NO331637B1 - Isolerte DNA molekyler, rensede polypeptider og anvendelse av disse, antistoff, vektorer, diagnostisk sett og fremgangsmater for pavisning og prognostisk evaluering av humant retrovirus i brystkreft. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder brysttumorvirus (MTV). MTV representerer en gruppe av retrovirus som har svært høy homologi med musebrysttumorvirus (MMTV), et virus som vites å forårsake neoplastisk brystsykdom hos mus. Som beskrevet heri har MTV blitt identifisert i menneske, katt og rhesus ape. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nærmere bestemt rekombinante nukleinsyrer og polypeptider avledet fra disse MTV, så vel som fremgangsmåter for anvendelse av disse biologiske molekylene.

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende patentsøknad krever prioritet fra den foreløpige U.S. patentsøknad nr. 60/141,626, innlevert 30. juni 1999.

1. Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder isolerte DNA molekyler, rensede polypeptider, vektorer og fremgangsmåter for påvisning, prognostisk evaluering av onkogene forstyrrelser, nærmere bestemt brystcancer.

Nærmere bestemt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sammensetninger som er anvendbare for identifisering og behandling av forstyrrelser forbundet med nylig identifiserte endogene retrovirus som foreligger i en undergruppe av mennesker, katter og ikke-menneskelige primater.

2. Teknisk problem som oppfinnelsen er rettet mot

Mutasjoner i kjente mottagelighetsgener kan ikke forklare all brystkreft

Brystkreft (BC) er en av de viktigste dødsårsaker blant kvinner. Induksjon av BC antas å omfatte et samspill mellom flere faktorer, innbefattet vertens genetiske, hormonelle, immunologiske og fysiologiske tilstand, så vel som kostvaner og utsatthet for kjemikalier, stråling eller infeksiøse midler. Det er nå klart at variasjoner i flere gener, innbefattet BRCA-1 og BRCA-2, kan føre til svært forhøyet utsatthet for utvikling av BC. Defekter i kjente BC-mottagelighetsgener utgjør imidlertid bare tilnærmet 5% av BC, de såkalte familiære tilfeller (Armstrong et al., 2000; Gayther et al., 1998).

Som for andre cancertyper har muligheten for at et virus er etiologisk innblandet i sporadisk forekommende BC ikke blitt utelukket. Det har følgelig lenge vært et behov for å bestemme hvilke virus, om noen, som er årsaksmessig knyttet til utvikling av BC. Identifisering av et slikt virus vil sannsynligvis være en uvurderlig støtte i følgende områder av BC-medisinen: forebyggelse, diagnose, prognosebestemmelser og behandling.

3. Beskrivelse av teknikkens stand

Retrovirus- induksjon av brystkreft hos mus

Musebrysttumor-virus (MMTV), et retrovirus av B-type, ble oppdaget under undersøkelser av arvelig kreft hos mus ved Jackson Laboratories på 1930-tallet (Bittner, 1936). Som en prototype på langsomt transformerende retrovirus har MMTV blitt definitivt vist å forårsake BC hos mus. Tidligere undersøkelser fastslo at MMTV overføres både i kimcellelinjen som endogene provirus og eksogent via melk. Som endogene elementer følger MMTV-provirus mendelske nedarvingsmønstre, i likhet med andre sekvenser i genomet (Cohen et al., Cell, 1979; Cohen og Varmus, 1979,1980; Traina et al., 1981; Traina-Dorge og Cohen, 1983; Traina-Dorge et al.; 1985; Varmus et al., 1978). Horisontal overføring av MMTV skjer typisk ved infeksjon av museunger med MMTV-viruspartikler som foreligger i melken hos infiserte mødre. Det er således mulig å overføre MMTV til mus ved foring ved fostermødre. 30 eller flere unike provirale integrasjonsseter for endogent MMTV har blitt identifisert. Noen ville mus bærer imidlertid intet endogent MMTV-provirus (Cohen og Varmus, 1979; Cohen et al., 1982). Dette resultat antyder at de mange endogene MMTV-provirus er relativt nye addisjoner til musegenomet. Den mest sannsynlige forklaring er at MMTV gikk inn i kimcellelinjen hos ville mus (men ikke andre) ved flere anledninger etter den evolusjonære oppdeling av forskjellige arter og underarter av slekten mus. Visse endoge MMTV kan aktiveres ved hormoner til dannelse av infeksiøse viruspartikler som kan indusere brystkarsinomer etter lange latenstider. De fleste endogene MMTV-provirus er defekte og koder ikke for infeksiøse viruspartikler.

MMTV- geners og cellulære geners roller i onkogenesen

MMTV Orf-proteinet kan fungere som et superantigen (SA). Ved ekspresjon i tymus under den tidlige fosterutvikling kan det formidle fullstendig eller ufullstendig fjerning av SA-reaktive T-celler. SA-ekspresjon er nødvendig for aktivering av B-celler rettet mot MMTV i det tarmforbundne lymfevev hos diende museunger. Fullstendig fjerning av de SA-responderende kloner gjør således musen resistent overfor MMTV-infeksjon i tarmen, noe som fører til lav forekomst av MMTV-induserte tumorer. Hos mus med bare delvis fjernede responderende kloner av lymfeceller stimulerer derimot SA-aktiveringen ekspansjon av målcellene og spredning av MMTV. Når infiserte hunnmus når puberteten styrer østrogenhormoner ekspresjonen av den lange terminale repetisjon (LTR) i MMTV via dennes hormonresponselement (HRE). Dette tillater produksjon og oppbygging av MMTV og spredning av viruset til andre hormonsensitive vev, innbefattet bryst og ovarier. Integrasjon av MMTV LTR i nabostilling til visse cellulære gener, for eksempel proto-onkogenene Int, Wnt og Fgf, kan gi forhøyet ekspresjon av disse genene, noe som fører til BC og andre cancere.

De molekylærgenetiske interaksjoner mellom MMTV, immunsystemet hos museverten og brystceller og andre hormonsensitive celler som er ondartet transformert med dette retrovirus har blitt undersøkt grundig. MMTV fremmer brystkjertelkreft hos mus ved insersjonsmutagenese (Varmus et al, 1978; Varmus, 1985). MMTV-provirale LTR- elementer styrer steroidhormonavhengig transaktivering av forskjellige cellulære onkogener, innbefattet Int, Wnt og Fgf, hvorved klonal ekspansjon av tumorceller fremmes (Shackleford og Varmus, 1987, Shackleford et al., 1993; Jakobovits et al., 1986; Nusse, 1991; Nusse et al., 1985). For produktiv, vedvarende infeksjon og fullføring av replikasjonssyklusen må MMTV inneholde et superantigen og interagere med et funksjonelt immunsystem hos verten (Golovkina et al., 1995; Luther og Acha-Orbea, 1996; Coffin, 1992).

Leting etter et humant brystkreftvirus

Oppdagelsen av det onkogene MMTV har fått mange forskere til å lete etter en retroviral etiologi for BC hos mennesker (Sårkar, 1980). Resultater oppsamlet over de siste fem tiår har antydet eksistensen av en human homolog av MMTV. I 1971 rapporterte Moore og medarbeidere at 60% av humane melkeprøver fra BC-pasienter inneholder partikler av B-type som ikke kan skilles fra MMTV ved elektron mikroskopi, sammenlignet med 5% av den generelle befolkning (Moore et al., 1971). Disse forskerne rapporterte også at 39% av Parsi-kvinner fra India, en innavlet populasjon med to gangers forhøyet forekomst av BC, hadde partikler B-type i melken (Das et al., 1972, Moore, 1971). Flere undersøkelser har vist at BC-celler, men ikke celler fra normale vev, også inneholder revers-transkriptase (RT), et enzym forbundet med alle retroviruser. En rekke forskere har undersøkt serum og brystmelk for forekomst av antistoffer som reagerer med MMTV. De fleste av disse undersøkelsene ble utført i tiden før AIDS, før utviklingen av svært sensitive og spesifikke teknikker for påvisning av antiretrovirale antistoffer, nødvendige for påvisning av HIV-antistoffer i blod fra blodgivere.

Til tross for de mange elektronmikroskopiske, biokjemiske og immunologiske undersøkelser av humant brystkarsinomvev, melk, pasientserum og brystkarsinomcelle-linjer som tyder på forekomsten av en human homonolog av MMTV har det vist seg vanskelig å bevise at et slikt middel foreligger (Andersson et al, 1996; Ziegler, 1997). De fleste forfattere har avvist betydningen av tidligere undersøkelser som prøvde å bevise forekomsten av en human homolog av MMTV grunnet forekomsten av et stort antall humane endogene retroviser (HERV) (Larsson et al., 1994; Li et al., 1996: Lower et al, 1996; Meese et al; 1996; Ono, 1986; Patience et al., 1996; Faff et al, 1992). Det finnes tilnærmet 50.000 HERV eller HERV-beslektede sekvenser i det humane genom, av hvilke noen har blitt vist å ha opp til 60% homologi med MMTV. I denne sammenheng er det viktig å bemerke at seroraktivitet overfor HERV-KIO, til nå det HERV som anses å være mest beslektet med MMTV, ikke kan forklare forekomsten av MMTV-reaktive antistoffer i serum fra brystcancerpasienter og på en lavere forekomst hos friske individer (Vogetseder et al., 1995). Vi antar videre at forekomsten av disse MMTV-beslektede sekvensene faktisk er grunnen til at humane homologer av MMTV ikke tidligere har blitt påvist med sikkerhet ved molekylære teknikker. Forekomsten av disse beslektede, men adskilte sekvensene kan ha forhindret påvisning av nærmere beslektede sekvenser av tidligere forskere som anvendte mindre følsomme teknikker, for eksempel Southern-blotting.

