JPH10506278A - 哺乳動物蛋白質及びウイルス蛋白質の過剰発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物細胞で通常発現する蛋白質をコードする合成遺伝子を特徴とする。該合成遺伝子は、哺乳動物の蛋白質をコードする天然の遺伝子では好ましくないか、または比較的好ましくない少なくとも１個のコドンを、同じアミノ酸をコードする好ましいコドンで置換したものである。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物蛋白質及びウイルス蛋白質の過剰発現 発明の分野 本発明は、真核生物の細胞において、真核生物及びウイルスの蛋白質を高レベ ルで発現させるための遺伝子及び方法に関する。 発明の背景 原核生物における真核生物の遺伝子産物の発現は、大腸菌（E.coli）ではあま り使われないコドンが存在することによって制約されることがある。このような 遺伝子の発現は、遺伝子の中にあるコドンを、原核生物で高度に発現する遺伝子 に多く出現するコドンで体系的に置換することによって上昇させることができる （Robinsonら、1984）。稀なコドンはリボソームの停止の原因となり、新生ポリ ペプチド鎖が完成されるのを妨げ、転写及び翻訳の連動を失わせることになると 、一般には考えられている。停止したリボソームが結合しているmRNAの3'末端側 は細胞内のリボヌクレアーゼに曝されるため、転写物の安定性が減少する。 発明の概要 本発明は、哺乳動物細胞で通常発現する蛋白質をコードする合成遺伝子であっ て、哺乳動物の蛋白質をコードする天然の遺伝子中の好ましくない、または比較 的好ましくない少なくとも１個のコドンを、同じアミノ酸をコードする好ましい コドンで置換したものを特徴とする。 好ましいコドンは、Ala（gcc）、Arg（cgc）、Asn（aac）、Asp（gac）、Cys （tgc）、Gln（cag）、Gly（ggc）、His（cac）、Ile（atc）、Leu（ctg）、Lys （aag）、Pro（ccc）、phe（ttc）、Ser（agc）、Thr（acc）、Tyr（tac）、及 びVal（gtc）である。比較的好ましくないコドンは、Gly（ggg）、Ile（att）、 Leu（ctc）、Ser（tcc）、Val（gtg）である。好ましいコドンの記載になく、比 較的好ましくないコドンの記載にもないコドンはすべて好ましくないコドンであ る。 哺乳動物細胞で通常発現する蛋白質とは、自然条件下で、哺乳動物細胞におい て発現する蛋白質を意味する。この語には、第VIII因子、第IX因子、インターロ イキン、及びその他の蛋白質など、哺乳動物のゲノム中にある遺伝子が含まれる 。また、この語には、癌遺伝子、ならびに感染後に哺乳動物細胞で発現するウイ ルス（レトロウイルスを含む）によってコードされる遺伝子など、疾病条件下の 哺乳動物細胞で発現する遺伝子も含まれる。 好ましい態様において、合成遺伝子は、同一条件下（すなわち、同一細胞型、 同一培養条件、同一発現ベクター）のインビトロの哺乳動物細胞培養系において 、該当する天然の遺伝子によって発現される哺乳動物蛋白質のレベルの少なくと も110％、150％、200％、500％、1,000％、または10,000％のレベルで、該哺乳 動物蛋白質を発現させることができる。 合成遺伝子、及びそれに対応する天然の遺伝子の発現を測定するのに適した細 胞培養系については後述する。哺乳動物細胞を用いる他の適当な発現系は、当業 者には周知であり、例えば、後記の標準的な分子生物学の参考文献に記載されて いる。合成遺伝子及び天然の遺伝子を発現させるのに適したベクターは、後述し ており、また、後記の参考文献にも記載されている。「発現」とは、蛋白質の発 現のことである。目的の蛋白質に特異的な抗体を用いて、発現を測定することが できる。このような抗体及び測定技術は、当業者に周知である。「天然の遺伝子 」とは、蛋白質を本来、コードしている遺伝子の配列を意味する。 別の好ましい態様において、天然の遺伝子におけるコドンは、10％、20％、30 ％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％以上が好ましくないコドンであ る。 好ましい態様において、蛋白質はレトロウイルスの蛋白質である。より好まし い態様において、蛋白質はレンチウイルスの蛋白質である。さらに好ましい態様 において、蛋白質はHIV蛋白質である。他の好ましい態様において、蛋白質はgag 、pol、env、gp120、またはgp160である。別の好ましい態様において、蛋白質は ヒトの蛋白質である。 本発明はまた、通常哺乳動物細胞で発現される蛋白質をコードする合成遺伝子 を調製する方法を特徴とする。この方法には、蛋白質をコードする天然の遺伝子 中の好ましくないコドンまたは比較的好ましくないコドンを同定し、好ましくな いコドン及び比較的好ましくないコドンを、置換コドンとして同じアミノ酸をコ ードする好ましいコドンに置き換えることが含まれる。 ある条件の下（例えば、制限酵素部位を導入するため）では、好ましくないコ ドンを、好ましいコドンよりもむしろ比較的好ましくないコドンで置き換える方 が望ましいこともある。 すべての比較的好ましくないコドンまたは好ましくないコドンを、好ましいコ ドンで置き換える必要はない。一部を置き換えても、発現の増加を達成すること ができる。 別の好ましい態様において、本発明は、合成遺伝子を含むベクター（発現ベク ターを含む）を特徴とする。 「ベクター」とは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または哺乳動 物もしくは昆虫のウイルスに由来するDNA分子で、その中にDNA断片を挿入ないし クローニングしうるものを意味する。ベクターには、１個またはそれ以上の、特 有の制限酵素部位が含まれ、クローン化された配列を複製できるよう、一定の宿 主ないし媒介生物の中で自律複製をする能力がある。したがって、「発現ベクタ ー」とは、蛋白質の合成を指令することができる自律的な要素を意味する。この ようなDNA発現ベクターには、哺乳動物のプラスミド及びウイルスが含まれる。 本発明は、また、蛋白質の所望の部位をコードする合成遺伝子断片を特徴とす る。このような合成遺伝子断片は、それらが蛋白質の一部のみをコードしている ことを除けば、本発明の合成遺伝子と同様である。このような遺伝子断片は、好 ましくは、蛋白質の50個、100個、150個、または500個以上の連続的なアミノ酸 をコードしている。 本発明の合成遺伝子を構築する際、CpG配列があると遺伝子が不活性状態（サ イレンシング）になる可能性があるので、これを避けることが望ましい。 HIVのgp120エンベロープ遺伝子に存在するコドンの偏りは、gag蛋白質及びpol 蛋白質にも存在する。したがって、これらの遺伝子に見られる、好ましくないコ ドン及び比較的好ましくないコドンの部分を好ましいコドンで置換することによ り、高レベルで発現できる遺伝子を作出できる。第VII因子及び第IX因子をコー ドしているヒトの遺伝子の大部分のコドンは、好ましくないコドンかまたは比較 的好ましくないコドンである。これらのコドンの一部を好ましいコドンで置換す ることにより、哺乳動物の培養細胞において高レベルの発現をすることができる 遺伝子を得られるはずである。逆に、発現を低下させるための方法としては、天 然 の遺伝子の中の好ましいコドンを比較的好ましくないコドンに置き換えることが 望ましい。 組み換えDNA技術の一般原則を開示している標準的な参考文献は、「ワトソン （Watson）,J.D.ら、遺伝子の分子生物学（Molecular Biology of the Gene）、 第１及び２巻、ベンジャミン／カミングス出版社（Benjamin/Cummings Publishi ng Company,Inc）発行、カリフォルニア州メンロパーク」、「ダーネル（Darnel l）,J.E.ら、分子細胞生物学（Moleccular Cell Biology）、サイエンティフッ クアメリカンブック社（Scientific American Books,Inc）発行、ニューヨーク 州ニューヨーク」、「オールド（Old）,R.W.ら、遺伝子操作の原理：遺伝子工学 への手引き（Principles of Gene Mnipulation:An Introduction to Genetic En gineering）、第２版、カリフォルニア大学出版（University of California Pr ess）発行、カリフォルニア州バークレイ（1981）」、「マニアティス（Maniati s）,T.ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Labora tory Mannual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spr ing Harbor Laboatory）発行、ニューヨーク州ニューヨーク（1989）」及び、「 分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、 オースベル（Ausubel）ら、ウイリー出版（Wiley Press）、ニューヨーク州ニュ ーヨーク（1989）」である。 