JP2002534980A - 自己免疫疾患に関連する内因性核酸断片、標識方法及び試薬 - Google Patents
自己免疫疾患に関連する内因性核酸断片、標識方法及び試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、単離された形態の、レトロウィルスタイプの内因性核酸断片であって、前記断片は、自己免疫疾患に関連する、又は妊娠の失敗若しくは妊娠の病理的状態に関連する内因性レトロウィルスのgag遺伝子の少なくとも一の部分を含む又はそれからなり、前記部分は少なくとも、直接的又は間接的に、発現産物をコードすることを特徴とする断片、又はその断片の相補配列に関する。さらに、この断片に属する内因性ヌクレオチド配列を検出する方法と、この断片を含む試薬にも関する。
Description
【０００１】
本発明は、ヒトゲノムのＤＮＡに組み込まれたレトロウィルスタイプの内因性
核酸断片に関する。
核酸断片に関する。
【０００２】
レトロウィルスは、pol遺伝子にコードされている逆転写酵素（ＲＴ）と呼ば
れるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介する、逆転写と呼ばれるプロセスによ
り複製するＲＮＡウィルスである。レトロウィルスのＲＮＡは、少なくとも２の
付加的な遺伝子、gag及びenv遺伝子も含む。gag遺伝子は、バックボーンのタン
パク質、すなわちマトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシドをコードす
る。env遺伝子は、エンベロープタンパク質をコードする。転写は、レトロウィ
ルスゲノムの５’−及び３’−末端部の境界であるLTRs（Long Terminal Repeat
）に位置するプロモーター領域により制御される。
れるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介する、逆転写と呼ばれるプロセスによ
り複製するＲＮＡウィルスである。レトロウィルスのＲＮＡは、少なくとも２の
付加的な遺伝子、gag及びenv遺伝子も含む。gag遺伝子は、バックボーンのタン
パク質、すなわちマトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシドをコードす
る。env遺伝子は、エンベロープタンパク質をコードする。転写は、レトロウィ
ルスゲノムの５’−及び３’−末端部の境界であるLTRs（Long Terminal Repeat
）に位置するプロモーター領域により制御される。
【０００３】 進化の過程で、ヒト又はその先祖は、感染の後、レトロウィルス起原の物質を
それらのゲノムに組み込んだ。具体的には、細胞が感染するとき、逆転写酵素が
レトロウィルスＲＮＡのＤＮＡ複製をつくり、このＤＮＡ複製がついでヒトゲノ
ム中に組み込むかもしれない。レトロウィルスは、胚の細胞に感染し、垂直メン
デル伝達により、さらなる世代に移ることができる。それらはついで、すべての
ヒト細胞のゲノムに組み込まれたプロウィルスの形態で存在する内因性レトロウ
ィルスとされる。多くの内因性レトロウィルスはサイレント又は欠損している。
しかしながら、それらのうちのあるものは、それらの最初の特性の一部又は全部
を保存されることができ、特定の条件下で活性化されることができる。内因性レ
トロウィルスの発現は、ウィルス遺伝子の転写からウィルス粒子の生産までの範
囲である。
それらのゲノムに組み込んだ。具体的には、細胞が感染するとき、逆転写酵素が
レトロウィルスＲＮＡのＤＮＡ複製をつくり、このＤＮＡ複製がついでヒトゲノ
ム中に組み込むかもしれない。レトロウィルスは、胚の細胞に感染し、垂直メン
デル伝達により、さらなる世代に移ることができる。それらはついで、すべての
ヒト細胞のゲノムに組み込まれたプロウィルスの形態で存在する内因性レトロウ
ィルスとされる。多くの内因性レトロウィルスはサイレント又は欠損している。
しかしながら、それらのうちのあるものは、それらの最初の特性の一部又は全部
を保存されることができ、特定の条件下で活性化されることができる。内因性レ
トロウィルスの発現は、ウィルス遺伝子の転写からウィルス粒子の生産までの範
囲である。
【０００４】 これらの内因性レトロウィルスは、ある病理状態の進展に、直接又は間接に、
関連することができる。
関連することができる。
【０００５】 内因性レトロウィルス構造は、完全な、ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｌ
ＴＲの形態又は先端を欠いた形態とすることができる。
ＴＲの形態又は先端を欠いた形態とすることができる。
【０００６】 例えば、以前の特許出願（ＰＣＴ／ＦＲ９８／０１４４２）において、出願人
は、Ｐｐｏｌ−ＭＳＲＶプローブ（配列番号１８）を用いてｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、７５８２ヌクレオチドの推定ゲノムＲＮＡを再構築する
ことを可能にする重なるクローンを検出した。このゲノムＲＮＡは、Ｒ−ＵＳ−
ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ構造を有する。再構築したゲノムを用いて、
いくつかのデータベースについての「blastn」呼びかけは、ヒトゲノムにおいて
、かなりの量の関連するゲノム（ＤＮＡ）配列が存在し、いくつかの染色体に存
在することを示すことを可能にした。こうして、出願人は、ヒトゲノム中のレト
ロウィルスタイプの部分構造を存在を示し、自己免疫疾患、妊娠の失敗、又は妊
娠の病理的状態の進展におけるそれらの潜在的な役割を認識した。
は、Ｐｐｏｌ−ＭＳＲＶプローブ（配列番号１８）を用いてｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、７５８２ヌクレオチドの推定ゲノムＲＮＡを再構築する
ことを可能にする重なるクローンを検出した。このゲノムＲＮＡは、Ｒ−ＵＳ−
ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ構造を有する。再構築したゲノムを用いて、
いくつかのデータベースについての「blastn」呼びかけは、ヒトゲノムにおいて
、かなりの量の関連するゲノム（ＤＮＡ）配列が存在し、いくつかの染色体に存
在することを示すことを可能にした。こうして、出願人は、ヒトゲノム中のレト
ロウィルスタイプの部分構造を存在を示し、自己免疫疾患、妊娠の失敗、又は妊
娠の病理的状態の進展におけるそれらの潜在的な役割を認識した。
【０００７】 自己免疫疾患は、例としては、多発性硬化症、リューマチ関節炎、播種性エリ
テマトーデス、インスリン依存性糖尿病及び／又はそれらに関連する病理を挙げ
ることができる。
テマトーデス、インスリン依存性糖尿病及び／又はそれらに関連する病理を挙げ
ることができる。
【０００８】 重なるｃＤＮＡ断片の単離及び配列決定と、単離されたＤＮＡクローンに対応
するゲノム（ＤＮＡ）クローンの同定は、出願人の上記ＰＣＴ特許出願に記載さ
れており、ここに参照として取り込まれる。
するゲノム（ＤＮＡ）クローンの同定は、出願人の上記ＰＣＴ特許出願に記載さ
れており、ここに参照として取り込まれる。
【０００９】 重なるｃＤＮＡ断片の単離と配列決定は： 出願人により、ＨＥＲＶ−Ｗと名づけられた内因性レトロウィルスの新規ファミ
リーの構成に関する情報は、胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Clontech cat#HL5014a
）を、Ppol-MSRV（配列番号１８）とPenv-C15（配列番号１９）プローブでテス
トし、得られた新規配列を用いて“gene walking”技術を行うことにより得られ
た。実験は、ライブラリーの供給者の推薦する方法を参照して行った。ＤＮＡに
対するＰＣＲ増幅も、この構成を理解するために用いた。
リーの構成に関する情報は、胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Clontech cat#HL5014a
）を、Ppol-MSRV（配列番号１８）とPenv-C15（配列番号１９）プローブでテス
トし、得られた新規配列を用いて“gene walking”技術を行うことにより得られ
た。実験は、ライブラリーの供給者の推薦する方法を参照して行った。ＤＮＡに
対するＰＣＲ増幅も、この構成を理解するために用いた。
【００１０】 以下のクローンを選択し、配列決定した： −クローンｃｌ．６Ａ２（配列番号２０）：ＨＥＲＶ−Ｗの５’非翻訳領域とｇ
ａｇの一部。 −クローンｃｌ．６Ａ１（配列番号２１）：ｇａｇと、ｐｏｌの一部。 −クローンｃｌ．７Ａ１６（配列番号２２）：ｐｏｌの３’領域。 −クローンｃｌ．Ｐｉ２２（配列番号２３）：ｐｏｌの３’領域とｅｎｖの初め
の部分。 −クローンｃｌ．２４．４（配列番号２４）：ＨＥＲＶ−Ｗの５’非翻訳領域の
一部、ｐｏｌの末尾、及びｅｎｖの５’領域を含む、スプライスしたＲＮＡ。 −クローンｃｌ．Ｃ４Ｃ５（配列番号２５）：ｅｎｖの末尾及びＨＥＲＶ−Ｗの
３’非翻訳領域。 −クローンｃｌ．ＰＨ７４（配列番号２６）：サブゲノムＲＮＡ：ＨＥＲＶ−Ｗ
の５’非翻訳領域、ｐｏｌの末尾、ｅｎｖ、及びＨＥＲＶ−Ｗの３’非翻訳領域
。 −クローンｃｌ．ＰＨ７（配列番号２７）：マルチスプライスしたＲＮＡ：ＨＥ
ＲＶ−Ｗの５’非翻訳領域、 ｅｎｖの末尾、及びＨＥＲＶ−Ｗの３’非翻訳領
域。 −クローンｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（配列番号２８）：部分的ｐｏｌ遺伝子及びＵ３−Ｒ
領域。 −クローンｃｌ．４４．４（配列番号２９）：Ｒ−Ｕ５領域、ｇａｇ遺伝子及び
部分的ｐｏｌ遺伝子。
ａｇの一部。 −クローンｃｌ．６Ａ１（配列番号２１）：ｇａｇと、ｐｏｌの一部。 −クローンｃｌ．７Ａ１６（配列番号２２）：ｐｏｌの３’領域。 −クローンｃｌ．Ｐｉ２２（配列番号２３）：ｐｏｌの３’領域とｅｎｖの初め
の部分。 −クローンｃｌ．２４．４（配列番号２４）：ＨＥＲＶ−Ｗの５’非翻訳領域の
