsto que el análisis inmunoquímico pueda incluir, entre otros, análisis por transferencia de tipo western o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Se reconocerá que la selección de parámetros necesarios para optimizar el rendimiento de estos métodos entran dentro de las capacidades del experto habitual. Los análisis se pueden realizar usando inmunoquímica directa (si los anticuerpos se han marcado con un resto detectable) o mediante inmunoquímica indirecta.

Otras formas de realización de la descripción actual proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden ADN, ARN y/o proteínas de MTV descritas anteriormente. Estas composiciones pueden además comprender un excipiente, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable y no contienen ninguna sustancia biológicamente dañina. Un experto habitual en la técnica puede formular las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Formulaciones farmacéuticas adecuadas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, que es un texto de referencia estándar en el campo que se incorpora en el presente documento por referencia.

Las composiciones farmacéuticas pueden además comprender agentes colorantes o estabilizantes, agentes osmóticos, agentes antibacterianos o cualquier otra sustancia siempre que dichas sustancias no interfieran con la función de la composición. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden, por ejemplo, formularse en forma de solución, suspensión o emulsión en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y 5% de albúmina humana. También se pueden usar liposomas. El vehículo puede contener aditivos que mantengan la isotonicidad (p. ej., cloruro sódico o manitol) y estabilidad química (p. ej., tampones y conservantes). Debe apreciarse que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Además, para administración a humanos, las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por la Oficina de Patrones Biológicos de la Dirección Federal de Fármacos y Alimentos de EE.UU. Las formulaciones pueden esterilizarse mediante técnicas habituales, tales como filtración.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a sustancias y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o, de otro modo, indeseada cuando se administra a un animal o a un ser humano, según sea adecuado. Una sustancia que produjo alguno de estos efectos secundarios se clasificaría como "biológicamente dañina" dentro del alcance de la presente invención. Las sustancias y composiciones farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción. Excepto cuando sea incompatible con la invención, se contempla el uso de cualquier ingrediente convencional. Además, también se pueden incorporar en las presentes composiciones ingredientes activos complementarios que sirven para otros propósitos farmacológicamente convenientes.

Se ha contemplado que los procedimientos y composiciones descritos en lo que antecede son de gran beneficio en lo referente a ayudar a determinar si MTV o los componentes vitales de MTV están presentes o no en los tejidos de una persona. Este conocimiento sería de ayuda para predecir la susceptibilidad de un paciente al cáncer derivado etiológicamente del MTV. Los procedimientos proporcionan un medio para determinar la carga viral de los pacientes 8la cantidad de virus presente en los tejidos de la persona). A este respecto, se ha previsto que se conseguiría un tremendo beneficio mediante la adaptación de los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva a la extendida detección selectiva de la población general y, en particular, a todas las mujeres humanas maduras.

Otras composiciones que se contemplan como parte de diversas formas de realización de la presente invención proporcionan un medio para estabilizar o reducir la cantidad de virus presente en un ser humano u otro animal.

Los diversos procedimientos descritos anteriormente son fácilmente adaptables para la preparación de kit diagnósticos para detectar la presencia de ADN, ARN y/o polipéptidos de MTV. En consecuencia, para la práctica clínica de la invención se contemplan todavía otras formas de realización de la presente invención, que proporcionan kit diagnósticos. Tales kit son útiles para el análisis cualitativo y cuantitativo de una muestra con el fin de detectar y quizá determinar la cantidad de ADN, ARN y/o polipéptido de, MTV presente en ella. En un aspecto de esta forma de realización de la invención, el kit incluye, como parte de sus componentes, una o más moléculas de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias de ADN de MTV descritas anteriormente en la presente invención. También de acuerdo con este aspecto de la invención, el kit puede comprender, además de (o como alternativa a) el ADN recombinante del MTV, uno o más pares de oligonucleótidos sintéticos cebadores útiles para la amplificación por PCR de estas secuencias de ADN de MTV.

Otro aspecto de esta forma de realización de la invención proporciona un kit para detectar anticuerpos que reconocen específicamente proteínas de virus tumoral mamario. Como parte de sus componentes, este kit incluye un reactivo que comprende uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de ADN de MTV descritas en lo que antecede.

