DE69535147T3 - Überexpression von säugetier- und virusproteinen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Gene und Verfahren für die Expression von HIV-Proteinen in hohem Maß in eukaryotischen Zellen.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Die Expression eukaryotischer Genprodukte in Prokaryoten ist bisweilen durch das Vorhandensein von Codons eingeschränkt, die in E. coli selten verwendet werden. Die Expression solcher Gene lässt sich durch systematische Substitution der endogenen Codons durch Codons verstärken, die in hoch exprimierten prokaryotischen Genen überrepräsentiert sind (Robinson et al. 1984). Üblicherweise geht man davon aus, dass seltene Codons ein Pausieren des Ribosoms bewirken, weshalb die naszierende Polypeptidkette nicht fertig gestellt wird und Transkription und Translation entkoppelt werden. Das 3'-Ende der mRNA des blockierten Ribosoms ist zellulären Ribonukleasen ausgesetzt, welche die Stabilität des Transkripts herabsetzen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Gens und ein synthetisches Gen erhältlich durch dieses Verfahren nach den beiliegenden Ansprüchen.
  • Bevorzugte Codons sind: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac); Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac); und Val (gtg). Weniger bevorzugte Codons sind: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc). Alle Codons, die nicht der Beschreibung bevorzugter Codons oder weniger bevorzugter Codons entsprechen, sind nicht bevorzugte Codons.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann das synthetische Gen das Säugerprotein in einem Maß exprimieren, das mindestens 150%, 200%, 500%, 1.000% oder 10.000% des Maßes des Expression des natürlichen Gens in einem Säugerzellkultursystem in vitro unter identischen Bedingungen (d. h. gleicher Zelltyp, gleiche Kulturbedingungen, gleicher Expressionsvektor) entspricht.
  • Geeignete Zellkultursysteme zum Messen der Expression des synthetischen Gens und des entsprechenden natürlichen Gens sind unten beschrieben. Weitere geeignete Expressionssysteme, die Säugerzellen verwenden, sind einem Fachmann gut bekannt und beispielsweise in den unten genannten Standardbezugswerken der Molekularbiologie beschrieben. Geeignete Vektoren zur Expression der synthetischen und natürlichen Gene sind unten und in den unten beschriebenen Standardbezugswerken beschrieben. Mit „Expression” ist Proteinexpression gemeint. Expression kann mithilfe eines Antikörpers gemessen werden, der für das relevante Protein spezifisch ist. Solche Antikörper und Messtechniken sind einem Fachmann gut bekannt. Mit „natürliches Gen” ist die Gensequenz gemeint, die das Protein natürlicherweise kodiert.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der Codons in dem natürlichen Gen nicht bevorzugte Codons.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein HIV-Protein. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Protein gag, pol, env, gp120 oder gp160.
  • Unter manchen Umständen (z. B. um das Einführen einer Restriktionsschnittstelle zu ermöglichen) kann es wünschenswert sein, ein nicht bevorzugtes Codon durch ein weniger bevorzugtes Codon und nicht durch ein bevorzugtes Codon zu ersetzen.
  • Es ist nicht erforderlich, alle weniger bevorzugten oder nicht bevorzugten Codons durch bevorzugte Codons zu ersetzen. Verstärkte Expression kann auch durch partiellen Austausch erreicht werden.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung Vektoren (einschließlich Expressionsvektoren), welche das synthetische Gen aufweisen.
  • Mit „Vektor” ist ein DNA-Molekül gemeint, das z. B. von einem Plasmid, Bakteriophagen oder einem Säuger oder Insektenvirus abstammt, in das DNA-Fragmente eingesetzt oder kloniert werden können. Ein Vektor enthält eine oder mehrere einmalig vorhandene Restriktionsschnittstellen und kann in einem definierten Wirt oder einem Vehikelorganismus derart zu autonomer Replikation fähig sein, dass die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Mit „Expressionsvektor” ist daher jedes autonome Element gemeint, das die Synthese eines Proteins steuern kann. Solche DNA-Expressionsvektoren umfassen Säugerplasmide und -viren.
  • Bei der Konstruktion der synthetischen Gene der Erfindung kann es wünschenswert sein, CpG-Sequenzen zu vermeiden, da diese Sequenzen das Ausschalten (Silencing) von Genen verursachen können.
  • Die Codonverschiebung, die im Hüllgen gp120 von HIV vorhanden ist, gibt es auch in den Proteinen gag und pol. Der Austausch eines Anteils der in diesen Genen vorhandenen nicht bevorzugten und weniger bevorzugten Codons durch bevorzugte Codons sollte daher ein Gen hervorbringen, das zu stärkerer Expression fähig ist. Ein großer Bruchteil der Codons in den humanen Genen, die Faktor VIII und Faktor IX kodieren, sind nicht bevorzugte Codons und weniger bevorzugte Codons. Der Austausch eines Anteils dieser Codons durch bevorzugte Codons sollte Gene ergeben, die in Säugerzellkulturen zu stärkerer Expression fähig sind. Dagegen kann es wünschenswert sein, bevorzugte Codons in einem natürlich vorkommenden Gen durch weniger bevorzugte Codons zu ersetzen, um die Expression zu verringern.
  • Standardbezugsarbeiten, welche die allgemeinen Prinzipien von DNA-Rekombinationstechnologie beschreiben, umfassen Watson, J. D. et al., Molecular Biology of the Gene, Band I und II, die Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Verlag, Menlo Park, CA, USA (1987); Darnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Verlag, New York, N. Y., USA (1986); Old, R. W., et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Auflage, University of California Press, Verlag, Berkeley, CA, USA (1981); Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Verlag, Cold Spring Harbor, NY, USA (1989); und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY, USA (1989).
  • Ausführliche Beschreibung
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Sequenz des synthetischen Gens gp120 (SEQ ID Nr: 34) und eines synthetischen Gens gp160 (SEQ ID Nr: 35), in denen Codons durch solche ersetzt wurden, die in stark exprimierten humanen Genen vorkommen.
  • 2 ist eine Schemazeichnung des synthetischen gp120(HIV-1 MN)-Gens. Die schraffierten Anteile mit der Markierung v1 bis v5 zeigen hypervariable Regionen an. Der gefüllte Kasten zeigt die CD4-Bindungsstelle an. Es ist eine begrenzte Anzahl der einmalig vorhandenen Restriktionsschnittstellen gezeigt: H (Hind3), Nh (Nhe1), P (Pst1), Na (Nae1), M (Mlu1), R (EcoR1), A (Age1) und No (Not1). Die chemisch synthetisierten DNA-Fragmente, die als PCR-Vorlagen dienten, sind unter der gp120-Sequenz gezeigt, zusammen mit den Positionen der für ihre Amplifizierung verwendeten Primer.
  • 3 ist eine Fotografie der Ergebnisse von Tests der transienten Transfektion, die zur Messung der gp120-Expression verwendet wurden. Gelelektrophorese immunpräzipitierter Überstände von 293T-Zellen, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die gp120 exprimieren, das von dem IIIB-Isolat von HIV-1 (gp120IIIb), von dem MN-Isolat (gp120mn), von dem MN-Isolat, das durch Substitution des endogenen Leaderpeptids durch das des CD5-Antigens modifiziert wurde (gp120mnCD5L), oder von dem chemisch synthetisierten Gen kodiert wird, welches die MN-Variante mit der humanen CD5-Leadersequenz kodiert (syngp120mn). Überstände wurden nach einem 12-stündigen Markierungszeitraum 60 Stunden nach der Transfektion abgenommen und mit CD4:IgG1-Fusionsprotein und Protein A Sepharose immunpräzipitiert.
  • 4 ist ein Schaubild, das die Ergebnisse von ELISA-Assays zeigt, die zur Messung der Proteinmengen in Überständen transient transfizierter 293T-Zellen verwendet wurden. Überstände von 293T-Zellen, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die gp120 exprimieren, das von dem IIIB-Isolat von HIV-1 (gp120IIIb), von dem MN-Isolat (gp120mn), von dem MN-Isolat, das durch Substitution des endogenen Leaderpeptids durch das des CD5-Antigens modifiziert wurde (gp120mnCD5L), oder von dem chemisch synthetisierten Gen kodiert wird, welches die MN-Variante mit der humanen CDS-Leadersequenz kodiert (syngp120mn), wurden nach 4 Tagen abgenommen und in einem gp120/CD4-ELISA getestet. Die Menge von gp120 ist in ng/ml angegeben.
  • 5, Tafel A, ist eine Fotografie eines Gels, das die Ergebnisse eines Immunpräzipitationstests darstellt, der zur Messung der Expression des nativen und des synthetischen gp120 in Gegenwart von rev in trans und von RRE in cis verwendet wurde. Bei diesem Experiment wurden 293T-Zellen durch Kalziumphosphatkopräzipitation von 10 μg Plasmid transient transfiziert, das Folgendes exprimierte: (A) die synthetische gp120MN-Sequenz und RRE in cis, (B) den gp120-Anteil von HIV-1 IIIB, (C) den gp120-Anteil von HIV-1 IIIB und RRE in cis, alle in Gegenwart oder Abwesenheit von rev-Expression. Die RRE-Konstrukte gp120IIIbRRE und syngp120mnRRE wurden unter Verwendung eines Eag1/Hpa1-RRE-Fragments erzeugt, dass durch PCR von einem HIV-1 HXB2-Provirusklon kloniert wurde. Jedes gp120-Expressionsplasmid wurde mit 10 μg pCMVrev- oder CDM7-Plasmid-DNA kotransfiziert. Die Überstände wurden 60 Stunden nach der Transfektion abgenommen, mit CD4:IgG-Fusionsprotein und Protein-A-Agarose immunpräzipitiert und auf einem 7%igen reduzierenden SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Die Gelexpositionszeit wurde verlängert, damit die Induktion von gp120IIIbrre durch rev aufgezeigt werden konnte. 5, Tafel B, ist eine kürzere Exposition eines ähnlichen Experiments, in dem syngp120mnrre mit oder ohne pCMVrev kotransfiziert wurde. 5, Tafel C ist ein Schemadiagramm der in Tafel A verwendeten Konstrukte.