Kun nylig har sekvenser med relativt høy homologi (>90%) med sekvensen til MMTV blitt isolert fra humant BC-vev (Wang et al, 1995, 1998;). Sekvenser med 95-99% likhet med MMTV env ble amplifisert ved PCR i 121 (38,5%) av 314 ikke-selekterte brystkrefttumorprøver. Det er på sin plass å bemerke at de MMTV-lignende sekvensene kun ble påvist i 1 (1,8%) av 107 brystprøver fra reduksjonsmammoplastikk og i 0/80 prøver fra normale vev eller ikke-brysttumorer. Det MMT-ewv-lignende RNA ble uttrykt (som bestemt ved RT-PCR) i 66% av DNA PCR-positive brysttumorer (Wang et al., 1998). Et komplett provirus på 9,9 kb med 94% likhet med MMTV ble påvist i 2 brysttumorer. FISH (fluorescent in situ - hybridisering) viste integrasjon i flere DNA-seter avledet fra BC-tumorer, men ikke i normale brystceller (Wang et al., 1999 ACR-møte, sammendrag nr. 2933, 2944). Wang et al. foreslå forekomsten av et humant brysttumor virus (HMTV) som spres ved den eksogene infeksjonsvei (horisontal overføring). Forsøk fra disse og andre forskere på å amplifisere andre områder fra MMTV-beslektede virus fra genomisk DNA eller cDNA fra individer som ikke har BC ga HERV-sekvenser (for eksempel HERV-K10) med bare tilnærmet 60% homologi med MMTV. BC-vev er således de eneste vev hvori sekvenser som viser stor likhet med MMTV-sekvenser hittil har blitt funnet. Følgelig så normalt brystvev og andre vev ut til å være negative når det gjelder ekspresjon av virus med høy homologi med MMTV.

MMTV kan overføres horisontalt eller vertikalt

Den retrovirale replikasjonssyklus særpreges ved overføring av det enkelttrådede RNA-virus genom til dobbelttrådet provirus-DNA ved de mange enzymatiske aktiviteter til den viruspartikkel-forbundne reverse transkriptase (RT). Som for andre retrovirus er integrasjon av MMTV-provirus-DNA i vertscellegenomet nødvendig for ekspresjon av virusproteiner og produksjon av infeksiøst avkom. Både i infiserte musebrystkjertler og i heterologe celler integreres MMTV-provirus-DNA i et stort antall tilsynelatende tilfeldige seter. Integrasjon av MMTV-provirus som inneholder transkripsjonsaktive LTR nær noen cellulære gener (proto-onkogener) for eksempel Int, Wnt og Fgfkan føre til overekspresjon av disse genene, cellulær transformasjon og klonal ekspansjon av tumorcellene (Varmus, 1985; Shackleford et al., 1993; Jakobvitz et al, 1986; Cohen, 1980, Breznik og Cohen, 1982). Den lange latenstid for MMTV-indusert karsinogenese forklares delvis av behovet for integrasjon av provirus i disse spesielle setene.

Genetiske forskjeller mellom stammer av MMTV kan delvis forklare den varierende forekomst av BC i forskjellige musestammer. Mus fra C3H-stammen har mer enn 90% forekomst av BC, sammenlignet med <1% forekomst av BC hos BALB/c-mus. BALB/c-mus med C3H-fostermødre har høy forekomst av BC, noe som antyder at det tumorigene MMTV hos C3H kan overføres horisontalt i melken (Bittner, 1936). Omvendt, dersom C3H-mus har BALB/c-fostermødre er forekomsten av BC signifikant lavere (22-55%), men ikke så lav som for musestammer med lav forekomst. Denne siste observasjon understreker betydningen av det horisontalt overførte virus i melk hos stammene med høy forekomst, men peker også på de vesentlige forskjellene i tumorgent potensiale blant endogene MMTV-provirus. Provirus hos forskjellige mus med høy og lav tumorforekomst kan skilles fra hverandre ved forskjeller i hybridiseringskinetikk i løsning og kuttemønstre med restriksjonsendonukleaser (Cohen et al, Cell, 1979; Cohen og Varmus, 1979, 1980; Traina-Dorge og Cohen, 1983; Breznik et al, 1984). Ved å anvende restriksjonsenzymer som skiller mellom hypometylert og metylert DNA ble provirus av MMTV i melk også vist å være hypometylerte, mens de fleste endogene provirus inneholder store mengder 5-metylsytosin (Cohen, 1980; Breznik og Cohen, 1982; Breznik et al., 1984). Siden hypometylering er forbundet med forhøyet genekspresjon kan denne observasjon forklare betydningen av horisontalt overført MMTV i melk hos musestammer med høy forekomst av BC. Spesifikk hypometylering av et endogent MMTV-provirus var forbundet med ekspresjon av et transkript på 1,6 kb i melkeutskillende brystkjertel hos BALB/c-mus (Traina-Dorge et al., 1985).

I andre undersøkelser har endogene MMTV-provirus blitt vist å segregere som stabile genetiske enheter under innavl, og det har blitt vist at visse av disse endogene provirus er transkripsjonelt aktive (Cohen et al., Cell, 1979; Cohen og Varmus, 1979,1980; Traina et al., 1981; Traina-Dorge og Cohen, 1983; Traina-Dorge et al, 1985; Varmus et al., 1978). Rekombinante innavlede (RI) musestammer har blitt benyttet for å definere sammensetning og kromosomal plassering av MMTV-provirus (Traina et al, 1981; Traina-Dorge og Cohen, 1983). RI-stammene ble utviklet ved å krysse mus fra to svært innavlede linjer, tilfeldig parring av brødre og søstre fra F2-generasjonen og opprettholdelse av begge som separate linjer. Mange genetiske loci ble kartlagt til spesifikke kromosomer i disse stammene. Ved å anlysere segresjonsmønsteret for forskjellige MMTV-provirus med disse genetiske markørene ved restriksjonsendo-nuklease analyse og Southern-blotting var det mulig å bestemme den kromosomale plassering av en rekke MMTV-provirus i disse stammene og å fastslå at disse provirus segrerer ut fra reglene for mendelsk arv. Disse og andre analyser definerte 10 adskilte MMTV-enheter (provirus) i disse dyrene, noen full-lengde enheter og noen avkortede enheter. Nedarvingsmønsteret for de fleste av disse MMTV-provirusene var i samsvar med enkel-nedarving av enkeltgener, selv om tre av MMTV-enhetene viste noe variasjon. Mest bemerkelsesverdig var forekomsten av en enhet med opphav i en forelder som forelå hos 23 av de 26 analyserte RI-stammene. Det ble identifisert spesifikke provirus-enheter som var transkripsjonelt aktive og forbundet med forhøyet tumorproduksjon (Traina-Dorge et al., 1985). Det er av betydning at det ble identifisert cellulære gener som i signifikant grad var forbundet med virusekspresjonen, noe som viser betydningen av vertens genetikk på sykdomsutviklingen (Traina-Dorge et al., 1985).

Flere ting tyder på at de endogene MMTV-provirus har blitt integrert relativt nylig i kimcellelinjen hos forskjellige musestammer (Cohen og Varmus, 1979; Varmus et al., 1978). Dersom MMTV ble utviklet fra elementer som forelå i en forløper for mus musculus (laboratoriemusen), ville man forventet at alle de enkelte mus ville ha samme MMTV-provirus. Imidlertid har både laboratoriemus og ville mus fanget på flere steder et temmelig variabelt antall og en variabel fordeling av integrasjonsseter i kimcellelinjen for sine MMTV-provirus (Cohen og Varmus, 1979). Det mest slående funn blant disse resultatene var forekomsten av noen innfangede villdyr som ikke inneholdt endogene MMTV-provirus. Den mest sannsynlige tolkning av disse resultater er at de endogene MMTV-provirus oppsto ved flere uavhengige integrasjoner i DNA i kimceller etter artsdannelsen i slekten mus, snarere enn at de oppsto fra genetiske elementer som forelå i musens evolusjonære forløpere.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert DNA-molekyl, kjennetegnet ved

at det består av:

et DNA fragment som har minst 99% identitet med SEKV. ID. nr. 2, 3,4, 5,6,7, 8,21, 23,25, 27 eller 29, hvor nevnte DNA fragment finnes i ikke-cancerøst vev.

Oppfinnelsen omfatter også renset polypeptid, kjennetegnet ved at det kodes av et DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av et polypeptid i følge krav 9 eller 10 som et antigen i fremstillingen av et antistoff.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også vektor ifølge krav 15, kjennetegnet ved at den uttrykker DNA-sekvensen av nevnte fragment i minst en av følgende celletyper: insektceller, bakterieceller, fugleceller, gjærceller eller pattedyrceller.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for påvisning av nærvær av DNA molekylet i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: i) tilveiebringe en biologisk prøve som mistenkes for å inneholde et DNA-molekyl

i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4,

ii) utførelse av en polymerase-kjedereaksjon (PCR) og,

iii) analysere resultatene fra PCR for å fastslå hvorvidt DNA-molekylet foreligger i

prøven.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også fremgangsmåte for påvisning av nærvær av antistoffer som gjenkjenner et eller flere brysttumorvirus-polypeptider, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: i) tilveiebringe en prøve som mistenkes for å inneholde antistoffer som er

spesifikke for brysttumorviruspeptider,

ii) erholdelse av minst et renset polypeptid kodet for av et DNA molekyl i følge et

hvilket som helst kravene 1,2 eller 4,

iii) utførelse av en immunkjemisk analyse ved anvendelse av prøven og

polypeptidet, og

iv) analyse av resultatene fra trinn iii) for å fastslå hvorvidt antistoffer som spesifikt

interagerer med polypeptidet foreligger i prøven.

