JPH02299587A - サル免疫不全ウイルスの遺伝子ｒｎａに相補性を示すｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、サル免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡに相補
性を示すＤＮＡに関する。更に詳細には本発明はマンド
リルから単離されるサル免疫不全ウィルスＳＩＶＭＮＤ
の遺伝子ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ及びかかるＤＮＡ
を含むプラスミドに関する。

〔従来の技術〕

後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎ
ｏｄｅｆｉ−ｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　；ＡＩ
ＤＳ）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）が引き起こ
す重篤な免疫不全症であり、現在では全世界的に広がり
つつありその治療薬の開発が望まれている。ＡＩＤＳの
病因ウィルスとして、ＲＮＡを遺伝子として持つレトロ
ウィルスであるヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１
）が最初に単離されＣＭ、＾、Ｇｒｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、＾、、Ｖｏ１．８３．ｐ、４００７（１９８６
））　、また最近においてはパスツール研究所のグルー
プによって、ＡＩＤＳのあたらしい病因ウィルスとして
西アフリカのＡＩＤＳ患者よりヒＩ・免疫不全ウィルス
２型（ＨＩＶ−２）が単離されている（Ｆ、ＣＩａｖｅ
ｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　、
Ｖｏｌ、３２４．Ｐ、６９１（１９８１）　）。

一方、ＡＩＤＳウィルスに類似するレトロウィルスがサ
ルからも単離されている。即ち、例えばベンガルザルよ
りＳＩＶ　Ｍ＾Ｃ（Ｓｉｍｉａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）が単離されており（Ｎｅｕ
＋ｍａｒｋ、Ｐ、　、Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、３２６．Ｐ、５４８　（１９８７））　、また
アフリカミドリザルよりＳＩＶＡｃＭが単離されている
（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３３３ｐｐ、６１７２〜６１
７６（１９８８）　）。

〔発明が解決しようとする課題〕 ＡＩＤＳの病因ウィルスであるＨＩＶ−１においては、
個々のウィルス間でその塩基配列が変異しており、その
多様性が見い出されている。このウィルスは場所により
あるいは経時的に変異し、遺伝的な均一性がないなめ、
このウィルスに対するワクチンの開発には多くの問題が
ある。

従ってＡＩＤＳウィルスについての遺伝子の十分な解明
が望まれている。旧ｖ−１．旧Ｖ−２についてはその一
部のウィルスについて全塩基配列が決定されている（Ｂ
、Ｒ，５ｔａｒｃｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、Ｖ
ｏｌ、４５．ｐ。

６３７（１９８６）　；　Ｍ、Ｇｕｙａｄｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）。

Ｖｏｌ　、３２６．ｐ、６６２（１９８７）　）。

しかしながら、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）につい
てはＳＩＶＡＧＭの全塩基配列が決定されているにすぎ
ない（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ　、３３３　ｐ、６１７２
−　（１９８８）　）。

本発明者らは、ＳＩＶについて研究を重ねた結果、ＳＩ
ＶＭＮＤ（７）遺伝子Ｒ，ＮＡに相補性を示すＤＮＡの
全塩基配列を決定することに成功した。そしてかかる成
功により、新たなＡＩＤＳウィルスのワクチン、診断薬
等の開発が可能となることを見出し、本発明を完成する
に至った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶＭＮＤ＞の遺
伝子ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ及びかかるＤＮＡを含
むプラスミドに関する。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明のＳＩＶＭＮＤの遺伝子ＲＮＡに相補性を示すＤ
ＮＡの単離及びクローニングは以下のようにして行なう
ことができる。

マンドリルより末梢血を採取し、フィコールを用いた遠
心法により末梢血リンパ球を調製することによってウィ
ルス感染を受けた細胞を得ることができる。この細胞を
培養後、例えばＭｏ１ｔ−４ｃｌｏｎｅ　８細胞（Ｒ，
Ｋｉｋｕｋａｕ＋ａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、
５７゜１１５９（１９８６）　）などと共に培養して更
にウィルス感染を行なう。Ｍｏ１ｔ−４ａｌｏｎｅ　８
細胞はヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）等の遺
伝子の単離にも使用されたものであり、かかる細胞にウ
ィルス感染後、染色体外ＤＮＡを単離することによって
、レトロウィルスのＲＮＡに相補性のＤＮＡにより主と
して構成される２本鎖環状ＤＮＡが得られる。