También se contemplan útiles para detectar la presencia de proteínas de MTV mediante inmunocitoquímica, que comprenden uno o más anticuerpos (bien monoclonales o policlonales), que son específicos de al menos un polipéptido de MTV. Opcionalmente, estos anticuerpos se pueden modificar de modo que comprendan un resto de detección (p. ej., un colorante fluorescente o un isótopo radioactivo, tal como ^{35}S).

Los kit de acuerdo con estas formas de realización de la invención pueden comprender envases, en los que cada uno de ellos contiene uno o más de los diversos reactivos (normalmente en forma concentrada) que se requieren para realizar las respectivas pruebas diagnósticas. Se contemplan kit de acuerdo con estas formas de realización de la invención que son útiles para detectar y/o cuantificar ADN, ARN y/o proteína de MTV en muestras biológicas (o de otros tipos). Tales muestras se pueden seleccionar de, entre otras, las siguientes: plasma o suero sanguíneo, sangre entera, orina, esputo, efluente de colon, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, médula ósea, muestras de tejido (tales como los de una biopsia quirúrgica) o cualquier otra muestra de la que se sospeche que contiene estas moléculas biológicas.

Los kit pueden además incluir uno o más resultados fiduciarios. Como se usa en la presente memoria descriptiva "resultado fiduciario" se refiere a un patrón de referencia frente al cual se compara un resultado de una prueba para evaluar los resultados en términos de calidad y/o cantidad. Una "serie fiduciaria" es una pluralidad de tales referencias que representan puntos a lo largo de una escala cualitativa o cuantitativa. A este respecto se prefieren los kit que incluyan una serie fiduciaria para interpretar los resultados. El fiduciario puede estar en forma de una o más fotografías o puede representarse de otros modos, incluidas las descripciones escritas.

Por tanto, se pueden desarrollar fiduciarios como parte de los kit, de acuerdo con este aspecto de la invención, para guiar la interpretación de los resultados. A este respecto, una concentración de ARN o de polipéptido de una muestra biológica se puede caracterizar de acuerdo con lo anterior. La muestra se puede tomar de una sección transversal representativa de los pacientes en varios estadios de la enfermedad (incluyendo asintomáticos o esencialmente sin enfermedad), para preparar una serie fiduciaria. La caracterización a este respecto puede beneficiarse a posteriori siguiendo el curso real de la progresión de la neoplasia en los pacientes a medida que pasan por el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento posterior. La determinación de la carga viral (determinada por la abundancia de ADN, ARN o polipéptido del MTV), como se ha indicado anteriormente, para varios pacientes con un estado conocido de cáncer de mama y el eventual resultado, y la posterior correlación de estos valores es de un incalculable valor pronóstico. Esto ayudará a proporcionar al paciente un pronóstico más exacto y también ayudará al paciente y al oncólogo a determinar el mejor curso de tratamiento terapéutico, cuando tal tratamiento sea necesario.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona una composición que induce una respuesta inmunológica frente al MTV en un animal. Un aspecto específicamente contemplado de esta invención es una composición que induce una respuesta inmunológica frente a la proteína viral de tumor mamario humano en seres humanos (véase el Ejemplo 7). Cabe esperar que tal inmunidad inducida puede prevenir el cáncer de mama en individuos que portan MTV endógeno, bloqueando la diseminación del virus a tejidos sensibles a hormonas.

También se conocen procedimientos para producir una respuesta inmunológica al ADN y/o ARN viral en animales, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 5.990.091 y 6.004.799, que se incorporal en la presente memoria descriptiva por referencia. Por tanto, las composiciones que provocan una respuesta inmunológica al ADN y/o ARN del MTV también se contemplan como aspecto de esta forma de realización de la invención.

Otras forma de realización proporcionan composiciones terapéuticas que disminuyen la actividad y la presencia de virus de tumor mamario humano. Una característica común a todos los retrovirus es la presencia de tres enzimas implicadas en varias etapas del ciclo de replicación viral la transcriptasa inversa (TI), la proteasa (PR) y la integrasa (IN). Se han desarrollado varios productos farmacéuticos dirigidos contra la RT y la PR del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), un retrovirus poco relacionado con el MTV. Además, se han identificado sustancias químicas que inhiben de forma selectiva la IN del VIH y se están desarrollando fármacos prototipo dirigidos contra esta enzima (Hong y col., 1998; Mathe, 1999; Robinson, 1998; Singh y col., 2000). De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o una mezcla de dos o más inhibidores retrovirales en una cantidad eficaz para inhibir la actividad o la diseminación de los MTV de la presente invención.

