ES2270430T3 - Sobreexpresion de proteinas de mamifero y virales. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION CARACTERIZA UN GEN SINTETICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA NORMALMENTE EXPRESADA EN CELULAS DE MAMIFERO EN DONDE AL MENOS UN CODIFICADOR NO PREFERIDO O MENOS PREFERIDO EN EL GEN NATURAL QUE CODIFICA LA PROTEINA DE MAMIFERO HA SIDO SUSTITUIDO POR UN CODIFICADOR PREFERIDO QUE CODIFICA EL MISMO AMINOACIDO.
Description
Sobreexpresión de proteínas de mamífero y
virales.
La invención se refiere a genes y métodos para
expresar proteínas de VIH a altos niveles en células eucariotas.
La expresión de productos de genes eucarióticos
en procariotas algunas veces está limitado por la presencia de
codones que se usan con poca frecuencia en E. coli. La
expresión de estos genes puede potenciarse por medio de la
sustitución sistemática de los codones endógenos con codones
sobrerrepresentados en genes procarióticos de alta expresión
(Robinson et al. 1984). Comúnmente se supone que los codones
raros producen paradas del ribosoma, con lo que no se puede
completar la cadena polipeptídica naciente y se produce el
desacoplamiento de la transcripción y la traducción. El extremo 3'
del ARNm del ribosoma parado se expone a ribonucleasas celulares,
reduciéndose de esta manera la estabilidad del transcrito.
La invención se refiere a un gen sintético de
acuerdo con la reivindicaciones adjuntas.
Son codones preferidos: Ala (gcc); Arg (cgc);
Asn (aac); Asp (gac) Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile
(atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr
(acc); Tyr (tac); y Val (gtg). Son codones menos preferidos: Gly
(ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc). Todos los codones
que no se ajustan a la descripción de codones preferidos o codones
menos preferidos son codones no preferidos.
En realizaciones preferidas, el gen sintético
puede expresar dicha proteína de mamífero a un nivel que es al menos
110%, 150%, 200%, 500%, 1.000%, o 10.000% del expresado por dicho
gen natural en un sistema de cultivo de células de mamífero in
vitro en condiciones idénticas (es decir, el mismo tipo celular,
las mismas condiciones de cultivo, y el mismo vector de
expresión).
A continuación se describen sistemas de cultivo
de células adecuados para medir la expresión del gen sintético y el
gen natural correspondiente. Los especialistas en la técnica conocen
bien otros sistemas de expresión adecuados que emplean células de
mamífero y los describen, por ejemplo, en los trabajos de referencia
de biología molecular convencionales indicados más adelante. Los
vectores adecuados para la expresión de los genes sintéticos y
naturales se describen más adelante y en los trabajos de referencia
convencionales descritos a continuación. Por "expresión" se
entiende expresión de proteínas. La expresión puede medirse usando
un anticuerpo específico por la proteína de interés. Estos
anticuerpos y técnicas de medición son bien conocidos para los
especialistas en la técnica. Por "gen natural" se entiende la
secuencia génica que codifica de forma natural la proteína.
En otras realizaciones preferidas al menos 10%,
20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de los codones del gen
natural son codones no preferidos.
En una realización preferida, la proteína es una
proteína de VIH. En otras realizaciones preferidas, la proteína es
gag, pol, env, gp120, o gp160.
La invención también se refiere a un método para
preparar un gen sintético que codifica una proteína que se expresa
normalmente por células de mamífero. El método incluye identificar
codones no preferidos y menos preferidos en el gen natural que
codifica la proteína y reemplazar al menos el 50% de los codones no
preferidos y menos preferidos por un codón preferido que codifica el
mismo aminoácido que el codón reemplazado.
En algunas circunstancias (por ejemplo, para
permitir la introducción de un sitio de restricción) puede ser
deseable reemplazar un codón no preferido por un codón menos
preferido en lugar de por un codón preferido.
No es necesario reemplazar todos los codones
menos preferidos o no preferidos por codones preferidos. Puede
conseguirse una expresión aumentada incluso con un reemplazo
parcial.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a vectores (incluyendo vectores de expresión) que
comprenden el gen sintético.
Por "vector" se entiende una molécula de
ADN obtenida, por ejemplo, a partir de un plásmido, bacteriófago o
virus de mamífero o de insecto, en el que pueden insertarse o
clonarse fragmentos de ADN. Un vector contendrá uno o más sitios de
restricción únicos y puede replicarse de forma autónoma en un
hospedador u organismo vehículo definido de tal forma que la
secuencia clonada sea reproducible. De esta manera, por "vector de
expresión" se entiende cualquier elemento autónomo capaz de
dirigir la síntesis de una proteína. Estos vectores de expresión de
ADN incluyen plásmidos y virus de mamífero.
La invención también se refiere a fragmentos de
genes sintéticos que codifican una porción deseada de la proteína.
Estos fragmentos génicos sintéticos son similares a los genes
sintéticos de la invención con la excepción de que codifican sólo
una porción de la proteína. Estos fragmentos génicos preferiblemente
codifican al menos 50, 100, 150, o 500 aminoácidos contiguos de la
proteína.
Para construir los genes sintéticos de la
invención puede ser deseable evitar secuencias CpG, ya que estas
secuencias pueden producir silenciamiento génico.
La preferencia codónica presente en el gen de la
envuelta gp120 de VIH también está presente en las proteínas gag y
pol. De esta manera, el reemplazo de una porción de los codones no
preferidos y menos preferidos encontrados en estos genes por codones
preferidos produciría un gen que podría tener un mayor nivel de
expresión. Una gran fracción de los codones presentes en los genes
humanos que codifican el Factor VIII y el Factor IX son codones no
preferidos o codones menos preferidos. El reemplazo de una porción
de estos codones por codones preferidos produciría genes que podrían
tener un mayor nivel de expresión en cultivo de células de mamífero.
Por el contrario, puede ser deseable reemplazar codones preferidos
en un gen natural por codones menos preferidos como medio para
reducir la
expresión.
expresión.
Los trabajos de referencia convencionales que
describen los principios generales de la tecnología de ADN
recombinante incluyen Watson, J.D. et al., Molecular
Biology of the Gene, Volumes I and II, the Benjamin/Cummings
Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell,
J.E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific
American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Old, R.W.,
et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction
to Genetic Engineering, 2ª Ed., University of California Press,
publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T., et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); y
Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et
al., Wiley Press, New York, NY
(1989).
(1989).
La Figura 1 representa la secuencia de la
proteína gp120 sintética (SEC ID Nº: 34) y un gen sintético de gp160
(SEC ID Nº: 35) en la que los codones se han reemplazado por los
encontrados en genes humanos de alta expresión.
La Figura 2 es un dibujo esquemático del gen
gp120 sintético (MN de VIH-1). Las porciones
sombreadas marcadas v1 a v5 indican regiones hipervariables. Los
recuadros negros indican el sitio de unión a CD4. Se muestra un
número limitado de los sitios de restricción únicos: H (Hind3), Nh
(Nhe1), P (Pst1), Na (Nae1), M (Mlu1), R (EcoR1), A (Age1) y No
(Not1). Los fragmentos de ADN sintetizados químicamente que
sirvieron como plantillas de PCR se muestran debajo de la secuencia
de gp120, junto con las localizaciones de los cebadores usados para
su amplificación.
La Figura 3 es una fotografía de los resultados
de ensayos de transfección transitoria usados para medir la
expresión de gp120. Electroforesis en gel de sobrenadantes
inmunoprecipitados de células 293T transfectadas con plásmidos que
expresan gp120 codificada por el aislado IIIB de
VIH-1 (gp120IIIb), por el aislado MN (gp120mn), por
el aislado MN modificado por sustitución del péptido líder endógeno
por el del antígeno CD5 (gp120mnCD5L), o por el gen sintetizado
químicamente que codifica la variante MN con el líder de CDS humanas
(syngp120mn). Los sobrenadantes se recogieron después de un período
de marcaje de 12 horas 60 horas después de la transfección y se
inmunoprecipitaron con proteína de fusión CD4:IgG1 y proteína A
sepharose.
La Figura 4 es un gráfico que representa los
resultados de ensayos ELISA usados para medir los niveles de
proteína en sobrenadantes de células 293T transfectadas de forma
transitoria. Se recogieron sobrenadantes de células 293T
transfectadas con plásmidos que expresaban gp120 codificada por el
aislado IIIB de VIH-1 (gp120 IIIb), por el aislado
MN (gp120mn), por el aislado MN modificado por sustitución del
péptido líder endógeno por el del antígeno CD5 (gp120mn CD5L), o por
el gen sintetizado químicamente que codifica la variante MN con el
líder de CDS humanas (syngp120mn) después de 4 días y se ensayaron
en un ELISA con gp120/CD4 . El nivel de gp120 se expresa en
ng/ml.