Videre omfatter oppfinnelsen diagnostisk sett for påvisning av DNA eller RNA fra et brysttumorvirus, kjennetegnet ved at det omfatter et reagens som omfatter et DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også diagnostisk sett for påvisning av antistoffer mot brysttumorvirus, kjennetegnet ved at det omfatter en reagens som omfatter en eller begge av følgende bestanddeler: i) et eller flere polypeptider i følge krav 9 eller 10;

ii) et antistoff som er spesifikt for et polypeptid ifølge krav 9 eller 10.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for påvisning av brysttumorvirus-RNA i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: i) tilveiebringe en prøve som mistenkes for å inneholde RNA som kodes av et eller

flere DNA-molekyler i følge et hvilket som helt av kravene 1,2 eller 4;

ii) utførelse av en RNAse-beskyttelsesanalyse (RPA) og

iii) analyse av RPA-resultatene for å fastslå hvorvidt RNA som definert i trinn i)

foreligger i prøven og eventuelt kvantifisering av dette RNA.

Antistoff, kjennetegnet ved at det er spesifikt for et polypeptid i følge krav 9 eller 10 er også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåter for å svekke eller fjerne aktiviteten av MTV i vertsdyret er mulig å frembringe. Dette kan igjen tilveiebringe farmasøytiske preparater som omfatter forbindelser som ødelegger aktiviteten av MTV-enzymene revers transkriptase, protease eller integrase. Videre er det mulig å tilveiebringe farmasøytiske preparater som kan utløse en immunrespons i et vertsdyr.

Kort beskrivelse av figurene

De påfølgende figurer utgjør en del av den foreliggende beskrivelse og inngår for ytterligere å demonstrere disse sider ved foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen kan forstås bedre ved henvisning til en eller flere av disse figurene, i kombinasjon med den detaljerte beskrivelse av spesifikke utførelser som presenteres heri.

Figur 1 viser resultatene av amplifisering av sekvenser beslektet med MMTV fira humant brystkreftvev.

Felt A: DNA ble ekstrahert fra humane brysttumorer (tilveiebragt av Michael Press, M.D., USC, Los Angeles eller Derrick Beech M.D., TMC/UT Memphis), og PCR ble utført ved anvendelse av primere som var spesifikke for det human MMTV env-beslektede gen. PCR-produktene ble overført til nitrocellulose ved blotting, og MMTV-beslektede produkter ble påvist ved hybridisering til en MMTV env probe på 1,8 kb. Spor a: ikke-radioaktivt merkede markører, ikke vist, sporene b-d, f-h, j: brysttumor-DNA: sporene e og i: intet DNA, spor k: kontroll med vann, spor 1: positiv kontroll, MMTV ewv-fragment klonet i "pBluescript".

Felt B: Som en analyse av integriteten av DNA fra de kliniske prøvene amplifiserte vi HERV-3-provirus-DNA, et humant endogent heterovirus som foreligger i en enkelt kopi, ved anvendelse av PCR-betingelser utviklet av Griffiths et al, (1997). Påvisning med etidium bromid (markørene er synlige i spor a). De samme prøver som i felt A, bortsett fra spor 1: positiv kontroll, HERV3 pol-fragment klonet i "pBluescript"

(Stratagene). Synlige bånd forelå i sporene c og g, men er vanskelige å se på kopien.

Figur 2 viser et eksempel på amplifisering av MMTV-beslektede sekvenser fra blod fra friske kontrollpersoner.

Felt A: DNA ble ekstrahert fra helblod fra friske kontrollindivider, og PCR ble utført ved anvendelse av primere som var spesifikke for det humane MMTV ewv-beslektede gen og PCR-produkter påvist ved Southern-hybridisering. Spor A: markører, sporene b-k: DNA fra helblod fra friske kontrollpersoner, spor 1: kontroll med vann, spor m: positiv kontroll, MMTV ewv-fragment i "pBluescript" (Stratagene).

Felt B: PCR-amplifisering av HERV-3. Påvisning med etidium bromid (markørene er synige i spor a). Samme prøver som i felt A bortsett fira spor m: positiv kontroll, HERV3 po/-fragment i "pBluescript".

Figur 3 viser et eksempel på påvisning av HMTV-mRNA ved ribonuklease beskyttelses-analysen. RNA ble ekstrahert fra tre HMTV PCR positive brystkreft-tumorer eller fra gjærceller og hybridisert til enten en probe på 189 baser som var spesifikk for HMTV eller til en B-aktinprobe på 245 baser. Prøvene ble så kuttet med Rnase A/Tl. Fragmentene av de merkede probene som var beskyttet i hybridisert RNA ble synliggjort og analysert etter separasjon i en denaturerende polyakrylamid gel. To av de tre tumorprøvene ga beskyttede fragmenter med forventet størrelse med HMTV-proben (pil) (sporene 1-3), mens alle tre tumor-RNA ga beskyttede fragmenter med R-aktin proben (sporene 5-7). Som forventet ble ingen av probene spesifikt beskyttet av gjær-RNA (sporene 4, 8).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolert DNA, RNA og isolerte polypeptider avledet fra brysttumorvirus (MTV), som er et virus med høy sekvenshomologi med musebrysttumorvirus. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre diagnostiske fremgangsmåter for anvendelse av disse makromolekylene. I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse diagnostiske sett som omfatter MTV-DNA, -RNA, og/eller - polypeptid, som kan anvendes ifølge de beskrevne fremgangsmåter.

Forskjellige utførelser av MTV-nukleinsyre som tilsvarer minst en av følgende kan tilveiebringes: DNA-sekvenser med minst 99% identitet med en av følgende:

a) minst 99% identitet med SEKV. ID. nr. 2, 3,4, 5, 7, 8,21, 25 eller 27; eller

b) minst 99% identitet med en eller flere av følgende: minst 340 på hverandre følgende baser fra SEKV. ID. nr. 2, minst 150 på hverandre følgende nukleotider fra

sekvensen representert ved nukleotidene 1-380 i SEKV. ID. nr. 3, minst 140 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 1-400 i SEKV. ID. nr. 4, minst 130 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 1-360 i SEKV. ID. nr. 5, minst 130 på hverandre følgende nukleotider fra SEKV. ID. nr. 6, minst 140 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 1-380 i SEKV. ID. nr. 7, minst 210 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 20-462 i SEKV. ID. nr. 8, minst 160 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 97-462 i SEKV. ID.nr. 21, minst 170 på hverandre følgende nukleotider fra SEKV. ID. nr. 23, minst 100 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 337-462 i SEKV. ID. nr. 25, minst 300 på hverandre følgende nukleotider fra sekvensen representert ved nukleotidene 85-462 i SEKV. ID. nr. 27, eller minst 200 på

hverandre følgende nukleotider fra SEKV. ID. nr. 29; eller

c) minst 92% identitet med SEKV. ID. nr. 10.

Sekvensene har fortrinnsvis mer enn 99% identitet med mer enn 200,250, 300, 350

eller 400 nukleotider fra SEKV. ID. nr. 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 21,23,25,27 eller 29. Sekvensene kan også ha mer enn 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identitet med SEKV. ID. nr. 10. Disse nuklein-syrene kan være avledet fra MTV fra mennesket, katt eller rhesus ape. Mest foretrukket er DNA identisk med hele eller deler av SEKV. ID. nr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,10,21,23,25,27 eller 29.

I en side ved denne utførelse av oppfinnelsen er DNA-sekvensene beskrevet ovenfor innført i en vektor. I forskjellige beslektede sider av oppfinnelsen er MTV-sekvensene under transkripsjonskontroll av en heterolog promoter. Vektorene som ansett som anvendbare ifølge foreliggende oppfinnelse kan uttrykke MTV-DNA-sekvensene i minst en av følgende celletyper: insektceller, bakterieceller, fugleceller, gjærceller, eller pattedyrceller. Videre kan vektorene ifølge denne side av oppfinnelsen replikeres episomalt og/eller integreres i kromosomet i minst en av de angitte celletyper.

I en annen side ved denne utførelse omfatter DNA-sekvensene en eller flere påvisbare grupper. Påvisbare grupper som anses som egnede for foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, fluoriserende fargestoffer og radioaktive isotoper av fosfor, svovel, oksygen, karbon eller hydrogen.

I ytterligere en side av denne utførelse av oppfinnelsen er det isolerte DNA-molekyl suspendert eller oppløst i et fortynningsmiddel som er kompatibelt med oppfinnelsen. Egnede fortynningsmidler forstyrrer ikke anvendelsen av DNA ifølge de forskjellige utførelser av foreliggende oppfinnelse. Fortynningsmidler som er anvendbare ifølge denne utførelse av oppfinnelsen er velkjente blant fagfolk. De omfatter, men er ikke begrenset til, bufrede vanlige løsninger. Disse løsningene kan være bufret med enhver forbindelse som er forenlig med foreliggende oppfinnelse. Eksempler på bufringsmidler omfatter fosfatbuffere og buffere som inneholder trishydroksy-aminometan (Tris). Slike bufrede vandige løsninger kan videre omfatte enhver annen forbindelse, for eksempel natriumklorid, som ikke interfererer med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Ifølge denne side ved foreliggende oppfinnelse kan MTV-DNA foreligge i enhver egnet konsentrasjon. Konsentrasjonen er fortrinnsvis fra tilnærmet 0,1 ng/ul til 100 ug/ul.

