KR20240012352A - T 세포 림프종의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

Abstract

T 세포 림프종은 T 림프구에서 발생하는 악성 종양의 이질적인 그룹으로, 일반적으로 예후가 좋지 않은 것이 특징이다. 그 중, 피부 T세포 림프종은 주로 피부에서 발생한다. 균상 식육종 및 세자리(Sezary) 증후군이 가장 흔한 피부 T세포 림프종이다. 본 발명자들은 세자리 세포의 조절 T 표현형을 연구하고 세자리 세포 및 기타 T 세포 림프종 세포주에 의한 CCR8(CD198)의 발현을 확인하였다. 따라서 CCR8은 유용한 진단, 예후 및 추적 관찰 마커이자 T세포 림프종의 잠재적인 치료 표적인 것으로 보인다. CCR8-발현 암세포의 치료적 고갈은 종양 세포를 제거하고 또한 T 세포 림프종에서 항종양 면역을 활성화시킨다.

Description

T 세포 림프종의 진단 및 치료 방법

발명은 의학 분야, 특히 종양학 분야에 관한 것이다.

T 세포 림프종은 T 림프구에서 발생하는 악성 종양의 이질적인 그룹으로, 일반적으로 예후가 좋지 않은 것이 특징이다. 그 중, 피부 T세포 림프종(CTCL)은 주로 피부에서 발생한다. 균상 식육종 및 세자리(Sezary) 증후군(SS)이 가장 흔한 CTCL이다. 순환하는 클론 종양 T 세포(세자리 세포)는 CD4를 발현하고 CD7 및 CD26의 발현을 상실할 수 있지만 대부분의 경우 CD158k(KIR3DL2)의 비정상적인 발현을 나타낸다(1,2). 진행성 CTCL에서는 장기적인 반응이 드물며 새로운 치료법이 필요하다. 최근, 항-CCR4 단클론 항체(mogamulizumab)를 이용한 치료로 인해 CTCL의 무진행 생존율이 향상되었다(3). CCR4는 세자리 세포뿐만 아니라 말초 혈액 활성화 조절 T 세포(Treg)에 의해서도 발현되며(4), 모가물리주맙 치료에 의한 CCR4+ 순환 Treg의 고갈은 자가면역 부작용의 발생과 관련이 있다(5,6). CCR4 외에도, 세자리 세포는 PD1(7), CD39(8) 및 TIGIT(9)와 같은 여러 Treg 마커 및 면역 체크포인트 억제제를 발현한다. 세자리 세포에 의한 이러한 마커의 발현으로 인해, 본 발명자들은 피부에의 림프구의 복귀(homing)에 관여하는 케모카인 수용체인 CCR8(CD198)의 발현을 조사하게 되었다(10).

본 발명은 청구항들에 의해 정의된다. 특히, 본 발명은 T 세포-림프종의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 세자리 세포의 조절 T 표현형을 연구하고 세자리 세포 및 기타 T 세포 림프종 세포주에 의한 CCR8(CD198)의 발현을 확인하였다. CCR8은 피부에의 림프구의 복귀에 관여하는 케모카인 수용체이다(10). CCR8은 균상 식육종(12)에서 기원한 종양 세포로 의심되는 피부 상주 기억 T 세포(TRM)(11)에 의해 발현된다. 또한, CCR8은 면역 탈출에 관여하는 종양 침윤 조절 T 세포에 의해 강력하게 발현되는 반면, 말초 혈액 Treg에서의 발현은 더 낮았다(13). CCR8+ Treg의 고갈은 LLC-OVA 및 MC38 종양 마우스 모델에서 독립적으로 또는 PD-1 억제제와 조합으로 강력한 항종양 효과를 나타냈다(13). 따라서 CCR8은 유용한 진단, 예후 및 추적 관찰 마커이자 T세포 림프종의 잠재적인 치료 표적인 것으로 보인다. CCR8-발현 암세포의 치료적 고갈은 종양 세포를 제거하고 또한 T 세포 림프종에서 항종양 면역을 활성화시킨다.

주요 정의:

본원에서 사용되는 용어 "T 세포"는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며 세포 매개 면역에서 중심적인 역할을 하는 면역계의 중요한 구성요소를 나타낸다. T 세포는 복잡한 주조직 적합성의 분자에 의한 제시 또는 제한을 통해 그의 TCR(항원에 대한 T 세포 수용체)에 의해 항원을 인식하므로 통상적인 림프구로 알려져 있다. CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및 감마 델타 T 세포와 같은, 고유한 기능을 각각 갖는 T 세포의 여러 하위 집합이 있다. 본원에서 사용되는 용어 "CD8+ T 세포"는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며 그의 표면에 CD8을 발현하는 T 세포의 하위 집합을 의미한다. 이들은 MHC 클래스 I으로 제한되고 세포독성 T 세포로 기능한다. "CD8+ T 세포"는 세포독성 T 림프구(CTL), T-킬러 세포, 세포용해 T 세포 또는 킬러 T 세포라고도 한다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자(supergene) 패밀리의 구성원이며 주요 조직적합성 복합체 클래스 I-제한 상호작용의 연관 인식 요소(associative recognition element)이다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 침윤 CD8+ T 세포"는 혈류를 떠나 종양으로 이동한 환자의 CD8+ T 세포 풀을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "CD4+ T 세포"(T 보조 세포 또는 TH 세포라고도 함)는 그의 표면에 CD4 당단백질을 발현하고 형질 세포 및 기억 B 세포로의 B 세포의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯한 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는 T 세포를 의미한다. CD4+ T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면에 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원과 함께 제시될 때 활성화된다. 이들 세포는 일단 활성화되면 빠르게 분열하여, 활성 면역 반응을 조절하거나 돕는 사이토카인을 분비한다. 이들 세포는 TH1, TH2, TH3, TH17, TH9, TFH 또는 Treg를 포함한 여러 하위 유형 중 하나로 분화될 수 있으며, 이러한 하위 유형은 다양한 사이토카인을 분비하여 다양한 유형의 면역 반응을 촉진한다. APC의 신호는 T 세포를 특정 하위 유형으로 지시한다. CD4 외에도, 당업계에 공지된 TH 세포 표면 바이오마커로는 CXCR3(Th1), CCR4, Crth2(Th2), CCR6(Th17), CXCR5(Tfh)뿐만 아니라 T-bet, GATA3, EOMES, RORγT, BCL6 및 FoxP3을 포함한 전사인자 및 사이토카인의 하위유형-특이적 발현이 있다. 본원에서 사용되는 용어 "감마 델타 T 세포"는 당업계에서의 일반적인 의미를 갖는다. 감마 델타 T 세포는 일반적으로 건강한 개체(인간, 원숭이)의 말초 혈액 림프구의 1 내지 5%를 차지한다. 이들은 방어적인 면역 반응을 일으키는데 관여하며, 항원 제시 세포의 MHC 분자에 의한 제시 없이 항원과의 직접적인 상호작용을 통해 그의 항원 리간드를 인식하는 것으로 확인되었다. 감마 9 델타 2 T 세포(때때로 감마 2 델타 2 T 세포라고도 함)는 가변 도메인 Vγ9 및 Vδ2를 갖는 TCR 수용체를 보유하는 감마 델타 T 세포이다. 이들은 인간 혈액에서 감마 델타 T 세포의 대부분을 형성한다. 활성화되면 감마 델타 T 세포는 강력한 비-MHC 제한 세포독성 활성을 발휘하며, 특히 다양한 유형의 세포, 특히 병원성 세포를 죽이는데 효율적이다. 이들은 바이러스(Poccia 등, J. Leukocyte Biology, 1997, 62:1-5) 또는 마이코박테리아(Constant 등, Infection and Immunity, December 1995, vol. 63, no. 12: 4628-4633) 또는 원생동물(Behr 등, Infection and Immunity, 1996, vol. 64, no. 8: 2892-2896)과 같은 다른 세포내 기생충에 의해 감염된 세포일 수 있다. 또한, 이들은 암세포일 수도 있다(Poccia 등, J. Immunol., 159: 6009-6015; Fournie and Bonneville, Res. Immunol., 66th Forum in Immunology, 147: 338-347). 따라서, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 상기 세포의 활성을 조절할 가능성은 감염성 질환(특히 바이러스 또는 기생충), 암, 알레르기, 심지어는 자가면역 질환 및/또는 염증성 장애와 같은 다양한 병리의 치료에서 새롭고 효과적인 치료 접근법을 제공할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "T 세포 림프종"은 당업게에서의 그의 일반적인 의미를 가지며 T 세포에 영향을 미치는 희귀한 형태의 암성 림프종을 의미한다. 림프종은 주로 T 세포의 통제되지 않은 증식으로 인해 발생하며 암으로 발전할 수 있다. T 세포 림프종은 비호지킨 림프종(NHL) 범주에 속하며 이 범주에 있는 모든 비호지킨 질환의 15% 미만을 나타낸다. T 세포 림프종은 종종 성장 패턴에 따라 공격적(빠르게 성장) 또는 완만함(느리게 성장)으로 분류된다. 특히, T세포 림프종으로는 말초 T세포 림프종, 혈관면역모구 T세포 림프종(AITL), 간비장 T세포 림프종(HSTL), 자연살해 T세포 림프종(NKTL), 피부 T세포 림프종CTCL)이 있다.

본원에서 사용되는 용어 "피부 T 세포 림프종" 또는 "CTCL"은 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며, 피부 복귀(skin-homing) 성숙 T 세포에서 유래된 비호지킨 림프종의 희귀한 이종 그룹을 의미한다. 균상 식육종(MF)과 세자리 증후군(SS)은 원발성 CTCL의 가장 일반적인 하위 유형을 나타내며 발생률은 연간 1,000,000명당 4.1명이고 남성이 우세하다.

본원에서 사용되는 용어 "세자리 증후군" 또는 "SS"는 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며 적혈구종, 림프절병증 및 순환 비정형 림프구(세자리 세포)의 3군(triad)을 특징으로 하는 공격적인 형태의 피부 T 세포 림프종을 의미한다. SS는 남성에서 가장 자주 발생하고 노인에서 더 자주 발생하며 빠르게 진행된다. SS는 T세포 피부 림프종의 IVA2 및 IVB 단계에 해당한다(이 용어 참조). 환자는 종종 사자상(leonine facies)과 심한 가려움증을 동반하는 인설성 홍피증과 침윤을 보인다. 탈모증, 외전증, 경증 손발바닥 각화증 및 손발톱 조갑 이영양증이 나타날 수 있다. 림프절병증 및 간비장비대가 관찰된다. 환자들은 종종 부들부들 떨고 오한 및 전반적인 피로를 호소한다.

본원에서 사용되는 용어 "CCR8"은 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며 C-C 케모카인 수용체 유형 8을 의미한다. 이 용어는 CD198, CKRL1, CMKBR8 또는 CMKBRL2로도 명명된다. CCR8에 대한 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 1로 나타낸다. 그 수용체는 서열번호 1에서 다음 위치 1 내지 35, 94 내지 107, 172 내지 202 및 264 내지 280에 의해 정의되는 여러 세포외 도메인을 특징으로 한다.

서열번호 1 >sp|P51685|CCR8_HUMAN C-C 케모카인 수용체 유형 8 OS=호모 사피엔스 OX=9606 GN=CCR8 PE=1 SV=1

