DE10030466A1 - Nukleotid- und Aminosäurensequenzen eines zellulären Repressors der DNA Replikation des Herpesvirus Epstein-Barr - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung eines zellulären Repressors, der mit TB7 bezeichnet wird, der DNA Replikation des Herpesvirus Epstein-Barr (EBV), die Aufklärung der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von TB7 sowie die Verwendung von TB7, insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, um die Vermehrung von EBV in infizierten Patienten zu supprimieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betriff die Identifizierung eines zellulären Repressors, der mit TB7 bezeichnet wird, der DNA Replikation des Herpesvirus Epstein-Barr (EBV), die Aufklärung der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von TB7 sowie die Verwendung von TB7, insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, um die Vermehrung von EBV in infizier­ ten Patienten zu supprimieren.

Das Epstein-Barr Virus

Das Epstein-Barr Virus (EBV) gehört zur Familie der Herpesviridae, die aufgrund ihrer Patho­ genität, der Zelltypen die sie infizieren und ihrer Vermehrungseigenschaften in drei Unterfamili­ en (α-, β- und γ-Herpesviren) eingeteilt werden. Das Epstein-Barr Virus wird in die Unterfamilie der γ-Herpesviren eingeordnet, die sich durch ein sehr enges Wirtsspektrum auszeichnen. Ein charakteristisches Merkmal aller Herpesviren ist ihre Fähigkeit, nach der Primärinfektion im infizierten Wirt lebenslang in einem latenten Zustand ohne Bildung infektiöser Partikel zu persistieren. In diesem Zustand liegt das Genom als histonbepacktes, episomales Plasmid in der Zelle vor.

Die Primärinfektion mit EBV erfolgt meist bereits im frühen Kindesalter über Zellen des Nasen- Rachenraumes und verläuft ohne klinische Symptome. Findet der Kontakt mit EBV erst im frü­ hen Erwachsenenalter oder später statt, ist er oft mit dem Erkrankungsbild der Infektiösen Mo­ nonukleose (IM) verbunden. Diese akute Phase der Infektion geht mit einer massiven Proliferati­ on der B-Lymphozyten einher, die zu einer starken T-Zellaktivierung und damit zu den klini­ schen Symptomen der IM führt. Die meisten EBV-infizierten Zellen werden normalerweise sehr effizient durch das Immunsystem eliminiert, alle Infizierten tragen aber lebenslang EBV-positive B-Lymphozyten im Blut und einige latent Infizierte scheiden das Virus über den Speichel aus. Die B-Lymphozyten, die nach einer Infektion mit EBV im Körper verbleiben, enthalten das Vi­ rus und haben die Fähigkeit, in vitro zu immortalisierten Zellinien auszuwachsen. Bei Patienten mit einer geschwächten Immunabwehr oder im Zusammenhang mit genetischen Defekten kann EBV jedoch zu einer tödlich verlaufenden Mononukleose führen. EBV wird auch mit der Ent­ stehung von Tumoren im Zusammenhang gebracht. So findet man das EBV-Genom in mindes­ tens drei Krebsarten beim Menschen, dem Burkitt Lymphom, dem Hodgkin Lymphom und dem Nasopharynxkarzinom (zur Übersicht: Rickinson und Kieff, 1996).

Das EBV-Genom besteht aus linearer doppelsträngiger DNA mit einer Länge von 172 kbp und kodiert für etwa 90 verschiedene Proteine. Es war das erste herpesvirale Genom, das vollständig kloniert und sequenziert wurde (Skare und Strominger, 1980; Baer et al., 1984). Am Ende des Genoms befinden sich ca. 500 bp-lange repetitive Sequenzen (TR, "terminal repeats"), die je nach EBV-Stamm in unterschiedlicher Anzahl vorkommen. Über diese Sequenzen erfolgt nach Infek­ tion der Wirtszelle die Zirkularisierung des Genoms (Kintner und Sugden, 1979).

Der Vermehrungszyklus des EBV verläuft, wie der aller Herpesviren, in zwei Phasen. Bei der Primärinfektion infiziert das Virus Epithelzellen und B-Lymphozyten, die sich in den Schleim­ häuten des Nasen-Rachenraumes befinden. In dieser Phase wird das Virusgenom in den meisten Zellen lytisch repliziert, was zu einer massiven Freisetzung infektiöser Viruspartikel und zum Tod der Wirtszellen führt. In einem Teil der infizierten B-Lymphozyten etabliert sich hingegen die latente Phase, in der das Virusgenom als extrachromosomales Plasmid synchron mit dem Zellzyklus repliziert und an die Tochterzellen weitergegeben wird. Die Replikation in diesen beiden Phasen ist in Abb. 1 schematisch dargestellt.

Die latente Phase des Epstein-Barr Virus

Nach Infektion von B-Lymphozyten wird das Genom durch Fusion der terminalen Sequenzen ("terminal repeats") zirkularisiert und über einen bisher nicht geklärten Mechanismus amplifi­ ziert, so daß in der latenten Phase zwischen 2 und 250 Kopien pro Zelle vorliegen (Sugden et al., 1979; Metzenberg, 1990). In dieser Phase werden nur einige wenige virale Gene exprimiert, die für die Immortalisierung der infizierten Zellen und für die stabile Weitergabe des viralen Ge­ noms benötigt werden (Hammerschmidt und Sudgen, 1989; Tomkinson et al., 1993).

Die Replikation des EBV-Genoms in der latenten Phase erfolgt am cis-aktiven Replikation­ sursprung oriP, der aus zwei Komponenten zur Initiation (DS-Element) und zur Termination (FR-Element) zusammengesetzt ist (Gahn und Schildkraut, 1989). Das viral kodierte Protein EBNA1 (EBV-nukleäres Antigen1) bindet an das FR-Element von oriP, und gewährleistet, wahrscheinlich durch die Interaktion mit Chromatin, die gleichmäßige Verteilung des viralen Episoms am Ende der Mitose (Aiyar et al., 1998) (siehe Abb. 1.1 B). Weitere virale Faktoren sind an der Replikation in der latenten Phase nicht beteiligt. Das EBV-Genom repliziert wie ein chromosomaler Replikationsursprung mit Hilfe zellulärer Replikationsenzyme genau einmal mit dem Zellzyklus und wird so stabil an die Tochterzellen weitergegeben (Yates und Guan, 1991; Davenport und Pagano, 1999)

Die lytische Phase des Epstein-Barr Virus

Die lytische Replikation des EBV findet in vivo in Epithelzellen des Rachenraumes statt und ist für die Verbreitung des Virus wichtig. Die Mechanismen, die in vivo in latent infizierten Zellen zu einer Reaktivierung des lytischen Zyklus führen, sind nicht bekannt. Da kein natürliches Zell­ kultur-system für das Studium der lytischen Replikation in Epithelzellen existiert, beschränken sich die bisherigen Erkenntnisse auf Beobachtungen in latent infizierten immortalisierten B- Lymphozyten. In latent EBV-infizierten B-Lymphozyten stellt die Aktivierung des lytischen Zyklus aber eher die Ausnahme dar.

Virale Replikationsproteine

Im Gegensatz zur Replikation in der latenten Phase, die durch zelluläre Replikationsenzyme ge­ steuert wird, stellen Herpesviren in der lytischen Phase die meisten zur Replikation benötigten Proteine selbst zur Verfügung. Die EBV-Gene, die für die lytische Replikation verantwortlich sind, wurden in transienten Transfektionsexperimenten identifiziert (Fixman et al., 1992) und sind in Tabelle 1.1 dargestellt. Diese sechs viralen Genprodukte, zusammen mit BZLF1, sind ausreichend für die Replikation von oriLyt-Plasmiden. Es konnte aber kein typisches Initiations­ protein charakterisiert werden, das Helikaseaktivität besitzt und spezifisch an den lytischen Replikationsursprung oriLyt bindet, wie es für Herpes Simplex Virus 1 (UL9), Papillomavirus (E1) und SV40 (T-Ag) beschrieben ist (Challberg, 1986; Hassell und Brinton, 1996; Stenlund, 1996). Die Bindung von BZLF1 an oriLyt ist zwar notwendig für dessen Aktivierung, jedoch besitzt BZLF 1 keine intrinsische Helikaseaktivität.

Tab. 1.1

Lytische Replikationsfaktoren des Epstein-Barr Virus

Der lytische Replikationsursprung oriLyt

In der lytischen Phase erfolgt die Replikation des EBV-Genoms vom Replikationsursprung ori­ Lyt (Hammerschmidt und Sugden, 1988), der in der latenten Phase nicht funktionell ist. OriLyt ist ein komplexer Replikations-ursprung, der sowohl Elemente der Transkription als auch der Replikation enthält und sich in seinem Aufbau von allen bisher bekannten eukaryontischen Replikationsursprüngen unterscheidet (Abb. 2). Der zentrale Bereich von oriLyt enthält zwei essentielle Komponenten, die den minimalen Replikations-ursprung darstellen und die aufgrund ihrer Lage als "upstream"- und "downstream"-Komponente bezeichnet werden (Schepers et al., 1993). Dieser zentrale Bereich wird flankiert von sogenannten Replikationsverstärkern, Sequen­ zen, die für die lytische Replikation wichtig, aber nicht essentiell sind (Hammerschmidt und Sugden, 1988). Innerhalb der "upstream"-Komponente befindet sich der Promotor des BHLF1- Gens, der durch die Bindung des viralen

Transaktivators BZLF1 an benachbarte ZRE-Bindestellen (ZRE 1-4; ZRE: BZLF1 responsive element) direkt aktiviert wird. Für die Aktivierung von oriLyt ist die Bindung von BZLF1 an die ZRE-Bindestellen der "upstream"-Komponente absolut notwendig, die Bindung an ZRE 5, 6 und 7, die sich zwischen der "downstream"-Komponente und dem Promotor des BHRF1-Gens befin­ den, ist hingegen für die lytische DNA-Replikation entbehrlich (Schepers et al., 1996). Zwischen den Bindestellen ZRE 5 und 6 befinden sich außerdem zwei Bindestellen für einen weiteren vi­ ralen Transaktivator BRLF1, der zusammen mit BZLF1 transaktivierend auf den BHLF1- Promotor wirkt (Gruffat et al., 1990; Giot et al., 1991).