La identificación del fármaco o los fármacos para usar en las composiciones farmacéuticas de esta forma de realización se puede realizar usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Para ejemplos de inhibidores de la proteasa y la transcriptasa inversa y procedimientos para determinar la eficacia de tales fármacos como inhibidores retrovirales véanse las patentes de EE.UU. número 5.858.738, 6.017.928 y 6.046.228, que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia. Las diversas composiciones de esta forma de realización de la invención pueden comprender, por ejemplo, los inhibidores actualmente conocidos de la integrasa, la proteasa o la transcriptasa inversa del VIH; como alternativa, dichos inhibidores se puede modificar de modo que se incremente su especificidad por los MTV. Asimismo, otras clases de inhibidores del VIH, como los péptidos que son análogos de la glucoproteína transmembrana, pueden servir como profármacos para desarrollar fármacos específicos que disminuyan la actividad y la presencia del MTC en seres humanos y otras especies. Estas composiciones se contemplan como útiles para inhibir la actividad y la diseminación del MTV en seres humanos y otras especies que portan estos virus, tales como elementos genéticos endógenos. Dichos fármacos podrían usarse para tratar a pacientes con cáncer de mama afectados por MTV y cabría esperar que mejoren la gravedad y reduzcan la recurrencia de la enfermedad. Además, dichos fármacos podrían usarse de forma profiláctica para prevenir que los individuos de alto riesgo desarrollen la enfermedad.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar las formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descrias en los ejemplos que figuran a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención y, por tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos de su práctica. No obstante, los expertos en la técnica deberán apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las formas de realización específicas que se describen y todavía obtener un resultado igual o similar sin desviarse del espíritu y el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Secuencias relacionadas con el MMTV en seres humanos

A partir de muestras de ADN humano, incluidas subpoblaciones de tejidos de CM (cáncer de mama) y de tejidos que no son CM, se amplificaron por PCR secuencias altamente similares (> 95%) al gen env del MMTV. Las secuencias relacionadas con MMTV se encontraron por PCR y una técnica de transferencia sensible no sólo en tumores de mama (véase la figura 1), sino también en la sangre de una subpoblación de controles sanos (véase la figura 2) y el pacientes de lupus eritematoso sistémico (LES) sin cáncer de mama. Los resultados de los autores difieren de los de Wang y colaboradores (1995) que, con pocas excepciones, pudieron detectar secuencias similares a MMTV únicamente en tumores de mama. Las secuencias de ADN humano fueron distintas de las secuencias del MMTV usadas como controles en estas reacciones de PCR, lo que indica que los resultados de los autores no se deben simplemente a contaminación. Para confirmar estos resultados se usó un ensayo de protección de ribonucleasa, usando una técnica no basada en PCR para determinar que la mayoría de los tejidos de CM positivos en PCR, pero ninguno de los tejidos negativos en PCR, expresaba esta secuencia a nivel de ARNm. Muchos de los productos de estas reacciones de PCR se han secuenciado. El análisis de estas secuencias proporciona más pruebas importantes de que la contaminación en la PCR es una explicación poco probable para los resultados observados. Las secuencias similares al env de MMTV de individuos diferentes derivadas en el mismo ciclo de PCR fueron distintas entre sí. Este resultado indica la ausencia de un contaminante ubicuo en la PCR que habría producido una secuencia más constante que debería haber sido idéntica (o casi idéntica) en los diversos tubos de reacción. Además, el ADN de sujetos individuales produjo secuencias similares al env de MMTV consistentes internamente de un ciclo de PCR a otro ciclo de PCR. Las variaciones dentro de las secuencias relacionadas con el MMTV de un paciente dado pueden representar un número bajo de errores Taq, pero también son sugestivos de variaciones esperadas de un retrovirus replicante (errores de la transcriptasa inversa).