MDYTLDLSVTTVTDYYYPDIFSSPCDAELIQTNGKLLLAVFYCLLFVFSLLGNSLVILVL

VVCKKLRSITDVYLLNLALSDLLFVFSFPFQTYYLLDQWVFGTVMCKVVSGFYYIGFYSS

MFFITLMSVDRYLAVVHAVYALKVRTIRMGTTLCLAVWLTAIMATIPLLVFYQVASEDGV

LQCYSFYNQQTLKWKIFTNFKMNILGLLIPFTIFMFCYIKILHQLKRCQNHNKTKAIRLV

LIVVIASLLFWVPFNVVLFLTSLHSMHILDGCSISQQLTYATHVTEIISFTHCCVNPVIY

AFVGEKFKKHLSEIFQKSCSQIFNYLGRQMPRESCEKSSSCQQHSSRSSSVDYIL

본원에서 사용되는 용어 "CCR8 발현 암세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 작용제"는 세포 및/또는 생리학적 조건 하에서 CCR8 발현 암세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 특히, 이 작용제(agent)는 CCR8 발현 암세포의 세포자멸사를 유도할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 작용제는 CCR8 암세포를 고갈시킬 수 있다. 본원에서 암세포에 관하여 사용되는 용어 "고갈(depletion)"은 환자에서 CCR8 발현 암 세포 수의 측정가능한 감소를 의미한다. 그 감소는 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 이 용어는 환자에서의 CCR8 암 세포의 수가 검출 가능한 한계 미만으로 감소하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "CCR8 억제제"는 CCR8의 생물학적 활성 또는 발현을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 분자를 의미한다. CCR8 억제제는, 예를 들어 CCR8-코딩 핵산의 전사 또는 번역을 감소시키거나 또는 CCR8 폴리펩티드 활성을 억제 또는 차단하거나 또는 둘 모두를 통해 세포 내 CCR8과 관련된 신호 전달을 방해하는 임의의 유형의 분자일 수 있다. CCR8 억제제의 예로는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 간섭 RNA, 촉매적 RNA, RNA-DNA 키메라, CCR8-특이적 앱타머, 항-CCR8 항체, 항-CCR8 항체의 CCR8 결합 단편, CCR8 결합 소분자, CCR8 결합 펩타이드뿐만 아니라, CCR8에 특이적으로 결합하여 CCR8 억제제와 CCR8 사이의 상호작용으로 인해 CCR8 활성 또는 발현이 감소되거나 중단되도록 하는 다른 폴리펩티드(하나 이상의 추가 도메인에 선택적으로 융합된 하나 이상의 CCR8 리간드의 CCR8-결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않음)이 있으나 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원 결합 영역을 갖는 임의의 항체-유사 분자를 지칭하기 위해 사용되고, 이러한 용어는 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DAB), TandAbs 이량체, Fv, scFv(단일 사슬 Fv), dsFv, ds-scFv, Fd, 선형 항체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편, 비바디, 트리바디(scFv-Fab 융합체, 각각 이중특이적 또는 삼중특이적임); sc-디아바디; 카파(람다)바디(scFv-CL 융합체); BiTE(이중특이적 T 세포 참여자(Engager), T 세포를 유인하기 위한 scFv-scFv 탠덤(tandem)); DVD-Ig(이중 가변 도메인 항체, 이중특이적 형태); SIP(일종의 미니바디인 소형 면역단백질); SMIP("소형 모듈식 면역약제" scFv-Fc 이량체); DART(ds-안정화 디아바디 "이중 친화성 재표적화"); 하나 이상의 CDR를 포함하는 소형 항체 모방체 등과 같은, 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편을 포함한다. 다양한 항체 기반 작제물 및 단편을 제조하고 사용하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다(본원에 참조로 구체적으로 포함되는 Kabat 등, 1991 참조). 특히 디아바디는 EP 404,097호 및 WO 93/11161호에 추가로 기재되어 있으며; 선형 항체는 Zapata 등 (1995)의 문헌에 추가로 기재되어 있다. 항체는 통상의 기법을 사용하여 단편화될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편을 처리하여 이황화물 브릿지를 환원시켜서 Fab' 단편을 생성할 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성으로 이어질 수 있다. 또한, Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 기타 단편이 재조합 기법에 의해 합성될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있다. 항체 단편을 생산하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있고 기술되어 있다. 예를 들어 Beckman 등, 2006; Holliger 및 Hudson, 2005; Le Gall 등, 2004; Ref 및 Heard, 2001; Reiteret 등, 1996; 및 Young 등, 1995의 문헌에서는 효과적인 항체 단편의 생산을 추가로 기재하고 가능하게 한다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일 사슬 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "단일 도메인 항체"는 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며, 자연적으로 경쇄가 없는 카멜리드 포유동물에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 의미한다. 이러한 단일 도메인 항체는 "nanobody®"이기도 하다. (단일) 도메인 항체의 일반적인 설명에 대해서는 위에 인용된 선행 기술뿐만 아니라 EP 0 368 684호, 문헌[Ward 등. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)], 문헌[Holt 등, Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490], WO 06/030220호, 및 WO 06/003388호를 또한 참조한다. 천연 항체에서는, 두 개의 중쇄가 이황화 결합을 통해 서로 연결되고, 각 중쇄는 이황화 결합을 통해 경쇄에 연결되어 있다. 경쇄에는 람다(1)와 카파(k)의 두 가지 유형이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5개의 주요 중쇄 클래스(또는 이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각 사슬은 고유한 서열 도메인을 포함하고 있다. 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)이라는 두 개의 도메인을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 즉 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CHI, CH2 및 CH3, 집합적으로 CH로 지칭됨)을 포함한다. 경쇄(VL)와 중쇄(VH) 모두의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식과 특이성을 결정한다. 경쇄(CL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬 결합, 분비, 태반을 통한 이동성(trans-placental mobility), 보체 결합, 및 Fc 수용체(FcR)에의 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 구성된다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정기 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR) 유래의 잔기로 구성된다. 때로는, 비초가변 또는 프레임워크 영역(FR) 유래의 잔기가 항체 결합 부위에 참여하거나 전체 도메인 구조에 영향을 미쳐서 결합 부위에 영향을 미칠 수 있다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 의미한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 지정된 3개의 CDR을 갖는다. 따라서, 항원 결합 부위는 일반적으로 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각 유래의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 프레임워크 영역(FR)은 CDR 사이에 있는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 가변 도메인의 잔기는 통상적으로 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이 시스템은 문헌[Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하 "Kabat 등")에 기재되어 있다. 본 명세서에서는 이러한 넘버링 시스템을 사용한다. Kabat 잔기 명칭은 SEQ ID 서열의 아미노산 잔기의 선형 넘버링(linear numbering)과 항상 직접적으로 일치하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)인지 여부에 관계없이 구조적 성분의 단축 또는 이에의 삽입에 해당하는 엄격한 Kabat 넘버링보다 더 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 잔기를 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다. 중쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 31 내지 35B(H-CDR1), 잔기 50 내지 65(H-CDR2) 및 잔기 95 내지 102(H-CDR3)에 위치한다.

본원에서 사용되는 용어 "결합하다"은 항체가 표면 분자에 대해 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 에피토프에의 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag]로 정의되는 해리 상수 Kd로 주어지고, 여기서 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 결합되지 않은 항체의 몰 농도이고, [Ag]는 결합되지 않은 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 바람직한 방법은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan 등 편집, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), 및 Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 확인할 수 있다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 잘 알려진 한 가지 바람직하고 표준적인 방법은 Biacore 기기를 사용하는 것이다.

본원에서 사용되?j 용어 "완전 인간"은, 전체 분자가 인간 기원이거나 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 구성되는, 항체 또는 항체 단편과 같은 면역글로불린을 의미한다.

본원에서 사용되는 "키메라 항체"는 비인간 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인, 및 인간 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체를 의미한다. 몇몇 구현예에서, "키메라 항체"는, (a) 불변 영역(즉, 중쇄 및/또는 경쇄) 또는 이의 일부가 변경, 치환 또는 교체되어 항원 결합 부위(가변 영역)가 다르거나 변경된 클래스, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역에 연결되거나 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 다른 분자(예: 효소, 독소, 호르몬, 성장인자, 약물 등)에 연결되어 있거나, 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교체되어 있는, 항체 분자이다. 또한, 키메라 항체로는 영장류화 항체, 특히 인간화 항체가 있다. 더욱이, 키메라 항체는 수용 항체(recipient antibody) 또는 공여 항체(donor antibody)에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 더 자세한 내용은 문헌[Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). (see U.S. Pat. No. 4,816,567; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))]을 참조한다.

본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간 항체의 가변영역 프레임워크 및 불변영역을 가지면서 기존 비인간 항체의 CDR을 유지하는 항체를 의미한다. 몇몇 구현예에서, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 대부분의 경우, 인간화 항체 및 이의 항체 단편은, 수용자의 CDR(상보성 결정 영역)의 잔기가 원하는 특이도, 친화도 및 능력(capacity)을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여 항체)의 CDR 유래의 잔기로 치환되어 있는, 인간 면역글로불린(수용 항체 또는 항체 단편)일 수 있다. 몇몇의 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 치환된다. 더욱이, 인간화 항체/항체 단편은 수용 항체나 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 결합 영역이 유래된 비인간 항체의 결합 특이성을 유지하지만 비인간 항체에 대한 면역 반응을 회피하도록 설계된다. 이러한 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 더욱 개선하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 하나, 일반적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 상당한 부분은 인간 면역글로불린 서열의 FR 영역이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로는 인간 면역글로불린의 일부분을 포함할 수 있다. 더 자세한 내용은 문헌[Jones 등, Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann 등, Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.

본원에서 사용되는 용어 "이중특이적 항체"는 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며, 두 개의 서로 다른 중쇄 및 경쇄 쌍과 두 개의 서로 다른 항원 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며, T 세포 신호전달 도메인에 연결된 항체(예를 들어, scFv)의 항원 결합 도메인을 함유하는 인공적으로 작제된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. CAR의 특징에는 단일클론 항체의 항원 결합 특성을 활용하여 비-MHC-제한 방식으로 선택된 표적을 향해 T 세포 특이성 및 반응성을 재지시(redirect)하는 능력이 포함된다. 더욱이, T 세포에서 발현되는 경우, CAR은 유리하게는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화되지 않는다. 본 발명의 키메라 항원 수용체는 일반적으로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "CAR-T 세포"는 CAR을 발현하도록 유전적으로 조작된 T 림프구를 의미한다. CAR T 세포의 정의는 CD4+, CD8+ T 세포, 감마 델타 T 세포뿐만 아니라 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포 등을 포함하는 T 림프구의 모든 클래스 및 하위 클래스를 포함한다. 유전적으로 변형된 T 림프구는 유전적으로 변형된 T 세포를 사용하여 치료를 받을 환자로부터 "유래" 또는 "획득"될 수 있거나, 다른 환자로부터 "유래" 또는 "획득"될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 질병에 걸릴 위험이 있거나 질병에 걸린 것으로 의심되는 환자뿐만 아니라 병들었거나 질병 또는 의학적 상태를 앓고 있는 것으로 진단된 환자의 치료를 포함하는 예방적 치료뿐만 아니라 완치적 또는 질병 수정 치료를 모두 의미하고, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료제는 장애 또는 재발성 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 치유, 발병을 지연, 중증도를 감소 또는 증상을 개선하거나 그러한 치료가 없을 때 예상되는 것 이상으로 환자의 생존을 연장하기 위해, 의학적 장애가 있거나 궁극적으로 장애가 발생할 수 있는 환자에게 투여될 수 있다. "치료 요법"은 질병의 치료 패턴, 예를 들어 치료 중에 사용되는 투여 패턴을 의미한다. 치료 요법에는 유도 요법 및 유지 요법이 포함될 수 있다. "유도 요법(induction regimen)" 또는 "유도 기간"이라는 문구는 질병의 초기 치료에 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 의미한다. 유도 요법의 일반적인 목표는 치료 요법의 초기 기간 동안 환자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 의사가 유지 요법 동안 사용하는 것보다 더 많은 용량의 약물을 투여하거나, 의사가 유도 요법 동안 약물을 투여하는 것보다 더 자주 약물을 투여하는 것거나, 둘 모두를 포함할 수 있는 "부하 요법(loading regimen)"을 (부분적으로 또는 전체적으로) 사용할 수 있다. "유지 요법" 또는 "유지 기간"이라는 문구는 질병 치료 동안 환자의 유지를 위해(예를 들어, 장기간(수개월 또는 수년) 동안 환자의 차도를 유지하기 위해) 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 의미한다. 유지 요법은 연속 요법(예를 들어, 정기적인 간격으로, 예를 들어 매주, 매월, 매년 등의 간격으로 약물 투여)) 또는 간헐 요법(예: 중단된 치료, 간헐적 치료, 재발 시 치료, 특정의 예정 기준[예를 들어, 질병 증상 등]의 달성시 치료를 이용할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 활성제(active agent)의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 개체에서 원하는 반응을 유도하는 활성제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료적 유효량은 약물의 독성 또는 해로운 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 양이다. 활성제의 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료할 질병 또는 상태에 따라 다르며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 당업자는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준보다 낮은 수준에서 약학 조성물에 사용되는 활성제의 투여를 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 늘릴 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 특정 투여 요법에 따라 치료 효과를 생성하는데 효과적인 최저 투여량인, 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 위에서 설명한 요인에 따라 달라진다. 예를 들어, 치료 용도를 위한 치료적 유효량은 질병의 진행을 안정화시키는 그의 능력에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, 암을 억제하는 화합물의 능력은 예를 들어, 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 치료적 유효량의 치료 화합물은 종양 크기를 감소시키거나 환자의 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 환자의 크기, 환자의 증상의 중증도, 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인에 따라 이러한 양을 결정할 수 있다. 본 발명의 억제제의 치료적 유효량에 대한 예시적이고 비제한적인 범위는 약 0.1 내지 100 mg/kg, 예를 들어 약 0.1 내지 50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1 내지 20 mg/kg, 예를 들어 약 0.1 내지 10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 약 0.3, 약 1, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg 또는 약 8 mg/kg이다. 본 발명의 억제제의 치료적 유효량에 대한 예시적이고 비제한적인 범위는 0.02 내지 100 mg/kg, 예를 들어 약 0.02 내지 30 mg/kg, 예를 들어 약 0.05 내지 10 mg/kg 또는 0.1 내지 3 mg/kg, 예를 들어 약 0.5 내지 2 mg/kg이다. 투여는 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여일 수 있고, 예를 들어 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 상기 치료 방법 및 용도의 투여 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있거나, 시간이 지남에 따라 여러 분할 용량이 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 치료 효능은 치료 동안 예를 들어 미리 정의된 시점에서 모니터링된다. 몇몇 구현예에서, 효능은 질병 부위의 시각화를 통해, 또는 본원에 추가로 설명되는 다른 진단 방법을 통해, 예를 들어 본 발명의 표지된 억제제, 본 발명의 억제제로부터 유래된 단편 또는 미니항체를 사용하여 하나 이상의 PET-CT 스캔을 수행함으로써 모니터링될 수 있다. 원하는 경우, 약학적 조성물의 효과적인 일일 용량은 하루 내내 적절한 간격으로 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 하위 용량으로, 선택적으로 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 원치 않는 부작용을 최소화하기 위해 장기간(예를 들어 24시간 초과)에 걸쳐 느린 연속적 주입에 의해 투여된다. 또한, 본 발명의 억제제의 유효량은 매주, 격주 또는 삼주 투여 기간을 사용하여 투여될 수 있다. 투여 기간은 예를 들어 8주, 12주 또는 임상적 진행이 확립될 때까지로 제한될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 치료는 하루에 약 0.1 내지 100 mg/kg, 예를 들어 0.2, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 양으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하나, 또는 치료의 개시후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합에서 24, 12, 8, 6, 4, 2시간마다 또는 이들의 임의의 조합마다 단일 또는 분할 용량을 사용하여 본 발명의 억제제의 일일 투여량으로 제공될 수 있다.

