JP3851480B2 - Hivグル−プに属するレトロウイルス、mvp−2901/94、およびその変異体を検出する診断方法及びそのための試験キット並びにワクチン - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、MVP−2901/94なる名称を有し、欧州動物細胞培養収集機関(ヨ−ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャ−ズ;ECACC)において第V95012601号として寄託されているレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学的性質を有する、HIVグル−プに属する免疫不全ウイルスまたはRNAの相同性が少なくとも75%である該ウイルスの変異体を抗原・抗体反応によって検出する診断方法及びかかる診断方法に用いる試験キット並びに前記ウイルス及び/又はその変異体を抑制・阻害するワクチンにおいて、特異的抗原として前記免疫不全ウイルスの外被糖タンパク質gp41をコ−ドする表1のDNA配列又はこの配列との相同性が少なくとも75%であるDNA配列から演繹されるペプチドを特異的抗原として使用することを特徴とする、診断方法及び試験キットに係わる。
【0002】
【従来の技術】
いわゆるHIVグループに属するレトロウイルスは、ヒトに感染した場合、免疫不全即ちエイズ(AIDS;後天性免疫不全症候群)なる総称で概括される疾患症状の原因となる。
【0003】
疫学的研究の結果、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)がエイズ(後天性免疫不全症候群)症例の圧倒的大部分の発病因子であることが証明されている。1983年に一人の患者から単離され次いで特性化されたレトロウイルスは、HIV−1と命名された(Barre-Sinoussi、F. et al., Science 220, 868-871 1983) 。HIV−1の一変異株については、WO86/02383に記載されている。
【0004】
ヒト免疫不全ウイルスの第二のグループが1985年に西アフリカで確認され(Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 1986)、ヒト免疫不全ウイルスタイプ2(HIV−2)と命名された(EP−A−O239425)。HIV−2レトロウイルスはHIV−1とは明らかに相違するが、サル免疫不全ウイルス(SIV−2)に関連性がある。HIV−1と同様、HIV−2もエイズの症候を惹起する。
【0005】
最近、ANT70(J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1586-1596) およびMVP−5180/91(J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1581-1585) で表示される新らしいウイルスが報告されているが、これらはHIV−1サブタイプA−Fに分類できないものである。これらの単離株は、既知のHIV−1株とは構造上明瞭に相違するため暫定的に共にサブタイプOに分類されている(G. Meyers, Los Alamos Data Base) ものの、ゲノムヌクレオチド配列は相互に明らかに異なっている。
【0006】
高度の変異性を示しそのために異なる分離株の比較可能性が著しく錯綜することになるのが、ヒト免疫不全ウイルスの一つの特徴である。異なるHIV−1分離株を比較する場合、たとえば、ゲノムのいくつかの領域、特に外被糖タンパク質をコ−ドするenv遺伝子領域において高度の変異性が見られるのに対して他のゲノム領域は比較的によく保存されている場合がある(Benn, S. et. al., Science, 230, 949-951 1985) 。HIV−2が極めて高い多型性を示すことも報告されている(Clavel, et. al., Nature 324, 691- 6951986)。即ち、構造的にも酵素的にも必須であるタンパク質をコ−ドするgagおよびpol遺伝子諸領域が、遺伝的安定性が最も大きいのであるが、これとは対照的にenv遺伝子中のいくつかの領域及び調節タンパク質をコ−ドする遺伝子(vif,vpr,tat,rev,nef)は変異性が極めて高いのである。
【0007】
さらに、HIV−1に対する抗血清は、仮に配列相同性が低くても、HIV−2のgagおよびpol遺伝子産物とも交差反応することが証明されている。これら2種のウイルスの間でのハイブリダイゼーションも、厳密性の極めて低い条件を用いない限り、大きな意義を持つものとはならなかったという(Clavel, et. al., Nature 324, 691-695 1986) 。
【0008】