  • 6 ist ein Vergleich der Sequenz des THY1-Wildtypgens der Ratte (wt) (SEQ. ID. Nr.: 37) und eines synthetischen THY-1-Rattengens (env) (SEQ. ID. Nr.: 36), konstruiert durch chemische Synthese und mit den häufigsten Codons im HIV-1-env-Gens.
  • 7 ist ein schematisches Diagram des synthetischen Ratte-THY-1-Gens. Der gefüllte schwarze Kasten bezeichnet das Signalpeptid. Der schraffierte Kasten bezeichnet die Sequenzen im Vorläufer, die die Bindung eines Phophatidylinositolglycan-Ankers steuern. Einmalige Restriktionsschnittstellen, die zum Zusammenbau der THY-1-Konstruktes verwendet werden, sind mit H (Hind3), M (Mlu1), S (Sac1) und No (Not1) markiert. Die Positionen der synthetischen Oligonukleotide, die bei der Konstruktion verwendet wurden, sind unten in der Figur gezeigt.
  • 8 ist ein Schaubild, welches die Ergebnisse der Durchflusszytometrieanalyse zeigt. Bei diesem Experiment wurden 293T-Zellen transient entweder mit Wildtyp-THY-1 der Ratte (dunkle Linie), Ratten-THY-1 mit Hüllproteincodons (helle Linie) oder nur Vektor (gepunktete Linie) transfiziert. 293T-Zellen wurden mit den verschiedenen Expressionsplasmiden durch Kalziumphosphatkopräzipitation transfiziert und 3 Tage nach der Transfektion mit dem monoklonalen Anti-Ratte-THY-1-Antikörper OX7, gefolgt von einem polyklonalen FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper, gefärbt.
  • 9, Tafel A, ist eine Fotografie eines Gels, das die Ergebnisse von Immunpräzipitationsanalysen von Überständen humaner 293T-Zellen, die mit syngp120mn (A) oder einem Konstrukt syngp120mn.rTHY-1env transfiziert wurden, zeigt, welches das rTHY-1env-Gen in der nicht translatierten 3'-Region des syngp120mn-Gens aufweist (B). Das syngp120mn.rTHY-1env-Konstrukt wurde erzeugt, indem ein Not1-Adapter in die stumpf gemachte Hind3-Schnittstelle des rTHY-1env-Plasmids eingesetzt wurde. Anschließend wurde ein 0,5-kb-Not1-Fragment, welches das rTHY-1env-Gen enthält, in die Not1-Schnittstelle des Plasmids syngp120mn kloniert und auf korrekte Ausrichtung getestet. Überstände von 35S-markierten Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion geerntet, mit CD4:IgG-Fusionsprotein und Protein-A-Agarose präzipitiert und durch 7%ige reduzierende SDS-PAGE aufgetrennt. 9, Tafel B, ist ein schematisches Diagramm der Konstrukte, die für die in Tafel A dieser Figur gezeigten Experimente verwendet wurden.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Konstruktion eines synthetischen gp120-Gens mit Codons, die in stark exprimierten humanen Genen vorkommen
  • Unter Verwendung von Software, die von der University of Wisconsin Genetics Computer Group entwickelt wurde, wurde eine Codonhäufigkeitstabelle für den Hüllproteinvorläufer des LAV-Subtyps von HIV-1 erstellt. Die Ergebnisse dieser Tabellenaufstellung sind in Tabelle 1 dem Muster der Codonverwendung bei einer Sammlung stark exprimierter humaner Gene gegenüber gestellt. Für jede Aminosäure, die von degenerierten Codons kodiert wird, unterscheidet sich das am meisten bevorzugte Codon der stark exprimierten Gene von dem am meisten bevorzugten Codon des HIV-Hüllproteinvorläufers. Darüber hinaus beschreibt eine einfache Regel das Muster gegebenenfalls bevorzugter Hüllproteincodons: bevorzugte Codons maximieren die Anzahl an Adeninresten in der viralen RNA. In allen Fallen, außer einem, bedeutet dies, dass das Codon, in dem die dritte Position A ist, das am häufigsten Verwendete ist. Im Spezialfall von Serin steuern drei Codons gleichermaßen einen A-Rest zu der mRNA bei; zusammen machen diese drei 85% der tatsächlich in den Hüllproteintranskripten verwendeten Codons aus. Ein besonders eindrucksvolles Beispiel der A-Verschiebung findet sich in der Codonwahl für Arginin, in dem das AGA-Triplett 88% aller Codons ausmacht. Außer dem Übergewicht von A-Resten, zeigt sich eine deutliche Präferenz für Uridin unter degenerierten Codons, deren dritter Rest ein Pyrimidin sein muss. Schließlich lässt sich die Beobachtung, dass das Dinukleotid CpG unterrepräsentiert ist, auf die Uneinheitlichkeiten unter den weniger häufig verwendeten Varianten zurückführen; deshalb ist die dritte Position weniger wahrscheinlich G, wenn die zweite Position C ist, wie es bei den Codons für Alanin, Prolin, Serin und Threonin der Fall ist; und die CGX-Triplets für Arginin werden so gut wie gar nicht verwendet. Tabelle 1: Codonhäufigkeit im HIV-1-IIIb-env-Gen und in stark exprimierten humanen Genen.
    Stark Hüllpr. Stark Hüllpr.
    Expr Expr
    A1a Cys
    GC C 53 27 TG C 68 16
    T 17 18 T 32 84
    A 13 50
    G 17 5 Gln
    CA A 12 55
    Arg G 88 45
    CG C 37 0
    T 7 4 Glu
    A 6 0 GA A 25 67
    G 21 0 G 75 33
    AG A 10 88
    G 18 8 Gly
    GG C 50 6
    Asn T 12 13
    AA C 78 30 A 14 53
    T 22 70 G 24 28
    Asp His
    GA C 75 33 CA C 79 25
    T 25 67 T 21 75
    Ile
    AT C 77 25
    T 18 31
    A 5 44
    Leu Ser
    CT C 26 10 TC C 28 8
    T 5 7 T 13 8
    A 3 17 A 5 22
    G 58 17 G 9 0
    TT A 2 30 AG C 34 22
    G 6 20 T 10 41
    Lys Thr
    AA A 18 68 AC C 57 20
    G 82 32 T 14 22
    A 14 51
    G 15 7
    Pro Tyr
    CC C 48 27 TA C 74 8
    T 19 14 T 26 92
    A 16 55
    G 17 5
    Phe Val
    TT C 80 26 GT C 25 12
    T 20 74 T 7 9
    A 5 62
    G 64 18
  • Die Codonhäufigkeit wurde mit dem von der University of Wisconsin Genetics Computer Group entwickelten GCG-Programm berechnet. Die Zahlen geben die Prozentanteile der Fälle wieder, in denen das jeweilige Codon verwendet wird. Die Häufigkeiten der Codonverwendung von Hüllproteingenen andere HIV-1-Virusisolate sind vergleichbar und zeigen eine ähnliche Verschiebung.
  • Um ein gp120-Gen zu produzieren, das zu einer hochgradigen Expression in Säugerzellen fähig ist, wurde ein synthetisches Gen konstruiert (syngp120mn), welches das gp120-Segment von HIV-1 kodiert, basierend auf der Sequenz des häufigsten HIV-1-Subtyps in Nordamerika HIV-1-MN (Shaw et al. 1984; Gallo et al. 1986). In diesem synthetischen gp120-Gen wurden nahezu alle nativen Codons systematisch durch Codons ersetzt, die in stark exprimierten humanen Genen am häufigsten verwendet wurden (1). Dieses synthetische Gen wurde aus chemisch synthetisierten Oligonukleotiden mit einer Länge von 150 bis 200 Basen zusammengesetzt. Wenn Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 120 bis 150 Basen chemisch synthetisiert werden, kann der Prozentanteil des Volllängenproduktes niedrig sein, und das Material besteht zum größten Teil aus kürzeren Oligonukleotiden. Da diese kürzeren Fragmente Klonierungs- und PCR-Verfahren hemmen, kann es sehr schwierig sein, Oligonukleotide zu verwenden, die eine bestimmte Länge überschreiten. Zur Verwendung von Syntheserohmaterial ohne vorherige Reinigung wurden Pools aus einzelsträngigen Oligonukleotiden vor dem Klonieren PCR-amplifiziert. PCR-Produkte wurden in Agarosegelen gereinigt und im nächsten PCR-Schritt als Vorlagen verwendet. Zwei benachbarte Fragmente konnten aufgrund von überlappenden Sequenzen am Ende jedes Fragments koamplifiziert werden. Diese Fragmente, die eine Länge zwischen 350 und 400 bp hatten, wurden in ein von pCDM7 abstammendes Plasmid subkloniert, das die Leadersequenz des CD5-Oberflächenmoleküls gefolgt von einem Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1-Polylinker enthält. Jedes der Restriktionsenzyme in diesem Polylinker stellt eine Schnittstelle dar, die am 5'- oder am 3'-Ende des PCR-erzeugten Fragments vorhanden ist. So wurde das gesamte gp120-Gen durch sequenzielles Subklonieren jedes der 4 langen Fragmente zusammengesetzt. Für jedes Fragment wurden 3 bis 6 verschiedene Klone subkloniert und vor dem Zusammensetzen sequenziert. In 2 ist eine schematische Zeichnung des zur Konstruktion des synthetischen gp120 verwendeten Verfahrens gezeigt. Die Sequenz des synthetischen gp120-Gens (und eines synthetischen gp160-Gens, das mit demselben Ansatz hergestellt wurde) ist in 1 dargestellt.
  • Die Mutationsrate war erheblich. Die häufigsten Mutationen waren kurze (1 Nukleotid) und lange (bis zu 30 Nukleotiden) Deletionen. In manchen Fällen war es erforderlich, Teile entweder durch synthetische Adapter oder Stücke aus anderen Subklonen ohne Mutation in der jeweiligen Region zu ersetzen. Einige Abweichungen von der strikten Verwendung optimierter Codons erfolgten, um die Einführung von Restriktionsschnittstellen in das resultierende Gen zu ermöglichen und damit den Austausch verschiedener Segmente zu vereinfachen (2). Diese einmaligen Restriktionsschnittstellen wurden in Abständen von etwa 100 bp in das Gen eingefügt. Die native HIV-Leadersequenz wurde durch das hoch effiziente Leaderpeptid des humanen CD5-Antigens ausgetauscht, um die Sekretion zu ermöglichen. Das für die Konstruktion verwendete Plasmid ist ein Derivat des Säugerexpressionsvektors pCDM7, der das eingesetzte Gen unter der Kontrolle eines starken humanen CMV-immediate-early-Promotors transkribiert.
