JPH06234791A - ヒト免疫不全ウィルスの新規トランスドミナントｔａｔ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ＨＩＶウイルスＴＡＴ蛋白質または少なくとも
１つの突然変異を含む該蛋白質の機能性フラグメントの
トランスドミナント変異体であって、該突然変異が３８
位、４０位、４１位、４５位または４７位には、天然残
基と異なるアミノ酸残基が存在し、４１位はアラニンま
たはスレオニンと異なり、４７位はアラニンまたはヒス
チジンと異なることを特徴とする変異体、該変異体の製
造方法及び害変異体を有効成分とするＨＩＶ感染の治療
または予防用の薬学的組成物。 【効果】ＨＩＶ感染の治療または予防を行えるようにな
った。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）のＴＡＴ蛋白の新規な変異体、ならびにこの
変異体をコードするＤＮＡフラグメント、組換え経路に
よりその発現を可能とする発現カセットおよびこの発現
カセットを含む細胞に関する。ＴＡＴ蛋白変異体、カセ
ットおよび細胞は、ＨＩＶ感染の予防或いは治療に特に
有用である。

【０００２】

【従来技術とその問題点】後天性免疫不全症候群（エイ
ズ）は、ＨＩＶウイルスによる個体のＴ４リンパ球の感
染に引き続いて、進行する。感染後も、多年に亘り無症
候性である場合もあるが、細胞が活性化されると直ち
に、ＨＩＶウイルスは、急速に複製を開始し、細胞を破
壊する。エイズは、日和見感染症に対して感染者を特に
鋭敏にさせる効果を有する細胞性免疫の欠陥により特徴
付けられる。ＷＨＯは、１９９２年７月に世界中で５０
１２７２件のエイズの症例を記録している（「後天性免
疫不全症候群とそれに関連するレトロウイルス類につい
てのＡＩＤＳ国際文献」、Ａ．Ｗ．ボイルストン編、１
９９２、８、リーズ ユニバーシティー プレス、リー
ズ）。しかしながら、幾つかのアフリカ諸国において
は、この病気は、真の流行病となっているので、これら
の数値は、実際の値よりも低い。

【０００３】エイズは、１９９２年においても、その死
亡率が非常に高い病気である。実際、エイズの発病から
２年以内に、９０％以上のヒトが死亡する。これまでに
も、多大の努力が払われてきたにも拘らず、完全に満足
すべきことが証明された治療法は存在しない。効果的な
治療法の開発は、ＨＩＶウイルスの特異的な複雑さの故
に、妨げられてきた。ＨＩＶは、レンチウイルス科に属
するレトロウイルスの一種である。他のレトロウイルス
と同様に、ＨＩＶは、蛋白性のカプシドを囲むエンベロ
ープにより構成されており、カプシドは、複製サイクル
の最初の段階で必要とされる種々のウイルス蛋白と結合
したＲＮＡ分子からなる遺伝材料を含んでいる。

【０００４】Ｔリンパ球の感染後、ＲＮＡ分子は、ウイ
ルスの逆転写酵素によりコピーされ、ＤＮＡとなる。Ｄ
ＮＡは、細胞ゲノム内に組み込まれ、通常プロウイルス
と呼ばれるものを形成する。プロウイルス性のＤＮＡ
は、潜伏状態でそこにとどまり続けることもできるし、
或いは細胞の機構によりＲＮＡに転写されて、一方では
ウイルスのゲノムＲＮＡを形成し、他方ではウイルス蛋
白に翻訳されるべきメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を形成する。新しいウイルス粒子、即ちビリオンの形成
は、ウイルスのゲノムＲＮＡのカプシド内への包み込み
により、生ずる。この様にして形成された粒子は、ウイ
ルスエンベロープグリコプロテインが組み込まれる細胞
膜の一部で発生する破れ（ｂｕｄｄｉｎｇ）により、細
胞から分離する。この様にして放出されたビリオンは、
Ｔ４リンパ球の表面で発現されるＣＤ４レセプターとＨ
ＩＶエンベロープ蛋白との特異的で且つ相互的な認識に
より、他のリンパ球に感染することができる。

【０００５】図１に示す様に、一般にＨＩＶゲノムは、
以下の構成を備えている： −３つの構造遺伝子；カプシド、エンベロープおよび逆
転写酵素蛋白をそれぞれコードするｇａｇ、ｐｏｌおよ
びｅｎｖ、 −少なくとも６つの遺伝子；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、
ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ。これらは、いまだ僅かに
しか判明していないものもある制御機能を恐らく有して
いる蛋白をコードしている、および −シス−制御配列（ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ）。これは、転写のために必須であ
り、ＬＴＲｓ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅ
ａｔ）のレベルでプロウイルスＤＮＡの５′末端および
３′末端の両方に局在する。５′末端のＬＴＲは、転写
の開始に必要なプロモーター配列と制御エレメントとを
含むのに対し、３′末端のＬＴＲは、転写の停止に関与
する。さらに、ウイルス遺伝子の転写は、特にウイルス
蛋白ＴＡＴおよびＲＥＶによりコントロールされる複合
制御の対象となる。ＴＡＴ蛋白は、ウイルスサイクルの
初期段階で発現される制御蛋白である。その作用部位
は、核である。その役割は、全てのＨＩＶ蛋白をコード
する遺伝子の発現をトランス活性化すること（ｔｒａｎ
ｓａｃｉｔｉｖａｔｉｎｇ）にある。ＴＡＴ蛋白は、ウ
イルスゲノムの短鎖ヌクレオチド配列と特異的に相互作
用する。即ち、ＴＡＲ（トランス活性化反応性部位（Ｔ
ｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖ
ｅ Ｒｅｇｉｏｎ））配列は、５′末端のＬＴＲの−１
７と＋８０ヌクレオチド（ｎｔ）の間でＨＩＶゲノムの
５′末端に局地的に存在する。従って、この配列は、全
てのウイルスｍＲＮＡにおいて部分的に存在する。ＴＡ
Ｔ−ＴＡＲコンプレックスは、恐らく他の細胞性因子
（ｃｅｌｌｕｌａｒｆａｃｔｏｒｓ）とともにウイルス
遺伝子の転写に有利に働き、この様にして得られたｍＲ
ＮＡを安定化させ、これらのｍＲＮＡの蛋白への翻訳を
改善するものと推測される。かくしてウイルスは、ｔａ
ｔ遺伝子が活性化されるや否や、急速に増殖する。

【０００６】ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチル
・トランスフェラーゼ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏ
ｌ Ａｃｅｔｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子の
様な、その発現を容易に測定できる指標遺伝子（ｉｎｄ
ｉｃａｔｏｒ ｇｅｎｅ）を使用して、ＴＡＴ蛋白質に
より誘導されるトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｉｔｉ
ｖａｔｉｏｎ）の効果をインビトロで評価することは、
可能であった。ＴＡＲ配列を含むＨＩＶウイルスの５′
ＬＴＲの制御下に置かれたＣＡＴ遺伝子が、トランスフ
ェクションにより、動物細胞内に導入された。ＴＡＴを
発現しない細胞、例えば、ＨＩＶウイルスにより感染さ
れていない細胞においては、ウイルスプロモーターから
のＣＡＴ遺伝子の転写は、ブロックされるか最小限にま
で減少するので、ＣＡＴ遺伝子生成物は全く或いは殆ど
検知されない。これに対し、ＴＡＴ蛋白の存在下では、
細胞の種類にもよるが、１００〜１０００というファク
ターでの遺伝子発現の増大が観察された。この結果は、
翻訳の効率の改善と関連する転与の促進によるものであ
る。ＨＩＶトランス活性化遺伝子（ｔａｔ）は、２つの
コード化エクソンを有している。第１のエクソンは、ゲ
ノムの中心領域で、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を
コードする配列間に位置しており、蛋白の大部分、即
ち、Ｎ末端の７２個のアミノ酸をコードしている。Ｃ末
端の１４個のアミノ酸のみをコードする第２のエクソン
は、生物学的活性のためには、必須ではない。

