DE69434328T2

DE69434328T2 - TAT transdominante Variante aus Human Immunodeficiency Virus

Info

Publication number: DE69434328T2
Application number: DE69434328T
Authority: DE
Inventors: Majid Mehtali; Tania Sorg
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1993-01-04
Filing date: 1994-01-03
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2014-01-04
Also published as: EP1424394A2; DE69434328D1; EP0614980B1; EP1580272A2; JP2004065256A; JP3613734B2; EP0614980A1; AU668441B2; DK0614980T3; ATE292981T1; CA2112652A1; FR2700169B1; EP1424394A3; FR2700169A1; EP1580272A3; JPH06234791A; AU5280393A; US6284252B1; US5889175A; ES2236688T3

Description

Die Erfindung hat neue Varianten des TAT-Proteins des "human immunodeficiency virus" (HIV) sowie die DNA-Fragmente, die diese Varianten kodieren, die Expressionskassetten, die deren Expression auf rekombinantem Wege erlauben, und die Zellen, die diese Expressionskassetten enthalten, zum Gegenstand. Die Varianten des TAT-Proteins, Kassetten und Zellen sind insbesondere für die Verhütung oder die Behandlung von HIV-Infektionen nützlich.
Das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) entwickelt sich in der Folge einer Infektion der T4-Lymphozyten eines Individuums durch das HIV-Virus. Die Infektion kann während zahlreicher Jahre symptomlos verlaufen, aber ab dem Zeitpunkt, wo die Zellen aktiviert sind, repliziert sich das HIV-Virus schnell und zerstört diese. AIDS ist durch einen Defekt der zellulären Immunität gekennzeichnet, der zur Folge hat, dass das Individuum hinsichtlich einer jeglichen opportunistischen Infektion besonders empfindlich gemacht wird. Im Juli 1992 hat die WHO 501 272 Fälle von AIDS auf der Welt registriert (AIDS Information international literature on acquired immunodeficiency syndrom and related retroviruses, 1992, 8, Leeds University Press. Herausgeber A. W. Boylston, Leeds). Aber diese Zahlen sind gleichwohl geringer als die Realität, denn diese Krankheit bildet in bestimmten afrikanischen Ländern eine wahrhaftige Epidemie.
AIDS bleibt eine Krankheit, bei der der Mortalitätsgrad in 1992 noch immer sehr hoch ist. Tatsächlich versterben 90% der Personen in den 2 Jahren nach dem Ausbruch von AIDS. Bis heute hat sich trotz der zahlreichen investierten Anstrengungen keine Behandlung als vollständig zufrieden stellend erwiesen. Die Entwicklung von wirksamen Behandlungen wird durch die besondere Komplexität des HIV-Virus behindert.
Das HIV ist ein Retrovirus, das zu der Familie der Lentiviren gehört. Wie alle Retroviren wird das HIV aus einer Hülle gebildet, welche ein Kapsid von Proteinnatur umgibt, welches das aus einem RNA-Molekül, welches mit diversen viralen Proteinen assoziiert ist, die für die ersten Schritte des Replikationszyklus erforderlich sind, bestehende genetische Material enthält.
Nach einer Infektion eines T-Lymphozyten wird das RNA-Molekül durch die virale reverse Transkriptase in DNA kopiert. Die DNA integriert sich in das Zellgenom und bildet das, was üblicherweise als ein Provirus bezeichnet wird. Die provirale DNA kann dort im latenten Zustand verbleiben oder kann durch die zelluläre Maschinerie in RNA transkribiert werden, um einerseits die virale genomische RNA und andererseits die Messenger-RNAs (mRNA), die in virale Proteine translatiert werden, zu produzieren.
Die Bildung der neuen Viruspartikel oder Virionen erfolgt durch Verkapselung der genomischen RNA in dem Kapsid. Das so gebildete Partikel löst sich von der Zelle durch Knospung ab, wobei es einen Teil der Zellmembran, in welche das virale Hüllglycoprotein eingebaut ist, mitführt. Die so freigesetzten Virionen sind in der Lage, andere lymphoide Zellen dank einer spezifischen und wechselseitigen Erkennung des CD4-Rezeptors, der auf der Oberfläche der T4-Lymphozyten exprimiert wird, und des Hüllproteins des HIV zu infizieren.
Allgemein umfasst das HIV-Genom, wie in der 1 angegeben:
3 Strukturgene: gag, pol und env, welche die Proteine des Kapsids, der Hülle bzw. die reverse Transkriptase kodieren,
wenigstens 6 Gene: tat, rev, nef, vif, vpr und vpu, die Proteine kodieren, die wahrscheinlich regulatorische Funktionen, die für bestimmte noch schlecht definiert sind, haben, und
die cis-regulatorischen Sequenzen, die für die Transkription unabdingbar sind, die an den beiden 5'- und 3'-Enden der proviralen DNA auf der Höhe der LTRs ("Long Terminal Repeat") lokalisiert sind. Die 5-LTR enthält die Promotorsequenzen und die Regulationselemente, die für die Initiation der Transkription erforderlich sind, wohingegen die 3'-LTR an der Beendigung der Transkription beteiligt ist. Außerdem ist die Transkription der viralen Gene einer komplexen Regulation, die insbesondere durch die viralen Proteine TAT und REV kontrolliert wird, unterworfen.
Das TAT-Protein ist ein regulatorisches Protein, welches früh während des viralen Zyklus exprimiert wird. Sein Wirkort ist der Kern. Seine Rolle besteht darin, die Expression der Gene, welche die gesamten Proteine des HIV kodieren, zu transaktivieren. Das TAT-Protein wechselwirkt spezifisch mit einer kurzen Nukleotidsequenz des Virusgenoms: der Sequenz TAR ("Trans-Activation Responsive Region"), die am 5'-Ende des Genoms von HIV zwischen den Nukleotiden (nt) –17 und +80 der 5'-LTR lokalisiert ist. Diese Sequenz ist folglich teilweise in allen viralen mRNAs vorhanden. Man vermutet, dass der TAT-TAR-Komplex wahrscheinlich in Verbindung mit anderen zellulären Faktoren die Transkription der viralen Gene begünstigt, die so erhaltenen mRNAs stabilisiert und die Translation dieser mRNAs in Proteine verbessert. So vermehrt sich das Virus sehr schnell ab dem Zeitpunkt, wo das tat-Gen aktiviert ist.
Die Transaktivierungswirkung, die durch das TAT-Protein induziert wird, konnte in vitro unter Verwendung eines Indikatorgens, dessen Expression leicht gemessen werden kann, wie des CAT (Chloramphenicolacetyltransferase)-Gens, ausgewertet werden. Das CAT-Gen, welches unter die Kontrolle der 5'-LTR des HIV-Virus einschließlich der TAR-Sequenz gestellt ist, wurde in tierische Zellen durch Transfektion eingeführt. In den Zellen, die TAT nicht exprimieren, beispielsweise Zellen, die nicht durch das HIV-Virus infiziert sind, ist die Transkription des CAT-Gens ausgehend von dem viralen Promotor blockiert oder auf ein Minimum reduziert derart, dass kein oder sehr wenig Produkt des CAT-Gens nachgewiesen wird. Im Gegensatz dazu beobachtet man in Gegenwart des TAT-Proteins eine Verstärkung der Genexpression um einen Faktor von 100 bis 1000 je nach den Zellen, die aus einer Beschleunigung der Transkription verbunden mit einer besseren Effizienz der Translation resultiert.