  • Zum Vergleich der Wildtyp-Kodierungssequenzen und der Kodierungssequenzen des synthetischen gp120 wurde die synthetische gp120-Kodierungssequenz in einen Säugerexpressionsvektor eingesetzt und in transienten Transfektionsassays getestet. Mehrere verschiedene native gp120-Gene wurden als Kontrollen verwendet, um Variationen des Expressionsgrades zwischen verschiedenen Virusisolaten und Artefakte, die von verschiedenen Leadersequenzen induziert werden, auszuschließen. Das als Kontrolle verwendete gp120-HIVIIIb-Konstrukt wurde durch PCR hergestellt, wobei ein Sal1/Xho1-HIV-1-HXB2-Hüllproteingenfragment als Vorlage verwendet wurde. Zum Ausschluss von PCR-induzierten Mutationen wurde ein Kpn1/Ear1-Fragment, das etwa 1,2 kb des Gens enthält, durch die entsprechende Sequenz aus dem proviralen Klon ausgetauscht. Die als Kontrollen verwendeten gp120mn-Wildtypkonstrukte wurden durch PCR von HIV-1-MN-infizierten C8166-Zellen (AIDS Repository, Rockville, MD, USA) kloniert und exprimierten gp120 entweder mit einer nativen Hüllproteingen- oder einer CD5-Leadersequenz. Da in diesem Fall keine proviralen Klone verfügbar waren, wurden zwei Klone jedes Konstruktes getestet, um PCR-Artefakte zu vermeiden. Zum semiquantitativen Bestimmen der Menge an sezerniertem gp120 wurden Überstände von 293T-Zellen, die durch Kalziumphosphatkopräzipitation transient transfiziert worden waren, mit löslichem CD4:Immunglobulin-Fusionsprotein und Protein A Sepharose immunpräzipitiert.
  • Die Ergebnisse dieser Analyse (3) zeigen, dass das synthetische Genprodukt im Vergleich zu den nativen gp120-Kontrollen in sehr hohem Maß exprimiert wird. Das Molekulargewicht des synthetischen gp120-Gens war vergleichbar mit Kontrollproteinen (3) und schien im Bereich von 100 bis 110 kd zu liegen. Die etwas schnellere Migration lässt sich durch die Tatsache erklären, dass in manchen Tumorzelllinien wie beispielsweise 293T Glykosylierung entweder unvollständig oder bis zu einem gewissen Grad verändert ist.
  • Für einen genaueren Vergleich der Expression wurden die gp120-Proteinmengen mithilfe eines gp120-ELISAs mit CD4 in der demobilisierten Phase quantifiziert. Diese Analyse zeigt (4), dass ELISA-Daten mit den Immunpräzipitationsdaten vergleichbar waren, mit einer gp120-Konzentration von etwa 125 ng/ml für das synthetische gp120-Gen und weniger als der Hintergrund-Schwellenwert (5 ng/ml) für alle nativen gp120-Gene. Die Expression des synthetischen gp120-Gens scheint daher mindestens um eine Größenordnung über der von gp120-Wildtyp-Genen zu liegen. In dem gezeigten Experiment war die Erhöhung mindestens 25-fach.
  • Die Rolle von rev bei der Expression von gp120
  • Da rev seine Wirkung bei mehreren Schritten der Expression eines viralen Transkriptes auszuüben scheint, wurde die mögliche Rolle nicht-translationaler Effekte bei der verbesserten Expression des synthetischen gp120-Gens getestet. Um zunächst die Möglichkeit auszuschließen, dass negative Signalelemente, die entweder verstärkten mRNA-Abbau oder Retention im Kern vermitteln, durch Veränderung der Nukleotidsequenz ausgeschaltet wurden, wurden die mRNA-Mengen im Zytoplasma getestet. Die RNA im Zytoplasma wurde durch NP40-Lyse transient transfizierter 293T-Zellen und anschließende Entfernung der Kerne durch Zentrifugation präpariert. Die zytoplasmatische RNA wurde anschließend durch mehrfache Phenolextraktionen und Präzipitation aus Lysaten präpariert, mit einer Slot-Blot-Vorrichtung auf Nitrozellulose punktweise aufgetragen und schließlich mit einer hüllproteinspezifischen Sonde hybridisiert.
  • In Kürze wurde zytoplasmatische mRNA aus 293-Zellen, die mit CDM&, gp120IIIB oder syngp120 transfiziert worden waren, 36 Stunden nach der Transfektion isoliert. Zytoplasmatische RNA von Hela-Zellen, die mit Vakzinia-Wildtypvirus oder rekombinantem Virus, der gp120IIIb oder das synthetische gp120-Gen unter der Kontrolle des 7.5-Promotors exprimiert, infiziert worden waren, wurde 16 Stunden nach der Infektion isoliert. Mit einer Slot-Blot-Vorrichtung wurden gleiche Mengen punktweise auf Nitrozellulose aufgetragen und mit willkürlich markierten 1,5-kb-gp120IIIb- und syngp120-Fragmenten oder humanem Beta-Aktin hybridisiert. Der Grad der RNA-Expression wurde durch Scannen der hybridisierten Membranen mit einem Phosphoimager quantifiziert. Die verwendeten Vorgehensweisen sind unten ausführlicher beschrieben.
  • Dieses Experiment zeigte, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den mRNA-Mengen von Zellen gab, die mit dem nativen oder dem synthetischen gp120-Gen transfiziert waren. Tatsächlich war die Menge an zytoplasmatischer mRNA des synthetischen gp120-Gens sogar niedriger als die des nativen gp120-Gens.
  • Diese Daten wurden durch Messung der Expression rekombinanter Vakziniaviren bestätigt. Humane 293-Zellen oder HeLa-Zellen wurden mit Vakziniavirus infiziert, der Wildtyp-gp120IIIb oder syngp120mn bei einer Multiplicity of Infection (Anzahl Viren je Infektion) von mindestens 10 exprimierte. Überstände wurden 24 Stunden nach der Infektion abgenommen und mit CD4:Immunglobulin-Fusionsprotein und Protein A Sepharose immunpräzipitiert. Die bei diesem Experiment verwendeten Verfahrensweisen sind unten ausführlich beschrieben.
  • Dieses Experiment zeigte, dass die erhöhte Expression des synthetischen Gens noch beobachtet wurde, wenn das endogene Genprodukt und das synthetische Genprodukt von Vakziniavirusrekombinanten unter der Kontrolle des starken gemischten early- und Tate-7,5-k-Promotors exprimiert wurden. Da mRNAs von Vakziniavirus im Zytoplasma transkribiert und translatiert werden, kann eine erhöhte Expression des synthetischen Hüllproteingens in diesem Experiment nicht dem verbesserten Export aus dem Kern zugeschrieben werden. Dieses Experiment wurde mit zwei weiteren humanen Zelltypen, der Nierenkarzinomzelllinie 293 und HeLa-Zellen, wiederholt. Wie bei transfizierten 293T-Zellen waren die mRNA-Mengen in 293-Zellen, die mit jeweils einem der rekombinanten Vakziniaviren infiziert waren, ähnlich.
  • Codonverwendung bei Lentivirus
  • Da es den Anschein hat, dass die Codonverwendung einen signifikanten Einfluss auf die Expression in Säugerzellen hat, wurde die Codonhäufigkeit in den Hüllproteingenen anderer Retroviren untersucht. In dieser Studie wurde kein eindeutiges Muster einer Codonpräferenz zwischen Retroviren im Allgemeinen festgestellt. Wenn dagegen Viren aus der Gattung der Lentiviren, zu denen HIV-1 gehört, separat analysiert wurden, wurde eine Verschiebung der Codonverwendung festgestellt, die fast identisch zu der bei HIV-1 war. Es wurde eine Tabelle der Codonhäufigkeit bei Hüllglykoproteinen verschiedener Retroviren (hauptsächlich Typ C), ausschließlich Lentiviren, erstellt und mit einer Codonhäufigkeitstabelle verglichen, die aus den Hüllproteinsequenzen von vier Lentiviren erstellt wurden, welche nicht eng mit HIV-1 verwandt sind (Caprine-Arthritis-Encephalitis-Virus, Equine-Infectious-Anemia-Virus, Feline-Immunodeficiency-Virus und Visnavirus) (Tabelle 2). Das Codonverwendungsmuster für Lentiviren ist dem von HIV-1 sehr ähnlich, in allen Fällen, außer einem, entspricht das bevorzugte Codon für HIV-1 dem bevorzugten Codon für die anderen Lentiviren. Die Ausnahme ist Prolin, das bei 41% der nicht von HIV stammenden lentiviralen Hüllproteinreste von CCT und bei 40% der Reste von CCA kodiert wird, eine Situation, die eindeutig ebenfalls eine wesentliche Präferenz für das mit A endende Triplett wiedergibt. Das Muster der Codonverwendung der nicht-lentiviralen Hüllproteine zeigt keine ähnliche Prädominanz von A-Resten, und ist auch nicht in dem Maß in Richtung von C- und G-Resten an der dritten Position verschoben, wie es bei der Codonverwendung für stark exprimierte humane Gene der Fall ist. Im Allgemeinen scheinen nicht-lentivirale Retroviren die verschiedenen Codons gleichmäßiger zu nutzen, ein Muster, das sie mit weniger stark exprimierten humanen Genen teilen. Tabelle 2: Codonhäufigkeit im Hüllproteingen von Lentiviren (Lenti) und nicht-lentiviralen Retroviren (sonstige).