一部、ｐｏｌの末尾、及びｅｎｖの５’領域を含む、スプライスしたＲＮＡ。 −クローンｃｌ．Ｃ４Ｃ５（配列番号２５）：ｅｎｖの末尾及びＨＥＲＶ−Ｗの
３’非翻訳領域。 −クローンｃｌ．ＰＨ７４（配列番号２６）：サブゲノムＲＮＡ：ＨＥＲＶ−Ｗ
の５’非翻訳領域、ｐｏｌの末尾、ｅｎｖ、及びＨＥＲＶ−Ｗの３’非翻訳領域
。 −クローンｃｌ．ＰＨ７（配列番号２７）：マルチスプライスしたＲＮＡ：ＨＥ
ＲＶ−Ｗの５’非翻訳領域、 ｅｎｖの末尾、及びＨＥＲＶ−Ｗの３’非翻訳領
域。 −クローンｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（配列番号２８）：部分的ｐｏｌ遺伝子及びＵ３−Ｒ
領域。 −クローンｃｌ．４４．４（配列番号２９）：Ｒ−Ｕ５領域、ｇａｇ遺伝子及び
部分的ｐｏｌ遺伝子。
【００１１】 ＨＥＲＶ−Ｗの全体の配列モデルは、配列アラインメントを行うことにより、
これらのクローンを用いて作られた。スプライスしたＲＮＡｓは明らかにされ、
部分的スプライス供与体と受容体部位も明らかにされた。ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏ
ｌ及びｅｎｖは、現存のレトロウィルスに類似した研究により定義される。
これらのクローンを用いて作られた。スプライスしたＲＮＡｓは明らかにされ、
部分的スプライス供与体と受容体部位も明らかにされた。ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏ
ｌ及びｅｎｖは、現存のレトロウィルスに類似した研究により定義される。
【００１２】 ＲＮＡ形態のＨＥＲＶ−Ｗの推定遺伝子構成は以下の通りである（配列番号３
０）： 遺伝子 １．．７５８２． 再構築されたゲノムＲＮＡ配列のクローンの位置： ｃｌ．６Ａ２（１３２１ｂｐ）１−１３２５； ｃｌ．ＰＨ７４（５３５＋２２２９＝２７６４ｂｐ）７２−６０６及び５３５３
−７５８２； ｃｌ．２４．４（４９１＋１４５７＝１９４８ｂｐ）１１５−６０６及び５３５
３−６８１０； ｃｌ．４４．４（２３７２ｂｐ）１１５−２４９６； ｃｌ．ＰＨ７（３６９＋２９７＝６６６ｂｐ）２３７−６０６及び７０１７−７
３１３；ｃｌ．６Ａ１（２９３８ｂｐ）５８６−３５５９； ｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（２７８５＋５６６＝３３５１ｂｐ）２７４７−５５５７及び７
０１７−７５８２； ｃｌ．７Ａ１６（１４２２ｂｐ）２９０８−４３３７； ｃｌ．Ｐｉ２２（３１７＋１６８９＝２００６ｂｐ）３９５７−４２７３及び４
４７６−６１６８； ｃｌ．Ｃ４Ｃ５（１１１６ｂｐ）６４６７−７５８２ ５’ＬＴＲ １．．１２０ ／ノート＝５’ＬＴＲの’’Ｒ（５’末端非確実’’） １２１．．５７５ ／ノート＝“５’ＬＴＲのＵ５” ｍｉｓｃ． ５７９．．５９６ ／ノート＝“ＰＢＳ、プライマー結合部位、ｔＲＮＡ−Ｗ用” ｍｉｓｃ． ６０６ ／ノート＝’’スプライスジャンクション（スプライス供与体部位 ＡＴＣＣＡＡＡＧＴＧ−ＧＴＧＡＧＴＡＡＴＡ 及びスプライス供与体部位 ＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧ−ＡＴＧＧＧＡＡＡＣＧ、 クローンＲＧ０８３Ｍ０５、 ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号 ＡＣ００００６４） ｍｉｓｃ． ５３５３ ／ノート＝’’ＯＲＦ１（ｅｎｖ）のスプライス受容体部位’’ ｍｉｓｃ． ５５６０ ／ノート＝’’スプライス供与体部位’’ ＯＲＦ ５５８１．．７１９４ ／ノート＝”ＯＲＦ１ ｅｎｖ ５３８ ＡＡ” ／産物−＝“エンベロープ” ｍｉｓｃ． ７０１７ ／ノート＝“ＯＲＦ２とＯＲＦ３のスプライス受容体部位” ＯＲＦ ７０３９．．７１９４ ／ノート＝”ＯＲＦ２ ５２ ＡＡ” ＯＲＦ ７１１２．．７２５５ ／ノート＝”ＯＲＦ３ ４８ ＡＡ” ｍｉｓｃ． ７２４４．．７２５４ ／ノート＝”ＰＰＴ、ポリプリントラクト” ３’ＬＴＲ ７２５６．．７５８２ ／ノート＝”３’ＬＴＲ（未同定Ｕ３−Ｒジャンクション）のＵ３ −Ｒ” ｍｉｓｃ． ７５６３．．７５６９ ポリアデニル化シグナル
０）： 遺伝子 １．．７５８２． 再構築されたゲノムＲＮＡ配列のクローンの位置： ｃｌ．６Ａ２（１３２１ｂｐ）１−１３２５； ｃｌ．ＰＨ７４（５３５＋２２２９＝２７６４ｂｐ）７２−６０６及び５３５３
−７５８２； ｃｌ．２４．４（４９１＋１４５７＝１９４８ｂｐ）１１５−６０６及び５３５
３−６８１０； ｃｌ．４４．４（２３７２ｂｐ）１１５−２４９６； ｃｌ．ＰＨ７（３６９＋２９７＝６６６ｂｐ）２３７−６０６及び７０１７−７
３１３；ｃｌ．６Ａ１（２９３８ｂｐ）５８６−３５５９； ｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（２７８５＋５６６＝３３５１ｂｐ）２７４７−５５５７及び７
０１７−７５８２； ｃｌ．７Ａ１６（１４２２ｂｐ）２９０８−４３３７； ｃｌ．Ｐｉ２２（３１７＋１６８９＝２００６ｂｐ）３９５７−４２７３及び４
４７６−６１６８； ｃｌ．Ｃ４Ｃ５（１１１６ｂｐ）６４６７−７５８２ ５’ＬＴＲ １．．１２０ ／ノート＝５’ＬＴＲの’’Ｒ（５’末端非確実’’） １２１．．５７５ ／ノート＝“５’ＬＴＲのＵ５” ｍｉｓｃ． ５７９．．５９６ ／ノート＝“ＰＢＳ、プライマー結合部位、ｔＲＮＡ−Ｗ用” ｍｉｓｃ． ６０６ ／ノート＝’’スプライスジャンクション（スプライス供与体部位 ＡＴＣＣＡＡＡＧＴＧ−ＧＴＧＡＧＴＡＡＴＡ 及びスプライス供与体部位 ＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧ−ＡＴＧＧＧＡＡＡＣＧ、 クローンＲＧ０８３Ｍ０５、 ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号 ＡＣ００００６４） ｍｉｓｃ． ５３５３ ／ノート＝’’ＯＲＦ１（ｅｎｖ）のスプライス受容体部位’’ ｍｉｓｃ． ５５６０ ／ノート＝’’スプライス供与体部位’’ ＯＲＦ ５５８１．．７１９４ ／ノート＝”ＯＲＦ１ ｅｎｖ ５３８ ＡＡ” ／産物−＝“エンベロープ” ｍｉｓｃ． ７０１７ ／ノート＝“ＯＲＦ２とＯＲＦ３のスプライス受容体部位” ＯＲＦ ７０３９．．７１９４ ／ノート＝”ＯＲＦ２ ５２ ＡＡ” ＯＲＦ ７１１２．．７２５５ ／ノート＝”ＯＲＦ３ ４８ ＡＡ” ｍｉｓｃ． ７２４４．．７２５４ ／ノート＝”ＰＰＴ、ポリプリントラクト” ３’ＬＴＲ ７２５６．．７５８２ ／ノート＝”３’ＬＴＲ（未同定Ｕ３−Ｒジャンクション）のＵ３ −Ｒ” ｍｉｓｃ． ７５６３．．７５６９ ポリアデニル化シグナル
【００１３】
単離されたＤＮＡクローンに対応するゲノム（ＤＮＡ）クローンの同定： 再構築されたゲノムを用いて、いくつかのデーベースの“Blastn”質疑応答は
、ヒトのゲノムにおいてかなりの量の関連配列があることを示した。GenBankに
おいて約４００の配列が、ESTバンクにおいて２００を超える配列が同定され、
それらの多くがアンチセンスの方向であった。サイズと類似性において４つの最
も重要な配列は、以下のゲノム（DNA）クローンの配列である：
、ヒトのゲノムにおいてかなりの量の関連配列があることを示した。GenBankに
おいて約４００の配列が、ESTバンクにおいて２００を超える配列が同定され、
それらの多くがアンチセンスの方向であった。サイズと類似性において４つの最
も重要な配列は、以下のゲノム（DNA）クローンの配列である：
【００１４】 ヒトクローンＲＧ０８３Ｍ０５（ｇｂ ＡＣ００００６４）、染色体位置は７
ｑ２１−７ｑ２２、 ヒトクローンＢＡＣ３７８（ｇｂ Ｕ８５１９６、ｇｂ ＡＥ０００６６０）、
Ｔ細胞リセプターのアルファ／デルタ 位置に相当する、１４ｑ１１−１２に位
置する、 ヒトコスミドＱ１１Ｍ１５（ｇｂ ＡＦ０４５４５０）、染色体２１の領域２
１ｑ２２．３に相当する、 コスミドＵ１３４Ｅ６（ｅｍｂｌ Ｚ８３８５０）、染色体Ｘｑ２２上。
ｑ２１−７ｑ２２、 ヒトクローンＢＡＣ３７８（ｇｂ Ｕ８５１９６、ｇｂ ＡＥ０００６６０）、
Ｔ細胞リセプターのアルファ／デルタ 位置に相当する、１４ｑ１１−１２に位
置する、 ヒトコスミドＱ１１Ｍ１５（ｇｂ ＡＦ０４５４５０）、染色体２１の領域２
１ｑ２２．３に相当する、 コスミドＵ１３４Ｅ６（ｅｍｂｌ Ｚ８３８５０）、染色体Ｘｑ２２上。
【００１５】 各クローンの整列した領域の位置が示され、それが含まれる染色体が、角型カ
ッコの間に示されている（図６［ｓｉｃ］）。４つの配列と再構築されたゲノム
ＤＮＡとの間のパーセント類似性（大きな欠失部を除く）が示され、ゲノムの各
末端での反復配列の存在と、最長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の
サイズも示される。反復配列はこれらのクローンの３の末端に見出された。再構
築配列は、クローンＲＧ０８３Ｍ０５（９．６Ｋｂ）内に完全に含まれ、９６％
類似性を示す。しかしながら、クローンＲＧ０８３Ｍ０５は、５’非翻訳領域（
５’ＵＴＲ）の直下流に２Ｋｂ挿入を有する。この挿入は、３’非翻訳領域（３
’ＵＴＲ）の直上流に２．３Ｋｂ欠失を有する他の２つのゲノムクローンにも見
出される。どのクローンも、３つの機能するｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）を含まなかった。クローンＲＧ０８３Ｍ０
５は、全エンベロープに相当する５３８アミノ酸（ＡＡ）ＯＲＦを示す。コスミ
ドＱ１１Ｍ１５は、４１３ＡＡ（フレーム０）と３０５ＡＡ（フレーム＋１）の
２つの主な近接ＯＲＦｓを含み、これは先端を欠いたｐｏｌポリタンパク質に相
当する。
ッコの間に示されている（図６［ｓｉｃ］）。４つの配列と再構築されたゲノム
ＤＮＡとの間のパーセント類似性（大きな欠失部を除く）が示され、ゲノムの各
末端での反復配列の存在と、最長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の
サイズも示される。反復配列はこれらのクローンの３の末端に見出された。再構
築配列は、クローンＲＧ０８３Ｍ０５（９．６Ｋｂ）内に完全に含まれ、９６％