詳細な説明 図面の説明 図１は、高レベルで発現するヒト遺伝子に見られるコドンで置換されたコドン を有する、合成gp120遺伝子（配列番号：34）及び合成gp160遺伝子（配列番号： 35）の配列を示したものである。 図２は、合成gp120（HIV-1 MN）遺伝子の概略図である。v1からv5の影を付け た部分は、超可変領域を示す。黒塗りの部分はCD4結合部位を示す。特有の制限 酵素部位の一部、すなわちH（Hind3）、Nh（Nhe1）、P（pst1）、Na（Nae1）、M （Mlu1）、R（EcoR1）、A（Age1）、及びNo（Not1）が示されている。PCRの鋳型 に用いた、化学合成されたDNA断片を、増幅のために用いられたプライマーの位 置とともに、gp120配列の下部に示す。 図３は、gp120の発現を測定するために用いられた一過性形質転換解析の結果 を示した写真である。HIV-1のIIIB株によってコードされるgp120（gp120IIIb） 、MN株によってコードされるgp120（gp120mn）、内因性リーダーペプチドを、CD 5抗原のリーダーペプチドで置換して改変した朋株によってコードされるgp120（ gp120mnCD5L）、または、ヒトCD5リーダーを有するMN変異体をコードする化学合 成遺伝子によってコードされるgp120（snygp120mn）を発現するプラスミドで形 質転換した293T細胞の培養上清を免疫沈降したものをゲル電気泳動したものであ る。標識して12時間後、形質転換して60時間後に上清を回収して、CD4:IgG1融合 蛋白質及びプロテインAセファロースで免疫沈降した。 図４は、一過性形質転換された293T細胞の上清における蛋白質のレベルを測定 するために用いられたELISA解析の結果を示すグラフである。HIV-1のIIIB株によ ってコードされるgp120（gp120IIIb）、MN株によってコードされるgp120（gp120 mn）、内因性リーダーペプチドをCD5抗原のリーダーペプチドで置換して改変し たMN株によってコードされるgp120（gp120mnCD5L）、または、ヒトCD5リーダー を有するMN変異体をコードする化学合成遺伝子によってコードされるgp120（sny gp120mn）を発現するプラスミドで形質転換した293T細胞の培養上清を４日後に 回収して、gp120/CD4 ELISAで検査した。gp120のレベルはng/mlで表されている 。 図５のパネルAは、トランス因子rev及びシス因子RREの存在下で、天然及び合 成gp120の発現を測定するために用いられた免疫沈降解析の結果を示すゲルの写 真である。この実験では、rev発現の存在下または非存在下で、（A）合成gp120M N配列及びRREシス因子、（B）HIV-1のIIIBのgp120部位、（C）HIV-1のIIIBのgp1 20部位及びRREシス因子を発現するプラスミド10μgで293T細胞をリン酸カルシウ ム共沈澱法によって一過性形質転換させた。HIV-1 HXB2プロウイルスクローンか らPCRによってクローニングしたEag1/Hpa1 RRE断片を用いて、RRE構築物gp120II IbRRE及びsyngp120mnRREを作製した。各gp120発現プラスミドは、10μgのpCMVre vプラスミドDNAまたはCDM7プラスミドDNAのいずれかと共に形質転換させた。形 質転換して60時間後に上清を回収して、CD4:IgG1融合蛋白質及びプロテインAア ガロースで免疫沈降し、7％の還元SDS-PAGEを行なった。ゲルの感光時間は、rev によるgp120IIIbrreの誘導発現が示されるまで延長した。図５のパネルBは、syn gp120mnrre をpCMVrevと同時形質転換するか、またはpCMVrevなしで形質転換した同様の実験 で、感光時間を短縮したものである。図５のパネルCは、パネルAで用いられた構 築物の概略図である。 図６は、野生型ラットのTHY-1遺伝子（wt）の配列（配列番号：37）、及び化 学的に合成され、HIV-1 env遺伝子に見られるコドンで最も優勢なコドンを有す るように構築された、ラットのTHY-1合成遺伝子（env）の配列（配列番号：36） を比較したものである。 図７は、ラットTHY-1合成遺伝子の概略図である。黒四角は、シグナルペプチ ドを示す。斜線部は、ホファチジル−イノシトール・グリカンアンカーの付着を 指令する、前駆体の配列を示す。THY-1構築物を作製するために用いた特有の制 限酵素部位を、H（Hind3）、M（Mlu1）、S（Sac1）、及びNo（Not1）と示した。 構築に用いられた合成オリゴヌクレオチドの位置を、図の下部に示してある。 図８は、フローサイトメトリー解析の結果を示したグラフである。この実験で は、293T細胞を野生型のラットTHY-1（太線）、エンベロープコドンを有するラ ットTHY-1（細線）、または、ベクターのみ（点線）のいずれかを用いて一過性 形質転換させた。293T細胞を、リン酸カルシウム共沈澱法によって、異なる発現 プラスミドで形質転換し、形質転換後３日目に、抗ラットTHY-1モノクローナル 抗体OX7と、続いてポリクローナルFITC-結合抗マウスIgG抗体で染色した。 図９のパネルAは、syngp120mn（A）、または、syngp120mn遺伝子の3'側非翻訳 領域にrTHY-1env遺伝子を有するsyngp120mn.rTHY-1env構築物（B）のいずれかを 用いて形質転換したヒト293T細胞の上清の免疫沈降解析の結果を示すゲルの写真 である。syngp120mn.rTHY-1env構築物は、rTHY-1envプラスミドの平滑末端化さ れたHind3部位にNot1アダプターを挿入して作製した。さらに、rTHY-1env遺伝子 を含む0.5 kbのNot1断片を、syngp120mnプラスミドのNot1部位にクローニングし て、正しい方向にクローニングされているかを調べた。形質転換後72時間目に、³⁵ Sで標識した細胞の上清を回収し、CD4:IgG1融合蛋白質及びプロテインAアガロ ースで免疫沈降し、7％の還元SDS-PAGEを行なった。図９のパネルＢは、この図 のパネルAに示した実験で用いた構築物の概略図である。 好ましい態様の説明 高度に発現するヒト遺伝子に見られるコドンを有する合成gp120遺伝子の構築 HIV-1の亜型LAVのエンベロープ前駆体に関するコドン頻度表を、ウィスコンシ ン大学のジェネティクス・コンピューター・グループ（Genetics Computer Grou p）によって開発されたソフトウエアを用いて作製した。この表作成の結果を、 高度に発現するヒト遺伝子の集団におけるコドン使用のパターンと対比して、表 １に示した。縮重コドンによってコードされるアミノ酸のいずれにおいても、高 度に発現する遺伝子で最も好ましいコドンと、HIVのエンベロープ前駆体で最も 好ましいコドンとは異なっている。その上、エンベロープの好ましいコドンのパ ターンは、適用されるすべての場面において、簡単な原則で説明できる。すなわ ち、好ましいコドンは、ウイルスRNAのアデニン残基の数を最大にするコドンで ある。このことは、１つの場合を除くすべての場合において、３番目の位置がA であるコドンが最も頻繁に使用されるコドンであることを意味している。例外で あるセリンでは、３種のコドンがmRNAの一つのA残基に対して同等の寄与をして おり、これら３つを合わせると、実際にエンベロープ転写物で用いられているコ ドンの85％を含むことになる。Aに対する偏向を示す特に顕著な例は、アルギニ ンのコドンの選択に見ることができ、そこではAGAトリプレットがすべてのコド ンの88％を占める。A残基が優勢である上、３番目の残基がピリミジンでなけれ ばならない縮重コドンの場合には、ウリジンに対する顕著な選択性が見られる。 最後に、より低い頻度で用いられる変異コドンの間の不一致は、ジヌクレオチド CpGの比率が少なく見えるという観察から説明することができる。すなわち、ア ラニン、プロリン、セリン、及びスレオニンに対するコドンのように、２番目の 位置がCであるときはいつも、３番目がGである可能性は低いと考えられる。また 、アルギニンに対するCGXトリプレットは、ほとんど全く使用されない。 哺乳動物細胞で高レベルで発現することができるgp120遺伝子を作出するため に、もっとも普遍的な北米亜型HIV-1 MNの配列（Shawら、1984；Galloら、1986 ）に基づいて、HIV-1のgp120部分をコードする合成遺伝子（syngp120mn）を構築 した。この合成gp120遺伝子においては、ほとんどすべての本来のコドンが、大 量に発現するヒトの遺伝子で最も高い頻度で用いられるコドンによって体系的に 置換されていた（図１）。この合成遺伝子は、化学的に合成された150から200塩 基長のオリゴヌクレオチドから組み立てたものである。120から150塩基を超える 長さのオリゴヌクレオチドを化学的に合成すると、全長の産物の比率が下がる可 能性があり、ほとんどの物質が、短いオリゴヌクレオチドから構成されることに なる。これらの短い断片は、クローニング及びPCR処理を阻害するため、一定の 長さを超えるオリゴヌクレオチドを用いることは極めて困難である。