    Sonstige Lenti Sonstige Lenti
    Ala Cys
    GC C 45 13 TG C 53 21
    T 26 37 T 47 79
    A 20 46
    G 9 3 Gln
    CA A 52 69
    Arg G 48 31
    CG C 14 2
    T 6 3 Glu
    A 16 5 GA A 57 68
    G 17 3 G 43 32
    AG A 31 51
    G 15 26 Gly
    GG C 21 8
    Asn T 13 9
    AA C 49 31 A 37 56
    T 51 69 G 29 26
    Asp His
    GA C 55 33 CA C 51 38
    T 51 69 T 49 62
    Ile
    AT C 38 16
    T 31 22
    A 31 61
    Leu Ser
    CT C 22 8 TC C 38 10
    T 14 9 T 17 16
    A 21 16 A 18 24
    G 19 11 G 6 5
    TT A 15 41 AG C 13 20
    G 10 16 T 7 25
    Lys Thr
    AA A 60 63 AC C 44 18
    G 40 37 T 27 20
    A 19 55
    Pro G 10 8
    CC C 42 14
    T 30 41 Tyr
    A 20 40 TA C 48 28
    G 7 5 T 52 72
    Phe Val
    TT C 52 25 GT C 36 9
    T 48 75 T 17 10
    A 22 54
    G 25 27
  • Die Codonhäufigkeit wurde mit dem von der University of Wisconsin Genetics Computer Group entwickelten GCG-Programm berechnet. Die zahlen geben die Prozentanteile der Fälle wieder, in denen das jeweilige Codon verwendet wird. Die Codonverwendung von nicht-lentiviralen Retroviren wurde aus den Hüllproteinvorläufersequenzen des Rinderleukämievirus, des Katzenleukämievirus, des humanen T-Zell-Leukämievirus Typ 1, des humanen T-Zell-lymphotropen Virus Typ II, dem Nerz-Zellfokus bildenden Isolat des Mausleukämievirus (MuLV), dem Rauscher-Milzfokusbildenden Isolat, dem 10A1-Isolat, dem 4070A-amphotropen Isolat und dem myeloproliferativen Leukämievirusisolat und aus dem Rattenleukämievirus, dem Simian-Sarkomvirus, dem Simian-T-Zellleukämievirus, dem leukämogenen Retrovirus T1223/B und dem Gibbonaffenleukämievirus zusammengestellt. Die Tabellen der Codonhäufigkeit für die Nicht-HIV-, Nicht-SIV-Lentiviren wurden aus den Hüllproteinvorläufersequenzen für das Caprine-Arthritis-Encephalitis-Virus, das Equineinfectious-anemia-Virus, das Feline-Immunodeficiency-Virus und das Visnavirus zusammengestellt.
  • Außer der Prävalenz von A-haltigen Codons halten sich lentivirale Codons an das HIV-Muster einer starken Unterrepräsentierung von CpG, so dass die dritte Position in Alanin-, Prolin-, Serin- und Threonintripletts selten G ist. Das retrovirale Hüllproteintriplett zeigt eine ähnliche, aber weniger ausgeprägte Unterrepräsentierung von CpG. Der offensichtlichste Unterschied zwischen Lentiviren und anderen Retroviren in Bezug auf die Prävalenz von CpG liegt in der Verwendung der CGX-Variante von Arginintripletts, die bei den retroviralen Hüllproteinkodierenden Sequenzen relativ häufig vertreten ist, aber bei den vergleichbaren Lentivirussequenzen fast nie vorkommt.
  • Unterschiede der rev-Abhängigkeit zwischen nativem und synthetischem gp120
  • Um zu untersuchen, ob die Regulierung von rev mit der Codonverwendung bei HIV-1 verbunden ist, wurde der Einfluss von rev auf die Expression des nativen und des synthetischen Gens untersucht. Da die Regulierung durch rev erfordert, dass die rev-Bindungsstelle RRE in cis vorliegt, wurden Konstrukte hergestellt, in denen diese Bindungsstelle in die untranslatierte 3'-Region des nativen und des synthetischen Gens kloniert wurde. Diese Plasmide wurden mit rev oder einem Kontrollplasmid in trans in 293T-Zellen kotransfiziert, und der gp120-Expressionsgrad in den Überständen wurde semiquantitativ durch Immunpräzipitation bestimmt. Die in diesem Experiment beschriebenen Verfahren sind unten ausführlich beschrieben.
  • Wie in 5, Tafel A und B, gezeigt, reguliert rev das native gp120-Gen nach oben, übt aber keine Wirkung auf die Expression des synthetischen gp120-Gens aus. Die Wirkung von rev ist also bei einem Substrat, das keine Kodierungssequenz endogener Virushüllproteinsequenzen aufweist, nicht vorhanden.
  • Expression eines synthetischen THY-1-Gens der Ratte mit HIV-Hüllproteincodons
  • Das oben beschriebene Experiment lässt den Schluss zu, dass für eine rev-Regulierung tatsächlich „Hüllproteinsequenzen” vorhanden sein müssen. Zur Testung dieser Hypothese wurde eine synthetische Version des Gens hergestellt, welches das kleine, typischerweise stark exprimierte Zelloberflächenprotein, das THY-1-Antigen der Ratte, exprimiert. Die synthetische Version des THY-1-Gens der Ratte wurde derart entworfen, dass sie die gleichen Codons verwendet wie HIV-gp120. Beim Entwerfen dieses synthetischen Gens wurden AUUUA-Sequenzen, die mit mRNA-Instabilität verbunden sind, vermieden. Darüber hinaus wurden zwei Restriktionsschnittstellen eingeführt, um die Manipulation des resultierenden Gens zu vereinfachen (6). Dieses synthetische Gen mit HIV-Hüllprotein-Codonverwendung (rTHY-1env) wurde mithilfe von drei 150- bis 170-mer-Oligonukleotiden hergestellt (7). Im Gegensatz zum syngp120mn-Gen wurden die PCR-Produkte direkt in pUC12 kloniert und zusammengesetzt und anschließend in pCDM7 kloniert.
  • Der Grad der Expression von nativem rTHY-1 und rTHY-1 mit den HIV-Hüllprotein-Codons wurde durch Immunfluoreszenz von transient transfizierten 293T-Zellen quantifiziert. 8 zeigt, dass die Expression des nativen THY-1-Gens fast zwei Größenordnungen über dem Grad des Hintergrunds der transfizierten Kontrollzellen liegt (pCDM7). Dagegen ist die Expression des synthetischen Ratten-THY-1 erheblich geringer als die des nativen Gens (gezeigt durch die Verschiebung der Spitze in Richtung einer niedrigeren Kanalnummer).
  • Als Beweis, dass nicht absichtlich negative Sequenzelemente, welche mRNA-Abbau fördern, eingeführt wurden, wurde ein Konstrukt hergestellt, in dem das rTHY-1env an das 3'-Ende des synthetischen gp120-Gens kloniert wurde (9. Tafel B). In diesem Experiment wurden 293T-Zellen entweder mit dem syngp120mn-Gen oder mit dem syngp120/Ratte-THY-1env-Fusionsgen (syngp120mn.rTHY-1env) transfiziert. Die Expression wurde durch Immunpräzipitation mit CD4:IgG-Fusionsprotein und Protein A Agarose gemessen. Die in diesem Experiment beschriebenen Verfahren sind unten ausführlich beschrieben.
  • Da das synthetische gp120-Gen ein UAG-Stoppcodon aufweist, wird rTHY-1env von diesem Transkript nicht translatiert. Wenn negative Elemente, die einen verstärkten Abbau verleihen, in der Sequenz vorhanden wären, sollten die von diesem Konstrukt exprimierten Mengen an gp120-Protein im Vergleich zum syngp120mn-Konstrukt ohne rTHY-1env verringert sein. 9, Tafel A, zeigt, dass die Expression beider Konstrukte ähnlich ist, was darauf hinweist, dass die niedrige Expression mit der Translation zusammenhängen muss.
  • Rev-abhängige Expression von synthetischem THY-1-Gen der Ratte mit Hüllproteincodons
  • Um zu untersuchen, ob rev die Expression eines THY-1-Gens der Ratte mit env-Codons regulieren kann, wurde ein Konstrukt mit einer rev-Bindungsstelle am 3'-Ende des offenen Leserasters von rTHY1env hergestellt. Zur Messung der Responsivität eines Ratten-THY-1env-Konstruktes mit einer 3'-RRE wurden humane 293T-Zellen mit RattenTHY-1envrre und CDM7 oder pCMVrev kotransfiziert. Sechzig (60) Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 1 mM EDTA in PBS abgelöst und mit dem monoklonalen Maus-Anti-rTHY-1-Antikörper OX7 und einem sekundären FITC-konjugierten Antikörper gefärbt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem EPICS-XL-Cytofluorometer gemessen. Diese Verfahren sind unten ausführlich beschrieben.
  • In Wiederholungsexperimenten wurde eine leichte Erhöhung der Expression von rTHY-1env festgestellt, wenn rev mit dem rTHY-1env-Gen kotransfiziert wurde. Zur weiteren Erhöhung der Empfindlichkeit des Testsystems wurde ein Konstrukt hergestellt, welches eine sezernierte Version von rTHY-1env exprimiert. Dieses Konstrukt sollte zuverlässigere Daten produzieren, weil die akkumulierte Menge an sezerniertem Protein in dem Überstand das Ergebnis der Proteinherstellung über einen verlängerten Zeitraum wiedergibt, im Gegensatz zu Oberflächen-exprimiertem Protein, welches die eher die aktuelle Produktionsrate wiederzugeben scheint. Durch PCR wurde ein Gen hergestellt, das eine sezernierte Form exprimieren kann, indem Vorwärts- und Rückwärtsprimer verwendet wurden, die 3' von der endogenen Leadersequenz bzw. 5' von dem Sequenzmotiv binden, welches für eine Phosphatidylinositolglycanverankerung erforderlich ist. Das PCR-Produkt wurde in ein Plasmid kloniert, das bereits eine CD5-Leadersequenz aufwies, wodurch deshalb ein Konstrukt hergestellt wurde, in dem die Membranverankerung gelöscht und die Leadersequenz durch ein heterologes (und wahrscheinlich effizienteres) Leaderpeptid ausgetauscht wurde.
  • Die rev-Responsivität der sezernierten Form von Ratten-THY-1env wurde durch Immunpräzipitation von Überständen von humanen 293T-Zellen gemessen, die mit einem Plasmid, das eine sezernierte Form des Ratten-THY-1env und die RRE-Sequenz in cis (rTHY-1envPI-rre) exprimiert, und entweder mit CDM7 oder pCMVrev kotransfiziert wurden. Das rTHY-1envPI-RRE-Konstrukt wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac als Vorwärts- und cgcggatcccttgtattttgtactaata als Rückwärtsprimer und dem synthetischen rTHY-1env-Konstrukt als Vorlage hergestellt. Nach Verdau mit Nhe1 und Not1 wurde das PCR-Fragment in ein Plasmid kloniert, das CD5-Leader- und RRE-Sequenzen enthielt. Überstände von 35S-markierten Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion abgenommen, mit einem monoklonalen Mausantikörper OX7 gegen rTHY-1 und Anti-Maus-IgG-Sepharose präzipitiert und in einer 12%igen reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt.