Andre utførelser av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer RNA-transkripter og/eller polypeptider som kodes av nukleinsyrene beskrevet ovenfor. Disse RNA-transkriptene eller polypeptidene kan kodes av enhver av DNA-sekvensene beskrevet ovenfor. Disse RNA-transkriptene og polypeptidene er homologer av RNA-transkripter og polypeptider som kodes av MMTV-genene em, gag, eller pol. RNA-transkriptene kan kodes av DNA-sekvensene beskrevet ovenfor. Slike RNA-transkripter har en sekvens som er identisk med den beskrevne DNA-sekvens, bortsett fra at RNA inneholder uridin i stedet for tymidin. Sekvensen kan tilsvare det rensede polypeptid hele eller deler av et env, gag eller/>rø-protein produkt fra et brysttumorvirus fra menneske, katt eller rhesus ape. Det foretrekkes at peptidene er rensede polypeptider. De rensede polypeptider kan bestå av hele eller deler av sekvensen som dannes ved transkripsjon og translasjon med opprettholdt leseramme av enhver av MTV-DNA-sekvensen beskrevet ovenfor. I en foretrukket side ved foreliggende oppfinnelse tilsvarer polypeptidenes sekvens produktet av en translasjon med opprettholdt leseramme av SEKV. ID. Nr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10,21, 23, 25, 27 eller 29. Polypeptidsekvensene kan ha hele eller minst 80 aminosyrer fra SEKV.ID. Nr. 12, 13,14, 15, 16, 17,18, 20, 22, 24,26 eller 28. Begrepet "avledet fra MTV-DNA" er ment å bety at RNA eller peptid tilsvarer i sekvens RNA eller peptid dannet ved transkripsjon henholdsvis transkripsjon og translasjon med opprettholdt leseramme av MTV-DNA.

Med "rensede polypeptider" menes at hovedmengden (mer enn 50%) av polypeptidene i prøven er MTV-polypeptidene. MTV-polypeptidene utgjør fortrinnsvis mindre enn 70% av polypeptidet i den rensede polypeptidprøven. MTV-polypeptidet kan utgjøre mer enn 90% av polypeptidet i prøven eller så kan MTV-polypeptidet utgjøre mer enn 95% av polypeptidet i prøven. I tillegg angir begrepet "renset polypeptid" at prøven ikke inneholder forbindelser som forstyrrer fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Rensede polypeptider erholdt i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være fra enhver egnet kilde som er forenelig med foreliggende oppfinnelse.

Et antistoff mot et MTV-polypeptid som beskrevet ovenfor kan tilveiebringes. Antistoffer kan frembringes ved anvendelse av et eller flere av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som det antigene middel. Slike antistoffer kan være enten monoklonale eller polyklonale av natur. Antistoffene er fortrinnsvis monoklonale. Når først MTV har blitt erholdt kan antistoffene fremstilles ifølge fremgangsmåter som er velkjente blant fagfolk. For eksempel fremstilles polyklonale antistoffer vanligvis ved injeksjon av det antigene middel (i nærvær av et immun-responsfremmende middel, for eksempel komplett Freunds adjuvans) inn i et dyr, for eksempel en sau, storfe, hest, geit eller kanin.

Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved hybridom fusjonsteknikker eller ved teknikker som benytter Epstein Barr-virus (EBV)-imortaliseringsteknikker (for fremstilling av humane mAb), som er velkjente blant fagfolk, modifisert som beskrevet heri. I fremgangsmåten omfatter disse teknikkene injeksjon av et immunogen, i dette tilfellet renset MTV-polypeptid, slik at det utløses en ønsket immunrespons i dyret (dvs. produksjon av antistoff). Forsøksdyret (for eksempel en mus) gis gjentatte injeksjoner

(forsterker injeksjoner) av den samme imortaliterte cellelinje. I et avsluttende trinn gis dyret en injeksjon av primærceller av den valgte celletype.

I det illustrerende eksempel heri for fremstilling av agonistiske monoklonale antistoffer mot megakardiosyttceller ble et CMK-cellepreparat og et CMS-cellepreparat anvendt som de første immunogener, imidlertid kunne andre imortaliserte megakaryosyttceller som Mo7e- eller DAMI-celler blitt benyttet. Andre monoklonale antistoffer som er analoge til agonist antistoffet ifølge oppfinnelsen, BAH-1, som spesifikt gjenkjenner C-Mpl-reseptoren, kan frembringes ved anvendelse av membranbundet c-Mpl-reseptor protein som immunogen. For frembringelse av monoklonale agonistantistoffer mot andre celletyper velges andre celler fra den hematopoeitiske cellelinje, for eksempel stamceller, B-celler eller T-celler. I det første immuniseringstrinn kan stamceller for eksempel være representert ved den immortaliserte cellelinje CTS, B-celler med de immortaliserte cellelinjene ARH-77, SB- eller Nal-6 og T-celler ved de immortaliserte cellelinjene Jurkat eller H9.

Etter et tilstrekkelig tidsrom avlives dyret, og somatiske antistoff-produserende celler kan erholdes fra lymfeknuter, milt og perifert blod fra immuniserte dyr. Miltceller foretrekkes. Muselymfosytter gir høy prosentandel av stabile funksjoner med muse-myelomene beskrevet nedenfor. Anvendelse av somatiske celler fra rotte, kanin, frosk, sau og andre pattedyr er også mulig. Miltcellekromosomene som koder for ønskede immunglobuliner immortaliseres ved å fusjonere miltcellene til myelomceller, generelt i nærvær av et fusjonsmiddel som polyetylenglykol (PEG). Enhver av en rekke myelom cellelinjer kan anvendes som fusjonspartner ifølge standard teknikker, for eksempel myelomcellelinjene P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653 eller Sp2/0-Agl4 myelom-linjer. Disse myelomlinjene er tilgjengelige fra the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209.

De resulterende cellene, som omfatter de ønskede hybridomer, dyrkes så i et selektivt medium, for eksempel HAT-medium, i hvilket ikke-fusjonerte utgangsmyelomceller eller lymfosyttceller med tiden dør. Bare hybridomcellene overlever og kan dyrkes under betingelser for begrenset fortynning for erholdelse av isolerte kloner. Super-natanten fra hybridomene analyseres for nærvær av antistoff med den ønskede spesifisitet ved for eksempel immunanalyseteknikker som dem beskrevet heri ved anvendelse av antigenet som ble benyttet for immunisering. Positive kloner kan så subklones under grensefortynningsbetingelser, og det dannede monoklonale antistoff kan isoleres. Forskjellige konvensjonelle fremgangsmåter foreligger for isolering og rensing av de monoklonale antistoffene slik at de befris for andre proteiner og andre kontaminanter. Hyppig anvendte fremgangsmåter for rensing av mononklonale antistoffer omfatter utfelling med ammoniumsulfat, ionebytterkromatografi og affinitetskromatografi. Hybridomer fremstilt ifølge disse fremgangsmåtene kan videre dyrkes in vitro eller in vivo (i ascitesvæske) ved anvendelse av teknikker som er kjente innen faget (se generelt, Harlow et al., Antibodies, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s.1-726, 1988).

Andre utførelser av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for påvisning av DNA, RNA og/eller proteiner fra MTV i biologiske prøver og/eller andre prøvetyper.

En fremgangsmåte for påvisning av MTV-DNA i en prøve som omfatter følgende trinn kan være: i) erholdelse av en prøve som mistenkes for å inneholde en eller flere av MTV-DNA-sekvensene beskrevet ovenfor,

ii) utførelse av en polymerase-kjedereaksjon (PCR) for amplifisering av en DNA-sekvens som definert i trinn i), og

iii) bestemmelse av sekvensen eller på annet vis karakterisering av amplikonene (det PCR-amplifiserte DNA) fremstilt i trinn ii) for å fastslå hvorvidt DNA-sekvensen som definert i trinn i) foreligger i prøven.

En side ved denne utførelse tilveiebringer en fremgangsmåte for påvisning av MTV-RNA i en prøve som omfatter følgende trinn: i) erholdelse av en prøve som mistenkes for å inneholde RNA som kodes av en

eller flere av MTV-DNA-sekvensene beskrevet ovenfor,

ii) utførelse av en RNAse-beskyttelsesanalyse (RPA), og

iii) analyse av RPA-resultatene for å fastslå hvorvidt RNA som definert i trinn i)

foreligger i prøven og, om ønskelig, kvantitering av dette RNA.

Gjennomsnittsfagfolk vil forstå at valg av parametere som er nødvendige for optimalisering av trinnene i disse fremgangsmåtene ligger godt innenfor gjennomsnittsfagmannens evner. Disse parametrene, for eksempel PCR-betingelsene (for eksempel valg av hybridiseringstemperatur, forlengelsestider og primere) og DNA-sekvenserings- fremgangsmåter bestemmes rutinemessig i laboratorier hvor slike molekylærbiologiske teknikker benyttes.

En annen side ved denne utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for analyse av en prøve for å fastslå hvorvidt prøven inneholder antistoffer som gjenkjenner MTV-polypeptidene. Denne fremgangsmåten omfatter trinnene: i) erholdelse av en prøve som mistenkes for å inneholde antistoffer som er

spesifikke for brysttumorvirus-antigener,

ii) erholdelse av minst et renset MTV-polypeptid,

iii) utførelse av immunkjemisk analyse ved anvendelse av prøven fra trinn i) og

polypeptidet fra trinn ii), og

iv) analyse av resultatene fra trinn iiii) for å fastslå hvorvidt antistoffer som

spesifikt interagerer med peptidet fra trinn ii) foreligger i prøven.

En annen side ved denne utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for analyse av en cellekultur eller en vevsprøve ved en eller flere immunhistologiske fremgangsmåter for å fastslå hvorvidt prøven inneholder MTV-proteiner. Denne fremgangsmåten omfatter trinnene: i) erholdelse av en prøve som mistenkes for å inneholde brysttumorvirusproteiner, ii) forberedelse av prøven fra trinn i) for immunkjemisk analyse,

iii) inkubering av prøven fra trinn ii) med et eller en kombinasjon av to eller flere monoklonale eller polyklonale antistoffer som er spesifikke for MTV-polypeptider som kodes av en eller flere av MTV-DNA-sekvensene beskrevet ovenfor, hvori antistoffene om ønskelig har en gruppe som tillater spesifikk

påvisning av dem,

iv) vask av prøvene for å fjerne antistoff som ikke er spesifikt bundet,

v) viderebehandling av prøvene etter behov for den utvalgte påvisnings-fremgangsmåte, og

vi) analyse av resultatene fra trinn v) for å fastslå hvorvidt MTV-proteiner

foreligger i prøven.