前精製なし に粗合成材料を用いるために、クローニングする前に、一本鎖オリゴヌクレオチ ドプールをPCR増幅した。PCR産物をアガロースゲルで精製し、次のPCR処理のた めの鋳型に用いた。重複する配列が、隣接する２つの断片のいずれかの末端にあ るため、両方の断片を同時に増幅することができた。これらの断片は350から400 bpの大きさであったが、これらを、CD5表面分子のリーダー配列と、その後ろにN he1/Pst1/Mlul/EcoR1/BamH1ポリリンカーを含む、pCDM由来のプラスミドにサブ クローニングした。このポリリンカーの各制限酵素部位は、PCRによって作製さ れた断片の5'側または3'側のいずれかの末端にある。そして、４個の長い各断片 を連続してサブクローニングすることにより全長gp120遺伝子を組み立てた。組 立てを行う前に、断片３から断片６の異なる各クローンをサブクローニングして 配列を決定した。合成gp120を構築するために用いられた方法の概略図を図２に 示す。合成gp120造伝子（及び、同じ方法によって作出した合成gp160）の配列を 図１に示す。 変異率はかなり高かった。もっともよく見られる変異は、短い（１ヌクレオチ ド）欠失及び長い（30ヌクレオチドまで）欠失であった。いくつかの場合におい ては、特定の領域について、合成アダプターか、または変異を含まない他のサブ クローンの断片で部分交換する必要があった。さまざまな部分の置換を容易にす るため、作出された遺伝子に制限酵素部位を導入できるよう、最適なコドン使用 を厳守することからは幾分外れた（図２）。これらの特有の制限酵素部位を約10 0塩基間隔で遺伝子に導入した。分泌を促すために、天然のHIVのリーダー配列を 、ヒトのCD5抗原の高効率のリーダーペプチドと交換した。構築に用いられたプ ラスミドは、ヒトCMVの強力な前初期プロモーターの制御を受けて、挿入遺伝子 を転写する哺乳動物用発現ベクターpCDM7の誘導体である。 野生型及び合成gp120をコードする配列を比較するために、合成gp120をコード する配列を哺乳動物用発現ベクターに挿入して、一過性形質転換解析で調べた。 異なるウイルス株の間における発現レベルの変異、及び異なるリーダー配列によ って誘導される人工産物を除外するために、いくつかの異なる天然gp120遺伝子 を対照として用いた。Sal1/Xho1 HIV-1 HXB2エンベロープの断片を鋳型として用 いたPCRによって、対照として用いるgp120 HIV IIIb構築物を作製した。PCRによ って誘発される突然変異体を除くために、遺伝子の約1.2 kbを含むKpn1/Ear1断 片を、プロウイルスのクローンのそれぞれの配列と交換した。対照として用いた 野生型gp120mn構築物を、HIV-1 MNに感染したC8166細胞（AIDS貯蔵機関（AIDS R epository）、メリーランド州ロックビル）からPCRによってクローニングし、天 然のエンベロープまたはCD5リーダー配列のいずれかとともにgp120を発現させた 。この場合、プロウイルスのクローンを利用することができなかったため、PCR による人工産物を回避するために、各構築物ごとに２個のクローンを調べた。分 泌gp120の量を半定量的に測定するために、リン酸カルシウム共沈澱法によって 一過性形質転換された293T細胞の上清を、可溶性CD4：免疫グロブリン融合蛋白 質及びプロテインAセファロースと共に免疫沈降した。 この解析結果（図３）により、合成遺伝子産物が、対照の天然gp120遺伝子産 物に比べて非常に高いレベルで発現されることが分かる。合成gp120遺伝子の分 子量は対照の蛋白質に匹敵し（図３）、100 kdから110 kdの範囲にあると考えら れる 。僅かに速く泳動されるのは、293Tのような腫瘍細胞系によっては、グリコシル 化が完全でないか、またはある程度変化するという事実によって説明することが できる。 より正確に発現を比較するために、固定相にCD4を用いたgp120 ELISAを用いて gp120蛋白質のレベルを定量した。この解析により、合成gp120遺伝子ではgp120 がおよそ125 ng/mlの濃度であり、また、天然のgp120遺伝子ではすべてバックグ ラウンドのカットオフ値（5 ng/ml）より低い濃度となり、ELISAのデータが免疫 沈降のデータと一致することが示される（図４）。このことから、合成gp120遺 伝子の発現は、野生型gp120遺伝子よりも少なくとも１桁高いと考えられる。図 に示されている実験では、少なくとも25倍増加していた。gp120 発現におけるrevの役割 revは、ウイルスの転写物の発現におけるいくつかの段階においてその効果を 発揮すると考えられているが、合成gp120遺伝子での発現の改善において非翻訳 的な役割を果たしている可能性が調べられた。まず、ヌクレオチド配列を変える ことによって、mRNAの分解の促進または核への滞留をもたらすような負のシグナ ル要素が除去されたという可能性を排除するために、細胞質のmRNAのレベルを調 べた。一過性形質転換された293T細胞をNP40溶解し、その後、遠心分離によって 核を除去することにより細胞質RNAを調製した。さらに、フェノール抽出及び沈 澱を何回も繰り返して、溶解物から細胞質RNAを調製し、スロットブロット装置 を用いてニトロセルロース上に移し、最後に、エンベロープ特異的なプローブと ハイブリダイズさせた。 要約すると、CDM、gp120 IIIB、またはsyngp120で形質転換した293細胞の細胞 質mRNAを、形質転換後36時間目に分離した。野生型ワクシニアウイルス、または 、gp120 IIIbを発現する組換えウイルス、または、7.5プロモーターの制御下に ある合成gp120遺伝子を発現する組換えウイルスを感染させたヒーラ（HeLa）細 胞の細胞質RNAを感染後16時間目に分離した。スロットブロット装置を用いて、 等量をニトロセルロースに配置し、ランダム標識した1.5 kbのgp120IIIb及びsyn gp120断片またはヒトのベーターアクチンとハイブリダイズさせた。ハイブリダ イズさせた膜をホスフォイメージャーでスキャンして、RNAの発現レベルを定量 した。この 実験で用いた方法については、後に詳述する。 この実験によって、天然のgp120遺伝子で形質転換した細胞も、合成gp120遺伝 子で形質転換した細胞も、mRNAのレベルに有意な差はないことが明らかになった 。実際、いくつかの実験において、合成gp120遺伝子の細胞質mRNAのレベルは、 天然のgp120遺伝子のmRNAレベルよりも低いことさえあった。 これらのデータは、組換えワクシニアウイルスからの発現を測定することによ って確認された。ヒト293細胞またはヒーラ細胞に、野生型gp120 IIIbまたはsyn gp120mnを発現するワクシニアウイルスを、感染多重度10以上で感染させた。感 染後24時間で上清を回収し、CD4:免疫グロブリン融合蛋白質及びプロテインAセ ファロースを用いて免疫沈降した。この実験で用いた方法については、後に詳述 する。 この実験から、強力な混合された初期及び後期の7.5kプロモーターの制御下で ワクシニアウイルスの組換え体から、内因性遺伝子産物及び合成遺伝子産物が発 現されるときにも、合成遺伝子の発現増加が依然として観察されることが明らか になった。ワクシニアウイルスのmRNAは、細胞質で転写され、翻訳されるため、 本実験の合成エンベロープ遺伝子の発現増加は、核からの移行が促進されるのが 原因ではありえない。さらに、腎臓癌細胞系293及びヒーラ細胞の２つのヒトの 細胞型で本実験を反復した。形質転換した293T細胞の場合と同様に、どちらの組 換えワクシニアウイルスを感染させても、293細胞におけるmRNAのレベルは類似 していた。レンチウイルスにおけるコドン使用 コドン使用は哺乳動物細胞における発現に重要な影響を与えると考えられるた め、他のレトロウイルスのエンベロープ遺伝子におけるコドン頻度を調べた。こ の実験から一般に、レトロウイルスの間に、コドンの選択性の明確なパターンは 見られなかった。しかし、HIV-1が属するレンチウイルス属のウイルスだけを別 個に分析したところ、HIV-1のコドン使用の偏りとほとんど同じ偏りが見られた 。レンチウイルスを除く、さまざまなレトロウイルス（主にC型）のエンベロー プの糖蛋白質のコドン頻度表を作成し、HIV-1とは密接には関係しない４種のレ ンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルス（caprine arthritis encephalitis vir us）、ウ マ伝染性貧血ウイルス（equine infectious anemia virus）、ネコ免疫不全ウイ ルス（feline immunodeficiency virus）及びビスナウイルス（visna virus）） のエンベロープの配列から作成したコドン頻度表と比較した（表２）。レンチウ イルスのコドン使用パターンは、一つを除くすべての場合において、HIV-1のパ ターンと非常によく似ており、HIV-1にとって好ましいコドンは、他のレンチウ イルスにとって好ましいコドンと同じであった。