HIVグル- プに属するレトロウイルスが広く分布しかつ感染時点と病的変化の明確な症状が認められる時点との間に数年から数十年(2〜20年)もの期間が経過するため、HIVグル- プのレトロウイルスによる感染をできるだけ早期の段階でしかも特に信頼性の高い方法で確認することは、疫学的にきわめて重要である。このことは、免疫不全の幾つかの徴候を示している患者の診断において重要であるばかりでなく、給血者のスクリ−ニングにおいても殊更に重要である。HIV−1またはHIV−2型のレトロウイルスまたはこれらの成分を検出システムに使用する場合、血清によっては、血清を採取した患者に免疫不全の徴候が現われているにも関わらず、抗体も検出できないかまたは感度が極めて低い状態でしか検出できないことが今までに起きている。本発明のHIVグループのレトロウイルスを用いると、場合によってはかかる検出が可能である。
【0009】
HIVウイルスの遺伝子型の多様性は、特に診断上大きな問題となっている。HIV−1ウイルスの場合、各複製サイクル毎にゲノム当り1個のヌクレオチドが変化すると推定されている。このような遺伝的変異性があるため、HIVウイルスは、生体内選択圧力に対して異常なほど柔軟に対応することが可能でありまた生理活性物質に抵抗性を有するかまたはある程度の免疫学的防御を構築している個体を攻撃することが出来る突然変異体を生み出す能力を有するのである(Sharp et al., "Origins and diversity of human immunodeficiency viruses", AIDS 1994, vol. 8, Suppl. 1; pp. 27-42)。
【0010】
特に輸血に関連するばかりでなく臓器提供に関連した感染の蔓延を阻止するために、HIVウイルス感染を可能ならば100%の確実性で確認できなければならない。この理由によって、現在のところは幾つかの地域に分布しているだけであるが、適切な予防措置を講じなければ欧州およびアメリカ合衆国に容易に蔓延する可能性があるウイルスに起因する感染症を検出することが診断学上からも必要とされている。
【0011】
免疫不全の徴候を呈していたカメルーン出身の24歳の女性患者の末梢リンパ球から1994年に単離された、以下MVP−2901/94と称する新規のヒト免疫不全ウイルスの単離および特性について以下に記述する。地理的観点からすれば、このレトロウイルスは、HIV−1およびHIV−2ウイルスによる感染が風土病となっている西アフリカと伝播しているのがほとんどすべてHIV−1である東アフリカとの間に位置するアフリカのある地域を起源としている。従って、本発明は、MVP−2901/94と呼ばれるHIVサブタイプOグル−プの新種レトロウイルスに関する診断方法、そのために使用する試験キットに係わるのである。
【0012】
MVP−2901/94は、MT2細胞系およびジャ−カット(Jurkat)細胞系内で増殖することが出来る。ウイルス類の単離および増殖については、成書「HIV感染におけるウイルス数量化(Viral Quantitation in HIV Infection)、ジャン=マリ− アンドリュ−(Jean-Marie Andrieu)編、ジョン・リビ−・ユウロテクスト(John Libbey Eurotext)、1991年」に記載されている。該書に記載されている操作法を引用することにより本出願における開示に代える。
【0013】
本発明のMVP−2901/94とHIV−1およびHIV−2レトロウイルスとの差をよりよく理解出来るようにするため、免疫不全を惹起するレトロウイルスの構造を先ず簡単に説明する。ウイルスの中心には、RNAが円錐形のコア部の中に位置しており、該コアはp24(pはタンパク質の意)と称されるタンパク質サブユニットから組立られている。この内側コアは、タンパク質p17から構築されたタンパク質コ−ト(外側コア)ならびに糖タンパク質外被によって囲にょうされており、該糖タンパク質外被は、宿主細胞由来の脂質に加えて、膜貫通糖タンパク質gp41および外被糖タンパク質120(gp120)を含んでいる。このgp120が、次に宿主細胞のCD−4受容体に結合する。
【0014】
公知の範囲では、HIVウイルス類のRNAは単純化して記述すると、下記する遺伝子領域を有している:各端末に存在するいわゆる長い末端反復(LTR)及び次の遺伝子領域:gag、pol、envおよびnef。gag遺伝子は、とりわけ、コア蛋白質p24およびp17をコ−ドしており、pol遺伝子は逆転写酵素、プロテアーゼ、RNA分解酵素Hおよびインテグラーゼをコ−ドしておりまたenv遺伝子はウイルス外被の糖タンパク質gp41およびgp120をコードしている。nef遺伝子は、調節機能を有するタンパク質をコードしている。HIVタイプのレトロウイルスのゲノムの構成を図1に概略図として示す。
【0015】