Das Transaktivatorgen tat von HIV umfasst 2 kodierende Exons. Das Erste befindet sich in der zentralen Region des Genoms zwischen den Sequenzen, die die Gene pol und env kodieren, und kodiert den Hauptteil des Proteins, nämlich die 72 N-terminalen Aminosäuren. Das Zweite, das lediglich die 14 C-terminalen Aminosäuren kodiert, ist für die biologische Aktivität nicht unabdingbar.
Die Struktur des TAT-Proteins wird durch dessen Funktion nahegelegt. Sie muss wenigstens eine Domäne, die die Aktivierung der Transkription der viralen Gene erlaubt, eine sogenannte Aktivierungsdomäne, eine Domäne für die Bindung an die TAR-Nukleotidsequenz, dessen Zielsequenz, und eine Domäne, die dessen nukleäre Lokalisation erlaubt, umfassen.
Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass das TAT-Protein aus 5 Domänen gebildet wird (2):
eine erste Domäne (Aminosäuren 1 bis 37) weist eine an Cysteinen reiche Sequenz auf, deren Funktion noch unbekannt ist. Bestimmte Untersuchungen vermuten, dass diese Region an der Faltung des Proteins und an der Dimerisierung der TAT-Moleküle beteiligt ist und dieses möglicherweise gegenüber Proteasen schützt,
die aus den Aminosäuren 38 bis 48 bestehende Domäne entspricht der ersten Aktivierungsdomäne,
die aus den Aminosäuren 49 bis 57 bestehende Domäne weist die Kernlokalisierungssequenzen und die Sequenzen für die Anheftung an das TAR-Element auf,
die aus den Aminosäuren 58 bis 72 bestehende Domäne entspricht der zweiten Aktivierungsdomäne von TAT,
die aus den Aminosäuren 73 bis 86 bestehende Domäne ist für die Aktivität von TAT nicht essentiell.
Der größte Teil der mit HIV verwandten Retroviren weisen Transaktivatorgene auf, die Proteine kodieren, die in der Lage sind, die Transkription der viralen Gene ausgehend von den LTRs zu aktivieren. Seit einigen Jahren wurden zahlreiche Varianten dieser Transaktivatorproteine, die von verschiedenen Virustypen abgeleitet wurden, beschrieben und unter jenen negative und dominante Varianten (Wachsman et al., Science, 1987, 235, 674–677; Friedman et al., Nature, 1988, 335, 452–454), welche nachfolgend als transdominante Varianten bezeichnet werden.
Die transdominanten Varianten wurden als Varianten definiert, die ein verringertes Vermögen, die Aktivierung der Expression der unter die Kontrolle des viralen Promotors gestellten Gene zu induzieren, (verringerte transaktivierende Aktivität) aufweisen, die aber die Fähigkeit aufweisen, ihre Zielsequenz, die sich auf der Höhe eben dieses Promotors befindet, zu erkennen derart, dass sie auf kompetitive Weise die Funktion des nativen Transaktivatorproteins hemmen können.
Da diese Varianten auf dominante Weise mit der Funktion der nativen Proteine interferieren, könnten sie eine neue Klasse von antiviralen Mitteln bilden, welche in der Lage sind, die "intrazelluläre Immunisierung" der infizierten Zellen zu fördern. Allgemein besteht diese Technik darin, Zellen genetisch zu modifizieren, um diese ein Protein oder Nukleinsäuren synthetisieren zu lassen, die ihnen einen besonderen Vorteil verleihen, wie beispielsweise gemäß dem durch D. Baltimore definierten Konzept (Nature, 1988, 335, 395–396) eine Resistenz gegen die Infektion durch ein gegebenes Virus, wie das HIV-Virus.
So haben Green et al. (Cell, 1989, 58, 215–233) transdominante Varianten erzeugt, die in der ersten Aktivierungsdomäne des TAT-Proteins des HIV-Virus modifiziert sind. Diese Autoren offenbaren 4 Varianten, die von einem Peptidfragment des TAT-Proteins stammen: zwei von jenen werden als wirksame transdominante Varianten beschrieben, nämlich die Varianten TAT (Lys⁴¹ → Ala) und TAT (Tyr⁴⁷ → Ala) und die beiden anderen als mäßige transdominante Varianten, nämlich TAT (Ser⁴⁶ → Ala) und die Doppelvariante TAT (Ser⁴⁶, Tyr⁴⁷ → Ala, Ala).
Indessen scheinen die in dieser Veröffentlichung erwähnten Varianten kontrovers zu sein (Frankel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 7397–7401). Die Anmelderin hat gleichfalls versucht, die mit der Variante (Lys⁴¹ → Ala) erhaltenen Ergebnisse zu reproduzieren, aber ohne Erfolg, wie nachfolgend angegeben wird.
Andererseits weisen Pearson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 5079–5083) die Bedeutung der aus den Aminosäuren 48 bis 54 bestehenden Region bei der Erzielung eines transdominanten Phänotyps nach. Tatsächlich erzeugt das Ersetzen des Glutamin (Gln) an Position 54 kodierenden Codons durch ein Stop-Codon eine verkürzte Variante ⎕TAT, die einen solchen Phänotyp aufweist.
Es wurden jetzt neue Varianten des TAT-Proteins von HIV gefunden, die einen transdominanten Phänotyp aufweisen und die auf der Höhe von bestimmten Resten der Aktivierungsdomänen modifiziert worden sind.
Diese Varianten sind im Rahmen einer anti-AIDS-Therapie besonders nützlich, denn sie weisen eine verringerte transaktivierende Aktivität auf und sie interferieren auf dominante Weise mit der Funktion des nativen TAT-Proteins. Diese neuen Varianten könnten wirksame antivirale Mittel bilden, um die Replikation und die Vermehrung des HIV-Virus zu hemmen. Tatsächlich könnte sich die Wirkung dieser transdominanten Varianten ab dem ersten Infektionszyklus entfalten, sogar bevor das Virus die Pro teine und die RNA, welche für die Bildung von neuen Viruspartikeln erforderlich sind, hat synthetisieren können.
Die Erfindung hat folglich eine transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus oder eines funktionalen Fragments dieses Proteins, welche wenigstens eine Mutation umfasst, zum Gegenstand, wobei die Mutation durch die Anwesenheit eines von dem natürlichen Rest verschiedenen Aminosäurerest an Position 38 gekennzeichnet ist.
Allgemein empfiehlt es sich, die Sequenz einer Variante des TAT-Proteins auf der Grundlage der Sequenz des TAT-Proteins des Lai-Isolats des HIV1-Virus, wie sie von Wain-Hobson et al. (Cell, 1985, 40, 9–17) offenbart worden ist, zu beschreiben.