例外はプロリンで、HIV-1以外 のレンチウイルスのエンベロープの残基は、41％がCCTによってコードされ、40 ％はCCAによってコードされており、この状況も、明らかにAで終わるトリプレッ トに対する有意な選択性を反映している。レンチウイルス以外のレトロウイルス のエンベロープ蛋白質によるコドン使用パターンは、同じようなA残基の優勢を 示さず、また、高度に発現されるヒトの遺伝子のコドン使用のように、３番目の 位置におけるC及びG残基に対する偏りもない。一般的に、レンチウイルス以外の レトロウイルスは、あまり高度には発現しないヒトの遺伝子と共通するパターン をもち、異なるコドンをもっと平等に利用するようである。 レンチウイルスのコドンは、Aを含むコドンが優勢なのに加えて、CpGが非常に 現れにくいというHIVのパターンを厳しく守っているため、アラニン、プロリン 、セリン及びスレオニンのトリプレットの３番目の塩基がGであることはほとん どない。レトロウイルスのエンベロープのトリプレットも、あまり明確ではない が、同様にCpGは少ししか使われない。レンチウイルスと他のレトロウイルスの 間にある、CpGの優勢さに関する最も顕著な違いは、アルギニントリプレットがC GX変異コドンを使用する点にある。このコドンは、レトロウイルスのエンベロー プをコードする配列に適当な頻度で出現するが、これに相当するレンチウイルス の配列には殆ど全く出現しない。天然gp120と合成gp120の間のrev依存性の違い revによる制御が、HIV-1のコドン使用に関係するかを調べるため、天然の遺伝 子及び合成遺伝子の両方の発現に対するrevの影響を調査した。revによる制御に は、rev結合部位RREをシスに有することが必要であるため、この結合部位を、天 然の遺伝子及び合成遺伝子の両方の3'非翻訳領域にクローニングした構築物を作 成した。これらのプラスミドを、revまたは対照用プラスミドとともに、293T細 胞 にトランスで同時感染させ、免疫沈降によって、上清におけるgp120の発現レベ ルを半定量的に測定した。この実験で用いた方法については、後に詳述する。 図５のパネルA及びパネルBに示されているように、revは、天然のgp120遺伝子 を制御するが、合成gp120遺伝子の発現には作用しない。したがって、内因性ウ イルスエンベロープのコード配列を欠く基質に対するrevの作用は明らかでない 。HIV-1 エンベロープのコドンを有する合成ラットTHY-1遺伝子の発現 前記の実験から、rev制御が行われるためには、事実上「エンベロープ配列」 が存在する必要があることが示唆される。この仮説を調べるために、小さいが典 型的に高度発現される細胞表面蛋白質であるラットTHY-1抗原をコードする遺伝 子の合成遺伝子を調製した。HIV-1 gp120と同じようなコドン使用を有するラッ トTHY-1遺伝子を合成したものを設計した。この合成遺伝子を設計するにあって は、mRNAの不安定性に関係するAUUUA配列を避けた。さらに、構築が終わった遺 伝子（図６）の操作を簡単にするために、２つの制限酵素部位を導入した。150 から170マーのオリゴヌクレオチドを３つ用いて、このHIVエンベロープのコドン 使用を有する合成遺伝子（rTHY-1env）を作製した（図７）。syngp120mn遺伝子 とは対照的に、PCR産物をpCU12に直接クローニングして組み立て、さらに、pCDM 7にクローニングした。 天然のrTHY-1及びHIVエンベロープのコドンを有するrTHY-1の発現レベルを、 一過性形質転換した293T細胞で、免疫蛍光法によって定量した。図８は、天然の THY-1遺伝子の発現が、対照の形質転換細胞（pCDM7）のバックグラウンドのレベ ルよりもほぼ２桁高いことを示している。これに対し、合成したラットTHY-1の 発現は、天然の遺伝子の発現よりも実質的に低くなっている（ピークが横軸の小 さな数字の方に移動していることからわかる）。 mRNAの分解を促すような負の配列要素が偶然に導入されていないことを確かめ るため、合成gp120遺伝子の3'端にrTHY-1env遺伝子をクローニングした構築物を 作製した（図９、パネルB）。この実験では、syngp120mn遺伝子、または、syngp 120/rat THY-1env融合蛋白質遺伝子（syngp120mn.rTHY-1env）のいずれかを用い て、293Tを形質転換した。CD4:IgG1融合蛋白質及びプロテインAアガロースで免 疫沈降することにより発現を測定した。この実験で用いられた方法については、 後 に詳述する。 合成gp120遺伝子がUAG終止コドンを有するため、rTHY-1envは、この転写物か らは翻訳されない。分解を促進するような負の要素が配列に存在していると、こ の構築物から発現されるgp120蛋白質のレベルは、rTHY-1envをもたないsyngp120 mn構築物に比べて減少しているはずである。図９のパネルAから、両者の構築物 の発現が同じになることが示されているため、発現の低さは翻訳に関連したもの に違いない。エンベロープのコドンを有する合成ラットTHY-1造伝子のrev依存的発現 revが、envコドンを有するラットTHY-1遺伝子の発現を制御できるか否かを調 べるために、rTHY-1envのオープンリーディングフレームの3'末端にrev結合部位 をもつ構築物を作出した。3'RREを有するラットTHY-1env構築物のrev反応性を測 定するために、ヒト293T細胞をratTHY-1envrre、及びCDM7もしくはpCMVrevのい ずれかで同時形質転換した。形質転換後60時間目に、１mM EDTAを含むPBSで細胞 を剥離して、OX-7抗rTHY-1マウスモノクローナル抗体及びFITCを結合した二次抗 体で染色した。EPICS XL細胞蛍光測定器によって蛍光強度を測定した。この実験 に用いた方法については、後に詳述する。 反復実験において、revがrTHY-1env遺伝子とともに同時形質転換されると、rT HY-1envの発現が僅かに増加するのが検出された。解析系の感度をさらに高める ために、rTHY-1envの分泌型を発現する構築物を作製した。その時点での産生率 をより忠実に反映すると考えられる表面発現蛋白質とは対照的に、上清に蓄積さ れる分泌蛋白質の量は長期間にわたる蛋白質産生の結果を反映するので、この構 築物は、より信頼度の高いデータを生み出すはずである。分泌型を発現できる遺 伝子を、内因性リーダー配列の3'末端、及びホスファチジルイノシトール・グリ カンを固定するのに必要な配列モチーフの5'末端をそれぞれアニール化する、順 向きプライマーと逆向きプライマーを用いたPCRによって調製した。CD5のリーダ ー配列を既にもっているプラスミドに、PCR産物をクローニングして、膜アンカ ー部分を取り除き、リーダー配列を異種の（そして恐らくより有効な）リーダー ペプチドで置き換えた構築物を作製した。 ratTHY-1envの分泌型及びRRE配列をシスに発現するプラスミド（rTHY-1envPI- rre）、ならびにCDM7またはpCMVrevのいずれかを用いて同時形質転換したヒト29 3T細胞の上清の免疫沈降によって、分泌型ratTHY-1envのrev反応性を測定した。 オリゴヌクレオチドcgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaacを順向きプライマーに 、cgcggatcccttgtattttgtactaataを逆向きプライマーに、合成rTHY-1env構築物 を鋳型に用いたPCRによって、rTHY-1envPI-RRE構築物を作製した。Nhe１及びNot 1で制限酵素消化した後、このPCR断片を、CD5のリーダー配列及びRRE配列を含む プラスミドにクローニングした。³⁵S標識した細胞の上清を形質転換後72時間目 に回収し、rTHY-1に対するマウスモノクローナル抗体OX7及び抗マウスIgGセファ ロースで沈澱させ、12％の還元SDS-PAGEで電気泳動した。 この実験で、rTHY-1envがrevによって誘導されることが、前記の実験よりも、 はるかに顕著にかつ明確になり、revによって、使用頻度の低いコドンによる抑 制を受ける転写物が、翻訳段階で制御されうることを強く示唆している。rTHY-1env ：免疫グロブリン融合蛋白質のrev依存的発現 rev反応性を付与するには、コード配列全域にわたって使用頻度の低いコドン が存在しなければならないのか、それとも、短い領域だけで充分なのかを調べる ために、rTHY-1env：免疫グロブリン融合蛋白質を作製した。この構築物では、 （ホスファチジルイノシトール・グリカンの固定に関係する配列モチーフを持た ない）rTHY-1env遺伝子が、ヒトのIgG1のヒンジ、CH2及びCH3のドメインに結合 している。この構築物は、Nhe1制限酵素部位及びBamHI制限酵素部位を有するプ ライマー、ならびにrTHY-1envを鋳型に用いたアンカーPCRによって作出された。 PCR断片を、CD5の表面分子のリーダー配列及びヒトのIgG1免疫グロブリンのヒン ジ、CH2及びCH3部分を含むプラスミドにクローニングした。次に、rTHY-1enveg1 挿入部位を有するHind3/Eag1断片を、RRE配列とともにpCDM7由来のプラスミドに クローニングした。 