치료 방법:

따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은 CCR8 발현 암세포의 세포 사멸을 유도할 수 있는 작용제를 환자에게 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 T 세포 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다.

몇몇 구현예에서, T 세포 림프종은 혈관면역모구 T 세포 림프종, 간비장 T 세포 림프종, 자연 살해 T 세포 림프종 또는 피부 T 세포 림프종이다. 몇몇 구현예에서, T 세포 림프종은 피부 T 세포 림프종이다. 보다 구체적으로, T세포 림프종은 세자리 증후군이다.

몇몇 구현예에서, 환자는 인간 유아이다. 몇몇 구현예에서, 환자는 인간 어린이이다. 몇몇 구현예에서, 환자는 인간 성인이다. 몇몇 구현예에서, 환자는 노인이다. 몇몇 구현예에서, 환자는 미숙아이다.

몇몇 구현예에서, CCR8 발현 암세포의 세포 사멸을 유도할 수 있는 작용제는 CCR8 억제제이다.

CCR8 억제제는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, CCR8 억제제는 AZ084(Cas No. 929300-19-6), ML604086(Cas No. 850330-18-6), R243(Cas No. 688352-84-3), LMD-A(Cas No. 688352-84-3), MC148, CDBP0728 또는 CDBP5280일 수 있다. CCR8 억제제는 특허 문헌, 예를 들어 WO/2004/058736호에도 기재되어 있다.

CCR8 항체:

몇몇 구현예에서, 작용제는 CCR8에 대한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 몇몇 구현예에서, 작용제는 CCR8의 적어도 하나의 세포외 도메인에 대한 항체이다. 몇몇 구현예에서, 항체는 항-CCR8 중화 항체이다. 몇몇 구현예에서, 항체는 CCR8의 CCL1, CCL8 또는 CCL18 매개 활성화를 억제한다. 몇몇 구현예에서, 항체는 CCR8 발현 암세포의 고갈을 유도한다.

몇몇 구현예에서, 항체는 인간화 항체 또는 키메라 항체이다.

몇몇 구현예에서, 항체는 완전 인간 항체이다. 또한, 완전 인간 단일클론 항체는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 많은 부분에 대해 형질전환된 마우스를 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국특허 5,591,669호, 5,598,369호, 5,545,806호, 5,545,807호, 6,150,584호 및 거기에 인용된 참조문헌을 참조한다.

몇몇 구현예에서, 항체는 ATCC 기탁(Accession) 번호 PTA-6940을 갖는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다.

몇몇 구현예에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-6938을 갖는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다.

몇몇 구현예에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-6939를 갖는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다.

몇몇 구현예에서, 항체는 문헌[Lu S, Hu S, Gan X 등, 711 HBM1022, a novel anti-CCR8 antibody depletes tumor-infiltrating regulatory T cells via enhanced ADCC activity, mediates potent anti-tumor activity with Keytruda. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0711]에 개시된 HBM1022 항체이다.

몇몇 구현예에서, 항체는 문헌[Rankin A, Naik E861 Development of FPA157, an anti-CCR8 depleting antibody engineered to preferentially eliminate tumor-infiltrating T regulatory cells. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0861]에 개시된 FPA157 항체이다.

몇몇 구현예에서, 항체는 문헌[Lake A, Warren M, Das S 등, 726 SRF114 is a fully human, CCR8 selective IgG1 antibody that induces destruction of tumor Tregs through ADCC. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0726]에 개시된 SRF114 항체이다.

몇몇 구현예에서, 항체는 문헌[Lan, Ruth 등, "Highly selective anti-CCR8 antibody-mediated depletion of regulatory T cells leads to potent antitumor activity alone and in combination with anti-PD-1 in preclinical models." (2020): 6694-6694, 및 Bayati F, Mohammadi M, Valadi M, Jamshidi S, Foma AM, Sharif-Paghaleh E. The Therapeutic Potential of Regulatory T Cells: Challenges and Opportunities. Front Immunol. 2021;11:585819. Published 2021 Jan 15. doi:10.3389/fimmu.2020.585819]에 개시된 항-CCR8 hIgG1-푸코실화되지 않은 BMS-986340 항체이다.

몇몇 구현예에서, 항체는 문헌[Van Damme H, Dombrecht B, Kiss M, Roose H, Allen E, Van Overmeire E, Kancheva D, Martens L, Murgaski A, Bardet PMR, Blancke G, Jans M, Bolli E, Martins MS, Elkrim Y, Dooley J, Boon L, Schwarze JK, Tacke F, Movahedi K, Vandamme N, Neyns B, Ocak S, Scheyltjens I, Vereecke L, Nana FA, Merchiers P, Laoui D, Van Ginderachter JA. Therapeutic depletion of CCR8+ tumor-infiltrating regulatory T cells elicits antitumor immunity and synergizes with anti-PD-1 therapy. J Immunother Cancer. 2021 Feb;9(2):e001749. doi: 10.1136/jitc-2020-001749. PMID: 33589525; PMCID: PMC7887378]에 개시된 나노바디(nanobody)이다.

몇몇 구현예에서, 항체는 문헌[Depis, Fabien 등, "Preclinical evaluation of JTX-1811, an anti-CCR8 antibody with enhanced ADCC activity, for preferential depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells." (2020): 4532-4532]에 개시된 JTX-1811이다.

CCR8 고갈 항체

몇몇 구현예에서, CCR8 암세포의 고갈에 적합한 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 매개한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 비특이적 세포독성 세포(예: 자연살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후 표적 세포를 용해(lysis)를 유발하는, 세포 매개 반응을 의미한다.

임의의 특정 작용 기전으로 제한되기를 바라는 것은 아니지만, ADCC를 매개하는 이들 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다.

본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인의 유연한 힌지 N-말단을 의미한다. IgA 및 IgM의 경우 Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 면역글로불린 도메인인 Cgamma2 및 Cgamma3(Cγ2 및 Cγ3) 및 Cgamma1(Cγ1)과 Cgamma2(Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 그의 카르복실 말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되며, 여기서의 넘버링은 Kabat 등에서와 같이 EU 인덱스에 따른 것이다(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). "Kabat에 기재된 EU 인덱스"는 위의 Kabat 등에 기재된 바와 같은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. Fc는 분리된 이러한 영역을 의미하거나, 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질과 관련하여 이러한 영역을 의미할 수 있다. Fc 변이체 단백질은 항체, Fc 융합체, 또는 Fc 영역을 포함하는 임의의 단백질 또는 단백질 도메인일 수 있다. Fc 영역의 비천연 발생 변이체인 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질이 특히 바람직하다. 비천연 발생 Fc 영역(본원에서는 "변이체 Fc 영역"이라고도 함)의 아미노산 서열은 야생형 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 삽입 또는 치환의 결과로 변이체 Fc 영역의 서열에 나타나는 임의의 새로운 아미노산 잔기는 비천연 발생 아미노산 잔기로 지칭될 수 있다. 주: 다형성은 Kabat 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 Fc 위치에서 관찰되었으며, 따라서 제시된 서열과 선행 기술의 서열 사이에 약간의 차이가 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 5,500,362호 또는 5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 있다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌[Clynes 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)]에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 세포는 적어도 FcγRI, FCγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있다.

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체는 전장 항체이다. 몇몇 구현예에서, 전장 항체는 IgG1 항체이다. 몇몇 구현예에서, 전장 항체는 IgG3 항체이다.

몇몇 구현예에서, 암세포 고갈에 적합한 항체는 FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB 및 FcγRIV에 대해 증가된 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입 또는 결실은 FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB 및 FcγRIV에 대한 증가된 친화도를 초래한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기는 잔기 239, 330 및 332로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 아미노산 잔기는 EU 인덱스에 따라 넘버링된 것이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 S239D, A330L, A330Y 및 1332E로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 아미노산은 잔기는 EU 인덱스에 따라 넘버링된 것이다.

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체의 글리코실화(glycosylation)가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체에는 글리코실화가 결여되어 있다). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근 방식은 Co 등의 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 더 자세히 기재되어 있다. 추가로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기의 양이 감소되거나 푸코실 잔기가 없는 저푸코실화 또는 푸코실화되지 않은 항체 또는 이등분(bisecting) GlcNac 구조가 증가된 항체와 같은, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구(glycosylation machinery)를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술되어 왔으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP1176195호는 세포주에서 발현된 항체가 저푸코실화를 나타내거나 푸코실 잔기가 없도록, 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어 있는 세포주를 기재하고 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 저푸코실화 또는 비-푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서 재조합 발현에 의해 생산될 수 있다. Presta의 PCT 공개 WO 03/035835호에는 Asn(297)-연결 탄수화물에 푸코스를 부착하는 능력이 감소되어 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주인 Lecl3 세포가 기재되어 있다(또한 Shields, R.L. 등, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). Umana 등의 PCT 공개 WO 99/54342호는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예: 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))을 발현하도록 조작된 세포주로서, 그 세포주에서 발현된 항체가 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성이 증가하는 세포주를 기재하고 있다(또한 Umana 등, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180 참조). Eureka Therapeutics는 푸코실 잔기가 없는 변경된 포유동물 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 CHO 포유동물 세포를 추가로 기재하고 있다(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html). 대안적으로, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 포유동물-유사 글리코실화 패턴을 위해 조작되고 글리코실화 패턴으로서 푸코스가 결여된 항체를 생성할 수 있는 효모 또는 사상균에서 생산될 수 있다(예를 들어 EP1297172B1호 참조).

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체는 보체 의존적 세포독성을 매개한다.

본원에서 사용되는 용어 "보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 활성화를 개시하고 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예: 항체)에의 보체 시스템의 첫 번째 구성요소(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santaro 등, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석이 수행될 수 있다.

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체는 항체 의존적 식세포작용을 매개한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체 의존적 식세포작용" 또는 "옵소닌화"는, FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 식세포작용을 일으키는, 세포 매개 반응을 의미한다.

CCR8 다중특이적 항체:

몇몇 구현예에서, CCR8 암 세포의 고갈에 적합한 항체는 CCR8에 대한 제1 항원 결합 부위 및 상기 기재된 바와 같은 효과기 세포에 대한 적어도 하나의 제2 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 항체이다. 상기 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 예를 들어 인간 효과기 세포에 항원을 결합시킴으로써 사멸 메커니즘을 동원하는데 사용된다. 몇몇 구현예에서, 효과기 세포는 자연 살해 세포와 같은 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포는 표적 세포의 특정 사멸 및 면역 체계의 다른 구성 요소에 항원을 제시하는데 관여한다. 몇몇 구현예에서, 효과기 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식균할 수 있다. 효과기 세포에서 특정 FcR의 발현은 사이토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 효과기 세포는 표적 항원을 식균하거나 표적 세포를 식균하거나 용해할 수 있다. 적합한 세포독성제 및 제2 치료제는 아래에 예시되어 있으며, 독소(예: 방사성 표지된 펩티드), 화학요법제 및 전구약물을 포함함다. 몇몇 구현예에서, 제2 결합 부위는 상기 정의된 바와 같은 Fc 수용체에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 제2 결합 부위는 NK 세포의 표면 분자에 결합하여 상기 세포가 활성화될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제2 결합 부위는 NKp46에 결합한다. 본 발명의 다중특이적 항체 분자에 대한 예시적인 형태(format)로는 하기의 것들이 있으나 이에 제한되지 않는다: (i) 화학적 헤테로접합에 의해 가교된 2개의 항체(하나는 ILC의 특정 표면 분자에 대한 특이성을 갖고 다른 하나는 제2 항원에 대한 특이성을 가짐); (ii) 2개의 서로 다른 항원 결합 영역을 포함하는 단일 항체; (iii) 2개의 서로 다른 항원 결합 영역, 예를 들어 여분의 펩타이드 링커에 의해 나란히 연결된 2개의 scFv를 포함하는 단일 사슬 항체; (iv) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩타이드 결합을 통해 나란히 연결된 두 개의 가변 도메인을 포함하는 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig)(Wu 등, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig^TM) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (v) 화학적으로 연결된 이중특이적(Fab')2 단편; (vi) 각 표적 항원에 대한 두 개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 두 개의 단일 사슬 디아바디의 융합체인 Tandab; (vii) 다가 분자를 생성하는 scFv와 디아바디의 조합인 플렉시바디(flexibody); (viii) Fab에 적용시, 다른 Fab 단편에 연결된 두 개의 동일한 Fab 단편으로 구성된 삼가 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있는 Protein Kinase A의 "이량체화 및 도킹 도메인"을 기반으로 하는 소위 "독 앤드 락(dock and lock)" 분자; (ix) 예를 들어, 인간 Fab-암의 양쪽 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 전갈(Scorpion) 분자; 및 (x) 디아바디. 이중특이적 항체에 대한 또 다른 예시적인 형태는 이종이량체화를 강제하는 상보적인 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자이다. 이러한 분자는 알려진 기술, 예를 들어 Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech사), Knob-into-Hole(Genentech사), CrossMAb(Roche사) 및 정전기적으로 정합된(Amgen사), LUZ-Y(Genentech사), Strand Exchange Engineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono사), Biclonic(Merus사) 및 DuoBody(Genmab A/S사) 기술로 알려진 것들을 사용하여 제조할 수 있다.