  • In diesem Experiment war die Induktion von rTHY-1env durch rev viel deutlicher und eindeutiger als in dem oben beschriebenen Experiment und deutet stark darauf hin, dass rev in der Lage ist, Transkripte, die von selten verwendeten Codons unterdrückt werden, translational zu regulieren.
  • Rev-abhängige Expression eines rTHY-1env:Immunglobulin-Fusionsproteins
  • Zur Testung, ob selten verwendete Codons mit seltener in der gesamten Kodierungssequenz vorhanden sein müssen oder ob eine kurze Region ausreichend ist, um rev-Responsivität zu verleihen, wurde ein rTHY-1env:Immunglobulin-Fusionsprotein hergestellt. In diesem Konstrukt ist das rTHY-1env-Gen (ohne das Sequenzmotiv, das für die Phosphatidylinositolglycanverankerung verantwortlich ist) mit den Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen des humanen IgG1 verknüpft. Dieses Konstrukt wurde durch Anker-PCR hergestellt, wobei Primer mit Nhe1- und BamH1-Restriktionsschnittstellen und rTHY-1env als Vorlage verwendet wurden. Das PCR-Fragment wurde in ein Plasmid kloniert, das die Leadersequenz des CD5-Oberflächenmoleküls und die Scharnier-, CH2- und CH3-Teile des humanen IgG1-Immunglobulins enthält. Anschließend wurde ein Hind3/Eag1-Fragment mit dem rTHY-1enveg1-Insert in ein von pCDM7 abstammendes Plasmid mit der RRE-Sequenz kloniert.
  • Zur Messung der Reaktion des rTHY-1env/Immunglobin-Fusionsgens (rTHY-1enveglrre) auf rev wurden humane 293T-Zellen mit rTHY-1enveg1rre und pCDM7 oder pCMVrev kotransfiziert. Das rTHY-1enveg1rre-Konstrukt wurde mittels Anker-PCR unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern mit Nhe1- bzw. BamH1-Restriktionsschnittstellen hergestellt. Das PCR-Fragment wurde in ein Plasmid kloniert, das eine CD5-Leadersequenz und die Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen von humanem IgG1 enthält. Überstände von 35S-markierten Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion abgenommen, mit einem monoklonalen Mausantikörper OX7 gegen rTHY-1 und Anti-Maus-IgG-Sepharose präzipitiert und in einer 12%igen reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt. Die angewandten Verfahren sind unten ausführlicher beschrieben.
  • Wir bei dem Produkt des rTHY-1envPI-Gens wird dieses rTHY-1env/Immunglobulin-Fusionsprotein in den Überstand sezerniert. Dieses Gen sollte daher auf rev-Induktion ansprechen. Im Gegensatz zu rTHY-1envPI induzierte eine Kotransfektion von rev in trans keine oder nur einen vernachlässigbaren Anstieg der Expression von rTHY-1enveg1.
  • Die Expression des rTHY-1:Immunglobulin-Fusionsproteins mit nativen rTHY-1- oder HIV-Hüllproteincodons wurde durch Immunpräzipitation gemessen. In Kürze wurden humane 293T-Zellen mit rTHY-1enveg1 (env-Codons) oder rTHY-1wteg1 (native Codons) transfiziert. Das rTHY-1wteg1-Konstrukt wurde auf ähnliche Weise wie das rTHY-1enveg1-Konstrukt hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein Plasmid, welches das native rTHY-1-Gen enthält, als Vorlage verwendet wurde. Überstände von 35S-markierten Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion abgenommen, mit einem monoklonalen Mausantikörper OX7 gegen rTHY-1 und Anti-Maus-IgG-Sepharose präzipitiert und in einer 12%igen reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt. Die in diesem Experiment angewandten Verfahren sind unten ausführlicher beschrieben.
  • Der Grad der Expression von rTHY-1enveg1 war im Vergleich zu einem ähnlichen Konstrukt mit Wildtyp-rTHY-1 als Fusionspartner vermindert, aber immer noch erheblich höher als bei rTHY-1env. Entsprechend beeinflussten beide Teile des Fusionsproteins den Grad der Expression. Die Zugabe von rTHY-1env schränkte die Expression nicht in gleichem Maß ein, wie es bei rTHY-1env alleine beobachtet wurde. Die Regulation durch rev scheint daher unwirksam zu sein, wenn die Proteinexpression nicht fast vollständig unterdrückt wird.
  • Codonpräferenz bei HIV-1-Hüllproteingenen
  • Ein direkter Vergleich zwischen der Codonverwendungshäufigkeit bei HIV-Hüllproteingenen und stark exprimierten humanen Genen zeigt einen deutlichen Unterschied für alle zwanzig Aminosäuren. Ein einfaches Maß für die statistische Signifikanz dieser Codonpräferenz ist der Befund, dass bei allen neun Aminosäuren mit zweifacher Codondegeneration jeweils der bevorzugte dritte Rest A oder U ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass alle neun von zwei gleich wahrscheinlichen Möglichkeiten gleich sind, ist etwa 0,004, und daher ist die Wahl des dritten Restes nach keinem herkömmlichen Maßstab als zufällig anzusehen. Weitere Hinweise für eine verschobene Codonpräferenz finden sich unter den degenerierteren Codons, bei denen eine starke Selektion für Tripletts mit Adenin zu sehen ist. Dem gegenüber steht das Muster bei stark exprimierten Genen, welche Codons mit C, oder weniger häufig G, an der dritten Position von Codons mit drei- oder mehrfacher Degeneration bevorzugen.
  • Der systematische Austausch nativer Codons durch Codons stark exprimierter humaner Gene erhöhte die Expression von gp120 drastisch. Eine quantitative Analyse durch ELISA zeigte, dass die Expression des synthetischen Gens im Vergleich zum nativen gp120 nach transienter Transfektion in humane 293-Zellen mindestens 25-Mal höher war. Die Konzentrationsstufen in dem gezeigten ELISA-Experiment waren relativ gering. Da zur Quantifizierung ein ELISA verwendet wurde, der auf der Bindung von gp120 an CD4 beruht, wurde nur natives nicht denaturiertes Material nachgewiesen. Dies könnte die augenscheinlich schwache Expression erklären. Messung der Menge an zytoplasmatischer mRNA zeigte, dass die unterschiedliche Expression auf Translationsunterschiede und nicht auf mRNA-Stabilität zurückzuführen ist.
  • Retroviren zeigen im Allgemeinen keine ähnliche Präferenz für A und T, wie dies bei HIV der Fall ist. Wird diese Familie allerdings in zwei Untergruppen eingeteilt, in lentivirale und in nicht-lentivirale Retroviren, wurde eine ähnliche Präferenz für A und, weniger häufig, für T an der dritten Codonposition für Lentiviren festgestellt. Die festgestellten Hinweise lassen daher den Schluss zu, dass Lentiviren ein charakteristisches Muster von Hüllproteingencodons beibehalten, nicht wegen eines inhärenten Vorteils für die reverse Transkription oder Replikation solcher Reste, sondern vielmehr aus einem Grund, welcher der Physiologie dieser Virusklasse eigen ist. Der Hauptunterschied zwischen Lentiviren und nicht-komplexen Retroviren sind zusätzliche regulatorische und nicht-essenzielle akzessorische Gene bei Lentiviren, wie bereits erwähnt worden ist. Eine einfache Erklärung für die Restriktion der Hüllproteingenexpression könnte daher sein, dass darauf ein wichtiger regulatorischer Mechanismus eines dieser zusätzlichen Moleküle basiert. Tatsächlich ist eines dieser Proteine, rev, bekannt, welches mit großer Wahrscheinlichkeit bei allen Lentiviren Homologe aufweist. Die Codonverwendung in viraler mRNA dient also dazu, eine Klasse von Transkripten zu schaffen, die gegenüber der stimulatorischen Wirkung von rev empfänglich sind. Diese Hypothese wurde mithilfe einer ähnlichen Strategie wie oben bewiesen, aber dieses Mal wurde die Codonverwendung in die andere Richtung verändert. Die verwendeten Codons eines stark exprimierten zellulären Gens wurden durch die am häufigsten verwendeten Codons im HIV-Hüllproteingen ausgetauscht. Wie angenommen, war der Grad der Expression im Vergleich zu dem nativen Molekül bei Analyse durch Immunfluoreszenz der exprimierten Oberflächenmoleküle um fast zwei Größenordnungen erheblich geringer (siehe 4.7). Wenn rev in trans koexprimiert wird, und ein RRE-Element in cis vorhanden war, wurde für das Oberflächenmolekül nur eine leichte Induktion beobachtet. Wenn aber THY-1 als sezerniertes Molekül exprimiert wurde, war die Induktion durch rev viel deutlicher, was die obige Hypothese stützt. Dies könnte möglicherweise durch Akkumulierung von sezerniertem Protein im Überstand erklärt werden, was die Wirkung von rev erheblich amplifiziert. Wenn rev im Allgemeinen nur eine geringfügige Verstärkung in Bezug auf Oberflächenmoleküle induziert, kann die Induktion von HIV-Hüllproteinen durch rev nicht den Zweck einer erhöhten Oberflächenhäufigkeit haben, sondern eher hinsichtlich einer erhöhten Menge an intrazellulärem gp160. Es ist derzeit vollständig unklar, warum dies der Fall sein würde.
  • Zur Testung, ob kleine subtotale Elemente eines Gens ausreichend sind, um die Expression zu beschränken und sie rev-abhängig zu machen, wurden rTHY1env:Imunglobulin-Fusionsproteine erzeugt, bei denen nur etwa ein Drittel des gesamten Gens Codons von Hüllproteingenen verwendet. Der Grad der Expression dieses Konstruktes war mittelmäßig, was anzeigt, dass das rTHY-1env-negative Sequenzelement gegenüber dem Immunglobulinteil nicht dominant ist. Dieses Fusionsprotein war nicht oder nur leicht rev-responsiv, was anzeigt, das nur Gene, die fast vollständig supprimiert sind, rev-responsiv sein können.