Ejemplo 2 Determinación de los niveles del ARN del MTV mediante el ensayo de protección con ARNasa

El ensayo de protección con ribonucleasa (RPA) es un ensayo cuantitativo usado con frecuencia por los expertos habituales en la técnica para determinar los niveles de especies de ARN específicas sin amplificación por PCR. Brevemente, se realiza del siguiente modo para los transcritos de la presente invención: se sintetiza una sonda de longitud uniforme mediante transcripción in vitro de un molde clonado y marcado para actividad específica elevada. Se prepararon ribosondas marcadas con ^{[35]}S a partir de plásmidos que contienen los fragmentos de MTV clonados en el intervalo de tamaños de 150 a 400 pb. A continuación, la sonda se hibridó para analizar ARN, y los fragmentos de ARN que permanecen sin hibridar no están protegidos de la digestión por ARNasa A/T1. Los fragmentos de la ribosonda marcada protegidas mediante ARN hibridado se visualizaron y analizaron tras separación en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Los niveles de ARNm relacionados con MTV se comparan en cada muestra con los niveles de ARNm producidos por el gen de la \beta-actina, un gen "doméstico" para asegurar la integridad de la muestra de ARN (es decir, que el ARN no se ha degradado). El RPA detectó ARN en 2 de 3 tumores de mama positivos en PCR (véase la figura 3). El RPA es 10-15 veces más sensible que el análisis de tipo "Northern" para la detección de ARN mensajero raro. El análisis RPA se realiza directamente sobre ARN total, son ninguna manipulación previa, que puede introducir errores en el análisis cuantitativo.

Ejemplo 3 Determinación de los niveles de ARN de MTV mediante RT-PCR

Los ARNm del MTV también se pueden detectar usando RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con a transcriptasa inversa) en tiempo real. Por ejemplo, el I-Cycler (Biorad), con una instalación de detección fluoroscópica, es capaz de determinar la cinética a tiempo real del producto de amplificación por PCR a través de la cuantificación del producto de la PCR en la fase log-lineal de la reacción de la PCR. Usando este procedimiento, un termociclador en tiempo real puede comparar con fiabilidad cantidades minúsculas de un molde nucleotídico conocido de un modo reproducible.

Ejemplo 4 Detección de anticuerpos anti-MTV en sangre mediante análisis de transferencia de tipo western

Para generar proteínas recombinantes del MTV se puede usar el sistema InsectSelect^{TM} system (Invitrogen), que permite la producción estable de proteínas recombinantes en células de insecto de un modo similar a los sistemas de expresión en baculovirus bien caracterizados. Este es un sistema sin virus, que permite la creación de líneas celulares estables que producen de un modo continuo proteína de alta calidad. Las líneas celulares estables generadas en aproximadamente 9 días se pueden usar para la producción continua y prolongada de proteínas recombinantes. El sistema de expresión InsectSelect^{TM} se basa en un vector plasmídico que porta un gen de resistencia a antibiótico para la selección de líneas celulares de insecto de expresión estable. Este vector de expresión usa el promotor temprano inmediato, OpIE2, del baculovirus Douglas Fir Tussoc moth OpMNPV para la expresión génica. El OpIE2 es un fuerte promotor de la transcripción en lepidópteros (Sf9, 5121, High Five^{TM} (Invitrogen)) así como en líneas celulares de mosquito y dípteros. El vector de expresión pIZ/V5-His (Invitrogen) tiene múltiples sitios de clonación y diversas características que simplifican la producción y el análisis de proteínas recombinantes en células de insecto. Incluye un gen de resistencia a zeocina que permite la rápida selección de células transfeccionadas de forma estable, una cola C-terminal que codifica el epítopo V5 y una secuencia en el extremo C de polihistidina (6 His). Estas últimas características facilitan la rápida detección de proteínas con anticuerpos anti-V5 (Invitrogen) y la purificación proteica con resinas que se unen a la polihistidina. Sistemas de expresión eucariótica alternativos para proteínas relacionadas con el MMTV son un sistema de lisado en reticulocitos de conejo in vitro (Promega) con ARNm transcrito in vitro y protegido del sistema de expresión en virus Sindbis (Invitrogen).

Los genes relacionados con MMTV también pueden clonarse en un vector pGEX (Pharmacia) y expresarse en bacterias para hacer proteínas de fusión recombinantes con la proteína glutatión-S-transferasa (GST) para los estudios de inmunotransferencia. Este sistema tiene varias ventajas en comparación con otras metodologías de expresión de proteínas, de las cuales no es la menor la facilidad de producción, aislamiento y purificación de la proteína recombinante. Las proteínas de fusión generadas con la proteína GST normalmente permanecen solubles, lo que permite la recuperación en lisados celulares. Durante la purificación no se requieren condiciones de desnaturalización y, por tanto, a menudo se conservan las propiedades antigénicas y enzimáticas de la proteína. Además, la proteína de fusión con GST puede purificarse rápidamente y con eficacia mediante inmovilización de la GST sobre perlas o columnas recubiertas con glutatión, y se eluyen con glutatión reducido.