Die "downstream"-Komponente von oriLyt liegt etwa 530 bp von der "upstream"-Komponente entfernt. Mutationsstudien haben gezeigt, daß innerhalb dieser Komponente ein G/C-reicher Se­ quenzabschnitt, das TD-Element, absolut notwendig für die lytische DNA-Replikation ist und daß bereits Punktmutationen zum Verlust der Replikationseffizienz an oriLyt führen (Schepers et al., 1993). Daher vermutet man, daß diese Sequenz eine Plattform fit die spezifische Bindung von Proteinen darstellt, die an der lytischen Replikation beteiligt sind. Eine Bindung der viralen Transaktivatoren BZLF1 und BRLF1 findet nicht statt, jedoch wurden mehrere zelluläre Protein- Komplexe identifiziert, die sequenzspezifisch an das TD-Element binden (Gruffat et al., 1995).

Regulation der lytischen Replikation

Der lytische Zyklus kann in einigen latent infizierten Zellen experimentell durch Behandlung mit chemischen Substanzen induziert werden (zur Hausen et al., 1978). Bereits eine Stunde nach Stimulierung beobachtet man die Expression von sehr frühen ("immediate early") Genen, die für die viralen Transaktivatoren BZLF1 und BRLF1 kodieren (Takada und Ono, 1989; Sinclair et al., 1991). Diese sehr frühen Genprodukte stellen die erste Stufe einer kaskadenartigen Expressi­ on von mehr als 80 Genen dar, wobei die Transaktivatoren einer jeweiligen Stufe die Gene für die Aktivatoren der nächsten Stufe aktivieren, bis am Ende alle zur Virusproduktion wichtigen Gene exprimiert werden (Kenney et al., 1989; Holley et al., 1990). Der lytische Zyklus kann auch direkt durch Transfektion von BZLF1 oder BRLF1 in B-Lymphozyten (Countryman und Miller, 1985; Ragoczy et al., 1998) oder in Epithelzellen (Zalani et al., 1996) induziert werden.

BZLF1 ist ein Transaktivator, der Homologien zu Mitgliedern der AP-1-Transkriptionsfaktor- Familie, wie c-Jun und c-Fos, besitzt (Farrell et al., 1989). BZLF1 bindet als Homodimer an ZRE-Motive in oriLyt und kann außerdem mit hoher Affinität an zelluläre oder virale AP1- oder TRE (TPA responsive element)-Sequenzen binden (Urier et al., 1989). BRLF1 ist ebenfalls ein sequenz-spezifischer, DNA-bindender Transaktivator (Gruffat et al., 1990; Hardwick et al., 1992), der synergistisch mit BZLF1 virale Promotoren aktivieren kann (Cox et al., 1990). Die Aktivität von BRLF1 alleine ist aber für die Induktion der lytischen DNA-Replikation nicht aus­ reichend, wie Replikationsstudien mit einem rekombinanten BZLF1-defekten EBV-Genom zei­ gen konnten (Feederle et al., 1999).

Die Gene für BZLF1 und BRLF1 liegen in einer überlappenden Transkriptions-einheit und das BZLF1-Gen kann sowohl von einem eigenen Promotor als auch vom benachbart gelegenen Pro­ motor des BRLF1-Gens transkribiert werden (Manet et al., 1989). Die Regulation der BZLF1- und BRLF1-Gene unterliegt einem komplexen Mechanismus, der im Detail noch nicht verstan­ den ist. Die Komplexität wird dadurch gesteigert, daß sowohl BZLF1 als auch BRLF1 sich in ihrer Expression gegenseitig beeinflussen und zudem autoregulatorisch wirken können (Fle­ mington und Speck, 1990; Sinclair et al., 1991). Die transkriptionelle Regulierung dieser beiden Genprodukte durch zelluläre Faktoren ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Latenz. Das Umschalten von der latenten zur lytischen Phase benötigt wahrscheinlich nicht nur die Aktivie­ rung zellulärer Transkriptionsfaktoren, die die BZLF1- und BRLF1-Transkription aktivieren, sondern auch die Inaktivierung von reprimierenden Faktoren.

Es konnte gezeigt werden, daß die Promotoren des BZLF1- und BRLF1-Gens durch Bindung von Sp1 aktiviert werden (Zalani et al., 1992; Liu et al., 1997). Durch die Bindung des Transkripti­ onsfaktors YY1 (Yin-Yang 1) (Shi et al., 1991) an diese Promotoren wird deren Transkription negativ reguliert (Montalvo et al., 1995; Zalani et al., 1997). Andere Arbeiten konnten zeigen, daß die zellulären Transaktivatoren Re1A (Gutsch et al., 1994), und Sµbp-2 (Zhang et al., 1999) inhibierend auf BZLF1-abhängige Promotoren wirken und somit wahrscheinlich verantwortlich für die Aufrechterhaltung der latenten Phase sind. Neben der transkriptionellen Kontrolle wurden auch posttranslationale Regulations-mechanismen beschrieben, die die Aktivität des BZLF1- Proteins direkt beeinflussen. Eine Interaktion von BZLF1 mit p53 inhibiert die Transaktivierung durch BZLF1 (Zhang et al., 1994) während durch die Interaktion mit den basalen Transkriptions­ faktoren TFIIA und TFIID die Bindung an Promotoren stabilisiert wird (Lieberman et al., 1994).

Neueste Studien zeigen eine direkte Interaktion von BZLF1 mit dem CREB-Bindeprotein (CBP), einem transkriptionellen Koaktivator mit Histonazetyl-transferaseaktivität (Adamson und Ken­ ney, 1999; Zerby et al., 1999). Die CBP-vermittelte Azetylierung von Histonen könnte zu einer veränderten Chromatinstruktur ("chromatin-remodeling") beitragen, und somit einerseits die Transaktivierung von BZLF1-regulierten Promotoren begünstigen und andererseits die Ausbil­ dung eines Inititationskomplexes an oriLyt erleichtern (Kodadek, 1998).

Auf viraler Regulationsebene wird die Beteiligung des alternativ gespleißten Proteins RAZ (BRLF1 and BZLF1) diskutiert, das aus der DNA-Bindungs- und Dimerisierungsdomäne von BZLF1 und der DNA-Transaktivierungsdomäne von BRLF1 zusammengesetzt ist und durch Heterodimerbildung mit BZLF1 dessen Funktion inhibiert (Furnari et al., 1994).

Die Regulation des Überganges von der latenten zur lytischen Replikation kann also durch zel­ luläre Kontrolle der BZLF1- und BRLF1-Aktivität erfolgen. Zusätzlich scheint eine direkte Ak­ tivierung und/oder Repression der lytischen Replikation durch Bindung zellulärer Faktoren an oriLyt stattzufinden. Wie schon erwähnt, ist das TD-Element innerhalb der "downstream"- Komponente von oriLyt absolut essentiell für die lytische Replikation. Da weder BZLF1 noch BRLF1 mit dieser Sequenz interagieren, scheinen andere, bisher noch nicht identifizierte Fakto­ ren über die Bindung an das TD-Element den Übergang von der latenten zur lytischen Replikati­ on zu regulieren. In Bindungsstudien konnten mehrere Proteinkomplexe am TD-Element, dar­ unter der Transkriptionsfaktor Sp1, identifiziert werden. Neuere Daten zur Funktion von Sp1 bei der lytischen Replikation konnten zeigen, daß Sp1 und mindestens ein weiterer zellulärer Transkriptionsfaktor an das TD-Element binden und virale Replikationsfaktoren an den Replika­ tionsursprung rekrutieren (Baumann et al., 1999).

Eine Repression von oriLyt durch Bindung zellulärer Faktoren konnte bisher noch nicht nach­ gewiesen werden. Die Identifizierung und Charakterisierung eines zellulären Proteins, welches die lytische Replikation von EBV hemmt, wäre nicht nur von wissenschaftlichem Interesse; ein derartiges Protein könnte insbesondere zur Behandlung von an EBV-Infektionen erkrankten Pa­ tienten eingesetzt werden.

Es ist demnach eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, nicht nur die Existenz eines derartigen zellulären Repressors der lytischen DNA Replikation nachzuweisen, sondern insbesondere auch dessen genomische DNA-Sequenz, seine cDNA-Sequenz sowie Aminosäuresequenz aufzuzei­ gen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Nachweis der Existenz des TB7 Proteins und durch die Beschreibung der genomischen DNA-, cDNA- und Aminosäuresequenzen von TB7 gelöst, wie sie in den beiliegenden Patentansprüchen dargestellt sind. Der zelluläre Repressor TB7 eignet sich zur Suppression der Replikation von EBV und damit zur Behandlung von EBV infizierten Patienten, insbesondere zur Behandlung der Infektiösen Mononukleose. Da EBV auch im Zusammenhang mit Tumorerkrankungen steht, ist TB7 auch zur Behandlung von Tumoren einsetzbar, deren Entstehung mit EBV in Verbindung steht, insbesondere zur Behandlung des Burkitt Lypmphoms, des Hodgkin Lymphoms und des Nasopharynxkarzinoms.