いわゆるPCR(ポリメラ−ゼ連鎖反応)が、多様な利用可能性を持つ遺伝子操作法の一つとなっており、この方法を実施するのに必要な構成成分は購入可能である。この方法を用いれば、増幅するべき配列を有するのいくつかのDNA領域が公知であれば、DNA配列を増幅することが可能である。そこで次には簡単に言えば、増幅するべき核酸のある短い領域にアニ−ルする相補的DNA断片(オリゴヌクレオチド=プライマ−)を合成しなければならない。試験を実施するには、それらプライマ−とともに、HIV核酸ならびにポリメラ−ゼおよびヌクレオシド三燐酸類を含有する反応混合物中に導入する。重合(DNA合成)を所定時間実施し、つぎに、核酸鎖を加熱により解離させる。冷却後は、重合が再度進行する。それゆえ本発明のレトロウイルスがHIV−1またはHIV−2ウイルスである場合は、HIV−1およびHIV−2ウイルスの既知の配列の中に保存されているプライマ−を用いて核酸を増幅できるはずである。この種のいくつかのプライマ−が既に記載されている(pol3およびpol4については、Laure et al., Lancet ii, (1988) 538-54 及びsk38/39、sk68/69については Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297)。
【0016】
しかしながら、これらのプライマ−は、HIV分離株MVP−5180/91からDNAを増幅させる能力はない(J. Vir., 1994, vol. 68, no. 3, pp.1581-1585)。同様に、これらのプライマ−を使用しても、MVP−2901/94分離株からDNAを増幅させることはできなかったのであるが、このことは、当該分離株がHIV−1の共通配列から大幅に異なっているという見解を支持するものである。従って、既知の配列から誘導されかつ保存度を可能な限り高くした極めて多様な新規プライマ−を構築すること並びに反応条件を変えながらこのようなプライマ−を出来るだけ多くの組み合わせで使用することが必要であった。驚くべきことに、実施例4に記載した反応条件において、MVP−5180/91分離株の配列から誘導したプライマ−212および412の組合せを用いて、MVP−2901/94のDNAを増幅することが可能であり、かくして該分離株の配列についての最初の手掛かりを得ることができることが見出されたのである。
(配列識別番号1)
5’ 3’
212 AGT GCA GCA GGT AGC ACT ATG
(配列識別番号2)
5’ 3’
412 GTT CCA TTT TAC TGA TGT GTA
この場合におけるように、一旦HIウイルスの配列の一構成成分領域が解読さると、公知の標準的な分子生物学的方法を用いて、そのウイルスのゲノム全体をクロ−ン化し、配列決定することができる。
【0017】
1)このような配列決定は例えば、下記する方法でDNAをクロ−ン化することにより達成できる:適当な量(およそ1リットル)の培養液からウイルスを沈降させ、燐酸緩衝食塩水に再懸濁させる。次いでこれを、(20%)スクロ−スクッションを通してペレット化する。このウイルスペレットは、30mMジチオスレイト−ルと0.5%ノニデットP40中に溶かした6Mの塩化グアニジニウム溶液に懸濁させればよい。CsClを2モルの濃度まで加え、破砕されたウイルスを含有する溶液を塩化セシウムクッションに載置する。次いでこのウイルスRNAを遠心分離によってペレット化し、溶解させ、フェノ−ルで抽出し、エタノ−ルおよび塩化リチウムで沈澱させる。第一のcDNA鎖の合成は、オリゴ(dT)プライマ−を用いてかかるウイルスRNAまたはその部分上で行なう。逆転写酵素を加える目的で行う合成は市販のキットを用いて実施出来る。第二鎖の合成を行うためには、RNA/DNAハイブリッドのRNA鎖をRNA分解酵素Hで消化し、大腸菌由来DNAポリメラ−ゼIを用いて第二鎖を合成する。次に、T4DNAポリメラ−ゼを用いて平滑末端を生成させ、これらの末端を適当なリンカ−に結合させて、制限切断部位を生じさせればよい。適当な制限エンドヌクレア−ゼを用いて制限消化を行った後、アガロ−スゲルからcDNA断片を単離し、予め適当に切断しておいたベクタ−に連結させる。次いで、cDNA挿入片を含むベクタ−を用いて、受容能のある大腸菌を形質転換することができる。得られたコロニ−を次に膜に転写し、細胞溶解し、変性させ、最後にジゴキシゲニンまたはビオチンで標識した核酸とハイブリダイズさせることにより検出する。相当するcDNAを遺伝子操作によって一旦調製すると、レトロウイルスに由来する所望のDNA断片を単離することが可能である。次にこれらの断片を適当な発現ベクタ−に組み込めば、所望のタンパク質またはタンパク質断片を発現させ、診断試験に使用することが可能となる。
【0018】
2)上記方法の代替法として、免疫不全ウイルスの核酸をPCR技術を用いてクロ−ン化すればよい。このようなクロ−ン化を行うには夫々の場合に、当該配列の内の未知の領域からプライマ−を幾つか決定する必要があるのであって、かかるプライマ−は、当該配列の内の既知部分から導かれたプライマ−と組み合わせて分離株のDNAの増幅を行うこと可能ならしめるものである。
【0019】