本発明のＳＩＶＭｓｏのＲＮＡに相補性を示すＤＮＡは
、その全配列中にＸｂａ　Ｉ部位を有することが本発明
者らによって明らかにされている。従って、かかる制限
酵素部位を利用することによって、本発明のＤＮＡのク
ローニングを有利に実施することができる。

Ｍｏ１ｔ−４ｃｌｏｎｅ　８細胞から染色体外ＤＮＡと
して得られた本発明のＤＮＡのクローニングは例えば以
下のようにして行なうことができる。

即ち、得られた染色体外ＤＮＡを制限酵素χｂａＩで消
化し、他方同様にＸｂａ　Ｉ部位を唯一ケ所存在する制
限酵素部位として有するλフアージベクター、例えばλ
Ｃｎｇ　Ｃなどを用いてこれをＸｂａ　Ｉで消化する。

消化後に得られる両者のＤＮＡを、通常のライゲーショ
ンバッファー中でＴ、ＤＮＡリガーゼの存在下に反応さ
せて連結する。

次いで得られる反応液を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケ
ージングを行ないファージ粒子を構成する。このファー
ジ粒子をλファージに感染性の大腸菌例えばに−１２株
ＬＥ　３９２　（＾ＴＣＣ３３５７２）などに感染させ
て、寒天培地上に培養しλファージの溶菌プラークを形
成させる。この人ファージ溶菌プラークが形成された寒
天培地上にニトロセルロース膜を密着させて、λファー
ジの１部をニトロセルロース膜に固定化し、プラークハ
イブリダイゼーション法により、目的とするｓｒｖ、Ｈ
ＤのＲＮＡに相補性を示すＤＮＡが組み込まれたファー
ジプラークを同定する。同定に用いるプローブとしては
、ＳＩＶＡＣＭ由来ｐｓＡＨ１２１のｇａｇ−ｐｏｌ遺
伝子を含む断片をそれぞれニックトランスレーションに
より３２ｐで標識したＤＮＡ断片などを使用することが
できる。

かかるプローブとハイブリダイズするファージプラーク
より、ＳＩｖＭＮＤのＲＮＡに相補性を示すＤＮＡが組
み込まれたλフアージＤＮＡが得られる。

かくして得られるＳＩＶＭＮＤのＲＮＡに相補性を示す
ＤＮＡが組み込まれたλフアージＤＮＡ　（例えばλＯ
ｎｇＣＳＩＶＭＨＯＤＮＡ）を更に形質転換可能な大腸
菌、例えば大腸菌に一１２株ＪＭ　１０９　（Ｊ、Ｍｅ
ｓｓｉＢ。

Ｇｅｎｅ　、　３３　、１０３　（１９８５）　：）に
クローニングベクターｐＵＣ１１９を用いてサブクロー
ニングを行なう。

即チ、例えばλＯｎｇ　ＣＳＩＶＭＮＤを制限酵素Ｘｂ
ａ　１で消化し、得られる断片を同様の制限酵素部位を
有するプラスミド例えばｐＵｃ１１８　（Ｊ、Ｍｅｓｓ
ｉｎＨ等、。

Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：）などに
組み込む。得られるプラスミドを用いて大腸菌を形質転
換し、アンピシリン等の抗生物質耐性をマーカーとして
形質転換体を選択し、形質転換体から通常の方法、例え
ばアルカリ抽出法により、目的とするＳＩＶＭＮＤのＲ
ＮＡに相補性を示すＤＮＡが組み込まれたプラスミドＤ
ＮＡを得ることができる。

かくして得られるプラスミドを制限酵素Ｘｂａ　Ｉで消
化することによって、本発明のＳＩＶＭＮＤのＲＮＡに
相補性を示すＤＮＡが得られる。

またこのプラスミドは、５ＩｖｌｌＩＨＤのウィルス蛋
白を発現するための発現ベクターの構築などに用いるこ
とができ、かかるプラスミドを提供することも本発明の
目的の１つである。このようなプラスミドとしては、上
記した如きｐＵｃ１１８にＳＩＶＭＮＤのＲＮＡに相補
性を示すＤＮＡが組み込まれたプラスミド（ｐＳＭＨ１
０３）以外にも、例えばｐＵｃ１１９などのｐＵＣ系ベ
クター、ｐＢＲ３２２などのｐＢＲ系ベクター等の通常
使用される大腸菌由来のプラスミドにＳＩＶＭＮＤのＲ
ＮＡに相補性を示すＤＮＡを組み込んだプラスミドなど
が挙げられる。