Indessen wurden das TAT-Protein und das DNA-Fragment, welches das TAT-Protein kodiert, ursprünglich ausgehend von dem HIV1-Virusstamm, Isolat Lai, beschrieben. Indessen existieren Virusstämme und Virusisolate, die im Rahmen ein und desselben Stamms beschrieben worden sind, in großer Zahl. Außerdem kann ein bestimmtes Virus während seiner Vermehrung Abwandlungen erfahren. Folglich kann das DNA-Fragment, welches das TAT-Protein kodiert, eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche sich von dem einen Virus zum anderen unterscheidet. Ebenso kann das TAT-Protein eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von einem Virus zum anderen unterscheidet. Der gemeinsame Nenner ist aber die Funktion des Proteins, die darin besteht, die Expression der unter die Kontrolle eines Promotors, welcher eine TAR-Zielsequenz enthält, wie des Promotors des HIV-Virus einschließlich der 5'-LTR des Virusgenoms, gestellten Gene zu transaktivieren. Unter TAT-Protein von HIV versteht man ein jegliches Protein, welches ein Transaktivierungsergebnis liefert, welches im Wesentlichen identisch ist mit jenem, welches durch das TAT-Protein des Isolats Lai des HIV1-Virus gezeigt wird.
In der Praxis wird die Sequenz einer Variante des TAT-Proteins durch Alignment gegenüber jener des TAT-Proteins des HIV1-Virus ausgerichtet. Die Nummerierung der Aminosäuren in der Sequenz einer Variante des TAT-Proteins wird folglich von jener, die für das TAT-Protein des HIV1-Virus etabliert worden ist, übernommen. So ist ein Aminosäurerest an Position z.B. 41 in der Sequenz einer Variante des TAT-Proteins tatsächlich ein Aminosäurerest, der nach einem Alignment der Aminosäure an Position 41 in der Sequenz des nativen TAT-Proteins des HIV1-Virus entspricht.
Spezieller weist eine Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung insbesondere einen transdominanten Phänotyp auf, welcher durch eine transaktivierende Aktivität unter ungefähr 50% bezogen auf jene des nativen TAT-Proteins, vorteilhafterweise unter 20% und bevorzugt unter 10% und eine die native TAT-Funktion zu über 50%, vorteilhafterweise zu über 75% und vorzugsweise zu über 90% inhibierende Aktivität, wie bei einem Konzentrationsverhältnis Variante/natives TAT von 10/1 bestimmt, gekennzeichnet ist. Gegenwärtig sind verschiedene Methoden zur Messung der gekennzeichnet ist. Gegenwärtig sind verschiedene Methoden zur Messung der transaktivierenden Aktivität bekannt. Sie variieren je nach dem eingesetzten Reportergen. Als Beispiel kann die Methode, die das CAT-Gen, welches unter die Kontrolle der 5'-LTR des HIV-Virus gestellt ist, einsetzt, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, aufgeführt werden.
Eine erfindungsgemäße Variante des TAT-Proteins kann von einem funktionalen Fragment des Proteins abgeleitet und auf der Höhe eines Rests, wie oben angegeben, mutiert werden, wobei die Nummerierung der Aminosäuren gleichfalls durch Alignment mit jener, die für das native TAT-Protein des HIV-1-Referenzvirus etabliert worden ist, in Übereinstimmung gebracht worden ist. Unter funktionalem Fragment des TAT-Proteins versteht man ein jegliches Fragment des Proteins, das in der Lage ist, eine Transaktivierung der Expression der unter die Kontrolle eines Promotors, welcher die TAR-Sequenz umfasst, wie des Promotors des HIV-Virus, gestellten Gene zu induzieren. Beispielsweise kann eine Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung nach einer Mutation eines Fragments des TAT-Proteins, wie eines Fragments, welches bei der Aminosäure 1 beginnt und bei der Aminosäure 72 endet, erzeugt werden.
Eine Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung kann bezogen auf das native TAT-Protein des HIV mehrere Mutationen umfassen. Sie kann eine Kombination von wenigstens 2 Mutationen, wie sie oben beschrieben worden sind, umfassen.
Spezieller weist eine Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung insbesondere eine Sequenz auf, deren Homologiegrad mit der nativen TAT-Sequenz von HIV1 über 75%, vorteilhafterweise über 90% und bevorzugt über 95% liegt.
Selbstverständlich können die zu mutierenden Reste durch eine jegliche andere Aminosäure als den natürlichen Rest ersetzt werden bis auf den Rest an Position 41, der durch ein(e) Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tryptophan, Tyrosin und Valin ersetzt werden kann; und den Rest an Position 47, der durch ein(e) Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan und Valin ersetzt werden kann.
Gemäß einem besonders vorteilhaften Aspekt der Erfindung umfasst eine TAT-Variante an Position 38 eine Aminosäure, die eine saure Seitenkette aufweist, wie eine Glutaminsäure, eine Asparaginsäure oder vorzugsweise eine Asparaginsäure.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein DNA-Fragment, welches die Variante des TAT-Proteins kodiert. Die eine Variante des TAT-Proteins kodierende Sequenz kann erhalten werden gemäß den klassischen Techniken der Gentechnologie, beispielsweise durch gezielte Mutagenese. So wird das DNA-Fragment, welches das das native TAT-Protein von HIV kodierende Gen oder einen Abschnitt dieser Sequenz umfasst, in einen Phagen vom Typ M13 kloniert. Die Sequenz wird modifiziert, indem ein geeignetes Oligonukleotid eingesetzt wird derart, dass die gewünschte(n) Mutation(en) erhalten wird bzw. werden.
Die Erfindung umfasst gleichfalls eine Expressionskassette, welche ein DNA-Fragment, welches eine Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung kodiert, welches unter die Kontrolle von geeigneten Elementen, welche deren Expression erlauben, gestellt ist, umfasst. Eine Expressionskassette ist insbesondere nützlich, um zu erlauben, eine Variante des TAT-Proteins in einem heterologen Expressionssystem zu synthetisieren, oder ebenso als Element eines Vektors, welcher für die Gentherapie bestimmt ist, wie eines retroviralen oder adenoviralen Vektors. Unter geeigneten Elementen, welche die Expression des eine Variante des TAT-Proteins kodierenden DNA-Fragments erlauben, versteht man die Gesamtheit der Elemente, die die Transkription des DNA-Fragments in mRNA und die Translation der mRNA in Protein erlauben.
Diese Elemente umfassen insbesondere einen geeigneten Promotor. Im Kontext der Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Promotor" ein jegliches Transkriptionskontrollelement, welches an der Expression eines DNA-Fragments in Abhängigkeit von der Wirtszelle, die dieses enthält, beteiligt ist. Solche Kontrollelemente sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt und werden in die Expressionskassette durch die herkömmlichen Techniken der Gentechnologie inseriert.