【０００７】ＴＡＴ蛋白の構造は、その機能が示唆して
いる。ＴＡＴ蛋白は、ウイルス遺伝子の転写の活性化を
可能とする、活性化ドメインと呼ばれる少なくとも１つ
のドメイン、ＴＡＲヌクレオチド配列に結合する１つの
ドメイン、そのターゲット配列、およびその核局在化
（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を可能
とする１つのドメインをを備えている。多くの研究によ
れば、ＴＡＴ蛋白は、以下の５つのドメインを備えてい
る（図２参照）： −第１のドメイン（アミノ酸１〜３７）は、システイン
に富む配列を有しているが、その機能は未だ不明であ
る。幾つかの研究は、この領域が、蛋白の折りたたみお
よびＴＡＴ分子のダイマー化に関与しており、プロテア
ーゼに対して蛋白を保護しているものと考えれることを
示唆している。 −第１の活性化ドメインに対応するアミノ酸３８〜４８
からなるドメイン。 −アミノ酸４９〜５７からなるドメインは、核局在化お
よびＴＡＲエレメントへの結合のための配列を有してい
る。 −アミノ酸５８〜７２からなるドメインは、第２のＴＡ
Ｔ活性化ドメインに対応する。 −アミノ酸７３〜８６からなるドメインは、ＴＡＴ活性
には必須ではない。 多くのＨＩＶ関連レトロウイルスは、ＬＴＲからのウイ
ルス遺伝子の転写を活性化し得る蛋白をコード化するト
ランス活性化遺伝子を有する。過去数年間に、異なるタ
イプのウイルスから得られたこれらのトランス活性化蛋
白の種々の変異体が発表されている。それらの中には、
ネガティブおよびドミナント変異体（ｎｅｇａｔｉｖｅ
ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ）があ
り（ワックスマンら、サイエンス、１９８７，２３５，
６７４−６７７；フリードマンら、ネイチャー、１９８
８，３３５，４５２−４５４）、これらを以後トランス
ドミナント変異体という。

【０００８】トランスドミナント変異体は、以下の様に
定義されている。即ち、ウイルスプロモーターの制御下
におかれた遺伝子の発現の活性化を誘導する能力の低下
（低下したトランス活性化作用）を呈するが、このプロ
モーターのレベルにおかれたそのターゲット配列を認識
する能力を有しているので、野生型（ｎａｔｉｖｅ）ト
ランス活性化蛋白の機能を拮抗的に抑制することができ
るものである。これらの変異体は、野生型蛋白の機能に
ドミナント的に（ｉｎ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｎ
ｎｅｒ）干渉するので、感染した細胞の「細胞内免疫化
（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉ
ｏｎ）」を促進し得る新たな種類の抗ウイルス剤となり
得る。一般にいえば、この技術は、細胞に特異的な利点
を付与する蛋白または核酸を合成させる様に、細胞を遺
伝学的に改良することにある。例えば、ディー・ボルチ
モアー（ネイチャー、１９８８，３３５，３９５−３９
６）により定義されている様に、ＨＩＶウイルスの様な
特定のウイルスによる感染に対する抵抗性を付与するこ
とである。

【０００９】かくして、グリーンら（セル、１９８９，
５８，２１５−２３３）は、ＨＩＶウイルスＴＡＴ蛋白
の第１の活性化ドメインにおいて修飾されたトランスド
ミナント変異体を生成させている。グリーンらは、ＴＡ
Ｔ蛋白のペプチドフラグメントから得られた４つの変異
体を開示している。これらの２つ、即ち、変異体ＴＡＴ
（Ｌｙｓ^４１−＞Ａｌａ）およびＴＡＴ（Ｔｙｒ^４７−
＞Ａｌａ）は、有効なトランスドミナントであるである
と述べられ、他の２つ、即ち、変異体ＴＡＴ（Ｓｅｒ
^４６−＞Ａｌａ）および二重変異体ＴＡＴ（Ｓｅ
ｒ^４６、Ｔｙｒ^４７−＞Ａｌａ、Ａｌａ）は、温和なト
ランスドミナント（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｒａｎｓｄｏ
ｍｉｎａｎｔｓ）であると述べられている。それにも拘
らず、上記の文献に記載された変異体には、疑問が投げ
掛けられている様である（フランケルら、プロシージャ
ー オブ ナショナル アカデミーオブ サイエンス
ユーエスエー、１９８９，８６，７３９７−７４０
１）。本発明者も、変異体（Ｌｙｓ^４１−＞Ａｌａ）に
ついて得られた結果を再現しようと試みたが、下記に示
すように、不成功に終わった。さらに、ピアソンら（プ
ロシージャー オブ ナショナル アカデミー オブサ
イエンス ユーエスエー、１９９０，８７．５０７９−
５０８３）は、トランスドミナント表現型の形成に際し
てのアミノ酸４８〜５４からなる領域の重要性を示して
いる。事実、５４位においてグルタミン（Ｇｌｎ）をコ
ードするコドンをストップコドンで置換することによ
り、その様な表現型を示す先端を切断された（ｔｒｕｎ
ｃａｔｅｄ）ΔＴＡＴ変異体が得られる。

【００１０】現在、トランスドミナント表現型を示し且
つ活性化ドメインの或る残基にレベルで修飾された、Ｈ
ＩＶ ＴＡＴ蛋白の新しい変異体が見出されている。こ
れらの変異体は、より低いトランス活性化作用を示し、
且つ天然のＴＡＴ蛋白の機能に支配的に関与するので、
抗エイズ治療の枠組みにおいて、極めて有用である。こ
れらの新変異体は、ＨＩＶウイルスの複製および伝播を
抑制するに効果的な抗ウイルス剤となり得るものであ
る。事実、これらのトランスドミナント変異体の作用
は、ウイルスが新しいウイルス粒子の形成に必要な蛋白
とＲＮＡとを合成することができる以前においてさえ
も、初めの感染サイクルから生じていると考えられる。
従って、本発明の課題は、少なくとも１つの変異を含む
ＨＩＶウイルス ＴＡＴ蛋白またはこの蛋白の機能性フ
ラグメントのトランスドミナント変異体を提供すること
にある；この変異は、３８位、４０位、４１位、４５位
及び４７位で天然の残基と異なるアミノ酸残基の存在に
より特徴付けられる。しかしながら、該条件において、
４１位のアミノ酸はアラニンまたはスレオニンとは異な
り、４７位はアラニンまたはヒスチジンとは異なる。一
般に、ウエイン−ホブソンら（セル、１９８５，４０，
９−１７）により開示されているように、ＨＩＶ１ウイ
ルスＬａｉ単離体（ＨＩＶ１ ｖｉｒｕｓＬａｉ ｉｓ
ｏｌａｔｅ）のＴＡＴ蛋白の配列に基づくＴＡＴ蛋白の
変異体の配列を記載することが認められている。