  • Ein anderes charakteristisches Merkmal, das in den Tabellen der Codonhäufigkeit festgestellt wurde, ist eine bemerkenswerte Minderrepräsentation von CpG-Tripletts. Bei einer Vergleichsstudie der Codonverwendung bei E. coli, Hefen, Drosophila und Primaten wurde gezeigt, dass bei einer hohen Zahl analysierter Primatengene die 8 am wenigsten verwendeten Codons sämtlich Codons mit der CpG-Dinukleotidsequenz enthalten. In der Sequenz anderer Retroviren wurde ebenfalls eine Vermeidung von Codons festgestellt, die dieses Dinukleotidmotiv enthalten. Es scheint plausibel, dass der Grund für die Minderrepräsentation von CpG-enthaltenden Tripletts mit der Vermeidung einer Genstummschaltung durch Methylierung von CpG-Cytosinen zusammenhängt. Die erwartete Zahl von CpG-Dinukleotiden für HIV als Ganzes liegt bei etwa einem Fünftel der auf Grundlage der Basenzusammensetzung erwarteten Anzahl. Dies könnte anzeigen, dass die Möglichkeit einer starken Expression wiederhergestellt wird, und dass das Gen tatsächlich zu einem Zeitpunkt während der viralen Pathogenese stark exprimiert sein muss.
  • Die hierin präsentierten Ergebnisse zeigen deutlich, dass Codonpräferenz einen schwer wiegenden Effekt auf die Proteinmenge hat, und lassen den Schluss zu, dass translationale Verlängerung (Elongation) die Expression von Säugergenen kontrolliert. Es könnten aber auch weitere Faktoren eine Rolle spielen. Erstens weist das Übermaß nicht maximal beladener mRNAs in eukaryotischen Zellen darauf hin, dass die Initiation in mindestens einigen Fällen für die Translation geschwindigkeitslimitierend ist, da sonst alle Transkripte vollkommen von Ribosomen bedeckt wären. Wenn darüber hinaus das Blockieren von Ribosomen und der anschließende mRNA-Abbau den Mechanismus darstellen würden, würde die Suppression durch seltene Codons höchstwahrscheinlich nicht durch einen regulatorischen Mechanismus wie den hierin vorgestellten umgekehrt werden. Eine mögliche Erklärung für den Einfluss von Initiation und Elongation auf die Translationsaktivität ist, dass die Rate der Initiation bzw. der Zugang zu Ribosomen teilweise durch Hinweissignale kontrolliert wird, die in der ganzen RNA verteilt sind, so dass die lentiviralen Codons die RNA dazu prädisponieren, als Pool von kaum initiierter RNA zu akkumulieren. Diese Einschränkung braucht aber nicht kinetisch zu sein; beispielsweise könnte die Wahl der Codons die Wahrscheinlichkeit beeinflussen, dass ein bestimmtes Translationsprodukt nach der Initiation korrekt vervollständigt wird. Bei diesem Mechanismus würde das Übermaß weniger bevorzugter Codons eine signifikante kumulative Wahrscheinlichkeit des Versagens beim Vervollständigen der naszenten Polypeptidkette nach sich ziehen. Der abgesonderten RNA würde dann durch die Wirkung von rev eine verbesserte Initiationsrate verliehen werden. Da Adeninreste in rev-responsiven Iranskripten im Übermaß vorhanden sind, könnte es sein, dass RNA-Adeninmethylierung diese translationale Unterdrückung vermittelt.
  • Ausführliche Verfahrensweisen
  • In den oben beschriebenen Experimenten wurden folgende Verfahrensweisen verwendet.
  • Sequenzanalyse
  • Bei den Sequenzanalysen wurde die Software verwendet, die von der University of Wisconsin Computer Group entwickelt worden ist.
  • Plasmidkonstruktionen
  • Bei den Plasmidkonstruktionen wurden folgende Verfahren verwendet. Vektoren und Insert-DNA wurden bei einer Konzentration von 0,5 μg/10 μl in dem geeigneten Restriktionspuffer 1–4 Stunden lang verdaut (Gesamtreaktionsvolumen: etwa 30 μl). Der verdaute Vektor wurde vor der Gelelektrophorese 30 Minuten lang mit 10% (Vol./Vol.) 1 μg/ml alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Sowohl Vektor als auch Insert-Verdaus (jeweils 5 bis 10 μl) wurden in einem 1,5%igen bei niedriger Temperatur schmelzenden (Low Melting) Agarosegel mit TAE-Puffer aufgetrennt. Gelscheiben, welche relevanten Banden enthielten, wurden in ein 1,5-ml-Reaktionsröhrchen überführt, bei 65°C geschmolzen und der Ligation direkt zugegeben, ohne die Agarose zu entfernen. Die Ligationen wurden typischerweise in einem Gesamtvolumen von 25 μl in 1 × Low-Puffer mit 1 × Ligationszusätze mit 200–400 E Ligase, 1 μl Vektor und 4 μl Insert durchgeführt. Falls erforderlich, wurden 5'-Überhangenden aufgefüllt, indem 1/10 Volumen von 250 μM dNTPs und 2–5 E Klenow-Polymerase zu hitzeinaktivierten oder phenolextrahierten Verdauansätzen gegeben und etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Falls erforderlich, wurden 3'-Überhangenden aufgefüllt, indem 1/10 Volumen von 2,5 mM dNTPs und 5–10 E von T4-DNA-Polymerase zu hitzeinaktivierten oder phenolextrahierten Verdauansätzen gegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C für 30 Minuten. Bei diesen Reaktionen wurden folgende Puffer verwendet: 10 × Low-Puffer (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM (β-Mercaptoethanol, 0,02% NaN3); 10 × Medium-Puffer (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM β-Mercaptoethanol, 0,02% NaN3); 10 × High-Puffer (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgC12, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM β-Mercaptoethanol, 0,02% NaN3); 10 × Ligationszusätze (1 mM ATP, 20 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 10 mM Spermidin); 50× TAE (2 M Tris-Acetat, 50 mM EDTA).
  • Oligonukleotidsynthese und -reinigung
  • Oligonukleotide wurden in einem Milligen 8750 Synthesizer (Millipore) hergestellt. Die Säulen wurden mit 1 ml 30%igem Ammoniumhydroxid eluiert, und die eluierten Oligonukleotide wurden bei 55°C 6 bis 12 Stunden lang entblockt. Nach dem Entblocken wurden 150 μl Oligonukleotide mit dem 10-fachen Volumen an ungesättigtem n-Butanol in 1,5-ml-Reaktionsröhrchen präzipitiert, gefolgt von Zentrifugation bei 15.000 Umdrehungen pro Minute in einer Mikrofuge. Das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 50 μl H2O resuspendiert. Die Konzentration wurde bestimmt, indem die optische Dichte bei 260 nm in einer Verdünnung von 1:333 gemessen wurde (1 OD260 = 30 μg/ml).
  • Für die Konstruktion des synthetischen gp120-Gens wurden folgende Oligonukleotide verwendet (alle in diesem Text gezeigten Sequenzen verlaufen in Richtung 5' zu 3'):
    Figure 00300001
    Figure 00310001
  • Für die Konstruktion des RatteTHY-1env-Gens wurden folgende Oligonukleotide verwendet:
    Figure 00320001
  • Polymerasekettenreaktion
  • Kurze überlappende 15 bis 25 mer Oligonukleotide, die eine Annealing-Reaktion an beiden Enden durchführen, wurden verwendet, um die langen Oligonukleotide durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Typische PCR-Bedingungen waren: 35 Zyklen, 55°C Annealing-Temperatur, 0,2 Sek. Extensionszeit. PCR-Produkte wurden gelgereinigt, phenolextrahiert und in einer anschließenden PCR verwendet, um längere Fragmente zu erzeugen, die aus zwei benachbarten kleinen Fragmenten bestehen. Diese längeren Fragmente wurden in ein von CDM7 abstammendes Plasmid kloniert, das eine Leader-Sequenz des CD5-Oberflächenmoleküls, gefolgt von einem Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1-Polylinker enthält.
  • Bei diesen Reaktionen wurden folgende Lösungen verwendet: 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, 2 mM jedes dNTP). Der Endpuffer wurde mit 10% DMSO ergänzt, um die Genauigkeit (Fidelity) der Taq-Polymerase zu erhöhen.
  • DNA-Präparation in kleinem Maßstab
  • Transformierte Bakterien konnten für über 6 Stunden oder über Nacht in 3 ml LB-Kulturen wachsen. Etwa 1,5 ml jeder Kultur wurden in 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen überführt, 20 Sekunden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und in 200 μl Lösung I resuspendiert. Anschließend wurden 400 μl Lösung II und 300 μl Lösung III zugegeben. Die Mikrofugenröhrchen wurden verschlossen, gemischt und für > 30 Sek. zentrifugiert. Überstände wurde in frische Röhrchen überführt und einmal mit Phenol extrahiert. DNA wurde präzipitiert, indem die Röhrchen mit Isopropanol gefüllt, gemischt und in einer Mikrofuge für > 2 Min. zentrifugiert wurden. Die Pellets wurden in 70%igem Ethanol gespült und in 50 μl dH2O mit 10 μl RNAse A resuspendiert. Bei diesen Verfahren wurden folgende Medien und Lösungen verwendet: LB-Medium (1,0% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Trypton); Lösung I (10 mM EDTA pH 8,0); Lösung II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS); Lösung III (2,5 M KOAc, 2,5 M Eisessig); Phenol (pH-Wert auf 6,0 eingestellt, überschichtet mit TE); TE (10 mM Tris HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0).