Para realizar una inmunotransferencia de tipo western, las proteínas de MTV se disuelven en tampón de lisis (Base Tris 0,25 M, pH 6,8, que contiene dodecilsulfato sódico al 4%, ditiotreitol al 10%, glicerol al 20% y azul bromofenol 0,01% p/v) se calientan hasta 100ºC durante 3 minutos y se someten a electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) en un gel de poliacrilamida al 10%. A continuación, estas proteínas pueden transferirse electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (Protran^{TM}; Schlecher & Schuell) en tampón de Tris-glicina (pH 8,3) con 20% de metanol. Las manchas se pueden incubar durante la noche en tampón de bloqueo (Tris 0,002M, NaCl 0,1M, suero de cabra inactivado por calor, 0,01% de timerosal y 5% de leche desecada desnatada) con suero o plasma del ser humano o el animal en investigación (dilución 1:100 o dilución óptima). La incubación con anticuerpos secundarios, anticuerpos de cabra IgG anti-humanos biotinilados (u otras especies) diluidos 1:500 o 1:1.000 en tampón de bloqueo u con peroxidasa de rábano-avidina se puede realizar a temperatura ambiente durante 2 horas. Las inmunomanchas pueden desarrollarse con 4-cloro-1-naftol 7,8 mM y peroxidasa de hidrógeno al 0,03%. Las bandas correspondientes a las proteínas de MTV se cuantifican mediante barrido y se procesan con un software de análisis de imágenes (NIH Image).

Ejemplo 5 Detección de anticuerpos anti-MTV mediante inmunoensayo ligado a enzimas

Los anticuerpos que se unen específicamente a proteínas del MTV se pueden detectar usando un inmunoensayo ligado a enzimas con una proteína o proteínas del MTV como diana para los anticuerpos. En esta técnica, las proteínas de MTV producidas en un sistema de expresión, como el sistema parásito de células de insecto/baculovirus o purificadas a partir de preparaciones víricas se pueden unir al fondo de los pocillos en una placa de microtitulación de plástico de multipocillos. El suero o el plasma de otras especies se diluye hasta una dilución óptima determinada empíricamente y se incuba durante un tiempo desde 1 hora a durante toda la noche a aproximadamente 25ºC (temperatura ambiente). A continuación se lavan los pocillos tres veces en una solución salina que contiene Tween®20 (Aldrich) o con detergentes NP-40 (en la actualidad disponible como Igepal^{TM} CA-630, Sigma) usando un lavaplacas automático. Después, los anticuerpos unidos a las proteínas MTV se pueden detectar haciendo reaccionar los pocillos secuencialmente con tampones que contienen inmunoglobulina de cabra anti-humana biotinilada, seguida por avidina acoplada a peroxidasa de rábano y, por último, con 3,3'3,5,5'-tetrametilbencidina, un sustrato de la peroxidasa de rábano que produce un producto de reacción coloreado. Entre cada etapa, normalmente el pocillo se lava tres veces en una solución salina que contiene Tween®20 o con detergentes NP-40 usando un lavaplacas automático. La reacción coloreada producida en cada pocillo se cuantifica usando un lector de placas espectrofotómetro. La cantidad de producto de la reacción coloreada es proporcional a la cantidad da anticuerpos frente al MTV presente en la muestra original.

Ejemplo 6 Detección in situ de proteínas retrovirales del MTV usando inmunohistoquímica

Las proteínas retrovirales del MTV pueden detectarse en muestras de tejido mediante ensayos inmunohistoquímicos. En esta técnica, las proteínas de MTV producidas en un sistema de expresión , como el sistema parásito de células de insecto/baculovirus, o purificadas a partir de preparaciones víricas se pueden usar para generar anticuerpos monoclonales o policlonales mediante procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica. A continuación, estos anticuerpos pueden marcarse con un resto de detección, tal como biotina, fluoresceína, peroxidasa de rábano u otros marcadores usados para este fin. Las preparaciones con anticuerpos marcados se diluyen a continuación hasta una dilución óptima determinada empíricamente y se incuban con secciones finas fijas o congeladas o preparaciones celulares de muestras a analizar para detectar la presencia de proteínas de MTV. Las muestras se procesa, según dicta el tipo de marcador usado, y la unión del anticuerpo a las proteínas retrovirales de MTV puede detectarse mediante microscopia, autorradiografía, citometría de flujo etc., de nuevo, según dicta la identidad del resto marcador.