따라서, 몇몇 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

몇몇 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiTE이다. 본원에서 사용되는 용어 "이중특이적 T 세포 참여자(engager)" 또는 "BiTE"는 2개의 유연하게 연결된 단일 사슬 항체(scFv)로 구성된 재조합 단백질 작제물인 이중특이적 항체를 의미한다. 상기 scFv 항체 중 하나는 선택된 표적 세포 발현 종양 항원(즉, CCR8)에 특이적으로 결합하고, 두 번째 항체는 T 세포 상의 T 세포 수용체 복합체의 하위 단위인 CD3와 같은 다른 분자에 특이적으로 결합한다. 몇몇 구현예에서, BiTE 항체는 T 세포를 표적 세포에 일시적으로 결합시킬 수 있는 동시에 T 세포의 세포용해 활성을 활성화할 수 있다. T 세포의 BiTE 매개 활성화에는 T 세포의 특정 T 세포 수용체도 필요하지 않으며 표적 세포의 MHC I 분자, 펩티드 항원 또는 공동 자극 분자도 필요하지 않다.

CCR8 항체-약물 접합체:

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체는 치료 모이어티(moiety), 즉 약물에 접합된다.

몇몇 구현예에서, 치료 모이어티는 예를 들어 세포독소, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 면역 자극제, 용해 펩티드 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 이러한 접합체는 본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 기재된다.

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체는 세포독성 모이어티에 접합된다. 세포독성 모이어티는 예를 들어 다음의 것들로 이루어진 군에서 선택될 수 있다: 탁솔; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티듐 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테노포시드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜히친; 독소루비신; 다우노루비신; 디히드록시 안트라신 디온; 메이탄신 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 튜불린-억제제; 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 F 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 유사분열 억제제; 돌라스타틴 10 또는 15 또는 이의 유사체; 이리노테칸 또는 이의 유사체; 미톡산트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-디하이드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아미신 또는 이의 유사체 또는 유도체; 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 젬시타빈 또는 클라드리빈과 같은 항대사물질; 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진(DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C와 같은 알킬화제; 시스플라틴 또는 카르보플라틴과 같은 백금 유도체; 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 SA, 라첼마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 닥티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신(AMC)과 같은 항생제; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB); 디프테리아 A 사슬 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자와 같은 디프테리아 독소 및 관련 분자, 리신 A 또는 탈당화된 리신 A 사슬 독소와 같은 리신 독소, 콜레라 독소, SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소와 같은 시가(Shiga) 유사 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파사르신, Aleurites fordii 단백질, 디안틴 단백질, PAPI, PAPII 및 PAP-S와 같은 Phytolacca americana 단백질, 모모르디카 여주(momordica charantia ) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I, 포도상구균 장독소 A; 쑥갓 항바이러스 단백질; 디프테린 독소; 및 슈도모나스 내독소.

몇몇 구현예에서, 암세포 고갈에 적합한 항체는 아우리스타틴 또는 이의 펩티드 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 오리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 확인되었고(Woyke 등 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584), 항암 활성(US5663149호) 및 항진균 활성(Pettit 등, (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965)을 갖는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 일반적인 아우리스타틴 유도체로는 AFP, MMAF(모노메틸 아우리스타틴 F) 및 MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E)가 있다. 적합한 아우리스타틴 및 아우리스타틴 유사체, 유도체 및 전구약물뿐만 아니라 아우리스타틴을 Ab에 접합시키기 위한 적합한 링커는 예를 들어 미국특허 5,635,483호, 5,780,588호 및 6,214,345호, 및 국제 특허 출원 공개 WO02088172호, WO2004010957호, WO2005081711호, WO2005084390호, WO2006132670호, WO03026577호, WO200700860호, WO207011968호 및 WO205082023호에 기재되어 있다.

몇몇 구현예에서, 암세포의 고갈에 적합한 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB) 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 적합한 PDB 및 PDB 유도체 및 관련 기술은 예를 들어 문헌[Hartley J. A. 등, Cancer Res 2010; 70(17): 6849-6858; Antonow D. 등, Cancer J 2008; 14(3): 154-169; Howard P.W. 등, Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466, 및 Sagnou 등, Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18): 2083-2086]에 기재되어 있다.

몇몇 구현예에서, 암세포 고갈에 적합한 항체는 안트라사이클린, 메이탄신, 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 라첼마이신(CC-1065), 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 이리노테칸, 모노메틸 아우리스타틴 E, 모노메틸 아우리스타틴 F, PDB, 또는 이들 중 임의의 것의 유사체, 유도체 또는 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택된 세포독성 모이어티에 접합된다.

몇몇 구현예에서, 암세포 고갈에 적합한 항체는 안트라사이클린 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 메이탄신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 칼리케아미신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 듀오카르마이신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 라첼마이신(CC-1065) 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 돌라스타틴 10 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 돌라스타틴 15 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 모노메틸 아우리스타틴 F 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 항체는 이리노테칸 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다.

몇몇 구현예에서, 암세포 고갈에 적합한 항체는 핵산 또는 핵산 관련 분자에 접합된다. 하나의 이러한 구현예에서, 접합된 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제(RNase) 또는 데옥시-리보뉴클레아제(예를 들어, DNase I), 안티센스 핵산, 억제 RNA 분자(예를 들어, siRNA 분자) 또는 면역자극성 핵산(예를 들어, 면역자극성 CpG 모티프 함유 DNA 분자)이다. 몇몇 구현예에서, 항체는 압타머 또는 리보자임에 접합된다.

분자를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Arnon 등, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld 등 편집, Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2판, 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera 등 편집, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin 등 편집, Academic Press, 1985); 및 Thorpe 등, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 참조. 또한, 예를 들어 PCT 공개 WO 89/12624호 참조). 일반적으로, 핵산 분자는 각각 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 말레이미드 작용기를 통해 항체 상의 라이신 또는 시스테인에 공유적으로 부착된다. 조작된 시스테인을 사용하거나 비천연 아미노산의 통합을 사용한 접합 방법은 접합체의 균질성을 향상시키는 것으로 보고되었다(Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K. 등, (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.; Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G. 등, (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778). Junutulaet 등(2008)은 통상의 접합 방법에 비해 향상된 치료 지수를 나타내는 것으로 주장되는 'THIOMAB'(TDC)라고 불리는 시스테인-기반 부위-특이적 접합법을 개발했다. 항체에 통합된 비천연 아미노산에의 접합도 ADC에 대해 연구되고 있지만, 이러한 접근법의 일반성은 아직 확립되지 않았다(Axup 등, 2012). 특히, 당업자는 아실 공여체 글루타민 함유 태그(예를 들어, Gn 함유 펩티드 태그 또는 Q-태그) 또는 폴리펩티드 공학에 의해 반응성이 되는(예를 들어, 폴리펩티드 상의 아미노산 결실, 삽입, 치환 또는 돌연변이를 통해) 내인성 글루타민로 조작된 Fc-함유 폴리펩티드도 구상할 수 있다. 이어서, 트랜스글루타미나제는 아민 공여제(예를 들어, 반응성 아민을 포함하거나 이에 부착된 소분자)와 공유적으로 가교결합하여 아실 공여제와의 조작된 Fc 함유 폴리펩티드 접합체의 안정하고 균질한 집단을 형성할 수 있으며, 상기 아실 공여제는 아실 공여체 글루타민-함유 태그 또는 접근 가능/노출/반응성 내인성 글루타민을 통해 Fc-함유 폴리펩티드에 부위 특이적으로 접합된다(WO 2012059882호).

CCR8 CAR-T 세포

몇몇 구현예에서, 작용제(agent)는 CAR-T 세포이고, 여기서 CAR은 CCR8에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인을 적어도 포함한다.

몇몇 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 아래에 정의된 바와 같이 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본원에서는 "세포내 신호전달 도메인"으로도 기재됨)을 적어도 포함한다. 몇몇 측면에서, 폴리펩티드 세트는 서로 인접해 있다. 몇몇 구현예에서, 폴리펩티드 세트는, 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 연관된 제타 사슬이다. 몇몇 구현예에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 공동자극 분자는 본원에 기재된 공동자극 분자, 예를 들어 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다.

몇몇 구현예에서, CAR은 CCR8에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR은 CCR8에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR은 CCR8에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR은 CCR8에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다.

몇몇 구현예에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단(N-ter)에서 선택적 리더 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에서 리더 서열을 추가로 포함하며, 여기서의 리더 서열은 세포 처리 및 세포막으로의 CAR의 국소화 동안 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다.

특정 측면에서, CAR은 CD3-제타 막관통 도메인 및 엔도도메인에 융합된, CCR8에 특이적인 단클론 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 융합체를 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR은 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 및/또는 OX40과 같은 추가의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 공동자극 분자, 영상화(예를 들어, 양전자 방출 단층촬영)를 위한 리포터 유전자, 전구약물 첨가 시 T 세포를 조건부로 제거하는 유전자 산물, 복귀(homing) 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 및 사이토카인 수용체를 포함하는 분자가 CAR과 함께 공동발현될 수 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 CCR8에 특이적인 항체의 적어도 하나의 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, CCR8에 특이적인 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 부분은, 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일 사슬 항체(scFv), 인간화 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 연속적 폴리펩타이드 사슬의 일부로 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow 등, 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow 등, 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 등, 1988, Science 242:423-426). 몇몇 구현예에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 CCR8에 특이적인 항체 단편을 포함한다. 추가의 측면에서, CAR은 CCR8에 특이적인 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.

CAR-T 세포를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 몇몇 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)에는 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터가 형질도입된다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 몇몇 구현예에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 CAR을 암호화하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 그의 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 전체 CAR 작제물은 그의 전체 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA에서 동의어 코돈(즉, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈)의 발생 빈도가 다른 종에서 편향된다는 발견을 의미한다. 이러한 코돈 축퇴성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 적어도 미국 특허 제 5,300,000호 및 6,114,148호에 개시된 방법을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 글리코실화, 아미드화, 카르복실화, 인산화, 에스테르화, N-아실화, 고리화(예를 들어, 이황화 브릿지를 통해)되거나 산 부가염으로 전환되고/되거나 선택적으로 이량체화 또는 중합될 수 있다.

몇몇 구현예에서, CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 바람직하다면 CAR 활성이 제어될 수 있다. CAR 활성을 조절할 수 있는 방법에는 여러 가지가 있다. 예를 들어, 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용하는 유도성 세포자멸사(예를 들어, 문헌[Di 등, N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3;365(18):1673-1683] 참조)가 본 발명의 CAR 치료법에서 안전 스위치로 사용될 수 있다.

약학적 조성물:

일반적으로, 본 발명의 작용제는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 형태로 환자에게 투여된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 완충 물질, 글리신, 소르빈산, 소르빈산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어, 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 및 양모 지방이 있으나 이에 제한되지 않는다. 환자에게 투여하는데 사용하기 위해, 조성물은 환자에게 투여를 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 구강으로, 질로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 기법으로는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 윤활막내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법이 있다. 본 발명의 조성물의 멸균 주사용 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기법에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 내의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 내의 용액일 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 일반적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 부드러운 고정 오일을 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세리드 유도체와 같은 지방산은 주사제 제조에 유용하며, 특히 폴리옥시에틸화된 올리브 오일이나 피마자유와 같은 천연의 약학적으로 허용되는 오일도 마찬가지이다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 에멀샨 및 현탁액을 비롯한 약학적으로 허용되는 투여 형태의 제제에 일반적으로 사용되는 유사한 분산제를 함유할 수도 있다. 약학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 Tweens, Spans 및 기타 에멀션화제 또는 생체이용률 향상제와 같은 기타 일반적으로 사용되는 계면활성제도 제형화의 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 경구적으로 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체로는 유당 및 옥수수 전분이 있다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제로는 예를 들어 락토스가 있다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우, 유효 성분을 에멀션화제 및 현탁화제와 결합시킨다. 원하는 경우, 특정 감미료, 향료 또는 착색제를 첨가할 수도 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 직장 투여용 좌제 형태로 투여될 수 있다. 이들은 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적합한 비자극성 부형제와 작용제(agent)를 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 본 발명의 조성물은, 특히 치료 표적이 눈, 피부 또는 하부 장관의 질병을 포함하여 국소 적용에 의해 쉽게 접근할 수 있는 부위 또는 기관을 포함하는 경우, 국소적으로 투여될 수도 있다. 이들 부위 또는 기관 각각에 적합한 국소 제제가 쉽게 제조된다. 국소 적용의 경우, 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 유효 성분을 함유하는 적합한 연고로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체로는 미네랄 오일, 액체 바셀린, 화이트 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체에 현탁되거나 용해된 유효 성분을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 적합한 담체로는 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물이 있으나 이에 제한되지 않는다. 하부 장관에 대한 국소 적용은 직장 좌약 제제(위 참조) 또는 적합한 관장 제제로 이루어질 수 있다. 패치를 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 조성물은 약학적 제제의 분야에 널리 알려진 기법에 따라 제조되며, 벤질 알코올 또는 기타 적합한 방부제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 내의 용액으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 존재하는 항체는 100 mg(10 mL) 또는 500 mg(50 mL) 일회용 바이알에 10 mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. 이 제품은 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 구연산나트륨 이수화물, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 주사용 멸균수에서 IV 투여용으로 제형화된다. pH를 6.5로 조정된다. 본 발명의 약제학적 조성물 내의 항체에 대한 예시적인 적합한 투여량 범위는 약 1 mg/m² 내지 500 mg/m²일 수 있다. 그러나, 이들 스케줄은 예시적이며, 임상 시험에서 결정되어야 하는 약학적 조성물 내의 특정 항체의 친화도 및 내약성을 고려하여 최적의 스케줄 및 요법이 조정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 주사(예를 들어, 근육내, 정맥내)를 위한 본 발명의 약학적 조성물은 멸균 완충수(예를 들어 근육내의 경우 1 ml) 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 100 mg 내지 약 100 mg, 약 50 ng 내지 약 30 mg, 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 억제제를 함유하도록 제조될 수 있다.