類似性を示す。しかしながら、クローンＲＧ０８３Ｍ０５は、５’非翻訳領域（
５’ＵＴＲ）の直下流に２Ｋｂ挿入を有する。この挿入は、３’非翻訳領域（３
’ＵＴＲ）の直上流に２．３Ｋｂ欠失を有する他の２つのゲノムクローンにも見
出される。どのクローンも、３つの機能するｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）を含まなかった。クローンＲＧ０８３Ｍ０
５は、全エンベロープに相当する５３８アミノ酸（ＡＡ）ＯＲＦを示す。コスミ
ドＱ１１Ｍ１５は、４１３ＡＡ（フレーム０）と３０５ＡＡ（フレーム＋１）の
２つの主な近接ＯＲＦｓを含み、これは先端を欠いたｐｏｌポリタンパク質に相
当する。
【００１６】 内因性核酸断片は、現在見出され単離されており、ヒトゲノムＤＮＡに組み込
まれており、自己免疫疾患に、又は妊娠の失敗又は妊娠の病理状態に関連する内
因性レトロウィルスのｇａｇ遺伝子の少なくとも１つの部分を含むか、それから
なるものであって、この部分は少なくとも、直接又は間接に、発現産物をコード
している。もちろん、本発明は、前記断片に相補する配列も含む。
まれており、自己免疫疾患に、又は妊娠の失敗又は妊娠の病理状態に関連する内
因性レトロウィルスのｇａｇ遺伝子の少なくとも１つの部分を含むか、それから
なるものであって、この部分は少なくとも、直接又は間接に、発現産物をコード
している。もちろん、本発明は、前記断片に相補する配列も含む。
【００１７】 有利には、前記で定義される断片は、以下の特性の少なくとも１つを満たすも
のである： 前記全gag遺伝子を含む、またはそれからなる； 断片の前記部分が少なくともマトリックス及びキャプシドをコードする； 配列番号１、配列番号２、配列番号３又はこの配列のいずれか１つの相補断片
を含む又はそれからなる； ヒト染色体１，３，６，７及び１６の少なくとも１つに位置し、好ましくはヒ
ト染色体３に少なくとも位置する； 前記発現産物がメッセンジャーRNAである； 前記部分の前記発現産物が、多発性硬化症などの自己免疫疾患を患う患者から
の生物学的試料に存在する抗体により免疫的に認識される；好ましくは前記生物
学的試料が、血清、血漿、関節液、及び尿から選択される。
のである： 前記全gag遺伝子を含む、またはそれからなる； 断片の前記部分が少なくともマトリックス及びキャプシドをコードする； 配列番号１、配列番号２、配列番号３又はこの配列のいずれか１つの相補断片
を含む又はそれからなる； ヒト染色体１，３，６，７及び１６の少なくとも１つに位置し、好ましくはヒ
ト染色体３に少なくとも位置する； 前記発現産物がメッセンジャーRNAである； 前記部分の前記発現産物が、多発性硬化症などの自己免疫疾患を患う患者から
の生物学的試料に存在する抗体により免疫的に認識される；好ましくは前記生物
学的試料が、血清、血漿、関節液、及び尿から選択される。
【００１８】 本発明の別の主題は、単離された形態であり、請求項１乃至１１のいずれか１
項記載の断片のgag遺伝子の少なくとも前記部分の転写により得られる、内因性
転写産物である。
項記載の断片のgag遺伝子の少なくとも前記部分の転写により得られる、内因性
転写産物である。
【００１９】 本発明はまた、本発明の断片に属する内因性ヌクレオチド配列を検出する方法
であって、 組織又は生物学的液体からの細胞内ＤＮＡの抽出の前工程を行い、ついで細胞
内ＤＮＡの増幅を、例えばＰＣＲにより、配列番号４乃至配列番号９及び配列番
号１２乃至配列番号１７から特に選ばれるプライマーを用いて、少なくとも１サ
イクル行なうこと、 ハイブリダイゼーションに適当な条件下で、特に高ストリンジェンシーの条件
下で、試料内に存在する細胞内ＤＮＡを所定のプローブと接触させること、ここ
で、該プローブは、前記断片とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション複合
体を形成することが可能で、かつ配列番号３の、少なくとも１５、好ましくは１
７、有利には１９の連続したヌクレオチドを含むか、又は配列番号３からなるも
のである、 適当な手段でハイブリダイゼーション複合体を検出すること を含む方法にも関する。
であって、 組織又は生物学的液体からの細胞内ＤＮＡの抽出の前工程を行い、ついで細胞
内ＤＮＡの増幅を、例えばＰＣＲにより、配列番号４乃至配列番号９及び配列番
号１２乃至配列番号１７から特に選ばれるプライマーを用いて、少なくとも１サ
イクル行なうこと、 ハイブリダイゼーションに適当な条件下で、特に高ストリンジェンシーの条件
下で、試料内に存在する細胞内ＤＮＡを所定のプローブと接触させること、ここ
で、該プローブは、前記断片とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション複合
体を形成することが可能で、かつ配列番号３の、少なくとも１５、好ましくは１
７、有利には１９の連続したヌクレオチドを含むか、又は配列番号３からなるも
のである、 適当な手段でハイブリダイゼーション複合体を検出すること を含む方法にも関する。
【００２０】 有利には、前記プローブが、例えば放射性トレーサー又は酵素などのトレーサ
ーで標識されているものである。
ーで標識されているものである。
【００２１】 本発明はまた、本発明の断片に属する内因性ヌクレオチド配列の検出方法であ
って、 組織又は生物学的液体から、任意に単離された染色体からのもの、の細胞内Ｄ
ＮＡの抽出の前工程を行い、ついで細胞内ＤＮＡの増幅を、例えばＰＣＲにより
、配列番号４乃至配列番号９及び配列番号１２乃至配列番号１７から特に選ばれ
るプライマーを用いて、少なくとも１サイクル行うこと、 増幅産物のインビトロ転写／翻訳の工程を行うこと、及び 転写／翻訳工程由来の産物を、自己免疫疾患の患者からの血清又は血漿と反応
させること、 を含む方法に関する。
って、 組織又は生物学的液体から、任意に単離された染色体からのもの、の細胞内Ｄ
ＮＡの抽出の前工程を行い、ついで細胞内ＤＮＡの増幅を、例えばＰＣＲにより
、配列番号４乃至配列番号９及び配列番号１２乃至配列番号１７から特に選ばれ
るプライマーを用いて、少なくとも１サイクル行うこと、 増幅産物のインビトロ転写／翻訳の工程を行うこと、及び 転写／翻訳工程由来の産物を、自己免疫疾患の患者からの血清又は血漿と反応
させること、 を含む方法に関する。
【００２２】 本発明はまた、インビトロでＴ−細胞増殖を調べる及び／又はモニターする方
法であって、患者からのＴ細胞が、請求項１５に記載された方法で取得された転
写／翻訳産物（配列番号３１）、又は配列番号３１由来の、またはそれに含まれ
る合成ペプチドのいずれかと接触する方法にも関する。
法であって、患者からのＴ細胞が、請求項１５に記載された方法で取得された転
写／翻訳産物（配列番号３１）、又は配列番号３１由来の、またはそれに含まれ
る合成ペプチドのいずれかと接触する方法にも関する。
【００２３】 本発明の別の主題は、患者から単離された染色体のin situ分子標識の方法で
あって、配列番号３の全部又は一部を含む、いかなる適当なトレーサーで、標識
されたプローブを用いる方法である。
あって、配列番号３の全部又は一部を含む、いかなる適当なトレーサーで、標識
されたプローブを用いる方法である。
【００２４】 本発明はまた、以下のものに関する。 細菌宿主で発現カセットを用いて得られる組換えタンパク質であって、そのタ
ンパク質配列が配列番号３１からなることを特徴とするタンパク質；細菌宿主が
特に大腸菌である； 自己免疫疾患を検出するための又は妊娠をモニターするための試薬であって、
本発明の少なくとも一の断片、又は一のタンパク質を含む試薬； 生物学的試料中に、自己免疫疾患に対する感受性を検出するための、又は妊娠
をモニターするための、本発明の断片、又はタンパク質の使用；特に、前記自己
免疫疾患が多発性硬化症である。
ンパク質配列が配列番号３１からなることを特徴とするタンパク質；細菌宿主が
特に大腸菌である； 自己免疫疾患を検出するための又は妊娠をモニターするための試薬であって、
本発明の少なくとも一の断片、又は一のタンパク質を含む試薬； 生物学的試料中に、自己免疫疾患に対する感受性を検出するための、又は妊娠
をモニターするための、本発明の断片、又はタンパク質の使用；特に、前記自己
免疫疾患が多発性硬化症である。
【００２５】
本発明をより詳細に説明する前に、明細書と請求項で用いられた用語の定義を
示す。
示す。
【００２６】 「発現産物」という表現は、ヒトゲノムに組み込まれたレトロウィルスＤＮＡ
由来のいかなる産物も意味するものであり、転写産物（メッセンジャーＲＮＡ）
及び得られたメッセンジャーＲＮＡの翻訳由来の産物を含む。後者の場合、例え
ば産物は、機能性又は機能し得る、すなわち機能性となり得る、ペプチド又はタ
ンパク質でも良い。
由来のいかなる産物も意味するものであり、転写産物（メッセンジャーＲＮＡ）
及び得られたメッセンジャーＲＮＡの翻訳由来の産物を含む。後者の場合、例え
ば産物は、機能性又は機能し得る、すなわち機能性となり得る、ペプチド又はタ
ンパク質でも良い。
【００２７】 「発現産物を、直接又は間接的にコードする部分」とは、それ自身、少なくと
も、そこからアミノ酸配列を推理することができ、そのコード容量がエレメント
、例えば、プロモーター活性を持っているかもしれないもの、により、誘導され
得る、オープンリーディングフレームの全部又は一部を含む部分を意味すること
を意図するものである。この定義は、上記条件を満たす限りにおいて、コード核
酸配列に見出される変異性を含む。
も、そこからアミノ酸配列を推理することができ、そのコード容量がエレメント
、例えば、プロモーター活性を持っているかもしれないもの、により、誘導され
得る、オープンリーディングフレームの全部又は一部を含む部分を意味すること
を意図するものである。この定義は、上記条件を満たす限りにおいて、コード核
酸配列に見出される変異性を含む。
【００２８】
実施例１：サザンブロット法を用いたヒト染色体上のＨＥＲＶ−Ｗファミリーの
ｇａｇ遺伝子の位置 ＨＥＲＶ−Ｗファミリーのｇａｇ遺伝子の位置を決めるために、ＭＳＲＶから
のこの遺伝子に対応するプローブを、EcoRI制限酵素で消化した、２４体細胞ハ
イブリッド［ヒト×げっ歯類］（単離されたヒトゲノムＤＮＡ：２２常染色体及