本発明のＤＮＡの単離及びクローニングは、上記した方
法に限定されず他の通常の方法によっても行なうことが
できる。即ち、例えばマンドリルから採取したリンパ球
を他の細胞と培養し、得られる感染細胞の染色体にイン
チブレイトされたＳ■■ＭＮｏのｃＤＮ＾より、通常の
方法に従い単離及びクローニングを行なうこともできる
。

本発明のＤＮＡが組み込まれたプラスミドｐＳＭＨ１０
３を、各種の制限酵素、すなわちＫｐｎ　Ｉ　、Ｓａｃ
　　Ｉ　。

Ｐｓｔ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　、　Ｘｈｏ　Ｉなどで切
断することによって第２図に示してＳＩＶＭＮＤのＲＮ
Ａに相補性を示すＤＮＡの制限酵素地図を作成した。

この制限酵素地図をもとにＳＩＶＭＮＤのＤＮＡの各種
制限酵素による切断フラグメントを調製し、各フラグメ
ントをプラスミドｐＵｃ１１８　、　ｐＵｃ１１９など
にサブクローニングし、得られるサブクローンを用いて
一本鎖ファージＤＮＡを調整し、Ｍ１３ジデオキシ法（
Ｆ、Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、八ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、＾、、７４．ｐ、５４６３　（１９
７７））によって各フラグメン１への塩基配列を決定し
た。かくしてＳＩＶＭＮＤのＲＮＡに相補性を示すＤＮ
Ａの全塩基配列を決定した。全塩基配列は第４図に示し
た通りである。

本発明で対象とするＤＮＡは第４図で示されるものに限
定されず、第４図に示した塩基配列と実質的に同様の作
用を示すＤＮＡ、例えば遺伝子コードの縮重に基づく第
４図に示した塩基配列の誘導体、第４図に示した塩基配
列の一部が欠失したあるいは一部が修飾された誘導体も
包含される。

第４図に示したようにＳＩＶＭＮＤのＲＮＡに相補性を
示すＤＮＡは９，２１５の塩基対（ｂｐ）からなる。そ
の遺伝子の構成は第３図に示したように、レンチウィル
スで見られる構成と同じであり、５’　ＬＴＲ−ｇａｇ
−ｐｏｆ−セントラル領域−ｅｎｖ−Ｆ（３’　ｏｒｆ
）−３’　ＬＴＲで示される構成を有している。ＳＩｖ
ＭＮＤに特徴的な点は、セントラル領域が４つのオープ
ン・リーディング・フレーム即ちｖｉｆ　、　ｔａｔ　
、　ｒｅｖ　、　ｖｐｒから成り、ＳＩＶＡｃＭ　、　
ｓｒｖ曲りなどに見られるｖｐｘ遺伝子を有していない
点であるということと、旧Ｖ−１と同じ遺伝子構成をも
っている点である。

以下これらの構成について説明する。

（ｉ）　　ＬＴＲ遺伝子 ＬＴＲ遺伝子はウィルス遺伝子の両側に存在し、ウィル
スの増殖に必須であり、また細胞の染色体ＤＮＡへのイ
ンチブレイトに重要な役割を有するものである。

Ｓ　ＩＶＭＮＤ　＋７）　Ｌ　Ｔ　Ｒ遺伝子ハロ９７ｂ
ｐがらなり、ソノ構成エレメントのＵ３．Ｒ，Ｕ５はそ
れぞれ４２２ｂｐ　、　１７５ｂｐ　、　１００ｂｐで
ある。ＬＴＲ遺伝子には、第４図に示したようにプロモ
ーター、ポリＡ付加シグナル、プライマー結合部位（Ｐ
１３Ｓ）などが存在している。