rTHY-1env/免疫グロブリン融合遺伝子（rTHY-1enveg1rre）のrevに対する反応 性を測定するために、rTHY-1enveg1rre、及びpCDM7またはpCMVrevのいずれかで ヒト293T細胞を同時形質転換した。Nhe1制限酵素部位及びBamHI制限酵素部位を それぞれに含む、順向きプライマー及び逆向きプライマーを用いたアンカーPCR によってrTHY-1enveg1rre構築物を作製した。CD5のリーダー、ならびにヒトのIg G1のヒ ンジ、CH2及びCH3ドメインを含むプラスミドの中に、このPCR断片をクローニン グした。³⁵S標識した細胞の上清を形質転換後72時間目に回収し、rTHY-1に対す るマウスモノクローナル抗体OX7及び抗マウスIgGセファロースを用いて沈澱させ 、12％の還元SDS-PAGEで電気泳動した。この実験で用いられた方法については、 後に詳述する。 rTHY-1envPI-遺伝子産物におけると同じように、このrTHY-1env/免疫グロブリ ン融合蛋白質は、上清に分泌される。したがって、この遺伝子は、rev誘導に反 応するはずである。しかし、rTHY-1envPI-とは対照的に、revをトランスで同時 形質転換させても、rTHY-1enveg1発現の増加は、全く誘導されないか、または、 ごく僅かにしか誘導されなかった。 天然のrTHY-1またはHIVエンベロープのコドンを有する、rTHY-1：免疫グロブ リン融合蛋白質の発現を、免疫沈降法によって測定した。要約すると、rTHY-1en veg1（envコドン）またはrTHY-1wteg1（天然のコドン）のいずれかによって、ヒ ト293T細胞を形質転換した。天然のrTHY-1遺伝子を含むプラスミドを鋳型に用い たこと以外は、rTHY-1enveg1構築物に用いたのと同じ方法で、rTHY-1wteg1構築 物を作製した。³⁵S標識した細胞の上清を、形質転換後72時間目に回収し、rTHY- 1に対するマウスモノクローナル抗体OX7及び抗マウスIgGセファロースを用いて 沈澱させ、12％の還元SDS-PAGEで電気泳動した。この実験で用いられた方法につ いては、後に詳述する。 融合の相手として野生型のrTHY-1を用いた同じ構築物に比べて、rTHY-1enveg1 の発現レベルは減少したが、rTHY-1envよりは、依然としてかなり高かった。し たがって、融合蛋白質のいずれの部分も、発現レベルに効果があった。rTHY-1en vを添加しても、rTHY-1envのみに見られたのと同じ発現レベルに制限されること はなかった。このように、revによる制御は、蛋白質発現がほとんど完全に抑制 されない限り、効果がないように思われる。HIV-1 エンベロープ遺伝子におけるコドンの選択性 HIVエンベロープのコドン使用頻度と、高度に発現するヒト遺伝子のコドン使 用頻度とを直接に比較すると、20アミノ酸すべてについて、著しい違いがあるこ とが明らかになる。このコドンの選択性の統計学的有意性を単純に計算すると、 ２ 倍のコドン縮重を含む９種のアミノ酸において、好まれる３番目のコドンは、９ 種すべてでAまたはUである。９種すべてが、２つの同等の選択肢から、同じ選択 をする確率は約0.004であるので、従来のいかなる計算法を用いても、この３番 目の残基の選択が任意であるとは考えられない。さらに、コドンの選択性に偏り があることは、アデニンを含むトリプレットに対する強い選択性が見られる、よ り縮重度の高いコドンにおいて証明される。これは、３倍以上の縮重を有するコ ドンの３番目の位置に、C、またはよりまれにはGを含むコドンが選択されやすい 、高度発現遺伝子におけるパターンとは対照的である。 高度に発現するヒトの遺伝子のコドンを、本来のコドンで体系的に交換すると 、gp120の発現が劇的に上昇する。ELISAによる定量解析から、ヒト293細胞を一 過性形質転換すると、天然のgp120に比べて、合成遺伝子の発現が少なくとも25 倍高くなることが明らかになった。ELISA実験において示された濃度のレベルは 、むしろ低かった。ELISAは、CD4に結合しているgp120に基づいて定量に用いら れたため、天然の、非変性物質しか検出されなかった。これにより、明白な低い 発現が説明されうる。細胞質中のmRNAレベルを測定したところ、蛋白質発現の違 いは、mRNAの安定性ではなく、翻訳における違いによるものであることが明らか になった。 レトロウイルスは一般に、HIVに見られるような、A及びTに対する選択性を示 さない。しかし、この科のウイルスをレンチウイルス及びレンチウイルス以外の レトロウイルスの２つのサブグループに分けると、レンチウイルスの第３コドン の位置に、A、及び、より頻度は低いがTに対する、同様な選択性が検出された。 このように、有用な証拠からは、このような残基の逆転写ないし複製について本 質的な利点があるからというのではなく、むしろ、この分類のウイルスの生理学 に特有の何らかの理由によって、レンチウイルスがエンベロープコドンに特徴的 なパターンを保持していることが示唆されている。レンチウイルス及び非複合レ トロウイルスの間の大きな違いは、既に述べられているように、レンチウイルス には付加的な制御遺伝子及び必須でない補助遺伝子があるという点である。した がって、エンベロープ発現が制限されることに対する簡単な理由は、これらの付 加的な分子の一つが有する、重要な制御機構に基づくものであるかもしれない。 実 際、これらの蛋白質の一つであるrevが、すべてのレンチウイルスにおいて相同 物を有する可能性が最も高いことが知られている。このように、revの刺激作用 に感応するような種類の転写物を作出するには、ウイルスmRNAにおけるコドン使 用が用いられる。コドン使用を逆方向に変えたこと以外は前述した同じ方法を用 いて、この仮説が証明された。高度に発現する細胞遺伝子のコドン使用を、HIV エンベロープでもっとも頻繁に用いられるコドンで置換した。推測通り、天然の 分子に比べて、発現レベルはかなり低く、細胞表面に発現する分子の免疫蛍光に よって解析すると、ほぼ２桁低くなった（4.7参照）。revをトランスに同時発現 させ、RRE要素をシスに置くと、表面分子はほんの僅かしか誘導されないことが 分かった。しかし、分泌分子としてTHY-1を発現させると、revによる誘導ははる かに顕著になるため、前記の仮説が裏付けられる。これは、恐らく、分泌蛋白質 が上清に蓄積され、それによってrevの効果がかなり増幅されることによって説 明されよう。もし、一般的に、revのみが表面分子の僅かな増加を誘導するとし たら、revによるHIVエンベロープの誘導は、表面における増加を目的としたもの ではなく、むしろ、細胞内のgp160レベルを増加させることが目的であろう。目 下のところ、なぜこのようになるのかは全く分からない。 発現を制限し、rev依存的にするために、遺伝子の小さな部分をまとめた要素 が十分であるか否かを調べるために、遺伝子全体の約3分の1がエンベロープのコ ドン使用を有するrTHY-1env：免疫グロブリン融合蛋白質を作製した。この構築 物の発現レベルは、中程度のレベルであり、rTHY-1envの負の配列要素が免疫グ ロブリン部分に対して優勢でないことを示している。この融合蛋白質は、rev反 応性がないか、僅かにしかなく、ほとんど完全に抑制された遺伝子のみがrevに 反応しうることを示している。 コドン頻度表に見られた、もう一つの特徴的な性質は、CpGトリプレットの出 現が著しく少ないことである。大腸菌、酵母、ショウジョウバエ、及び霊長類に おけるコドン使用を比較して調べると、解析された霊長類の多数の遺伝子の中で 、最も使用されにくい８種のコドンは、すべてCpGジヌクレオチド配列を有する コドンを含んでいることが分かった。このジヌクレオチドモチーフを含むコドン の回避は、他のレトロウイルスの配列でも見られた。CpGを有するトリプレット の出現 が少ない理由は、CpGのシトシンのメチル化による、遺伝子のサイレンシングを 回避することと何らかの関係がある可能性が高い。HIV全体でのCpGジヌクレオチ ドの予想数は、塩基組成を基に予想される数の約5分の1である。これは、高発現 を回復させる可能性、及びその遺伝子が実際にウイルス病発生のある時点で高度 に発現しなければならないことを示しているのかもしれない。 本明細書に提示された結果により、コドンの選択性が、蛋白質のレベルに対し て重要な効果を有していることが明らかとなり、翻訳の伸長が哺乳動物の遺伝子 発現を制御していることが示唆される。しかし、他の因子も一定の役割を果たす かもしれない。まず、真核細胞の中で最大限には存在していないmRNA量が、少な くともいくつかの場合においては、翻訳開始が律速であることを示している。さ もなければ、すべての転写物は、リボソームによって完全に覆われるであろう。 さらに、リボソームの停止及びそれに続くmRNAの分解が、この機構であるならば 、本明細書に示されているような制御機構によって、稀なコドンによる抑制が逆 転するとは全く考えられない。開始及び伸長の両者が翻訳活性に及ぼす影響につ いての一つの説明としては、開始率またはリボソームへの結合が、RNA全体にわ たって分布しているシグナルによって部分的に制御され、それによって、レンチ ウイルスのコドンが、RNAが少ししか開始されないRNAのプールに蓄積される原因 となるいうことが考えられる。