La Figura 5, panel A es una fotografía de un gel
que ilustra los resultados de un ensayo de inmunoprecipitación usado
para medir la expresión de la gp120 nativa y sintética en presencia
de rev en trans y RRE en cis. En este experimento se transfectaron
de forma transitoria células 293T por coprecipitación con fosfato
cálcico de 10 \mug de plásmido que expresaba: (A) la secuencia de
gp120MN sintético y RRE en cis, (B) la porción de gp120 de IIIB de
VIH-1, (C) la porción de gp120 de IIIB de
VIH-I y RRE en cis, todos en presencia o ausencia de
expresión de rev. Las construcciones de RRE qp120IIIbRRE y
syngpl20mnRRE se generaron usando un fragmento de RRE Eagl/Hpal
clonado por PCR a partir de un clon proviral HXB2 de
VIH-1. Cada plásmido de expresión de gp120 se
co-transfectó con 10 \mug de ADN plasmídico de
pCMVrev o CDM7. Los sobrenadantes se recogieron 60 horas después de
la transfección, se inmunoprecipitaron con proteína de fusión
CD4:IgG y proteína A agarosa y se procesaron en una
SDS-PAGE reductora al 7%. El tiempo de exposición
del gel se prolongó para permitir la inducción de gp120IIIbrre por
rev que se quería demostrar. La Figura 5, panel B es una exposición
más corta de un experimento similar en el que se
co-transfectó syngp120mnrre con o sin pCMVrev. La
Figura 5 panel C es un diagrama esquemático de las construcciones
usadas en el panel A.
La Figura 6 es una comparación de la secuencia
del gen THY-1 de rata de tipo silvestre (wt) (SEC ID
Nº: 37) y un gen THY-1 sintético de rata (env) (SEC
ID Nº 36) construido por síntesis química y que tenía los codones
más prevalentes encontrados en el gen env de
VIH-1.
La Figura 7 es un diagrama esquemático del gen
THY-1 sintético de rata. El recuadro relleno negro
indica el péptido señal. El recuadro sombreado indica las secuencias
del precursor que dirigen la unión de un anclaje de
fosfatidilinositol glicano. Los sitios de restricción únicos usados
para el montaje de las construcciones de THY-1 están
marcados como H (Hind3), M (Mlu1), S (Sac1) y No (Not1). La posición
de los oligonucleótidos sintéticos empleados en la construcción se
muestra en la parte inferior de la figura.
La Figura 8 es un gráfico que representa los
resultados de un análisis de citometría de flujo. En este
experimento se transfectaron de forma transitoria células 293T con
THY-1 de rata de tipo silvestre (línea oscura),
THY-1 de rata con codones de envuelta (línea clara)
o vector solo (línea de puntos). Las células 293T se transfectaron
con los diferentes plásmidos de expresión por
co-precipitación con fosfato cálcico y se tiñeron
con anticuerpo monoclonal anti-THY-1
de rata OX7 seguido de un anticuerpo policlonal
anti-IgG de ratón conjugado con FITC 3 días después
de la transfección.
La Figura 9, panel A es una fotografía de un gel
que ilustra los resultados del análisis de inmunoprecipitación de
sobrenadantes de células 293T humanas transfectadas con syngp120mn
(A) o una construcción syngp120mn.rTHY-lenv que
tiene el gen rTHY-lenv en la región 3' no traducida
del gen syngp120mn (B). La construcción
syngp120mn.rTHY-lenv se generó insertando un
adaptador Not1 en el sitio Hind3 romo del plásmido
rTHY-lenv. Posteriormente, se clonó un fragmento
Not1 de 0,5 kb que contenía el gen rTHY-lenv en el
sitio Not1 del plásmido syngp120mn y se ensayó para comprobar si
tenía la orientación correcta. Se recogieron sobrenadantes de
células marcadas con 35S 72 horas después de la transfección, se
precipitaron con proteína de fusión CD4:IgG y proteína A agarosa y
se procesaron en una SDS-PAGE reductora al 7%. La
Figura 9, panel B es un diagrama esquemático de las construcciones
usadas en el experimento representado en el panel A de esta
figura.
Se generó una tabla de frecuencia de codones
para el precursor de la envuelta del subtipo LAV de
VIH-1 usando el software creado por el University of
Wisconsin Genetics Computer Group (Grupo de Informática Aplicada a
la Genética de la Universidad de Wisconsin). Los resultados de esta
tabla se contrastan en la Tabla 1 con el patrón de uso de codones
por una colección de genes humanos de alta expresión. Para cualquier
aminoácido codificado por codones degenerados, el codón más
preferido para los genes de alta expresión es diferente del codón
más preferido del precursor de la envuelta de VIH. Además, una regla
sencilla describe el patrón de codones de la envuelta preferidos
dondequiera que se aplique: los codones preferidos maximizan el
número de restos de adenina en el ARN viral. En todos los casos
excepto uno esto significa que el codón en el que la tercera
posición es A, es el usado con más frecuencia. En el caso especial
de la serina, tres codones aportan igualmente un resto A al ARNm;
conjuntamente, estos tres constituyen 85% de los codones usados
realmente en los transcritos de la envuelta. Un ejemplo
particularmente sorprendente de la preferencia de A se encuentra en
la elección de codones para arginina, en la que el triplete AGA
constituye 88% de todos los codones. Además de la preponderancia de
restos A, se observa una preferencia marcada por uridina entre
codones degenerados cuyo tercer resto debe ser una pirimidina.
Finalmente, las inconsistencias entre las variantes usadas con menos
frecuencia pueden explicarse por la observación de que el
dinucleótido CpG está infrarrepresentado; de esta manera, es menos
probable que la tercera posición sea G siempre que la segunda
posición es C, como ocurre en los codones para alanina, prolina,
serina y treonina; y los tripletes CGX para arginina apenas se
usan.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La frecuencia de codones se calculó usando el
programa GCG establecido en el University of Wisconsin Genetics
Computer Group. Los números representan el porcentaje de casos en
los que se usa el codón particular. Las frecuencias de uso de
codones de genes de la envuelta de otros aislados de virus
VIH-1 son comparables y muestran una preferencia
similar.
Para producir un gen gp120 que puede tener una
alta expresión en células de mamífero, se construyó un gen sintético
que codificaba el segmento gp120 de VIH-1
(syngp120mn), basándose en la secuencia del subtipo más común en
Norteamérica, MN de VIH-1 (Shaw et al. 1984;
Gallo et al. 1986). En este gen sintético de gp120, casi
todos los codones nativos se han reemplazado sistemáticamente por
codones usados con más frecuencia en genes humanos de alta expresión
(Fig. 1). Este gen sintético se ensambló a partir de
oligonucleótidos sintetizados químicamente con una longitud de 150 a
200 bases. Si se sintetizan químicamente oligonucleótidos que
exceden de 120 a 150 bases, el porcentaje de producto de longitud
completa puede ser bajo y la inmensa mayoría de material consiste en
oligonucleótidos más cortos. Como estos fragmentos más cortos
inhiben los procedimientos de clonación y de PCR, puede ser muy
difícil usar oligonucleótidos que excedan de una cierta longitud.
Para usar material de síntesis bruto sin purificación previa, se
amplificaron por PCR grupos de oligonucleótidos monocatenarios antes
de la clonación. Los productos de PCR se purificaron en geles de
agarosa y se usaron como plantillas en la siguiente etapa de PCR.
Pudieron co-amplificarse dos fragmentos adyacentes
debido al solapamiento de secuencias al final de cualquier
fragmento. Estos fragmentos, que tenían un tamaño comprendido entre
350 y 400 pb, se subclonaron en un plásmido derivado de pCDM7 que
contenía la secuencia líder de la molécula de superficie CD5 seguida
de un polienlazador Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1. Cada una de las
enzimas de restricción de este polienlazador representa un sitio que
está presente en el extremo 5' o 3' de los fragmentos generados por
PCR. De esta manera, por medio de la subclonación secuencial de cada
uno de los 4 fragmentos largos, se ensambló el gen gp120 entero.
Para cada fragmento se subclonaron de 3 a 6 clones diferentes y se
secuenciaron antes del ensamblaje. En la Fig. 2 se muestra un dibujo
esquemático del método usado para construir la gp120 sintética. La
secuencia del gen gp120 sintético (y un gen gp160 sintético creado
usando la misma estrategia) se presenta en la Fig. 1.
El índice de mutación fue considerable. Las
mutaciones encontradas con más frecuencia fueron deleciones cortas
(de 1 nucleótido) y largas (de hasta 30 nucleótidos). En algunos
casos, fue necesario cambiar partes con adaptadores o piezas
sintéticas de otros subclones sin mutación en esa región particular.
Se realizaron algunas desviaciones de la adhesión estricta al uso de
codones optimizados para acomodar la introducción de sitios de
restricción en el gen resultante con el fin de facilitar el
reemplazo de diversos segmentos (Fig. 2). Estos sitios de
restricción únicos se introdujeron en el gen a intervalos de
aproximadamente 100 pb. La secuencia líder de VIH nativa se cambió
por el péptido líder de alta eficacia del antígeno CD5 humano para
facilitar la secreción. El plásmido usado para la construcción es un
derivado del vector de expresión de mamífero pCDM7 que transcribe el
gen insertado bajo el control de un promotor temprano inmediato
fuerte de CMV humano.