Als mögliche weitere Anwendung von TB7 im pharmakologischen Sinn als antiviraler Wirkstoff kommen die sehr nahe verwandten humanen gamma-Herpesviren, Beispiel HHV8, und die rela­ tiv nahe verwandten humanen beta-Herpesviren, Beispiel humanes Cytomegalovirus, in Frage. Diese Herpesviren besitzen sehr homologe Replikationsorigins, die auf Grund ihrer strukturellen Gemeinsamkeiten ähnliche Effekte bei TB7 erwarten lassen.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, der nachfolgen­ den Beschreibung und den Ausfühbrungsbeispielen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die nach­ folgenden bevorzugten Ausführungsformen beschränkt.

Die Erfindung betrifft insbesondere die genomische DNA-Sequenz, die cDNA-Sequenz sowie die RNA-Sequenz des TB7 Gens sowie die Aminosäuresequenz des hiervon kodierten Proteins. Die Erfindung betrifft weiterhin Fragmente und andere Derivate und Analoga des TB7 Proteins.

Die Erfindung umfaßt weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Fragmente oder Derivate kodieren. Die Erfindung umfaßt insbesondere das TB7 Gen humanen Ursprungs, aber auch solche TB7 Gene aus Vertebraten, insbesondere aus Säugetieren, beispielsweise der Maus, der Ratte oder dem Kaninchen. Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Herstellung der genannten Proteine und Derivate, beispielsweise durch rekombinante Techniken.

Die Erfindung umfaßt auch Fragmente und Derivate dieser Fragmente von TB7, die ein oder mehrere funktionelle Einheiten enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin polyklonale oder mo­ noklonale Antikörper, die gegen TB7 und seine Derivate und Analoga, insbesondere seine Epi­ tope und Domänen, gerichtet sind.

Nachfolgend werden einige in der vorstehenden Anmeldung benutzte Begriffe näher definiert.

Der Ausdruck "isoliert" bei Nukleinsäuren bedeutet, daß die Nukleinsäure aus ihrer natürlich vorkommenden Umgebung, d. h. dem Chromosom der Zelle, entfernt wurde. Die Nukleinsäure befindet sich deshalb in einer zellfreien Lösung oder in einer von der Ausgangszelle unter­ schiedlichen zellulären Umgebung. Der Ausdruck bedeutet nicht, daß keine weiteren Nuklein­ säurebestandteile vorliegen können, sondern insbesondere, daß es aus seiner natürlichen, chro­ mosomalen Umgebung entfernt wurde. Gleiches gilt analog für Proteine bzw. Polypeptide.

Der Ausdruck "angereichert" bedeutet, daß der Anteil der Nukleinsäure oder des Proteins höher ist als der natürlicherweise in der Zelle vorkommende Anteil.

Der Ausdruck "gereinigt" bedeutet nicht, daß eine absolute Reinheit, d. h. eine homogene Präpa­ ration, vorliegt. Der Ausdruck "gereinigt" bedeutet, daß eine höhere Reinheit der Nukleinsäure oder des Proteins gegeben ist als die in der natürlichen Umgebung.

Der Ausdruck "Hybridisierung" bedeutet, daß eine DNA oder RNA Nukleinsäure mit hoher Af­ finität an ein gegebenes Nukleinsäuremolekül, welches DNA oder RNA sein kann, bindet. Unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren nur hoch komplementäre Nuklein­ säuresequenzen. Bevorzugt wird unter "hoch stringent" verstanden, wenn bei ein oder zwei Fehlpaarungen bei 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eine Hybridisierung nicht mehr statt­ findet.

Die Stringenz wird durch unterschiedliche Salzkonzentrationen oder Konzentrationen an denatu­ rierenden Mitteln bewirkt. Unter hoch stringenten Bedingungen sind beispielsweise die nachfol­ genden Hybridisierungsbedingungen zu verstehen: Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × SSC, 50 mM NaH₃PO₄, pH 6,8, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml ultraschallbehandelte Lachssperma DNA, 5 × Denhart Lösung bei 42°C über Nacht; Waschen mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei 45°C; Waschen mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 45°C. Dem Fachmann ist bekannt, daß die Bedingungen je nach Spezifität und Selektivität variiert werden können.

Unter cDNA versteht man solche Moleküle, die von der mRNA revers transkribiert wurden.

Der Ausdruck "Säugetiere" umfaßt Organismen wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Affen und bevorzugt Menschen.

Unter "Derivate" sind erfindungsgemäß Abwandlungen bzw. Modifikationen oder Analoga von chemischen Verbindungen zu verstehen. Analoga sind erfindungsgemäß Derivate chemischer Verbindungen, bei denen die räumliche Struktur der Verbindungen im wesentlichen unverändert bleibt.

Nukleinsäurederivate umfassen beispielsweise Nukleinsäuren, bei denen ein oder mehrere Nuc­ leotide ausgetauscht, abgewandelt oder modifiziert sind. Zu den Nukleinsäuren, bei denen ein oder mehrere Nucleotidbasen oder der Zuckeranteil einen zusätzlichen Alkyl-, Aryl und/oder Arylalkylrest aufweisen, die wiederum mit funktionellen Gruppen derivatisiert sein können. Weiterhin gehören zu den Nukleinsäurenderivaten auch Analoga, bei denen beispielsweise der Zuckeranteil eines Nucleotids durch eine andere Verbindung ersetzt ist oder der Zuckeranteil modifiziert ist.

Aminosäurederivate umfassen erfindungsgemäß beispielsweise solche Verbindungen, bei denen die Seitenkette modifiziert, ausgetauscht und/oder substituiert ist. Als Modifikationen oder Sub­ stituenten kommen beispielsweise Alkyl-, Aryl und/oder Arylalkylreste in Frage, die wiederum mit funktionellen Gruppen derivatisiert sein können. Erfindungsgemäß sind neben den üblicher­ weise vorkommenden L-Aminosäuren auch die D-Aminosäuren umfaßt.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausgestaltungen beschrieben.

Die Erfindung offenbart eine Nukleinsäure in isolierter, angereicherter oder gereinigter Form, die für ein TB7 Polypeptid kodiert oder die eine Nukleinsäure enthält, die für ein TB7 Polypeptid kodiert. Hierzu gehört beispielsweise die genomische DNA-Sequenz mit den Exonsequenzen des TB7 Gens, die cDNA für das TB7 Gen, aber auch Vektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die für ein TB7 Polypeptid kodiert.

Die erfindungsgemäß bereitgestellte Nukleinsäure umfaßt insbesondere die genomische DNA gemäß SEQ ID NO: 1 sowie die cDNA von SEQ ID NO: 3. Die Erfindung umfaßt auch solche Nukleinsäuren, die zur Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 komplementär sind sowie solche Nukleinsäuren, die unter hoch stringenten Bedingungen, wie sie oben näher definiert wurden, mit der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 1 hybridisieren und für ein funktionel­ les TB7 Polypeptid kodieren. Die Erfindung umfaßt auch solche Nukleinsäuren, die für einen funktionellen Teil des Polypeptids TB7 kodieren.

Unter dem Ausdruck "funktioneller Teil" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die für einen Teil des TB7 Polypeptids kodiert, der funktionelle Merkmale erfüllt. Hierzu gehö­ ren beispielsweise Epitope und Domänen von TB7, insbesondere solche Domänen des Polypep­ tids, die für die Erkennung und/oder Bindung an die EBV-DNA, insbesondere das TD-Element von EBV, verantwortlich sind oder die antigene Eigenschaften aufweisen.

Hierzu gehört insbesondere die DNA-bindende Domäne des Genprodukts TB7 mit den Amino­ säuren 103 bis 151, ausgehend von der Definition der Zink-Finger-Domänen.

Bevorzugte Quelle für die Nukleinsäure ist ein Säugetier, beispielsweise Maus, Ratte, Kanin­ chen, Meerschweinchen, Ziege usw., weiterhin bevorzugt Affe und insbesondere bevorzugt Mensch.

Die Erfindung umfaßt auch solche Nukleinsäuren, die aufgrund der Degeneration des geneti­ schen Codes durch eine andere Nukleinsäure ausgetauscht wurden. Die Erfindung umfaßt auch Nukleinsäuren, die für Derivate des TB7-Polypeptids oder Derivate funktioneller Teile des TB7 Polypeptids kodieren, wie sie hier näher beschrieben sind.

Die Erfindung umfaßt auch RNA, die sich von einer Nukleinsäure, wie sie oben dargestellt wur­ de, abgeleitet ist.

Die Erfindung umfaßt auch eine Nukleinsäuresonde zum Nachweis einer Nukleinsäure, die für ein TB7 Polypeptid kodiert. Unter "Nukleinsäuresonde" wird ein Nukleinsäuremolekül verstan­ den, das zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär ist und an sie binden kann, die für das TB7 Polypeptid spezifisch ist, bevorzugt unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen, wie sie oben beschrieben wurden.

Verfahren unter Verwendung dieser Sonden umfassen den Nachweis auf das Vorliegen von TB7-RNA oder -DNA oder eine Mengenbestimmung der TB7-RNA oder -DNA in einer Probe, wobei eine Nukleinsäuresonde unter solchen Bedingungen mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, die eine Hybridisierung und einen Nachweis der Bindung der Sonde an die TB7-RNA oder -DNA gestatten.