3)既知配列のセグメントから出発してウイルスをクロ−ン化するもう一つの可能性は、ウイルスのプロウイルスゲノムDNAをクロ−ン化する方法である。このためには、感染細胞系からのゲノムDNAをまず標準的方法によって精製する。次いで宿主のゲノムに組み込まれたプロウイルスDNAは、ゲノムライブラリ−の構築してスクリ−ンした後クロ−ン化すればよい。このようなクロ−ン化を行うには、ゲノムDNAを部分的に断片化し、長さ約10−25kbの断片を含有する画分を単離し、この長さの断片を収容できるベクタ−系、たとえばコスミドまたはラムダファ−ジ中にクロ−ン化する。選択したベクタ−系を用いて、ゲノム断片の混合物を大腸菌株に導入し、形質転換させる。次いでウイルスゲノムを含有するベクタ−は、探索したウイルスのクロ−ン化DNA断片とハイブリダイゼ−ションさせて同定し、その後に単離すればよいのであるが(プラ−クスクリ−ニングまたはコロニ−スクリ−ニング)、前記DNA断片は放射能又は他の何らかの方法で標識しておくのである。かくして、かかるウイルスゲノムは、配列分析を行ない、次いで当該タンパク質を発現させるのに利用可能となるわけである。
【0020】
異なるウイルス分離株の間の類似性は、核酸またはタンパク質の配列の間の相同性の度合によって表わすことができる。例えば、相同性50%とは、配列中の100個のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置のうちの50個が相互に一致することを意味するのである。このようなタンパク質の相同性は、配列分析により求める。相同性のDNA配列も、ハイブリダイゼ−ション手法により同定することが出来る。
【0021】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、欧州動物細胞培養コレクション(ECACC)に第V95012601号として1995年1月26日に寄託され、MVP−2901/94なる名称を有するレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学的性質を有するHIVグル−プの新規な免疫不全ウイルスまたはこのウイルスの変異株について、適した診断方法とそのために使用する試験キット及びワクチンに関わるものである。
【0022】
免疫不全ウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質とは、該ウイルスの免疫学的特性化を行う上で決定的に重要である構造を意味するものと解される。かかる意味で、感染者において抗体産生を増幅させかつウイルスを異なるサブクラスおよびサブタイプに分類するのに適しているエピト−プが特に重要である。従って、この意味において重要性を持つエピト−プはとりわけ、HIV−1グル−プおよび/またはHIV−2グル−プのウイルスにも存在するエピト−プではなくむしろ本発明に係わる寄託ウイルスたるMVP−2901/94ウイルスという狭いグル−プに属するその変異株にのみ存在するエピト−プである。ウイルスの形態学的および免疫学的性質は、外被糖タンパク質の内の診断上該当する領域にも反映されている。
【0023】
本発明は、寄託されている該ウイルス及びRNAとの相同性がゲノム全体を基準として少なくとも75%であるRNA配列を有する免疫不全ウイルスにも関わるものである。
【0024】
好ましい免疫不全ウイルスは、寄託されている該ウイルスのRNAとの相同性がゲノム全体を基準として少なくとも85%、特に好ましくは少なくとも90%であるRNA配列を有する免疫不全ウイルスである。ことのほか特に好ましい免疫不全ウイルスは、寄託されている該ウイルスのRNAとの相同性がゲノム全体を基準として92%又は95%であるDNA配列を有する免疫不全ウイルスである。
【0025】
前記免疫不全ウイルスは、表1に記載したDNA配列に相補的でありかつ表1のかかる配列と相同性が少なくとも75%であるRNA配列を包含して有する。好ましい一つの実施態様においては、本発明に係わる免疫不全ウイルスは、表1のDNA配列に対して相補的でありかつ表1のかかる配列との相同性が少なくとも85%であるRNA配列を包含して有するのである。これに関して言えば、当該配列の相同部分は長さがヌクレオチドで少なくとも50個であり、好ましい実施態様においては、長さがヌクレオチドで少なくとも100個である。
【0026】
前記免疫不全ウイルスは、表1に記載した配列に相補的であるか又はこの配列と相同性がある配列または構成成分配列を有し、表1に示した配列との配列差が、診断上該当する領域を基準としてヌクレオチドレベルで高々20%でありかつタンパク質レベルで25%である。
【0027】
好ましい一つの実施態様において、表1に記載した配列との配列差が、診断上該当する領域を基準としてヌクレオチドレベルで高々10%でありかつタンパク質レベルで15%である。
【0028】
本発明はまた、欧州動物細胞培養コレクション(ECACC)において第V95012601号として寄託されている免疫不全ウイルスMVP−2901/94、即ち本発明に関わるウイルスについて、そのRNAに対して相補的であるcDNAにも関する。
【0029】
かかる好ましい実施態様においては、かかるDNAは、組換えDNAの形状である。
【0030】
本発明はまた、本発明に係わるcDNAまたは組換えDNAを用いて又はそのcDNAから演繹されるアミノ酸構造を使用することをも包含する。
【0031】
好ましい一つの実施態様においては、本発明において使用する特異的抗原は、表1に記載したアミノ酸配列またはその構成成分配列に相当するアミノ酸配列から成るポリペプチドである。