Para comparar las secuencias codificantes
sintéticas y de tipo silvestre de gp120, la secuencia codificante
sintética de gp120 se insertó en un vector de expresión de mamífero
y se ensayó en ensayos de transfección transitorios. Como controles
para excluir variaciones en los niveles de expresión entre
diferentes aislados de virus y artefactos inducidos por distintas
secuencias líder se usaron varios genes gp120 nativos diferentes. La
construcción gp120 VIH IIIb usada como control se generó por PCR
usando un fragmento de la envuelta Sal1/Xho1 HXB2 de
VIH-1 como plantilla. Para excluir mutaciones
inducidas por PCR, un fragmento Kpn1/Ear1 que contenía
aproximadamente 1,2 kb del gen se cambió por la secuencia respectiva
del clon proviral. Las construcciones de gp120mn de tipo silvestre
usadas como controles se clonaron por PCR a partir de células C8166
infectadas con MN de VIH-1. (AIDS Repository,
Rockville, MD) y expresaron gp120 con una envuelta nativa o con una
secuencia líder de CD5. Como no se disponía de clones provirales en
este caso, se ensayaron dos clones de cada construcción para evitar
artefactos de PCR. Para determinar
semi-cuantitativamente la cantidad de gp120
secretada, se inmunoprecipitaron sobrenadantes de células 293T
transfectadas de forma transitoria por
co-precipitación con fosfato cálcico con proteína de
fusión soluble CD4:inmunoglobulina y proteína A sepharose.
Los resultados de este análisis (Fig. 3)
demuestran que el producto génico sintético se expresa a un nivel
muy elevado en comparación con el de los controles de gp120 nativo.
El peso molecular del gen gp120 sintético fue comparable al de las
proteínas de control (Fig. 3) y parecía estar en el intervalo de 100
a 110 kd. La migración ligeramente más rápida puede explicarse por
el hecho de que en algunas líneas de células tumorales tales como
293T, la glicosilación no se completa o está alterada en alguna
medida.
Para comparar la expresión de forma más precisa,
se cuantificaron los niveles de proteína gp120 usando un ELISA de
gp120 con CD4 en la fase inmóvil. Este análisis demuestra (Fig. 4)
que los datos del ELISA eran comparables a los datos de
inmunoprecipitación, con una concentración de gp120 de
aproximadamente 125 ng/ml para el gen gp120 sintético, y menos del
límite basal (5 ng/ml) para todos los genes gp120 nativos. De esta
manera, la expresión del gen gp120 sintético parece ser al menos un
orden de magnitud superior que los genes gp120 de tipo silvestre. En
el experimento mostrado el aumento fue de al menos 25 veces.
Como rev parece ejercer su efecto en varias
etapas en la expresión de un transcrito viral, se ensayó el posible
papel de efectos no traduccionales en la mejora de la expresión del
gen gp120 sintético. En primer lugar, para descartar la posibilidad
de que los elementos de señales negativas que conferían una mayor
degradación de ARNm o retención de ácido nucleico se eliminaran
cambiando la secuencia de nucleótidos, se ensayaron los niveles de
ARNm citoplásmico. Se preparó ARN citoplásmico por lisis con NP40 de
células 293T transfectadas de forma transitoria y la posterior
eliminación de los núcleos por centrifugación. Posteriormente se
preparó ARN citoplásmico a partir de los lisados por múltiples
extracciones con fenol y precipitación, se aplicaron sobre
nitrocelulosa usando un aparato slot blot y finalmente se hibridó
con una sonda específica para la envuelta.
En resumen, se aisló ARNm citoplásmico de
células 293 transfectadas con CDM&, gp120 IIIB, o syngp120 36
horas después de la transfección. El ARN citoplásmico de células
Hela infectadas con virus vaccinia de tipo silvestre o virus
recombinante que expresaba gp120 IIIb o el gen gp120 sintético
estaba bajo el control del promotor 7.5 y se aisló 16 horas después
de la infección. Se aplicaron cantidades iguales sobre nitrocelulosa
usando un dispositivo slot blot y se hibridaron con fragmentos de
gp120IIIb y syngp120 de 1,5 kb marcados aleatoriamente o
beta-actina humana. Los niveles de expresión de ARN
se cuantificaron explorando las membranas hibridadas con un
phosphoimager. Los procedimientos usados se describen con mayor
detalle más adelante.
Este experimento demostró que no había ninguna
diferencia significativa en los niveles de ARNm de las células
transfectadas con el gen gp120 nativo o sintético. De hecho, en
algunos experimentos el nivel de ARNm citoplásmico del gen gp120
sintético era incluso menor que el del gen gp120 nativo.
Estos datos se confirmaron midiendo la expresión
de virus vaccinia recombinantes. Se infectaron células 293 o células
Hela humanas con virus vaccinia que expresaba gp120 IIIb de tipo
silvestre o syngp120mn a una multiplicidad de infección de al menos
10. Los sobrenadantes se recogieron 24 horas después de la infección
y se inmunoprecipitaron con proteína de fusión CD4:inmunoglobina y
proteína A sepharose. Los procedimientos usados en este experimento
se describen con mayor detalle más adelante.
Este experimento demostró que se observaba una
mayor expresión del gen sintético cuando el producto del gen
endógeno y el producto del gen sintético se expresaban en
recombinantes de virus vaccinia bajo el control del promotor 7.5 k
mixto temprano y tardío fuerte. Como los ARNm del virus vaccinia se
transcriben y traducen en el citoplasma, el aumento de la expresión
del gen sintético de la envuelta en este experimento no puede
atribuirse a una mejor exportación desde el núcleo. Este experimento
se repitió en dos tipos de células humanas adicionales, la línea
celular de cáncer de riñón 293 y células HeLa. Como ocurre con las
células 293T transfectadas, los niveles de ARNm fueron similares en
células 293 infectadas con cualquier virus vaccinia
recombinante.
Como parece ser que el uso de codones tiene un
impacto significativo sobre la expresión en células de mamífero, se
examinó la frecuencia de codones en los genes de la envuelta de otro
retrovirus. Este estudio no encontró un patrón claro de preferencia
de codones entre los retrovirus en general. Sin embargo, si se
analizaran por separado virus del género lentivirus, al que
pertenece VIH-1, se encontrarían preferencias del
uso de codones casi idénticas a las de VIH-1. Se
preparó una tabla de frecuencia de codones a partir de las
glicoproteínas de la envuelta de una diversidad de retrovirus
(predominantemente de tipo C) excluyendo los lentivirus, y se
comparó con una tabla de frecuencia de codones creada a partir de
las secuencias de la envuelta de cuatro lentivirus no muy
relacionados con VIH-1 (virus de la encefalitis y
artritis caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la
inmunodeficiencia felina y virus visna) (Tabla 2). El patrón de uso
de codones para los lentivirus es sorprendentemente similar al de
VIH-1, en todos los casos excepto uno, el codón
preferido para VIH-1 es el mismo que el codón
preferido para los otros lentivirus. La excepción es prolina, que se
codifica por CCT en 41% de los restos de la envuelta lentiviral
no-VIH, y por CCA en 40% de los restos, una
situación que refleja también claramente una preferencia
significativa por el triplete que termina en A. El patrón de uso de
codones por las proteínas de la envuelta no lentivirales no muestra
una predominancia similar de restos A, y tampoco está tan sesgado
hacia los restos de tercera posición C y G como el uso de codones
para genes humanos de alta expresión. En general, los retrovirus no
lentivirales parecen explotar los diferentes codones más
equitativamente, un patrón que comparten con genes humanos menos
expresados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La frecuencia de codones se calculó usando el
programa GCG establecido por el University of Wisconsin Genetics
Computer Group. Los números representan el porcentaje en el que se
usa un codón particular. El uso de codones de retrovirus no
lentivirales se recopiló a partir de las secuencias de precursores
de la envuelta del virus de la leucemia bovina, el virus de la
leucemia felina, el virus de la leucemia de células T humanas de
tipo I, el virus linfotrópico de células T humana de tipo II, el
aislado que forma focos de células de visón del virus de la leucemia
murina (MuLV), el aislado que forma focos de bazo de Rauscher, el
aislado 10A1, el aislado anfotrópico 4070A y el aislado del virus de
la leucemia mieloproliferativa, y del virus de la leucemia de rata,
el virus del sarcoma de simio, el virus de la leucemia de células T
de simio, el retrovirus leucemogénico T1223/B y el virus de la
leucemia del gibón. Las tablas de frecuencia de codones para los
lentivirus no VIH, no VIS se recopilaron a partir de las secuencias
de precursores de la envuelta para el virus de la encefalitis y
artritis caprina, el virus de la anemia infecciosa equina, el virus
de la inmunodeficiencia felina y el virus visna.
Además de la prevalencia de codones que
contenían A, los codones lentivirales se adhieren al patrón de VIH
de infrarrepresentación de CpG fuerte, de forma que la tercera
posición para alanina, prolina, serina y treonina raramente es G.
Los tripletes de la envuelta retroviral muestran una
infrarrepresentación similar, pero menos pronunciada de CpG. La
diferencia más evidente entre los lentivirus y otros retrovirus con
respecto a la prevalencia de CpG se basa en el uso de la variante
CGX de tripletes de arginina, que se representa de una forma
razonablemente frecuente entre las secuencias codificantes de la
envuelta retroviral, pero casi nunca está presente entre las
secuencias de lentivirus comparables.