Zur Durchführung dieser und nachfolgender Untersuchungen wird allgemein auf die dem Fach­ mann bekannten Verfahren und auf Literatur, die diese Verfahren beschreiben, hingewiesen. Beispiele für Methodikhandbücher sind Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. I, II.

Die Erfindung umfaßt in einer weiteren Ausführungsform auch Vektoren, die ein Nukleinsäure­ molekül mit der erfindungsgemäßen TB7-DNA oder funktionelle Teilen hiervon enthält. Unter einem Vektor sind einzelsträngige oder doppelsträngige, meist zirkuläre Nukleinsäuremoleküle zu verstehen, die in Zellen transfiziert werden können oder mit denen Zellen transformiert wer­ den können und die unabhängig oder zusammen mit dem Wirtszellgenom replizieren. Derartige Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugt handelt es sich um Vektoren, die eine Expression des Polypeptids TB7 oder seiner funktionellen Teile in einer Wirtszelle ermögli­ chen. Unter Wirtszelle ist jede prokaryonte oder eukaryonte Zelle zu verstehen, in die ein re­ kombinanter Vektor, der TB7-DNA enthält, eingebracht und repliziert werden kann. Zu den besonders bevorzugten prokaryonten Zellen gehört beispielsweise die E. coli-Zelle. Zu den beson­ ders bevorzugten eukaryonten Zellen gehört beispielsweise eine B-Zelle.

Verfahren zum Einbringen von DNA, insbesondere der Vektor-DNA, in eine prokaryonte oder eukaryonte Zelle sind an sich bekannt. Die Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" um­ schreiben derartige Verfahren. Die Vektor-DNA kann entweder extrachromosomal in der Zelle replizieren oder sie kann auch in das Genom der Wirtszelle integrieren und damit zusammen mit der Wirtszell-DNA replizieren.

Die in eine derartige Wirtszelle eingebrachte TB7-DNA steht im allgemeinen unter Kontrolle eines Promotorelements, das natürlicherweise nicht für die Steuerung der Transkription des TB7 Gens in der Zelle verantwortlich ist und welches bevorzugt induzierbar ist. Das Promotorelement umfaßt Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, für die Polymerase und für die Transkription der Vektor-DNA in mRNA. Neben dem Promotorelement können weitere, an sich bekannte E­ lemente die Replikation und Transkription der Vektor-DNA steuern und ihre Handhabung er­ leichtern und auf der Vektor-DNA integriert werden. Hierzu gehören beispielsweise der Repli­ kationsursprung, Ribosomenbindungsstellen, Resistenzgene, Nukleotidsequenzen, die eine Sek­ retion des TB7 Polypeptids oder seine funktionellen Teile ermöglichen, Signale zur Aufreini­ gung des Polypeptids usw.

Die Erfindung umfaßt auch rekombinante Zellen, die eine rekombinante TB7-DNA oder funkti­ onelle Teile hiervon oder ihre Derivate. enthalten. Hierbei kann es sich sowohl um prokaryonte als auch um eukaryonte Zellen, aber auch Zellinien handeln. Typisches Beispiel für eine proka­ ryonte Zelle ist E. coli, typisches Beispiel für eine eukaryonte Zelle eine Säugerzelle, bevorzugt eine Humanzelle oder -Zellinie. Die rekombinante TB7-DNA oder funktionelle Teile hiervon oder ihre Derivate können in der rekombinanten Zelle, Zellinie und dann natürlich im rekombi­ nanten Organismus entweder in extra-chromosomaler Form oder in das Chromosom integriert vorliegt. Sie können damit entweder zusammen mit dem Wirtsgenom oder unabhängig hiervon replizieren, mit dem Wirtszellgenom rekombinieren und in dieses integrieren oder nicht.

Die vorliegende Erfindung beschreibt auch isoliertes, angereichertes oder gereinigtes TB7 Poly­ peptid oder funktionelle Teile dieses Polypeptids sowie Derivate des Polypeptids. Das Polypep­ tid wird von der Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodiert und weist die in SEQ ID NO: 3 und 4 beschriebene Aminosäuresequenz auf. Bevorzugt liegt es in nicht glycosy­ lierter Form vor.

Die Erfindung umfaßt auch Derivate des TB7 Polypeptids, d. h. derartige Polypeptide oder funktionelle Teile hiervon, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren durch eine andere A­ minosäure ersetzt sind, eine oder mehrere Aminosäuren deletiert sind und/oder ein oder mehrere Aminosäuren zusätzlich enthalten sind, wobei die Funktion von TB7 als Repressor der DNA- Replikation von EBV erhalten bleibt. Das gleiche gilt für funktionelle Teile des TB7 Repressors.

Unter "funktionelle Teile" werden Domänen und Epitope des TB7 Polypeptids verstanden. Unter "Domäne" ist ein Teil des TB7 Polypeptids zu verstehen, der für die Funktion, Wechselwirkung oder Aktivität des Proteins verantwortlich ist. Insbesondere wird hierunter der Teil des TB7 Po­ lypeptids verstanden, der mit der TD Sequenz des EBV in Wechselwirkung tritt.

Der Begriff "Derivate" umfaßt solche Aminosäuresequenzen des Polypeptids, die sich von der nativen Sequenz durch den oben beschriebenen Austausch, Addition oder Deletion von Amino­ säuren unterscheiden. Hierbei kann es sich um sogenannte konservative oder nicht-konservative Austausche von Aminosäuren handeln. Unter "konservativ" ist die Substitution einer Aminosäu­ re durch eine Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, beispielsweise in Bezug auf die Ladung, Hydrophobizität, Struktur usw., zu verstehen.

Unter "Epitop" ist eine Abfolge von Aminosäuren zu verstehen, die antigene Eigenschaften auf­ weist und spezifisch für das TB7 Polypeptid ist. Derartige Epitope können zur Produktion von Antikörpern eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch rekombinante Polypeptide von TB7, die durch rekombinante DNA- Techniken, wie sie oben beschrieben sind, hergestellt wurden und die oben beschriebenen Poly­ peptide, funktionelle Teile hiervon sowie ihre Derivate umfassen.

Die Erfindung beschreibt auch monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen die TB7 Polypeptide, funktionelle Teile hiervon und ihre Derivate gerichtet sind. Derartige Antikörper mit einer spezifischen Bindung an ein TB7 Polypeptid können zum Nachweis und/oder zur Mengenbestimmung des TB7 Polypeptids in einer Probe eingesetzt werden. Entsprechende Ver­ fahren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben.

Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren stammen, die mit einem Antigen oder einem funktionellen Teil hiervon immu­ nisiert wurden.

Monoklonale Antikörper sind im Wesentlichen homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen, hier gegen ein Epitop des TB7 Polypeptids. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern in Zellkulturen sind bekannt. Ein Beispiel hierfür ist die Originalliteratur von Köhler et al., Nature 256: 495-497 (1975) und U.S. Patent Nr. 4,376,110. Die Erfindung umfaßt auch Hybridomzellinien, d. h. immortalisierte Zellinien, die monoklonale Antikörper produzieren und die zur Erkennung und Bindung des TB7 Polypeptids geeignet sind.

Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Hemmung der lytische Replikation von EBV, wobei ein TB7 Polypeptid oder ein funktionelles Teil des TB7 Polypeptids oder ein Derivat hiervon mit einer EBV enthaltenden Zelle in Kontakt gebracht wird, wobei das TB7 Polypeptid oder ein funktioneller Teil des TB7 Polypeptids in einer solchen Menge vorliegt, das die lytische Replikation durch Bindung von TB7 an das TD-Element von EBV supprimiert wird. In einer alternativen Ausführungsform wird die genetische Information, die für das TB7 Polypeptid oder einen funktionellen Teil hiervon oder ein Derivat kodiert, in die zu behandelnde Zelle oder in einen zu behandelnden Patienten eingebracht und die Expression des Polypeptids induziert, um die Replikation von EBV zu verhindern oder zumindest zu unterdrücken.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die das TB7 Polypeptid oder einen funktionellen Teil des Polypeptids oder Deri­ vate hiervon in einer pharmazeutisch wirksamen Menge enthält. Das TB7 Polypeptid oder ein funktioneller Teil hiervon oder ein Derivat liegt zusammen mit üblichen Träger- und Hilfsstoffen vor. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann entweder systemisch oder lokal verabreicht werden. Geeignete Techniken zur Formulierung und Verabreichung sind beispielsweise genannt in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA. Die genaue Art und Weise der Formulierung, der Verabreichung und der Dosis können in Abhängig­ keit von der zu behandelnden Erkrankung, vom zu behandelnden Patienten, vom Arzt und vom Pharmazeuten ausgewählt werden. Die entsprechenden Verfahren sind beschrieben, und wir verweisen hierzu beispielsweise auf Fingl et al., in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kap. 1 S. 1, 1975.

Die Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung eines TB7 Polypeptids oder eines funktionellen Teils des TB7 Polypeptids oder eines Derivats hiervon. Hierbei wird beispielswei­ se in eine Zelle eine Nukleinsäure eingeführt, die die Information für die Expression des TB7 Polypeptids oder eines funktionellen Teils oder Derivats hiervon, zusammen mit üblichen Kon­ troll- und Regulationssequenzen wie Promotor, Enhancerelementen, Polyadenylierungssignalen usw. auf einem Vektor enthält. Geeignete Me­ thoden stehen dem Fachmann zur Verfügung, und es wird hier nur beispielsweise die Methode der Elektroporation oder der Transfektion genannt. Durch Induktion der Transkription erfolgt die Expression des TB7 Polypeptids oder eines funktionellen Teils oder Derivats hiervon. Die re­ kombinante Zelle bzw. Zellinie wird kultiviert und das rekombinante TB7 Polypeptid oder der funktionelle rekombinante Teil oder Derivat von TB7 wird durch geeignete Verfahren gewonnen und aufgereinigt.