Der enthaltene Promotor kann zellulärer oder viraler Herkunft sein. Der Promotor kann vom ubiquitären Typ sein, welcher eine permanente Expression des DNA-Fragments erlaubt. Ein solcher Fall ist der PGK (Phosphoglyceratkinase)-Promotor, der in der Hefe funktionsfähig ist, oder der späte Promotor des SV40-Virus (Simian Virus 40), der Promotor des HMG (Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Reduktase)-Gens, der Promotor des Gens der Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus vom Typ 1 (HSV1), der Promotor EIII und MLP ("Major Late Promotor") des Adenovirus und die LTR des Mo-MuLV-Virus ("Moloney Murine Leukemia Virus), die in den tierischen Zellen funktionsfähig sind.
Der Begriff "Promotor" umfasst gleichfalls einen Promotor vom regulierbaren Typ, beispielsweise einen gewebespezifischen Promotor, wie den für die lymphozytären Zellen spezifischen Promotor der Immunglobulingene.
Außerdem kann die Expressionskassette enthalten:

(1) UAS ("Upstream Activating Sequence"), wie die UAS des Gens GAL4 (Galactose) der Hefe,
(2) Enhancer-Sequenzen, die entweder strangaufwärts von dem Promotor oder strangabwärts von dem DNA-Fragment platziert sein können und die erlauben, die Expressionsniveaus zu erhöhen, wie den Enhancer des humanen CD2-Gens. Außerdem umfasst dieser Letztere Elemente, die erlauben, die Expression des DNA-Fragment zielgerichtet in den lymphozytären Zellen vom T-Typ erfolgen zu lassen,
(3) Intronsequenzen, die dafür bekannt sind, die Genexpression bei den höheren Eukaryoten zu verbessern, wie das Intron des SV40-Virus,
(4) Spleißsignalsequenzen, wie beispielsweise jene des SV40-Virus, welche die Entfernung der Intronsequenzen in den mRNAs, welche dazu bestimmt sind, in Proteine translatiert zu werden, erlauben,
(5) die Elemente, welche an der Beendigung der Transkription beteiligt sind, wie die Polyadenylierungssignale des SV40-Virus.

Allgemein kann die Expressionskassette die Expression einer Variante des TAT-Proteins im Inneren einer Wirtszelle und vorzugsweise im Inneren eines Lymphozyten erlauben.
Die Expressionskassette kann auch die Produktion der Variante des TAT-Proteins in dem Kulturmedium, aus welchem sie leicht geerntet werden kann, erlauben. In diesem Falle kodiert das DNA-Fragment eine Vorstufe der Variante des TAT-Proteins, welche strangaufwärts von der reifen Sequenz ein Signalpeptid umfasst, welches die Sekretion dieser Variante aus der Wirtszelle erlaubt. Solche Signalpeptide sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt, beispielsweise die Signalsequenz des Faktors Mat alpha aus der Hefe.
Die Expressionskassette wird in einen Expressionsvektor inseriert, der dazu dient, eine Wirtszelle, in welcher der Promotor und die geeigneten Elemente funktionsfähig sind, zu transformieren. Ein solcher Vektor kann in der Form eines Plasmids oder eines viralen Vektors, beispielsweise eines retroviralen Vektors, welcher sich von dem MoMuLV ableitet, oder eines adenoviralen Vektors, welcher sich von dem Adenovirus vom Typ 5 ableitet, vorliegen.
Die Erfindung erstreckt sich auf die Zellen, welche eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfassen, wobei die Zellen eukaryotischer oder prokaryotischer Herkunft sein können. Die Wirtszelle kann ein Bakterium, ein Pilz, beispielsweise eine Hefe, oder eine Säugetierzelle sein. Die Wirtszelle wird vorzugsweise eine humane Zelle der hämopoetischen Linie sein.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung, gemäß welchem:

(1) man eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle gemäß der Erfindung, welche ein DNA-Fragment, welches die Variante kodiert, umfasst, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und
(2) man die Variante ausgehend von dem Kulturmedium oder der Zelle gewinnt.

Die Erfindung umfasst gleichfalls eine Variante des TAT-Proteins, welche durch das Ausführen des Verfahrens erhalten wird.
Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf die therapeutische Verwendung einer Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung, einer Expressionskassette oder einer Zelle, die die Variante produziert, um die Replikation des HIV-Virus zu hemmen. Bevorzugt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Variante des TAT-Proteins oder einer Expressionskassette oder einer Zelle, welche die Variante produziert, für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung oder die Verhütung von AIDS bei Säugetieren, vorzugsweise bei Menschen, bestimmt ist.
Vorteilhafterweise können eine Expressionskassette oder eine Zelle gemäß der Erfindung zu Zwecken einer anti-AIDS-Gentherapie eingesetzt werden. Die Expressionskassette wird in einen Vektor vom retroviralen Typ inseriert, der in die Stammzellen der hämopoetischen Linie, die aus dem Knochenmark eines Individuums (welches vorzugsweise durch HIV infiziert ist) entnommen worden sind, eingeführt wird. Die so transfizierten Stammzellen werden dem Spender wieder injiziert. Sie sind in der Lage, sich zu teilen und sich unter anderem zu Lymphozyten zu differenzieren. Die Lymphozyten, die den retroviralen Vektor enthalten, werden zeitlich länger andauernd das Gen exprimieren, welches eine transdominante Variante des TAT-Proteins kodiert, was die Zellen gegenüber der Infektion durch das HIV resistent macht.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel eine erfindungsgemäße Variante, eine Expressionskassette oder eine Zelle, welche eine solche Variante produziert, umfasst. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann gemäß den Techniken, die allgemein Verwendung finden, hergestellt werden. Beispielsweise kombiniert man mit dem therapeutischen oder prophylaktischen Mittel in therapeutisch wirksamer Menge einen Träger, ein Verdünnungsmittel oder ein Adjuvans, die annehmbar sind.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Behandlungsverfahren, gemäß welchem man eine therapeutisch wirksame Menge einer Variante des TAT-Proteins gemäß der Erfindung, eine Expressionskassette oder eine Zelle, die eine solche Variante produziert, einem Patienten verabreicht.
Die Erfindung wird nachfolgend durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren veranschaulicht:
Die 1 ist eine schematische Darstellung des Genoms des HIV-Virus, wobei die die Proteine kodierenden Gene gemäß dem verwendeten Leseraster dargestellt sind; LTR: ausgefüllte Rahmen; die Strukturproteine kodierende Gene: grau eingefärbte Rahmen; Regulationsproteine kodierende Gene: leere Rahmen.
Die 2 ist eine schematische Darstellung der verschiedenen Domänen, die das native TAT-Protein des HIV-Virus bilden, wobei die Aminosäuren, die jede Domäne bilden, oberhalb von jeder der Domänen angegeben sind.