Para examinar si la regulación por rev está
relacionada con el uso de codones de VIH-1, se
investigó la influencia de rev sobre la expresión tanto del gen
nativo como del gen sintético. Como la regulación por rev requiere
el sitio de unión a rev RRE en cis, se realizaron construcciones en
las que este sitio de unión se clonó en la región 3' no traducida
tanto del gen nativo como del gen sintético. Estos plásmidos se
co-transfectaron con rev o un plásmido de control en
trans en células 293T, y los niveles de expresión de gp120 en los
sobrenadantes se midieron semicuantitativamente por
inmunoprecipitación. Los procedimientos usados en este experimento
se describen con mayor detalle más adelante.
Como se muestra en la Fig. 5, paneles A y B, rev
regula positivamente el gen gp120 nativo, pero no tiene ningún
efecto sobre la expresión del gen gp120 sintético. De esta manera,
la acción de rev no es evidente en un sustrato que carece de la
secuencia codificante de secuencias de la envuelta viral
endógenas.
El experimento descrito anteriormente sugiere
que, efectivamente, para la regulación de rev tienen que estar
presentes "secuencias de la envuelta". Para ensayar esta
hipótesis, se preparó una versión sintética del gen que codificaba
la proteína de la superficie celular pequeña, típicamente de alta
expresión, antígeno THY-1 de rata. La versión
sintética del gen THY-1 de rata se diseñó para tener
un uso de codones similar al de gp120 de VIH. Para diseñar este gen
sintético se evitaron secuencias AUUUA, que están asociadas con la
inestabilidad del ARNm. Además, se introdujeron dos sitios de
restricción para simplificar la manipulación del gen resultante
(Fig. 6). Este gen sintético, con el uso de codones de la envuelta
de VIH (rTHY-1env) se generó usando tres
oligonucleótidos de 150 a 170 unidades (Fig. 7). A diferencia del
gen syngp120mn, los productos de PCR se clonaron directamente y se
ensamblaron en pUC12, y posteriormente se introdujeron por clonación
en pCDM7.
Los niveles de expresión de
rTHY-1 nativo y rTHY-1 con los
codones de la envuelta de VIH se cuantificaron por
inmunofluorescencia de células 293T transfectadas de forma
transitoria. La Fig. 8 demuestra que la expresión del gen
THY-1 nativo es casi dos órdenes de magnitud
superior al nivel basal de las células transfectadas de control
(pCDM7). Por el contrario, la expresión del THY-1 de
rata sintético es sustancialmente menor que la del gen nativo (como
se muestra por el desplazamiento del pico hacia un número de canal
inferior).
Para demostrar que no se introdujeron sin querer
elementos de secuencia negativos que promovieran la degradación del
ARNm, se generó una construcción en la que se clonó el gen
rTHY-lenv en el extremo 3' del gen gp120 sintético
(Fig. 9, panel B). En este experimento, se transfectaron células
293T con el gen syngp120mn o el gen de fusión
syngp120/THY-1 de rata env
(syngp120mn.rTHY-lenv). La expresión se midió por
inmunoprecipitación con proteína de fusión CD4:IgG y proteína A
agarosa. Los procedimientos usados en este experimento se describen
con más detalle más adelante.
Como el gen gp120 sintético tiene un codón de
parada UAG, rTHY-1env no se traduce a partir de este
transcrito. Si estuvieran presentes en la secuencia elementos
negativos que confirieran una mayor degradación, los niveles de
proteína gp120 expresados a partir de esta construcción deberían
estar reducidos en comparación con la construcción syngp120mn sin
rTHY-1env. La Fig. 9, panel A, demuestra que la
expresión de las dos construcciones es similar, lo que indica que la
baja expresión debe estar asociada a la traducción.
Para explorar si rev puede regular la expresión
de un gen THY-1 de rata que tiene codones env, se
realizó una construcción con un sitio de unión a rev en el extremo
3' de la fase de lectura abierta de rTHYlenv. Para medir la
sensibilidad a rev de una construcción THY de
rata-lenv que tenía a RRE 3', se
co-transfectaron células 293T humanas con THY de
rata-lenvrre y CDM7 o pCMVrev. 60 horas después de
la transfección las células se separaron con EDTA 1 mM en PBS y se
tiñeron con el anticuerpo monoclonal de ratón
anti-rTHY-1 OX-7 y
un anticuerpo secundario conjugado con FITC. La intensidad de
fluorescencia se midió usando un citofluorómetro EPICS XL. Estos
procedimientos se describen con más detalle más adelante.
En experimentos repetidos, se detectó un ligero
aumento de la expresión de rTHY-lenv si se
co-transfectaba rev con el gen
rTHY-lenv. Para aumentar adicionalmente la
sensibilidad del sistema de ensayo, se generó una construcción que
expresaba una versión secretada de rTHY-lenv. Esta
construcción produciría datos más fiables debido a que la cantidad
acumulada de proteína secretada en el sobrenadante refleja el
resultado de producción de proteína durante un periodo prolongado, a
diferencia de la proteína expresada en la superficie que parece
reflejar con más precisión el porcentaje de producción actual. Se
preparó un gen capaz de expresar una forma secretada por PCR usando
cebadores directos e inversos que hibridaban en posición 3' de la
secuencia líder endógena y en posición 5' del motivo de secuencia
requerido para el anclaje de fosfatidilinositol glicano,
respectivamente. El producto de PCR se clonó en un plásmido que ya
contenía una secuencia líder de CD5, generando de esta manera una
construcción en la que se ha delecionado el anclaje
de la membrana y la secuencia líder se ha cambiado por un péptido líder heterólogo (y probablemente más eficaz).
de la membrana y la secuencia líder se ha cambiado por un péptido líder heterólogo (y probablemente más eficaz).
La sensibilidad a rev de la forma secretada de
THY de rata-lenv se midió por inmunoprecipitación de
sobrenadantes de células 293T humanas
co-transfectadas con un plásmido que expresaba una
forma secretada de THY de rata-lenv y la secuencia
RRE en cis (rTHY-lenvPI-rre) y CDM7
o pCMVrev. La construcción
rTHY-lenvPI-RRE se preparó por PCR
usando el oligonucleótido cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac como
cebador directo y cgcggatcccttgtattttgtactaata a como cebador
inverso y la construcción rTHY-lenv sintética como
plantilla. Después de la digestión con Nhe1 y Not1, el fragmento de
PCR se clonó en un plásmido que contenía secuencias líder de CD5 y
RRE. Se recogieron los sobrenadantes de las células marcadas con
^{35}S 72 horas después de la transfección, se precipitaron con un
anticuerpo monoclonal de ratón OX7 contra rTHY-1 y
anti-IgG de ratón sepharose, y se procesaron en una
SDS-PAGE reductora al 12%.
En este experimento, la inducción de
rTHY-1env por rev fue mucho más prominente y clara
que en el experimento descrito anteriormente y sugiere fuertemente
que rev puede regular la traducción de transcritos que se reprimen
por codones de bajo uso.
Para ensayar si los codones de bajo uso deben
estar presentes a lo largo de toda la secuencia codificante o si es
suficiente una región corta para conferir sensibilidad a rev, se
generó una proteína de fusión
rTHY-lenv:inmunoglobulina. En esta construcción, el
gen rTHY-lenv (sin el motivo de secuencia
responsable para el anclaje de fosfatidilinositol glicano) está
unido a la bisagra de IgG1 humana, dominios CH2 y CH3. Esta
construcción se generó por PCR de anclaje usando cebadores con
sitios de restricción Nhe1 y BamHI y rTHY-lenv como
plantilla. El fragmento de PCR se clonó en un plásmido que contenía
la secuencia líder de la molécula de superficie CD5 y la bisagra,
partes CH2 y CH3 de la inmunoglobulina IgG1. Un fragmento Hind3/Eagl
que contenía el inserto rTHY-lenveg1 se clonó
posteriormente en un plásmido derivado de pCDM7 con la secuencia de
RRE.
Para medir la respuesta del gen de fusión
rTHY-lenv/inmunoglobulina
(rTHY-lenveglrre) a rev, se
co-transfectaron células 293T humanas con
rTHY-lenveglrre y pCDM7 o pCMVrev. La construcción
rTHY-lenveglrre se obtuvo por PCR de anclaje usando
cebadores directo e inverso con sitios de restricción Nhe1 y BamH1
respectivamente. El fragmento de PCR se clonó en un plásmido que
contenía un líder de CDR y una bisagra de IgG1 humana, dominios CH2
y CH3. Los sobrenadantes de las células marcadas con ^{35}S se
recogieron 72 horas después de la transfección, se precipitaron con
un anticuerpo monoclonal de ratón OX7 contra rTHY-1
e IgG anti-ratón sepharose, y se procesaron en una
SDS-PAGE reductora al 12%. Los procedimientos usados
se describen con mayor detalle más adelante.
Como ocurre con el producto del gen
rTHY-lenvPI-, esta proteína de fusión
rTHY-lenv/inmunoglobulina se secreta en el
sobrenadante. De esta manera, este gen debe responder a la inducción
por rev. Sin embargo, a diferencia de rTHY-lenvPI-,
la co-transfección de rev en trans no indujo o
indujo únicamente un aumento insignificante de la expresión de
rTHY-1enveg1.