【００１１】ＴＡＴ蛋白およびＴＡＴ蛋白をコードする
ＤＮＡフラグメントは、最初にウイルス株ＨＩＶ１ Ｌ
ａｉ単離体から記載された。しかしながら、ウイルス株
及びウイルス単離体は、多数存在する同一の株の中で記
載された。さらに、特定のウイルスはその増殖中に変異
可能である。結果として、ＴＡＴ蛋白をコードするＤＮ
Ａフラグメントは、ウイルスによって異なるヌクレオチ
ド配列を有するかもしれない。同様に、ＴＡＴ蛋白は、
ウイルスによって異なるアミノ酸配列を有するかもしれ
ない。しかしながら、共通の標準は、ウイルスゲノムの
５´ＬＴＲ中に含まれるＨＩＶウイルスプロモーターの
ようなＴＡＲ標的配列を含むプロモーターの制御下に置
かれた遺伝子の発現をトランス活性化する蛋白質の機能
である。ＨＩＶ ＴＡＴ蛋白は、ＨＩＶ１ウイルスＬａ
ｉ単離体のＴＡＴ蛋白により発現されるのと実質的に同
一のトランス活性化の結果を与える全ての蛋白であると
理解される。実際に、ＴＡＴ蛋白の変異体の配列は、Ｈ
ＩＶ１ウイルスＴＡＴ蛋白の変異体の配列と整列させ
る。ＴＡＴ蛋白の変異体の配列におけるアミノ酸の番号
付けは、それゆえＨＩＶ１ウイルスＴＡＴ蛋白で確立さ
れた配列に基づくであろう。例えば、ＴＡＴ蛋白の変異
体の配列における４１位のアミノ酸残基は、実際、整列
後のＨＩＶ１ウイルスの天然のＴＡＴ蛋白の配列の４１
位に相当するアミノ酸である。

【００１２】より詳細には、本発明のＴＡＴ蛋白変異体
は、トランス活性化作用が天然型ＴＡＴ蛋白の約５０％
以下、有利には２０％以下、好ましくは１０％以下であ
り、変異体／天然型ＴＡＴが１０／１の濃度比で測定さ
れたものとして、天然型ＴＡＴ機能阻害活性が、５０％
以上、有利には７５％以上、好ましくは９０％以上であ
ることで特徴付けられるトランスドミナント表現型を示
す。トランス活性化作用を測定する種々の方法が現在知
られている。それらは使用されるリポーター遺伝子によ
り変化するが、以下の実施例に記載される、ＨＩＶウイ
ルスの５´ＬＴＲの制御下におかれたＣＡＴ遺伝子を用
いる方法が挙げられる。本発明のＴＡＴ蛋白変異体は、
該蛋白の機能性フラグメントから得ることもでき、上記
に記載されたような残基のレベルで変異することもで
き、アミノ酸の番号付けは対照のＨＩＶ１ウイルスの天
然のＴＡＴ蛋白で確立されたものと整列させる。ＴＡＴ
蛋白の機能性フラグメントは、ＨＩＶウイルスプロモー
ターのようなＴＡＲ配列を含むプロモーターの制御下に
置かれた遺伝子の発現のトランス活性化を誘導すること
のできる前記蛋白の全てのフラグメントとして理解され
る。例えば、本発明のＴＡＴ蛋白変異体は、アミノ酸１
位から始まりアミノ酸７２位で終わるフラグメントのよ
うなＴＡＴ蛋白のフラグメントの突然変異後に製造でき
る。

【００１３】本願に従うＴＡＴタンパク質の変異体は、
ＨＩＶの天然のＴＡＴタンパク質と比べて、幾つかの突
然変異を含み得る。それは、上述のように、少なくとも
２個の突然変異の組合せを含み得る。より詳細には、本
願に従うＴＡＴタンパク質変異体は、特に、ＨＩＶ１の
天然のＴＡＴ配列との相同性の程度が、７５％より多
く、有利には９０％より多く、好ましくは９５％より多
い配列を有する。無論、突然変異されるべき残基は、ア
ルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイ
ン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジ
ン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルア
ラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン
およびバリンで置換され得る４１位の残基、およびアル
ギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、
グリシン、グルタミン酸、グルタミン、イソロイシン、
ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プ
ロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンおよびバ
リンで置換され得る４７位の残基を除き、天然の残基以
外のあらゆるアミノ酸残基で置換されることができる。

【００１４】本願の特に有利な局面に従うと、ＴＡＴの
変異体は、以下のものから選択される。 （１）３８位に、酸性の側鎖を有するアミノ酸、例えば
グルタミン酸、アスパラギン酸、好ましくはアスパラギ
ン酸を含む変異体、（２）４０位に、非極性側鎖を有す
るアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、
トリプトファン、好ましくはアラニンを含む変異体、
（３）４１位に、酸性の側鎖を有するアミノ酸、例えば
グルタミン酸、アスパラギン酸、好ましくはグルタミン
酸を含む変異体、（４）４５位に、非荷電極性側鎖を有
するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタ
ミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、ま
たは好ましくはセリンを含む変異体、（５）４７位に、
塩基性の側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギ
ニン、ヒスチジンまたは好ましくは、アルギニンを含む
変異体、（６）５９位に、非荷電極性側鎖を有するアミ
ノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、シ
ステイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ま
しくは、グリシンを含む変異体、（７）６０位に、非極
性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファンまたは好ましくは、トリプ
トファンを含む変異体、（８）６１位に、塩基性の側鎖
を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチ
ジンまたは好ましくは、アルギニンを含む変異体、
（９）６２位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリ
ン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンま
たは好ましくは、アラニンを含む変異体、（１０）６３
位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、
スレオニン、チロシン、または好ましくは、セリンを含
む変異体、

【００１５】（１１）６４位に、非極性側鎖を有するア
ミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリ
プトファンまたは好ましくは、ロイシンを含む変異体、
（１２）６５位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例え
ばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリ
ン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンま
たは好ましくは、ロイシンを含む変異体、（１３）６６
位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、
スレオニン、チロシン、または好ましくは、チロシンを
含む変異体、（１４）６７位に、塩基性の側鎖を有する
アミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジンまた
は好ましくは、アルギニンを含む変異体、（１５）６８
位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、
スレオニン、チロシン、または好ましくは、アスパラギ
ンを含む変異体、（１６）６９位に、塩基性の側鎖を有
するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン
または好ましくは、アルギニンを含む変異体、（１７）
７０位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグ
リシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリ
ン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、グルタ
ミンを含む変異体、（１８）７１位に、非荷電極性側鎖
を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グ
ルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシ
ン、または好ましくは、スレオニンを含む変異体、（１
９）７２位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、
フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンまたは
好ましくは、ロイシンを含む変異体。