진단 방법:

본 발명의 추가 목적은 환자로부터 얻은 샘플에서 CCR8의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는 환자에서 T 세포 림프종을 진단하는 방법에 관한 것이다.

몇몇 구현예에서, 본 발명은 환자로부터 얻은 샘플에서 CCR8의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는 환자에서 T 세포 림프종을 진단하는 방법에 관한 것이며, 여기서 미리 결정된 기준 값과 비교한 CCR8의 과발현은 상기 환자는 상기 T세포 림프종을 앓고 있다는 것을 나타낸다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 간비장 T 세포 림프종, 자연 살해 T 세포 림프종 또는 피부 T 세포 림프종을 진단하는데 특히 적합하다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 피부 T 세포 림프종을 진단하는데 특히 적합하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 세자리 증후군을 진단하는데 특히 적합하다.

본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 시험관내 평가 목적으로 얻은 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 몇몇 구현예에서,샘플은 PBMC 샘플이다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 (i) 정제된 혈액 백혈구, (ii) 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC, (iii) 정제된 림프구, (iv) 정제된 T 세포, (v) 정제된 CD4+ T 세포 또는 (vi) 정제된 CD3+ T 세포의 샘플이다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 정제된 CD3+CD4+CD26- 및/또는 CD7-KIR3DL2+ 림프구의 샘플이다. 몇몇 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플이다. 용어 "조직 샘플"은 생검 또는 부검 샘플과 같은 조직 절편 및 조직학적 목적으로 채취한 냉동 절편을 포함한다. 따라서 몇몇 구현예에서, 조직 샘플은 대상체의 피부에서 수행된 생검의 결과일 수 있다.

몇몇 구현예에서, 마커의 수준은 면역조직화학(IHC)에 의해 결정된다. 면역조직화학은 일반적으로 다음 단계를 포함한다. i) 상기 조직 샘플을 포르말린으로 고정하는 단계, ii) 상기 조직 샘플을 파라핀에 포매하는 단계, iii) 상기 조직 샘플을 염색용 절편으로 절단하는 단계, iv) 상기 절편을 마커에 특이적인 결합 파트너와 함께 인큐베이션하는 단계, v) 상기 절편을 헹구는 단계, vi) 상기 절편을 비오티닐화된 2차 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, vii) 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체를 이용하여 항원-항체 복합체를 확인하는 단계. 따라서, 조직 샘플은 먼저 결합 파트너와 함께 배양된다. 세척 후, 관심 마커에 결합된 표지된 항체는 표지된 항체가 보유하는 표지(label), 예를 들어 방사성, 형광성 또는 효소 표지의 종류에 따라 적절한 기법을 통해 확인한다. 다중 표지를 동시에 수행할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 증폭 시스템(염색 신호를 강화하기 위한) 및 효소 분자에 결합된 2차 항체를 사용할 수 있다. 이러한 결합된 2차 항체는 예를 들어 Dako사로부터 EnVision system으로서 상업적으로 이용 가능하다. 대조 염색, 예를 들어 H&E, DAPI, Hoechst이 사용될 수 있다. 다른 염색 방법은 자동화, 반자동화 또는 수동 시스템을 비롯한, 당업자에게 명백한 임의의 적합한 방법 또는 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표지를 항체에 부착하여 표적 단백질(즉, 마커)을 검출할 수 있다. 예시적인 표지로는 방사성 동위원소, 형광단, 리간드, 화학발광제, 효소 및 이들의 조합이 있다. 몇몇 구현예에서, 표지는 양자점이다. 1차 및/또는 2차 친화성 리간드에 접합될 수 있는 표지의 비제한적인 예로는 형광 염료 또는 금속(예: 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 플루오레스카민), 발색 염료(예: 로돕신), 화학발광 화합물(예: 루미날, 이미다졸) 및 생물발광 단백질(예: 루시페린, 루시퍼라제), 합텐(예: 비오틴)이 있다. 다양한 다른 유용한 형광물질(fluorescer) 및 발색단(chromophore)은 문헌[Stryer L(1968) Science 162:526-533 및 Brand L 및 Gohlke JR(1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868]에 기재되어 있다. 또한, 친화성 리간드는 효소(예: 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-락타마제), 방사성 동위원소(예: 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I) 및 입자(예: 금)로 표지될 수 있다. 다양한 화학적 반응, 예를 들어 아민 반응 또는 티올 반응을 사용하여 다양한 유형의 표지를 친화성 리간드에 접합할 수 있다. 그러나, 아민 및 티올 이외의 다른 반응성 기, 예를 들어 알데히드, 카르복실산 및 글루타민을 사용할 수 있다. 관심 단백질을 검출하기 위한 다양한 효소적 염색 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 효소적 상호작용은 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제와 같은 다양한 효소 또는 DAB, AEC 또는 Fast Red와 같은 다양한 발색체(chromogen)를 사용하여 시각화할 수 있다. 다른 예에서, 항체는 표지된 결합 파트너 또는 항체를 통해 검출될 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 접합될 수 있다. 간접 IHC 분석에서는 표지되지 않기 때문에 첫 번째 결합 파트너의 결합을 검출하기 위해 2차 항체 또는 두 번째 결합 파트너가 필요하다. 얻어지는 염색된 표본은, 각각 검출 가능한 신호를 보고(viewing) 염색의 디지털 이미지와 같은 이미지를 획득하기 위한 시스템을 사용하여 이미지화된다. 이미지 획득 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 샘플이 염색되면, 정립 또는 도립 광학 현미경, 주사 공초점 현미경, 카메라, 스캐닝 또는 터널링 전자 현미경, 캐닝 프로브 현미경 및 이미징 적외선 검출기와 같은 임의의 광학 또는 비광학 이미징 장치를 사용하여 염색 또는 바이오마커 라벨을 검출할 수 있다. 몇몇 예에서, 이미지는 디지털 방식으로 캡처될 수 있다. 획득된 이미지는 샘플 내 마커의 양을 정량적 또는 반정량적으로 결정하는데 사용될 수 있다. 면역조직화학과 함께 사용하기에 적합한 다양한 자동화된 샘플 처리, 스캐닝 및 분석 시스템이 당업계에서 입수가능하다. 이러한 시스템은 자동화된 염색 및 현미경 스캐닝, 컴퓨터 이미지 분석, 연속 절편 비교(샘플 방향 및 크기의 변화에 대한 제어를 위해), 디지털 보고서 생성, 및 샘플 보관 및 추적(예: 조직 절편이 위치하는 슬라이드 등)을 포함할 수 있다. 면역염색 샘플을 비롯한 세포 및 조직에 대한 정량 분석을 수행하기 위해 통상적인 광학 현미경과 디지털 이미지 처리 시스템을 겸비한 세포 이미징 시스템이 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, CAS-200 시스템(Becton, Dickinson & Co.사)을 참조한다. 특히, 검출은 수동으로 이루어질 수 있거나, 컴퓨터 프로세서 및 소프트웨어를 포함하는 이미지 처리 기법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 소프트웨어를 사용하면, 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 예를 들어 염색 품질 또는 염색 강도를 포함하는 요인에 기반하여 이미지를 구성, 교정, 표준화 및/또는 검증할 수 있다(예를 들어, 공개된 미국특허 공보 US20100136549호 참조). 이미지는 샘플의 염색 강도에 따라 정량적 또는 반정량적으로 분석되고 점수가 매겨질 수 있다. 정량적 또는 반정량적 조직화학법은 지정된 바이오마커(즉, 마커)의 존재를 식별하고 정량화하기 위해 조직화학법을 거친 샘플을 스캐닝하고 점수를 매기는 방법을 의미한다. 정량적 또는 반정량적 방법은 이미징 소프트웨어를 사용하여 염색 밀도 또는 염색량을 검출하거나, 인간의 눈으로 염색을 검출하는 방법을 사용할 수 있으며, 이 경우 숙련된 작업자는 결과의 순위를 수치로 매긴다. 예를 들어, 이미지는 픽셀 카운트 알고리즘(예: Aperio Spectrum 소프트웨어, 자동 정량 분석 플랫폼(AQUA® 플랫폼)) 및 염색 정도를 측정하거나 정량화하거나 반정량화하는 기타 표준 방법을 사용하여 정량적으로 분석할 수 있다: 예를 들어, 미국특허 8,023,714호; 미국특허 7,257,268호; 미국특허 7,219,016호; 미국특허 7,646,905호; 공개된 미국특허 공보US20100136549호 및 20110111435호; 문헌[Camp 등, (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327; Bacus 등, (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328)]을 참조한다. 총 염색 면적의 합에 대한 강한 양성 염색(예: 갈색 염색)의 비율을 계산하고 점수를 매길 수 있다. 검출된 바이오마커(즉, 마커)의 양은 정량화되고 양성 픽셀의 백분율 및/또는 점수로 제공된다. 예를 들어, 양수 픽셀의 백분율로 양을 정량화할 수 있다. 몇몇 예에서, 양은 염색된 영역의 백분율, 예를 들어 양성 픽셀의 백분율로 정량화된다. 예를 들어, 샘플은 전체 염색 영역과 비교하여 적어도 약 0, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 양성 픽셀을 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서, 샘플의 조직화학적 염색의 강도 또는 양을 수치로 표현하고 샘플에 존재하는 표적 바이오마커(예를 들어, 마커)의 양을 나타내는 점수가 샘플에 주어진다. 광학 밀도 또는 백분율 영역 값은 예를 들어 정수 척도로 환산 점수(scaled score)를 부여받을 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기의 단계를 포함한다: i) 마커와 선택적으로 상호작용할 수 있는 결합 파트너(예: 위에서 설명한 바와 같은 항체)를 이용하여 자동화된 슬라이드 염색 시스템에 의해 얻은 조직 절편의 하나 이상의 면역염색 슬라이스를 제공하는 단계; ii) 고해상도 스캔 캡처를 통해 단계 a의 슬라이드를 디지털화하는 단계; iii) 디지털 사진에서 조직 섹션의 슬라이스를 검출하는 단계, iv) 동일한 표면을 갖는 균일하게 분포된 단위를 갖는 크기 기준 그리드를 제공하는 단계(상기 그리드는 분석할 조직 절편의 크기에 맞춰 조정됨); 및 v) 각 유닛에서 염색된 세포의 검출, 정량 및 강도를 측정하여 각 유닛에서 염색된 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 단계.