（ｉｉ）　　ｇａｇ遺伝子 ｇａｇ遺伝子は、ウィルス粒子の内部構造を構成する蛋
白質の前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子である。

ＳＩＶＭＮＤのｇａｇ遺伝子は、４５０がら１９５８ま
でのヌクレオチドに相当し、５０３個のアミノ酸をコー
ドしている。ＷｉｌｂｕｒとＬｉｐｍａｎのプログラム
（ＬＷｉｌｂｕｒとり、Ｊ、Ｌｉｐｍａｎ、Ｐ、Ｎ、＾
、Ｓ、、ＵＳＡ、８０，７２６（１９８３）　〕を用い
て、ＳＩｖＭＮＤのｇａｇ遺伝子に対応するアミノ酸配
列と他のウィルス遺伝子のそれとの相同性を調べた所、
ＨＩＶ−ＢＲＵ　［１’１ａｉｎ　Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、
、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ。

Ｖｏｌ、４０．ｐｐ、９−１７（１９８５）　）とは４
８．５％であり、ＨＩＶ−２ＲＯＤ　［Ｇｕｙａｄｅｒ
、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３２６
゜ｐｐ、６６２−６６９（１９８７）　〕とは４７．３
％であった。

ｇａｇ遺伝子によってコードされる前駆体ポリペプチド
はスプライシングを受けて３つの蛋白ｐ１７゜ｐ２４　
、　ｐ１５になる。

ｇａｇ遺伝子により、通常最も大量のウィルス蛋白が発
現されるのでかかるウィルス蛋白に基づいてウィルス抗
原を検出し易い。従ってｇａｇ遺伝子、即ちｇａｇ遺伝
子のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡは、ウィルスの感染を
診断する診断薬、あるいは治療薬の開発に有用であり、
かかるｇａｇ遺伝子のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを提
供することも本発明の目的の１つである。

ｇａｇ遺伝子のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡは、例えば
Ｘｈｏ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩなどの制限酵素によって切
り出すことができる。

（ｉｉｉ）　　ｐｏβ遺伝子 ｐｏ１遺伝子は逆転写酵素をコードする遺伝子であり、
１，７４５から４，７７４まで′のヌクレオチドに相当
し、１．０１０個のアミノ酸をコードしている。またそ
の塩基配列のうち２１３ｂｐがｇａｇ遺伝子とオーバー
ラツプしている。ＨＩＩＩ　ＢＲＵと旧Ｖ−２ＲＯＤと
のｐｏ１遺伝子に対応するアミノ酸配列の相同性は各５
３．３　、５６．３％である。

（ｉｖ）　　セントラル領域（ｖｉｆ　、　ｔａｔ　、
　ｒｅｖ　、　ｖｐｒ）は、ＳＩｖＭＮＤの遺伝子の中
心部に存在し、ｖｉｆは１７３個のアミノ酸をコードし
ており、ｖｐｒは１０５個のアミノ酸をコードしている
。

ＳＩＶＭＮＤの遺伝子のセントラル領域にはｖｐｘ遺伝
子が存在しておらす、この点が５ＩＶＩＩＩＨＤの大き
な特徴である。

（ｖ）　　ｅｎｖ遺伝子 ｅｎｖ遺伝子はウィルスの感染能を規定するウィルス粒
子の表面の糖蛋白質をコードする遺伝子であり、５７６
６から８３７８まで゛のヌクレオチドに相当し、外部糖
蛋白（ＥＧＰ）とトランスメンブレン蛋白（ＴＭＰ）と
の前駆体ポリペプチドをコードしている。ｅｎｖ逍１云
子は８，１２４から８，１２６にストップコドンを有し
ている。

ＳＩＶＭＮＤと他のＨＩＶあるいはＳＩＶとのｅｎｖ遺
伝子に対応するアミノ酸配列の相同性は２９．６−３１
．２％（ＡＧＭ　３０．１％　　ＭＡＣ２９，６％　　
ＨＩＶ　　２３１．２％ＨＩＶ−１２９，９％）テある
。

ｅｎｖ遺伝子はウィルス感染性を決める糖蛋白をコード
するものであり、従ってｅｎｖ遺伝子、即ちｅｎｖ遺伝
子のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡは、ＡＩＤＳワクチン
、診断薬などを開発するための極めて有用な手段となり
得るものである。それ故かかるＤＮＡを提供することも
本発明の大きな目的の　１つである。