【００１６】本願はまた、該ＴＡＴタンパク質変異体を
コードするＤＮＡフラグメントにも関する。ＴＡＴタン
パク質変異体をコードする配列は、慣用されている遺伝
子工学的技術、例えば、部位特異的突然変異誘発によっ
て得ることができる。従って、ＨＩＶの天然ＴＡＴタン
パク質または該配列の一部をコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメントが、Ｍ１３タイプのファージにクロー
ン化される。この配列は、所望の突然変異（１箇所また
は複数箇所）を得るために、適切なオリゴヌクレオチド
を使用して、改変される。本発明はまた、本発明に従う
ＴＡＴタンパク質変異体をコードするＤＮＡフラグメン
トを含む発現カセットをも包含し、該発現カセットは、
その発現を可能にする適切なエレメントの制御下に置か
れる。発現カセットは、異種の発現システム中でＴＡＴ
タンパク質変異体を合成することを可能にするために、
または代替的に、遺伝子治療に意図されるベクター、例
えばレトロウィルスあるいはアデノウィルスベクターの
エレメントとして、特に有用である。ＴＡＴタンパク質
変異体をコードするＤＮＡフラグメントの発現を可能に
する適切なエレメントとして、該ＤＮＡフラグメントの
ｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳
を可能にする全てのエレメントが包含される。

【００１７】これらのエレメントは、特に、適切なプロ
モーターを含む。本発明における用語「プロモーター」
は、保持される宿主細胞によるＤＮＡフラグメントの発
現に関連するあらゆる転写の制御用のエレメントを意味
する。そのような制御用エレメントは、当業者に周知で
あり、慣用されている遺伝子工学技術によって、発現カ
セット中に挿入される。保持されるプロモーターは、細
胞またはウィルス起源のものであって良い。プロモータ
ーは、ＤＮＡフラグメントの恒久的発現を可能にする遍
在性タイプのものであって良い。酵母中で機能するＰＧ
Ｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターまたは
ＳＶ４０ウィルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）
の後期プロモーター（ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、
ＨＭＧ（ヒドロキシ−メチル−グルタリル補酵素Ａリダ
クターゼ）遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスＩ型ウ
ィルス（ＨＳＶ１）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子
のプロモーター、動物細胞で機能するアデノウィルスの
ＥＩＩＩプロモーターおよびＭＬＰ（主要後期プロモー
ター（Ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ））、
並びにＭｏＭｕＬＶウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙマウスリ
ンパ白血病ウィルス）のＬＴＲなどが、そのようなプロ
モーターとして例示される。

【００１８】用語「プロモーター」はまた、調節可能な
タイプのプロモーター、例えば、リンパ球細胞に特異的
な免疫グロブリン遺伝子のプロモーターのような、組織
特異的プロモーターも含む。さらに、発現カセットは、
以下を含み得る。 （１）ＵＡＳ（上流活性化配列）、例えば酵母のＧＡＬ
４（ガラクトース）遺伝子のＵＡＳ、（２）プロモータ
ーの上流またはＤＮＡフラグメントの下流に設置され
得、発現レベルを増加させることが可能なエンハンサー
で、例えばヒトＣＤ２遺伝子のエンハンサー。さらに、
後者は、Ｔ型リンパ球細胞中のＤＮＡフラグメントの発
現を選択的に標的とすることが可能なエレメントを含
む、（３）高等な真核生物中での遺伝子発現を改善する
ものとして知られる介在配列、例えばＳＶ４０ウィルス
のイントロン、（４）タンパク質に翻訳されることを意
図して、ｍＲＮＡから介在配列を除去可能にする、例え
ばＳＶ４０ウィルスのもののような、スプライシングシ
グナル、 （５）転写の終結に関連するエレメント、例
えばＳＶ４０ウィルスのポリアデニル化シグナル。

【００１９】一般に、発現カセットは、宿主細胞の中
で、好ましくはリンパ球の中で、ＴＡＴタンパク質変異
体の発現を行わせることができる。発現カセットはま
た、ＴＡＴタンパク質変異体の、それが容易に回収され
得る培養培地においての産生を行わせることもできる。
この場合、ＤＮＡフラグメントは、宿主細胞から該変異
体の分泌を行わせるシグナルペプチドを成熟配列の上流
に含む、ＴＡＴタンパク質変異体の前駆体をコードして
いる。そのようなシグナルペプチドは、当業者に周知で
あり、例えば酵母のＭａｔアルファ因子のシグナル配列
である。発現カセットは、発現ベクターに挿入され、プ
ロモーターおよび適切なエレメントが機能する宿主細胞
を形質転換するのに使用される。そのようなベクター
は、プラスミドまたはウィルスベクターの形態で有り
得、例えばＭｏＭｕＬＶ由来のレトロウィルスベクター
またはアデノウィルス５型由来のアデノウィルスベクタ
ーである。本発明は、本発明に従う発現カセットを含む
細胞まで範囲が広がり、真核または原核起源の細胞に対
しても可能である。宿主細胞は、細菌、真菌、例えば酵
母、または哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、宿主
細胞は、造血系のヒト細胞である。

【００２０】本発明はまた、本発明に従うＴＡＴタンパ
ク質変異体の調製のための方法にも関する。それは、以
下の通りである。 （１）該変異体をコードするＤＮＡフラグメントを含
む、本発明に従う、真核または原核細胞が、適切な培養
培地で培養され、および（２）変異体は、培養培地また
は該細胞から回収される。本発明はまた、該方法を使用
して得られるＴＡＴタンパク質変異体をも包含する。本
発明はまた、ＨＩＶウィルスの複製を阻害するために、
本発明に従うＴＡＴタンパク質変異体、発現カセット、
または該変異体を産生する細胞を治療的に使用すること
にも範囲が広がる。好ましくは、本発明は、哺乳動物、
特にヒトにおける、ＡＩＤＳの治療または予防を意図し
た医薬生成物の生産のための、ＴＡＴタンパク質変異
体、発現カセット、該変異体を産生する細胞の使用に関
する。有利には、本発明に従う発現カセットまたは細胞
は、抗ＡＩＤＳ遺伝子治療の目的のために使用され得
る。発現カセットは、レトロウィルスのタイプのベクタ
ーに挿入され、該ベクターは、個体（好ましくは、ＨＩ
Ｖに感染している個体）の骨髄から採集される造血系の
幹細胞に導入される。

【００２１】このようにしてトランスフェクトされた幹
細胞は、ドナーに再注入される。それらは、分裂し、な
かんずくリンパ球に分化することができる。レトロウィ
ルスベクターを含むリンパ球は、ＴＡＴタンパク質のト
ランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）変異
体をコードする遺伝子を、長期間にわたって発現するレ
トロウィルスベクターを含み、該細胞をＨＩＶ感染に耐
性とさせる。本発明はまた、本発明に従う変異体、発現
カセットまたはそのような変異体を産生する細胞を治療
または予防剤として含む薬学的組成物にも関する。本発
明に従う薬学的組成物は、通常の使用における技術に従
って調製され得る。例えば、受容可能な担体、希釈剤ま
たはアジュバントが、治療的に有効な量の、治療または
予防剤と組み合わせられる。最後に、本発明は、本発明
に従うＴＡＴタンパク質変異体、発現カセットまたはそ
のような変異体を産生する細胞の、治療的に有効な量が
患者に投与される、治療方法に関する。