Die 3 ist eine schematische Darstellung des eukaryotischen Expressionsvektors pSG5, der der Reihenfolge nach umfasst: den SV40-Promotor (SV40 pro; ausgefüllter Rahmen), das 3'-Fragment des nicht-kodierenden Exons 1 des ⎕-Globingens des Kaninchens (leerer Rahmen), das Intron des ⎕-Globingens des Kaninchens (durchgezogene Linie), den nicht-kodierenden Beginn des Exons 2 des ⎕-Globingens des Kaninchens (leerer Rahmen), den Promotor des Bakteriophagen T7 (T7 pro; ausgefüllter Rahmen), einmalig vorkommende EcoRI-, BamHI-, BgIII-Stellen, die die Klonierung eines Gens von Interesse erlauben, und das Polyadenylierungssignal des SV40-Virus (pA SV40; grau gefärbter Rahmen).
Die 4 ist eine schematische Darstellung des Expressionsvektors des nativen TAT-Proteins pHMG-Tat, der der Reihenfolge nach umfasst: den Promotor des HMG-Gens (HMGpro), das nicht-kodierende Exon I des HMG-Gens (gestreifter Rahmen), das Intron I und die Spleißakzeptorstelle des HMG-Gens, die cDNA, welche die 86 Aminosäuren des TAT-Proteins kodiert, (ausgefüllter Rahmen) und das Polyadenylierungssignal von SV40 (pA, leerer Rahmen).
Die 5 ist eine schematische Darstellung des retroviralen Vektors pLXSP, welcher der Reihenfolge nach die 5'-LTR des MSV-Virus ("Marine Sarcoma Virus") einschließlich der viralen Promotorregion, eine Verkapselungsregion (psi), den 5'-Abschnitt des viralen gag-Gens (gag°), Mehrfachklonierungsstellen, welche die Insertion von heterologen Genen (Gen x) erlauben, den Promotor des SV40-Virus, welcher die Expression des Puromycinresistenzgens (PAC) dirigiert, und die 3'-LTR des MPSV-Virus ("Myelo Proliferative Sarcoma Virus") einschließlich der Polyadenylierungssignale umfasst.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Konstruktion des Expressionsplasmids pTG2332, Expression der Variante TAT (Phe³⁸ → Asp) und Charakterisierung des transdominanten Phänotyps
Ein DNA-Fragment, welches die cDNA, welche den 2 Exons des tat-Gens des Genoms des HIV-Isolats Lai (Wain-Hobson et al., Cell, 1985, 40, 9–17; Sodroski et al., Science, 1985, 229, 74–77) entspricht, umfasst, war modifiziert worden, um eine BamHI-Stelle 5' von dem ATG-Startcodon zu erzeugen. Außerdem existiert von Natur aus eine BamHI-Stelle 53 bp nach dem Stop-Codon des tat-Gens. Das BamHI-Fragment von 300 bp, welches das nicht mutierte tat-Gen umfasst, war durch den Kit Gene Clean (Bio 101, Inc., P. O. Box 2284, La Jolla) gereinigt und in einen Vektor M13TG130 (Kieny et al., Gene, 1983, 26, 91–99) inseriert worden, um den Vektor M13TG2306 zu erhalten, an welchem die Mutagenesen ausgeführt werden.
Die Mutation des Codons, welches den Rest 38 kodiert, erfolgt an M13TG2306 unter Verwendung des Amersham-Kits ("Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system", Version 2.1 RPN 1523) und unter Einsatz des in der Sequenzbeschreibung SEQ ID NO: 1 beschriebenen Oligonukleotids.
Das Oligonukleotid war so gestaltet worden, dass das den Phenylalaninrest (Phe) an Position 38 kodierende Codon durch eine Asparaginsäure (Asp) ersetzt wird und gleichfalls eine HindIII-Restriktionsstelle auf der Höhe des Codons, welche den Rest an Position 42 der TAT-Sequenz kodiert, erzeugt wird, ohne die Aminosäure, welche es kodiert, zu modifizieren. Die Anwesenheit einer Restriktionsstelle erlaubt es, leicht die ausgehend von den Ausgangsvektoren mutierten Vektoren während der Analyse der DNAs des Bakteriophagen durch die von Maniatis et al. (Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory) beschriebene Minipräparationsmethode zu identifizieren.
Nach der Mutagenese wird dann das BamHI-Fragment; welches das mutierte tat-Gen umfasst, in den eukaryotischen Expressionsvektor pSG5 (Green et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16, 369), der in der 3 veranschaulicht wird, transferiert. Das daraus resultierende Plasmid, pTG2332, erlaubt die Expression der TAT-Variante (Phe³⁸ → Asp).
Die transdominanten TAT-Varianten des Standes der Technik, die TAT-Variante (Lys⁴¹ → Ala) bzw. ΔTAT (Gln⁵⁴ → Stop), wurden durch zielgerichtete Mutagenese des Vektors M13TG2306 erzeugt unter Einsatz der Oligonukleotide, die beschrieben werden in SEQ ID NO: 2, welches Oligonukleotid erlaubt, das den Lysinrest an Position 41 kodierende Codon durch ein Alanin zu modifizieren, bzw. in SEQ ID NO: 3, welches Oligonukleotid erlaubt, ein Stop-Codon anstelle des den Glutaminrest an Position 54 kodierenden Codons zu erzeugen.
Nach der Mutagenese wird das mutierte tat-Gen in den eukaryotischen Expressionsvektor pSG5 inseriert, was pTG2351, welcher die Produktion der TAT-Mutante (Lys⁴¹ → Ala) erlaubt, bzw. pTG2352, welcher die Produktion von ΔTAT erlaubt, ergibt. Diese Mutanten des Standes der Technik werden als positive Transdominanz-Vergleichsprobe eingesetzt. Ihre transaktivierende Aktivität wie auch ihre Fähigkeit, das native TAT-Protein zu hemmen, werden gemäß Bedingungen, die streng identisch sind mit jenen, die für die erfindungsgemäßen TAT-Varianten eingesetzt werden, und die nachfolgend beschrieben werden, ausgewertet.
Man wertet die transaktivierende Aktivität der TAT-Variante (Phe³⁸ → Asp) durch transitorische Transfektion von HeLa-Zellen durch den Expressionsvektor pTG2332 mit dem Reportervektor LTR-CAT (Emerman et al., EMBO J., 1987, 6, 37–55) aus. Die Zellen werden gemäß der Calciumphosphat-Technik (Maniatis et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory) transfiziert. Andere Protokolle, die erlauben, eine Nukleinsäure in eine Zelle einzuführen, können gleichfalls eingesetzt werden, wie die Dextransulfat-Technik, die Elektroelution, die auf osmotischen Schocks basierenden Methoden oder die Mikroinjektion in eine ausgewählte Zelle.
Man kultiviert die humanen HeLa-Zellen bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ in einem MEM-Medium ("Eagle's minimum essential medium"), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 1% Glutamin und 1% Gentamycin.