び２性染色体）からの５μｇのＤＮＡ及び３対照ＤＮＡｓ（ヒト、マウス及びハ
ムスター）を含むナイロン膜（Hybond（登録商標）N+、Amersham）上にハイブリ
ダイズさせた。
ｇａｇ遺伝子の位置 ＨＥＲＶ−Ｗファミリーのｇａｇ遺伝子の位置を決めるために、ＭＳＲＶから
のこの遺伝子に対応するプローブを、EcoRI制限酵素で消化した、２４体細胞ハ
イブリッド［ヒト×げっ歯類］（単離されたヒトゲノムＤＮＡ：２２常染色体及
び２性染色体）からの５μｇのＤＮＡ及び３対照ＤＮＡｓ（ヒト、マウス及びハ
ムスター）を含むナイロン膜（Hybond（登録商標）N+、Amersham）上にハイブリ
ダイズさせた。
【００２９】 以下のプローブを用いる：クローンＭＳＲＶ ｇａｇ Ｃ１２のコード領域（１
０５６ｂｐ）に相当する、配列番号３により同定されたＰｇａｇ−Ｃ１２ １．１−３’領域に、プロテアーゼ遺伝子に相当するｐｏｌ遺伝子に相同な部分
、及び、ヌクレオキャプシドに相当するｇａｇ遺伝子に相同な部分、及びｇａｇ
遺伝子、より具体的にはＭＳＲＶ−１のマトリックス及びキャプシドに相当する
５’コード領域を含む、クローン２、Ｃ１２の生産
０５６ｂｐ）に相当する、配列番号３により同定されたＰｇａｇ−Ｃ１２ １．１−３’領域に、プロテアーゼ遺伝子に相当するｐｏｌ遺伝子に相同な部分
、及び、ヌクレオキャプシドに相当するｇａｇ遺伝子に相同な部分、及びｇａｇ
遺伝子、より具体的にはＭＳＲＶ−１のマトリックス及びキャプシドに相当する
５’コード領域を含む、クローン２、Ｃ１２の生産
【００３０】 ＭＳを患う患者からの１００μｌの血漿から抽出された全ＲＮＡについて、Ｐ
ＣＲ増幅を行った。同じ条件で処理した水対照を陰性対照として用いた。３００
ｐｍｏｌのランダムプライマー（Gibco-BRL、フランス）と “Expand RT”逆転
写酵素（Boehringer Mannheim、フランス）によって、会社の推薦する条件にし
たがってｃＤＮＡの合成を行った。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅を、Taqポ
リメラーゼ酵素（Perkin Elmer、フランス）によって、１０μｌのｃＤＮＡを用
いて以下の条件によって行った：９４℃２分、５５℃１分及び７２℃２分、つい
で９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分を３０サイクル、及び７２℃７分、最終
反応容量は５０μｌ。
ＣＲ増幅を行った。同じ条件で処理した水対照を陰性対照として用いた。３００
ｐｍｏｌのランダムプライマー（Gibco-BRL、フランス）と “Expand RT”逆転
写酵素（Boehringer Mannheim、フランス）によって、会社の推薦する条件にし
たがってｃＤＮＡの合成を行った。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅を、Taqポ
リメラーゼ酵素（Perkin Elmer、フランス）によって、１０μｌのｃＤＮＡを用
いて以下の条件によって行った：９４℃２分、５５℃１分及び７２℃２分、つい
で９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分を３０サイクル、及び７２℃７分、最終
反応容量は５０μｌ。
【００３１】 ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通りである： −５’プライマー、配列番号４で同定されている
【００３２】
【００３３】 −３’プライマー、配列番号５で同定されている
【００３４】
【００３５】 第２の「ネスト化」ＰＣＲ増幅を、すでに増幅した領域の内側に位置する５’
及び３’プライマーで、行った。この第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲで用いたも
のと同じ実験条件で、第１のＰＣＲ由来の増幅産物１０μｌを用いて行った。
及び３’プライマーで、行った。この第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲで用いたも
のと同じ実験条件で、第１のＰＣＲ由来の増幅産物１０μｌを用いて行った。
【００３６】 ネスト化ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通りである： −５’プライマー、配列番号６で同定されている
【００３７】
【００３８】 −３’プライマー、配列番号７で同定されている
【００３９】
【００４０】 ＭＳ患者血漿から抽出したＲＮＡから１５１１ｂｐ増副産物を得た。対応する
断片は、水対照には観察されなかった。この増副産物を、以下の方法でクローン
化した。
断片は、水対照には観察されなかった。この増副産物を、以下の方法でクローン
化した。
【００４１】 増幅されたＤＮＡを、ＴＡクローニングキット（登録商標）を用いてプラスミ
ドに挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０×ライ
ゲーションバッファー、２μｌのＰＣＲ（登録商標）ベクター（２５ｎｇ／ｍｌ
）及び１μｌのＴ４リガーゼと混合した。この混合物を一晩１４℃でインキュベ
ートした。ＴＡクローニング（登録商標）キット（Invitrogen）の指示にしたが
って、以下の工程を行った。大腸菌でのライゲーションの形質転換の後、ライゲ
ーション混合物をプレートにまいた。方法の最後に、組換え細菌の白いコロニー
を拾って、培養し、”ＤＮＡミニプレパレーション”法（J.Sambrook、E.F.Frit
sch及びT.Maniatis、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring H
arbour Laboratory Press、1989）に従って、組み込まれたプラスミドを抽出し
た。各組換えコロニーからのプラスミド調製物をEcoRI制限酵素で切断し、アガ
ロースゲルで分析した。ゲルをエチジウムブロミドで染色した後、ＵＶ光で検出
された挿入物を有するプラスミドを選択し、TAクローニングキット（登録商標）
からのクローニングプラスミドに存在するT7プロモーターと相補するプライマー
とのハイブリダイゼーションの後、挿入物を配列決定した。配列決定の前の反応
を、”Prism（登録商標）Ready Reaction Amplitaq（登録商標） FS、DyeDeoxy
（登録商標）Terminator”配列キット（Applied Biosystems ref.402119）を用
いるために推薦する方法にしたがってついで行い、自動シークエンスを、Applie
d Biosystems 373Aと377機で、製作者の指示に従って行った。
ドに挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０×ライ
ゲーションバッファー、２μｌのＰＣＲ（登録商標）ベクター（２５ｎｇ／ｍｌ
）及び１μｌのＴ４リガーゼと混合した。この混合物を一晩１４℃でインキュベ
ートした。ＴＡクローニング（登録商標）キット（Invitrogen）の指示にしたが
って、以下の工程を行った。大腸菌でのライゲーションの形質転換の後、ライゲ
ーション混合物をプレートにまいた。方法の最後に、組換え細菌の白いコロニー
を拾って、培養し、”ＤＮＡミニプレパレーション”法（J.Sambrook、E.F.Frit
sch及びT.Maniatis、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring H
arbour Laboratory Press、1989）に従って、組み込まれたプラスミドを抽出し
た。各組換えコロニーからのプラスミド調製物をEcoRI制限酵素で切断し、アガ
ロースゲルで分析した。ゲルをエチジウムブロミドで染色した後、ＵＶ光で検出
された挿入物を有するプラスミドを選択し、TAクローニングキット（登録商標）
からのクローニングプラスミドに存在するT7プロモーターと相補するプライマー
とのハイブリダイゼーションの後、挿入物を配列決定した。配列決定の前の反応
を、”Prism（登録商標）Ready Reaction Amplitaq（登録商標） FS、DyeDeoxy
（登録商標）Terminator”配列キット（Applied Biosystems ref.402119）を用
いるために推薦する方法にしたがってついで行い、自動シークエンスを、Applie
d Biosystems 373Aと377機で、製作者の指示に従って行った。
【００４２】 得られたクローンは、C12と命名され、ｇａｇ遺伝子のマトリックスとキャプ
シド領域に相当する、３５９アミノ酸（配列番号３１）をコードする１０５６ｂ
ｐ（配列番号３）のN-末端領域にオープンリーディングフレームを有する１５１
１ｂｐ領域を定義することを可能にする。
シド領域に相当する、３５９アミノ酸（配列番号３１）をコードする１０５６ｂ
ｐ（配列番号３）のN-末端領域にオープンリーディングフレームを有する１５１
１ｂｐ領域を定義することを可能にする。
【００４３】 Ｃ１２のヌクレオチド配列は配列番号１により同定される。それは可能性のあ
るアミノ酸リーディングフレームとともに図２に示される。
るアミノ酸リーディングフレームとともに図２に示される。
【００４４】 １．２ ＭＳＲＶ ｇａｇ ｃ１２プローブの生産 ＰＣＲ増幅の後、クローンの挿入物：ＭＳＲＶ ｇａｇ ｃ１２を含む、ｐＣＲ
（登録商標）ベクタープラスミド（ＴＡクローニング（登録商標）キット、Invt
rogen）を用いて、Taqポリメラーゼ酵素（Perkin Elmer、フランス）によって、
以下の条件によってプローブを得た。：９４℃１分、５５℃１分及び７２℃２分
を３５サイクル、及び７２℃７分、最終反応容量は１００μｌ。 ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通りである： −５’プライマー、配列番号１２で同定されている
（登録商標）ベクタープラスミド（ＴＡクローニング（登録商標）キット、Invt
rogen）を用いて、Taqポリメラーゼ酵素（Perkin Elmer、フランス）によって、