Det forventes at den immunkjemiske analyse kan omfatte, men ikke er begrenset til, analyse ved western-blotting eller enzymkoblet immunabsorbsjonsanalyse. Det vil innses at valg av parametere som er nødvendige for optimalisering av disse fremgangs-måtenes yteevne ligger innenfor gjennomsnittsfagmannens evner. Analysen kan utføres ved benyttelse av enten direkte immunkjemi (dersom antistoffene har blitt merket med en påvisbar gruppe) eller ved indirekte immunkjemi.

Farmasøytiske preparater som omfatter MTV-DNA, -RNA og/eller -proteiner beskrevet ovenfor kan tilveiebringes. Disse preparatene kan videre omfatte en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, en bærer eller et fortynningsmiddel, og inneholder ingen biologisk skadelige forbindelser. De farmasøytiske preparatene kan utformes av en gjennomsnittsfagperson. Egnede farmasøytiske utforminger beskrives i Remington ' s Pharmaceutical Sciences som er en standard referansetekst innen feltet.

De farmasøytiske preparatene kan videre omfatte fargestoffer eller stabiliseringsmidler, osmotiske midler, antibakterielle midler eller hvilke som helst andre forbindelser, så lenge som disse forbindelsene ikke forstyrrer funksjonen av preparatet. De farmasøytiske preparatene kan for eksempel utformes som løsninger, suspensjoner eller emulsjoner i forbindelse med et farmasøytisk aksepterbart parenteralt bærestoff. Eksempler på slike bærestoffer er vann, saltvann, Ringer's løsning, dekstroseløsning og 5% humant albumin. Liposomer kan også anvendes. Bærestoffer kan inneholde tilsetningsstoffer som opprettholder isotonisitet (for eksempel natriumklorid eller mannitol) og kjemisk stabilitet (for eksempel buffere og konserveringsmidler). Det bør forstås at endotoksinkontamineringen bør holdes på et trygt nivå, for eksempel mindre enn 0,5 ng/mg protein. For human tilførsel bør preparatene videre oppfylle standardene vedrørende sterilitet, pyrogenisitet, generell sikkerhet og renhet ifølge kravene til United States Food and Drug Adminstration Office of Biological Standard. Preparatene kan steriliseres ved vanlig anvendt teknikker som filtrering.

Begrepet "farmasøytisk aksepterbart" viser til forbindelser og preparater som ikke frembringer en skadelig, allergisk eller på annen måte uønsket reaksjon ved tilførsel til et dyr eller et menneske. En forbindelse som gir noen av disse uønskede virkningene ville klassifiseres som "biologisk skadelig". Farmasøytiske aksepterbare forbindelser og preparater kan omfatte løsemidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotonisitetsmidler og absorbsjonsforsinkede midler. Videre kan aktive tilleggsbestanddeler som spiller en annen farmakologisk hensiktsmessig rolle også inngå i de foreliggende preparater.

Fremgangsmåtene og preparatene som beskrives ovenfor forventes å være av stor nytte som hjelp til å fastslå hvorvidt MTV eller MTV-virus bestanddeler foreligger i en persons vev. Denne kunnskap vil være av nytte for å forutsi en pasients mottagelighet for kreft som er etiologisk avledet fra MTV. Fremgangsmåtene tilveiebringe et middel for å bestemme en pasients virusbelastning (mengden virus som foreligger i personens vev). I dette henseende forventes det at enorme fordeler vil oppnås ved å tilpasse fremgangsmåtene som beskrives heri til omfattende analyse av den generelle befolkning, og særlig av alle kjønnsmodne kvinner.

Andre preparater som tilveiebringer et middel for å stabilisere eller redusere mengden virus som foreligger i et menneske eller et annet dyr kan tilveiebringes.

De forskjellige fremgangsmåtene som beskrives ovenfor kan lett tilpasses til fremstilling av diagnostiske sett for påvisning av nærvær av MTV-DNA, -RNA og/eller -polypeptider. For den kliniske utførelse av oppfinnelsen omfattes følgelig enda flere utførelser av foreliggende oppfinnelse som tilveiebringer diagnostiske sett. Slike sett er anvendbare for kvalitativ og kvantitativ analyse av en prøve for å påvise, og kanskje bestemme mengden av, MTV-DNA, -RNA og/eller -polypeptid som foreligger i denne. I en side ved denne utførelse av oppfinnelsen omfatter settet som en del av bestanddelene et eller flere rekombinante DNA-molekyler som omfatter en eller flere av MTV-DNA-sekvensene beskrevet ovenfor. Ifølge denne side ved oppfinnelsen kan settet i tillegg til (eller alternativt til) det rekombinante MTV-DNA inneholde et eller flere syntetiske oligonukleotidprimerpar som er anvendbare for PCR-amplifisering av disse MTV-DNA-sekvensene.

En annen side ved denne utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer et sett for påvisning av antistoffer som spesifikt gjenkjenner brysttumorvirusproteiner. Som en del av bestanddelene i dette settet omfattes et reagens som omfatter et eller flere polypeptider som kodes av MTV-DNA-sekvensene beskrevet ovenfor.

Det kan også frembringes et sett som er anvendbart for påvisning av nærvær av MTV-proteiner ved immunsytokjemi, som omfatter et eller flere antistoffer (enten monoklonale eller polyklonale) som er spesifikke for minst et MTV-polypeptid. Disse antistoffene kan om ønskelig være modifiserte slik at de inneholder en påvisbar gruppe (for eksempel et fluorescerende fargestoff eller en radioaktiv isotop, for eksempel S).

Sett ifølge disse utførelsene av oppfinnelsen kan omfatte pakker som hver inneholder en eller flere av de forskjellige reagensene (typisk i konsentrert form) som er nødvendige for utførelse av de angjeldende diagnostiske analyser. Settene ifølge disse utførelsene av oppfinnelsen kan forventes å være anvendbare for påvisning og/eller kvantifisering av MTV-DNA, -RNA og/eller -protein i biologiske prøver eller andre prøvetyper. Slike prøver kan være utvalgt fra, men er ikke begrenset til, følgende: blodplasma eller serum, helblod, urin, spytt, kolonvæske, cerebrospinalvæske, lymfevæske, beinmarg, vevsprøver (for eksempel fra en kirurgisk biopsy) eller enhver annen prøve som mistenkes å inneholde disse biologiske molekylene.

Settene kan også videre omfatte et eller flere standardresultater. Som benyttet heri viser et "standardresultat" til en referansestandard som et analyseresultat sammenlignes med for å vurdere resultatene når det gjelder kvalitet og/eller kvantitet. En "standardserie" er et større antall slike referanser som representerer punkter langs en kvalitativ eller kvantitativ skala. Foretrukne i denne sammenheng er sett som omfatter en standardserie for tolkning av resultatene. Standarden kan foreligge i form av et eller flere fotografier, eller den kan være avbildet på andre måter, innbefattet skriftlige beskrivelser.

Standardene kan således være utviklet som en del av settene i samsvar med denne side ved oppfinnelsen for å bidra til tolkning av resultater. I denne sammenheng kan konsentrasjonen av RNA eller polypeptid i en biologisk prøve karakteriseres i samsvar med det foregående. Prøver kan tas fra et representativt utvalg av pasienter i forskjellige sykdomsstadier (innbefattet asymptomatiske pasienter eller i det vesentlige sykdomsfrie pasienter) for fremstilling av en standardserie. I denne sammenheng kan karakteriseringen dra nytte av etterpåklokskap ved å følge det faktiske forløp av den neoplastiske progresjon i pasienter mens de gjennomgår diagnose, behandling og oppfølging etter denne. Bestemmelse av virusbelastningen (bestemt ut fra forekomsten av MTV-DNA-RNA eller -polypeptid) som beskrevet ovenfor for en rekke pasienter med kjent brystkreftstatus og endelig skjebne, og påfølgende korrelasjon av disse resultatene er av uvurderlig prognostisk verdi. Dette vil være en hjelp til å gi pasienten en mer nøyaktig prognose, og det vil også hjelpe pasienten og onkologen når det gjelder å bestemme det beste behandlingsskjema dersom slik behandling er nødvendig.

Et preparat som induserer en immunologisk respons mot MTV i et dyr kan frembringes. Det kan være et preparat som induserer en immunologisk respons mot humant brysttumorvirusprotein i mennesker (se eksempel 7). Det forventes at slik indusert immunitet kan forebygge brystkreft hos individer som bærer endogent MTV ved at spredningen av viruset til hormonsensitive vev blokkeres.

Fremgangsmåter for frembringelse av en immunrespons mot virus-DNA og/eller -RNA i dyr er også kjente, se for eksempel U.S. patentskrifter nr. 5,990,091 og 6,004,799. Terapeutiske preparater som reduserer aktiviteten og nærværet av humant brysttumorvirus kan tilveibringes. En felles egenskap for alle retrovirus er nærvær av tre enzymer som deltar i forskjellige trinn i virusets replikasjonssyklus: revers transkriptase (RT), protease (PR) og integrase (IN). Forskjellige farmasøytiske midler som er rettet mot RT og PR fra humant immundefisiensvirus (HIV), et retrovirus som er fjernt beslektet med MTV, har blitt utviklet. Videre har kjemiske stoffer som selektivt inhiberer HIV IN blitt funnet, og prototypemedikamenter rettet mot dette enzym er underutvikling. (Hong et al, 1998; Mathe, 1999; Robinson, 1998; Singh et al, 2000). Ifølge en side av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et farmasøytisk preparat som omfatter en eller en blanding av to eller flere retrovirusinhibitorer i en mengde som effektivt inhiberer aktiviteten eller spredningen av MTV ifølge foreliggende oppfinnelse.