ｅｎｖ遺伝子のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡは、例えば
制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、旧ｎｄＩＩ［などで消化するこ
とによってＳＩＶｍｎｏｃＩ）Ｄ　Ｎ　Ａから切り出す
ことができる。

（ｖｉ）　　Ｆ（３’　ｏｒｆ）遺伝子Ｆ遺伝子は８，
１７０のヌクレオチドからスタートしており、２１５個
のアミノ酸をコードしている。

〔発明の効果〕

以上に詳述した本発明て提供される、ｓｒｖ聞ｏの遺伝
子ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ、該ＤＮＡを含むプラス
ミド、並びにＳＩＶＭＮＤの遺伝子ＲＮＡに相補性を示
すＤＮＡの一部でそのｅｎｖ　、　ｇａｇ遺伝子にそれ
ぞれ相当するＤＮＡは、下記の如く新たなＡＩＤＳウィ
ルスの診断薬、治療薬等の開発に極めて有用なものであ
る。又、サルウィルス研究の有用性という点で、ＩＩＴ
Ｖ　、　ＳＩＶ遺伝子の核酸配列の比較よりウィルス群
の変異、進化のパターンを予測することができ、ワクチ
ン開発における重要な知見を得ることか可能であるとい
うことがあげられる。

又ＨＩ　Ｖはヂンパンジーのみにしか感染しないが、Ｓ
ＩＶとサルの系においてはウィルス種とサル種の選択に
より容易に感染、発症系を作製できる。

しかし、ヒトではできない。さらに感染から発症への機
序の解析を実験的に可能とするため、この系は、ワクチ
ル開発、治療薬開発の動物実験モデルとして利用できる
。

（１）　　ＳＩＶＭＮＤの遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
ＤＮＡの全塩基配列より、ｓｒｖＭ、Ｄが作る蛋白のア
ミノ酸配列を推定することができ、これにより診断薬、
治療薬などの開発に有用な蛋白の合成が可能となる。

（２）　　ＳＩＶＭｈｏノ遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
ＤＮＡを含むプラスミドに基づき、ＳＩＶＭＮＤのウィ
ルス蛋白を発現するための発現ベクターを構築すること
ができる。

（３）　　ｅｎｖ遺伝子のＤＮＡにより、新たなＡＩＤ
Ｓウィルスに対するワクチン、診断薬などの開発が可能
となる。同様にｇａｇ遺伝子のＤＮＡによってもワクチ
ン、診断薬などの開発が可能となる。

〔実施例〕

以下本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実ｊ１殊 １、染色体外Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍａｌ　ＤＮＡ）の抽出 マンドリルの末梢血リンパ球を、・２５μｇ／ｍｊ！濃
度になる様コンカナバリンＡを加えて、２０％胎児牛血
清、１０％粗精製インターロイキン２を含むＲＰＭ１１
６４０培地にて３日〜７日間培養し、これにＭｏ１ｔ−
４Ｃ１ｏｎｅ　８細胞を加え２４時間培養後、ハート法
〔Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、２６，３６５−３６９　（
１９６７）：）に従って、染色体外ＤＮＡを調製した。

２、染色体外ＤＮＡの制限酵素認識部位の検出クローニ
ングする際の染色体外ＤＮＡ中に存在する制限酵素の切
断部位を検出する為に、染色体外ＤＮＡをＢａｍ１ｌ　
Ｉ　、　Ｐｓｔ　　ｒ　、　Ｘｂａ　Ｉ　、　ｔｌｉｎ
ｄＩＩＩ等の酵素により切断し、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動を行った。このゲルを通常のザザーン法によ
り、ニトロセルロースフィルターに転写して、プローブ
としてＳＩｖＡｃＭ由来のｇａｇ−ｐｏβ領域を含むフ
ラグメントをニック）〜ランスレージョン法にて３２ｐ
標識したものを用いた。ハイブリダイゼーションは、３
０％ポルムアミド存在下、６　Ｘ　ＳＳＣ、５Ｘ　Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ’　Ｓ溶液、０．５％ＳＤＳによりプロー
ブをＩ　ＸＸ１０６ｃｐ／社となるように加え、４２℃
、１８時間行った。洗浄の条件は２　Ｘ　５ＳＣ１５０
℃、３０分間；０．５ＸＳＳＣ１５０℃、１５分間行っ
た。フィルターを一７０℃−晩露出させ現像した結果を
第１図に示した。この結果より染色体外ＤＮＡはＸｂａ
　Ｉにて２ケ所切断されることが示された。