몇몇 구현예에서, 마커의 수준은 유세포 분석 방법에 의해 결정된다. 본원에서 사용되는 용어 "유세포 분석 방법"은 관심 세포를 유체 흐름에 부유시키고 이를 전자 검출 장치를 통과시켜서 계수하는 기법을 의미한다. 유세포 분석 방법을 사용하면, 초당 최대 수천 개까지의 이벤트의 물리적 및/또는 화학적 매개변수(예를 들어, 형광 매개변수)를 동시에 다중 매개변수 분석할 수 있다. 최신 유세포 분석 장비에는 일반적으로 여러 개의 레이저와 형광 검출기가 있다. 유세포 분석 기법의 일반적인 변형법은 "형광-활성화 세포 분류"를 사용하여 관심 집단을 정제하거나 검출하기 위해 입자의 특성에 따라 입자를 물리적으로 분류하는 것이다. 본원에서 사용되는 "형광-활성화 세포 분류"(FACS)는 각 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성을 기반으로 생물학적 시료의 이질적인 세포 혼합물을 두 개 이상의 용기로 한 번에 한 세포씩 분류하는 유세포 분석 방법을 의미하며, 개별 세포의 형광 신호를 빠르고 객관적이며 정량적으로 기록할 뿐만 아니라 특정 관심 세포의 물리적 분리도 제공한다. 따라서, FACS는 본 발명의 세포 집단을 분리하고 검출하기 위해 본원에 기술된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광-활성화 세포 분류(FACS)가 사용될 수 있고, 이는 실질적으로 제조사의 지시에 따라 사용되는 BD Biosciences FACSCanto™ 유세포 분석기와 같은, 다중 형광단의 동시 여기 및 검출이 가능한 유세포 분석기의 사용을 포함한다. 세포계산 시스템(cytometric system)에는 아래에 설명된 바와 같이 세포계산 샘플 유체 하위시스템이 포함될 수 있다. 또한, 세포계산 시스템에는 세포계산 샘플 유체 하위시스템에 유체적으로 연결된 세포계측기가 포함된다. 본 발명의 시스템은 데이터 출력 장치(예: 모니터, 프린터 및/또는 스피커), 소프트웨어(예: Flowjo, Laluza™), 데이터 입력 장치(예: 인터페이스 포트, 마우스, 키보드 등), 유체 취급 부품, 전원 등과 같은 다수의 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 샘플은 관심 세포 집단의 특정 마커에 특이적인 항체 패널과 접촉된다. 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 R&D Systems사, BD Biosciences사, e-Biosciences사, Biolegend사, Proimmune사 및 Miltenyi사와 같은 공급업체로부터 상업적으로 입수할 수 있거나, 당업자에게 알려진 방법에 의해 이들 세포 표면 마커에 대해 생산될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 작용제는 관심 세포 집단의 분리 및 검출을 용이하게 하기 위해 태그로 표지된다. 본원에서 사용되는 용어 "표지" 또는 "태그"는 표적의 존재, 예를 들어 생물학적 시료 내 특정 세포 표면 마커의 존재를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 구성요소를 의미한다. 적합한 표지로는 형광 분자, 방사성 동위원소, 뉴클레오티드 발색단, 효소, 기질, 화학발광 모이어티, 자성 입자, 생물발광 모이어티 등이 있다. 따라서, 표지는 암세포를 분리하고 검출하는 방법에 필요한 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단을 통해 검출할 수 있는 임의의 구성 요소이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체와 같은 작용제를 표지하기 위한 형광 표지 또는 태그의 비제한적 예로는 하이드록시쿠마린, 숙신이미딜 에스테르, 아미노쿠마린, 숙신이미딜 에스테르, 메톡시쿠마린, 숙신이미딜 에스테르, 캐스케이드 블루, 하이드라지드, 퍼시픽 블루, 말레이미드, 퍼시픽 오렌지, 루시퍼 옐로우, NBD, NBD-X, R-피코에리트린(PE), PE-Cy5 접합체(사이크롬, R670, 3색, 퀀텀 레드), PE-Cy7 접합체, Red 613, PE-Texas Red, PerCP, PerCPeFluor 710, PE-CF594, 페리디닌 엽록소 단백질, TruRed(PerCP-Cy5.5 접합체), FluorX, 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), BODIPY-FL, TRITC, X-로다민(XRITC), 리사민 로다민 B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌(APC), APC-Cy7 접합체, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, BV 785, BV711, BV421, BV605, BV510 또는 BV650이 있다. 위에서 언급한 분석법은 고체 지지체에의 항체의 결합을 포함할 수 있다. 고체 표면은 항체로 코팅된 미세적정 플레이트일 수 있다. 대안적으로, 고체 표면은 활성화된 비드, 자기 반응성 비드와 같은 비드일 수 있다. 비드는 유리, 플라스틱, 폴리스티렌, 아크릴을 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 재료로 이루어질 수 있다. 또한, 비드는 바람직하게는 형광 표지된다. 바람직한 구현예에서, 형광 비드는 Becton Dickinson Biosciences사(켈리포니아주 산호세)에서 입수가능한 TruCount™ 튜브에 포함된 것들이다.

몇몇 구현예에서, 방법은 하나 이상의 추가 마커의 발현 수준을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일반적으로, 마커는 KIR3DL2, PLS3, Twist 및 NKp46으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 명세서에서, 각 관심 마커의 명칭은, 특히 인터넷 주소 http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/index.html에서 이용가능한 HUGO Gene Nomenclature Committee의 데이터베이스를 비롯하여, 국제적으로 인정된 유전자 서열 및 단백질 서열 데이터베이스에서 발견되는, 해당 유전자의 국제적으로 인정되는 명칭을 의미한다. 본 명세서에서, 관심 있는 다양한 마커 각각의 명칭은 국제적으로 인정되는 유전자 서열 및 단백질 서열 데이터베이스인 Genbank에서 발견되는, 해당 유전자의 국제적으로 인정되는 명칭을 의미할 수도 있다. 이러한 국제적으로 인정된 서열 데이터베이스를 통해, 당업자는 본원에 기술된 관심 마커 각각에 상응하는 핵산 및 아미노산 서열을 검색할 수 있다.

다중 조직 분석 기법은 조직 샘플의 여러 마커를 정량화하는데 특히 유용하다. 이러한 기법은 사용하면 단일 조직 샘플에서 최소 5개 또는 최소 10개 이상의 바이오마커를 측정할 수 있어야 한다. 더욱이, 바이오마커의 위치를 보존하고 암성 세포와 비암성 세포에서 바이오마커의 존재를 구별할 수 있는 기법이 유리하다. 이러한 방법으로는 예를 들어 미국 특허 5,300,000호, 6,602,661호, 6,969,615호, 7,214,477호 및 7,838,222호, 미국특허 공개 2011/0306514호(본원에 참조로 포함됨), 및 문헌[Chung & Hewitt, Meth Mol Biol, Prot Blotting Detect, Kurlen & Scofield, eds. 536: 139-148, 2009]에 교시된 층상 면역조직화학(L-IHC), 층상 발현 스캐닝(LES) 또는 다중 조직 면역블롯팅(MTI)이 있으며, 상기 각 참조문헌은 층상 및 블로팅된 막, 종이, 필터 등에 대한 조직 절편의 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 11개 이상의 이미지를 만드는 것이 사용될 수 있음을 교시하고 있다. L-IHC/MTI 공정을 수행하는데 유용한 코팅된 막은 20/20 GeneSystems, Inc.사(메릴랜드주 록빌)로부터 입수가능하다.

몇몇 구현예에서, L-IHC 방법은 신선하거나 보존된 다양한 조직 샘플 중 임의의 것에 대해 수행될 수 있다. 샘플은, 10% 일반 완충 포르말린에 정기적으로 고정되고 병리과에서 처리되는 핵심 니들 생검을 포함하였다. 표준 5μm 두께의 조직 절편을 조직 블록으로부터 대전된 슬라이드로 절단하여 L-IHC에 사용했다. 따라서, L-IHC는 본질적으로 조직 "이미지"의 카피를 생성하기 위해 조직 절편으로부터 복수의 생체친화성-코팅 막으로 전달된 분자의 카피를 얻음으로써 조직 절편에서의 여러 마커를 테스트할 수 있다. 파라핀 절편의 경우, 조직 절편은 당업계에 알려진 바와 같이 탈파라핀화되는데, 예를 들어 절편을 자일렌 또는 NEO-CLEAR®와 같은 자일렌 대체물, 및 등급(graded) 에탄올 용액에 노출시킨다. 절편은 파파인, 트립신, 단백질분해효소 K 등과 같은 단백질분해효소로 처리될 수 있다. 그 다음, 예를 들어 스택을 통해 단백질과 같은 조직 분자를 전달하기 위한 직경 0.4μm의 기공을 갖는 10μm 두께의 코팅된 중합체 백본의 복수 시트를 포함하는 막 기판의 스택을 조직 절편 상에 위치시킨다. 체액 및 조직 분자의 이동은 본질적으로 막 표면에 대해 수직으로 구성된다. 섹션, 멤브레인, 스페이서 페이퍼, 흡수성 페이퍼, 웨이트 등의 의 샌드위치는 조직으로부터 멤브레인 스택으로 분자의 이동을 촉진하기 위해 열에 노출될 수 있다. 조직의 단백질의 일부는 스택(20/20 GeneSystems, Inc.사(메릴랜드주 록빌)로부터 구입 가능함)의 생체친화성-코팅 막 각각에 포획된다. 따라서, 각각의 막은 조직의 카피를 포함하고, 표준 면역블로팅 기법을 사용하여 다른 바이오마커에 대해 조사될 수 있으며, 이는 단일 조직 절편에 대해 수행되는 바와 같이 마커 프로필의 개방형 확장을 가능하게 한다. 단백질의 양은 조직으로부터 스택 내의 더 먼 곳에 있는 막에서 더 낮을 수 있으므로, 예를 들어 조직 샘플 내 분자의 양이 다르고, 조직 샘플에서 방출된 분자의 이동성이 다르며, 단백질의 결합 친화도가 다르고, 막에 대한 분자의 결합 친화도, 이동 길이 등이 다를 수 있으므로, 값의 정규화, 제어 실행, 조직 분자의 전달된 수준 평가 등이, 막 내부, 막 사이 및 막 중에서(among)에서 발생하는 변화를 수정하고 막 내부, 막 사이 및 막 중에서의 정보를 직접 비교할 수 있도록 하는 절차에 포함될 수 있다. 따라서, 총 단백질은 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어, 표준 시약 및 방법을 사용하여 단백질과 같은 이용가능한 분자를 비오티닐화한 다음, Blot fastStain, Ponceau Red, Brilliant Blue 염료 등과 같은 단백질 염료인 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 막을 노출시켜서 결합된 비오틴을 확인함으로써 단백질을 정량하는 수단을 사용하여 막별로 측정할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 본 방법은 바이오마커를 측정하기 위해 다중 조직 각인(MTI) 기술을 이용하며, 여기서 방법은 다중 바이오마커, 몇몇의 경우에는 적어도 6개의 바이오마커를 허용함으로써 귀중한 생검 조직을 보존한다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 일부로서 사용될 수도 있는 대안적인 다중 조직 분석 시스템이 존재한다. 이러한 기법 중 하나는 질량 분광분석-기반 선택 반응 모니터링(SRM) 분석 시스템(OncoPlexDx사(메릴랜드주 록빌)에서 입수가능한 "액체 조직")이다. 그 기법은 미국특허 7,473,532호에 기재되어 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 GE Global Research사(뉴욕주 니스카유나)에 의해 개발된 다중 IHC 기법을 활용했다. 그 기법은 미국특허 공개 2008/0118916호 및 2008/0118934호에 기재되어 있다. 거기에서는, 형광 프로브를 샘플에 결합시킨 후 신호를 검출하고, 프로브를 비활성화한 다음, 또 다른 표적에 프로브를 결합시키고, 검출 및 비활성화하고, 모든 표적이 검출될 때 까지 이러한 과정을 반복하는 단계를 포함하여, 다수의 표적을 포함하는 생물학적 샘플에 대해 순차적 분석이 수행된다.

몇몇 구현예에서, 신호가 다중 스펙트럼 이미지 시스템으로 측정될 수 있는 형광(예를 들어, 형광단 또는 양자점)을 사용할 때 다중 조직 이미징이 수행될 수 있다. 다중 스펙트럼 이미징은 이미지의 각 픽셀에서의 분광 정보를 수집하고 결과 데이터를 스펙트럼 이미지 처리 소프트웨어로 분석하는 기법이다. 예를 들어, 시스템은 전기적으로 연속적으로 선택 가능한 다양한 파장의 일련의 이미지를 촬영한 다음 이러한 데이터를 처리하도록 설계된 분석 프로그램을 이용할 수 있다. 따라서 시스템은, 염료의 스펙트럼이 크게 중첩되거나 동일 위치에 있거나 스펙트럼 곡선이 다른 경우 샘플 내의 동일한 지점에서 발생하는 경우에도, 다수의 염료로부터 동시에 정량적 정보를 얻을 수 있다. 많은 생물학적 물질은 자동으로 형광을 발하거나, 고에너지 빛에 의해 여기되는 경우 저에너지 빛을 방출한다. 이러한 신호로 인해 이미지와 데이터의 대비(contrast)가 낮아질 수 있다. 다중 스펙트럼 이미징 기능이 없는 고감도 카메라는 형광 신호와 함께 자가형광 신호만을 증가시킨다. 다중 스펙트럼 이미징은 조직으로부터의 자가형광을 혼합하거나 분리함으로써, 달성 가능한 신호 대 잡음비를 증가시킬 수 있다. 간략하게, 정량화는 하기의 단계를 통해 수행할 수 있다: i) 대상체로부터 얻은 종양 조직 마이크로어레이(TMA)를 제공하는 단계; ii) TMA 샘플을 관심 단백질(들)의 특이성을 갖는 항-항체로 염색하는 단계; iii) TMA 슬라이드를, 종양과 간질의 자동 분할을 돕기 위해 상피 세포 마커로 추가로 염색하는 단계; iv) TMA 슬라이드를 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 스캔하는 단계; v) 스캔한 이미지를, 강력한 패턴 인식 알고리즘을 통해 특정 조직을 감지, 정량화 및 분할할 수 있는 자동화된 이미지 분석 소프트웨어(예: Perkin Elmer Technology)를 사용하여 처리하는 단계. 기계 학습 알고리즘은 일반적으로 간질에서 종양을 분할하고 표지된 세포를 식별하도록 이전에 훈련되었다.

몇몇 구현예에서, 마커의 수준은 핵산 수준에서 결정된다. 일반적으로, 유전자의 수준은 mRNA의 양을 결정함으로써 결정될 수 있다. mRNA의 양을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 샘플(예: 대상체로부터 준비된 세포 또는 조직)에 포함된 핵산은 먼저 예를 들어 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 표준 방법에 따라 추출되거나 제조사의 지침에 따라 핵산 결합 수지를 이용하여 추출된다. 추출된 mRNA는 혼성화(예를 들어, 노던 블롯 분석, 현장 혼성화) 및/또는 증폭(예를 들어, RT-PCR)을 통해 검출된다. 다른 증폭 방법으로는 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사 매개 증폭(TMA), 가닥 치환 증폭(SDA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)이 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 마커의 발현 수준을 미리 결정된 기준 값과 비교하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 마커의 발현 수준과 미리 결정된 기준 값 사이의 차이를 검출하는 것은 대상체가 T 세포 림프종을 가지고 있는지 여부를 나타낸다.