【0032】
該抗原は好ましくは、表1に記載したアミノ酸配列から選択された少なくとも10個、特に好ましくは少なくとも20個のアミノ酸から成る構成成分配列を有するペプチドである。
【0033】
特に好ましい一実施態様においては、本発明に係わる抗原は、アミノ酸配列NQQLLNLWGCKGKLICYTSVKWNまたはその内の連続した少なくとも10個のアミノ酸から成るその構成成分配列のポリペプチドである。
【0034】
本発明に係わる抗原は、組換え手段によって調製するのが好ましいが、合成法により、例えば固相合成によって該抗原を調製することも可能である。
【0035】
本発明はまた、免疫不全症惹起ウイルスを検出する診断方法に使用するための試験キットをも包含する。
【0036】
該試験キットは、ウェスタンブロット、ELISA試験または蛍光抗体検出法に依拠するものであればよい。これらの方法は、ウイルス核酸またはその特定の領域を増幅させるものであり、ウイルス特にHIVウイルスの診断に対して極めて感度が高くかつ有効であることが、最近明らかになっている。
【0037】
公知の検出法の一つとして、ポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)法がある。この変法として、HIV感染の検出を行うために競争ポリメラ−ゼ連鎖反応も使用することが出来る(例えば、AIDS (1993), 7, Suppl. 2; pp. 65-71)。
【0038】
特にHIV診断に関連して最近重要性の増している他の検出法として、NASBA(核酸配列に基づいた増幅)法がある。この方法は例えば、AIDS (1993), 7( Suppl. 2): pp. 107-110に記載されている。この方法においては、T7RNAポリメラ−ゼを用いて一本鎖RNA又は他の場合二本鎖DNAを増幅し、次いで検出を行うのである。
【0039】
HIVウイルスを検出する別の一方法は、分枝DNAを用いたシグナル増幅によって検出する方法である。これについては例えば、AIDS (1993), 7( Suppl. 2): pp. 11-14に記載されている。この方法においては、ウイルス核酸を、固相に結合させたプロ−ブにハイブリダイズさせるのである。更には、検出分子(分枝DNA構造)を前記プロ−ブとハイブリダイズさせ、次いで酵素法により検出する。
【0040】
上記諸方法に共通する一つの特徴は、検出すべきウイルスに特異的である明確に定義された核酸配列を検出法に使用していることである。これらの検出法の場合、明確に定義された短い核酸断片は、具体的にはDNA断片であるが、これらを選択して、検出法に使用するのである。
【0041】
本発明に関わる前記免疫不全ウイルス、本発明に関わるcDNAおよび特異的抗原は、免疫不全症を惹起するレトロウイルスの検出に使用出来る。
【0042】
前記特異的抗原は、前記免疫不全ウイルスを抑制・阻害するためのワクチンの製造にも利用出来るのであり、本発明はかかるワクチンをも包含する。
【0043】
本発明の範囲内において、診断のために特に関連し、該当する外被糖タンパク質の一部の配列が決定されたのである。かかる部分は、いわゆるV3ル−プの区域を包含するエンベロ−プ領域である;本発明の範囲内において配列決定された領域は、いわゆるgp41領域に及ぶものである。
【0044】
本発明の範囲内において、変異が最も高い頻度で生起する外被糖タンパク質の一部が初めて配列決定され、その結果この配列がHIVタイプの他のウイルスの対応する配列とは比較的低度の相同性しか示さなず、従って新規なレトロウイルスの亜型(sub−type)であることが確立された。デ−タベ−スを用いて行なった各HIV配列との比較により、とくにgp41領域は、ヌクレオチドレベルで、高々79.1%しか相同でないことが示され、新規のレトロウイルスであることは明らかである。
【0045】
本発明に関わるウイルスの配列は、既知ウイルスのそれとは異なっている。従って本発明は、かかるウイルス及びこれに対応するDNAとアミノ酸配列に関連するものであって、該アミノ酸配列は本発明のウイルスの配列と実質的に一致するものであるが、その偏差の程度は相同性の度合によって決まる。従って例えば、85%以上の相同性とは、100個のヌクレオチドまたはアミノ酸のうち少なくとも85個が同じヌクレオチドまたはアミノ酸であって残余は異なっていてよいとされるような配列が包含されることを意味する。相同性を確定するに際しては、二つの配列を相互に対応するヌクレオチドまたはアミノ酸が可能な限り多数相互に一致するように並列させ、比較するのである。
【0046】