Identifisering av medikamentet eller medikamentene for anvendelse i de farmasøytiske preparatene kan gjøres ved å benytte teknikker som er kjente blant fagfolk. For eksempler på inhibitorer av protease og revers transkriptase og fremgangsmåter for å bestemme virkningen av slike medikamenter som retrovirus-inhibitorer, se U.S. patentskrifter nr. 5,858,738, 6,017,928 og 6,046,228. De forskjellige preparatene kan for eksempel omfatte for tiden kjente inhibitorer av HIV-integrase, protease eller reverstranskriptase, alternativt kan slike inhibitorer modifiseres slik at deres spesifisitet overfor MTV øker. Likeså kan andre klasser av HIV-inhibitorer, for eksempel peptider som er analoger av transmembranglykoproteinet, fungere som promedikamenter for utvikling av spesifikke medikamenter som reduserer aktivitet og nærvær av MTV i mennesker og andre arter. Disse preparatene forventes å være anvendbare for inhibering av aktivitet og spredning av MTV i mennesker og andre arter som bærer disse virus som endogene genetiske elementer. Slike medikamenter kunne anvendes for behandling av brystkreftpasienter som er smittet med MTV, og vil forventes å lindre omfanget og redusere tilbakekomsten av sykdom. I tillegg kunne slike medikamenter anvendes profylaktisk for å redusere forekomsten av individer med høy risiko for å utvikle sykdommen.

EKSEMPLER

Eksempel 1: MMTV-beslektede sekvenser i mennesker

Sekvenser som er svært like (>95%) MMTV-ewv-genet ble amplifisert ved PCR fra humane DNA-prøver, innbefattet undergrupper av både BC (brystcancer)-vev og -ikke-

BC-vev. De MMTV-beslektede sekvensene ble ved PCR og en følsom blottingteknikk funnet ikke bare i brysttumorer (se figur 1), men også i blod fra en undergruppe av friske kontrollindvider (se figur 2) og pasienter med systemisk lupus erytematosus (SLE) uten brystkreft. Våre resultater avviker fra resultatene til Wang og medarbeidere

(1995), som med få unntak var i stand til å påvise MMT-lignende sekvenser kun i brysttumorer. Sekvensene fra humant DNA avvek fra MMTV-sekvensen som ble benyttet som kontroller i disse PCR-reaksjonene, noe som viser at våre resultater ikke ganske enkelt skyldtes kontaminering. En ribonukleasebeskyttelsesanalyse ble benyttet for å bekrefte disse resultatene ved anvendelse av en ikke-PCR-basert teknikk for å vise at flertallet av de PCR-positive BC-vev, men ingen av de PCR-negative vev, uttrykte denne sekvensen på mRNA-nivå. Mange av produktene fra disse PCR-reaksjonene har blitt sekvensert. Analyse av disse sekvensene gir ytterligere bevis for at PCR-kontaminering er en usannsynlig forklaring på de observerte resultater. MMTV-env-lignende sekvenser fra forskjellige individer, erholdt i samme PCR-eksperiment, avvek fra hverandre. Dette resultat viser mangel på en allestedsnærværende PCR-kontaminant, som ville gitt en mer enhetlig sekvens som skulle vært identisk (eller nesten identisk) i de forskjellige reaksjonsrør. Videre ga DNA fra enkeltindivider MMTV-env-lignende sekvenser som var innbyrdes konsistente fra PCR- eksperiment til PRC-eksperiment. Variasjonene i de MMTV-beslektede sekvensene fra en gitt pasient kan representere et lavt antall Taq-feil, men antyder også variasjoner som vil forventes for et replikerende retrovirus (revers transkriptase-feil).

Eksempel 2: Bestemmelse av MTV-RNA-nivå ved Rnase-beskyttelsesanalyse Ribonuklease-beskyttelsesanalyse (RPA) er en kvantitativ analyse som hyppig anvendes av gjennomsnittsfagfolk for å bestemme nivået av spesifikke RNA-typer uten PCR-amplifisering. Kort beskrevet utføres analysen som følger for transkriptene ifølge foreliggende oppfinnelse: En probe med enhetlig lengde syntetiseres ved in vitro-transkripsjon av et klonet templat og merkes til høy spesifikk aktivitet.<[35]>S-merkede riboprober ble fremstilt fra plasmider som inneholdt de klonede MTV-fragmentene i størrelsesområdet fra 150 til 400 bp. Proben fikk så hybridisere til analyse-RNA, og RNA-fragmenter som forblir ikke-hybridiserte beskyttes ikke mot kutting med RNAse A/Tl. Fragmentene av den merkede riboprobe som var beskyttet av hybridiserende RNA ble synliggjorte og analysert etter separasjon i en denaturerende polyakrylamidgel. Nivået av MTV-beslektet mRNA sammenlignes i hver prøve med mRNA-nivået dannet fra B-aktingenet, et "husholdnings"-gen, for å sikre RNA-prøvens integritet (dvs. at RNA ikke har blitt degradert). RPA påviste RNA i 2 av 3 PCR-positive brysttumorer (se figur 3). RPA er 10-15 ganger mer følsomt enn "northern"-analyser for påvisning av sjeldne budbringer-RNA. RPA-analysen utføres direkte på total-RNA uten forutgående manipulering som kan innføres feil i den kvantitative analysen.

Ekempel 3: RT-PCR-bestemmelse av MTV-RNA-nivåer

MTV-mRNA kan også påvises ved anvendelse av sanntids-RT-PCR (revers transkriptasekoblet polymerase-kjedereaksjon). For eksempel er instrumentet I-Cycler (Biorad) med utstyr for fluoroskopisk påvisning i stand til å bestemme sanntidskinetikken for PCR-amplifiseringsproduktet ved kvantifisering av PCR-produktet i den logaritmiske-lineære fase av PCR-reaksjonen. Ved anvendelse av denne fremgangsmåten kan en programmerbar varmeblokk med sanntidsutstyr på pålitelig måte sammenligne svært små mengder av kjent nukleotidtemplat på en reproduserbar måte.

Eksempel 4: Påvisning av anti-MTV-antistoffer i blod ved Western-blotanalyse InsectSelect™ System (Invitrogen) som tillater stabil produksjon av rekombinante proteiner i insektceller på en måte som tilsvarer velkarakteriserte bakulovirus-ekspresjonssystemer, kan anvendes for frembringelse av rekombinante MTV-proteiner. Dette er et virusfritt system som tillater dannelse av stabile cellelinjer som kontinuerlig produserer protein av høy kvalitet. Stabile cellelinjer fremstilt på tilnærmet 9 dager kan anvendes for kontinuerlig fremstilling over lang tid av rekombinante proteiner. Ekspresjonssystemet InsectSelect™ er basert på en plasmidvektor som bærer et antibiotikarestistensgen for seleksjon av stabilt uttrykkende insektcellelinjer. Denne ekspresjonsvektoren benytter den umiddelbart tidlige promoter, OpIE2, fra OpMNPV-bakulovirus fra Douglas Gran Spinner for genekspresjon. OpIE2 er en kraftig transkripsjonspromoter i cellelinjer fra lipidopterin (Sf9, 5121, "High Five"

(Invitrogen)), så vel som i moskitocellelinjer og dipterincellelinjer. Ekspresjonsvektoren pIZ/V5-His (Invitrogen) har et flerkloningssete og flere egenskaper som forenkler produksjon og analyse av rekombinante proteiner i insektceller. Vektoren omfatter et Zeocin-resistensgen som tillater hurtig seleksjon av stabilt transfekterte celler, en C-terminal merkelapp som koder for V5-epitopen og en C-terminal polyhistidin (6xHis) sekvens. Disse siste egenskapene forenkler hurtig protein-påvisning med anti-V5-antistoffer (Invitrogen) og proteinrensing med resiner som binder polyhistidin. Alternative eukaryote ekspresjonssystemer for MMTV-beslektede proteiner er et in v/Yro-kaninretikulosytt lysat system (Promega) med in vitro-transkribert og "capped" mRNA eller Sindbis-virus ekspresjonssystemet (Invitrogen).

MMTV-beslektede gener kan også klones i en pGEX-vektor (Pharmacia) og uttrykkes i bakterier for fremstilling av rekombinant fusjonsprotein med glutation S-transferase (GST)-protein for immunblot analyser. Dette systemet har flere fordeler sammenlignet med andre metodologier for proteinekspresjon, ikke minst enkel produksjon, isolering og rensing av det rekombinante protein. Fusjonsproteiner dannet med GST-proteinet forblir typisk løselige, noe som tillater gjenvinning fra cellelysater. Denaturerende betingelser er ikke nødvendige under rensingen, og proteinets antigeniske egenskaper og enzymatiske egenskaper bevares ofte. Videre kan GST-fusjonsproteinet effektivt og hurtig renses ved å immobilisere GST til glutationbelagte kuler eller kolonner og eluering med redusert glutation.

For utførelse av et western-immunbloteksperiment løses MTV-proteiner i lyseringsbuffer (0,25 M Tris base, pH 6,8, inneholdende 4% natrium dodesyl sulfat, 10% ditiotreitol, 20% glyserol, og 0,01% v/v bromfenol blått), oppvarmes til 100°C i 3 minutter og fraksjoneres ved natrium dodesyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) i en 10% polyakrylamidgel. Disse proteinene kan så overføres elektroforetisk til en nitrocellulosemembran (Protran™; Schleicher & Schuell) i Tris-glysin (pH 8,3)-buffer med 20% metanol. Blottene kan inkuberes over natten i blokkeringsbuffer (0,02 M Tris, 0,1 M NaCl, varmeinaktivert geiteserum, 0,01% timerosal, og 5% fettfri tørrmelk) med serum eller plasma fra mennesket eller dyret som analyseres (1:100 fortynning eller optimal fortynning). Inkubering med sekundære antistoffer, biotinylerte anti-humant (eller andre arter) IgG-antistoff fra geit fortynnet 1:500 eler 1:1000 i blokkeringsbuffer, og med avidin-pepperrotperoksidase kan utføres ved romtemperatur i 2 timer. Immunblottene kan fremkalles med 7,8 mM 4-klor-l-naftol og 0,03% hydrogenperoksidase. Bånd som tilsvarer MTV-proteiner kvantifiseres ved scanning og analyseres med bildeanalyseprogramvare (NIH Image).