Nachfolgend wird die Isolierung und Charakterisierung von TB7-DNA und -Polypeptid näher beschrieben.

Ein Versuchsansatz, DNA-bindende Proteine zu isolieren, stellt eine modifizierte Form des von Wang und Reed zum ersten Mal beschriebenen genetischen Selektionssystems in Hefe dar, das inzwischen unter der Bezeichnung "one hybrid screen" Eingang in die Lehrbücher erhalten hat (Wang und Reed, 1993). Dieses System beruht auf der Beobachtung, daß viele eukaryontische Transkriptionsaktivatoren eine DNA-Bindedomäne und eine Aktivierungsdomäne enthalten. Fusioniert man eine beliebige cDNA, die eine DNA-Bindedomäne enthält, an eine Aktivierungs­ domäne, so kann das Fusionsprotein über die Bindung an die Zielsequenz die Aktivität von Indi­ katorgenen (z. B. HIS3, LacZ) regulieren. Diese Selektion in Hefe hat gegenüber biochemischen Methoden den Vorteil, daß die Proteine in der Zelle in ihrer nativen Faltung vorliegen und da­ durch die Sensitivität der DNA-Protein Wechselwirkungen gesteigert wird.

Isolierung TD-bindender Proteine mit Hilfe des "one hybrid screens" in Saccharomyces cerevisiae

Für das genetische Selektionssystem TD-bindender Proteine in S. cerevisiae mußte zunächst ein entsprechender Hefestamm entwickelt werden (Abb. 3A). Dazu wurden in den Hefestamm RH1533 (MATα; leu2-3, -112; ura3-52; his3-del200; trp1-del901; lys2-801; suc2-del9; MCI-) in Folge zwei linearisierte Integrationsplasmide transformiert. Diese Plasmide tragen multimeri­ sierte TD-Elemente und entweder das Markergen His3 oder LacZ unter der Kontrolle verschie­ dener Minimal-Promotoren. Die Integration der Plasmide erfolgte gerichtet in das Lys2- bzw. Ura3-Gen des Hefestammes, der durch Histidin- und Uracil-Prototrophie selektiert wurde. Die­ ser genetisch veränderte Hefestamm wurde mit einer cDNA-Bibliothek transfiziert, die von einer EBV-immortalisierten humanen B-Zellinie stammt (Durfee et al., 1993). Die cDNAs sind in die­ ser Bibliothek an die Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert. Nach spezifischer Bindung ei­ nes Fusionsproteins an die Sequenzmotive des TD-Elementes werden die Promotoren für das Histidin- bzw. LacZ-Gen durch die GAL4-Aktivierungsdomäne aktiviert. Um die Stringenz der Selektion zu erhöhen, wurde dem Medium eine zuvor ausgetestete Konzentration von 3- Aminotriazol (3-AT) zugegeben, das die Synthese von Imidazol-Glyzerol-3-Phosphat- Dehydratase, ein His3-kodiertes Enzym, inhibiert. Mit Leucin-Mangel wurde auf die erfolgrei­ che Transfektion der Plasmide der cDNA-Bibliothek selektioniert, die das Leucin-Gen auf dem Vektoranteil tragen (Abb. 3 B).

Es ist darauf hinzuweisen, dass TB7 und TD-BP7 als identische Begriffe eingesetzt werden.

Es wurden 2 Klone isoliert, die auf Minimalmedium ohne Leucin, Uracil und Histidin mit 30 mM 3-AT gewachsen waren und die nach Präparation der Plasmid DNA und Retransformation in Hefe wieder in der Lage waren, auf Minimalmedium zu wachsen (Daten nicht gezeigt). Die DNAs dieser Klone wurden anschließend sequenziert. Die im Folgenden als TD-Bindeprotein 7 (TD-BP7) bezeichnete cDNA-Sequenz war 951 bp lang. Der isolierte Klon enthielt partielle cDNAs mit zwei Zink-Finger-Domänen. Der identifizierte offene Leserahmen begann direkt mit der isolierten cDNA und enthielt an erster Position kein Startkodon. Die Sequenz weist keine Homologien zu bekannten Proteinen auf. Lediglich im Bereich der Zink-Finger-Domänen gibt es erkennbare Homologien zu anderen Proteinen mit Zink-Finger Strukturen. Um die Funktion des Proteins zu untersuchen, wurde die cDNA in voller Länge kloniert.

Isolierung der vollständigen cDNA: Durchsuchen einer cDNA-Bibliothek

Um die gesamte cDNA zu klonieren, wurde eine käuflich erworbene cDNA-Bibliothek, die aus RNA von humanen HeLa-Zellen erstellt wurde (Clontech, #HL1152X), mit der partiellen cDNA aus dem "one hybrid screen" als Sonde durchsucht. In dieser Bibliothek ist die cDNA in die BamHI-XbaI-Schnittstelle des Phagenvektors λpDR2 so kloniert, daß sie von zwei gleichge­ richteten loxP-Erkennungssequenzen des P1-Phagen flankiert ist. Der Sinn dieser Konstruktion des Phagenvektors besteht darin, daß die cDNAs nicht wie bei herkömmlichen Lambda- Vektoren aufwendig subkloniert werden müssen, sondern während der Infektion eines Cre­ exprimierenden E.coli-Stammes (AM1) in vivo durch ortsspezifische Rekombination an den loxP-Sequenzen rekombinieren. Bei der Rekombination entstehen Plasmide, die die klonierte cDNA enthalten.

Für das Durchsuchen der Bibliothek wurden zunächst ca. 1,2 × 10⁶ Plaque bildende Einheiten (pfu) auf 24 Bakterienplatten (∅ 140 mm) ausplattiert (ca. 50000 pfu/Platte) und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte das Übertragen der Plaques auf Nitrozellulose-Filter und nach Denaturierung und Fixierung der DNA auf den Filtern die Hybridisierung mit ³²P- radioaktiv markierten Sonden. Als spezifische Sonden wurde die aus dem "one hybrid screen" isolierte partielle cDNA TD-BP7 eingesetzt. Um unspezifische Signale auszuschließen, wurden jeweils 2 Filterabzüge (Replika) pro Platte hergestellt und die Signale beider Filter miteinander verglichen. Die Hybridisierung mit der TD-BP7-spezifischen Sonde zeigte ein positives Signal, das auf dem Replika-Filter bestätigt wurde. Nach Cre-vermittelter ortsspezifischer Rekombinati­ on und anschließender Zirkularisierung wurde das neu entstandene rekombinante Plasmid iso­ liert und die DNA gereinigt. Die Analyse der cDNA erfolgte zunächst durch Spaltung mit Re­ striktionsenzymen und anschließender Gelelektrophorese. Der aus dem "one hybrid screen" iso­ lierte Klon konnte bestätigt und die Sequenz in 5'- und 3'-Richtung ergänzt werden. Nach Se­ quenzierung ergab sich für die cDNA von TD-BP7 eine Länge von 2308 bp mit einem offenen Leserahmen von 193 Aminosäuren.

Charakterisierung der genomischen Sequenz von TD-BP7

Um regulatorische Elemente und den Aufbau des Gens für TD-BP7 zu bestimmen, wurde eine humane Plazenta-Bibliothek mit einer TD-BP7-spezifischen Sonde durchsucht. Insgesamt wur­ den 5 × 10⁵ Plaques nach Standardmethode hybridisiert (Sambrook et al., 1989) und aus drei po­ sitiven Phagenplaques die DNA gereinigt. Um die gesuchten genomischen Abschnitte des TD- BP7-Gens aus den Phagen zu isolieren, wurden diese mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten, die entsprechenden Fragmente isoliert und in den mit XhoI-linearisierten Vektor pACYC177 ligiert. Drei rekombinante Plasmide konnten etabliert werden (p2147, p2148, p2149). Nach Transformation und Präparation der plasmidalen DNA wurden die Klone einer umfassenden Restriktionsenzym-Analyse unterzogen. Es stellte sich heraus, daß Klon p2147 kleiner war als die Klone p2148 und p2149 und daß diese beiden letzteren Klone identisch und lediglich in ent­ gegengesetzter Orientierung in den Plasmidvektor kloniert waren. Zusätzlich wurden die Agaro­ segele mit den aufgetrennten Restriktionsfragmenten einer Southern-Blot-Analyse unter Ver­ wendung einer TD-BP7-speziflschen Sonde unterzogen, um die Identität der DNA zu bestätigen und um die genomischen Fragmente vom Vektoranteil unterscheiden zu können.