３、染色体外ＤＮＡライブラリーの作成ａ、ライブラリ
ーのタイター（Ｌｉｔｅｒ）の決定染色体外Ｄ　Ｎ　Ａ
　（Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ）　２
　μｇをＤＮＡ中２ケ所切断する制限酵素Ｘｂａ　Ｉ　
（１０ｕｎｉｔ）にて、完全に切断後、フェノール抽出
及びエタノール沈殿を行った。この方法は以下のように
して行なった。即ち、反応液を等量のフェノール−クロ
ロホルム−イソアミルアルコール（５０：５０：１）で
抽出する。遠心にて上層を分取後、２等量のエタノール
を加え、−８０°Ｃ１３０分間放置する。

４℃にて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮＡ
を沈殿させた後、乾燥させる（以下この操作をエタノー
ル沈殿とする）。沈殿を１０μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．　０
．５ｍＭジチオスレイトール及び０．１ｍＭ＾ＴＰから
なる溶液（ライゲーションバッファー）に溶解し、ファ
ージベクターλＯｎｇ　Ｃ（Ｘｈａ　Ｉ切断アーム）２
μｇを加え、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（１３００ｕｎ　ｉ
　ｔ）にて、１６°Ｃ５１８時間反応した。反応液の約
１／４量（ＤＮＡ量として１μｇ）を用いて、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッケージングを行った。ｉｎ　ｖｉｔｒｏパ
ッケージングは、ストラ１ヘジーン社のインビトロパッ
ケージングキットを用い、添付のマニュアル通り行った
。この結果、５００μｐのパッケージングファージ溶液
が得られ、このうちの一部を用いてタイトレージョン（
ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を行った。Ｔｉｔｒａｔｉｏｎは
、指示菌として大腸菌に一１２株、ＬＥ　３９２を用い
た。ＬＢプレート　（バク１〜１ヘリプトン１％、酵母
エキス０．５％ＮａＣ１０，５％）に軟寒天培地（０，
７％アガロース／ＬＢ）中に１０ｍＭ　ＨｇＣｌ２を含
むＬＢ培地にて一晩培養した指示菌（１００Ｊ１１）を
加え、１０−５〜１０−２希釈したファージ溶液を加え
たものを重層し、３７℃にて一晩培養しな。出現したプ
ラーク類を数え、このライブラリーのタイター（ｔｉｔ
ｅｒ）とした。

ｂ、λファージの調製及びＤＮＡ抽出 １０＋＋＋Ｍ　Ｈｇ５Ｏ，を含むＬＢ培地１０社に指示
菌として用いた大腸菌ＬＥ　３９２の一晩培養したもの
を１／１００量接種し、０．０６００が０．２となるま
で３７℃で振とう培養した。ハイブリダイゼーションで
、ポジティブなシグナルを示す単一プラークを、パスツ
ールピペットにて突き取りこの培養液に加え、３７℃１
５時間振とうしながら培養した。得られた培養液に、ク
ロロホルム１滴（５０μｌ）加え、ポルテックスミキサ
ーにてかくはんし、３０００ｇ、１０分間、遠心し、上
清をあつめた。このうちの８ｍＮ上清に等量の５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１、ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇ５Ｏ
，溶液（以下ＴＭバッファー）、及び１ｍｇ／ｍ１濃度
のＤＮａｓｅ　３２０μｐを加え、室温に１０分間放置
しな。さらに、１．．６ｍ（ｌの５ＭＮａＣＮ溶液、１
．８ｇのＰＥＧ　−６０００（ポリエチレングリコール
６０００）を加えとかした後、水中で１５分間放置後、
１０．０００１？で１０分間スウィングローターを用い
て遠心した。