Eksempel 5: Påvisning av anti-MTV-antistoffer ved enzymkoblet immunanalyse Antistoffer som spesifikt bindes til et eller flere MTV-proteiner kan påvises ved anvendelse av en enzymkoblet immunanalyse med MTV-protein eller -proteiner som mål for antistoffene. I denne teknikken kan MTV-proteiner som er fremstilt i et ekspresjonssystem, for eksempel bakulovirus/insektcellesystemet, eller er renset fra viruspreparater bindes til bunnen av brønner i en flerbrønners mikrotiterplate av plast. Serum eller plasma fra mennesker eller andre arter fortynnes til en empirisk bestemt optimal fortynning og inkuberes fra 1 time til over natten ved tilnærmet 25°C (romtemperatur). Brønnene vaskes så tre ganger med en saltløsning som inneholder detergentene Tween® 20 (Aldrich) eller NP-40 (for tiden tilgjengelig som "Igepal"™ Ca-630, Sigma) ved anvendelse av en automatisk platevasker. Antistoffer som er bundet til MTV-proteinene kan så påvises ved å la brønnene reagere, først med buffere som inneholder biotinylert anti-humant immunglobulin fra geit, så med avidin koblet til pepperrotperoksidase, og endelig med 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin, et substrat for pepperrot peroksidase som gir et farget reaksjonsprodukt. Mellom hvert trinn vaskes brønnen typisk tre ganger med en saltløsning som inneholder detergentene "Tween"® 20 eller NP-40 ved anvendelse av en automatisk platevasker. Det fargede reaksjonsprodukt som dannes i hver brønn kvantifiseres ved anvendelse av en spektrofotometrisk plateleser. Mengden farget reaksjonsprodukt er proporsjonalt med mengden antistoffer mot MTV som foreligger i den opprinnelige prøve.

Eksempel 6: Påvisning av MTV-retrovirusproteiner in situ ved anvendelse av immunhistokj emi

MTV-retrovirusproteiner kan påvises i vevsprøver ved immunhistokjemiske analyser. I denne teknikken kan MTV-proteiner som er fremstilt i et ekspresjonssystem, for eksempel bakulovirus/insektcellesystemet, eller renset fra viruspreparater anvendes for frembringelse av monoklonale eller polyklonale antistoffer ved fremgangsmåter som er velkjente blant fagfolk. Disse antistoffene kan så merkes med en påvisbar gruppe, for eksempel biotin, fluorescein, pepperrotperoksidase eller andre merkingsgrupper som anvendes for dette formål. De merkede antistoffpreparatene fortynnes så til en empirisk bestemt optimal fortynning og inkuberes med fikserte eller nedfrosne tynne snitt eller cellepreparater fra prøver som skal analyseres for nærvær av MTV-proteiner. Prøvene prosesseres ifølge den valgte merkingstype, og binding av antistoffet til MTV-retrovirus-proteiner kan påvises ved mikroskopi, autoradiografi, "flow"-sytometri osv., igjen ut fra hvilken merkingsgruppe som har blitt benyttet.

Eksempel 7: Fremstilling av et farmasøytisk preparat som kan utløse en immunrespons mot humant brysttumorvirus i mennesker.

Et farmasøytisk preparat som skal anvendes for å indusere den immunologiske respons i mennesker eller dyr mot MTV-protein kan utvikles som følger: MTV-proteiner som er produsert i et ekspresjonssystem, for eksempel bakulovirus/insektcelledyrknings-systemet beskrevet ovenfor, eller som er isolert fra viruspreparater kan renses grundig ved anvendelse av kolonnekromatografi og/eller eventuelt andre metodologier som vanligvis anvendes av erfarne fagfolk. De rensede MTV-proteinene kan så blandes eller emulgeres med et egnet adjuvanspreparat (for tiden er alum den eneste adjuvans som er godkjent for anvendelse i mennesker) for produksjon av en vaksine. Dette immunogene preparatet kan så injiseres subkutant eller intradermalt i måldyret.

REFERANSER

Andersson, M.L., Medstrand, P., Yin, H., og Blomberg, J. (1996). "Differential expression of human endogenous retroviral sequences similar to mouse mammary tumor virus in normal peripheral blood mononuclear cells. AIDS Res Hum Retroviruses 12, 833-40.

Armstrong, K., Eisen, A. og Weber, B. (2000). Assessing the Risk of Breast Cancer. NEJM 342, 564-571.

Bittner, J. (1936). Some possible effects of nursing on the mammary gland tumor incidence in mice., Science 84, 162-166, 1936.

Breznik, T. og Cohen, J.C. (1982). Altered methylation of endogenous viral promoter sequences during mammary carcinogensis. Nature 295,255-257.

Breznik, T. Traina-Dorge V., Gama-Sosa M., Gehrke C.W., Ehrlich M., Medina D., Butel, J.S. Cohen, J.C. (1984). Mouse mammary tumor virus DNA methylation: tissue-specific variation, Virology, 136,69-77.

Coffin, J.M. (1992). Superantigens and endogenous retroviruses: a confluence of puzzles, Science 255,411-3.

Cohen, J.C. (1980). Methylation of milk-borne and genetically transmitted mouse mammary tumor virus proviral DNA, Cell. 19, 653-62, 1980.

Cohen, J.C. og Varmus, H.E. (1979). Endogenous mammary tumor virus DNA varies among wild mice and segregates during inbreeding. Nature 278, 418-423.

Cohen, J.C. og Varmus, H.E. (1980). Proviruses of mouse mammary tumor virus in normal and neoplastic tissues from GR and C3Hf mouse strains. J. Virology 35,298-305.

Cohen, J.C, Majors, J.E. og Varmus, H.E. (1979). Organization of mouse mammary tumor virus-specific DNA endogenous to BALB/c mice. J. Virology 32,483-496. Cohen, J.C. Shank, P.R. Morris, V.L., Cardiff, R., og Varmus, H.E. (1979). Integration of the DNA of mouse mammary tumor virus in virus-infected normal and neoplastic tissue of the mouse. Cell 16, 333-345.

Cohen, J.C, Traina, V.L., Breznik, T., Gardner, M. (1982). Development of an MMTV negative strain: a new system for the study of mammary carcinogenesis. J. Virology 44, 882-885.

Das, M.R., Vaidya, A.B., Sirsat, S.M. og Moore, (1972). D.H. Polymerase and RNA studies on milk virions from women of teh Parsi community, J. Nati Cancer Inst. 48, 1191-6.

Faff, O., Murray, A.B., Schmidt, J., Lieb-Mosch, C, Erfle, V., og Hehlmann, R. (1992). Retrovirus-like particles from the human T47D cell line are related to mouse mammary tumor virus and are of human endogenous origin, J. Gen Virol. 73, 1087-97.

Gayther, S.A., Pharoah P.D. og Ponder B.A. (1998). The genetics of inherited breast cancer. J. Mammary Gland Biol Neoplasia 3, 365-76.

Golovkina, T.V. Dudley, J.P., Jaffe, A.B. og Ross, S.R. (1995). Mouse mammary tumor vimses with functional superantigen genes are selected during in vivo infection, Proe Nati Acad Sei USA 92,4828-32.

Hong, H., Meamati, N., Winslow, H.E., Christensen, J.L. Orr, A., Pommier, Y., og Milne, G.W. (1998). Identification of HIV-1 integrase inhibitors based on a four-point pharmacophor, Antivir. Chem. Chemother, 9, 941-72.

Jakobvits, A., Shackleford, G.M. Varmus, H.E. og Martin, G.R. (1986). Two proto oncogenes implicated in mammary carcinogenesis, int.l and int-2, are independantly regulated during mouse development. Proe Nati Acad. Sei USA, 83, 7806-10.

Kitajewski, J., Mason, J.O. og Varmus, H.E. (1992). Interaction of Wnt-1 proteins with the binding protein BiP, Mol Cell Biol 12, 784-90.

Kitamura, Y., Ayukawa, T., Ishikawa, T., Kanda, T., og Yoshiike, K. (1996). Human endogenous retrovirus K10 encodes a functional integrase. J. Virol. 70, 3302-6. Larsson, E., Andersson, A.C., og Nilsson, B.O. (1994). Expression of an endogenous retrovirus (ERV3 HERV-R) in human reproductive and embryonic tissues - evidence for a function for envelope gene products. Ups J. Med Sei. 99, 113-20.

Li, J.M., Fan, W.S. Horsfall, A.C. Anderson, A.C., Rigby, S., Larsson, E. og Venables, P.J. (1996). Expression of human endogenous retrovirus-3 i fetal cardiac tissue and antibodies in congenital heart block Clin Exp Immunol. 104, 388-93.

Lower, R., Lower, J. og Kurth, R. (1996). The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous sequences. Proe Nati Acad Sei USA 93, 5177-84.

Luther, S.A. og Acha-Orbeca, H. (1996). Immune response to mouse mammary tumor virus, Curr Opin Immunol. 8,498-502.

Mathe, G. (1999) Why have ten or so nontoxic, retrovirus integrase inhibitors not been made available for AIDS-treatment? A ten-year experience [correction of experiment] must liberate them, Biomed. Pharmacother. 53,484-86.

May, F.E. og Westley, B.R. (1986). Structure of a human retroviral sequence related to mouse mammary tumor virus, J. Virol. 60,743-9.