しかし、この制限は熱力学的である必要はない。 例えば、コドンの選択は、ある特定の翻訳産物が、開始後、適切に完成される確 率に影響するであろう。この機構の下では、比較的好ましくないコドンが多いと 、新生ポリペプチド鎖が完成されない確率を有意に累積させる結果となろう。そ して、revの作用によって、隔離されたRNAの開始率が高められることになろう。 reV反応性転写物においては、アデニン残基が多いため、RNAのアデニンのメチル 化が、この翻訳抑制を仲介することになろう。 詳細な方法 以下の方法は、前述の実験において用いられた。配列解析 配列解析では、ウィスコンシン大学のコンピュータ・グループによって開発さ れたソフトウエアを用いた。プラスミド構築 プラスミド構築には、以下の方法を用いた。ベクター及び挿入断片DNAは、0.5 μl/10μlの濃度で、適当な制限酵素緩衝液中で１時間から４時間消化した（反 応液の総量は30μｌ）。ゲル電気泳動の前に、消化されたベクターを、10％（v/ v）の1μg/ml子ウシ小腸アルカリホスファターゼで30分間処理した。ベクター及 び挿入断片の消化物（それぞれ5から10μl）を、TAE緩衝液と共に1.5％低融点ア ガロースゲルで泳動した。目的のバンドを含むゲル切片を、1.5 mlの反応チュー ブに移し、65℃で溶解し、アガロースを除去することなく、直接にライゲーショ ン液に加えた。ライゲーションは、一般的には、１×ロー（Low）緩衝液、200〜 400Uのリガーゼを含む1×ライゲーション添加液（Ligation Addition）、1μlの ベクター及び挿入断片4μlの総量25μlで行われた。必要であれば、加熱して不 活性化するかまたはフェノール抽出した消化物に、1/10容量の250μM dNTP及び2 〜5 Uのクレノウ（Klenow）ポリメラーゼを加え、室温で約20分間インキュベー トして、5'突出末端を充填した。必要であれば、加熱して不活性化するかまたは フェノール抽出した消化物に、1/10容量の2.5 mM dNTP及び5〜10 UのT4DNAポリ メラーゼを加えて、37℃で30分間インキュベートして、3'突出末端を充填した。 次の緩衝液を、これらの反応に用いた。10×ロー緩衝液（60 mM トリスHCl，pH7 .5，60 mM MgCl₂，50 mM NaCl，4 mg/ml BSA，70 mM β-メルカプトエタノール ，0.02％ NaN₃）；10×メディウム（Medium）緩衝液（60 mM トリスHCl，pH 7.5 ，60mM MgCl₂，50 mM NaCl，4 mg/ml BSA，70 mM β-メルカプトエタノール，0. 02％ NaN₃）；10×ハイ（High）緩衝液（60 mM トリスHCl，pH 7.5，60 mM MgCl₂ ，50 mM NaCl，4mg/ml BSA，70 mM β-メルカプトエタノール，0.02％ NaN₃） ；10×ライゲーション添加液（1 mM ATP，20 mM DTT，1 mg/ml BSA，10 mM スペ ルミジン）；50×TAE（2 Mトリス酢酸，50 mM EDTA）。オリゴヌクレオチドの合成及び精製 オリゴヌクレオチドは、ミリガン（Milligen）8750合成機（ミリポア社）で作 製した。カラムを1 mlの30％水酸化アンモニウムで溶出し、溶出されたオリゴヌ クレオチドを55℃で６時間から12時間置いて脱保護した。脱保護した後、1.5 ml の反応チューブの中で、150μlのオリゴヌクレオチドを10×容量の不飽和n-ブタ ノールで沈澱させてから、微量遠心機で15,000 rpmで遠心した。沈殿物を70％エ タノールで洗浄し、50μlのH₂Oに再懸濁した。濃度は、1:333に希釈して260 mn の光学濃度（10D₂₆₀ = 30μg/ml）を測定して決定した。 以下のオリゴヌクレオチドを合成gp120遺伝子の構築に用いた（これに関して 、配列はすべて5'から3'の方向に示されている）。 ポリメラーゼ連鎖反応 両末端をアニール化した、短い、重複する15から25マーのオリゴヌクレオチド を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、長いオリゴヌクレオチドを増幅す るために用いた。典型的なPCR条件は、35サイクル、アニーリング温度は55℃、 伸長時間は0.2秒間であった。PCR産物をゲル精製して、フェノール抽出し、その 後、２つの隣り合う短い断片からできた長い断片を生成させるためのPCRに用い た。これらの長い断片を、CD5表面分子のリーダー配列、及びその後ろにNhe1/Ps t1/Mlu1/EcoR1/BamH1ポリリンカーを含む、CDM7由来のプラスミドにクローニン グした。 これらの反応には、10×PCR用緩衝液（500 mM KCl，100 mMトリスHCl，pH 7.5 ，8 mM MgCl₂，2 mM 各dNTP）を用いた。最終緩衝液には、Taqポリメラーゼの信 頼度を増強するために、10％DMSOを補足した。少量DNA調製 形質転換した細菌は、3 mlのLB培地で６時間以上または一晩培養した。およそ 1.5 mlの各培養液を、1.5 mlの微量遠心用チューブに注入して、細胞を沈澱させ るために20秒間遠心して、200μlの溶液Iに懸濁した。さらに、400μlの溶液II 及び300μlの溶液IIIを加えた。微量遠心用チューブの蓋をして、混合し、30秒 以上遠心した。上清を新しいチューブに移して、フェノール抽出を一回行なった 。このチューブにイソプロパノールを充填して、混合し、微量遠心分離機で２分 間以上遠心した。沈澱を70％エタノールで洗浄して、10μlのRNAse Aを含んだdH 20 50μl中に再懸濁した。これらの実験において、以下の培地及び溶液を用いた 。LB培地（1.0 ％ NaCl，0.5 ％ 酵母抽出物、1.0％ トリプトファン）；溶液Ｉ （10 mM EDTA，pH 8.0）；溶液II（0.2 M NaOH，1.0 ％ SDS）；溶液III（2.5 M KOAc，2.5 M 氷酢酸）；フェノール（pHを6.0に調整してTEで覆う）；TE（10 m M トリスHCl，pH 7.5，1 mM EDTA pH 8.0）。大量DNA調製 形質転換した細菌の培養液１リットルを24時間から36時間（pCDM誘導体で形質 転換したMC1061p3）、または、12時間から16時間（pUC誘導体で形質転換したMC1 061）を、37℃で、M9細菌培養培地（pCMD誘導体）またはLB培地（pUC誘導体）の いずれかで培養した。細菌を１リットルのボトルに入れ、ベックマン（Beckman ）J6遠心機を用いて、4,200 rpmで20分間遠心した。沈澱を40 mlの溶液Ｉに再懸 濁した。さらに、80 mlの溶液II及び40 mlの溶液IIIを加え、塊が2 mmから3 mm の大きさになるまで、強めに振った。このボトルを4,200 rpmで５分間遠心して 、上清をチーズクロスを通して250 mlのボトルに移した。この上にイソプロパノ ールを加え、4,200 rpmで10分間遠心した。沈澱を、4.1 mlの溶液Ｉに再懸濁し て、塩化セシウム 4.5 g、10 mg/mlの臭化エチジウム 0.3 ml、及び、１％トラ イトン（Triton）XI00溶液 0.1 mlに加えた。このチューブをベックマンJ2高速 遠心機にて、10,000 rpmで５分間遠心した。この上清を、ベックマンのクイック シール超高速遠心チューブに移し、シールをして、ベックマン超高速遠心機で、 NVT90固定アングルローターを用いて、80,000 rpmで2.5時間以上遠心した。１ml の注射器及び20ゲージの注射針を用いて、可視光によってバンドを抽出した。抽 出した物質に、等量の蒸留水を加えた。DNAは、１M塩化ナトリウムで飽和したn- ブタノールで１回抽出し、その後、等量の10 M 酢酸アンモニウム/1 mM EDTAを 加えた。この物質を13 mlのスナップ付きチューブに注入して、次に、無水エタ ノールを上から加えて満たし、混合してから、ベックマンJ2遠心機に入れて、10 ,000 rpmで10分間遠心した。沈澱は70 ％エタノールで洗浄して、0.5 から１ml のdH₂Oに再懸濁した。DNAの濃度は、200倍希釈で260 nmの光学濃度（10D₂₆₀ = 5 0μg/ml）を測定して決定した。 これらの実験において、以下の培地及び緩衝液を用いた。M9細菌培養用培地（ M9塩 10 g、カザミノ酸（水和物）10 g、M9培地添加物 10 ml、テトラサイクリ ン7.5μg/ml（15 mg/mlの保存用溶液を500μl）、アンピシリン 12.5μg/ml（10 mg/mlの保存用溶液を125μl））；M9培地添加物（10 mM CaCl₂，100 mM MgSO₄ ，200μg/ml チアミン、70％グリセロール）；LB培地（1.0 ％ NaCl，0.5 ％ 酵 母抽出物、1.0 ％ トリプトン）；溶液Ｉ（10 mM EDTA，pH 8.0）；溶液II（0.2 M NaOH，1.0 ％ SDS）；溶液III（2.5 M KOAc，2.5 M HOAc）。配列決定 サンガージデオキシヌクレオチド法によって、合成遺伝子の配列を決定した。 簡単にいうと、20から50μgの２本鎖プラスミドDNAを、0.5 M NaOHで５分間変性 させた。