【００２２】

【実施例】実施例１：発現プラスミドｐＴＣ２３３２の構築、変異
ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→Ａｓｐ）の発現及びトランスドミ
ナント表現型の確認。 ＨＩＶ−Ｌａｉ単離体ゲノムのｔａｔ遺伝子の２エクソ
ンに対応するコピーＤＮＡを包含するＤＮＡフラグメン
ト（ヴアイン−ホブソン〔Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ〕
ら，セル〔Ｃｅｌｌ〕，１９８５，４０，９−１７；ゾ
ドロスキ〔Ｓｏｄｒｏｓｋｉ〕ら，サイエンス〔Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ〕，１９８５，２２９，７４−７７〕を修飾し
てイニシエーターＡＴＧの５´にＢａｍＨＩを形成し
た。さらに、ＢａｍＨＩ部位は、天然にｔａｔ遺伝子の
停止コドンの下流５３ｂｐに存在する。突然変異してい
ないｔａｔ遺伝子を包含する３００ｂｐのＢａｍＨＩフ
ラグメントを、ジーン クリーン キット〔Ｇｅｎｅ
Ｃｌｅａｎ ｋｉｔ〕（バイオ〔Ｂｉｏ〕 １０１，Ｉ
ｎｃ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ２２８４，ラ ジョラ〔ＬａＪ
ｏｌｌａ〕）を用いて精製し、ベクターＭ１３ＴＧ１３
０に導入して（キニー〔Ｋｉｅｎｙ〕ら，ジーン〔Ｇｅ
ｎｅ〕，１９８３，２６，９１−９９）ベクターＭ１３
ＴＧ２３０６を得た。該ベクター上で突然変異誘発を行
う。Ｍ１３ＴＧ２３０６における残基３８をコードする
コドンの突然変異には、アメルシャム キット〔Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ ｋｉｔ〕（インビトロでの突然変異誘発シ
ステム バージョン〔ｖｅｒｓｉｏｎ〕２．１ ＲＰＮ
１５２３に関与するオリゴヌクレオチド）を使用し、
該オリゴヌクレオチドは配列番号１に記載する。

【００２３】オリゴヌクレオチドを設計して、３８位の
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基をコードするコドンを
アスパラギン酸（Ａｓｐ）で置換し、また、コードする
アミノ酸を修飾することなくＴＡＴ配列の４２位の残基
をコードするコドンのレベルでＨｉｎｄＩＩＩの制限部
位を形成した。制限部位の存在により、マニアティス
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ〕ら（モレキュラー クローニング
〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ〕：ア ラボラト
リー マニュアル〔ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕ
ａｌ〕，１９８９，コールドスプリグハーバーラボラト
リー〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ〕）に記載のミニプレパレイション法
〔ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ〕により、バクテリオファージＤＮＡの解析におい
て、突然変異ベクターを、親のもの〔ｐａｒｅｎｔａｌ
ｓ〕から容易に同定できる。突然変異誘発させた後、突
然変異したｔａｔ遺伝子を包含するＢａｍＨＩフラグメ
ントを、図３に記載の真核発現ベクターｐＳＧ５（グリ
ーン〔Ｇｒｅｅｎ〕ら，ヌクレイック アシッド レス
〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ〕，１９８８，
１６，３６９）に挿入する。結果として得られるプラス
ミドｐＴＧ２３３２は変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→Ａｓ
ｐ）を発現できる。従来技術のトランスドミナントＴＡ
Ｔ変異型、即ち、変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ^４１→Ａｌａ）
及びΔＴＡＴ（Ｇｌｎ^５４→停止）のそれぞれの合成
を、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド（４１位の
リシン残基をコードするコドンをアラニンに変更するこ
とを可能にする）及び配列番号３に記載の（５４位のグ
ルタミン残基をコードするコドンの位置に停止コドンを
形成することを可能にする）オリゴヌクレオチドを使用
し、ベクターＭ１３ＴＧ２３０６の部位特異的突然変異
により行った。

【００２４】突然変異誘発させた後、突然変異したｔａ
ｔ遺伝子を真核発現ベクターｐＳＧ５に挿入し、それぞ
れ、突然変異ＴＡＴ（Ｌｙｓ^４１→Ａｌａ）の合成を可
能にするｐＴＧ２３５１、及び、ΔＴＡＴの合成を可能
にするｐＴＧ２３５２を得る。これら従来技術の突然変
異体〔ｍｕｔａｎｔｓ〕は、トランスドミナンスに対す
るポジティブ・コントロールとして有用である。それら
のトランス活性化作用及び、天然のＴＡＴタンパク質を
阻害する能力は、以下に記載される本発明のＴＡＴ変異
型に適用するのと完全に同一の条件で評価される。変異
体ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→Ａｓｐ）のトランス活性化作用
は、リポーターベクターＬＴＲ−ＣＡＴ（エメルマン
〔Ｅｍｅｒｍａｎ〕ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８７，
６，３７−５５）を用いた発現ベクターｐＴＧ２３３２
のＨｅＬａ細胞への一時的なトランスフェクションによ
り評価する。細胞のトランスフェクションは、リン酸カ
ルシウム法により行う（マニアティス〔Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ〕ら，モレキュラー クローニング〔Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ〕：ア ラボラトリー マニュア
ル〔ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ〕，１９
８９，コールドスプリングハーバーラボラトリー〔Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ〕）。核酸を細胞に導入できる他の手段も利用でき
る。例えば、デキストラン硫酸法、電気溶出、浸透圧シ
ョック、又は、選択細胞〔ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃｅｌ
ｌ〕へのマイクロインジェクションに基づく方法も利用
できる。ヒトＨｅＬａ細胞の培養は、３７℃で、５％Ｃ
Ｏ_２の存在下、ＭＥＭ培地（イーグルの〔Ｅａｇｌｅ´
ｓ〕最小必須培地）中で、１０％のウシ胎児血清、１％
の非必須アミノ酸、１％のグルタミン及び１％のゲンタ
マイシンを添加して行う。

【００２５】プラスミドＤＮＡは、塩化セシウムグラジ
エントで精製する。ｐＴＧ２３３２１μｇ及びプラスミ
ドＬＴＲ−ＣＡＴ ０．５μｇを培地中のＨｅＬａ細胞
にトランスフェクトし、ディッシュ当り４×１０^５個の
細胞の割合でプレートに配置する。ｐＨＭＧ−Ｔａｔ
（図４）１μｇ及びＬＴＲ−ＣＡＴ ０．５μｇのトラ
ンスフェクションにより、トランス活性化に対するポジ
ティブ・コントロールを構築する。ベクターｐＨＭＧ−
ｔａｔは、ＴＡＴタンパク質の８６のアミノ酸をコード
するｔａｔ遺伝子のコピーＤＮＡを包含するＢａｍＨＩ
フラグメントのベクターｐＨＭＧのＢａｍＨＩ部位への
クローニングに由来する（メエタリ〔Ｍｅｈｔａｌｉ〕
ら，ジーン〔Ｇｅｎｅ〕，１９９０，９１，１７９−１
８４）。トランスフェクトされるべきプラスミドＤＮＡ
をＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５；１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）４２０μｌ中に回収し、２Ｍ ＣａＣｌ
_２６０μｌと混合する。該混合物をチューブを静かに振
りながら、２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ；１．５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４−２Ｈ_２
Ｏを、ＮａＯＨでｐＨ７．１２に調節したもの）４８０
μｌに加える。１５分後、沈殿物を滴状に細胞の上に注
ぐ。培地をトランスフェクションの２４時間後に取替え
て、過剰の沈殿物を除去する。細胞抽出液の分析を形質
転換の４８時間後に行ってＣＡＴ遺伝子の発現を評価す
る。ＨｅＬａ細胞をＣＡＴ緩衝液（１５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ ｐＨ８；６０ｍＭＫＣｌ；１５ｍＭ ＮａＣ
ｌ；２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５ｍＭスペルミン；１ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）；０．４ｍＭフェニル
メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））にすり落と
して回収する。３凍結融解サイクル〔３ｆｒｅｅｚｅ−
ｔｈａｗ ｃｙｃｌｅｓ〕を液化窒素中で行った後、３
７℃で４分間インキュベーションする。このようにして
得られたライゼートを６５℃で１０分間インキュベート
し、遠心分離を１０，０００ｒｐｍで１０分間行って細
胞破壊片〔ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｂｒｉｓ〕を分離す
る。上澄みを回収し、そのタンパク質濃度をバイオラド
比色試験〔Ｂｉｏｒａｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ
ｔｅｓｔ〕により測定する。