Ausgehend von der bereits bekannten TD-BP7-cDNA Sequenz und der pACYC Vektorsequenz wurden Primer ausgewählt und die Sequenzierung des Klons 2148 durchgeführt. Nach insgesamt 23 Sequenzierungsreaktionen ergab sich für die Sequenz des genomischen Abschnittes eine Län­ ge von 14328 bp, die im folgenden als TD-BP7-Gen bezeichnet wird. Diese Bezeichnung ent­ spricht der Bezeichnung TB7. Durch Computeranalysen und den Vergleich der genomischen Sequenz mit der cDNA-Sequenz konnte für das TD-BP7-Gen folgender Aufbau ermittelt werden (Abb. 5): Das TD-BP7-Gen enthält eine 5'-UTR, die innerhalb einer CpG-Insel liegt und der eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor Sp1 vorangeht. Das zweite Exon beinhaltet das Translations-Initiations-Codon, das in eine gute Kozak-Konsensussequenz eingebettet ist (AT- CAGCatgG; (Kozak, 1996)). Der offene Leserahmen wird bereits nach 9 bp durch das zweite Intron unterbrochen. Es folgen weitere fünf Exons unterschiedlicher Länge, das siebte Exon be­ endet den offenen Leserahmen mit einem Stop-Codon. Die mRNA endet nach der 1.2 kbp langen 3'-UTR mit einer Poly-A-Sequenz, der allerdings kein eindeutiges Polyadenylierungs-Signal vorangeht. Die Zink-Finger-kodierenden Sequenzen (Typ C₂H₂) befinden sich in Exon 5 und 6. Mit Ausnahme der Übergänge des S. Introns (GT. . .CA) entsprechen alle 5'- und 3'-Spleißstellen den Spleiß-Konsensus-Motiven (GT. . .AG).

Die cDNAs TD-BP7 und TD-BP17 kodieren für unbekannte Proteine

Um festzustellen, ob die cDNA von TD-BP7 für ein Protein mit bekannten Funktionen kodiert, wurde ein Vergleich der Sequenz mit dem BlastN-Algorithmus und der GENIUSnet-Datenbank (DKFZ, Heidelberg) durchgeführt. Homologien fanden sich für die cDNA-Sequenz in den 5'- und 3'-untranslatierten Regionen zu EST-cDNAs ("expressed sequence tag"). Außerdem gab es, wie bereits erwähnt, im Bereich der Zink-Finger kodierenden Sequenzen Homologien zu be­ kannten Zink-Finger-Proteinen. Eine graphische Darstellung der Homologiebereiche zeigt Abb. 4.

Herstellung monoklonaler Antikörper gegen TD-BP7

Um die Expression der cDNA auf Proteinebene untersuchen zu können und um spezifische DNA-Wechselwirkungen von TD-BP7 in Bindungsstudien nachzuweisen, wurden monoklonale Antikörper gegen dieses Protein hergestellt. Zur Immunisierung von Ratten mußten zunächst die Protein-Antigene produziert und gereinigt werden. Dazu wurden Fusions-plasmide von Teilen der TD-BP7-cDNA mit der Glutathion-S-Transferase (GST) oder dem Maltose-Bindeprotein (MBP) hergestellt und nach Überexpression in E.coli gereinigt.

Monoklonale Antiseren wurden durch Immunisierung von Lou/c-Ratten mit MBP-TD-BP7 An­ tigenen gewonnen. Die dazu erforderliche Fusion von isolierten Milzzellen aus der Ratte mit einer Maus-Myelomzellinie und die zweimalige Reklonierung positiver Klone wurden nach Standardmethoden durchgeführt (Kohler und Milstein, 1975). Die Testung von je 20 Kulturüber­ ständen der jeweiligen Hybridomzellinien erfolgte durch Westernblot-Analyse. Um auszuschlie­ ßen, daß die monoklonalen Antikörper gegen den MBP-(TD-BP7) Anteil oder eventuell gegen eine Neo-Determinante gerichtet sind, wurden die Hybridomüberstände jeweils mit partiell ge­ reinigten Antigenen getestet, die als GST-(TD-BP7) Fusionsproteine vorlagen, und die nicht zur Immunisierung eingesetzt worden waren. Es wurde ein monoklonaler Antikörper gegen TD-BP7 (10C1) ausgewählt.

Der monoklonale Antikörper erkennt das jeweilige Antigen. Ein Nachweis von endogen expri­ miertem TD-BP7 in HeLa-Proteinextrakten war mit diesen Antikörpern allerdings nicht möglich. Nach Expression von pCMV-TD-BP7 in 293-Zellen konnten aber spezifische Signale detektiert werden. Somit war es gelungen, monoklonale Antikörper gegen TD-BP7 herzustellen, deren Affinität aber nicht ausreichte, endogene Genprodukte von TD-BP7 nachzuweisen. In Gelretar­ dations-Experimenten wurden die Antikörper auf ihre Fähigkeit hin getestet, an nicht- immobilisierte Protein-DNA-Komplexe zu binden.

Interaktion von TD-BP7 und TD-BP17 mit der "downstream"-Komponente von oriLyt: in vitro-Bindungsstudien

Die Protein-Interaktion mit dem TD-Element im "one hybrid-screen" in S. cerevisiae führte zur Isolierung der cDNA von TD-BP7. Im Folgenden soll untersucht werden, ob die von dieser cDNA kodierten Proteine auch in vitro an das TD-Element binden. Da aus früheren Studien be­ kannt ist, daß insgesamt sechs zelluläre Komplexe an der "downstream"-Komponente ausgebil­ det werden (Gruffat et al., 1995), sollte außerdem überprüft werden, ob diese Proteine Teil der beschriebenen Komplexe sind.

Die rekombinanten Proteine TD-BP7 und TD-BP17 binden in vitro an das TD-Element von oriLyt

Um festzustellen, ob das Protein TD-BP7 in vitro an das TD-Element bindet, wurden zunächst Gelretentionsanalysen mit rekombinanten Fusionsproteinen durchgeführt. Die 62 bp-Sequenz des TD-Elementes von oriLyt wurde radioaktiv markiert und diente als DNA-Probe für die Inkubati­ on mit rekombinanten MBP-TD-BP7 Proteinextrakten. Um die Spezifität der Komplexe beur­ teilen zu können, wurden zusätzlich Kompetitionen mit unmarkierten Oligonukleotiden (T1-T6 und TD) aus dem Bereich der "downstream"-Komponente durchgeführt. Es zeigte sich, daß das Protein mit dem TD-Element interagiert. Nach Inkubation des TD-Elementes mit dem MBP-TD- BP7 Extrakt bildeten sich zwei Komplexe aus, von denen der obere Komplex I durch Zugabe an unmarkiertem TD-Element nahezu vollständig kompetiert wurde. Die Kompetition mit Oligo­ nukleotid T4 aus der "downstream"-Komponente zeigte das gleiche Resultat, mit den Oligo­ nukleotiden T3, T3.4 und T6 wurde die Bindung des oberen Komplexes I vollständig blockiert. Die Zugabe unmarkierter Oligonukleotide inhibierte die Ausbildung des unteren Komplexes II nur leicht. Die Spezifität der Komplexe wurde außerdem durch die Ausbildung eines Supershif­ tes nach Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen das Protein TD-BP7 bestätigt.

Die Kompetition der Komplexausbildung am TD-Element durch das Oligonukleotid T6, das außerhalb der TD-Sequenz liegt, ist auf die hohe Sequenzähnlichkeit beider Sequenzen zurück­ zuführen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die rekombinant exprimierten Proteine TD-BP17 und TD-BP7 in vitro spezifisch an das TD-Element von oriLyt binden. Die Interaktion findet dabei genau in dem Bereich des TD-Elementes statt (EBV #53,355-#53,395), in dem bereits Punkt­ mutationen zur vollständigen Blockierung der lytischen DNA-Replikation von EBV führen (Schepers et al., 1993).

Einfluß des Proteins TD-BP7 auf die lytische Replikation von EBV

Die bisherigen Ergebnisse zeigten, daß das Protein TD-BP7 in vitro spezifisch an das TD- Element von oriLyt bindet. Eine zentrale Frage war, ob dieses Protein einen Einfluß auf die Effi­ zienz der lytischen Replikation bei EBV ausübt. Der lytische Replikationsursprung von EBV wurde von W. Hammerschmidt mit Hilfe eines transienten Replikationsversuches identifiziert (Hammerschmidt und Sugden, 1988). Bei dieser Methode wurde in EBV-positiven Zellen, die in der Lage sind, die lytische Phase von EBV zu unterstützen, die Replikation rekombinanter Plas­ mide untersucht. Dazu wurden rekombinante Plasmide, die oriLyt-Sequenzen des EBV Stammes B95-8 tragen, zusammen mit einem BZLF1-Expressionsplasmid in EBV-positive D98/HR1- Zellen transfiziert. BZLF1 induziert dabei den lytischen Zyklus des endogenen EBV. Zwei Tage nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und die DNA isoliert (Hirt, 1967). Nach einer Restriktionsspaltung mit BamHI und DpnI wurde die neu replizierte DNA durch Southern- Blot-Hybridisierung quantifiziert. Als Sonde wurden prokaryontische Sequenzen, die spezifisch die plasmidale DNA erkennen, verwendet. Die Unterscheidung zwischen transfizierter und neu replizierter DNA wird durch die Spaltung der DNA mit DpnI erreicht, ein Enzym, das aus­ schließlich solche DNA spaltet, die in einem dam⁺-E.coli-Stamm methyliert wurde. Da die DpnI-Erkennungssequenz GATC sehr häufig vorkommt, wird die transfizierte DNA stark frag­ mentiert. DNA, die in eukaryotischen Zellen repliziert hat, wird nicht gespalten und bleibt intakt.