その後、DNAを、1/10容量の酢酸ナトリウム（pH 5.2）及び２倍容量の エタノールで沈澱させて、５分間遠心した。沈澱は70 ％エタノールで洗浄して 、１μg/μlの濃度になるように再懸濁した。４μgの鋳型DNA及び40 ngのプライ マーを、1×アニーリング緩衝液の中で、最終容量10μlでアニーリング反応を行 なった。反応液を65℃まで加熱して、37℃までゆっくり下げた。別個のチューブ で、この各反応液に、0.1 M DTTを１μl、標識混合液を２μl、dH₂Oを0.75μl、 [³⁵S]dATPを１μl（10 uCi）、及び、シーケナーゼ（Sequenase登録商標）（12 U/μl）を0.25μl加えた。この混合液５μlを、アニール化した各プライマー-鋳 型の入ったチューブに添加して室温で５分間インキュベートした。各標識反応液 について、４つのターミネーション混合液をそれぞれ2.5μlずつ、テラサキプレ ートに加え、37℃で予熱した。インキュベート時間の終わりに、3.5μlの標識反 応液を４つの各ターミネーション混合液に加えた。５分後、４μlの反応停止溶 液を各反応液に加え、オーブンの中で、テラサキプレートを80℃で10分間インキ ュベートした。配列決定用反応液は、５％変性ポリアクリルアミドゲルで泳動し た。アクリルアミド溶液は、200 mlの10×TBE緩衝液及び957 mlのdH₂Oを、100g のアクリルアミド：ビスアクリルアミド（29：１）に加えて調製した。38 mlの アクリルアミド溶液及び28 gの尿素とを組み合わせて、５％ポリアクリルアミド −46％尿素−1×TBEゲルを調製した。400μlの10％過硫酸アンモニウム（ammoni um peroxodisulfate）及び60μlのTEMEDを加えて、重合を開始させた。シラン化 したガラス板及びシャークコームを用いてゲルを注入し、１×TBE緩衝液中で、6 0から100ワットで２時間から４時間（読むべき領域による）泳動した。ゲルをワ ットマンのブロッティング紙に移して、80℃で約１時間乾燥させ、室温でX線に 感光させた。一般的な感光時間は12時間であった。以下の溶液を、これらの実験 で用いた。５×アニーリング緩衝液（200 mM トリスHCl，pH 7.5，100 mM MgCl₂ ，250 mM NaCl）；標識用混合液（7.5μM 各dCTP，dGTP，及びdTTP）；ターミネ ーション混合液（80μM 各dNTP，50 mM NaCl，8μM ddNTP（各１種ずつ））；反 応停止溶液（95％ ホルムアミド，20 mM EDTA，0.05％ ブロムフェノールブルー，0.05％ キシレン シアノール）；5×TBE（0.9 M トリスホウ酸，20 mMEDTA）；ポリアクリルアミ ド溶液（96.7 g ポリアクリルアミド，3.3 g ビスアクリルアミド，200 ml 1×T BE，957 ml dH20）。RNA 分離 リン酸カルシウム法で形質転換して36時間後の293T細胞、及び感染16時間後の ワクシニアに感染したヒーラ細胞から、本質的にギルマンによって開示されてい るところに従って細胞質RNAを分離した（組織培養細胞からの細胞質RNAのギルマ ン調製法（Gilman Preparation of cytoplasmic DNA from tissue culture cell s）、分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、Ausubelら編、ウィリーアンドサンズ（Wiley & Sons）、ニューヨー ク、1992）。簡潔にいえば、400μlの溶解緩衝液で細胞を溶解し、遠心によって 核を除いて、SDS及びプロテイナーゼKを、それぞれ、0.2％及び0.2 mg/mlになる よう加えた。細胞質抽出物を37℃で20分間インキュベートし、フェノール／クロ ロフォルムで２回抽出して沈澱させた。RNAを100μlの緩衝液Ｉに溶解して37℃ で20分間インキュベートした。反応液に25μlの停止緩衝液を加えて反応を停止 し、再び沈澱させた。 以下の溶液を、これらの実験で用いた。溶解緩衝液（50 mM トリス，pH8.0，1 00 mM NaCl，5 mM MgCl₂，0.5％ NP40を含むTE）；緩衝液Ｉ（10 mM MgCl₂,1 mM DTT，0.5 U/μl 胎盤RNAse阻害剤，0.1 U/μl RNAse非含有DNAse I）；反応停 止緩衝液（50 mM EDTA，1.5 M NaOAc，1.0％ SDS）。スロットブロット解析 スロットブロット解析のために、10μgの細胞質RNAを50μlのdH₂Oに溶解して 、150μlの10×SSC/18％ホルムアルデヒドを加えた。そして、溶解したRNAを65 ℃で15分間インキュベートして、スロットブロット装置で配置した。1.5 Kbのgp 120IIIb及びsyngp120mn断片を放射性標識したプローブをハイブリダイゼーショ ンに用いた。10μlの5×オリゴ標識緩衝液、8μlの2.5 mg/ml BSA、4μlの∝[³² P]-dCTP（20 uCi/μl；6000 Ci/mmol）、及び5 Uのクレノウ断片を含む50μlの 反応液中で、２つの各断片をランダム標識した。37℃で１時間から３時間インキ ュベー トした後、100μlのTEを加えて、G50スピンカラムを用いて、取り込まれなかっ た∝[³²P]-dCTPを除去した。ベックマンのベータカウンタで活性を測定し、等価 の特異的活性度をハイブリダイゼーションに用いた。膜を２時間プレハイブリダ イゼーションして、ハイブリダイゼーション溶液1 ml当たり0.5×10⁶cpmのプロ ーブを用いて、42℃で12時間から24時間ハイブリダイズした。この膜を室温下、 洗浄用緩衝液Ｉで２回（５分間）洗浄して、洗浄用緩衝液IIに入れて65℃で１時 間置いてからX線フィルムに感光させた。3'非翻訳領域を含むpCDM7の、1.1 kbの Not1/Sfi1断片を用いても、同様の結果が得られた。ランダム標識したヒトのベ ーターアクチンプローブを用いた、対照のハイブリダイゼーションを平行して行 なった。マグネティック・ダイナミクス（Magnetic Dynamics）蛍光画像機で、 ハイブリダイズしたニトロセルロース膜をスキャンしてRNA発現を定量した。 以下の溶液を、これらの実験で用いた。5×オリゴ標識緩衝液（250 mM トリス 塩酸，pH 8.0，25 mM MgCl₂,5 mM β-メルカプトエタノール，2 mM dATP，2 mM dGTP，2 mM dTTP，1 M ヘペス（Hepes）pH 6.6，1 mg/ml ヘキサヌクレオチド[d NTP]6）；ハイブリダイゼーション溶液（ M リン酸ナトリウム，250 mM NaCl,7 ％ SDS，1 mM EDTA，5％ 硫酸デキストラン，50％ ホルムアミド，100μg 変性 サケ精子DNA）；洗浄用緩衝液Ｉ（2× SSC，0.1％ SDS）；洗浄用緩衝液II（0.5 × SSC,0.1％ SDS）；20× SSC（3 M NaCl，0.3 M クエン酸3ナトリウム，pHを7 .0に調整する）。ワクシニア組み換え ワクシニア組み換えには、ロメオ及びシード（Romeo and Seed，Cell，64: 10 37，1991）によって記載された方法を修正したものを用いた。簡潔に説明すれば 、70％から90％の集密度のCV1細胞に、１μlから３μlの野生型ワクシニア保存 株WR（2×10⁸pfu/ml）を、仔ウシ血清を含まない培養培地の中で１時間感染させ た。24時間後、１枚のプレートにつき25μgのTKGプラスミドDNAを用いて、リン 酸カルシウム法によって細胞を形質転換させた。さらに24時間から48時間後、細 胞をプレートからかき取り、遠心して、１mlの容量に再懸濁した。凍結／融解の サイクルを３回繰り返した後、トリプシンを0.05 mg/mlになるように加え、溶解 物を20分間インキュベートした。この溶解物の10、１及び0.1μlを段階希釈した もの を、12.5μg/mlのマイコフェノール酸、0.25 mg/mlのキサンチン、及び、1.36 m g/mlのヒポキサンチンで６時間前処理した小さなプレート（6 cm）中のCV1細胞 に感染させるために用いた。感染した細胞を２日から３日培養し、その後gp120 に対するモノクローナル抗体NEA9301、及びアルカリホスファターゼを結合した 二次抗体で染色した。細胞は、0.33 mg/ml NBT及び0.16 mg/ml BCIPとともにAP- 緩衝液中でインキュベートし、最後に、PBS中1％アガロースで覆った。陽性のプ ラークを採集し、100μlのトリスpH 9.0に再懸濁した。プラーク精製を１回反復 した。高濃度の保存液を作製するために、感染をゆっくりと拡大させた。最後に 、大きなプレート中のヒーラ細胞に、前回のウイスルの半量を感染させた。3 ml のPBS中で感染細胞を剥離し、ダウンス型（Dounce）ホモジナイザーですり潰し 、遠心によって大きな細胞残渣から分離した。VPE-8組換えワクシニア保存株を 、メリーランド州ロックビルにあるAIDS貯蔵機関（AIDS repository）から厚意 によっていただき、7.5初期／後期混合プロモーターの制御下でHIV-1 IIIB gp12 0を発現させた（Earlら、J．Virol.