  • DNA-Präparation in großem Maßstab
  • Ein-Liter-Kulturen transformierter Bakterien konnten 24 bis 36 Stunden (MC1061p3, transformiert mit pCDM-Derivaten) oder 12 bis 16 Stunden (MC1061 transformiert mit pUC-Derivaten) bei 37°C in M9-Bakterienmedium (pCDM-Derivate) oder LB (pUC-Derivate) wachsen. Die Bakterien wurden in 1-Liter-Flaschen in einer Beckman-J6-Zentrifuge bei 4.200 Umdrehungen pro Minute 20 Minuten lang zentrifugiert. Das Pellet wurde in 40 ml Lösung I resuspendiert. Anschließend wurden 80 ml Lösung II und 40 ml Lösung III zugegeben, und die Flaschen wurden mittelkräftig geschüttelt, bis sich Klumpen mit einer Größe von 2 bis 3 mm entwickelten. Die Flasche wurde 5 Min. bei 4.200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und der Überstand wurde durch ein Seihtuch in eine 250-ml-Flasche gegossen. Es wurde Isopropanol auf die Oberfläche gegeben und die Flasche 10 Min. bei 4.200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4,1 ml Lösung I resuspendiert und zu 4,5 g Cäsiumchlorid, 0,3 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid und 0,1 ml 1%iger Triton-X100-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden 5 Minuten lang in einer Beckman-J2-Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 10.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde in Quick-Seal-Ultrazentrifugenröhrchen von Beckman überführt, die anschließend verschlossen und für > 2,5 Stunden bei 80.000 Umdrehungen pro Minute in einem Festwinkelrotor NVT90 in einer Beckman-Ultrazentrifuge zentrifugiert wurden. Die Bande wurde im sichtbaren Licht mit einer 1-ml-Spritze und einer 20-Gauge-Kanüle extrahiert. Dem extrahierten Material wurde ein gleiches Volumen an dH2O zugegeben. DNA wurde einmal mit n-Butanol, gesättigt mit 1 M Natriumchlorid, extrahiert, gefolgt von der Zugabe eines gleichen Volumens von 10 M Ammoniumacetat/1 mM EDTA. Das Material wurde in ein 13-ml-Schnappdeckelröhrchen gegossen, welches dann bis oben mit absolutem Ethanol gefüllt, gemischt und für 10 Minuten in einer Beckman-J2-Zentrifuge bei 10.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gespült und in 0,5 bis 1 ml H2O resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde bestimmt, indem die optische Dichte bei 260 nm in einer Verdünnung von 1:200 gemessen wurde ( (1 OD260 = 50 μg/ml).
  • Bei diesen Verfahren wurden folgende Medien und Puffer verwendet: M9-Bakterienmedium (10 g M9-Salze, 10 g Casaminosäuren (hydrolysiert), 10 ml M9-Zusätze, 7,5 μg/ml Tetracyclin (500 μl einer Stammlösung mit 15 mg/ml), 12,5 μg/ml Ampicillin (125 μl einer Stammlösung mit 10 mg/ml); M9-Zusätze (10 mM CaCl2, 100 mM MgSO4, 200 μg/ml Thiamin, 70% Glycerin); LB-Medium (1,0% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Trypton); Lösung I (10 mM EDTA pH 8,0); Lösung II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS); Lösung III (2,5 M KOAc, 2,5 M HOAc).
  • Sequenzierung
  • Synthetische Gene wurden mit dem Didesoxynukleotidverfahren nach Sanger sequenziert. In Kürze wurden 20 bis 50 μg doppelsträngige Plasmid-DNA in 0,5 M NaOH 5 Min. lang denaturiert. Anschließend wurde die DNA mit 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Volumen Ethanol präzipitiert und 5 Min. zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und in einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert. Die Annealing-Reaktion wurde mit 4 μg Vorlagen-DNA und 40 ng Primer in 1× Annealing-Puffer in einem Endvolumen von 10 μl durchgeführt. Die Reaktion wurde auf 65°C erhitzt und langsam auf 37°C abgekühlt. In ein separates Röhrchen wurden je Reaktion 1 μl 0,1 M DTT, 2 μl Markierungsgemisch, 0,75 μl dH2O, 1 μl [35S]dATP (10 uCi) und 0,25 μl SequenaseTM [12 E/μl) gegeben. Fünf μl dieser Mischung wurden zu jedem Röhrchen mit der Annealing-Reaktion zwischen Primer und Vorlage gegeben und 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Für jede Markierungsreaktion wurden je 2,5 μl der vier Terminationsgemische in eine Terasaki-Platte gegeben und auf 37°C vorgewärmt. Am Ende der Inkubationszeit wurden 3,5 μl Markierungsreaktion zu jedem der 4 Terminationsgemische gegeben. Nach 5 Min. wurden zu jeder Reaktion 4 μl Stopplösung gegeben und die Terasaki-Platte wurde bei 80°C 10 Min. in einem Ofen inkubiert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem 5%igen denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Es wurde eine Acrylamidlösung hergestellt, indem 200 ml 10 × TBE-Puffer und 957 ml dH2O zu 100 g Acrylamid:Bisacrylamid (29:1) gegeben wurden. Es wurde ein Gel aus 5% Polyacrylamid, 46% Harnstoff und 1 × TBE hergestellt, indem 38 ml Acrylamidlösung und 28 g Harnstoff kombiniert wurden. Die Polymerisierung wurde ausgelöst, indem 400 μl 10%iges Ammoniumpersulfat und 60 μl TEMED zugegeben wurden. Die Gele wurden unter Verwendung von silanisierten Glasplatten und Haifischzahnkämmen gegossen und in 1 × TBE-Puffer bei 60 bis 100 W 2 bis 4 Stunden lang (je nach der zu messenden Region) laufen gelassen. Die Gele wurden auf Whatman-Blottingpapier übertragen, bei 80°C etwa 1 Stunde lang getrocknet, und bei Raumtemperatur Röntgenfilmen ausgesetzt. Die typische Expositionszeit war 12 Stunden. Bei diesen Verfahren wurden folgende Lösungen verwenden: 5 × Annealing-Puffer (200 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 250 mM NaCl); Markierungsgemisch (je 7,5 μM dCTP, dGTP und dTTP); Terminationsgemische (je 80 μM dNTP, 50 mM NaCl, 8 μM ddNTP (jeweils eines)); Stopplösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylolcyanol); 5 × TBE (0,9 M Tris-Borat, 20 mM EDTA); Polyacrylamidlösung (96,7 g Polyacrylamid, 3,3 g Bisacrylamid, 200 ml 1× TBE, 957 ml dH2O).
  • RNA-Isolierung
  • Aus Kalziumphosphat-transfizierten 293T-Zellen wurde 36 Stunden nach der Transfektion und aus Vakziniainfizierten Hela-Zellen 16 Stunden nach der Infektion zytoplasmatische RNA isoliert, im Wesentlichen wie von Gilman beschrieben. („Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells”. In Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., Wiley & Sons, New York, USA, 1992). In Kürze wurden Zellen in 400 μl Lysepuffer lysiert, die Kerne wurden abzentrifugiert, und es wurden SDS bis zu 0,2% und Proteinase K bis zu 0,2 mg/ml zugegeben. Die Zytoplasmaextrakte wurden 20 Min. bei 37°C inkubiert, zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und präzipitiert. Die RNA wurde in 100 μl Puffer I gelöst und 20 Min. bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde angehalten, indem 25 μl Stopp-Puffer zugegeben wurde und die Präzipitation wiederholt wurde.
  • Bei diesem Verfahren wurden folgende Lösungen verwendet: Lysepuffer (TE, enthaltend 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP40); Puffer I (TE-Puffer mit 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 E/μl plazentaler RNAse-Inhibitor, 0,1 E/μl RNAse freie DNAse I); Stopp-Puffer (50 mM EDTA 1,5 M NaOAc, 1,0% SDS).
  • Slot-Blot-Analyse
  • Für die Slot-Blot-Analyse wurden 10 μg zytoplasmatische RNA in 50 μl dH2O gelöst, und dazu wurden 150 μl 10 × SSC/18% Formaldehyd gegeben. Die gelöste RNA wurde anschließend 15 Min. bei 65°C inkubiert und mit einer Slot-Blot-Vorrichtung punktförmig aufgetragen. Für die Hybridisierung wurden 1,5 kb lange, radioaktiv markierte Sonden der gp120IIIb- und syngp120mn-Fragmente verwendet. Jedes der beiden Fragmente wurde willkürlich in einer 50-μl-Reaktion mit 10 μl 5 × Oligomarkierungspuffer, 8 μl von 2,5 mg/ml BSA, 4 μl ∝ P[32P]-dCTP (20 uCi/μl 6000 Ci/mmol) und 5 E Klenow-Fragment markiert. Nach einer Inkubation von 1 bis 3 Stunden bei 37°C wurden 100 μl TE zugegeben, und nicht eingebautes ∝[32P]-dCTP wurde mithilfe einer G50-Zentrifugensäule entfernt. Die Aktivität wurde in einem Beta-Zähler von Beckman gemessen, und für die Hybridisierung wurden gleiche spezifische Aktivitäten verwendet. Die Membranen wurden 2 Stunden vorhybridisiert und 12 bis 24 Stunden bei 42°C mit 0,5 × 106 cpm Sonde je ml Hybridisierungsflüssigkeit hybridisiert. Die Membran wurde zweimal (5 Min.) bei Raumtemperatur mit Waschpuffer I, eine Stunde bei 65°C in Waschpuffer II gewaschen und anschließend einem Röntgenfilm ausgesetzt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem 1,1-kb-Not1/Sfi1-Fragment von pCDM7 erhalten, welches die nicht translatierte 3-Region enthielt. Kontrollhybridisierung erfolgte parallel mit einer willkürlich markierten humanen Beta-Aktin-Sonde. Die RNA-Expression wurde quantifiziert, indem die hybridisierten Nitrocellulosemembranen mit einem Phosphorimager von Magnetic Dynamics gescannt wurden.
  • Bei diesem Verfahren wurden folgende Lösungen verwendet:
    5× Oligomarkierungspuffer (250 mM Tris HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl2, 5 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mmM dTTP, 1 M Hepes pH 6,6, 1 mg/ml Hexanukleotide [dNTP]6); Hybridisierungslösung (__ M Natriumphosphat, 250 mM NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% Dextransulfat, 50% Formamid, 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien DNA); Waschpuffer I (2 × SSCS, 0,1% SDS); Waschpuffer II (0,5 × SSC, 0,1% SDS); 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na3citrat, pH-Wert eingestellt auf 7,0).