以下の条件によってプローブを得た。：９４℃１分、５５℃１分及び７２℃２分
を３５サイクル、及び７２℃７分、最終反応容量は１００μｌ。 ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通りである： −５’プライマー、配列番号１２で同定されている
【００４５】
【００４６】 −３’プライマー、配列番号１３で同定されている
【００４７】
【００４８】 １０５６ｂｐ増幅産物を、ＭＳＲＶ ｇａｇ ｃ１２について得た。
【００４９】 ＰＣＲ増幅の後、断片を１％アガロースゲルで分析した。ゲルをエチジウムブ
ロミドで染色した後、ＵＶ光で検出された断片を、切り出し、ランダムプライマ
ー（Gibco−BRL、フランス）を用いて、”Ready-to-go DNAラベリング”キット
（Pharmacia Biotech）の指示に従って、［α−Ｐ32］で標識した。取り込まれ
ていないヌクレオチドを、G-50 Quick Spinカラム（Boheringer、Mannheim）で
除去した。
ロミドで染色した後、ＵＶ光で検出された断片を、切り出し、ランダムプライマ
ー（Gibco−BRL、フランス）を用いて、”Ready-to-go DNAラベリング”キット
（Pharmacia Biotech）の指示に従って、［α−Ｐ32］で標識した。取り込まれ
ていないヌクレオチドを、G-50 Quick Spinカラム（Boheringer、Mannheim）で
除去した。
【００５０】 １．３−サザンブロット ハイブリダイゼーション条件は以下の通りである： ４時間のプレハイブリダイゼーション（５×ＳＳＣ、１×Denhardt’s、０．
１％ SDS、５０％ホルムアミド、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．
１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中）の後、ヒト染色体を含むナイロン膜を、１８
時間４２℃で、32Ｐ−標識化１０５６ｂｐ ｇａｇ ｃ１２ＤＮＡプローブ（配列
番号３）でハイブリダイズさせた（５×ＳＳＣ、１×Denhardt’s、０．１％ SD
S、５０％ホルムアミド、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１ｍｇ
／ｍｌニシン精子ＤＮＡ及び５％デキストランサルフェート中）。ハイブリダイ
ゼーションの後、ｇａｇプローブとハイブリダイズした膜（ Quantum Bioprobe
からのBIOS Monochromosomal Somatic Cell Hybrid blot）を、２×ＳＳＣ／０
．２％ＳＤＳ溶液中で、１５分間、室温で２回洗浄し、１５分間４５℃で（０．
２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液中で）２回洗浄した。洗浄の後、−８０℃にお
いて増幅スクリーンの存在下でＸ線フィルムに膜をさらした。
１％ SDS、５０％ホルムアミド、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．
１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中）の後、ヒト染色体を含むナイロン膜を、１８
時間４２℃で、32Ｐ−標識化１０５６ｂｐ ｇａｇ ｃ１２ＤＮＡプローブ（配列
番号３）でハイブリダイズさせた（５×ＳＳＣ、１×Denhardt’s、０．１％ SD
S、５０％ホルムアミド、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１ｍｇ
／ｍｌニシン精子ＤＮＡ及び５％デキストランサルフェート中）。ハイブリダイ
ゼーションの後、ｇａｇプローブとハイブリダイズした膜（ Quantum Bioprobe
からのBIOS Monochromosomal Somatic Cell Hybrid blot）を、２×ＳＳＣ／０
．２％ＳＤＳ溶液中で、１５分間、室温で２回洗浄し、１５分間４５℃で（０．
２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液中で）２回洗浄した。洗浄の後、−８０℃にお
いて増幅スクリーンの存在下でＸ線フィルムに膜をさらした。
【００５１】 結果を以下の表１に示す。
【００５２】 この表において： ｍはマウスを、ｈはハムスターを表し、ヒト染色体ＤＮＡのレシピエント細胞
に対応する。 各染色体において示された数は、遭遇したバンドの数に対応する。 ｇａｇ遺伝子のコピーの合計数は６６である。
に対応する。 各染色体において示された数は、遭遇したバンドの数に対応する。 ｇａｇ遺伝子のコピーの合計数は６６である。
【００５３】
【表１】
【００５４】 実施例２：単離された各ヒト染色体上のＨＥＲＶ−Ｗファミリーのｇａｇ遺伝子
のＰＣＲ増幅；サザンブロットにより増幅の特異性の確認；コード容量を確認し
、どのヒト染色体が、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーのｇａｇ遺伝子についてオープン
リーディングフレームを有しているのかを発見するためのPCR産物を用いた「in
vitro」転写／翻訳（PTT）テスト
のＰＣＲ増幅；サザンブロットにより増幅の特異性の確認；コード容量を確認し
、どのヒト染色体が、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーのｇａｇ遺伝子についてオープン
リーディングフレームを有しているのかを発見するためのPCR産物を用いた「in
vitro」転写／翻訳（PTT）テスト
【００５５】 ２．１−ＰＣＲ増幅 ＨＥＲＶ−Ｗｇａｇ遺伝子を増幅するために、ＰＣＲを、単離された各ヒト染
色体について［NIGMSヒト／げっ歯体細胞ハイブリッドパネル＃２．ヒトモノ染
色体NIGMS体ハイブリッドマッピングパネル＃２、H.L.Drwingaら、及びB.L.Dubo
isらにより記載されている、Coriell Institute（Camden,NJ）得られている］、
Taqポリメラーゼ酵素（Perkin Elmer、フランス）によって、以下のものを用い
て行った：各プライマーの４０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ（Pharmacia）２５ｍＭ、
２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、標準バッファー（ Perkin Elmer ）中のTaqポリメラー
ゼ酵素２．５Ｕ及び３００ｎｇの単離された染色体ＤＮＡ、最終反応容量は１０
０μｌ。ｇａｇ領域を増幅するためのＰＣＲ条件は、以下の通りである ：９４℃３分；ついで９４℃１分、５５℃１分及び７２℃３分を３０サイクル、
及び７２℃７分。
色体について［NIGMSヒト／げっ歯体細胞ハイブリッドパネル＃２．ヒトモノ染
色体NIGMS体ハイブリッドマッピングパネル＃２、H.L.Drwingaら、及びB.L.Dubo
isらにより記載されている、Coriell Institute（Camden,NJ）得られている］、
Taqポリメラーゼ酵素（Perkin Elmer、フランス）によって、以下のものを用い
て行った：各プライマーの４０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ（Pharmacia）２５ｍＭ、
２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、標準バッファー（ Perkin Elmer ）中のTaqポリメラー
ゼ酵素２．５Ｕ及び３００ｎｇの単離された染色体ＤＮＡ、最終反応容量は１０
０μｌ。ｇａｇ領域を増幅するためのＰＣＲ条件は、以下の通りである ：９４℃３分；ついで９４℃１分、５５℃１分及び７２℃３分を３０サイクル、
及び７２℃７分。
【００５６】 単離された各ヒト染色体上のＨＥＲＶ−Ｗｇａｇ配列に組み込まれているＡＴ
Ｇから、ｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通りである： −５’プライマー、配列番号１４で同定されている
Ｇから、ｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通りである： −５’プライマー、配列番号１４で同定されている
【００５７】
【００５８】 プライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、「スペーサー」、
Ｋｏｚａｋ配列（真核生物における翻訳開始部位）、及びＨＥＲＶ−Ｗ ＡＴＧ
から始まる５’ｇａｇ配列を含む。 −３’プライマー、配列番号１５で同定されている
Ｋｏｚａｋ配列（真核生物における翻訳開始部位）、及びＨＥＲＶ−Ｗ ＡＴＧ
から始まる５’ｇａｇ配列を含む。 −３’プライマー、配列番号１５で同定されている
【００５９】
【００６０】 プライマーはポリＡテール（ＲＮＡの転写を安定化するためのもの、１８Ｔベ
ースで示されている）、終止コドン（ＴＣＡで示されている）及びＭＳＲＶ−１
プロテアーゼ遺伝子の配列（Ｇ＋Ｅ＋Ａ）を含む。
ースで示されている）、終止コドン（ＴＣＡで示されている）及びＭＳＲＶ−１
プロテアーゼ遺伝子の配列（Ｇ＋Ｅ＋Ａ）を含む。
【００６１】 ＬＴＲで定義されたオリゴヌクレオチドを用いてＨＥＲＶ−Ｗｇａｇ遺伝子と
ＨＥＲＶ−Ｗのプロテアーゼ領域の増幅のために、Taqポリメラーゼ酵素（Perki
n Elmer、フランス）での、ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃３分；つい
で９４℃１分、６０℃１分及び７２℃２分を３５サイクル； 及び７２℃７分、
各モノ染色体ＤＮＡの５０ｎｇによる。
ＨＥＲＶ−Ｗのプロテアーゼ領域の増幅のために、Taqポリメラーゼ酵素（Perki
n Elmer、フランス）での、ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃３分；つい
で９４℃１分、６０℃１分及び７２℃２分を３５サイクル； 及び７２℃７分、