単離された配列に基づいて、免疫優性エピト−プ(ペプチド)を構造作成して、合成すればよい。当該ウイルスの外被糖タンパク質gp41の核酸配列が既知となったので、当業者は、かかる配列からアミノ酸配列を演繹可能である。このアミノ酸配列を表1に示す。従って、本発明はまた、表1に記載した情報を用いて調製できる特異的抗原、即ちタンパク質、オリゴペプチドまたはポリペプチドにも関する。これらの特異的抗原、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドは、表1に示したアミノ酸配列を有する。かかる抗原またはペプチドは、第1表に図示してあるアミノ酸配列の内の比較的短い構成成分配列を有するものであってもよい。当業者にとって公知であるように、このようなアミノ酸配列は、抗原決定基としては長さが少なくとも10個のアミノ酸であれば抗体産性のためには充分であり、好ましくは少なくとも20個、特に好ましくは25個のアミノ酸である。これらのペプチドは、組換え技術を利用することに加えて合成法によっても調製すること出来る。適合した調製ル−トはメリフィ−ルドタイプの固相合成である。本方法及び現行の技術水準から公知である他の方法については、詳細な記述は、文献、例えばボダンスキ−ら(M. Bodansky et al.)、Peptide Synthesis,John Wiley & Sons, 2nd Ed., 1976においてなされている。
【0047】
診断試験においては、検査を受ける人から採取した血清試料を、MVP−2901/94に由来する一種以上の蛋白質または糖タンパク質(真核細胞系で発現可能である)の蛋白鎖またはそれらの部分を適宜の支持体に固定して接触させればよい。好ましい試験法としては、免疫蛍光検査法または酵素免疫検査法(たとえばELISAおよび免疫ブロット)が挙げられる。
【0048】
酵素免疫検査法(ELISA)においては、MVP−2901/94又はその変異体由来の抗原を例えばマイクロタイタ−プレ−トの壁面に結合させればよい。これに関連して使用する使用量は、試験システム及びマイクロタイタ−プレ−トの処理に本質的に依存して異なる。検査を受ける人に由来する血清または血清希釈液を次いでマイクロタイタ−プレ−トのウエルに加える。所定のインキュベ−ション期間が経過した後、プレ−トを洗って、特異的免疫複合体をヒト免疫グロブリンと特異的に結合する抗体で検出するのであるが、かかる抗体は、例えば西洋わさびペルオキシダ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼなどの酵素又は酵素で標識された抗原に予め結合させておく。これらの酵素は、無色の基質を高度に着色した生成物に変換させることが出来ので、特異的抗HIV抗体の存在を、その色の強度から判定することが出来る。本発明に関わるウイルスを種々の試験系に使用する上で可能性のある用途は、ウェスタンブロットに使用する用途である。
【0049】
免疫不全ウイルスに対して常に特異的であるワクチンを調製することは、変異が高頻度に生起するため極めて困難であることが証明されつつあるとはいえ、本発明に関わる新規な免疫不全ウイルスについては、レトロウイルスワクチンのタ−ゲットとなるウイルス外皮糖タンパク質の塩基配列が同定されたために免疫優性エピト−プおよび細胞性免疫誘導物質、または組換え技術により特異的抗原が調製可能となり、ワクチンの開発と製造にも充分使用することも出来るのである。
【0050】
【実施例】
実施例1(ウイルスの培養)
本発明の免疫不全ウイルスMVP−2901/94を、免疫不全の徴候を示す女性患者の血液から単離した。このような単離するために、末梢単核細胞(末梢血リンパ球、PBL)およびHIVに感染していないドナ−の血液の末梢リンパ球(PBL)を、植物凝集素で刺激し、培養させた。このためにウシ胎児血清を10%含有する慣用のRPMI1640培地を用いた。培養条件は、A.ランデイら(Landay A., et al. )、J. Inf. Dis., 161 (1990) pp. 706 - 710に記載されている。巨細胞の形成は一切認められなかった。HIウイルスの産生は、アボット社から市販されている試験キットを用いてp24抗原を測定することにより決定した。ウイルスの増殖を決定するために用いた他の試験は、粒子結合逆転写酵素を用いる試験(Everle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp.347 - 356)であった。その結果, ウイルス産生をモニタ−するために、週に1回または2回培養上澄み中の酵素活性に基づいて、ウイルスの増殖を測定した。週に1回、新しいドナ−リンパ球を加えた。
【0051】
HIウイルスの増殖が一旦確立すると、HIVに感染していない健康なドナ−の血液から得た新鮮な末梢リンパ球(PBL)を、最初の培養液の上澄み液で感染させる。この工程を繰り返し、次いでMT2またはジャ−カット(Jurkat)細胞を前記上澄み液で感染させた。このようにして、免疫不全ウイルスを永続的に生産することが可能であった。
実施例2
HIV分離株MVP−2901/94のゲノムの一区画(外被糖タンパク質gp41をコ−ドする)のDNA単離と増幅及び構造特性化
ゲノムDNAをMVP−2901/94感染血液リンパ球から標準的方法
(Current Protocols in Molecular Biology、Wiley International, 1994)を用いて単離した。
【0052】