Man reinigt die Plasmid-DNAs auf einem Cäsiumchlorid-Gradienten. Man cotransfiziert die zu 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung verteilten HeLa-Zellen in Kultur mit 1 μg pTG2332 und 0,5 μg des Plasmids LTR-CAT. Die Transfektion mit 1 μg pHMG-Tat (4) und 0,5 μg LTR-CAT bildet die positive Vergleichsprobe der Transaktivierung. Der Vektor pHMG-tat entstammt der Klonierung des BamHI-Fragments, welches die cDNA des tat-Gens, welche die 86 Aminosäuren des TAT-Proteins kodiert, umfasst, in die BamHI-Stelle des Vektors pHMG (Mehtali et al., Gene, 1990, 91, 179–184). Die Plasmid-DNAs, mit denen eine Transfektion ausgeführt werden muss, werden in 420 μl TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) wieder aufgenommen und mit 60 μl 2 M CaCl₂ gemischt. Man setzt die Mischung zu 480 μl 2 × HBS (280 mM NaCl; 50 mM HEPES, 1,5 mM Na₂HPO₄·2H₂O, mit NaOH auf pH 7,12 eingestellt) hinzu, indem man das Röhrchen leicht bewegt. Nach 15 min wird der Niederschlag tropfenweise auf die Zellen gegossen. Man wechselt das Medium 24 h nach der Transfektion, um den Überschuss von Niederschlag zu entfernen. Man analysiert die Zellextrakte 48 h nach den Transformationen, um die Expression des CAT-Gens auszuwerten.
Man sammelt die HeLa-Zellen durch Abkratzen in einem CAT-Puffer (150 mM Tris-HCl, pH 8; 60 mM KCl; 15 mM NaCl; 2 mM EDTA; 0,15 mM Spermin; 1 mM Dithiothreitol (DTT); 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)). Man führt drei Einfrier-Auftau-Zyklen in flüssigem Stickstoff, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C während 4 min aus. Man inkubiert das so erhaltene Lysat bei 65°C 10 min und man zentrifugiert bei 10000 Upm 10 min, um die Zellrückstände zu entfernen. Man gewinnt den Überstand, bei welchem man die Proteinkonzentration durch einen kolorimetrischen Biorad-Test bestimmt.
Man inkubiert 15 μl gegebenenfalls verdünnten und mit H₂O auf 800 μl aufgefüllten Zellextrakt und 200 μl Biorad-Reagens in H₂O 10 bis 60 min bei Umgebungstemperatur. Man bestimmt die Proteinkonzen tration durch Messung der optischen Dichte bei 595 nm bezogen auf einen Referenzbereich von Rinderserumalbumin.
Man bestimmt die Expression des CAT-Gens an einem Aliquot Extrakt, welches 10 bis 20 μg Proteinen entspricht. Man inkubiert das adäquate Volumen Zellextrakt, das vorab mit 0,25 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,8, auf 300 μl aufgefüllt worden ist, mit 32 μl 5 mM Acetyl-Coenzym A und 20 μl (0,5 μCi)¹⁴C-Chloramphenicol 1 h 30 bei 37°C. Nach der Extraktion mit Ethylacetat und Zentrifugation bei 10000 Upm während 5 min lyophilisiert man die obere Phase. Jene wird in 15 μl Ethylacetat wieder aufgenommen, auf eine Kieselgel 60F₂₃₄-Platte (Merck) aufgetragen und durch Dünnschichtchromatographie (Wanderung in einem Chloroform/Methanol 19/1-Puffer während 1 h 30) analysiert. Die Chromatographie wird durch Autoradiographie sichtbar gemacht und die dem acetylierten Chloramphenicol entsprechenden Banden werden ausgeschnitten. Der Radioaktivitätsgehalt wird durch Szintillationszählung ausgewertet. Der Prozentsatz von transaktivierender Aktivität der Mutante wird bezogen auf den bei der Vergleichsprobe (pHMG-Tat + LTR-CAT) gemessenen Wert, welcher 100% transaktivierende Aktivität repräsentiert, berechnet.
Man wertet die transdominante Aktivität der Variante TAT (Phe³⁸ → Asp) aus, indem man deren Vermögen, die transaktivierende Funktion des nativen TAT-Proteins zu hemmen, misst. Die transdominante Aktivität wird durch transitorische Transfektion von HeLa-Zellen mit dem Expressionsvektor pTG2332 mit dem LTR-CAT-Reportervektor und dem Expressionsvektor des nativen TAT-Proteins pHMG-Tat bestimmt. Man cotransfiziert mit 10 μg pTG2332, 1 μg pHMG-Tat und 0,5 μg LTR-CAT gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll.
48 h nach der Transfektion werden die Zellextrakte hergestellt und deren Proteinkonzentration bestimmt. Ein Aliquot Extrakt, welches 10 bis 20 μg Proteinen entspricht, wird dem CAT-Assay unterworfen. Die eingesetzten technischen Bedingungen wurden zuvor im Detail beschrieben. Der Prozentsatz von Inhibition des nativen TAT-Proteins durch die Variante TAT (Phe³⁸ → Asp) wird bezogen auf die positive Vergleichsprobe der Aktivierung, welche aus der Cotransfektion mit pHMG-Tat und LTR-CAT resultiert, welche 0% repräsentiert, berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben.
Die Variante TAT (Phe³⁸ → Asp) ist eine wirkungsvolle transdominante Mutante, denn die transaktivierende Aktivität, die sie zeigt, ist verschwindend klein (Expression des CAT-Gens ausgewertet zu 1,4% bezogen auf jene, die mit dem nativen TAT-Protein gemessen wird) und da diese die Aktivität des nativen TAT-Proteins stark hemmt (98% Inhibition in Gegenwart von pTG2332).
Man kann feststellen, dass die Variante TAT (Lys⁴¹ → Ala), die von Green et al. beschrieben worden ist und die nach den Autoren einen transdominanten Phänotyp aufweisen sollte, in diesen Experimenten ganz und gar entgegengesetzte Ergebnisse liefert. Tatsächlich weist diese eine besonders hohe transaktivierende Aktivität auf (172%) und scheint folglich in Kooperation mit dem nativen TAT-Protein zu wirken. Außerdem übt diese Variante keinerlei dominante Wirkung auf die native TAT-Funktion aus (0% transdominante Aktivität).
Die durch pTG2352 produzierte Variante ⎕TAT des Standes der Technik bildet gut eine Vergleichsprobe für die Transdominanz, was die Gültigkeit dieser Experimente bestätigt. Sie hemmt die transaktivierende Aktivität des nativen TAT-Proteins zu 92%. Indessen ist diese Variante in der Lage, eine Expression des CAT-Gens, welches unter die Kontrolle der LTR des HIV gestellt ist, zu induzieren (28%), wobei die Transaktivierung gleichwohl geringer als jene ist, die bei der positiven Vergleichsprobe pHMG-Tat gemessen wird.
BEISPIEL 2: Konstruktion des Expressionsvektors pTG2333 Expression der Variante TAT (Thr⁴⁰ → Ala) und Charakterisierung des Transdominanz-Phänotyps.