【００２６】必要に応じて水で希釈して８００μｌに調
節した細胞抽出液１５μｌと水中のバイオラド試薬〔Ｂ
ｉｏｒａｄ ｒｅａｇｅｎｔ〕２００μｌとを室温で１
０〜６０分間インキュベートする。タンパク質濃度は、
５９５ｎｍにおける光学密度をウシ血清アルブミン検定
系列〔ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ〕と対比
して測定して決定する。ＣＡＴ遺伝子の発現は、タンパ
ク質１０〜２０μｇに対応する抽出液の一部で測定す
る。細胞抽出液の適当量を事前に３００μｌに０．２５
Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）で調節し、５ｍ
Ｍアセチル補酵素Ａ ３２μｌ及び^１４Ｃ−クロラムフ
ェニコール２０μｌ（０．５μＣｉ）と一緒に３７℃で
１時間３０分間インキュベートする。酢酸エチルで抽出
して１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上相
を凍結乾燥する。後者を酢酸エチル１５μｌに取り、６
０Ｆ_２３４シリカゲルプレート（メルク）上に保持させ
て薄層クロマトグラフィーにより分析する（クロロホル
ム／メタノール １９／１緩衝液中で１時間３０分間泳
動する）。クロマトグラムをオートラジオグラフィーで
視覚化し、アセチル化クロラムフェニコールに対応する
バンドを切り出す。放射能レベルをシンチレーション計
数により評価する。突然変異体のトランス活性化のパー
セントを、ポジティブ・コントロール（ｐＨＭＧ−Ｔａ
ｔ ＋ ＬＴＲ−ＣＡＴ）（これは１００％のトランス
活性化作用を示す）により測定したレベルと対比して計
算する。

【００２７】変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→Ａｓｐ）のト
ランスドミナント活性は、天然のＴＡＴタンパク質のト
ランス活性化機能を阻害する能力を測定することにより
評価する。トランスドミナント活性は、レポーターベク
ターＬＴＲ−ＣＡＴ及び天然のＴＡＴタンパク質発現ベ
クターｐＨＭＧ−Ｔａｔを用いた、ＨｅＬａ細胞への発
現ベクターｐＴＧ２３３２の一時的なトランスフェクシ
ョンにより決定する。すなわち、ｐＴＧ２３３２ １０
μｇ、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ １μｇ及びＬＴＲ−ＣＡＴ
０．５μｇを上記の手順に従って一緒にトランスフェク
トする〔ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ〕。トランスフェ
クションの４８時間後、細胞抽出液を調製し、それらの
タンパク質濃度を測定する。タンパク質１０〜２０μｇ
に対応する抽出液の一部をＣＡＴアッセイにより検定す
る。適用する技術的条件は、既に詳細に記載してある。
天然のＴＡＴタンパク質の変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→
Ａｓｐ）による阻害パーセントは、０％を示すｐＨＭＧ
−ＴａｔとＬＴＲ−ＣＡＴとのコトランスフェクション
〔ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ〕に由来する活性化
のためのポジティブ・コントロールと対比して計算す
る。得られた結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→Ａｓｐ）は、
そのトランス活性化作用が非常に小さいために（ＣＡＴ
遺伝子の発現は、天然のＴＡＴタンパク質により測定さ
れたものと対比して１．４％と評価された）、また、そ
れが天然のＴＡＴタンパク質の活性を強く阻害するため
に（ｐＴＧ２３３２の存在下において９８％阻害）、効
果的なトランスドミナント突然変異体である。グリーン
〔Ｇｒｅｅｎ〕らにより報告されたＴＡＴ変異体（Ｌｙ
ｓ^４１→Ａｌａ）は、報告者によりトランスドミナント
表現型を有すると考えられているが、完全に反対の結果
が、これらの実験で得られた。確かに、それは、特に高
いトランス活性化作用（１７２％）を示し、その結果、
天然のＴＡＴタンパク質と共同作用するように見える。
加えて、このベクターは、天然のＴＡＴ機能に対し優性
の効果を与えない（０％トランスドミナント活性）。従
来技術のｐＲＧ２３５２によって合成される変異体ΔＴ
ＡＴは、事実上、トランスドミナンスに関して、コント
ロールを形成し、これらの実験の正当性を裏付ける。そ
れは、天然のＴＡＴタンパク質のトランス活性化作用を
９２％阻害する。それにもかかわらず、この変異型は、
ＨＩＶ ＬＴＲ（２８％）の制御下にあるＣＡＴ遺伝子
の発現を誘発する能力を有する。そのトランス活性化
は、しかしながら、ポジティブ・コントロールのｐＨＭ
Ｇ−Ｔａｔで測定したものより少ない。

【００３０】実施例２：発現ベクターｐＴＧ２３３３の
構築、ＴＡＴ変異体（Ｔｈｒ^４０→Ａｌａ）の発現及び
トランスドミナント表現型の確認。 ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘
発させて、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の４０位のスレオ
ニン（Ｔｈｒ）残基をコードするコドンを、アラニン
（Ａｌａ）残基をコードするコドンで置換し、更に、サ
イレント突然変異を導入し、突然変異ベクターの速やか
な決定を可能にするＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、残基４
２をコードするコドンのレベルに形成する。使用するオ
リゴヌクレオチドは配列番号４に記載されている。突然
変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５中に転移し、ｐＴ
Ｇ２３３３を生じさせる。これにより変異体ＴＡＴ（Ｔ
ｈｒ^４０→Ａｌａ）を生産することができる。ベクター
ｐＴＧ２３３３を、ベクター ＬＴＲ−ＣＡＴとともに
ＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェクトし、変異体
ＴＡＴ（Ｔｈｒ^４０→Ａｌａ）のトランス活性化作用を
上記の手順に従って測定する。同時に、そのトランスド
ミナント活性を、ｐＴＧ２３３３、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及
びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の濃度比でのコト
ランスフェクションにより測定する。結果を表１に示
す。変異体ＴＡＴ（ＴＨＲ^４０→Ａｌａ）が、本発明が
規定するトランスドミナント表現型を示すことが観察さ
れる。それは、天然のＴＡＴタンパク質の機能を８３％
阻害し、１５．６％の小さいトランス活性化作用を保持
する。