各モノ染色体ＤＮＡの５０ｎｇによる。
【００６２】 単離された各ヒト染色体上のＨＥＲＶ−Ｗ ＬＴＲ配列で定義されたオリゴヌ
クレオチドを用いたｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通り
である：
クレオチドを用いたｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下の通り
である：
【００６３】 −５’プライマー、配列番号１６で同定されている
【００６４】
【００６５】 −３’プライマー、配列番号１７で同定されている
【００６６】
【００６７】 プライマーはポリＡテール（ＲＮＡの転写を安定化するためのもの、１８Ｔベ
ースで示されている）、終止コドン（ＴＣＡで示されている）及びＭＳＲＶ−１ Ｇ＋Ｅ＋Ａプロテアーゼ遺伝子の配列を含む。
ースで示されている）、終止コドン（ＴＣＡで示されている）及びＭＳＲＶ−１ Ｇ＋Ｅ＋Ａプロテアーゼ遺伝子の配列を含む。
【００６８】 ＰＣＲ増幅をＭＪReseach PTC200 Peltier Thermal Cycler機で行った。PCR産
物（各PCR産物１０μｌ）を、１×TBE（トリス−HCl、ホウ酸、EDTA）中で１％
アガロースのゲルで分析した。増幅産物の特異性を確認するために、３μｌの各
PCR産物を、アガロースゲルで分析し、０．４N NaOHを用いてナイロン膜（ Hybo
nd（登録商標）−N+、Amersham ）（サザンブロット）に移した。ｇａｇ ｃ１２
プローブ（１０５６ｂｐ）でのハイブリダイゼーション（ J.Sambrookら、１９
８９ ）を以下の条件で行った：４時間のプレハイブリダイゼーション（５×Ｓ
ＳＣ、１×Denhardt’s、０．１％ SDS、５０％ホルムアミド、２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中）の後、ナイロ
ン膜を、１８時間４２℃で、32Ｐ−標識化 ｇａｇ プローブとハイブリダイズさ
せた（５×ＳＳＣ、１×Denhardt’s、０．１％ SDS、５０％ホルムアミド、２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ及び
５％デキストランサルフェート中）。単離された各ヒト染色体からのｇａｇＰＣ
Ｒ産物を、１回、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で、１５分間、室温で洗浄
し；２回、各々６５℃で１５分間（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で；
２回、各々６５℃で１５分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で；及び
２回、室温で３０分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄した。
物（各PCR産物１０μｌ）を、１×TBE（トリス−HCl、ホウ酸、EDTA）中で１％
アガロースのゲルで分析した。増幅産物の特異性を確認するために、３μｌの各
PCR産物を、アガロースゲルで分析し、０．４N NaOHを用いてナイロン膜（ Hybo
nd（登録商標）−N+、Amersham ）（サザンブロット）に移した。ｇａｇ ｃ１２
プローブ（１０５６ｂｐ）でのハイブリダイゼーション（ J.Sambrookら、１９
８９ ）を以下の条件で行った：４時間のプレハイブリダイゼーション（５×Ｓ
ＳＣ、１×Denhardt’s、０．１％ SDS、５０％ホルムアミド、２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中）の後、ナイロ
ン膜を、１８時間４２℃で、32Ｐ−標識化 ｇａｇ プローブとハイブリダイズさ
せた（５×ＳＳＣ、１×Denhardt’s、０．１％ SDS、５０％ホルムアミド、２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ及び
５％デキストランサルフェート中）。単離された各ヒト染色体からのｇａｇＰＣ
Ｒ産物を、１回、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で、１５分間、室温で洗浄
し；２回、各々６５℃で１５分間（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で；
２回、各々６５℃で１５分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で；及び
２回、室温で３０分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄した。
【００６９】 ＰＣＲ増幅産物の残りの容量（４μｌ）の一部を、ＰＴＴ「インビトロ」転写
／翻訳テスト（Roest PAMら、１９９３）（Promega、フランス）のために用いた
。残りの容量は、キットの指示にしたがってｐCR（登録商標）２．１−TOPOベク
ター（Invitrogen）へのクローニングのため、及び「ＰＲＩＳＭ（登録商標）Re
ady Reaction Amplitaq（登録商標）、FS,Dyedeoxy（登録商標）Terminator」シ
ーケンスキット（Applied Biosystems ref.402119）を用いるために推薦する方
法による配列決定するために用い、Applied Biosystems 373Aと377機による自動
シーケンスを、製作者の指示に従って行った。
／翻訳テスト（Roest PAMら、１９９３）（Promega、フランス）のために用いた
。残りの容量は、キットの指示にしたがってｐCR（登録商標）２．１−TOPOベク
ター（Invitrogen）へのクローニングのため、及び「ＰＲＩＳＭ（登録商標）Re
ady Reaction Amplitaq（登録商標）、FS,Dyedeoxy（登録商標）Terminator」シ
ーケンスキット（Applied Biosystems ref.402119）を用いるために推薦する方
法による配列決定するために用い、Applied Biosystems 373Aと377機による自動
シーケンスを、製作者の指示に従って行った。
【００７０】 ２００９ｂｐ断片（配列番号２）によりコードされる部分（配列番号３１）を
PCRによりPwo酵素（５U／μｌ）（Boehringer Manneim、フランス）を用いて、
１μｌのｇａｇクローンＤＮＡ（配列番号３）ミニプレパレーションを用いて、
以下の条件で増幅した：９５℃１分、６０℃１分、72℃２分を２５サイクル、最
終反応容量５０μｌ、以下のプライマーを用いる。 −５’プライマー（ＢａｍＨＩ）（配列番号８）
PCRによりPwo酵素（５U／μｌ）（Boehringer Manneim、フランス）を用いて、
１μｌのｇａｇクローンＤＮＡ（配列番号３）ミニプレパレーションを用いて、
以下の条件で増幅した：９５℃１分、６０℃１分、72℃２分を２５サイクル、最
終反応容量５０μｌ、以下のプライマーを用いる。 −５’プライマー（ＢａｍＨＩ）（配列番号８）
【００７１】
【００７２】 −３’プライマー（HindIII）、配列番号９で同定されている
【００７３】
【００７４】 PCRの後、得られた断片は、BamHIとHindIIIで直線化し、 BamHIとHindIIIで直
線化したｐET28CとｐET21C発現ベクター内にサブクローニングした。２つの発現
ベクター中の１０８９ｂｐ断片のDNAを”Prism（登録商標）Ready Reaction Amp
litaq（登録商標） FS、DyeDeoxy（登録商標）Terminator”配列キット（Applie
d Biosystems ref.402119）を用いるために推薦する方法にしたがって配列決定
し、自動シークエンスを、Applied Biosystems 373Aと377機で、製作者の指示に
従って行った。
線化したｐET28CとｐET21C発現ベクター内にサブクローニングした。２つの発現
ベクター中の１０８９ｂｐ断片のDNAを”Prism（登録商標）Ready Reaction Amp
litaq（登録商標） FS、DyeDeoxy（登録商標）Terminator”配列キット（Applie
d Biosystems ref.402119）を用いるために推薦する方法にしたがって配列決定
し、自動シークエンスを、Applied Biosystems 373Aと377機で、製作者の指示に
従って行った。
【００７５】 pET28cとpET21c発現ベクターによる、ｇａｇクローン１０８９ｂｐ断片のヌク
レオチド配列の発現は、配列番号１０と配列番号１１で、各々同定される。
レオチド配列の発現は、配列番号１０と配列番号１１で、各々同定される。
【００７６】 ２．２−「インビトロ」転写／翻訳テスト（PTT、Promega） このテストは、HERV-Wファミリーのｇａｇ遺伝子についてオープンリーディン
グフレームを有するヒト染色体をピンポイントするために行った。 １２．５μｌのＴＮＴ（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物（Promega）、１μ
ｌのTNT（登録商標）反応バッファー（Promega）、０．５μｌのTNT（登録商標
）RNAポリメラーゼ（Promega）、メチオニンを除くアミノ酸１ｍＭの混合物０．
５μｌ 、１０ｍＣｉ／μｌの35Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（A
mersham）２μｌ、４０U/μｌのRNasin（登録商標）リボヌクレアーゼインヒビ
ター０．５μｌ、各ヒト染色体からの４μｌのPCR増幅産物（１μｇ当量）、及
び４μｌの水の混合物、反応容量２５μｌ この混合物は３５℃９０分インキュベートされた。
グフレームを有するヒト染色体をピンポイントするために行った。 １２．５μｌのＴＮＴ（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物（Promega）、１μ
ｌのTNT（登録商標）反応バッファー（Promega）、０．５μｌのTNT（登録商標