몇몇 구현예에서, 미리 결정된 기준 값은, 동일하거나 유사한 연령대의 대상체, 동일하거나 유사한 인종 그룹의 대상체, 및 동일한 병변 중증도를 갖는 대상체를 제한 없이 포함하는 인구 연구로부터 도출된 수치 또는 값에 대한 상대적인 값이다. 이러한 미리 결정된 기준 값은 수학적 알고리즘 및 계산된 지수로부터 얻은 인구 집단의 통계 분석 및/또는 위험 예측 데이터로부터 도출될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 적절하게 보관된 과거 대상체 샘플에서 마커 수준의 소급 측정을 사용하여 이러한 미리 결정된 기준 값을 확립할 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 미리 결정된 기준 값은 임계값 또는 컷오프 값이다. 검사의 기능 및 수혜/위험 균형(위양성 및 위음성의 임상적 결과)에 따라 최적의 민감도 및 특이도를 얻기 위해 임계값을 결정해야 한다. 일반적으로, 최적의 민감도 및 특이도(및 임계값)은 실험 데이터를 기반으로 하는 ROC(수신기 작동 특성) 곡선을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 기준군에서의 마커의 수준을 결정한 후, 검사할 샘플에서 측정된 마커의 수준을 통계적으로 처리하기 위한 알고리즘 분석을 사용하여 샘플 분류를 위한 유위성을 갖는 분류 기준을 얻을 수 있다. ROC 곡선의 전체 명칭은 수신자 작동 특성 곡선이라고 알려져 있는 수신자 작동 특성 곡선이다. 이는 주로 임상 생화학적 진단 검사에 사용된다. ROC 곡선은 진양성률(민감도)과 위양성률(1-특이도)의 연속적 변수를 반영하는 종합 지표이다. 이는 이미지 구성 방법을 통해 민감도와 특이도의 관계를 나타낸다. 일련의 서로 다른 컷오프 값(한계값 또는 임계값, 진단 검사의 정상 및 비정상 결과 사이의 경계값)을 연속 변수로 설정하여 일련의 민감도 및 특이도 값을 계산한다. 그런 다음, 민감도를 수직 좌표로 사용하고 특이도를 수평 좌표로 사용하여 곡선을 그린다. 곡선아래 면적(AUC)이 높을수록 진단 정확도가 높다. ROC 곡선에서는, 좌표도의 가장 왼쪽 상단에 가장 가까운 지점이 높은 민감도 및 높은 특이도 값을 모두 갖는 임계점이다. ROC 곡선의 AUC 값은 1.0 내지 0.5이다. AUC>0.5인 경우, AUC가 1에 가까워질수록 진단 결과는 점점 좋다. AUC가 0.5 내지 0.7인 경우 정확도는 낮다. AUC가 0.7 내지 0.9인 경우 정확도는 보통이다. AUC가 0.9보다 높은 경우, 정확도는 아주 높다. 이러한 알고리즘 방법은 바람직하게는 컴퓨터를 사용하여 수행된다. ROC 곡선을 그리기 위해서는 당업계에서의 기존 소프트웨어 또는 시스템, 예를 들어 MedCalc 9.2.0.1 의료 통계 소프트웨어, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0(Dynamic Microsystems, Inc.사, 미국 메릴랜드주 실버 스프링) 등을 사용할 수 있다.

일반적으로, 실시예에서 입증된 바와 같이, CCR8의 발현 수준은 건강한 개체의 샘플에서 결정된 발현 수준보다 높다. 몇몇 구현예에서, CCR8 발현 수준은 형광 강도를 이용하여 결정된다. 몇몇 구현예에서, CCR8 발현 수준은 CCR8 평균 형광 강도를 이용하여 결정된다. 몇몇 구현예에서, 방법은, CCR8 평균 형광 강도를 결정하고 CCR8 평균 형광 강도를 결정가 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 또는 500 보다 높은 경우 환자는 T 세포 림프종을 앓고 있다고 결론짓는 것으로 구성되는 추가 단계를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 CCR8 평균 형광 강도를 결정하고 CCR8 평균 형광 강도가 400보다 높은 경우 환자는 T 세포 림프종을 앓고 있다고 결론짓는 것으로 구성되는 추가 단계를 포함한다. 몇몇 구현예에서, CCR8 발현 수준은 CCR8 델타 평균 형광 강도를 사용하여 결정된다. 몇몇 구현예에서, CCR8 델타 평균 형광 강도는 IgG2a 대조군 이소형 발현 수준과 비교하여 계산된다. 몇몇 구현예에서, CCR8 델타 평균 형광 강도는 IgG2a 대조군 이소형 평균 형광 강도와 비교하여 계산된다. 몇몇 구현예에서, 방법은, CCR8 델타 평균 형광 강도를 결정하고 CCR8 델타 평균 형광 강도가 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 또는 500 보다 높은 경우 환자는 T 세포 림프종을 앓고 있다고 결론짓는 것으로 구성되는 추가 단계를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은, CCR8 델타 평균 형광 강도를 결정하고 CCR8 델타 평균 형광 강도가 160보다 높은 경우 환자는 T 세포 림프종을 앓고 있다고 결론짓는 것으로 구성되는 추가 단계를 포함한다.

CCR8 발현 수준에 미치는 작용제(예: 약물 화합물)의 영향을 모니터링하는 것은 시간 경과에 따라 환자에서 T 세포 림프종 상태를 모니터링하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 항-T세포 림프종 치료를 받고 있는 대상체를 치료하는 동안 마커 발현에 영향을 미치는 작용제의 유효성을 모니터링할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, T 세포 림프종을 앓고 있는 환자의 치료 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다:

(i) 작용제를 투여하기 전에 환자로부터 투여전(pre-administration) 샘플을 얻는 단계;

(ii) 투여전 샘플에서 CCR8의 발현 수준을 검출하는 단계;

(iii) 환자로부터 하나 이상의 투여후(post-administration) 샘플을 얻는 단계;

(iv) 투여후 샘플에서 동일한 마커(들)의 발현 수준을 검출하는 단계;

(v) 투여전 샘플 내 CCR8 발현 수준을 투여후 샘플 또는 샘플들 내 CCR8 발현 수준과 비교하는 단계; 및

(vi) 이에 따라 환자에의 작용제의 투여를 변경하는 단계.

예를 들어, 치료 과정 동안 CCR8의 발현 수준을 평가함으로써 결정되는 더 나쁜 진단은 투여량(dosage)이 효과적이지 않고 투여량을 늘리는 것이 바람직함을 나타낼 수 있다. 반대로, CCR8의 발현 수준을 평가함으로써 결정되는 더 나은 진단은 효과적인 치료가 가능하고 투여량을 변경할 필요가 없음을 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 T 세포 림프종을 앓고 있는 환자에서 치료법을 조정하는(adapting) 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

a) 상기 환자로부터 수집된 적어도 하나의 시료에 대하여 본원에 개시된 체외 진단 방법을 수행하는 단계; 및

b) 상기 환자에게 투여함으로써 상기 환자의 치료법을 조정하는 단계.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 진단 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 다수의 시약, 특히 CCR8 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작용제를 포함한다. 마커 단백질과의 결합에 적합한 시약으로는 항체, 항체 유도체, 항체 단편 등이 있다. 마커 핵산(예: 게놈 DNA, mRNA, 스플라이싱된 mRNA, cDNA 등)과의 결합에 적합한 시약에는 상보적인 핵산이 포함된다. 예를 들어, 핵산 시약에는 기질에 고정된 올리고뉴클레오티드(표지되거니 또는 비표지됨), 기질과 결합되지 않은 표지된 올리고뉴클레오티드, PCR 프라이머 쌍, 분자 표지(beacon) 프로브 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 추가 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 상보적 핵산을 어닐링하는데 적합하거나 특이적으로 결합하는 단백질과 항체를 결합시키는데 적합한 유체(예: SSC 완충액), 하나 이상의 샘플 구획, 본 발명의 시험관내 진단 방법의 성능을 설명하는 지침 자료 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

도 1 . 세자리 증후군 환자 유래의 신선한 말초 혈액 종양 세포에서 CCR8 발현
도 2 . T세포 림프종 세포주(SNK6, DERL-2 및 HuT78 세포주)의 CCR8 발현
도 3 . CCR8은 CTCL 말초 혈액 종양 세포의 세포 표면에서 과발현되며 세자리 세포 활성화 및 증식에 관여한다. 말초 혈액 세자리 세포, 건강한 대조군 T 세포 및 T 세포 림프종 세포주에 의한 CCR8 발현의 유세포 분석. (A) 말초 혈액 세자리 세포의 게이팅 전략(왼쪽 패널) 및 2명의 세자리 환자의 세자리 세포(대조군 이소형 대비)에서 CCR8 발현의 평균 형광 강도(오른쪽 패널). (B) 건강한 대조군 T 세포와 비교하여 세자리 환자 유래의 신선한 세자리 세포에서 CCR8 델타 평균 형광 강도(CCR8 mAb - 대조군 이소형). (C) 그의 CCL1 리간드에 의한 CCR8 자극은 세자리 세포 증식을 유도한다. 신선한 PBMC를 CFSE에서 배양하고 IL-2(100IU/ml), CCL-1(10ng/ml) 또는 IL-2/CCL1에서 96시간 이상 배양하고 살아있는 KIR3DL2+ 세자리 세포 중에서 CFSE^lo 세포의 비율을 계산했다. (D) 시험관내 CD3/28 활성화 3일 전 및 후 새로 분리된 건강한 대조군 말초 혈액 단핵 세포에서 CCR8 발현.
도 4. (A) AITL 유래의 PDX 세포에서 CCR8 발현. AITL 환자로부터 유래된 비장 세포를 대조군 이소형 또는 항-인간 CD4 및 항-CCR8 항체(클론 L263.G8)와 함께 4℃에서 15분 동안 배양한 후 PBS로 세척하고 LSRX20 유세포 분석기에서 분석했다. 히스토그램은 CD4+ 세포에서의 CCR8 발현을 나타낸다. (B) HSTL 세포에서의 CCR8 발현. 비장 세포를 대조군 이소형 또는 항-CD3, CD5, TCRγδ 및 항-CCR8 항체로 염색하였다. 히스토그램은 CD3+ CD5-TCRγδ+ 세포에서의 CCR8 발현을 나타낸다.

실시예 1:

방법

세자리 증후군 환자 유래의 신선한 말초 혈액 종양 세포에서 CCR8 발현

정보를 제공하고 사전 동의에 서명한 후 항CD4, CD158k(=KIR3DL2, 세자리 세포의 표면 마커) 및 CCR8(CD198) 항체(클론 L263.G8) 또는 대조군 이소형을 이용한 세자리 증후군 환자 4명의 말초 혈액 단핵 세포에 대한 유세포 분석에 의한 CCR8 발현의 연구

T 세포 림프종 세포주의 CCR8 발현

세포를 대조군 이소형 또는 항-CCR8(CD198) 항체(클론 L263.G8)와 함께 4℃에서 15분 동안 배양한 다음 PBS로 세척하고 LSRX20 유세포 분석기에서 분석했다.

결과

세자리 증후군 환자 유래의 신선한 말초 혈액 종양 세포에서 CCR8 발현

반응성 KIR3DL2-CD4 T 세포와 비교하여 세자리 증후군 환자 유래의 순환 CD4 + KIR3DL2 + 종양 세포에 의한 CCR8(CD198)의 과발현( 도 1 ). 4 명의 서로 다른 세자리 환자의 세포를 항CD4, 항KIR3DL2 및 항CD198 항체로 염색했다. CD198 발현은 CD4+ KIR3DL2+ 종양 세포 집단에 대해 분석하였다.

T 세포 림프종 세포주의 CCR8 발현

SNK(EBV-양성 NK/T 세포 림프종), DERL-2(간비장 감마-델타 T 세포 림프종) 및 HuT78(세자리 증후군) 세포주를 항-CCR8 항체 또는 대조군 이소형으로 염색하고 CCR8 발현을 유세포 분석법으로 분석했다( 도 2 ).