La expresión de la proteína de fusión
rTHY-1:inmunoglobulina con codones nativos de
rTHY-1 o de la envuelta de VIH se midió por
inmunoprecipitación. En resumen, se transfectaron células 293T
humanas con rTHY-lenveg1 (codones env) o
rTHY-1wteg1 (codones nativos). La construcción
rTHY-1wteg1 se generó de una manera similar a la
usada para la construcción rTHY-lenvegl, con la
excepción de que como plantilla se usó un plásmido que contenía el
gen rTHY-1 nativo. Los sobrenadantes de las células
marcadas con ^{35}S se recogieron 72 horas después de la
transfección, se precipitaron con un anticuerpo monoclonal de ratón
OX7 contra rTHY-1 y anti-IgG de
ratón sepharose, y se procesaron en una SDS-PAGE
reductora al 12%. Los procedimientos usados en este experimento se
describen con mayor detalle más adelante.
Los niveles de expresión de
rTHY-lenvegl se redujeron en comparación con una
construcción similar con rTHY-1 de tipo silvestre
como molécula de fusión, pero aún eran considerablemente mayores que
rTHY-lenv. Por consiguiente, las dos partes de la
proteína de fusión influyeron sobre los niveles de expresión. La
adición de rTHY-lenv no restringió la expresión a un
nivel igual al visto para rTHY-lenv solo. De esta
manera, la regulación por rev parece ser ineficaz si la expresión de
la proteína no se suprime casi completamente.
La comparación directa entre la frecuencia del
uso de codones de la envuelta de VIH y genes humanos de alta
expresión revela una diferencia sorprendente para los veinte
aminoácidos. Una medida sencilla del significado estadístico de esta
preferencia de codones es el descubrimiento de que entre los nueve
aminoácidos con degeneración doble de codones, el tercer resto
preferido es A o U en todos ellos. La probabilidad de que las nueve
elecciones de parejas equiprobables sea la misma es de
aproximadamente 0,004, y por lo tanto por cualquier medición
convencional la elección del tercer resto no puede considerarse
aleatoria. Se encuentran pruebas adicionales de una preferencia de
codones sesgada entre los codones más degenerados, donde puede verse
una fuerte selección de tripletes que llevan adenina. Esto contrasta
con el patrón para genes de alta expresión, que favorece a los
codones que llevan C, o menos comúnmente G, en la tercera posición
de codones con degeneración triple o mayor.
El cambio sistemático de codones nativos por
codones de genes humanos de alta expresión aumentó espectacularmente
la expresión de gp120. Un análisis cuantitativo por ELISA demostró
que la expresión del gen sintético era al menos 25 veces mayor en
comparación con la proteína gp120 nativa después de la transfección
transitoria en células 293 humanas. Los niveles de concentración en
el experimento ELISA mostrado fueron bastante bajos. Como se usó un
ELISA para la cuantificación que se basa en la unión de gp120 a CD4,
sólo se detectó material nativo no desnaturalizado. Esto puede
explicar la baja expresión que se observa. La medición de los
niveles citoplásmicos de ARNm demostraron que la diferencia en la
expresión de proteínas se debe a diferencias de traducción y no a la
estabilidad del ARNm.
Los retrovirus en general no muestran una
preferencia similar hacia A y T como se encuentra para VIH. Pero si
esta familia se dividiera en dos subgrupos, lentivirus y retrovirus
no lentivirales, se detectaría una preferencia similar por A y,
menos frecuente, por T, en la tercera posición del codón para
lentivirus. De esta manera, las pruebas disponibles sugieren que los
lentivirus retienen un patrón característico de codones de envuelta
que no es debido a una ventaja intrínseca para la transcripción
inversa o replicación de estos restos, sino más bien por alguna
razón peculiar a la fisiología de esa clase de virus. La diferencia
principal entre lentivirus y retrovirus no complejos son genes
adicionales reguladores y no esencialmente auxiliares presentes en
los lentivirus, como ya se ha mencionado. De esta manera, una
explicación sencilla para la restricción de una expresión de la
envuelta podría ser que en ella se basa un mecanismo regulador
importante de una de estas moléculas adicionales. De hecho, se sabe
que una de estas proteínas, rev, probablemente tiene homólogos en
todos los lentivirus. Este uso de codones en el ARNm viral se usa
para crear una clase de transcritos que es susceptible a la acción
estimuladora de rev. Esta hipótesis se demostró usando una
estrategia similar a la anterior, pero esta vez el uso de codones
cambió a la dirección inversa. El uso de codones de un gen celular
de alta expresión se sustituyó con los codones usados con más
frecuencia en la envuelta de VIH. Como se asumía, los niveles de
expresión fueron considerablemente menores en comparación con la
molécula nativa, casi dos órdenes de magnitud cuando se analizaron
por inmunofluorescencia de la molécula expresada en la superficie
(véase 4.7). Si rev se co-expresaba en trans y el
elemento RRE estaba presente en cis, únicamente se encontró una
ligera inducción para la molécula de superficie. Sin embargo, si
THY-1 se expresaba como una molécula secretada, la
reducción por rev era mucho más prominente, confirmando la hipótesis
anterior. Esto probablemente puede explicarse por una acumulación de
proteína secretada en el sobrenadante, lo cual amplifica
considerablemente el efecto de rev. Si rev sólo induce un pequeño
aumento para moléculas de superficie en general, la inducción de la
envuelta de VIH por rev no puede tener el objetivo de una mayor
abundancia en la superficie, sino más bien un mayor nivel de gp160
intracelular. Está muy poco claro en este momento por qué ocurriría
esto.
Para ensayar si pequeños elementos subtotales de
un gen son suficientes para restringir la expresión y hacer que sea
dependiente de rev, se generaron proteínas de fusión
rTHY1env:immunoglobulin en las que sólo aproximadamente un tercio
del gen total tenía el uso de codones de la envuelta. Los niveles de
expresión de esta construcción estaban en un nivel intermedio,
indicando que el elemento de secuencia negativo para
rTHY-lenv no es dominante en la parte de
inmunoglobulina. Esta proteína de fusión no respondía a rev o sólo
lo hacía ligeramente, indicando que sólo los genes reprimidos casi
completamente pueden responder a rev.
Otro rasgo característico que se encontró en las
tablas de frecuencia de codones es una infrarrepresentación
sorprendente de tripletes CpG. En un estudio comparativo del uso de
codones en E. coli, levadura, drosophila y primates, se
demostró que en un alto número de genes de primate analizados, los 8
codones menos usados contenían todos los codones con la secuencia
dinucleotídica CpG. También se encontró la ausencia de codones que
contenían este motivo dinucleotídico en la secuencia de otros
retrovirus. Parece convincente que la razón de la
infrarrepresentación de tripletes que llevan CpG tenga algo que ver
con la ausencia de silenciamiento génico por metilación de citosinas
de CpG. El número esperado de dinucleótidos CpG para VIH en conjunto
es aproximadamente un quinto del esperado basándose en la
composición de bases. Esto podría indicar que se restaura la
posibilidad de una expresión elevada y que el gen efectivamente
tiene que tener una alta expresión en algún punto durante la
patogénesis viral.
Los resultados presentados aquí indican
claramente que la preferencia de codones tiene un efecto severo
sobre los niveles de proteínas, y sugiere que el alargamiento
traduccional está controlando la expresión de genes de mamífero. Sin
embargo, pueden intervenir otros factores. En primer lugar, la
abundancia de ARNm no cargados máximamente en células eucariotas
indica que la iniciación es limitante de la velocidad para la
traducción al menos en algunos casos, ya que de lo contrario todos
los transcritos estarían completamente cubiertos por los ribosomas.
Además, si el mecanismo fuera la parada de los ribosomas y la
posterior degradación de ARNm, es muy probable que la supresión por
codones raros no se invirtiera por ningún mecanismo regulador tal
como el presentado en este documento. Una posible explicación de la
influencia tanto de la iniciación como del alargamiento de la
actividad traduccional es que la velocidad de iniciación, o el
acceso a los ribosomas, se controla en parte por claves distribuidas
a lo largo del ARN, de tal manera que los codones lentivirales
predisponen al ARN a acumularse en un grupo de ARN iniciados
deficientemente. Sin embargo, esta limitación no necesariamente es
cinética; por ejemplo, la elección de codones podría influir sobre
la probabilidad de que un producto de la traducción dado, una vez
iniciado, se complete de manera apropiada. Con este mecanismo, la
abundancia de codones menos preferidos provocaría una probabilidad
acumulativa significativa de incapacidad de completar la cadena
polipeptídica naciente. El ARN retenido entonces se prestaría a una
velocidad de iniciación mejorada por la acción de rev. Como los
restos de adenina son abundantes en transcritos que responden a rev,
es posible que la metilación de adenina del ARN medie esta supresión
de la traducción.
En los experimentos descritos anteriormente se
usaron los siguientes procedimientos.
Los análisis de la secuencia emplearon el
software desarrollado por el University of Wisconsin Computer Group
(grupo de informática de la Universidad de Wisconsin.