Die Replikationseffizienz des oriLyt-Plasmides p968.22 wurde nach Kotransfektion von CMV- Expressionsplasmiden für den offenen Leserahmen (ORF) von TD-BP7 im transienten Replika­ tionsversuch getestet. Die Kotransfektion von pCMV-BP7/ORF führte zu einer deutlichen Re­ pression der Replikationseffizienz im Vergleich zur Vektorkontrolle. Um festzustellen, ob TD- BP7 mit der Bindung essentieller Replikationsfaktoren an das TD-Element kompetiert oder ob es sich bei dem beobachteten Effekt um eine aktive Repression handelt, wurde im Vergleich ein Expressionsplasmid der DNA-Bindedomäne von TD-BP7 transfiziert (pCMV-BP7/DBD). Es zeigte sich, daß auch die TD-BP7-DNA-Bindedomäne alleine ausreicht, um die Replikation zu unterdrücken. Die Repression der Replikation von oriLyt ist demnach auf eine kompetitive Bin­ dung von TD-BP7 an das TD-Element zurückzuführen, die wahrscheinlich zur Verdrängung essentieller Replikationsfaktoren führt.

Um auszuschließen, daß bei der Transfektion die pCMV-Expressionsplasmide um Transkripti­ onsfaktoren konkurrieren und deshalb die Induktion des lytischen Zyklus durch pCMV-BZLF1 in den Ansätzen unterschiedlich war, wurden die transfizierten Zellen zusätzlich in Westernblot- Analysen auf die Menge an BZLF1-Expression untersucht. Die BZLF1-Expression war in allen Ansätzen vergleichbar.

Die bisherigen Ergebnisse zeigen, daß TD-BP7 spezifisch an das TD-Element von oriLyt bindet. Die Expression von TD-BP7 führte zur vollständigen Repression der lytischen Replikation, was auf die Bindung des Proteins an den lytischen Replikationsursprung zurückgeführt werden konnte.

TD-BP7 reprimiert die Bindung von Sp1 an das TD-Element

Die Kontaktstellen von TD-BP7 mit dem TD-Element liegen innerhalb einer Sequenz, die als Bindungsmotiv für den Transkriptionsfaktor Sp1 beschrieben wurde (Gruffat et al., 1995). In jüngsten Untersuchungen zur Rolle von Sp1 bei der lytischen Replikation konnte gezeigt wer­ den, daß der zelluläre Transkriptionsfaktor an das TD-Element bindet und virale Replikations­ faktoren an den lytischen Replikationsursprung oriLyt rekrutiert (Baumann et al., 1999). Da TD- BP7 die lytische Replikation von EBV reprimiert, lag es nahe nachzuprüfen, ob TD-BP7 die Bindung von Sp1 an das TD-Element unterdrücken kann. Diese Hypothese wurde mit DNaseI- Schutzexperimenten überprüft. Steigende Mengen rekombinantes Sp1 oder MBP-BP7 wurden mit einem radioaktiv markierten Fragment der "downstream"-Komponente inkubiert, die DNA anschließend unter definierten Bedingungen mit DNaseI gespalten und in einem denaturierenden PAA-Gel aufgetrennt (Abb. 6). Bereits bei der niedrigsten eingesetzten Menge an MBP-BP7 führte die Bindung an die "downstream"-Komponente, in Übereinstimmung mit den kompetiti­ ven Gelretardations-Experimenten, zu einer deutlichen Protektion der DNA gegenüber der DNa- seI-Spaltung im Bereich T3.4 und T6 (EBV #53,403-53,424 und EBV #53,364-53,391), die mit steigenden Mengen an MBP-BP7 noch deutlicher wurde. Durch die Bindung des Proteins wurde die Sequenz beidseitig der Bindungsstellen gegenüber DNaseI hypersensitiv. Die Bindung von Sp1 erzeugte ebenfalls eine Protektion im Bereich von T6 und des TD-Elementes, war aber we­ niger gut ausgeprägt und leicht versetzt im Vergleich zu MBP-TD7 (EBV #53,403-53,422 bzw. EBV #53,359-53,379). Die gleichzeitige Inkubation der Probe mit einer konstanten Menge (höchste Konzentration der Einzelinkubation) an Sp1 und steigenden Mengen MBP-BP7 oder vice versa inhibierte in allen Ansätzen die Ausbildung des Sp1-Protektionsmusters nahezu voll­ ständig.

Diese Ergebnisse zeigen, daß TD-BP7 mit dem Transkriptionsfaktors Sp1 um die Bindung an die "downstream"-Komponente von oriLyt kompetiert. Die beobachtete Repression der lytischen Replikation durch Bindung von TD-BP7 könnte also mit der Verdrängung zellulärer und/oder viraler Faktoren vom lytischen Replikationsursprung erklärt werden.

Die Expression von TD-BP7 inhibiert die DNA-Replikation von EBV

Um den Einfluß von TD-BP7 auf die lytische DNA-Replikation von EBV zu untersuchen, wurde in der Zellinie 2098-31, die das rekombinante EBV-Genom trägt, die lytische Replikation durch Transfektion von BZLF1 induziert. Gleichzeitig wurden CMV-Flag-Expressionsplasmide für den offenen Leserahmen oder die DNA-Bindedomäne von TD-BP7 kotransfiziert. Nach drei Tagen wurden Raji-Zellen mit filtrierten Kulturüberständen inkubiert und nach weiteren drei Tagen im Fluoreszenzmikroskop auf GFP-Expression untersucht (Abb. 8). Mit Überständen, die durch Transfektion der Vektorkontrolle gewonnen wurden, exprimierten etwa 40% der Raji- Zellen GFP. Zellkultur-überstände, die nach Transfektion mit pCMV-BP7/DBD oder pCMV- BP7/ORF gewonnen wurden, enthielten deutlich weniger infektiöse Partikel, wie die Infektions­ rate der Raji-Zellen erkennen läßt. Besonders ausgeprägt war dieser Effekt nach Transfektion des Plasmides pCMV-BP7/ORF, das offensichtlich besonders stark die DNA-Replikation von EBV reprimiert. Westernblot-Analysen der Transfektionsansätze mit BZLF1- und Flag-spezifischen Anti-körpern dienten zur Kontrolle des Expressionsniveaus der transfizierten Plasmide (Abb. 8). Die schwache Expression des pCMV-BP7/DBD-Plasmids erklärt die verminderte Repression der Replikation im Vergleich zum Effekt nach Transfektion des pCMV-TD-BP7/ORF-Plasmides. Diese Ergebnisse bestätigen die Daten aus den transienten Replikationsversuchen und Bindungs­ studien. TD-BP7 reprimiert die DNA-Replikation von oriLyt stark, und dieser Effekt beruht auf der Bindung des Proteins an den lytischen Replikationsursprung.

Es konnte somit in transienten Replikationsversuchen gezeigt werden, das die Expression des zellulären Faktors TB7 zu einer nahezu vollständigen Unterdrückung der DNA Replikation von oryLyt führt (Abb. 7).

Die beiliegenden Abbildungen zeigen:

Abb. 1 Die beiden Phasen des Epstein-Barr Virus. Nach Infektion der Wirtszelle wird die lineare virale DNA freigesetzt und zirkularisiert über die terminalen repetitiven (TR) Sequenzen. In der lytischen Phase (A) erfolgt die DNA-Replikation am lytischen Replikationsursprung ori­ Lyt. Die DNA-Synthese verläuft dabei wahrscheinlich unidirektional über den sogenannten "rol­ ling circle"-Mechanismus ab, wie er für die Replikation des Bakteriophagen ▱ beschrieben ist. Als Produkt entstehen konkatemere Moleküle, die an den TR-Sequenzen basenspezifisch ge­ schnitten und in Viruskapside verpackt werden. In latent infizierten Zellen liegt das virale Ge­ nom als extra-chromosonales Episom vor. In dieser latenten Phase repliziert das virale Genom synchron zum Zellzyklus mit Hilfe des plasmidalen Replikationsursprungs oriP (B). Nur wenige latent infizierte Zellen unterstützen die spontane lytische Replikation. Durch Behandlung der Zellen mit Chemikalien oder durch den viral kodierten Transaktivator BZLF1 kann aber in ei­ nem Teil der Zellen der lytische Zyklus experimentell induziert werden (C).

Abb. 2 Schematische Darstellung des lytischen Replikationsursprunges oriLyt des Epstein- Barr Virus. Der lytische Replikationsursprung ist komplex aufgebaut und enthält Elemente der Transkription und Replikation. Im zentralen Bereich (ca. 1 kbp) befinden sich die beiden für die Replikation essentiellen "upstream"- und "downstream"-Komponenten, die von zwei in entgegengesetzter Richtung transkribierten Genen flankiert sind. Diese flankierenden Bereiche werden als Replikationsverstärker bezeichnet, da sie die Replikation unterstützen, aber nicht unbedingt notwendig sind. Im unteren Teil der Abbildung sind die bisher definierten Elemente von oriLyt näher dargestellt. Der Promotor des BHLF1-Gens (TATA) kolokalisiert mit der "upstream"- Komponente und enthält vier Bindungsstellen für den viralen Transaktivator BZLF1 (ZRE: BZLF1 responsive element). Weitere ZRE-Bindestellen befinden sich in einem Bereich zwi­ schen der "downstream"-Komponente und dem BHRF1-Promotor, wo auch zwei Bindestellen (R) für den viralen Transaktivator BRLF1 liegen. Die "downstream"-Komponente enthält eine 60 bp-lange G/C-reiche Sequenz (TD-Element), an die die Bindung von Sp1 und anderen, bisher nicht näher charakterisierten zellulären Proteinen nachgewiesen wurde. Mutationen innerhalb des TD-Elementes verhindern die lytische Replikation von EBV (nach Gruffat et al., 1995).