실시예 2:

본 발명자들은 SS 및 지속적인 혈액 침범(blood involvement)이 있는 13명의 환자에서 말초 혈액 백혈구의 유세포 분석을 수행했다. 세자리 세포는 이전에 설명된 바와 같이(14,15) CD3+CD4+CD26- 및/또는 CD7-KIR3DL2+ 림프구로 확인되었다(도 3A). CCR8 발현은 L263G8 단클론 항체와 대조군 IgG2a 이소형을 사용하여 측정하였으며 건강한 공여자의 T 세포와 비교하였다. CCR8+ 종양 T 세포는 모든 경우에 CCR4를 공동발현했다(데이터 미도시). 세자리 환자 유래의 말초 혈액 CD4⁺ CD25^hi CD127^lo Treg는 높은 수준의 CCR8을 발현하지 않았다(데이터 미도시). CCR8 델타 중간 평균 형광 강도(CCR8 mAb - 대조 이소형)는 세자리 세포에서는 580(범위, 150 내지 1420)이었고 건강한 대조군에서는 110(범위, 80 내지 160)이었다(p<0.001, 도 3B). 흥미롭게도 CTCL HuT78(SS) 세포주뿐만 아니라 NK/T 세포 림프종 SNK6, 간비장 감마-델타 T 세포 림프종 DERL-2 세포주 및 AITL 세포주도 CCR8을 발현하였으며(도 2 및 도 4), 이는 CCR8이 다양한 T-세포 림프종 아형에서의 잠재적인 치료 표적임을 시사한다. 리간드 CCL18 및 CCL1에 의한 CCR8 결합은 30분에서 유의한 Erk1/2 인산화를 유도했으며 세자리 환자의 종양 세포에서 IL-2에 대해 독립적이었다(데이터 미도시). 더욱이, 일부 환자에서는 IL-2과 함께 CCL1가 IL-2 단독에 비해 더 높은 세자리 세포 증식을 유도한 것으로 보인다(42% 대 12% CFSE_lo 세자리 세포)(도 3C). 또한, CCR8 발현은 CD3/28 활성화 전(0일) 또는 후에(3일) 건강한 대조군의 새로 분리된 말초 혈액 림프구의 시험관내 활성화 후에 분석하였다. T 세포에 의한 CCR8 발현은 시험관내 활성화 3일 후에 유의하게 증가했으며 CD25^int T 세포에 비해 CD25^bright 활성화 T 세포에서 더 높았다(도 3D).

결론

결론적으로, 본 연구는 복귀 마커인 CCR8이 건강한 대조군 T 세포와 비교하여 말초 혈액 세자리 세포에 과발현됨을 확인시켜 준다. 이 분자는 다른 T 세포 림프종 세포주의 세포 표면에서도 발현되므로, 본 발명자들의 결과는 CCR8이 뚜렷한 공격성 T 세포 림프종 하위 유형에서 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다.

본 발명자들의 연구는 CCR8을 CTCL에서의 잠재적인 치료 표적으로 분석한 최초의 연구이다. PD-1 억제(7) 또는 동종 줄기세포 이식(17)과 같은 면역조절 치료(16)는 CTCL에서 장기적인 반응을 생성할 수 있는 것으로 확인되었으며, 이는 항종양 면역 반응의 활성화가 장기간 지속되는 질병 통제를 제공할 수 있음을 시사한다. 모가물리주맙으로 치료받은 환자에서, CCR4 발현 말초 활성화 Treg의 고갈은 면역 부작용과 관련이 있었지만 이러한 면역 반응은 질병 반응 및 장기적인 질병 통제와 관련이 있었다(5,6,18). 최근 CCR8은 최적의 종양 Treg 표적으로 제안되었다(19). CCR4와 달리, CCR8은 인간 종양 Tregs에서 선택적으로 발현되었으며 전염증성 효과기 T 세포에서는 최소한으로 발현되었다. 전임상 마우스 종양 모델은 FcγR 결합 항-CCR8 항체를 통한 CCR8+ Treg의 고갈이 PD-1 차단과 상승작용하는 용량 의존적이고 효과적이며 오래 지속되는 항종양 면역을 가능하게 한다는 것을 보여주었다(19). Fc-최적화되고 푸코실화되지 않은 항-인간 CCR8 항체는 1차 인간 표본 유래의 생체외 종양 배양물에서 Treg를 특이적으로 고갈시키고 효과기 T 세포는 고갈시키지 않았다(19).

참고문헌:

본 출원의 전반에 걸쳐, 다양한 참고문헌들이 본 발명과 관련된 선행 기술을 기술한다. 이러한 참고문헌들에 개시된 내용은 본 출원에 참조로서 통합된다.

1. Bagot M, Moretta A, Sivori S, Biassoni R, Cantoni C, Bottino C, et al. CD4(+) cutaneous T-cell lymphoma cells express the p140-killer cell immunoglobulin-like receptor. Blood. 2001;97(5):1388-91.

2. Battistella M, Leboeuf C, Ram-Wolff C, Hurabielle C, Bonnafous C, Sicard H, et al. KIR3DL2 expression in cutaneous T-cell lymphomas: expanding the spectrum for KIR3DL2 targeting. Blood. 2017;130(26):2900-2.

3. Kim YH, Bagot M, Pinter-Brown L, Rook AH, Porcu P, Horwitz SM, et al. Mogamulizumab versus vorinostat in previously treated cutaneous T-cell lymphoma (MAVORIC): an international, open-label, randomised, controlled phase 3 trial. Lancet Oncol. 2018;19(9):1192-204.

4. Sugiyama D, Nishikawa H, Maeda Y, Nishioka M, Tanemura A, Katayama I, et al. Anti-CCR4 mAb selectively depletes effector-type FoxP3+CD4+ regulatory T cells, evoking antitumor immune responses in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(44):17945-50.

5. Bonnet P, Battistella M, Roelens M, Ram-Wolff C, Herms F, Frumholtz L, et al. Association of autoimmunity and long-term complete remission in patients with Sezary syndrome treated with mogamulizumab. Br J Dermatol. 2019;180(2):419-20.

6. Algarni AS, Ram-Wolff C, Bagot M, De Masson A. Mogamulizumab-induced vitiligo in patients with Sezary syndrome: three cases. Eur J Dermatol. 2021;31(2):213-6.

7. Khodadoust MS, Rook AH, Porcu P, Foss F, Moskowitz AJ, Shustov A, et al. Pembrolizumab in Relapsed and Refractory Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome: A Multicenter Phase II Study. J Clin Oncol. 2020;38(1):20-8.

8. Bensussan A, Janela B, Thonnart N, Bagot M, Musette P, Ginhoux F, et al. Identification of CD39 as a Marker for the Circulating Malignant T-Cell Clone of Sezary Syndrome Patients. J Invest Dermatol. 2019;139(3):725-8.

9. Jariwala N, Benoit B, Kossenkov AV, Oetjen LK, Whelan TM, Cornejo CM, et al. TIGIT and Helios Are Highly Expressed on CD4+ T Cells in Sezary Syndrome Patients. J Invest Dermatol. 2017;137(1):257-60.

10. McCully ML, Ladell K, Hakobyan S, Mansel RE, Price DA, Moser B. Epidermis instructs skin homing receptor expression in human T cells. Blood. 2012;120(23):4591-8.

11. McCully ML, Ladell K, Andrews R, Jones RE, Miners KL, Roger L, et al. CCR8 Expression Defines Tissue-Resident Memory T Cells in Human Skin. J Immunol Baltim. 2018;200(5):1639-50.

12. Clark RA, Watanabe R, Teague JE, Schlapbach C, Tawa MC, Adams N, et al. Skin effector memory T cells do not recirculate and provide immune protection in alemtuzumab-treated CTCL patients. Sci Transl Med. 2012;4(117):117ra7.

13. Van Damme H, Dombrecht B, Kiss M, Roose H, Allen E, Van Overmeire E, et al. Therapeutic depletion of CCR8+ tumor-infiltrating regulatory T cells elicits antitumor immunity and synergizes with anti-PD-1 therapy. J Immunother Cancer. 2021;9(2).

14. Moins-Teisserenc H, Daubord M, Clave E, Douay C, Felix J, Marie-Cardine A, et al. CD158k is a reliable marker for diagnosis of Sezary syndrome and reveals an unprecedented heterogeneity of circulating malignant cells. J Invest Dermatol. 2015;135(1):247-57.

15. Roelens M, de　Masson A, Ram-Wolff C, Maki G, Cayuela J-M, Marie-Cardine A, et al. Revisiting the initial diagnosis and blood staging of mycosis fungoides and Sezary syndrome with the KIR3DL2 marker. Br J Dermatol. 2020;182(6):1415-22.

16. Roccuzzo G, Giordano S, Fava P, Pileri A, Guglielmo A, Tonella L, et al. Immune Check Point Inhibitors in Primary Cutaneous T-Cell Lymphomas: Biologic Rationale, Clinical Results and Future Perspectives. Front Oncol. 2021;11:733770.

17. de　Masson A, Beylot-Barry M, Bouaziz J-D, Peffault de Latour R, Aubin F, Garciaz S, et al. Allogeneic stem cell transplantation for advanced cutaneous T-cell lymphomas: a study from the French Society of Bone Marrow Transplantation and French Study Group on Cutaneous Lymphomas. Haematologica. 2014;99(3):527-34.

18. Trum NA, Zain J, Martinez XU, Parekh V, Afkhami M, Abdulla F, et al. Mogamulizumab Efficacy is Underscored by its Associated Rash that Mimics Cutaneous T-cell Lymphoma: A Retrospective Single-Centre Case Series. Br J Dermatol. 2021 (Epub ahead of print)

19. Campbell JR, McDonald BR, Mesko PB, Siemers NO, Singh PB, Selby M, et al. Fc-Optimized Anti-CCR8 Antibody Depletes Regulatory T Cells in Human Tumor Models. Cancer Res. 2021;81(11):2983-94.

SEQUENCE LISTING <110> INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE) ASSISTANCE PUBLIQUE-HOPITAUX DE PARIS (APHP) UNIVERSITE PARIS CITE UNIVERSITE PARIS-EST CRETEIL VAL DE MARNE <120> METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF T CELL-LYMPHOMAS <130> IP20234345FR <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 355 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Tyr Thr Leu Asp Leu Ser Val Thr Thr Val Thr Asp Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Ile Phe Ser Ser Pro Cys Asp Ala Glu Leu Ile Gln Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Val Phe Tyr Cys Leu Leu Phe Val Phe 35 40 45 Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Val Cys Lys 50 55 60 Lys Leu Arg Ser Ile Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser 65 70 75 80 Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Phe Pro Phe Gln Thr Tyr Tyr Leu Leu 85 90 95 Asp Gln Trp Val Phe Gly Thr Val Met Cys Lys Val Val Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr Tyr Ile Gly Phe Tyr Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser 115 120 125 Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Ala Val Tyr Ala Leu Lys Val 130 135 140 Arg Thr Ile Arg Met Gly Thr Thr Leu Cys Leu Ala Val Trp Leu Thr 145 150 155 160 Ala Ile Met Ala Thr Ile Pro Leu Leu Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser 165 170 175 Glu Asp Gly Val Leu Gln Cys Tyr Ser Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Leu 180 185 190 Lys Trp Lys Ile Phe Thr Asn Phe Lys Met Asn Ile Leu Gly Leu Leu 195 200 205 Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met Phe Cys Tyr Ile Lys Ile Leu His Gln 210 215 220 Leu Lys Arg Cys Gln Asn His Asn Lys Thr Lys Ala Ile Arg Leu Val 225 230 235 240 Leu Ile Val Val Ile Ala Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val 245 250 255 Val Leu Phe Leu Thr Ser Leu His Ser Met His Ile Leu Asp Gly Cys 260 265 270 Ser Ile Ser Gln Gln Leu Thr Tyr Ala Thr His Val Thr Glu Ile Ile 275 280 285 Ser Phe Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly 290 295 300 Glu Lys Phe Lys Lys His Leu Ser Glu Ile Phe Gln Lys Ser Cys Ser 305 310 315 320 Gln Ile Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Arg Glu Ser Cys Glu 325 330 335 Lys Ser Ser Ser Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Ser Ser Ser Val Asp 340 345 350 Tyr Ile Leu 355

Claims (16)

1. T 세포 림프종의 치료를 필요로 하는 환자에서 T 세포 림프종을 치료하는 방법으로서, CCR8 발현 암 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있는 작용제를 상기 환자에게 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서,
   T 세포 림프종은 혈관면역모구 T 세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma), 간비장 T 세포 림프종(hepatosplenic T-cell　lymphoma), 자연 살해 T 세포 림프종(natural killer T-cell lymphoma), 또는 피부 T 세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma)인, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   T 세포 림프종은 피부 T 세포 림프종인, 방법.
4. 제3항에 있어서,
   T세포 림프종은 세자리 증후군인, 방법.
5. 제1항에 있어서,
   작용제는 CCR8 억제제인, 방법.
6. 제1항에 있어서,
   작용제는 CCR8에 대한 결합 친화도를 갖는 항체인, 방법.
7. 제6항에 있어서,
   작용제는 CCR8의 적어도 하나의 세포외 도메인에 대한 항체이고, CCR8 발현 암세포의 고갈을 유도하는, 방법.
8. 제7항에 있어서,
   CCR8 암세포의 고갈에 적합한 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 매개하는, 방법.
9. 제7항에 있어서,
   항체는 CCR8에 대한 제1 항원 결합 부위 및 효과기 세포에 대한 적어도 하나의 제2 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 항체인, 방법.
10. 제7항에 있어서,
    항체는 세포독성 모이어티에 접합되는, 방법.
11. 제1항에 있어서,
    작용제(agent)는 CAR-T 세포이고, 여기서 CAR은 CCR8에 특이적인 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는, 방법.
12. 환자로부터 얻은 샘플에서 CCR8의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는 환자에서 T 세포 림프종을 진단하는 방법.
13. 제12항에 있어서,
    혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 간비장 T 세포 림프종, 자연 살해 T 세포 림프종 또는 피부 T 세포 림프종을 진단하는, 방법.
14. 제12항에 있어서,
    피부 T 세포 림프종을 진단하는, 방법.
15. 제14항에 있어서,
    세자리 증후군을 진단하는, 방법.
16. 제14항에 있어서,
    KIR3DL2, PLS3, Twist 및 NKp46으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 추가 마커의 발현 수준을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.