Las construcciones de plásmidos emplearon los
siguientes métodos. Se digirieron vectores y el ADN de inserción a
una concentración de 0,5 \mug/10 \mul en el tampón de
restricción apropiado durante 1-4 horas (volumen de
reacción total aproximadamente 30 \mul). El vector digerido se
trató con 10% (v/v) de fosfatasa alcalina de intestino de ternero a
una concentración de 1 \mug/ml durante 30 min antes de la
electroforesis en gel. Los productos de digestión tanto del vector
como del inserto (de 5 a 10 \mul de cada uno) se procesaron en un
gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% con tampón TAE. Los
cortes de gel que contenían bandas de interés se transfirieron a un
tubo de reacción de 1,5 ml, se fundieron a 65ºC y se añadieron
directamente a la unión sin retirar la agarosa. Los ligamientos se
realizaron típicamente en un volumen total de 25 \mul en 1x Tampón
Bajo 1x Adiciones de Ligamiento con 200-400 U de
ligasa, 1 \mul de vector y 4 \mul de inserto. Cuando fue
necesario, los extremos salientes 5' se rellenaron añadiendo 1/10
del volumen de dNTP 250 \muM y 2-5 U de polimerasa
de Klenow a los productos de digestión extraídos con fenol o
inactivados por calor e incubando durante aproximadamente 20 minutos
a temperatura ambiente. Cuando fue necesario, los extremos 3'
salientes se rellenaron añadiendo 1/10 del volumen de dNTP 2,5 mM y
5-10 U de ADN polimerasa de T4 a los productos de
digestión extraídos con fenol o inactivados con calor, seguido de
incubación a 37ºC durante 30 min. En estas reacciones se usaron los
siguientes tampones: 10x tampón Bajo (Tris HCl 60 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 60 mM, NaCl 50 mM, BSA a 4 mg/ml,
\beta-mercaptoetanol 70 mM, NaN_{3} al 0,02%);
10x tampón Medio (Tris HCl 60 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 60 mM, NaCl 50
mM, BSA a 4 mg/ml, \beta-mercaptoetanol 70 mM,
NaN_{3} al 0,02%); 10x tampón Alto (Tris HCl 60 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 60 mM, NaCl 50 mM, BSA a 4 mg/ml,
\beta-mercaptoetanol 70 mM, NaN_{3} al 0,02%);
10x Adiciones de ligamiento (ATP 1 mM, DTT 20 mM, BSA a 1 mg/ml,
espermidina 10 mM); 50x TAE (Tris acetato 2 M, EDTA 50 mM).
\newpage
Se produjeron oligonucleótidos en un
sintetizador Milligen 8750 (Millipore). Las columnas se eluyeron con
1 ml de hidróxido amónico al 30% y los oligonucleótidos eluidos se
desbloquearon a 55ºC durante un periodo de 6 a 12 horas. Después del
desbloqueo, se precipitaron 150 \mul de oligonucleótido con 10
veces el volumen de n-butanol insaturado en tubos de
reacción de 1,5 ml, seguido de centrifugación a 15.000 rpm en una
microcentrífuga. El sedimento se lavó con etanol al 70% y se
resuspendió en 50 \mul de H_{2}O. La concentración se determinó
midiendo la densidad óptica a 260 nm en una dilución de 1:333 (1
DO_{260} = 30 \mug/ml).
Para construir el gen gp120 sintético se usaron
los siguientes oligonucleótidos (todas las secuencias mostradas en
este texto están en la dirección 5' a 3').
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Para la construcción del gen THY de
rata-lenv se usaron los siguientes
oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se usaron oligonucleótidos solapantes cortos de
15 a 25 unidades que hibridaban por los dos extremos para amplificar
los oligonucleótidos largos por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Las condiciones típicas de la PCR fueron: 35 ciclos,
temperatura de hibridación 55ºC, tiempo de extensión 0,2 seg. Los
productos de la PCR se purificaron en gel, se extrajeron con fenol y
se usaron en una PCR posterior para generar fragmentos de mayor
tamaño que constaban de dos fragmentos pequeños adyacentes. Estos
fragmentos de mayor tamaño se clonaron en un plásmido derivado de
CDM7 que contenía una secuencia líder de la molécula de superficie
CD5 seguido de un polienlazador Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1.
En estas reacciones se usaron las siguientes
soluciones: 10x tampón PCR (KCl 500 mM, Tris HCl 100 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 8 mM, cada dNTP 2 mM). El tampón final se complementó con
DMSO al 10% para aumentar la fidelidad de la Taq polimerasa.
Las bacterias transformadas se cultivaron en 3
ml de cultivos LB durante más de 6 horas o durante una noche. Se
vertieron aproximadamente 1,5 ml de cada cultivo en tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron durante 20 segundos para
sedimentar las células y se resuspendieron en 200 \mul de solución
I. Posteriormente, se añadieron 400 \mul de solución II y 300
\mul de solución III. Los tubos de microcentrífuga se taparon, se
mezclaron y se centrifugaron durante > 30 seg. Los sobrenadantes
se transfirieron a tubos limpios y se extrajeron con fenol una vez.
El ADN se precipitó rellenando los tubos con isopropanol, mezclando
y centrifugando en una microcentrífuga durante > 2 min. Los
sedimentos se aclararon en etanol al 70% y se resuspendieron en 50
\mul de dH20 que contenía 10 \mul de RNAsa A. En estos
procedimientos se usaron los siguientes medios y soluciones: medio
LB (NaCl al 1,0%, extracto de levadura al 0,5%, triptón al 1,0%);
solución I (EDTA 10 mM pH 8,0); solución II (NaOH 0,2 M, SDS al
1,0%); solución III (KOAc 2,5 M, ácido acético glacial 2,5 M); fenol
(pH ajustado a 6,0, recubierto con TE); TE (Tris HCl 10 mM, pH 7,5,
EDTA 1 mM, pH 8,0).
Se cultivaron cultivos de un litro de bacterias
transformadas durante 24 a 26 horas (MC1061p3 transformada con
derivados de pCDM) o durante 12 a 16 horas (MC1061 transformada con
derivados de pUC) a 37ºC en medio de bacterias M9 (derivados de
pCDM) o LB (derivados de pUC). Las bacterias se centrifugaron en
frascos de 1 litro usando una centrífuga Beckman J6 a 4.200 rpm
durante 20 min. El sedimento se resuspendió en 40 ml de solución I.
Posteriormente, se añadieron 80 ml de solución II y 40 ml de
solución III y los frascos se agitaron semivigorosamente hasta que
se formaron bloques con un tamaño de 2 a 3 mm. El frasco se
centrifugó a 4.200 rpm durante 5 min y el sobrenadante se vertió a
través de una estopilla en un frasco de 250 ml. Se añadió
isopropanol a la parte superior y el frasco se centrifugó a 4.200
rpm durante 10 min. El sedimento se resuspendió en 4,1 ml de
solución I y se añadió a 4,5 g de cloruro de cesio, 0,3 ml de
bromuro de etidio a 10 mg/ml y 0,1 ml de solución de Triton X100 al
1%. Los tubos se centrifugaron en una centrífuga de alta velocidad
Beckman J2 a 10.000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se transfirió
a tubos de ultracentrífuga Beckman Quick Seal, que después se
cerraron herméticamente y se centrifugaron en una ultracentrífuga
Beckman usando un rotor de ángulo fijo NVT90 a 80.000 rpm durante
> 2,5 horas. La banda se extrajo por luz visible usando una
jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 20. Al material extraído se
le añadió un volumen igual de dH_{2}O. El ADN se extrajo una vez
con n-butanol saturado con cloruro sódico 1 M,
seguido de la adición de un volumen igual de acetato amónico 10
M/EDTA 1 mM. El material se vertió en un tubo de resorte de 13 ml
que después se rellenó hasta arriba con etanol absoluto, se mezcló y
se centrifugó en una centrífuga Beckman J2 a 10.000 rpm durante 10
min. El sedimento se aclaró con etanol al 70% y se resuspendió en
0,5 a 1 ml de H_{2}O. La concentración de ADN se determinó
midiendo la densidad óptica a 260 nm en una dilución de 1:200 (1
DO_{260} = 50 \mug/ml).