  • Vakziniarekombination
  • Bei der Vakziniarekombination wurde eine Modifikation des Verfahrens verwendet, das von Romeo und Seed beschrieben worden ist (Romeo and Seed, Cell, 64: 1037, 1991). In Kürze wurden CV1-Zellen mit einer Konfluenz von 70 bis 90% mit 1 bis 3 μl eines Vakzinia-Wildtyp-Stamms WR (2 × 108 pfu/ml) 1 Stunde lang in Kulturmedium ohne Kalbsserum infiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mithilfe von Kalziumphosphat mit 25 μg TKG-Plasmid-DNA je Schale transfiziert. Nach weiteren 24 bis 48 Stunden wurden die Zellen von der Platte geschabt, zentrifugiert und in einem Volumen von 1 ml resuspendiert. Nach 3 Einfrier-/Auftau-Zyklen wurde Trypsin bis zu 0,05 mg/ml zugegeben und die Lysate wurden 20 Min. lang inkubiert. Es wurde eine Verdünnungsreihe dieser Lysate von 10, 1 und 0,1 μl verwendet, um kleine Schalen (6 cm) von CV1-Zellen zu infizieren, die 6 Stunden lang mit 12,5 μg/ml Mycophenolsäure, 0,25 mg/ml Xanthin und 1,36 mg/ml Hypoxanthin vorbehandelt worden waren. Infizierte Zellen wurden 2 bis 3 Tage lang kultiviert und anschließend mit dem monoklonalen Antikörper NEA9301 gegen gp120 und einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten sekundären Antikörper angefärbt. Die Zellen wurden mit 0,33 mg/ml NBT und 0,16 mg/ml BCIP in AP-Puffer inkubiert und schließlich mit 1% Agarose in PBS überschichtet. Positive Plaques wurden gepickt und in 100 μl Tris pH 9,0 resuspendiert. Die Plaquereinigung wurde einmal wiederholt. Um Stammlösungen mit hohem Titer zu produzieren, wurde der Maßstab der Infektion langsam erhöht. Schließlich wurde eine große Platte mit HeLa-Zellen mit der Hälfte an Virus der vorherigen Runde infiziert. Infizierte Zellen wurden in 3 ml PBS abgelöst, mit einem Dounce-Homogenisator lysiert und durch Zentrifugation von größeren Trümmern befreit. Stammlösungen mit rekombinantem Vakzinia VPE-8 wurden freundlicherweise von AIDS Repository in Rockville, MD, USA zur Verfügung gestellt und exprimieren HIV-I-IIIb-gp120 unter Kontrolle des 7,5-gemischten-early/late-Promotors (Earl et al., J. Virol., 65:31, 1991). In allen Experimenten mit rekombinantem Vakzinia wurden die Zellen bei einer Multiplicity of Infektion von mindestens 10 infiziert.
  • Bei diesem Verfahren wurde folgende Lösung verwendet:
    AP-Puffer (100 mM Tris HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2).
  • Zellkultur
  • Die Affennierenkarzinomzelllinien CV1 und Cos7, die humane Nierenkarzinomzelllinie 293T und die humane Zervixkarzinomzelllinie HeLa wurden von der American Tissue Typing Collection erhalten und in supplementiertem IMDM gehalten. Sie wurden auf 10-cm-Gewebekulturschalen gehalten und typischerweise alle 3 bis 4 Tage 1:5 bis 1:20 geteilt. Bei diesem Verfahren wurde folgendes Medium verwendet:
    Supplementiertes IMDM (90% Iscove's Modified Dulbecco Medium, 10% Kalbsserum, mit Eisen ergänzt, 30 Min. bei 56°C hitzeinaktiviert, 0,3 mg/ml L-Glutamin, 25 μg/ml Gentamycin, 0,5 mM β-Mercaptoethanol (pH-Wert eingestellt mit 5 M NaOH, 0,5 ml)).
  • Transfektion
  • Kalziumphosphattransfektion von 293T-Zellen wurde durchgeführt, indem 10 μg Plasmid-DNA in 250 μl 0,25 M CaCl2 unter Mischen auf dem Vortex langsam während des Mischens auf dem Vortex zum gleichen Volumen an 2 × HEBS-Puffer gegeben wurden. Nach Inkubation für 10 bis 30 Min. bei Raumtemperatur wurde das DNA-Präzipitat zu einer kleinen Schale mit zu 50 bis 70% konfluenten Zellen gegeben. In Kotransfektionsexperimenten mit rev wurden die Zellen mit 10 μg gp120IIIb, gp120IIIbrre, syngp120mnrre oder rTHY-1enveglrre und 10 μg pCMVrev- oder CDM7-Plasmid-DNA transfiziert.
  • Bei diesem Verfahren wurden folgende Lösungen verwendet: 2 × HERS-Puffer (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM steril filtriert); 0,25 mM CaCl2 (autoklaviert).
  • Immunpräzipitation
  • Nach 48 bis 60 Stunden wurde das Medium ausgetauscht, und die Zellen wurden für weitere 12 Stunden in Cys-/Met-freiem Medium mit 200 μCi 35S-Translabel inkubiert. Die Überstände wurden abgenommen und 15 Min. bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Nach Zugabe der Proteaseinhibitoren Leupeptin, Aprotinin und PMSF auf respektive 2,5 μg/ml, 50 μg/ml bzw. 100 μg/ml wurde 1 ml Überstand entweder mit 10 μl gepackter Protein A Sepharose alleine (rTHY-1enveg1rre) oder mit Protein A Sepharose und 3 μg eines gereinigten CD4/Immunglobulin-Fusionsproteins (freundlicherweise von Behring zur Verfügung gestellt) (alle gp120-Konstrukte) 12 Stunden lang bei 4°C auf einem Rotator inkubiert. Anschließend wurden die Protein-A-Kügelchen 5 Mal jeweils 5 bis 15 Minuten gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden 10 μl Ladepuffer, enthaltend, zugegeben, die Proben wurden 3 Min. lang gekocht und auf 7%ige (alle gp120-Konstrukte) oder 10%ige (rTHY-1enveg1rre) SDS-Polyacrylamidgele aufgetragen (IRIS-Puffer, pH 8,8 im Trenngel, TRIS-Puffer, pH 6,8 im Sammelgel, Laufpuffer: TRIS-Glycin, Maniatis et al. 1989). Die Gele wurden in 10% Essigsäure und 10% Methanol fixiert, mit Amplify 20 Min. lang inkubiert, getrocknet und 12 Stunden lang exponiert.
  • Bei diesem Verfahren wurden folgende Puffer und Lösungen verwendet: Waschpuffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1% NP-40); 5 × Laufpuffer (125 mM Tris, 1,25 M Glycin, 0,5% SDS); Ladepuffer (10% Glycerin, 4% SDS, 4% β-Mercaptoethanol, 0,02% Bromphenolblau).
  • Immunfluoreszenz
  • 293T-Zellen wurden durch Kalziumphosphatkopräzipitation transfiziert und nach 3 Tagen auf Oberflächenexpression von THY-1 untersucht. Nach Ablösen mit 1 mM EDTA/PBS wurden die Zellen 20 Minuten bei 4°C mit dem monoklonalen Antikörper OX7 in einer Verdünnung von 1:250 gefärbt, mit PBS gewaschen und anschließend mit einer 1:500-Verdünnung eines FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Immunglobulinantiserums inkubiert. Die Zellen wurden erneut gewaschen, in 0,5 ml einer Fixierlösung resuspendiert und in einem EPICS XL-Zytofluorometer (Coulter) analysiert.
  • Bei diesem Verfahren wurden folgende Lösungen verwendet: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, pH-Wert eingestellt auf 7,4); Fixierlösung (2% Formaldehyd in PBS).
  • ELISA
  • Die Konzentration von gp120 in Kulturüberständen wurde mithilfe von CD4-beschichteten ELISA-Platten und Ziege-Anti-gp120-Antiseren in der löslichen Phase bestimmt. Überstände von mit Kalziumphosphat transfizierten 293T-Zellen wurden nach 4 Tagen abgenommen, bei 3000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang zentrifugiert, um Trümmer zu entfernen, und in den Platten 12 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Nach 6 Waschschritten mit PBS wurden für 2 Stunden 100 μl Ziege-Anti-gp120-Antiserum in einer Verdünnung von 1:200 zugegeben. Die Platten wurden erneut gewaschen und 2 Stunden mit einem Peroxidase-konjugierten Kaninchen-Anti-Ziege-IgG-Antiserum 1:1000 inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und 30 Min. mit 100 μl Substratlösung inkubiert, die 2 mg/ml o-Phenylendiamin in Natriumcitratpuffer enthielt. Die Reaktion wurden schließlich mit 100 μl 4 M Schwefelsäure angehalten. Die Platten wurden bei 490 nm mit einem Mikrotiterplattenlesegerät von Coulter analysiert. Als Kontrolle wurde gereinigtes rekombinantes gp120IIIb verwendet. Bei diesem Verfahren wurden folgende Puffer und Lösungen verwendet: Waschpuffer (0,1% NP40 in PBS); Substratlösung (2 mg/ml o-Phenylendiamin in Natriumcitratpuffer). SEQUENZLISTE
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Claims (4)

  1. Verfahren zur Herstellung eines für ein normalerweise in Säugerzellen exprimiertes Protein codierenden synthetischen Gens, wobei wenigstens 50% der im für das Protein codierenden natürlichen Gen vorhandenen nicht bevorzugten Codons und weniger bevorzugten Codons gegen die gleichen Aminosäuren codierende bevorzugte Codons ausgetauscht sind, wobei die bevorzugten Codons ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg, die weniger bevorzugten Codons ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus ggg, att, ctc, tcc und gtc und es sich bei den nicht bevorzugten Codons um alle von den bevorzugten Codons und den weniger bevorzugten Codons verschiedenen Codons handelt, wobei das synthetische Gen dazu in der Lage ist, das Säugerprotein auf einem Niveau zu exprimieren, das mindestens 110% des Expressionsniveaus des natürlichen Gens in einem Säugerzellenkultursystem in vitro unter identischen Bedingungen entspricht.
  2. Synthetisches Gen, erhältlich mit einem Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Protein um ein HIV-Protein handelt.
  3. Synthetisches Gen nach Anspruch 2, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gag, pol und env.
  4. Synthetisches Gen nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Protein um gp120 oder gp160 handelt.
DE69535147T 1994-09-19 1995-09-08 Überexpression von säugetier- und virusproteinen Expired - Lifetime DE69535147T3 (de)

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