）RNAポリメラーゼ（Promega）、メチオニンを除くアミノ酸１ｍＭの混合物０．
５μｌ 、１０ｍＣｉ／μｌの35Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（A
mersham）２μｌ、４０U/μｌのRNasin（登録商標）リボヌクレアーゼインヒビ
ター０．５μｌ、各ヒト染色体からの４μｌのPCR増幅産物（１μｇ当量）、及
び４μｌの水の混合物、反応容量２５μｌ この混合物は３５℃９０分インキュベートされた。
【００７７】 各ヒト染色体からＨＥＲＶ−Ｗファミリーのｇａｇ遺伝子の転写／翻訳の産物
に相当するｇａｇタンパク質は、ＰＣＲによって増幅されたものであり、硫酸ド
デシルナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥの存在下で１０％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で、増幅スクリーンの存在下で室温でゲルをＸ線フィルムにさらした
後解析された。
に相当するｇａｇタンパク質は、ＰＣＲによって増幅されたものであり、硫酸ド
デシルナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥの存在下で１０％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で、増幅スクリーンの存在下で室温でゲルをＸ線フィルムにさらした
後解析された。
【００７８】 結果は以下の表２に示す。 表２において、各染色体で示した数は、ＳＤＳの存在下のポリアクリルアミド
ゲルで可視化されたタンパク質の分子量（ｋＤａ）に対応する。
ゲルで可視化されたタンパク質の分子量（ｋＤａ）に対応する。
【００７９】
【表２】
【００８０】 実施例３：ｇａｇクローンの大腸菌における発現、ヒト血清との反応 コード領域配列番号２は大腸菌で発現され、ついでこうして発現した産物を、
ＭＳを患う患者からの血清に対して、及び健康な人からの血清に対してテストし
た。
ＭＳを患う患者からの血清に対して、及び健康な人からの血清に対してテストし
た。
【００８１】 構築物ｐＥＴ２８ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）及びｐＥＴ２１Ｃ−ｇ
ａｇクローン（１０８９ｂｐ）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株中で合成する。こ
れはｐＥＴ２８ＣベクターではＮ末端とＣ末端融合タンパク質であり、 ｐＥＴ
２１ＣベクターではＣ末端融合タンパク質であり、６つのヒスチジン残基を有し
、みかけの分子量は約４５ｋＤａであり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリル
アミドゲル電気泳動で明らかである（U.K. Laemmli, Cleavage of structural p
roteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 197
0, 227: 680-685）。
ａｇクローン（１０８９ｂｐ）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株中で合成する。こ
れはｐＥＴ２８ＣベクターではＮ末端とＣ末端融合タンパク質であり、 ｐＥＴ
２１ＣベクターではＣ末端融合タンパク質であり、６つのヒスチジン残基を有し
、みかけの分子量は約４５ｋＤａであり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリル
アミドゲル電気泳動で明らかである（U.K. Laemmli, Cleavage of structural p
roteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 197
0, 227: 680-685）。
【００８２】 抗ヒスチジンモノクローナル抗体（DIANOVA）に対するタンパク質の反応性を
ウェスタンブロット法（H. Towbinら、Electrophoretic transfer of proteins
from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some ap
plications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76; 4350-4354）を用いて調
べた。
ウェスタンブロット法（H. Towbinら、Electrophoretic transfer of proteins
from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some ap
plications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76; 4350-4354）を用いて調
べた。
【００８３】 組換えタンパク質ｐＥＴ２８Ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）及びｐＥＴ
２１Ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）を、細菌抽出液の５０μｌのライソザ
イム（１０ｍｇ／ｍｌ）の酵素消化と、超音波破砕の後、不溶分画で、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、可視化した。
２１Ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）を、細菌抽出液の５０μｌのライソザ
イム（１０ｍｇ／ｍｌ）の酵素消化と、超音波破砕の後、不溶分画で、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、可視化した。
【００８４】 組換えタンパク質ｐＥＴ２８Ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）及びｐＥＴ
２１Ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）の抗原特性を、細菌ペレットを２％Ｓ
ＤＳと５０ｍＭβ−メルカプトエタノールで可溶化した後、ウェスタンブロット
でテストした。多発性硬化症を患う患者からの血清、神経学的対照からの血清、
血液輸血センター（ＢＴＣ）対照血清、とのインキュベーションの後、免疫複合
体を、アルカリンホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ血清を用いて検
出した。 結果を以下の表３に示す。
２１Ｃ−ｇａｇクローン（１０８９ｂｐ）の抗原特性を、細菌ペレットを２％Ｓ
ＤＳと５０ｍＭβ−メルカプトエタノールで可溶化した後、ウェスタンブロット
でテストした。多発性硬化症を患う患者からの血清、神経学的対照からの血清、
血液輸血センター（ＢＴＣ）対照血清、とのインキュベーションの後、免疫複合
体を、アルカリンホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ血清を用いて検
出した。 結果を以下の表３に示す。
【００８５】
【表３】
【００８６】 これらの結果は、用いられた技術条件の下で、試験したうちの約４０％のヒト
多発性硬化症血清が組換えｇａｇタンパク質と反応することを示す。
多発性硬化症血清が組換えｇａｇタンパク質と反応することを示す。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月１７日（２００１．４．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】 得られたクローンは、C12と命名され、ｇａｇ遺伝子のマトリックスとキャプ
シド領域に相当する、３６３アミノ酸（配列番号３１）をコードする１０８９ｂ
ｐ（配列番号２の断片４３４−１５２１）のN-末端領域にオープンリーディング
フレームを有する１５１１ｂｐ領域を定義することを可能にする。
シド領域に相当する、３６３アミノ酸（配列番号３１）をコードする１０８９ｂ
ｐ（配列番号２の断片４３４−１５２１）のN-末端領域にオープンリーディング
フレームを有する１５１１ｂｐ領域を定義することを可能にする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ 33/564 33/566 33/566 33/569 Ｈ 33/569 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 CA26 CB03 DA12 DA13 DA14 FB02 FB03 FB07 4B024 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ42 QR56 QR62 QR69 QS24 QS25 QS34 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 CE14 DA13 4H045 AA10 AA30 BA10 CA01 EA50 FA74 GA22 GA30 HA05
Claims (22)
- 【請求項１】 単離された形態の、レトロウィルスタイプの内因性核酸断片
であって、前記断片は、自己免疫疾患に関連する、又は妊娠の失敗若しくは妊娠
の病理的状態に関連する内因性レトロウィルスのgag遺伝子の少なくとも一の部
分を含む又はそれからなり、前記部分は少なくとも、直接的又は間接的に、発現
産物をコードすることを特徴とする断片、又はその断片の相補配列。 - 【請求項２】 前記全gag遺伝子を含む、またはそれからなることを特徴と
する、請求項１記載の断片。 - 【請求項３】 前記部分が少なくともマトリックス及びキャプシドをコード
することを特徴とする請求項１記載の断片。 - 【請求項４】 配列番号１、配列番号２、配列番号３又はこの配列のいずれ
か１つに相補する配列を含むことを特徴とする請求項１記載の断片。 - 【請求項５】 配列番号１、配列番号２、配列番号３又はこの配列のいずれ