Der Vektor M13TG2306 wird einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen, um das den Threoninrest (Thr) an Position 40 des TAT-Proteins des HIV kodierende Codon durch ein Codon, welches einen Ala-ninrest (Ala) kodiert, zu ersetzen und stumme Mutationen einzuführen derart, dass eine HindIII-Restriktionsstelle auf der Höhe des den Rest 42 kodierenden Codons erzeugt wird, welche eine schnelle Identifizierung der mutierten Vektoren erlaubt. Das eingesetzte Oligonukleotid ist in der SEQ ID NO: 4 beschrieben. Das mutierte tat-Gen wird in den Vektor pSG5 transferiert, was pTG2333 ergibt, welches erlaubt, die Variante TAT (Thr⁴⁰ → Ala) zu produzieren.
HeLa-Zellen werden transitorisch mit dem Vektor pTG2333 und dem Vektor LTR-CAT cotransfiziert, um die transaktivierende Aktivität der Variante TAT (Thr⁴⁰ → Ala) gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll zu bestimmen. Parallel dazu wird deren transdominante Aktivität durch Cotransfektion mit pTG2333, pHMG-Tat und LTR-CAT in einem Konzentrationsverhältnis von 10:1:0,5 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Man kann feststellen, dass die Variante TAT (Thr⁴⁰ → Ala) einen transdominanten Phänotyp aufweist, wie gemäß der Erfindung definiert. Sie hemmt die Funktion des nativen TAT-Proteins um 83% und sie bewahrt eine geringe transaktivierende Aktivität von 15,6%.
BEISPIEL 3: Konstruktion des Expressionsvektors pTG2340, Expression der Variante TAT (Lys⁴¹ → Glu) und Charakterisierung des Transdominanz-Phänotyps.
Der Vektor M13TG2306 wird einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen, um das den Lysinrest (Lys) an Position 41 des TAT-Proteins des HIV kodierende Codon durch ein Codon, welches einen Glutaminsäurerest (Glu) kodiert, zu ersetzen und stumme Mutationen einzuführen derart, dass eine HindIII-Restriktionsstelle auf der Höhe des den Rest 42 kodierenden Codons erzeugt wird, welche eine schnelle Identifizierung der mutierten Vektoren erlaubt. Das eingesetzte Oligonukleotid ist in der SEQ ID NO: 5 beschrieben. Das mutierte tat-Gen wird in den Vektor pSG5 transferiert, was pTG2340 ergibt, welches erlaubt, die Variante TAT (Lys⁴¹ → Glu) zu produzieren.
HeLa-Zellen werden transitorisch mit dem Vektor pTG2340 und dem Vektor LTR-CAT cotransfiziert, um die transaktivierende Aktivität der Variante TAT (Lys⁴¹ → Glu) gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll zu bestimmen. Parallel dazu wird deren transdominante Aktivität durch Cotransfektion mit pTG2340, pHMG-Tat und LTR-CAT in einem Konzentrationsverhältnis von 10:1:0,5 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Man kann feststellen, dass die Variante TAT (Lys⁴¹ → Glu) einen transdominanten Phänotyp aufweist, wie gemäß der Erfindung definiert. Die transaktivierende Aktivität der Variante ist gering (3% der durch das native TAT-Protein verliehenen Aktivität) und sie ist in der Lage, die transaktivierende Funktion des nativen TAT-Proteins wirksam zu hemmen (Hemmung um 97%).
Man kann festhalten, dass die durch pTG2340 produzierte Variante TAT (Lys⁴¹ → Glu) und die Variante TAT (Lys⁴¹ → Ala) des Standes der Technik, die sich wie das native TAT-Protein verhält, an dem gleichen Rest mutiert sind. Je nach der ausgeführten Modifizierung kann folglich der Phänotyp der erhaltenen Variante vollständig unterschiedlich sein. So verleiht die Ersetzung des Lys⁴¹ durch ein Glu, wie von der Anmelderin offenbart, der erzeugten Variante einen transdominanten Phänotyp.
BEISPIEL 4: Konstruktion des Expressionsvektors pTG2358, Expression der Variante TAT (Ile⁴⁵ → Ser) und Charakterisierung des Transdominanz-Phänotyps.
Der Vektor M13TG2306 wird einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen, um das den Isoleucinrest (Ile) an Position 45 des TAT-Proteins des HIV kodierende Codon durch ein Codon, welches einen Serinrest (Ser) kodiert, zu ersetzen und um eine BamHI-Restriktionsstelle auf der Höhe des den Rest 45 kodierenden Codons zu erzeugen, welche eine schnelle Identifizierung der mutierten Vektoren erlaubt. Das eingesetzte Oligonukleotid ist in der SEQ ID NO: 6 beschrieben. Das mutierte tat-Gen wird in den Vektor pSG5 transferiert, was pTG2358 ergibt, welches erlaubt, die Variante TAT (Ile⁴⁵ → Ser) zu produzieren.
HeLa-Zellen werden transitorisch mit dem Vektor pTG2358 und dem Vektor LTR-CAT cotransfiziert, um die transaktivierende Aktivität der Variante TAT (Ile⁴⁵ → Ser) gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll zu bestimmen. Parallel dazu wird deren transdominante Aktivität durch Cotransfektion mit pTG2358, pHMG-Tat und LTR-CAT in einem Konzentrationsverhältnis von 10:1:0,5 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Man kann feststellen, dass die Variante TAT (Ile⁴⁵ → Ser) einen transdominanten Phänotyp aufweist, wie gemäß der Erfindung definiert. Sie hemmt die Funktion des nativen TAT-Proteins partiell um 62,5% und sie bewahrt eine moderate transaktivierende Aktivität von 47%.
BEISPIEL 5: Konstruktion des Expressionsvektors pTG2348, Expression der Variante TAT (Tyr⁴⁷ → Arg) und Charakterisierung des Transdominanz-Phänotyps.
Der Vektor M13TG2306 wird einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen, um das den Tyrosinrest (Tyr) an Position 47 des TAT-Proteins des HIV kodierende Codon durch ein Codon, welches einen Argininrest (Arg) kodiert, zu ersetzen und um eine XbaI-Restriktionsstelle auf der Höhe des den Rest 47 kodierenden Codons zu erzeugen, welche eine schnelle Identifizierung der mutierten Vektoren erlaubt. Das eingesetzte Oligonukleotid ist in der SEQ ID NO: 7 beschrieben. Das mutierte tat-Gen wird in den Vektor pSG5 transferiert, was pTG2348 ergibt, welches erlaubt, die Variante TAT (Tyr⁴⁷ → Arg) zu produzieren.
HeLa-Zellen werden transitorisch mit dem Vektor pTG2348 und dem Vektor LTR-CAT cotransfiziert, um die transaktivierende Aktivität der Variante TAT (Tyr⁴⁷ → Arg) gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll zu bestimmen. Parallel dazu wird deren transdominante Aktivität durch Cotransfektion mit pTG2348, pHMG-Tat und LTR-CAT in einem Konzentrationsverhältnis von 10:1:0,5 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Man kann feststellen, dass die Variante TAT (Tyr⁴⁷ → Arg) einen moderaten transdominanten Phänotyp aufweist, wie gemäß der Erfindung definiert. Sie hemmt die Funktion des nativen TAT-Proteins um 78% und sie bewahrt eine transaktivierende Aktivität von 56%.