【００３１】実施例３：発現ベクターｐＴＧ２３４０の
構築、変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ^４１→Ｇｌｕ）の発現及び
トランスドミナント表現型の確認 ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘
発させて、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の４１位のリシン
（Ｌｙｓ）残基をコードするコドンを、グルタミン酸
（Ｇｌｕ）残基をコードするコドンで置換し、更に、サ
イレント突然変異を導入し、突然変異ベクターの速やか
な決定を可能にするＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、残基４
２をコードするコドンのレベルに形成する。使用するオ
リゴヌクレオチドは配列番号５に記載されている。突然
変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５中に転移し、ｐＴ
Ｇ２３４０を生じさせる。これにより変異体ＴＡＴ（Ｌ
ｙｓ^４１→Ｇｌｕ）を生産することができる。ベクター
ｐＴＧ２３４０を、ベクターＬＴＲ−ＣＡＴとともにＨ
ｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェクトし、変異体Ｔ
ＡＴ（Ｌｙｓ^４１→Ｇｌｕ）のトランス活性化作用を上
記の手順に従って測定する。同時に、そのトランスドミ
ナント活性を、ｐＴＧ２３４０、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及び
ＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の濃度比でのコトラ
ンスフェクションにより測定する。結果を表１に示す。
変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ^４１→Ｇｌｕ）が、本発明が規定
するトランスドミナント表現型を示すことが判る。該変
異体のトランス活性化作用は低く（天然のＴＡＴタンパ
ク質と比較して３％の活性）、また、天然のＴＡＴタン
パク質のトランス活性化機能を効果的に阻害する（９７
％の阻害）。ｐＴＧ２３４０により合成される変異体Ｔ
ＡＴ（Ｌｙｓ^４１→Ｇｌｕ）と、従来技術の天然ＴＡＴ
タンパク質と同様に作用する変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ^４１
→Ａｌａ）とは、同じ残基において突然変異されると認
められる。行われた修飾によれば、得られる変異体の表
現型は全体として異なっていることもできる。こうし
て、Ｌｙｓ^４１をＧｌｕにより置換することにより、こ
こに開示されているように、生成する変異型がトランス
ドミナント表現型を与えられる。

【００３２】実施例４：発現ベクターｐＴＧ２３５８の
構築、変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ^４５→Ｓｅｒ）の発現及び
トランスドミナント表現型の確認 ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘
発させて、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の４５位のイソロ
イシン（Ｉｌｅ）残基をコードするコドンを、セリン
（Ｓｅｒ）残基をコードするコドンで置換し、更に、突
然変異ベクターの速やかな決定を可能にするＢａｍＨＩ
制限部位を、残基４５をコードするコドンのレベルに形
成する。使用するオリゴヌクレオチドは配列番号６に記
載されている。突然変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ
５中に転移し、ｐＴＧ２３５８を生じさせる。これによ
り変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ^４５→Ｓｅｒ）を生産すること
ができる。ベクターｐＴＧ２３５８を、ベクターＬＴＲ
−ＣＡＴとともにＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフ
ェクトし、変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ^４４→Ｓｅｒ）のトラ
ンス活性化作用を上記の手順に従って測定する。同時
に、そのトランスドミナント活性を、ｐＴＧ２３５８、
ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．
５の濃度比でのコトランスフェクションにより測定す
る。結果を表１に示す。変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ^４５→Ｓ
ｅｒ）が、本発明が規定するトランスドミナント表現型
を示すことが判る。それは、天然のＴＡＴ蛋白質の機能
を６２．５％部分阻害し、４７％の温和なトランス活性
化作用を保持する。

【００３３】実施例５：発現ベクターｐＴＧ２３４８の
構築、変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ^４７→Ａｒｇ）の発現及び
トランスドミナント表現型の確認 ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘
発させて、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の４７位のチロシ
ン（Ｔｙｒ）残基をコードするコドンを、アルギニン
（Ａｒｇ）残基をコードするコドンで置換し、更に、突
然変異ベクターの速やかな決定を可能にするＸｂａＩ制
限部位を、残基４７をコードするコドンのレベルに形成
する。使用するオリゴヌクレオチドは配列番号７に記載
されている。突然変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５
中に転移し、ｐＴＧ２３４８を生じさせる。これにより
変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ^４７→Ａｒｇ）を生産することが
できる。ベクターｐＴＧ２３４８を、ベクターＬＴＲ−
ＣＡＴとともにＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェ
クトし、変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ^４７→Ａｒｇ）のトラン
ス活性化作用を上記の手順に従って測定する。同時に、
そのトランスドミナント活性を、ｐＴＧ２３４８、ｐＨ
ＭＧ−Ｔａｔ及びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の
濃度比でのコトランスフェクションにより測定する。結
果を表１に示す。変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ^４５→Ａｒｇ）
が、本発明が規定する温和なトランスドミナント表現型
を示すことが判る。それは、天然のＴＡＴ蛋白質の機能
を７８％阻害し、５６％のトランス活性化作用を保持す
る。

【００３４】実施例６：トランスドミナントＴＡＴ変異
体を発現する安定な細胞株の確立及びＨＩＶウイルスに
よる感染抵抗性の評価 トランスドミナントＴＡＴ変異体（Ｐｈｅ^３８→Ａｓ
ｐ）を生産する安定な細胞株が、インビボでの可能性の
ある用途、例えば遺伝子治療手順のため変異体の効率を
確認するために確立された。細胞のＨＩＶ感染に対する
抵抗性を評価するために、それらがウイルスにより感染
されることが必要であり、すなわち、該変異体が細胞表
面にヒトＣＤ_４レセプターを発現することが必要であ
る。２種のタイプの細胞系が確立されている。− ヒト
Ｔ細胞由来でＣＤ_４レセプターを有するＣＥＭ−Ａ３細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）は、それゆえ当然にＨＩＶ
感染性である。− ＨＩＶ感染に対する感受性を与える
ために、ヒトＣＤ_４レセプター ｐＴＧ６２０のために
普遍性の発現ベクターでコトランスフェクトされたＨｅ
Ｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）。ベクターｐＴＧ６２
０は、ヒトＣＤ_４レセプターのコピーＤＮＡを含む大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼ・クレノウ・フラグメントで処理
されたＥｃｏＲＩフラグメントのベクターｐＨＭＧのＥ
ｃｏＲＶ部位への導入により得られる（マドンら、セ
ル、１９８６、４７、３３３−３４８）。トランスドミ
ナント変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ^３８→Ａｓｐ）をコードす
る遺伝子を含有するＢａｍＨＩフラグメントが、レトロ
ウイルスベクターｐＬＸＳＰ（図５）のＢａｍＨＩ部位
に挿入され、ｐＴＧ２３５０を得る。ベクターｐＬＸＳ
Ｐは、ｐＬＸＳＮに由来し（ミラー及びロスマン、バイ
オテクニークス、７、１９８９、９８０−９８８）、ピ
ューロマイシン耐性を与える遺伝子によりネオマイシン
遺伝子を置換し、並びにＭＰＳＶ由来のそれによりＭＳ
Ｖ由来の３´ＬＴＲを置換することにより得られる。