か１つの相補配列からなることを特徴とする請求項１記載の断片。 - 【請求項６】 ヒト染色体１，３，６，７及び１６の少なくとも１つに位置
することを特徴とする請求項１記載の断片。 - 【請求項７】 ヒト染色体３に少なくとも位置することを特徴とする請求項
６記載の断片。 - 【請求項８】 前記発現産物がメッセンジャーRNAであることを特徴とする
請求項１記載の断片。 - 【請求項９】 前記発現産物が、自己免疫疾患を患う患者からの生物学的試
料に存在する抗体により免疫的に認識されることを特徴とする請求項１記載の断
片。 - 【請求項１０】 前記生物学的試料が、血清、血漿、関節液、及び尿から選
択される生物学的液体であることを特徴とする請求項９記載の断片。 - 【請求項１１】 前記自己免疫疾患が多発性硬化症であることを特徴とする
請求項９記載の断片。 - 【請求項１２】 単離された形態であり、かつ請求項１乃至１１のいずれか
１項記載の断片のgag遺伝子の少なくとも前記部分の転写により得られるもので
ある、内因性転写産物。 - 【請求項１３】 請求項１乃至１１のいずれか１項記載の断片に属する内因
性ヌクレオチド配列を検出する方法であって、 組織又は生物学的液体からの細胞内ＤＮＡの抽出の前工程を行い、ついで細胞
内ＤＮＡの増幅を、例えばＰＣＲにより、配列番号４乃至配列番号９及び配列番
号１２乃至配列番号１７から特に選ばれるプライマーを用いて、少なくとも１サ
イクル行なうこと、 ハイブリダイゼーションに適当な条件下で、特に高ストリンジェンシーの条件
下で、試料内に存在する細胞内ＤＮＡを所定のプローブと接触させること、ここ
で、該プローブは、前記断片とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション複合
体を形成することが可能で、かつ配列番号３の、少なくとも１５、好ましくは１
７、有利には１９の連続したヌクレオチドを含むか、又は配列番号３からなるも
のである、 適当な手段でハイブリダイゼーション複合体を検出すること を特徴とする方法。 - 【請求項１４】 前記プローブが、例えば放射性トレーサー又は酵素などの
トレーサーで標識されているものであることを特徴とする請求項１３記載の方法
。 - 【請求項１５】 請求項１乃至１１のいずれか１項記載の断片に属する内因
性ヌクレオチド配列の検出方法であって、 組織又は生物学的液体から、任意に単離された染色体からのもの、の細胞内ＤＮ
Ａの抽出の前工程を行い、ついで細胞内ＤＮＡの増幅を、例えばＰＣＲにより、
配列番号４乃至配列番号９及び配列番号１２乃至配列番号１７から特に選ばれる
プライマーを用いて、少なくとも１サイクル行うこと、 増幅産物のインビトロ転写／翻訳の工程を行うこと、及び 転写／翻訳工程由来の産物を、自己免疫疾患の患者からの血清又は血漿と反応さ
せること、 を特徴とする方法。 - 【請求項１６】 インビトロでＴ−細胞増殖を調べる及び／又はモニターす
る方法であって、患者からのＴ細胞を、請求項１５に記載された方法で取得され
た転写／翻訳産物（配列番号３１）、又は配列番号３１由来の、またはそれに含
まれる合成ペプチドのいずれかと接触させる方法。 - 【請求項１７】 患者から単離された染色体のin situ分子標識の方法であ
って、配列番号３の全部又は一部を含む、適当なトレーサーで、標識されたプロ
ーブを用いる方法。 - 【請求項１８】 細菌宿主で発現カセットを用いて得られる組換えタンパク
質であって、そのタンパク質配列が配列番号３１からなることを特徴とするタン
パク質。 - 【請求項１９】 細菌宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項１８記載
のタンパク質。 - 【請求項２０】 自己免疫疾患を検出するための又は妊娠をモニターするた
めの試薬であって、請求項１乃至１１のいずれか１項記載の少なくとも一の断片
、または請求項１６，１８、及び１９記載の一のタンパク質を含む試薬。 - 【請求項２１】 生物学的試料中で、自己免疫疾患に対する感受性を検出す
るための、又は妊娠をモニターするための、請求項１乃至１１のいずれか１項記
載の断片の、又は請求項１６，１８、及び１９記載のタンパク質の使用。 - 【請求項２２】 前記自己免疫疾患が多発性硬化症であること特徴とする請
求項２１記載の使用。
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|---|---|---|---|
| FR9900888A FR2788784A1 (fr) | 1999-01-21 | 1999-01-21 | Fragment nucleique endogene associe a une maladie auto-immune, procede de marquage et reactif |
| FR99/00888 | 1999-01-21 | ||
| PCT/FR2000/000144 WO2000043521A2 (fr) | 1999-01-21 | 2000-01-21 | Fragment nucleique endogene associe a une maladie auto-immune, procede de marquage et reactif |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002534980A true JP2002534980A (ja) | 2002-10-22 |
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ID=9541271
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000594929A Pending JP2002534980A (ja) | 1999-01-21 | 2000-01-21 | 自己免疫疾患に関連する内因性核酸断片、標識方法及び試薬 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1147187B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002534980A (ja) |
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| ES (1) | ES2388913T3 (ja) |
| FR (1) | FR2788784A1 (ja) |
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| DK173091D0 (da) * | 1991-10-11 | 1991-10-11 | Schleroseforeningen The Danish | Biologisk materiale |
| FR2689520B1 (fr) * | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede et milieu de culture pour l'obtention de cellules infectees par un virus associe a la sclerose en plaques. |
| GB9310657D0 (en) * | 1993-05-24 | 1993-07-07 | Univ London | Retrovirus |
| DE674004T1 (de) * | 1994-02-04 | 1996-09-19 | Bio Merieux | MSRV1 Virus und ansteckender und/oder krankheitserregender MSRV2, die mit Multipler Sklerose verbunden sind, ihre nukleären Bestandteile und Verwendungen. |
| FR2731356B1 (fr) * | 1995-03-09 | 1997-04-30 | Bio Merieux | Virus msrv-1 et agent pathogene et/ou infectant msrv-2 associes a la polyarthrite rhumatoide |
| FR2737500B1 (fr) * | 1995-08-03 | 1997-08-29 | Bio Merieux | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| US6582703B2 (en) * | 1996-11-26 | 2003-06-24 | Bio Merieux | Isolated nucleotide sequences associated with multiple sclerosis or rheumatoid arthritis and a process of detecting |
| FR2765588A1 (fr) * | 1997-07-07 | 1999-01-08 | Bio Merieux | Materiel nucleique retroviral et fragments nucleotidiques notamment associes a la sclerose en plaques et/ou la polyarthrite rhumatoide, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| ATE346153T1 (de) * | 1997-07-07 | 2006-12-15 | Bio Merieux | Endogene retrovirale sequenzen, verwandten mit auto-immune krankheiten oder mit schwangerschaftsstörungen |
-
1999
- 1999-01-21 FR FR9900888A patent/FR2788784A1/fr not_active Withdrawn
-
2000
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