En estos procedimientos se usaron los siguientes
medios y tampones: medio bacteriano M9 (10 g de sales M9, 10 g de
casaminoácidos (hidrolizados), 10 ml de adiciones de M9, 7,5
\mug/ml de tetraciclina (500 \mul de una solución madre a una
concentración de 15 mg/ml), 12,5 \mug/ml de ampicilina (125 \mul
de una solución madre a una concentración de 10 mg/ml); adiciones de
M9 (CaCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 100 mM, tiamina a 200 \mug/ml,
glicerol al 70%); medio LB (NaCl al 1,0%, extracto de levadura al
0,5%, triptón al 1,0%); solución I (EDTA 10 mM pH 8,0); solución II
(NaOH 0,2 M, SDS al 1,0%); Solución III (KOAc 2,5 M, HOAc 2,5 M)
Los genes sintéticos se secuenciaron por el
método de didesoxinucleótido de Sanger. En resumen, se
desnaturalizaron de 20 a 50 \mug de ADN plasmídico bicatenario en
NaOH 0,5 M durante 5 minutos. Posteriormente, el ADN se precipitó
con 1/10 de volumen de acetato sódico (pH 5,2) y 2 volúmenes de
etanol y se centrifugó durante 5 min. El sedimento se lavó con
etanol al 70% y se resuspendió a una concentración de 1
\mug/\mul. La reacción de hibridación se realizó con 4 \mug de
ADN de plantilla y 40 ng de cebador en 1x tampón de hibridación en
un volumen final de 10 \mul. La reacción se calentó a 65ºC y se
enfrió lentamente a 37ºC. En un tubo separado, se añadieron para
cada reacción 1 \mul de DTT 0,1 M, 2 \mul de mezcla de marcaje,
0,75 \mul de dH_{2}O, 1 \mul de [^{35}S] dATP (10 \muCi) y
0,25 \mul de Sequenase™ (12 U/\mul). A cada tubo de
cebador-plantilla hibridados se le añadieron cinco
\mul de esta mezcla y los tubos se incubaron durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Para cada reacción de marcaje, se añadieron
2,5 \mul de cada una de las 4 mezclas de terminación en una placa
Terasaki y se precalentaron a 37ºC. Al final del periodo de
incubación, se añadieron 3,5 \mul de reacción de marcaje a cada
una de las 4 mezclas de terminación. Después de 5 min, se añadieron
4 \mul de solución de parada a cada reacción y la placa Terasaki
se incubó a 80ºC durante 10 minutos en una estufa. Las reacciones de
secuenciación se realizaron en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante al 5%. Se preparó una solución de acrilamida
añadiendo 200 ml de 10x tampón TBE y 957 ml de dH_{2}O a 100 g de
acrilamida:bisacrilamida (29:1). Se preparó 5% de poliacrilamida 46%
de urea y 1x gel TBE combinando 38 ml de solución de acrilamida y 28
g de urea. La polimerización se inició por la adición de 400 \mul
de peroxodisulfato amónico al 10% y 60 \mul de TEMED. Los geles se
vertieron usando placas de vidrio silanizadas y peines de dientes de
tiburón y se procesaron en 1x tampón TBE a 60 a 100 W durante un
periodo de 2 a 4 horas (dependiendo de la región a leer). Los geles
se transfirieron a papel secante Whatman, se secaron a 80ºC durante
aproximadamente 1 hora y se expusieron a una película de rayos x a
temperatura ambiente. Típicamente, el tiempo de exposición fue de 12
horas. En estos procedimientos se usaron las siguientes soluciones:
5x Tampón de hibridación (Tris HCl 200 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100
mM, NaCl 250 mM); Mezcla de Marcaje (7,5 \muM de cada dCTP, dGTP y
dTTP); Mezclas de terminación (80 \muM de cada dNTP, NaCl 50 mM,
ddNTP 8 \muM (cada uno)); Solución de parada (formamida al 95%,
EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,05% y xilencianol al 0,05%); 5x
TBE (Tris borato 0,9 M, EDTA 20 mM); Solución de poliacrilamida
(96,7 g de poliacrilamida, 3,3 g de bisacrilamida, 200 ml de 1x TBE,
957 ml de dH_{2}O).
Se aisló ARN citoplásmico a partir de células
293T transfectadas con fosfato cálcico 36 horas después de la
transfección y a partir de células Hela infectadas con vaccinia 16
horas después de la infección esencialmente como describe Gilman.
(Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. En
Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds.,
Wiley & Sons, New York, 1992). En resumen, las células se
lisaron en 400 \mul de tampón de lisis, los núcleos se
centrifugaron y se añadieron SDS y proteinasa K a 0,2% y 0,2 mg/ml
respectivamente. Los extractos citoplásmicos se incubaron a 37ºC
durante 20 min, se extrajeron con fenol/cloroformo dos veces y se
precipitaron. El ARN se disolvió en 100 \mul de tampón I y se
incubó a 37ºC durante 20 min. La reacción se detuvo por la adición
de 25 \mul de tampón de parada y se precipitó de nuevo.
En este procedimiento se usaron las siguientes
soluciones: Tampón de lisis (TE que contenía Tris 50 mM pH 8,0, NaCl
100 mM, MgCl_{2} 5 mM, NP40 al 0,5%); Tampón I (tampón TE con
MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, 0,5 U/\mul de inhibidor de RNAsa
placentaria, 0,1 U/\mul de DNAsa I sin RNAsa); Tampón de parada
(EDTA 50 mM, NaOAc 1,5 M, SDS al 1,0%).
Para el análisis slot blot se disolvieron 10
\mug de ARN citoplásmico en 50 \mul de dH_{2}O al que se
habían añadido 150 \mul de 10x SSC/formaldehído al 18%. El ARN
solubilizado después se incubó a 65ºC durante 15 min y se aplicó
puntualmente sobre un aparato de slot blot. Para la hibridación se
usaron sondas marcadas radiactivamente de fragmentos de gp120IIIb y
syngp120mn de 1,5 kb. Cada uno de los dos fragmentos se marcó
aleatoriamente en una reacción de 50 \mul con 10 \mul de 5x
oligo-tampón de marcaje, 8 \mul de BSA a 2,5
mg/ml, 4 \mul de \alpha[^{32}P]-dCTP
(20 \muCi/\mul; 6000 Ci/mmol) y 5 U de fragmento de Klenow.
Después de 1 a 3 horas de incubación a 37ºC, se añadieron 100 \mul
de TE y el \alpha[^{32}P]-dCTP no
incorporado se eliminó usando una columna de centrifugación G50. La
actividad se midió en un contador beta Beckman y para la hibridación
se usaron actividades específicas iguales. Las membranas se
prehibridaron durante 2 horas y se hibridaron durante 12 a 24 horas
a 42ºC con 0,5 x 10^{6} cpm de sonda por ml de fluido de
hibridación. La membrana se lavó dos veces (5 min) con tampón de
lavado I a temperatura ambiente, durante una hora en tampón de
lavado II a 65ºC, y después se expuso a la película de rayos x. Se
obtuvieron resultados similares usando un fragmento NotI/SfiI de 1,1
kb de pCDM7 que contenía la región 3' no traducida. Las
hibridaciones de control se realizaron en paralelo con una sonda de
beta-actina humana marcada aleatoriamente. La
expresión de ARN se cuantificó explorando las membranas de
nitrocelulosa hibridadas con un phosphorimager de Magnetic
Dynamics.
En este procedimiento se usaron las siguientes
soluciones:
- 5x Oligo-tampón de marcaje (Tris HCl 250 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 25 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM, dATP 2 mM, dGTP 2 mM, dTTP 2 mM, Hepes 1 M pH 6,6, 1 mg/ml de hexanucleótidos [dNTP]6); Solución de hibridación (fosfato sódico _M, NaCl 250 mM, SDS al 7%, EDTA 1 mM, sulfato de dextrano al 5%, formamida al 50%, 100 \mug/ml de esperma de salmón desnaturalizado); Tampón de lavado I (2x SSC, SDS al 0,1%); Tampón de lavado II (0,5x SSC, SDS al 0,1%); 20x SSC (NaCl 3 M, citrato de Na_{3} 0,3 M, pH ajustado a 7,0).
La recombinación con vaccinia usó una
modificación del otro método descrito por Romeo y Seed (Romeo y
Seed, Cell, 64: 1037, 1991). En resumen, se infectaron células CV1 a
una confluencia de 70 a 90% con 1 a 3 \mul de una solución madre
de vaccinia de tipo silvestre WR (2 x 10^{8} pfu/ml) durante 1
hora en medio de cultivo sin suero de ternero. Después de 24 horas,
las células se transfectaron por fosfato cálcico con 25 \mug de
ADN de plásmido TKG por placa. Después de 24 a 48 horas más, las
células se rasparon de la placa, se centrifugaron y se
resuspendieron en un volumen de 1 ml. Después de 3 ciclos de
congelación/descongelación, se añadió tripsina a 0,05 mg/ml y los
lisados se incubaron durante 20 min. Para infectar placas pequeñas
(6 cm) de células CV1, que se habían pretratado con ácido
micofenólico a 12,5 \mug/ml, xantina a 0,25 mg/ml e hipoxantina a
1,36 mg/ml durante 6 horas, se usó una serie de dilución de 10, 1 y
0,1 \mul de este lisado. Las células infectadas se cultivaron
durante 2 a 3 días y posteriormente se tiñeron con el anticuerpo
monoclonal NEA9301 contra gp120 y un anticuerpo secundario conjugado
con fosfatasa alcalina. Las células se incubaron con NBT a 0,33
mg/ml y BCIP a 0,16 mg/ml en tampón AP y finalmente se recubrieron
con agarosa al 1% en PBS. Se recogieron las placas positivas y se
resuspendieron en 100 \mul de Tris pH 9,0. La purificación de
placas se repitió una vez. Para producir soluciones madre de alta
titulación, se aumentó lentamente la escala de la infección.