【００３５】ｐＴＧ２３５０のプラスミドＤＮＡは、エ
レクトロポレーションによりＣＥＭ−Ａ３細胞に導入さ
れる。塩化セシウム・グラジエントで精製されたＤＮＡ
２０μｇを、２０μｌのＰＢＳ緩衝液（１ｍＭＫＨ_２Ｐ
Ｏ_４；２ｍＭ ＫＣｌ；１３６ｍＭ ＮａＣｌ；３ｍＭ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４）に加えた。ＤＮＡ調製物をエレクト
ロポレーション・タンク（バイオラド）中、１８０μｌ
のＰＢＳに再懸濁させた。該混合物は、室温で１０分間
プレインキュベートする。エレクトロポレーション後
（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｂｉｏｒａｄ，電圧２１０
ボルト、静電容量９６０μＦ）、細胞は室温に１０分間
保たれ、５％のＣＯ_２の存在下にＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ
−ＢＲＬ）６ｍｌ中、３７℃でインキュベートする。ピ
ューロマイシン耐性ＣＥＭ−Ａ３クローンが、限界希釈
（ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌ）により単離され
る。プラスミドＤＮＡ ｐＴＧ２３５０は、上記のリン
酸カルシウムトランスフェクション技術によりｐＴＧ６
２０とともにＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトされ
る。ピューロマイシン耐性のＨｅＬａ細胞クローンの連
続継代培養（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕ
ｒｅ）（ピューロマイシン ２μｇ／ｍｌ）により単離
される。細胞表面のヒトＣＤ_４レセプターの発現を、該
レセプター対するフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙ
ｔｈｒｉｎ）で標識されたＬｅｕ３Ａ抗体（ベクトン
ディキンソン）を用い、フルオロサイトメトリー（ＦＡ
ＣＳ：蛍光活性化細胞選別機、スキャン ベクトン デ
ィキンソン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ，ｓｃａｎ Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））により分析する。

【００３６】ＣＥＭ−Ａ３細胞系におけるＴＡＴ蛋白
（ｐｒｏｔｅｎ）の発現は、上記技術によるＬＴＲ−Ｃ
ＡＴおよびｐＨＭＧ−Ｔａｔベクターの一時的なトラン
スフェクションを行うことにより検出される。ＣＥＭ−
Ａ３細胞系に由来し、ピューロマイシンに対し耐性で、
トランスドミナントＴＡＴ変異体を発現し、天然のＴＡ
Ｔ蛋白の阻害の種々の程度が観察される３種のクローン
が、ＨＩＶウイルスで感染される。ウイルスの増殖は、
培養上清の逆転写酵素活性を測定することにより評価で
きる。ウイルス増殖の２日のシフトが、トランスドミナ
ントを発現しないＣＥＭ−Ａ３細胞で得られた結果と比
較して、トランスドミナント変異体を発現するＣＥＭ−
Ａ３細胞系のクローンの１つで観察された。さらに、逆
転写酵素活性は、該酵素で９０％減少した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＩＶウィルスのゲノムの構成図であ
り、タンパク質をコードする遺伝子は使用されるリーデ
ィングフレームに従って表示される；ＬＴＲ：黒枠、構
造蛋白をコードする遺伝子：灰色枠；調節タンパク質を
コードする遺伝子：白枠が示されている。

【図２】図２は、ＨＩＶウィルスの天然ＴＡＴタンパク
質を構成する種々のドメインの構成図であり、各ドメイ
ンを構成するアミノ酸は、各ドメインの上に示されてい
る。

【図３】図３は、真核発現ベクターｐＳＧ５の構成図で
あり、順に、ＳＶ４０のプロモーター（ＳＶ４０ ｐｒ
ｏ；黒枠）、ウサギβ−グロビン遺伝子の非コーディン
グ・エクソン１の３´フラグメント（白枠）、ウサギβ
−グロビン遺伝子のイントロン（連続線）、ウサギβ−
グロブリン遺伝子のエクソン２の非コーディングの開始
部（白枠）、Ｔ７バクテリオファージのプロモーター
（Ｔ７ ｐｒｏ；黒枠）、所望の遺伝子のクローニング
を可能にするユニークなＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよび
ＢｇｌＩＩ部位、およびＳＶ４０ウィルスのポリアデニ
ル化シグナル（ｐＡ ＳＶ４０；灰色枠）を含む。

【図４】図４は、天然のＴＡＴ蛋白質発現ベクターであ
るｐＨＭＧ−Ｔａｔの構成図であり、順に、ＨＭＧ遺伝
子のプロモーター（ＨＭＧ ｐｒｏ）、ＨＭＧ遺伝子の
非コーディング・エクソンＩ（斜線枠）、イントロンＩ
およびＨＭＧ遺伝子のスプライシングのためのアクセプ
ター部位、ＴＡＴタンパク質の８６アミノ酸をコードす
るコピーＤＮＡ（黒枠）、およびＳＶ４０ウィルスのポ
リアデニル化シグナル（ｐＡ；白枠）を含む。

【図５】図５は、レトロウィルスベクターｐＬＸＳＰの
構成図であり、順に、ウィルスプロモーター領域を含む
ＭＳＶウィルス（マウスサルコーマウィルス）の５´Ｌ
ＴＲ、カプセル化領域（ｐｓｉ）、ウィルスｇａｇ遺伝
子（ｇａｇ°）の５´部分、異種遺伝子（遺伝子 ｘ）
の挿入を行わせる多重クローニング部位、ピューロマイ
シン耐性遺伝子（ＰＡＣ）の発現を指令するＳＶ４０ウ
ィルスプロモーター、およびポリアデニル化シグナルを
含むＭＰＳＶのウィルス（骨髄増殖性サルコーマウィル
ス）の３´ＬＴＲを含む。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/49 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも１つの突然変異を含むＨＩＶウ
   イルスＴＡＴ蛋白質または該蛋白質の機能性フラグメン
   トのトランスドミナント変異体であって、該突然変異が
   ３８位、４０位、４１位、４５位または４７位は、天然
   残基と異なるアミノ酸残基が存在し、４１位のアミノ酸
   はアラニンまたはスレオニンと異なり、４７位のアミノ
   酸はアラニンまたはヒスチジンと異なることを特徴とす
   る変異体。
2. 【請求項２】前記変異体が、ＨＩＶ１ ＴＡＴ蛋白質に
   由来する請求項１記載の変異体。
3. 【請求項３】以下の変異体： （１）３８位にアスパラギン酸を含む変異体； （２）４０位にアラニンを含む変異体； （３）４１位にグルタミン酸を含む変異体； （４）４５位にセリンを含む変異体；および （５）４７位にアルギニンを含む変異体； から選択される、請求項１または２記載の変異体。
4. 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のＴＡＴ蛋
   白質変異体をコードするＤＮＡフラグメント。
5. 【請求項５】その発現を許容する適切なエレメントの制
   御下に置かれる請求項４記載のＤＮＡフラグメントを含
   む発現カセット。
6. 【請求項６】請求項５記載の発現カセットを含む原核ま
   たは真核細胞。
7. 【請求項７】以下の工程： − 請求項６記載の原核または真核細胞を適切な培養培
   地で培養すること、および − 生産された変異体を培養培地または前記細胞から採
   集することを含む請求項１〜３のいずれかに記載の変異
   体の製造方法。
8. 【請求項８】請求項７記載の方法を用いて得たＴＡＴ蛋
   白質変異体。
9. 【請求項９】ＨＩＶウイルスの複製を阻害するための、
   請求項１〜３のいずれかに記載の変異体、請求項５記載
   の発現カセットまたは医薬生成物としての請求項６記載
   の細胞の使用。
10. 【請求項１０】治療または予防剤として、請求項１〜３
    のいずれかに記載の変異体、請求項５記載の発現カセッ
    トまたは請求項６記載の細胞を含むＨＩＶ感染の治療ま
    たは予防用の薬学的組成物。