ｔ２０） 得られた沈殿を３０Ｏｎ＋ｊ２　ＴＭバッファーに懸濁
して、３００μｐのクロロホルムを加えよく混ぜ合わせ
、遠心（１００００ｒｐｍ）　Ｌで、水層を分離した。

この操作をくり返し、ポリエチレングリコールを除去し
た。

水層ニ１５ｍｆノ０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ、３
０μｆノ５　ＭＮａＣ（ｌを加え、フェノール／　（Ｔ
　Ｅ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（ｔ！、ｐ１１８．
０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ））飽和を３５０７ｄ！加えフェ
ノール抽出を行った。このフェノール抽出を２回くり返
し、さらにクロロホルム抽出を１回行った。上層を遠心
分Ｍｆ＆、２当量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿とし
て得た。

この結果約１×１０５フアージの染色体外ＤＮＡλＯｎ
ｇＣファージライブラリーを作成することができた。

４、　λＯｎｇＣＳＩＶＭＮＤのクローニングＳ　ＩＶ
ＭＮｏ　（１）　Ｄ　Ｎ　Ａを含むファージ（λＯｎｇ
　ＣＳＩＶＭＮｏ）のスクリーニングは、得られたファ
ージライブラリーよりプラークハイブリダイゼーション
法を用いて行った。一枚のプレートについて約５０００
個のファージプラークが出現する（２↑） （Ｌυ） ようにし、合計５Ｘ１０’プラークについて行った。

前記の方法にて１０枚のプレートを準備した。

得られたプレートを４°Ｃにて約１時間冷却し、ニトロ
セルロースフィルターにプラークをうつしとり、常法に
従って、プラークハイブリダイゼーションを行った。（
条件については前記した通りに行った）。プローブとし
ては５ＩｖＡｃヶ、　ｐＳ八へ２１株由来のｇａｇ−ｐ
ｏｆ領域をコードするＸｈｏ　　Ｉ　−ＢａｍＨＩの２
ｋｂフラグメントをニックトランスレーション法により
、ｐ３２ラベルしたちの１μｇ（約ｌＸｌ０’ｃｐｍ）
を用いた。ハイブリダイゼーションは、３０％ホルムア
ミド５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｔ’　ｓ中、４２℃で一晩行
い、２ＸＳＳＣで５０℃、１５分洗浄を２回行った後、
ｏ、ｉｘ　ｓ　ｓ　ｃ、５０℃、１５分間洗浄を行った
。フィルターを乾燥後、Ｋｏｄａｃｋ　Ｘ線フィルム（
ｘＲ−５）で、−８０℃、−晩感光後、現像し、ポジテ
ィブシグナルを約１０制得た。得られたポジティブシグ
ナルを示すプラークを更にシングルプラーク単離に付し
た（単一なプラークとして得られるように再度ハイブリ
ダイゼーションを行い精製した）。

５　クローン化されたＳＩＶＭ、ｏのサブクローニング 上記のことく得られたλＯｎｇＣＳＩＶヶ、、　ＤＮＡ
（３μｇ）を制限酵素Ｘｂａ　ｌにて切断後、０．７％
低融点アガロースゲル電気泳動で、約９キロベースのＸ
ｂａ　　Ｉ断片を分離し、フェノール抽出及びエタノー
ル沈殿にてフラグメントを精製した。得られたフラグメ
ントをｐＵｃ１１８（ＥｏｃＲＩで切断したもの）２０
ｍｇと混ぜ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ　、　ｐＨ７
，５、１０ｍＭＨｇＣ（！２．　０．５ｍＭ　ＤＴＴ　
、　　０．１．ｍＭ　ＡＴＰ存在下、Ｔ４−　ＤＮＡリ
ガーゼ（１３００ｕｎｉｔ）を加え、１６℃、１８時間
反応した。この反応液を用いて、大腸菌に一１２株ＪＭ
　１０９を形質転換し、ＸＧＡｒ叩−プレ＝１へ（５−
ブロモ−４−クロロ−インドリルβ−Ｄ−ガラクＩ・シ
ト（０，０４％）、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−
ヂオガラクトピラノシド、５０μｇ／ｍＶアンピシリン
を含むＬＢプレート）にて選択し、得られた形質転換細
胞から、アルカリ抽出法によりプラスミドＤＮＡを調製
した。このようにして得られた目的のプラスミドＤＮＡ
をｐｓＭＩ（１０３と名付けた。