Ejemplo 7 Preparación de una composición farmacéutica capaz de provocar una respuesta inmunológica frente al virus de tumor mamario humano, en seres humanos

Una composición farmacéutica a usar para inducir una respuesta inmunológica frente a una proteína del MTV en seres humanos o en animales de puede desarrollar del siguiente modo. Las proteínas de MTV producidas en un sistema de expresión , como el sistema parásito de células de insecto/baculovirus descrito antes, o purificadas a partir de preparaciones víricas se pueden purificar ampliamente usando cromatografía en columna y/o cualquier otra metodología empleada habitualmente por los expertos en la técnica. A continuación, las proteínas de MTV purificadas pueden mezclarse o emulsionarse con una preparación adyuvante adecuada (normalmente alumbre es el único adyuvante aprobado para usar en seres humanos) para producir una vacuna. Esta composición inmunogénica puede después inyectarse por vía subcutánea o intradérmica en el animal diana.

Todas las composiciones y procedimientos descritos y reivindicados en la presente memoria descriptiva se pueden realizar y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y procedimientos de esta invención se han descrito en términos de formas de realización preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones de las composiciones y procedimientos y en las etapas o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva sin desviarse del alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes química y fisiológicamente relacionados pueden sustituirse por los agentes descritos en la presente memoria descriptiva y se conseguirían resultados iguales o similares. Todos estos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del alcance y el concepto de la invención como se ha definido en las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan ejemplos de procedimientos u otros detalles complementarios a los expuestos en la presente memoria descriptiva, se incorporan específicamente en la presente memoria descriptiva por referencia.

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<212> PRT

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<219> Virus de tumor mamario de gato

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<400> 20

22

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<210> 21

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<211> 460

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<212> ADN

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 21

23

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<210> 22

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 22

24

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<210> 23

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<211> 461

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<212> ADN

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 23

25

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<210> 24

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<211> 153

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<212> PRT

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<212> Virus de tumor mamario humano

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<400> 24

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26

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<210> 25

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<211> 461

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<217> ADN

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 25

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27

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<210> 26

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 26

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28

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<210> 27

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<211> 460

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<212> ADN

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 27

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29

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<210> 23

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<211> 152

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<212> PRT

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<213> Virus de tumor mamario humano

\newpage

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<400> 28

30

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<210> 29

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<211> 461

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<212> ADN

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 29

31

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<210> 30

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<211> 43

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<212> PRT

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<213> Virus de tumor mamario humano

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<400> 30

32

Claims (28)

1. Una molécula de ADN aislado, que comprende:

a) Un fragmento de ADN que tiene una identidad de al menos el 99% con la longitud completa de las SEC ID Nº 2, 3, 4, 5, 7, 8, 21, 25 ó 27, en las que dicho fragmento de ADN se encuentra en tejido no canceroso; o

b) Un fragmento de ADN idéntico a uno o más de los siguientes: al menos 340 bases contiguas de la SEC ID Nº 2; al menos 150 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 3; al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-400 de la SEC ID Nº 4, al menos 130 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-360 de la SEC ID Nº 5; al menos 130 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 6, al menos 140 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 1-380 de la SEC ID Nº 7, al menos 210 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 20-462 de la SEC ID Nº 8, al menos 160 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 97-462 de la SEC ID Nº 21, al menos 170 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 23, al menos 100 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 337-462 de la SEC ID Nº 25, al menos 300 nucleótidos contiguos de la secuencia representada por los nucleótidos 85-462 de la SEC ID Nº 27, o al menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 29.

2. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 1, que comprende las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 21, 23, 25, 27 ó 29.

3. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN es de ser humano, macaco rhesus o gato.

4. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 1, que además comprende un resto de detección.

5. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 1, que está suspendida o disuelta en un diluyente.

6. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 5, en la que el diluyente es una solución acuosa tamponada.

7. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 5, en la que el ADN está presente a una concentración de aproximadamente 0,1 ng/\mul a 100 \mug/\mul.

8. Un polipéptido purificado codificado por una molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. El polipéptido purificado de la reivindicación 8, que es SEC ID Nº: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 24, 26, 28 ó 30.

10. El polipéptido purificado de la reivindicación 8 ó 9, que está presente en una composición farmacéutica.

11. El uso del polipéptido de las reivindicaciones 8 a 9 como antígeno en la preparación de anticuerpos, en el que el polipéptido no se usa como antígeno terapéutico.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

13. Un ARN correspondiente a una molécula de ADN de las reivindicaciones 1-4.

14. La molécula de ADN aislado de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, que se incorpora en un vector; en el que dicha secuencia de ADN está bajo el control transcripcional de un promotor heterólogo.

15. El vector de la reivindicación 14, que es capaz de expresar la secuencia de ADN en al menos uno de los siguientes tipos celulares: células de insecto, células bacterianas, células de ave, células de levadura o células de mamífero.

16. El vector de la reivindicación 14, en el que dicho vector es capaz de realizar replicación episomal o integración cromosómica en al menos uno de los siguientes tipos celulares: células de insecto, células bacterianas, células de ave, células de levadura o células de mamífero.

17. Un procedimiento para detectar la presencia de la molécula de ADN de las reivindicaciones 1-4, que comprende las etapas de:

i)

obtener una muestra biológica de la que se sospecha que contiene ADN que comprende una molécula de ADN de las reivindicaciones 1-4;

ii)

llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar la secuencia de ADN sospechosa tal y como se ha definido en la etapa i); para producir amplicones; y

iii)

determinar la secuencia, o si no caracterizar, de los amplicones producidos en la etapa ii) para determinar si la secuencia de ADN como se define en la etapa i) está o no presente en la muestra.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la muestra biológica se obtiene de ser humano, macaco rhesus o gato.

19. Un procedimiento para detectar la presencia de anticuerpos que reconocen uno o más polipéptidos de virus de tumor mamario, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

i) obtener una muestra de la que se sospecha que contiene anticuerpos específicos para anticuerpos virales de tumor de mama;

ii) obtener al menos un polipéptido purificado codificado por una molécula de ADN de las reivindicaciones 1-4;

iii) realizar análisis de inmunoquímico usando la muestra de la etapa i) y el polipéptido de la etapa ii); y

iv) analizar los resultados de la etapa iii) para determinar si los anticuerpos que interaccionan de forma específica con el péptido de la etapa ii) están presentes o no en la muestra.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el análisis inmunoquímico de la etapa iii) es un análisis de transferencia de tipo western.

21. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el análisis inmunoquímico de la etapa iii) es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.

22. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que uno o más de los polipéptidos derivan de los genes env o gag y los anticuerpos son específicos de uno o más de los polipéptidos siguientes de SEC ID Nº 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 24, 26, 28 ó 30.

23. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la muestra de la etapa ii) comprende anticuerpos de un ser humano, macaco rhesus o gato.

24. Un kit diagnóstico para detectar ADN o ARN de un virus de tumor mamario, en el que dicho kit comprende un reactivo que comprende una molécula de ADN de las reivindicaciones 1-4.

25. Un kit diagnóstico para detectar anticuerpos frente a virus de tumor mamario, en el que dicho kit comprende un reactivo que comprende uno o ambos de los siguientes:

i) uno o más polipéptidos codificados por una molécula de ADN de las reivindicaciones 1-4;

ii) un anticuerpo específico de un polipéptido de acuerdo con la etapa i).

26. Un procedimiento para la detección de ARN de virus de tumor mamario en una muestra, que comprende las etapas siguientes:

i) obtener una muestra de la que se sospecha que contiene ARN codificado por una o más de las secuencias de ADN de las reivindicaciones 1-4;

ii) llevar a cabo un ensayo de protección con ARNasa (RPA); y,

iii) analizar los resultados del RPA para determinar si el ARN como se define en la etapa i) está presente en la muestra y, opcionalmente, cuantificar dicho ARN.

27. El uso de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido purificado de la reivindicación 8 para determinar si dicho polipéptido está o no presente en una muestra.

28. El uso de la reivindicación 27, en el que el anticuerpo está marcado con un resto detectable.