Finalmente, se infectó una placa grande de células Hela con la mitad
del virus de la vuelta previa. Las células infectadas se separaron
en 3 ml de PBS, se lisaron con un homogeneizador Dounce y se
limpiaron de los desechos de mayor tamaño por centrifugación. Las
soluciones madre de vaccinia recombinantes VPE-8 se
proporcionaron amablemente por el depósito de SIDA, Rockville, MD, y
expresan IIIB gp120 de VIH-1 bajo el promotor mixto
temprano/tardío 7.5 (Earl et al., J. Virol., 65:31, 1991). En
todos los experimentos con vaccinia recombinante, las células se
infectaron a una multiplicidad de infección de al menos 10.
En este procedimiento se usó la siguiente
solución: tampón AP (Tris HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM,
MgCl_{2} 5 mM)
Las líneas celulares de carcinoma de riñón de
mono CV1 y Cos7, la línea celular de carcinoma de riñón humano 293T
y la línea celular de carcinoma de cuello de útero humano Hela se
obtuvieron a partir de la American Tissue Typing Collection y se
mantuvieron en IMDM suplementado. Se mantuvieron en placas de
cultivo de tejido de 10 cm y típicamente se dividieron de 1:5 a 1:20
cada 3 a 4 días. En este procedimiento se usó el siguiente
medio:
- IMDM suplementado (Medio de Dulbecco modificado por Iscove al 90%, suero de ternero al 10%, complementado con hierro, inactivado con calor durante 30 min a 56ºC, 0,3 mg/ml de L-glutamina, 25 \mug/ml de gentamicina, \beta-mercaptoetanol 0,5 mM (pH ajustado con NaOH 5 M, 0,5 ml)).
La transfección con fosfato cálcico de células
293T se realizó añadiendo lentamente con agitación vorticial 10
\mug de ADN plasmídico en 250 \mul de CaCl_{2} 0,25 M al mismo
volumen de 2x tampón HEBS mientras se agitaba vorticialmente.
Después de la incubación durante 10 a 30 min a temperatura ambiente,
el precipitado de ADN se añadió a pequeñas placas de células
confluentes de 50 a 70%. En experimentos de
co-transfección con rev, las células se
transfectaron con 10 \mug de gp120IIIb, gp120IIIbrre,
syngp120mnrre o rTHY-lenveglrre y 10 \mug de ADN
del plásmido pCMVrev o CDM7.
En este procedimiento se usaron las siguientes
soluciones: 2x tampón HEBS (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, filtrado estéril
1,5 mM); CaCl_{2} 0,25 mM (esterilizado en autoclave).
Después de 48 a 60 horas, el medio se cambió y
las células se incubaron durante 12 horas más en medio sin Cys/Met
que contenía 200 \muCi de marcador trans ^{35}S. Los
sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron durante 15 minutos a
3000 rpm para retirar los residuos. Después de la adición de los
inhibidores de proteasa leupeptina, aprotinina y PMSF a 2,5
\mug/ml, 50 \mug/ml y 100 \mug/ml respectivamente, 1 ml de
sobrenadante se incubó con 10 \mul de proteína A sepharose
empaquetada sola (rTHY-lenveglrre) o con proteína A
sepharose y 3 \mug de una proteína de fusión CD4/inmunoglobulina
purificada (proporcionada amablemente por Behring) (todas
construcciones de gp120) a 4ºC durante 12 horas en un rotador.
Posteriormente, las perlas de proteína A se lavaron 5 veces durante
5 a 15 minutos cada vez. Después de añadir el lavado final que
contenía 10 \mul de tampón de carga, las muestras se hirvieron
durante 3 min y se aplicaron en geles de SDS poliacrilamida al 7%
(todas construcciones de gp120) o al 10%
(rTHY-lenveglrre) (tampón TRIS pH 8,8 en la
resolución, tampón TRIS pH 6,8 en el gel adherente, tampón de
proceso TRIS-glicina, Maniatis et al. 1989).
Los geles se fijaron en ácido acético al 10% y metanol al 10%, se
incubaron con Amplify durante 20 min, se secaron y se expusieron
durante 12 horas.
En este procedimiento se usaron los siguientes
tampones y soluciones: Tampón de lavado (Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl
150 mM, CaCl_{2} 5 mM, NP-40 al 1%); 5x Tampón de
proceso (Tris 125 mM, Glicina 1,25 M, SDS al 0,5%); Tampón de carga
(glicerol al 10%, SDS al 4%, \beta-mercaptoetanol
al 4%, azul de bromofenol al 0,02%).
Se transfectaron células 293T por
co-precipitación con fosfato cálcico y se analizaron
con respecto a la expresión de THY-1 en la
superficie después de 3 días. Después de la separación con EDTA 1
mM/PBS, las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal
OX-7 en una dilución 1:250 a 4ºC durante 20 min, se
lavaron con PBS y posteriormente se incubaron con una dilución 1:500
de un antisuero de cabra anti-inmunoglobulina de
ratón conjugado con FITC. Las células se lavaron de nuevo, se
resuspendieron en 0,5 ml de una solución de fijación y se analizaron
en un citofluorómetro EPICS XL (Coulter).
\newpage
En este procedimiento se usaron las siguientes
soluciones:
- PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, pH ajustado a 7,4); Solución de fijación (formaldehído al 2% en PBS).
La concentración de gp120 en los sobrenadantes
de cultivo se determinó usando placas ELISA recubiertas con CD4 y
antisuero de cabra anti-gp120 en la fase soluble.
Los sobrenadantes de las células 293T transfectadas por fosfato
cálcico se recogieron después de 4 días, se centrifugaron a 3000 rpm
durante 10 min para retirar los residuos y se incubaron durante 12
horas a 4ºC en las placas. Después de 6 lavados con PBS, se
añadieron 100 \mul de antisuero de cabra
anti-gp120 diluido 1:200 durante 2 horas. las placas
se lavaron de nuevo y se incubaron durante 2 horas con un antisuero
de conejo anti-IgG de cabra conjugado con peroxidasa
1:1000. Posteriormente, las placas se lavaron y se incubaron durante
30 minutos con 100 \mul de solución de sustrato que contenía 2
mg/ml de o-fenilendiamina en tampón citrato sódico.
La reacción finalmente se detuvo con 100 \mul de ácido sulfúrico 4
M. Las placas se leyeron a 490 nm con un lector de microplacas
Coulter. Como control se usó gp12oIIIb recombinante purificado. En
este procedimiento se usaron los siguientes tampones y soluciones:
Tampón de lavado (NP40 al 0,1% en PBS); Solución de sustrato (2
mg/ml de o-fenilendiamina en tampón citrato
sódico).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: SEED, BRIAN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SOBREEXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE MAMÍFERO Y VIRALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 37
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 225 Franklin Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02110-2804
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30B
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/308.286
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-SEP-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CLARK, PAUL T
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.162
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 00786/226001
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 542-5070
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 542-8906
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 200154
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGGCTAG CCACCGAGAA GCTG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 196 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACCATGTT GTTCTTCCAC ATGTTGAAGT TCTC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCGAGAAC TTCAACATGT GGAAGAACAA CAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 192 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGAAGCTG CAGTTCTTCA TCTCGCCGCC CTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGAACTGC AGCTTCAACA TCACCACCAG C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 195 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAACTTCTTG TCGGCGGCGA AGCCGGCGGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCCCCCGC CGGCTTCGCC ATCCTGAAGT GCAACGACAA GAAGTTC
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 198 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTGGGACG CGTGCAGTTG ATCTGCACGC TCTC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAGCGTGC AGATCAACTG CACGCGTCCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGTTCCAC TTGGCTCTAG AGATGTTGCA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAACATCTC TAGAGCCAAG TGGAACGAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 131 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGTAGAAG AATTCGCCGC CGCAGTTGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAACTCCGG CGGCGAATTC TTCTACTGC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 195 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGACCGGT GATGTTGCTG CTGCACCGGA TCTGGCCCTC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGGGCCAG ATCCGGTGCA GCAGCAACAT CACCGGTCTG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 242 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGGCGGC CGCTTTAGCG CTTCTCGCGC TGCACCAC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGGGGAT CCAAGCTTAC CATGATTCCA GTAATAAGT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGGGAAT TCACGCGTTA ATGAAAATTC ATGTTG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA CGCGTGAAAA AAAAAAACAT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 149 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAATTCG AGCTCACACA TATAATCTCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCG AGCTCAGAGT AAGTGGACAA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 170 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAATTCG CGGCCGCTTC ATAAACTTAT AAAATC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1632 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2481 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 486 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
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- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Un método para preparar un gen sintético que
codifica una proteína que se expresa normalmente en células de
mamífero, donde al menos 50% de los codones no preferidos y menos
preferidos presentes en el gen natural que codifica dicha proteína
se han reemplazado por codones preferidos que codifican los mismos
aminoácidos, seleccionándose dichos codones preferidos entre el
grupo consistente en gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc,
ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac y gtg, seleccionándose dichos
codones menos preferidos entre el grupo consistente en ggg, att,
ctc, tcc y gtc, y siendo todos dichos codones no preferidos codones
distintos de dichos codones preferidos y dichos codones menos
preferidos.
2. Un gen sintético que se puede obtener por un
método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína
es una proteína de VIH.
3. Un gen sintético de la reivindicación 2, en
el que dicha proteína se selecciona entre el grupo consistente en
gag, pol y env.
4. Un gen sintético de la reivindicación 2, en
el que dicha proteína es gp120 o gp160.
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