，65: 31，1991）。組換えワクシニアを用い たすべての実験において、細胞には、感染多重度10以上で感染させた。 AP緩衝液（100 mM トリス HCl，pH 9.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl₂）を、この 実験で用いた。細胞培養 サル腎臓癌細胞系CV1及びcos7、ヒト腎臓癌細胞系293T、ならびにヒト子宮頸 癌細胞系ヒーラをアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手して、補足 IMDM中で維持した。これらは、10 cmの組織培養プレートに保存し、一般的には 、３日から４日置きに1:5から1:20に分けた。以下の培地を、この実験で用いた 。補足IMDM（90％ イスコブ（Iscove's）修正ダルベッコ培地、10％ 仔ウシ血清 、鉄分を補充、30分間56℃で加熱して不活性化、0.3 mg/ml L-グルタミン、25μ g/ml ゲンタマイシン、0.5 mM β-メルカプトエタノール（5 M NaCl，0.5 mlでp Hを調整した））。形質転換 250μlの0.25 M CaCl₂中10μgのプラスミドDNAを、同量の2×HEBS緩衝液に、 撹拌しながらゆっくりと添加することにより、293T細胞のリン酸カルシウム形質 転 換を行なった。10分間から30分間、室温でインキュベートした後、小さなプレー ト中で50〜70％の集密状態の細胞に、DNA沈殿物を加えた。revとの同時形質転換 実験において、細胞を、10μgのgp120IIIb、gp120IIIbrre、syngp120mnrreまた はrTHY-1enveg1rre、及び10μgのpCMVrevまたはCDM7プラスミドDNAを用いて形質 転換した。 以下の溶液を、これらの実験で用いた。2×HEBS緩衝液（280 mM NaCl，10m M KCl，1.5 mM 濾過滅菌）；0.25 mM CaCl₂（オートクレーブ）。免疫沈降 48時間から60時間後、培地を交換して、200μCiの³⁵Sトランス標識を含む、Cy s/Met除去培地で、さらに12時間細胞をインキュベートした。上清を回収して、 残渣を取り除くために3000 rpmで15分間遠心分離した。プロテアーゼ阻害剤のロ イペプチン、アプロチニン及びPMSFを、それぞれ2.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ mlずつ添加した後、１mlの上清を、回転装置上、４℃で12時間、10μlの充填さ れたプロテインAセファロースのみとインキュベートする（rTHY-1enveg1rre）か 、または、プロテインAセファロース及び3μgの精製CD4/免疫グロブリン融合蛋 白質（ベーリング（Behring）社の厚意により提供された）とインキュベートし た（すべてのgp120構築物）。その後、プロテインAビーズを５分から15分間ずつ ５回洗浄した。最後の洗浄後、10μlのローディング緩衝液を加え、試料を３分 間煮沸して、７％（すべてのgp120構築物）または10％（rTHY-1enveg1rre）のSD Sポリアクリルアミドゲルに載せた（溶解用トリスpH 8.8緩衝液、スタッキング ゲル用トリスpH 6.8緩衝液、トリス−グリシン泳動用緩衝液、Maniatisら、1989 ）。10％酢酸及び10％メタノール中でゲルを固定して、アンプリファイ（Amplif y）とともに20分間インキュベートし、乾燥させてから12時間感光させた。 以下の緩衝液及び溶液を、この実験で用いた。洗浄用緩衝液（100 mM トリス ，pH 7.5，150 mM NaCl，5 mM CaCl₂，1％ NP-40）；5×泳動用緩衝液（125 mM トリス，1.25 Mグリシン，0.5％ SDS）；ローディング緩衝液（10％グリセロー ル、4％ SDS，4％ β-メルカプトエタノール，0.02％ ブロムフェノールブルー ）。免疫蛍光法 293T細胞をリン酸カルシウム共沈澱によって形質転換させ、３日後、表面THY- 1発現について解析した。１ mM EDTA/PBSで剥離した後、1:250の希釈率、４℃で 20分間、モノクローナル抗体OX-7で細胞を染色し、PBSで洗浄してから、1:500に 希釈した、FITC結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗血清とともにインキュベート した。細胞を再び洗浄して、0.5 mlの固定液に再懸濁して、EPICS XL細胞蛍光定 量器（Coulter社）で解析した。 以下の溶液を、この実験で用いた。PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，4.3 mM N a₂HPO₄，1.4 mM KH₂PO₄，pHを7.4に調整した）；固定液（2％ホルムアルデヒド 含有PBS）。ELISA CD4で覆われたELISA用プレート及びヤギ抗gp120抗血清を用いて、培養上清中 のgp120の濃度を可溶相で測定した。リン酸カルシウムで形質転換された293T細 胞の上清を４日後に回収して、残渣を取り除くために3000 rpmで10分間遠心分離 し、プレート上、４℃で12時間インキュベートした。PBSで６回洗浄した後、1:2 00に希釈したヤギ抗gp120抗血清を100μl加えて、２時間置いた。プレートを再 び洗浄して、ペルオキシダーゼを結合したウサギ抗ヤギIgG抗血清1:1000で２時 間インキュベートした。次に、プレートを洗浄してから、クエン酸ナトリウム緩 衝液中２ mg/mlのo-フェニレンジアミンを含む基質液100μlとともに30分間イン キュベートした。最後に、100μlの４M硫酸で反応を停止させた。コウルター・ マイクロプレート読み取り器（Coulter microplate reader）を用いて490nmでプ レートを読み取った。精製した、組換えgp120IIIbを対照として用いた。以下の 緩衝液及び溶液を、この実験で用いた。洗浄用緩衝液（0.1％ NP40含有PBS）； 基質溶液（2 mg/mlのo-フェニレンジアミン含有クエン酸ナトリウム緩衝液）。利用法 本発明の合成遺伝子は、細胞培養液中の哺乳動物細胞において通常発現する蛋 白質を発現させるのに有用である（例えば、hGH、TPA、第VII因子、及び第IX因 子などのヒト蛋白質の商業的生産のため）。また、本発明の合成遺伝子は、遺伝 子治療にも有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物細胞で通常発現する蛋白質をコードする合成遺伝子であって、該 哺乳動物蛋白質をコードする天然の遺伝子における好ましくない、または比較的 好ましくない少なくとも１個のコドンを、同じアミノ酸をコードする好ましいコ ドンに置き換えた合成遺伝子。 ２．同一条件下のインビトロ哺乳動物細胞培養系において天然遺伝子によって 発現されるレベルの少なくとも110％のレベルで哺乳動物蛋白質を発現させるこ とができる、請求項１の合成遺伝子。 ３．同一条件下のインビトロ哺乳動物細胞培養系において天然遺伝子によって 発現されるレベルの少なくとも150％のレベルで哺乳動物蛋白質を発現させるこ とができる、請求項１の合成遺伝子。 ４．同一条件下のインビトロ哺乳動物細胞培養系において天然遺伝子によって 発現されるレベルの少なくとも200％のレベルで哺乳動物蛋白質を発現させるこ とができる、請求項１の合成遺伝子。 ５．同一条件下のインビトロ哺乳動物細胞培養系において天然遺伝子によって 発現されるレベルの少なくとも500％のレベルで哺乳動物蛋白質を発現させるこ とができる、請求項１の合成遺伝子。 ６．同一条件下のインビトロ哺乳動物細胞培養系において天然遺伝子によって 発現されるレベルの少なくとも10倍のレベルで哺乳動物蛋白質を発現させること ができる、請求項１の合成遺伝子。 ７．天然遺伝子におけるコドンの少なくとも10％が好ましくないコドンである 、請求項１の合成遺伝子。 ８．天然遺伝子におけるコドンの少なくとも50％が好ましくないコドンである 、請求項１の合成遺伝子。 ９．天然遺伝子に存在する好ましくないコドン及び比較的好ましくないコドン の少なくとも50％が好ましいコドンに置き換えられている、請求項１の合成遺伝 子。 10．天然遺伝子に存在する好ましくないコドン及び比較的好ましくないコドン の少なくとも90％が好ましいコドンに置き換えられている、請求項１の合成遺伝 子。 11．蛋白質がレトロウイルスまたはレンチウイルスの蛋白質である、請求項１ の合成遺伝子。 12．蛋白質がHIVの蛋白質である、請求項11の合成遺伝子。 13．蛋白質がgag、pol及びenvからなる群より選択されたものである、請求項1 2の合成遺伝子。 14．蛋白質がgp120又はgp160である、請求項13の合成遺伝子。 15．蛋白質がヒト蛋白質である、請求項１の合成遺伝子。 16．通常哺乳動物細胞によって発現される蛋白質をコードする合成遺伝子を調 製する方法であって、該蛋白質をコードする天然の遺伝子における好ましくない コドン及び比較的好ましくないコドンを同定し、１つ又は複数の該好ましくない コドン及び比較的好ましくないコドンを置換コドンとして同じアミノ酸をコード する好ましいコドンに置き換えることを含む方法。