Meese, E. Gottert, E. Zang, K.D., Sauter, M., Schommer, S. og Mueller-Lantzsch, N.

(1996). Human endogenous retroviral element K10 (HERV-Kl0): chromosomal localization by somatic hybrid mapping and fluorescense in situ in hybridization Cytogenet Cell Genet. 72,40-2.

Moore, D.H. (1971). Evidence for a human breast cancer virus, Indian J. Cancer, 8, 80-3.

Moore, D.H. Charney, J., Kramarsky, B., Lasfargues, E.Y. Sårkar, N.H., Brennan, M.J. Burrows, J.H. Sirsat, S.M., Paymaster, J.C. og Vaidya, A.B. (1971). Search for a human breast cancer virus, Nature, 229,611.

Nusse, R. (1991). Insertional mutagenesis in mouse mammary tumorigenesis, Curr Top Microbiol Immunol. 171,43-65.

Nusse, R., Brown, A., Papkoff, J., Scambler, P., Shackleford, G., McMahon, A., Moon, R., og Varmus, H. (1985). Retroviral insertional mutagenesis in murine mammary cancer, Proe R Soc LondB Biol Sei. 226, 3-13.

Ono, M. (1986). Molecular cloning and long terminal repeat sequences of human endogenous retrovirus genes related to types A and B retrovirus genes, J. Virol. 58, 937-44.

Patience, C, Simpson, G.R., Colletta, A.A., Welch, H.M., Weiss, R.A. og Boyd, M.T.

(1996). Human endogenous retrovirus expression and reverse transcriptase activity in the T47D mammary carcinoma cell line J. Virol. 70, 2654-7.

Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennario, red. 16. utgave, 1980.

Robinson, W.E. Jr. (1998) L-chicoric acid, an inhibitor of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) integrase, improvews on the in vi tro anti-HIV-1 effect of Zidovudine plus at protease inhibitor (AG 1350), Antiviral Res. 39,101-11.

Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

Sårkar, N.H. (1980). B-type virus and human breast cancer. I: G. Giraldo og E. Beth (red.) - The role of vimses in human cancer, s. 207-235. New York: Elsevier.

Shackleford, G.M og Varmus, H.E. (1987). Expression of the proto-oncogene int-1 is restricted to postmeiotic male germ cells and the neural tube of mid-gestational embrys, Cell 50, 89-95.

Shackleford, G.M., MacArthur, CA. Kwan, H.C og Varmus, H.E. (1993). Mouse mammary tumor vims infection accelerates mammary carcinogenesis in Wnt-1 transgenic mice by insertional activation of int-2/Fgf-3 and hst/Fgf-4. Proe Nati Acad Sei USA 90, 740-4.

Sing, S.B., Felock, R. og Hazuda, D.J. (2000) Chemical and enzymatic modifications of integric acid and HIV-1 integrase inhibitory activity, Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 235-38.

Traina, V.L., Taylor, B.A. og Cohen, J.C. (1981). Genetic Mapping of endogenous mouse mammary tumor vimses: locus characterization, segregation, and chromosomal distribution, J. Virology 40, 735-44.

Traina-Dorge, V. og Cohen, J.C. (1983). Molecular genetics of mouse mammary tumor vims, Curr Top Microbiol Immunol. 106,35-56.

Traina-Dorge, V.L., Carr, J.K., Bailey-Wilson, J.E., Elston, R.C. Taylor, B.A. og Cohen, J.C, (1985). Cellular genes in the mouse regulate in trans the expression of endogenous mous mammary tumor vimses, Genetics 111, 597-615.

Varmus, H.E. (1985). Vimses, genes, and cancer. I. The discovery of cellular oncogenes and their role in neoplasia, Cancer, 55,2324-8.

Varmus, H.E., Cohen, J.C. Shank, P.R. Ringold, G.M., Yamamoto, K.R., Cardiff, R. og Morris, V.L. (1978). The endogenous and acquired provimses of mouse mammary tumor vims, s. 161-79, i: Stevens Jg, et al, red. Persistent vimses. New York, Academic Press. 11.161-79.

Vogetseder, W., Denner, J., Boller, K., Kurth, R og Dietrich, M.P. (1995). Human endogenous retrovirus K does not encode mouse mammary tumor virus-related antigens in human breast carcinomas AIDS Res Hum Retroviruses 11, 869-72.

Wang, Y., G , V., Holland, J.F., Melana, S.M. og Pogo, B.G. (1998). Expression of mouse mammary tumor virus-like env gene sequences in human breast cancer. Clin. Cancer Res. 4,2565-2568.

Wang, Y., Holland, J.F. Bleiweiss, I.J., Melana, S., Liu, X., Pelisson, I., Cantarella, A., stellrecht, K., Mani, S. og Pogo, B.G. (1995). Detection of mammary tumor vims env gene-like sequences in human breast cancer. Cancer Res. 55,5173-5179.

Ziegler, J., (1997). An unlikely link? Researches probe viral role in breast cancer. J. Nati Cancer Inst. 89, 608-10.

Claims (28)

1. Isolert DNA-molekyl,karakterisert vedat det består av: et DNA fragment som har minst 99% identitet med SEKV. ID. nr. 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,21, 23, 25, 27 eller 29, hvor nevnte DNA fragment finnes i ikke-cancerøst vev.

2. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det består av SEKV. ID. nr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,21, 23, 25, 27 eller 29.

3. Isolert DNA molekyl i følge krav 1,karakterisert vedat molekylet omfatter SEQ ID NO:2,3,4,5,7,8,21,25 eller 27.

4. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-fragmentet er fra et menneske, rhesus ape eller katt.

5. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det videre omfatter en påvisbar gruppe.

6. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat er suspendert eller oppløst i et fortynningsmiddel.

7. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 6,karakterisert vedat fortynningsmidlet er en bufret vandig løsning.

8. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 6,karakterisert vedat DNA molekylet foreligger i en konsentrasjon på fra tilnærmet 0,1 ng/ul til 100 ug/ul.

9. Renset polypeptid,karakterisert vedat det kodes av et DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 4.

10. Renset polypeptid ifølge krav 9,karakterisert vedat det har en sekvens ifølge SEKV. ID. nr. 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 22,24, 26, 28 eller 30.

11. Renset polypeptid ifølge krav 9 eller 10,karakterisertved at det foreligger i et farmasøytisk preparat.

12. Anvendelse av et polypeptid i følge krav 9 eller 10 som et antigen i fremstillingen av et antistoff.

13. Anvendelsen ifølge krav 12, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.

14. RNA-molekyl,karakterisert vedat det tilsvarer et DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4..

15. Isolert DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er innført i en vektor, hvori DNA fragmentet er under transkripsjonskontroll av en heterolog promoter.

16. Vektor ifølge krav 15,karakterisert vedat den uttrykker DNA-sekvensen av nevnte fragment i minst en av følgende celletyper: insektceller, bakterieceller, fugleceller, gjærceller eller pattedyrceller.

17. Vektor ifølge krav 15,karakterisert vedat nevnte vektor gjennomgår episomal replikasjon eller kromsomal integrasjon i minst en av følgende celletyper: insektceller, bakterieceller, fugleceller, gjærceller, eller pattedyrsceller.

18. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av DNA molekylet i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4,karakterisert vedat den omfatter trinnene: i) tilveiebringe en biologisk prøve som mistenkes for å inneholde et DNA-moleky i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4, ii) utførelse av en polymerase-kjedereaksjon (PCR) og, iii) analysere resultatene fra PCR for å fastslå hvorvidt DNA-molekylet foreligger i prøven.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat den biologiske prøve er fra et menneske, rhesus ape eller katt.

20. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av antistoffer som gjenkjenner et eller flere brysttumorvirus-polypeptider,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: i) tilveiebringe en prøve som mistenkes for å inneholde antistoffer som er spesifikke for brysttumorviruspeptider, ii) erholdelse av minst et renset polypeptid kodet for av et DNA molekyl i følge et hvilket som helst kravene 1,2 eller 4, iii) utførelse av en immunkjemisk analyse ved anvendelse av prøven og polypeptidet, og iv) analyse av resultatene fra trinn iii) for å fastslå hvorvidt antistoffer som spesifikt interagerer med polypeptidet foreligger i prøven.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat den immunkjemiske analyse i trinn iii) er en Western-blot analyse.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat den immunkjemiske analyse i trinn iii) er en enzym-koblet immunadsorbsjonsanalyse (ELISA)-analyse.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat antistoffene er spesifikke for et eller flere av følgende polypeptider: SEKV. ID. nr 12, 13,14, 15,16,17,18, 22,24,26,28 eller 30.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 20 hvor prøven i trinn ii) er,karakterisert vedat den omfatter antistoffer som er avledet fra et menneske, en rhesus ape eller en katt.

25. Diagnostisk sett for påvisning av DNA eller RNA fra et brysttumorvirus,karakterisert vedat det omfatter et reagens som omfatter et DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 4.

26. Diagnostisk sett for påvisning av antistoffer mot brysttumorvirus,karakterisert vedat det omfatter en reagens som omfatter en eller begge av følgende bestanddeler: i) et eller flere polypeptider i følge krav 9 eller 10; ii) et antistoff som er spesifikt for et polypeptid ifølge krav 9 eller 10.

27. Fremgangsmåte for påvisning av brysttumorvirus-RNA i en prøve,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: i) tilveiebringe en prøve som mistenkes for å inneholde RNA som kodes av et eller flere DNA-molekyler i følge et hvilket som helt av kravene 1,2 eller 4; ii) utførelse av en RNAse-beskyttelsesanalyse (RPA) og iii) analyse av RPA-resultatene for å fastslå hvorvidt RNA som definert i trinn i) foreligger i prøven og eventuelt kvantifisering av dette RNA.

28. Antistoff,karakterisert vedat det er spesifikt for et polypeptid i følge krav 9 eller 10.