BEISPIEL 6: Etablierung von stabilen Zelllinien, welche eine transdominante TAT-Variante exprimieren, und Auswertung von deren Widerstandsfähigkeit gegen die Infektion durch das HIV-Virus.
Es wurden stabile Zelllinien, die die transdominante Variante TAT (Phe³⁸ → Asp) produzieren, etabliert, um die Wirksamkeit der Varianten für eine etwaige Verwendung in vivo, beispielsweise in einem Gentherapieprotokoll, zu validieren. Um die Widerstandsfähigkeit der Zellen gegenüber einer Infektion durch das HIV auszuwerten, ist es erforderlich, dass diese durch das Virus infizierbar sind, d.h. dass sie den humanen CD4-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Es wurden zwei Arten von Zelllinien etabliert:

– die von den humanen T-Zellen abgeleiteten CEM-A3-Zellen (ATCC CCL119) weisen den CD4-Rezeptor auf und sind folglich von Natur aus durch das HIV infizierbar,
– die HeLa-Zellen (ATCC CCL2), die mit einem ubiquitären Expressionsvektor des humanen CD4-Rezeptors, pTG620, cotransfiziert sind, um diesen eine Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion durch das HIV zu verleihen. Der Vektor pTG620 geht aus der Einführung eines durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E. coli behandelten EcoRI-Fragments, welches die cDNA des humanen CD4-Rezeptors umfasst (Maddon et al., Cell, 1986, 47, 333–348), in die EcoRV-Stelle des Vektors pHMG hervor.

Das BamHI-Fragment, welches das die transdominante Variante TAT (Phe³⁸ → Asp) kodierende Gen umfasst, wird in die BamHI-Stelle des retroviralen Vektors pLXSP inseriert (5), wodurch pTG2350 erzeugt wird. Der Vektor pLXSP leitet sich von pLXSN (Miller und Rossman, Biotechniques, 7, 1989, 980–988) ab und geht aus der Ersetzung des Neomycingens durch ein Gen, welches eine Resistenz gegen Puromycin verleiht, und der 3'-LTR des MSV durch jene des MPSV hervor.
Die Plasmid-DNA von pTG2350 wird in die CEM-A3-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Man nimmt 20 μg auf einem Cäsiumchloridgradienten gereinigte DNA in 20 μl PBS-Puffer (1 mM KH₂PO₄; 2 mM KCl; 136 mM NaCl, 3 mM Na₂HPO₄) wieder auf. Man mischt die DNA-Präparation mit 2 × 10⁷ Zellen, die in 180 μl PBS in einem Elektroporationsgefäß (Biorad) resuspendiert worden sind. Man inkubiert bei Umgebungstemperatur 10 min vor. Nach der Elektroporation (Gene pulser Biorad, Spannung 210 V, Kapazität 960 μF) hält man die Zellen 10 min bei Umgebungstemperatur und man inkubiert sie bei 37°C in 6 ml RPMI (Gibco-BRL) in Gegenwart von 5% CO₂. Man isoliert die gegen Puromycin resistenten CEM-A3-Klone durch Grenzwertverdünnung (Puromycin 0,5 μg/ml).
HeLa-Zellen werden durch die pTG2350-Plasmid-DNA und pTG620 durch die zuvor beschriebene Calciumphosphat-Transfektionstechnik cotransfiziert. Man isoliert die Klone von gegen Puromycin resistenten HeLa-Zellen durch aufeinanderfolgende Repickierungen (Puromycin 2 μg/ml). Man analysiert die Expression des humanen CD4-Rezeptors auf der Oberfläche der Zellen durch Fluorozytometrie (FACS; Fluorescence Activated Cell Sorter, Scan Becton Dickinson) mit Hilfe des mit Phycoerythrin markierten Antikörpers Leu3A, der gegen diesen Rezeptor gerichtet ist (Becton Dickinson).
Man detektiert die Expression des TAT-Proteins in der Zelllinie CEM-A3 unter Ausführung von transitorischen Transfektionen mit den Vektoren LTR-CAT und pHMG-TAT gemäß der zuvor beschriebenen Technik.
Drei Klone, die aus der Zelllinie CEM-A3 hervorgehen, die gegen Puromycin resistent sind und die transdominante TAT-Variante exprimieren und bei welchen verschiedene Inhibitionsgrade des nativen TAT-Proteins beobachtet worden sind, werden durch das HIV-Virus infiziert. Die Vermehrung des Virus kann ausgewertet werden durch Messung der reverse Transkriptase-Aktivität in den Kulturüberständen. So konnte eine Verschiebung der Virusvermehrung um 2 Tage in einem der Klone der CEM-A3-Zelllinie, welche die transdominante Variante exprimiert, bezogen auf das Ergebnis, welches in den CEM-A3-Zellen, die keine transdominante Variante exprimieren, erhalten wird, detektiert werden. Darüber hinaus ist die reverse Transkriptase-Aktivität in diesem Klon um 90% verringert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Trans-dominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus oder von einem funktionalen Fragment dieses Proteins, welche in der Lage ist, eine Transaktivierung der Expression von einem oder mehreren Gen(en), welches bzw. welche unter die Kontrolle eines die TAR-Sequenz umfassenden Promotors gestellt ist bzw. sind, zu induzieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Variante eine Mutation umfasst, welche ausgewählt wird unter den Mutationen, welche aus dem Vorhandensein eines Rests mit einer sauren Seitenkette, wie einer Glutaminsäure oder einer Asparaginsäure, an Position 38 bestehen.
Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Variante von dem TAT-Protein von HIV1 abgeleitet ist.
Variante nach den Ansprüchen 1 bis 2, welche eine Asparaginsäure an Position 38 umfasst.
DNA-Fragment, welches eine Variante des TAT-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Expressionskassette, welche ein DNA-Fragment nach Anspruch 4, welches unter die Kontrolle von geeigneten Elementen, welche dessen Expression erlauben, gestellt ist, umfasst.
Eukaryotische oder prokaryotische Zelle, welche eine Expressionskassette nach Anspruch 5 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gemäß welchem: – man eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle nach Anspruch 6 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und – man die produzierte Variante ausgehend von dem Kulturmedium oder der Zelle gewinnt.
Variante des TAT-Proteins, welche durch das Ausführen eines Verfahrens nach Anspruch 7 erhalten wird.
Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 3, Expressionskassette nach Anspruch 5 oder Zelle nach Anspruch 6 für deren Verwendung als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche für die Behandlung oder die Verhütung einer HIV-Infektion bestimmt ist, welche als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel eine Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eine Expressionskassette nach Anspruch 5 oder eine Zelle nach Anspruch 6 umfasst.
Verwendung einer Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einer Expressionskassette nach Anspruch 5 oder einer Zelle nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches dazu bestimmt ist, die Replikation des HIV-Virus zu hemmen.