MVP−2901/94単離株のゲノムの種々の領域の特性を知るために、gp41外被タンパク質領域からのプライマ−対を幾つ用いてPCR(ポリメラ−ゼ連鎖反応)実験を実施した。PCR(Saik et al., Science 239: 487-491, 1988) は、下記する修正を加えて実施した:
HIVに特異的なDNA領域を増幅するために、MVP−2901/94感染血液リンパ球から得たゲノムDNA5μl (200μg/ml)をピペットを用いて、100μl の反応混合物(0.25mM dNTP、1μMの各プライマ−、10mMトリス/HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.001%ゼラチン、2.5単位のTaqポリメラ−ゼ(パ−キン・エルマ−社))に加え、次の温度プログラムに従って増幅させた:1.初期変性:95℃で3分間、2.増幅:94℃で90秒間、56℃で60秒間、72℃で90秒間(30サイクル)。
【0053】
このようなPCRおよびヌクレオチド配列決定に用いたプライマ−は、バイオサ−チ(Biosearch)8750オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成したもので、かかる次の配列を有するものであった:
文献に記載されているプライマ−を用いても(pol3およびpol4についの Laure et al., Lancet ii, (1988) 538-541 及びsk38/39、sk68/69についての Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297)前記単離株を増幅することが可能でなかったので、既知配列から導かれかつ可能な限り強度に保存されている広範な種類の新規プライマ−を構築し、反応条件を変化させながら考え得る全ての組み合わせで使用した。驚くべきことに、単離株MVP−5180/91の配列から導いたプライマ−212と412との組合せにより、MVP−2901/94のDNAを増幅させることが可能となり、かくしてこの分離株の配列について最初の手掛かりが得られることが明かとなったのである。
【0054】
最初に増幅した試料の配列を決定した結果、MVP−2901/94に特異的であるプライマ−425および431を設計することが可能となった。かくして既知となった領域をさらに拡大するために、新規プライマ−を上記した基準に従って設計し、プライマ−425またはプライマ−431と組合せて使用した。次いでMVP−5180/91から誘導したプライマ−214を425と組合せて使用することにより、3’方向の拡張が達成されまた5’方向の拡張は、431/438および431/447の組合せを用いて達成したが、プライマ−438および447は、殆どのHIV−1サブタイプにおいて保存されている領域から導いたものである。
【0055】
増幅したDNAを、3%”Nusieve”アガロ−スゲル(Biozyme社製)を用いて分画し、増幅された断片を切り出し、等量の緩衝液(1xTBE(0.09M tris/瑙酸塩、0.002M EDTA、pH 8.0) )で処理した。このDNA/アガロ−ス混合物を70℃で10分間インキュベートし、その後フェノールで抽出したのち、1/10容量の3M NaAc、pH5.5および2容量のエタノールを加えて、DNAを水相から−20℃にて15分間沈澱させ、エッペンドルフ遠心分離器でペレット化した(13000rpm、4℃、10分間)。ペレット化したDNAを乾燥し、水にとり、次いでベックマン分光光度計により260nmで測光してDNA濃度を定量した後、サンガー法(F. Sanger, Proc. Natl. Acad., 74:5436, 1977) により配列を決定した。クレノウDNAポリメラ−ゼを用いて配列決定する代わりに、アプライド・バイオシステムズ社製のキット("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" 、注文番号401150)を用いて、配列決定反応を行った。このPCRに用いたプライマーの一つを夫々の場合に個々の配列分析反応におけるプライマ−として使用した(各場合とも1μM)。この配列決定反応は、アプライド・バイオシステムズ社の373ADNAシークエンサ−を用いてメーカーの指示に従って解析した。
【0056】
増幅されたDNA領域のヌクレオチド配列及びそれから演竏されるアミノ酸配列を表1に示す(配列識別番号10)。
実施例3
単離株MVP−2901/94を他のHIV単離株から識別する方法
表1に示した、今回発見されたヌクレオチド配列につき、GENEBANKデ−タベ−ス(Release 83, June 1994)及びEMBLデ−タベ−ス(Release 38March, 1994)において相同配列があるか否かを検索し、又同時にこのヌクレオチドから演竏されるタンパク質配列について、GCGコンピュ−タプログラム(Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin USA, version 7.1, March 1992)を用いてSWISSPROTタンパク質デ−タベ−ス(Release 28, February 1994)で検索した。これらのデ−タベ−スには、ヒト起源の免疫不全ウイルスおよび霊長類からの分離株について1994年7月にて既知となっているヌクレオチド配列の大半が包含されている。
【0057】
表1のヌクレオチド配列は最善の場合で、HIV−1サブタイプOの一つの分離株と79.6%の相同性を有しているのであるが、他のHIV−1サブタイプとの最善の相同性は59.6%である。表1のDNAは、HIV−2分離株との相同性がせいぜい51.6%である。
【0058】
表1のアミノ酸配列は最善の場合で、HIV−1サブタイプOの代表的な株の相応する外被タンパク質区画との相同性が2.7%であり、またHIV−1分離株HIV−1−Malとの相同性は最善の場合でも52.1%である。表1のアミノ酸配列は、HIV−2外被タンパク質(HIV−2ROD分離株)とは相同性がせいぜい37.0%である。
【0059】
表2
相同性比較の結果に基づくと、MVP−2901/94は、これまで暫定的にHIV−1サブタイプOと称されてきた2つの分離株MVP−5180/91およびANT70に極めて類似している。しかしながら、これら2つの分離株に関しては、ヌクレオチドレベルで少なくとも20.9%またタンパク質レベルで少なくとも27.3%という比較的大きい配列異常が存在している。
【0060】
本発明は従って、組換え技術によりまたは合成により調製可能でありかつ表1に記載した配列またはその構成成分配列を有するペプチドに関する。なお前記構成成分配列は、少なくとも10個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも20個また特に好ましくは少なくとも25個の連続したアミノ酸を有するものであるとする。
【0061】
本発明は従って、ウイルス、DNA配列、アミノ酸配列およびそれらの構成成分配列であって、表1に記載された配列との相同性が、診断上該当する遺伝子座を基準として少なくとも表3において%数値で表した割合だけ相違するような前記ウイルス、DNA配列、アミノ酸配列およびそれらの構成成分配列に関する。表3
遺伝子座を基準とした相同性、タンパク質配列における最大の差として表示。
【0062】
遺伝子座 差 好ましい差 特に好ましい差
ENV 25% 15% 10%
ENV領域は、表1にヌクレオチド配列としてまたアミノ酸配列として示した診断上該当する外被タンパク質領域である。
【0063】
表3において%値で示した相同性数値は、表1のタンパク質配列を他のウイルス由来の配列と比較した場合、多くとも上記した百分率に相当する配列割合のみが相違していることが許容されることを意味している。
実施例4
MVP−2901/94に関する血清学的デ−タ
本ウイルスが持つ血清学的診断法上の重要性を評価するために、2901に感染した患者に由来する血清試料を市販の種々の抗HIV−1/2スクリ−ニング試験器で検査した。
【0064】
これらの検討の結果を表4に示す。
【0065】
表4
表4から明らかなように、市販試験キットのいずれもこの試料を検出するこよはない。これとは逆に一つのアミノ酸を除いて(NQQLLの代わりにNQQRL)2901の配列に相当するペプチド(NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN)を固相抗原として使用しまたEnzygnost抗HIV−1/2試薬を液体試薬として使用する新らしいELISAを用いると、かかる試料は容易に検出される。例えばPasteur製などの市販のウェスタンブロット材は、このようなMVP−2901/94試料(図示していない)を検出することはない。従って、このようなウエスタンブロット材は、MVP−2901/94感染症に由来する資料については間違って陰性の結果を与えることは極めて可能性が高いであろう。
【0066】
表1に記載したアミノ酸配列の内で特に好ましい領域は、アミノ酸配列NQQLL・・・から開始する領域である(この領域は、表1において用いた配列・数列法に従えば、ヌクレオチド番号1010のところから概略始まる)。
【0067】
実施例4の結果から、本発明に係わるかかる開示を診断法に利用するために、アミノ酸配列に僅かな変更を幾つか加えても、相応する試験が有する診断上の関連性に有害な影響を及ぼすことはないことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】HIVタイプレトロウイルスのゲノムの構成を示す。
Claims (4)
- HIVグループに属する免疫不全ウイルスに由来するcDNAの組換え発現によって作られ得るものであり、 配列番号12(表1)に記載されたアミノ酸配
列を有する抗原。 - 配列番号12(表1)に記載されたアミノ酸配列を有するペプチド。
- 請求項1の抗原又は請求項2のペプチドを含む免疫不全ウイルスに対する抗体を検出するための試験キット。
- 請求項1の抗原又は請求項2のペプチドを用いる免疫不全ウイルスに対する抗体を検出する検出方法。
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