６、　　ｐｓＭ８１０３の制限酵素地図の作成ｐＳＭＨ
１０３を用いて、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｘｂａ　Ｉ　
。

Ｋｐｎ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　、旧ｎｄＩ［［、Ｘｈｏ
　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ　、　ＰｖｕＩＩ、について制限
酵素で切断し、第２図に示す制限酵素地図を作成した。

７、　　ＳＴＶＭＮＤの塩基配列の決定ｐｓＭＩ＋１０
３のＫｐｎ　Ｉ　、　Ｓａｃ　　Ｉ　、　ＢａｍＨＩの
制限酵素切断部位を用いて、クローニングベクターｐＵ
ｃ１１８゜ｐＵｃ１１９にサブクローニングを行った。

得られたサブクローンを用い、ジデオキシ法により塩基
配列を決定した。

各サブクローンをＴＡＫＡＲΔ社製のキロシーフェンス
用デレージョンキットを用い、添付されているマニュア
ル通りの操作を行い、各種の欠損体を作成した。これに
大腸菌に一１２株ＭＶ　１１８４を形質転換しくカルシ
ウム、クロライド法）、得られた形質転換株から１本鎖
ファージＤＮＡを調整した。

１本鎖ファージＤＮＡの調整は、ＴＡＫＡＲＡ社ｐＵＣ
１１８、１１９添付のマニュアル通り行った。要約すれ
ば、形質転換株を０Ｄ６００が０．２となるまで培養し
、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７をｍｏｉ約１０で感染
させ、選択用薬剤として、カナマイシンを加え、−晩（
１８時間）培養する。培養液から菌体を沈殿させ、上清
にポリエチレングリコール６０００を加え、ファージを
遠心により沈殿させる。得られたファージ粒子をフェノ
ールにて処理し、一本鎖ＤＮＡをエタノール沈殿で得た
。これを用いてＭ１３ジデオキシ法で塩基配列を決定し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は染色体外ＤＮＡをＸｂａ　Ｉにより消化した場
合（レーン２）及び未消化の場合の電気泳動図である。 レーン２より、このＤＮＡはＸｂａ　　Ｉにより２ケ所
で切断されることが判明した。 第２図は本発明のＤＮＡの制限酵素地図である。 第３図はサル免疫不全ウィルス遺伝子の構成を示す。 第４図は、本発明のＤＮＡの全塩基配列を示す。 第１図 “８と　°擾−！シ　・旨　、ツ　・茶１　・づＴ　・
≦　　興　・腺曹　・≦　　→δミニ−δタ　≧−ご２
　≧Ｃ豪覧 ｌ＋ｃ６のＨ−Ｆ−１１−１４Ｅ−４０ω　〇−手続補
正書（方式） 平成１年９月λｇ日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　事件の表示 平成１年特許願第１１６１２９号 ２、　発明の名称 ザル免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡに相補性を示すＤ
ＮＡ ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 氏名速水正憲 名称　東亜燃料工業株式会社 ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）図面（第４図） （２）委任状 ７、　補正の内容 （１）図面（第４図）の浄書（内容に変更なし）（２）
委任状を別紙のように追究する。 ８、添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ＿Ｍ＿Ｎ＿Ｄ）の遺
   伝子ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ。 ２、全塩基配列が第４図に示される請求項１記載のＤＮ
   Ａ。 ３、ＳＩＶ＿Ｍ＿Ｎ＿Ｄの遺伝子ＲＮＡのｅｎｖ遺伝子
   に相補性を示すＤＮＡ。 ４、ＳＩＶ＿Ｍ＿Ｎ＿Ｄの遺伝子ＲＮＡのｇａｇ遺伝子
   に相補性を示すＤＮＡ。 ５、ＳＩＶ＿Ｍ＿Ｎ＿Ｄの遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
   ＤＮＡを含むプラスミド。 ６、ＳＩＶ＿Ｍ＿Ｎ＿Ｄの遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
   ＤＮＡが大腸菌由来のプラスミドに組み込まれた請求項
   ５記載のプラスミド。 ７、プラスミドがｐＳＭＨ１０３である請求項６記載の
   プラスミド。