Abb. 3 Schema des "one hybrid screens" in S. cerevisiae. (A) Herstellung des Hefestamms. Der Hefestamm RH1533 wurde mit zwei Plasmiden transformiert, die gerichtet in die defekten LYS2- bzw. URA3-Gene integrierten. Diese Integrationplasmide führen die beiden unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren stehenden Markergene HIS3 und LacZ ein, deren Ak­ tivität von multimerisierten TD-Elementen bestimmt wird. Nach Integration des Markergens HIS3 sind die Hefen auf Grund von minimaler HIS3-Promotoraktivität in der Lage, auf Histidin­ freiem Medium zu wachsen. Für die Selektion nach Transfektion der cDNA-Bibliothek muß diese Restaktivität des Promotors durch die Zugabe von 3-Aminotriazol gehemmt werden. Die Selektion auf Integration erfolgte durch Wachstum auf Minimalmedium ohne Histidin und Ura­ cil. (B) Transformation der cDNA-Bibliothek in den hergestellten Hefestamm. Die Promotoren des HIS3- bzw. LacZ-Gens werden nur dann aktiviert, wenn ein Fusionsprotein spezifisch an die DNA-Sequenzmotive von TD bindet und dabei die GAL4-Aktivierungsdomäne in die Nähe der Promotoren bringt. Mit Leucin-Mangel wurde auf die erfolgreiche Transfektion der cDNA- Bibliothek selektioniert, die das Leu2-Gen auf dem Vektoranteil trägt.

Abb. 4 TB7 kodiert für ein unbekanntes Genprodukt. Graphische Darstellung der Homolo­ giebereiche zwischen EST-Sequenzen aus der GENIUSnet-Datenbank und der cDNA von TB7. Die Nummern der Pfeile beziehen sich auf die in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzen. Die Pfeil­ richtung gibt an, ob die homologen Sequenzen den kodierenden oder nicht-kodierenden Strang betreffen. Weiße Balken zeigen die Lokalisation der Zink-Finger-Domänen.

Abb. 5 Schematischer Aufbau des TD-BP7 Gens. Die klonierte Sequenz des TD-BP7-Gens beträgt 14328 bp. Dargestellt sind die kodierenden Bereiche mit Exons 1-7 und 3'-UTR (schraf­ fiert), die Introns (grau) und die genomische Sequenz (weiß). Der Transkriptions-Startpunkt (+1) liegt innerhalb einer CpG-Insel. Eine putative Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor Sp1 ist gekennzeichnet. Größenangaben in bp.

Abb. 6 TD-BP7 kompetiert mit Sp1 um die Bindung an die "downstream"-Komponente. Ein 242 bp-Fragment der "downstream"-Komponente wurde radioaktiv markiert und in Anwe­ senheit von rekombinantem Sp1 und/oder MBP-TD-BP7 mit DNaseI inkubiert. Die eingesetzten Mengen rekombinanter Proteine sind angegeben. Zur Bestimmung der Sequenzpositionen diente eine G+A-Sequenzreaktion (G+A) des Fragmentes nach Maxam-Gilbert. Als Negativkontrolle wurde eine DNaseI-Reaktion ohne vorherige Proteininkubation verwendet. DNaseI- hypersensitive Stellen sind durch Sternchen markiert. Seitlich sind die durch die Bindung von TD-BP7 bzw. Sp1 vor DNaseI-Spaltung geschützten Bereiche der "downstream"-Komponente schematisch dargestellt (gepunktete bzw. schraffierte Balken). fpu: "footprinting units".

Abb. 7 Transiente Replikationsversuche mit TB7 und Mutanten. Im oberen Teil der Abbil­ dung sind schematisch der Aufbau des offenen Leserahmens von TB7 und verschiedene Deleti­ onsmutanten dargestellt. Nach Kotransfektion dieser verschiedenen Expressionsplasmide und eines Expressionsplasmids für BZLF1 (pCMV-BZLF1 als Induktor der lytischen Replikation) in D98/HR1 Zellen wurde die Replikationseffizienz eines oriLyt-Plasmides untersucht. Durch Ex­ pression des intakten TB7 Proteins bzw. einer im 5' Bereich leicht verkürzten Variante wird die lytische DNA Replikation vollständig unterdrückt (p2065 bzw. p2181). Die Deletion des 5' Be­ reiches resultiert in einer partiellen Aufhebung dieses repressorischen Effektes (p2608) während nach Deletion der DNA bindenden Zink-Finger Domänen die lytische DNA Replikation nicht beeinträchtigt wird.

Abb. 8 TB7 reprimiert die DNA Replikation von EBV.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (29)

1. Isolierte, angereicherte oder gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein TB7 Polypeptid kodiert oder die für ein TB7 Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz aufweist, die

• a) für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 oder 4 oder einem funktionellen Teil hiervon kodiert;
• b) komplementär zur Nukleotidsequenz von (a) ist;
• c) unter hoch stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure von (a) hybridisiert und für ein funktionelles TB7 Polypeptid oder einen funktionellen Teil oder Derivat hiervon kodiert.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, die der cDNA von TB7 entspricht, und sie Teil der genomischen DNA von SEQ ID NO: 1 ist.

4. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Säugetier isoliert ist, wobei das Säugetier bevorzugt ein Mensch ist.

5. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Expressionsvektor zur Expression des TB7 Polypeptids oder eines funktionellen Teils oder Derivats hiervon in einer Wirtszelle vorliegt.

6. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die cDNA von TB7 aufweist.

7. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Basen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abgeändert sind.

8. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Fragment ist, das für eine Domäne oder ein Epitop des TB7 Polypeptids kodiert.

9. Nukleinsäuresonde zum Nachweis der für ein TB7 Polypeptid oder eines funktionellen Teils oder Derivats hiervon kodierenden Nukleinsäure in einer Probe.

10. RNA, die von einer Nukleinsäure nach einer oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche abgeleitet ist.

11. Isoliertes angereichertes oder gereinigtes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodiert wird oder die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3 oder 4 oder einen funktionellen Teil oder Derivat davon aufweist.

12. Polypeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Aminosäuren durch eine andere Aminosäure ersetzt sind, eine oder mehrere Aminosäuren deletiert sind und/oder ein oder mehrere Aminosäuren zusätzlich ent­ halten sind, wobei die Funktion von TB7 als Repressor der DNA-Replikation von EBV oder die Funktion der Domäne oder Epitops beibehalten bleibt.

13. Polypeptid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche mit den Aminosäuren 103 bis 151 gem. SEQ ID NO: 4.

14. Isoliertes, gereinigtes oder angereichertes TB7 Polypeptid, funktionelle Teile und Derivate hiervon.

15. Antikörper oder Antikörperfragment mit einer spezifischen Bindungsaffinität an ein TB7 Polypeptid oder eine TB7 Polypeptid-Domäne oder TB7 Polypeptid Epitop.

16. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er ein monoklonaler Antikörper ist.

17. Hybridom, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität an ein TB7 Polypeptid oder eine TB7 Polypeptid-Domäne oder -Epitop produziert.

18. Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein TB7 Polypeptid oder einen funktionellen Teil oder Derivat hiervon exprimiert.

19. Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäure enthält, die für ein rekombinantes TB7 Polypeptid oder einen funktio­ nellen Teil oder Derivat hiervon kodiert.

20. Rekombinante Zelle nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine prokaryonte Zelle, bevorzugt eine E. coli-Zelle, ist.

21. Rekombinante Zelle nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eukaryonte Zelle, bevorzugt eine B-Zelle, ist.

22. Verfahren zur Hemmung der Replikation von EBV, dadurch gekennzeichnet, daß man eine das EBV Genom enthaltende Zelle mit dem TB7 Polypeptid oder einem funktio­ nellen Teil oder Derivat hiervon in Kontakt bringt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das in Kontakt bringen durch Expression eines TB7 Polypeptids oder funktionellen Teils oder Derivats hiervon in der infizierten Zelle erfolgt.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein TB7 Polypeptid oder einen funktionellen Teil oder Derivat hiervon in einer pharma­ zeutisch wirksamen Menge, zusammen mit üblichen Träger- und Hilfsstoffen, enthält.

25. Verwendung eines TB7 Polypeptids oder eines funktionellen Teils oder Derivats hiervon zur Hemmung der Replikation von gamma Herpesviren, insbesondere EBV und HHV8, und beta Herpesviren, insbesondere Cytomegalovirus.

26. Verwendung eines TB7 Polypeptids nach Anspruch 25 zur Behandlung von Erkrankungen, die mit gamma Herpesviren, insbesondere EBV und HHV8, und beta Herpesviren, insbesondere Cytomegalovirus assoziiert sind.

27. Verwendung nach Anspruch 26 zur Behandlung des Burkitt Lymphoms, des Hodgkin Lymphoms und des Nasopharynxkarzinoms.

28. Verfahren zur Herstellung eines TB7 Polypeptids oder eines funktionellen Teils oder Deri­ vats hiervon nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante Zelle, die eine Nukleinsäure enthält, die für ein TB7 Polypeptid oder ei­ nen funktionellen Teil oder ein Derivat hiervon kodiert, wobei die für das TB7 Polypeptid o­ der den funktionellen Teil oder ein Derivat hiervon kodierende Nukleinsäure unter der Kon­ trolle eines induzierbaren Promotors steht, der die Expression des TB7 Polypeptids oder des funktionellen Teils oder Derivats steuert, kultiviert wird, die Expression des Polypeptids oder seines funktionellen Teils oder Derivats erfolgt und anschließend das TB7 Polypeptid oder der funktionelle Teil oder das Derivat von TB7 gewonnen wird.

29. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche.