JP2001503252A - タンパク質の高レベル発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳類細胞で正常に発現している蛋白質をコードした人工遺伝子に関する。そして、この人工遺伝子は、前記蛋白質をコードした天然の遺伝子中に含まれる好ましくない又は好ましさの低いコドンを同一アミノ酸をコードした好ましいコドンに置換されている。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の高レベル発現 発明の属する技術分野 本発明は遺伝子に関し、特に真核細胞内の真核及びウイルス性タンパク質の高 レベルの発現方法に関する。 従来の技術 真核遺伝子生成物の原核生物内での発現は、大腸菌（E.coli）でまれにしか使 用されないコドンの存在によって時に制限される場合がある。このような遺伝子 の発現は、この内在的なコドンを原核遺伝子内で高く発現した過剰なほどに観察 されるコドンに系統的に置換することにより促進することできる（Robinson et al.，Nucleic Acids Res．12:6663,1984）。一般的には、まれなコドンがリボソ ームの中止の原因とされ、合成開始時のポリペプチド鎖を完成させることの妨げ となり、また、転写と翻訳との連結の妨げとなるとされている。リボソームの中 断は、ｍＲＮＡの３’端を細胞内のリボヌクレアーゼにさらすこととなると考え られている。 発明の概要 本発明は、人工遺伝子を提供する。この人工遺伝子は、通常哺乳類の細胞やそ の他の真核細胞で発現するタンパク質をコードする。この細胞は、タンパク質を コードする天然の遺伝子内に存在する一以上の（発現において）好ましくない（ 優先されない）、又はあまり好ましくない（優先させ難い）コドンを、同じアミ ノ酸をコードする好ましい（優先）コドンと置き換えたものである。 優先コドンは、Ａｌａ（ｇｃｃ）、Ａｒｇ（ｃｇｃ）、Ａｓｎ（ａａｃ）、Ａ ｓｐ（ｇａｃ）、Ｃｙｓ（ｔｇｃ）、Ｇｌｎ（ｃａｇ）、Ｇｌｙ（ｇｇｃ）、Ｈ ｉｓ（ｃａｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｌｅｕ（ｃｔｇ）、Ｌｙｓ（ａａｇ）、Ｐ ｒｏ（ｃｃｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｓｅｒ（ａｇｃ）、Ｔｈｒ（ａｃｃ）、Ｔ ｙｒ（ｔａｃ）、Ｖａｌ（ｇｔｇ）である。準優先コドンは、Ｇｌｙ（ｇｇｇ） 、Ｉｌｅ（ａｔｔ）、Ｌｅｕ（ｃｔｃ）、Ｓｅｒ（ｔｃｃ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ） 、 Ａｒｇ（ａｇｇ）である。優先コドン及び準優先コドンに分類されないコドンは 全て非優先コドンである。通常、特定コドンの優先程度は、高く発現したヒトの 遺伝子内でのそのコドンの優勢に表わされ、表１の表題「高い」の下に示す。例 えば、「ａｔｃ」は、高く発現した哺乳類細胞のＩｌｅコドンの７７％に相当し 、Ｉｌｅの優先コドンである。「ａｔｔ」は、高発現の哺乳類細胞のＩｌｅコド ンの１８％に相当し、Ｉｌｅの準優先コドンである。「ａｔａ」配列は高発現の ヒトの遺伝子の５％にしか相当せず、Ｉｌｅの非優先コドンである。あるコドン を高発現したヒトの遺伝子内の他のより優勢なコドンに置き換えることは、通常 、哺乳類細胞内での遺伝子の発現を増加させる。よって、本発明は、準優先コド ンを優先コドンと置き換えること及び非優先コドンを優先コドン又は準優先コド ンと置き換えることを含む。 「哺乳類細胞で普通に発現するタンパク質」とは、自然状態で哺乳類で発現す るタンパク質を意味する。この用語は、哺乳類ゲノムの遺伝子、例えば、抗血友 病因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インターロイキンやその他のタンパク質 をコードする遺伝子を含む。この用語はまた、腫瘍遺伝子など哺乳類細胞の病気 状態で発現する遺伝子や、感染後哺乳類細胞で発現するウイルス（レトロウィル スを含む）によってコードされる遺伝子を含む。「真核細胞で普通に発現するタ ンパク質」とは、真核生物において自然状態で発現するタンパク質を意味する。 この用語はまた、病気に罹患している状態の哺乳類細胞で発現する遺伝子を含む 。 好適な実施形態では、人工遺伝子は、インヴィトロの哺乳類細胞の培養システ ムで同一の状態（同じ細胞型、同じ培養状態、同じ発現ベクター）で哺乳類又は 真核タンパク質を「自然」（又は「天然」）遺伝子で発現するレベルの少なくと も１１０％、１５０％、２００％、５００％、１,０００％、５,０００％、又は １０,０００％のレベルで発現する。 人工遺伝子及び対応する自然の遺伝子の発現を計測する適切な細胞培養システ ムについては後述する。その他の、哺乳類細胞を使用した適切な発現システムは 、この分野に携わる人にはよく知られており、例えば、下に述べる標準の分子生 物学の参照資料に記されている。人工及び自然な遺伝子の発現に適切なベクター は、後述するが、又以下に述べる標準の参考資料に記載されている。「発現」と は、 タンパク質の発現を意味する。発現は、興味の対象となるタンパク質に特有の抗 体を用いて計測することができる。このような抗体及び計測技術は、この分野に 携わる人にはよく知られている。「自然遺伝子」又は「天然遺伝子」とは、タン パク質を自然でコードする遺伝子配列（自然に存在する対立遺伝子変異体を含む ）、例えば、天然又は自然なコーディング配列を意味する。 その他の好適な実施形態では、少なくとも自然遺伝子内のコドンの１０％、２ ０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が非優先コド ンである。 その他の好適な実施形態では、少なくとも自然遺伝子内の非優先コドンの１０ ％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が優先 コドン又は準優先コドンと置き換えられる。 その他の好適な実施形態では、少なくとも自然遺伝子内の非優先コドンの１０ ％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が優先 コドンと置き換えられる。 好適な実施形態では、タンパク質はレトロウイルスのタンパク質である。より 好適な実施形態では、タンパク質はレンチウイルスのタンパク質である。更に好 適な実施形態では、タンパク質は、ＨＩＶタンパク質である。その他の好適な実 施形態では、タンパク質がｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０で ある。その他の好適な実施形態では、タンパク質はヒトのタンパク質である。よ り好適な実施形態では、タンパク質はヒトの抗血友病因子及びＢ領域消去ヒト抗 血友病因子（Ｂ ｒｅｇｉｏｎｄｅｌｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ ＩＩＩ）のタンパク質である。その他の好適な実施形態では、タンパク質は緑蛍 光タンパク質である。 様々な好適な実施形態では、少なくとも人工遺伝子内のコドンの３０％、４０ ％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％が優先又は準優先コドン である。 本発明はまた、人工遺伝子を含む発現ベクターも提供する。 本発明のその他の態様では、人工遺伝子が潜む細胞を提供する。様々な好適な 実施形態では、この細胞は原核細胞及びこの細胞が哺乳類細胞である。 好適な実施形態では、人工遺伝子には、５０以下、４０以下、３０以下、２０ 以下、１０以下、５以下の「ｃｇ」配列が含まれるか又は全く「ｃｇ」配列は含 れない。 本発明はまた、人工遺伝子を調整するための方法を提供する。この人工遺伝子 は、哺乳類細胞又はその他の真核細胞で普通に発現するタンパク質をコードする 。この方法は、自然遺伝子内でタンパク質をコードする非優先及び準優先コドン を識別するステップと、一以上の非優先及び準優先コドンを同じアミノ酸をコー ドする優先コドンと置き換えるステップとを含む。 時には（例えば、制限部位の導入の許可）、非優先コドンを優先コドンではな く準優先コドンと置き換えるのが望ましい場合もある。 全ての準優先コドン又は非優先コドンを優先コドンと置き換える必要は無い。 発現の増加は、準優先又は非優先コドンの一部を優先コドンと置き換えることに よっても達成できる。時には、非優先コドンの一部のみを優先又は準優先コドン と置き換え、中間レベルの発現を得るのが望ましい。 その他の好適な実施形態では、本発明は、一以上の人工遺伝子を含むベクター （発現ベクターを含む）を提供する。 「ベクター」とは、ＤＮＡ分子を意味し、このＤＮＡ分子は、ＤＮＡの断片を 挿入又はクローン化することができる、例えば、プラスミド、バクテリオファー ジ又は哺乳類又は昆虫ウイルス等に由来する。ベクターは一以上の特有の制限部 位を含み、特定のホスト又はベヒクル生物で自律複製し、このクローン化された 配列を複製することができる。このように、「発現ベクター」とは、タンパク質 の人工を誘導することのできる自律エレメントを意味する。このようなＤＮＡ発 現ベクターには、哺乳類プラスミド及びウイルスを含む。 本発明はまた、人工遺伝子の断片を提供し、この人工遺伝子の断片には、タン パク質の所望の部分をコードされている。このような合成遺伝子断片は、本発明 の遺伝子に類似する。違いは、このような人工遺伝子断片が、タンパク質の一部 のみをコードする点である。このような遺伝子断片は、望ましくはタンパク質の ５０、１００、１５０、５００以上の隣接するアミノ酸をコードする。 本発明の人工遺伝子を形成するにあたって、ＣｐＧ配列を避けることが望まし い。なぜならこれらの配列は、遺伝子沈黙（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を 引起こすかもしれないからである。よって、好適な実施形態では、人工遺伝子の コーディング領域では、「ｃｇ」配列を含まない。 ＨＩＶｇｐ１２０ｅｎｖ遺伝子に存在するコドンバイアス（ｃｏｄｏｎ ｂｉ ａｓ）はｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子にも存在する。よって、これらの遺伝子の非優 先及び準優先コドンの一部の優先コドンへの置換は、より高いレベルの発現が可 能な遺伝子を生むはずである。ヒトの遺伝子内の抗血友病因子第ＶＩＩＩ因子及 び第ＩＸ因子をコードするコドンの大部分は、非優先コドン又は準優先コドンで ある。これらのコドンの一部分を優先コドンと置き換えることは、哺乳類細胞培 養でのより高いレベルの発現ができる遺伝子を生じるはずである。 本発明の人工遺伝子は、生きている生物の細胞に挿入することができる。例え ばベクター（ウイルス性又は非ウイルス性）を使用し、人工遺伝子を生きている 生物の細胞に挿入し、遺伝子治療を行う。 逆に、自然に存在する遺伝子の優先コドンを準優先コドンと置換し発現を抑え るのが望ましい場合もある。 組換えＤＮＡ技術の基本原理を説明する標準参考資料は、Watson et al.，Mol ecular Biology of the Gene，Volumes I and II，the Benjamin/Cummings Publ ishing Company，Inc.，publisher，Menlo Park，CA(1987)、Darnell et al.，M olecular Cell Biology，Scientific American Books，Inc.，Publisher，New Y ork，N.Y．(1986)、Old et al.，Principles of Gene Manipulation:An Introdu ction to Genetic Engineering，2d edition，University of California Press ，publisher，Berkeley，CA(1981)、Maniatis et al.，Molecular Cloning:A La boratory Manual，2nd Ed．Cold Spring Harbor Laboratory，publisher，Cold Spring Harbor，NY(1989)、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，Wiley Press，New York，NY(1992)を含む。 「形質転換細胞」とは、組換えＤＮＡ技術によって選択されたＤＮＡ分子、例 えば、人工遺伝子、が導入された（又は原種に挿入した）細胞を意味する。 「発現のために配置させる」とは、ＤＮＡ分子、例えば人工遺伝子を、配列の 転写及び翻訳を調節する（例えば、人工遺伝子によってコードされるタンパク質 の生産を容易にする）ＤＮＡ配列に隣接して配置させることを意味する。 図面の説明 図１は、人工ｇｐ１２０及び人工ｇｐ１６０遺伝子の塩基配列を示し、この遺 伝子中の複数のコドンは高発現のヒトの遺伝子中で見られるコドンに置換されて いる。 図２は、人工ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１ＭＮ）遺伝子を示す概略図である。ｖ１ からｖ５と印がつけられ斜線が加えられた領域は、超可変領域を示す。この斜線 の入れられた部分は、ＣＤ４結合サイトを示す。Ｈ（Ｈｉｎｄ３）、Ｎｈ（Ｎｈ ｅ１）、ｐ（ｐｓｔ１）、Ｎａ（Ｎａｅ１）、Ｍ（Ｍｌｕ１）、Ｒ（ＥｃｏＲ１ ）、Ａ（Ａｇｅ１）、Ｎｏ（Ｎｏｔ１）は配列内に一カ所しかない制限部位の一 部を示す。ＰＣＲの鋳型として働く化学的に人工されたＤＮＡ断片はｇｐ１２０ の下に示され、これら断片の増幅に使用されるプライマの位置と共に示す。 図３は、ｇｐ１２０の発現を測定するトランジェント（一過的な）トランスフ ェクション解析の結果を示す写真である。異なるｇｐ１２０を発現したプラスミ ドがトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の培養上清を電気泳動し、免疫沈降を 行った。これら異なるｇｐ１２０は、ＨＩＶ−１のＩＩＩＢ単離（ｇｐ１２０Ｉ ＩＩｂ）、ＨＩＶ−１のＭＮ単離（ｇｐ１２０ｍｎ）、ＨＩＶ−１のＭＮ単離の 内在性のリーダペプチドがＣＤ５抗原のそれと置換されたもの（ｇｐ１２０ｍｎ ＣＤ５Ｌ）又は化学的に人工された遺伝子でヒトのＣＤ５リーダを含むＨＩＶ− １のＭＮ変異体をコードしたもの（ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ）によりコードされた ｇｐ１２０である。培養上清は、１２時間のラベリング期間（ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄ）、６０時間後トランスフェクション、ＣＤ４：ＩｇＧ１融合タ ンパク質及びタンパク質Ａセファロースの免疫沈降の後、回収された。 図４は、ＥＬＩＳＡ解析結果のグラフを示す。このＥＬＩＳＡ解析は、トラン ジェントトランスフェクションをした２９３Ｔ細胞の上清のタンパク質レベルを 測定するために使用される。これら上清は、異なるｇｐ１２０を発現したプラス ミドによりトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来である。これらｇｐ１ ２０は、ＨＩＶ−１のＩＩＩＢ単離（ｇｐ１２０ＩＩＩｂ）、ＨＩＶ−１のＭＮ 単離（ｇｐ１２０ｍｎ）、ＨＩＶ−１のＭＮ単離の内在性リーダペプチドがＣＤ ５抗原のそれと置換されたもの（ｇｐ１２０ｍｎＣＤ５Ｌ）、ヒトのＣＤＳリー ダを含むＨＩＶ−１のＭＮ変異体をコードした化学的に合成した遺伝子（ｓｙｎ ｇｐ１２０ｍｎ）によりコードされている。上清は、４日後に収穫され、ｇｐ１ ２０／ＣＤ４ ＥＬＩＳＡで試験された。ｇｐ１２０のレベルは、ｎｇ／ｍｌで 表わされている。 図５Ａは、ゲルの写真であり免疫沈降検査の結果を示す。この免疫沈降検査は 、トランスにｒｅｖ及びシスにＲＲＥが存在する時の天然及び人工ｇｐ１２０の 発現を計測する。この実験では、２９３Ｔ細胞は、リン酸カルシウムで共沈した １０μｇのプラスミドでトランジェントトランスフェクションを行った。このプ ラスミドは、（Ａ）人工ｇｐ１２０ＭＮ配列及びシスにＲＲＥＮ（Ｂ）ＨＩＶ− １ ＩＩＩＢのｇｐ１２０部分、（Ｃ）ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢのｇｐ１２０部分 及びシスにＲＲＥ、を発現する。この全てを、ｒｅｖ発現の存在又は不在の状態 で行った。Ｅａｇ１／Ｈｐａｌ ＲＲＥ断片を、ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２プロウイ ルス性クローンからＰＣＲによってクローンし使用して、ＲＲＥ構成、ｇｐ１２ ０ＩＩＩｂＲＲＥ及びｓｙｎｇｐ１２０ｍｎＲＲＥを発生させた。それぞれのｇ ｐ１２０発現プラスミドを、１０μｇのｐＣＭＶｒｅｖ又はＣＤＭ７プラスミド ＤＮＡと共にトランスフェクションした。上清をトランスフェクションの６０時 間後に回収し、ＣＤ４：ＩｇＧ融合タンパク質とタンパク質Ａアガロースと免疫 沈降し、７％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて泳動を行った。ゲルをさらす時間を 延長しｇｐ１２０ＩＩＩｂｒｒｅのｒｅｖによる誘導させた。 図５Ｂは、類似した実験で、さらす時間を短くしたものを示し、ｓｙｎｇｐ１ ２０ｍｎｒｒｅはｐＣＭＶｒｅｖと共に又は伴わずにトランスフェクションした 。 図５Ｃは、図５Ａで使われた構成を示す略図である。 図６は、野生型のマウスＴＨＹ−１遺伝子（ｗｔ）の配列と人エマウスＴＨＹ −１遺伝子（ｅｎｖ）の比較図である。人工遺伝子は、化学的に人工され、ＨＩ Ｖ−１ｅｎｖ遺伝子で見つかる最も優勢なコドンを持つ。 図７は、人工マウスＴＨＹ−１遺伝子を示す略図である。黒く塗りつぶされた 部分は、シグナルペプチドを示す。陰を付けた部分は、先駆物質の配列を示しホ スファチジルイノシトールグリカンアンカーの取付けを指示する。ＴＨＹ−１構 成の組立てに使用した単一の制限部位は、Ｈ（Ｈｉｎｄ３）、Ｍ（Ｍｌｕ１）、 Ｓ（Ｓａｃ１）、Ｎｏ（Ｎｏｔ１）と表示した。構成に使用する合成オリゴヌク レオチドの場所は、図の下部に示す。 図８は、フローサイトメトリー分析結果のグラフを示す。この実験では、２９ ３Ｔ細胞を野生型のマウスＴＨＹ−１発現プラスミド（太線）、エンベロープ（ 外被）コドン発現プラスミドを含むマウスＴＨＹ−１（細線）、又はベクターの み（点線）とリン酸カルシウム共沈によるトランジェントトランスフェクション を行った。細胞は、トランスフェクションの３日後に抗ネズミＴＨＹ−１モノク ローナル抗体ＯＸ７で染色した後、ポリクローン性のＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇ Ｇ抗体でに染色した。 図９Ａは、ヒトの２９３Ｔ細胞上清の免疫沈降分析の結果を示すゲルの写真を 示す。このヒトの２９３Ｔ細胞は、ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ（Ａ）、又は、ｓｙｎ ｇｐ１２０ｍｎ遺伝子の翻訳されていない３’端のｒＴＨＹ−１ｅｎｖ遺伝子を 含む構成ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ．ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ（Ｂ）とトランスフェクシ ョンしたものである。ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ．ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ構成は、ｒＴ ＨＹ−１ｅｎｖプラスミドのＨｉｎｄ３部位を平滑末端とし、そこにＮｏｔｌア ダプターを挿入して生成した。その後、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ遺伝子を含む０．５ ｋｂのＮｏｔｌ断片を、ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎプラスミドのＮｏｔｌ部位へクロ ーンし、正方向か否かを確認した。³⁵Ｓで標識付けした細胞の上清をトランスフ ェクションの７２時間後に収穫し、ＣＤ４：ＩｇＧ融合タンパク質及びタンパク 質Ａアガロースで沈澱させ、７％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。 図９Ｂは、図９Ａに示す実験の構成を示す略図である。 図１０Ａは、ＣＯＳ細胞の写真を示す。このＣＯＳ（コス）細胞はＧＦＰ蛍光 を発しないベクターのみでトランスフェクションしたものである。 図１０Ｂは、コス細胞の写真を示す。このコス細胞はＣＤＭ７発現プラスミド によりトランスフェクションされ、このプラスミドは、天然ＧＦＰをコードして いる。この天然ＧＦＰはコンセンサス翻訳開始配列を含むように構成されている 。 図１０Ｃは、ＣＯＳ細胞の写真を示す。このＣＯＳ細胞は、発現プラスミドで トランスフェクションした。このプラスミドは、コドンを最適にした遺伝子配列 を担持する以外は図１０Ｂと同様、フランキングの配列及び開始コンセンサスを 保持する。 図１０Ｄは、ＣＯＳ細胞の写真を示す。このコス細胞は、図１０Ｃと同様、発 現プラスミドとトランスフェクションする。違いはアミノ残基６５にＳｅｒのか わりにＴｈｒを有することである。 図１１は、緑蛍光タンパク質をコードする人工遺伝子の配列を示す図である。 （配列番号：４０） 図１２は、中央Ｂ領域（アミノ酸７６０−１６３９を含む）が欠失した天然の ヒトの抗血友病因子遺伝子の配列を示す。（配列番号：４１） 図１３は、中央Ｂ領域（アミノ酸７６０−１６３９を含む）が欠失した人工し たヒトの抗血友病因子遺伝子の配列を示す。（配列番号：４２） 発明の実施の形態 [実施例１]高頻度発現のヒト遺伝子に見出されるコドンを持つ人工ｇｐ１２０遺 伝子の構築 ＨＩＶ−１のＬＡＶサブタイプのエンベロープ前駆体に対するコドン頻度表が 、ウイスコンシン大学遺伝学部コンピュータグループによって開発されたソフト ウエアを用いて生成された。上記の作表の結果は、表１で、高頻度で発現される ヒト遺伝子のコレクションによるコドン使用のパターンと対比されている。縮重 コドンによってコードされる何らかのアミノ酸に対して、高頻度で発現される遺 伝子の最も望ましいコドンは、ＨＩＶエンベロープの前駆体の最も好ましいコド ンとは異なっている。更に、簡単な規則によって、それが適用される場合には何 時も、望ましいエンベロープのコドンのパターンが記述され、即ち、それは、好 適なコドンは、ウイルスＲＮＡにおけるアデニン残基の数を最大限にすると云う ものである。このことは、一つの場合を除き、すべての場合において、三番目の 位置がＡであるコドンが最も頻繁に用いられることを意味する。セリンの特別な 場合において、三種類のコドンが同等にｍＲＮＡに対して一つのＡ残基を寄与し ており、これら三つのコドンが、纏めて、実際にエンベロープの転写体に用いら れ ているセリンのコドンの８５％を構成している。Ａ残基偏向の特に驚くべき例は 、アルギニンに対するコドン選択に見出され、ここではＡＧＡトリプレット（３ 塩基連鎖）がアルギニンのコドンの８８％を構成する。Ａ残基の優位性に加えて 、ウリジンに対する著明な優位性が三番目の残基がピリミジンでなければならな い縮重コドンの中に見出される。最後に、より低い頻度で用いられる変異体（変 異コドン）の中の不一致は、ジヌクレオチドであるＣｐＧがより少なく表示され るという観察によって説明がつく。この様にして、アラニン、プロリン、セリン 及びトレオニンに対するコドンにおける様に、第二の位置がＣである場合はいつ も第三番目の位置がＧである可能性は低く、又、アルギニンに対してＣＧＸトリ プレットは殆ど全く使用されない。 表１ ＨＩＶ−１ ＩＩＩｂ ｅｎｖ遺伝子及び高頻度発現のヒト遺伝子におけ るコドンの使用頻度 コドンの使用頻度は、ウイスコンシン大学遺伝学部コンピュータグループによっ て確立されたＧＣＧプログラムを用いて計算された。これらの数字は、ある特定 のコドンが使用されている場合の百分率を表す。他のＨＩＶ−１ウイルスの分離 体のエンベロープの遺伝子のコドン使用頻度は、同等であり、同様の偏向を示す 。 哺乳類の細胞において高いレベルで発現することの出来るｇｐ１２０遺伝子を 生成するために、最も普遍的なノースアメリカンサブタイプであるＨＩＶ−１Ｍ Ｎ（Ｓｈａｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１１６５、１９８４、Ｇａｌｌｏら 、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１１９、１９８６）の配列に基づいて、ＨＩＶ−１の ｇｐ１２０断片をコードする人工遺伝子（ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ）を構成した。 この人工ｇｐ１２０遺伝子において、天然のコドンの殆どすべてが、高頻度に発 現されるヒト遺伝子において最も頻繁に用いられているコドンによって組織的に 置換されている（図１）。この人工遺伝子は、長さが１５０から２００個の塩基 からなる化学合成されたオリゴヌクレオチドから組立られた。もし、１２０から １５０個迄の塩基のオリゴヌクレオチドが化学合成されると、完全長の生成物の 百分率は低い可能性があり、大過剰の物質はより短いオリゴヌクレオチドからな る。これらの短い断片は、クローニング及びＰＣＲの操作を阻害するので、一定 の長さを越えるオリゴヌクレオチドを用いることは非常に困難であり得る。予め 精製することなく粗製の合成材料を使用するために、一本鎖のオリゴヌクレオチ ドのプールは、クローニングの前にＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ生成物は 、アガロースゲル中で精製され、次のＰＣＲ段階における鋳型として使用された 。二つの隣接する断片は、両断片の末端における重複する配列のために同時増幅 されることがある。これらの断片は、大きさが３５０から４００ｂｐの間にあっ て、ＣＤ５表面分子のリーダー配列に続いてＮｈｅＩ／ＰｓｔＩ／ＭｌｕＩ／Ｅ ｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩポリリンカーを含むｐＣＤＭ７由来のプラスミド中にサブ クローンされた。このポリリンカー内の制限酵素の各々は、ＰＣＲによって生成 された断片の５’或いは３’末端に存在する一つの部位を表す。この様にして、 四つの断片の各々を連続してサブクローニングすることにより、ｇｐ１２０遺伝 子の全体が組立られた。各断片に対して三つから六つの異なったクローンがサブ クローンされ、組立に先立ち配列決定された。上記の人工ｇｐ１２０の構築に用 いられた方法の概略図を図２に示す。人工ｇｐ１２０遺伝子（及び、人工ｇｐ１ ６０遺伝子は同じ段取を用いて創成された）の配列は、図１に示されている。 突然変異の率は相当なものである。最も普通に見出される突然変異は、短い（ １個のヌクレオチド）及び長い（３０個迄のヌクレオチド）塩基の欠失である。 ある場合には、その部分を、合成のアダプター、或いはその特定の領域に突然変 異を持たない他のサブクローンからの小片と交換する必要があった。最適化され たコドンの使用に厳密に固執することから幾分逸脱して、結果として生じた遺伝 子に制限部位の導入の便宜を計り、種々の切片の置換を容易にした（図２）。こ れら独特の制限部位は、凡そ１００ｂｐの間隔で遺伝子に導人された。天然のＨ ＩＶのリーダー配列は、ヒトのＣＤ５抗原の高効率のリーダーペプチドと交換さ れて分泌を容易にした（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３，１９９０ ）。構築に用いられたプラスミドは、哺乳類の発現ベクターであるｐＣＤＭ７の 誘導体であり、強力なヒトのＣＭＶ前初期プロモーターの制御の下に上記の挿入 された遺伝子を転写する。 野性型及び人工のｇｐ１２０をコードする配列を比較するために、上記の人工 ｇｐ１２０をコードする配列を哺乳類の発現ベクターに挿入して一過性トランス フェクションアッセイで検査した。異なったウイルスの分離物と個別のリーダー 配列によによって誘導された人工産物との間の発現レベルにおける変動を除外す るために、幾つかの異なった天然のｇｐ１２０遺伝子が対照として用いられた。 対照として用いられたｇｐ１２０ＨＩＶ ＩＩＩｂ構成体は、ＳａｌｌＩＸｈｏ Ｉ ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２エンベロープ断片を鋳型として用いてＰＣＲにより生 成された。ＰＣＲにより導入される突然変異を除外するために、上記遺伝子の約 １．２ｋｂを含むＫｐｎＩ／ＥａｒＩ断片が、上記プロウイルスのクローンから の特定の配列と交換された。対照として用いられた野性型ｇｐ１２０ｍｎ構成体 は、ＨＩＶ−１ＭＮに感染したＣ８１６６細胞からＰＣＲによってクローンされ （ＡＩＤＳレポジトリー、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）、天然のエン ベロープ、或いはＣＤ５リーダー配列を持つｇｐ１２０を発現した。この場合、 プロウイルスのクローンは入手出来なかったので、各構成体の二つのクローンが ＰＣＲによる人工産物を回避するために検査された。分泌されるｇｐ１２０の量 を半定量的に測定するために、リン酸カルシウムを用いた共沈殿法により一過性 にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清を、可溶性ＣＤ４：免疫グロブリ ン融合タンパク質及びプロテインＡセファロースを用いて免疫沈降を行った。 この分析の結果（図３）は、人工遺伝子の生成物が、天然のｇｐ１２０の諸対 照と比較して極めて高レベルで発現されることを示している。上記の人工ｇｐ１ ２０遺伝子産物の分子量は、対照の諸タンパク質（図３）に匹敵し、１００から １１０ｋｄの範囲にあると思われた。幾分より早いバンドの移動は、ある種の腫 瘍細胞系、例えば、２９３Ｔにおいて、グリコシル化が完全でないか、或いはあ る程度変化しているという事実によって説明することが出来る。 発現を更に正確に比較するために、ｇｐ１２０タンパク質のレベルを非動貢相 においてＣＤ４を用いｇｐ１２０のＥＬＩＳＡ法を利用して定量した。この分析 （図４）は、ＥＬＩＳＡのデータが免疫沈殿法のデータに匹敵し、ｇｐ１２０の 濃度が、人工のｇｐ１２０遺伝子に対しては約１２５ｎｇ／ｍｌであり、すべて の天然のｇｐ１２０遺伝子に対してはバックグラウンド差引分（５ｎｇ／ｍｌ） 以下であった。この様に、人工ｇｐ１２０遺伝子の発現は、野性型ｇｐ１２０遺 伝子よりも少なくとも一桁高い様に思われる。ここに示された実験において、そ の増加は少なくとも２５倍であった。ｇｐ１２０の発現におけるｒｅｖの役割 ｒｅｖ遺伝子がウイルスの転写体の発現における幾つかの段階でその効果を及 ぼすと思われるので、人工ｇｐ１２０遺伝子の改善された発現における非翻訳的 効果の役割の可能性を検討した。先ず、負のシグナル、即ち、ｍＲＮＡの崩壊、 或いは核内保留の増大をもたらす要素が、ヌクレオチド配列を変更することによ り除去された可能性を除外するために、細胞質のｍＲＮＡレベルを検査した。細 胞質のｍＲＮＡは、一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＮＰ４０に よる溶解に引き続き遠心分離法による核の除去によって調製した。細胞質のｍＲ ＮＡは、次いで、細胞溶解物からフェノールによる多重抽出及び沈殿によって調 製し、スロットブロット装置を用いてニトロセルロース上へスポットし、最終的 にエンベロープに特異的なプローブとハイブリダイズさせた。 簡単に述べると、ＣＤＭ＆、ｇｐ１２０ＩＩＩＢ、或いはｓｙｎｇｐ１２０に 感染させた２９３細胞の細胞質ｍＲＮＡを感染後３６時間で分離した。７．５プ ロモーターの制御下にあるｇｐ１２０ＩＩＩｂ、或いは人工のｇｐ１２０遺伝子 を発現する野性型のワクシニアウイルス、又は組換えウイルスに感染したＨｅｌ ａ細胞の細胞質ＲＮＡを感染後１６時間で分離した。その等量をスロットブロッ ト装置を用いてニトロセルローズ上へスポットし、ランダムに標識された１．５ ｋｂのｇｐ１２０ＩＩＩｂ及びｇｐ１２０切片、或いはヒトのβアクチンとハイ ブリダイズさせた。ＲＮＡの発現レベルは、ハイブリダイズされたメンブランを フォスフォイメージャーで走査することによって定量された。使用された操作を 以下に更に詳細に説明する。 この実験により、天然の或いは人工のｇｐ１２０遺伝子でトランスフェクトさ れた細胞のｍＲＮＡレベルには有意の差が無かったことが証明された。事実、幾 つかの実験において、人工ｇｐ１２０遺伝子の細胞質ｍＲＮＡレベルは天然のｇ ｐ１２０遺伝子のそれよりも更に低いことさえあった。 これらのデータは、組換えワクシニアウイルスからの発現を測定することによ って確かめられた。ヒトの２９３細胞、或いはＨｅｌａ細胞を、野性型ｇｐ１２ ０ＩＩＩｂ又はｓｙｎｇｐ１２０ｍｎを発現するワクシニアウイルスに、少なく とも感染多重度１０で感染させた。感染後２４時間で上清を採集してＣＤ４：免 疫グロブリン融合タンパク質及びプロテインＡセファロースを用いて免疫沈降し た。この実験に使用された操作を以下に更に詳細に説明する。 この実験は、内在性の遺伝子産物及び人工遺伝子産物が、強力な混合の初期並 びに後期の７．５ｋプロモーターの制御下にあるワクシニアウイルス組換え体か ら発現される場合、人工遺伝子の発現の増大が、なお観察さることを証明した。 ワクシニアウイルスのｍＲＮＡは、細胞質で転写並びに翻訳されるので、この実 験における人工のエンベロープ遺伝子の発現の増大は核からの輸出の改善に帰す ることは出来ない。本実験は、二種類の追加のヒトの細胞系、即ち、腎癌細胞系 ２９３及びＨｅｌａ細胞において反復された。トランスフェクトされた２９３Ｔ 細胞における様に、ｍＲＮＡレベルは、いずれの組換えワクシニアウイルスに感 染させた２９３Ｔ細胞においても同様であった。レンチウイルスにおけるコドンの使用 コドンの使用が哺乳類の細胞における発現に少なからぬ影響を与えると思われ るので、他のレンチウイルスの遺伝子におけるコドンの使用頻度を検討した。こ の研究では、レトロウイルス全般の間に、コドンの選択について何ら明確なパタ ーンは見出されなかった。しかしながら、ＨＩＶ−１が属するレンチウイルス属 由来のウイルスを個別に分析したところ、ＨＴＶ−１の偏向と殆ど同一のコドン 使用の偏向が見出された。レンチウイルスを除く種々の（主としてタイプＣ）レ トロウイルスのエンベロープの糖タンパク質からコドンの使用頻度表を作成し、 ＨＩＶ−１と密接には関連していない四種のレンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウ イルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、及びビスナウイルス ）（表２）のエンベロープ配列から創成したコドンの頻度表を比較した。レンチ ウイルスに対するコドン使用のパターンは、一つの場合を除きすべての場合にお いて、ＨＩＶ−１のパターンと驚くほど類似しており、ＨＩＶ−１に対する好適 なコドンは他のレンチウイルスに対する好適なコドンと同一である。例外はプロ リンであり、プロリンは非ＨＩＶであるレンチウイルスのエンベロープの残基の ４１％においてＣＣＴによって、又残基の４０％においてはＣＣＡによってコー ドされており、これは、又、Ａで終わるトリプレットに対する有意の選択を明確 に反映する状況である。非レンチウイルスのエンベロープのタンパク質によるコ ドン使用のパターンは、Ａ残基の同様な優位性を示さず、又、三番目の位置のＣ 及びＧの方に高頻度に発現されるヒトの遺伝子に対するコドンの使用の様には偏 向していない。一般に、非レンチウイルスのレトロウイルスは異なったコドンを 更に均等に活用する様に思われ、これは、これらのウイルスがそれ程高度には発 現されないヒトの遺伝子と共有するパターンである。 表２ レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ（レンチ））及び非レンチウイルスのレトロ ウイルス（他）のエンベロープ遺伝子におけるコドンの使用頻度 コドンの使用頻度は、ウイスコンシン大学遺伝学部コンピュータグループによっ て確立されたＧＣＧプログラムを用いて計算された。各数字は、ある特定のコド ンが使用されている百分率を表す。非レンチウイルスのレトロウイルスのコドン 使用は、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス １、ヒトＴ細胞白血病ウイルス２、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）のミンク 細胞フォーカス形成単離物、ラウシャー脾臓フォーカス形成単離物、１０Ａ１単 離物、４０７０Ａ両種指向性の単離物、及び骨髄増殖性白血病ウイルス単離物の エンベロープ前駆体の配列から、並びにラット白血病ウイルス、サル肉腫ウイル ス、サルＴ細胞白血病ウイルス、白血病誘発性レトロウイルスＴ１２２３／Ｂ及 びテナガザル白血病ウイルスから編集された。非ＨＩＶ、非ＳＩＶのレンチウイ ルスに対するコドン使用頻度表は、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウ イルス、ネコ免疫不全ウイルス、及びビスナウイルスに対するエンベロープ前駆 体の配列から編集された。 Ａを含むコドンの優先性に加えて、レンチウイルスのコドンは表示の中で、強 いＣｐＧのＨＩＶパターンに固執し、そのためアラニン、プロリン、セリン及び トレオニンのトリプレットに対する三番目の位置がＧであることは稀である。レ トロウイルスのエンベロープのトリプレットは、ＣｐＧの表示の中で同様の、し かしそれ程著明でないパターンを示す。ＣｐＧ優先性に関するレンチウイルスと 他のレトロウイルスの間の最も明らかな違いは、アルギニンのトリプレットの中 でＣＧＸという変異トリプレットを使用することにあり、このトリプレットはレ トロウイルスのエンベロープをコードする配列の中に程よく頻繁に表示されるが 、匹敵するレンチウイルスの配列の中には殆ど全く存在しない。天然及び人工のｇｐ１２０間のｒｅｖ依存性の相違 ｒｅｖ遺伝子による制御がＨＩＶ−１のコドン使用に関連しているかどうかを 調べるために、天然及び人工の遺伝子の両者の発現に対するｒｅｖ遺伝子の影響 を検討した。ｒｅｖ遺伝子による制御にはｃｉｓ位にｒｅｖ遺伝子の結合部位で あるＲＲＥを必要とするので、この結合部位が天然遺伝子及び人工遺伝子両者の ３’非翻訳領域にクローンされた構築体を作成した。これらのプラスミドがｒｅ ｖ遺伝子と共に、或いは上記結合部位をｔｒａｎｓ位に持つ対照プラスミドが、 ２９３細胞に同時トランスフェクトされ、上清中のｇｐ１２０の発現レベルを免 疫沈殿法により半定量的に測定した。この実験に使用された操作を以下に更に詳 細に説明する。 図５Ａ及び図５Ｂに示される様に、ｒｅｖ遺伝子は天然のｇｐ１２０遺伝子の 発現を改善するが、人工ｇｐ１２０遺伝子の発現には何の効果も持たない。この 様に、ｒｅｖ遺伝子の作用は、内在性のウイルスのエンベロープ配列をコードす る配列の欠損している基質に対しては明らかではない。ＨＩＶエンベロープのコドンを付した人工ラットＴＨＹ−１遺伝子の発現 上述の実験から、「エンベロープ配列」が、実際にｒｅｖの制御に必須である と考えられた。この仮説を確かめるために、小型で概して高頻度発現する細胞表 面抗原である、ラットのＴＨＹ−１抗原（ｒＴＨＹ−１）をコードする人工遺伝 子を作製した。人工ｒＴＨＹ−１遺伝子の設計にあたっては、ＨＩＶのｇｐ１２ ０で使用されるコドンを持つようにした。また、ｍＲＮＡの不安定化に関連する ＡＵＵＵＡ配列は除いた。後の操作を簡便にするために、２つの制限酵素部位を 付加した（図６）。このＨＩＶエンベロープのコドン使用法を持つ人工遺伝子（ ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ）は、１５０塩基から１７０塩基の３つのオリゴヌクレオチ ドを用いて作製した（図７）。ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎとは異なり、ＰＣＲ産物を ｐＵＣ１２に直接クローニングして構築した後、ｐＣＤＭ７にクローニングした 。 天然のｒＴＨＹ−１と、ＨＩＶエンベロープのコドンを持つｒＴＨＹ−１の発 現レベルを、これらが一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の免疫蛍光 によって定量した。図８では、天然のｒＴＨＹ−１遺伝子の発現が、対照（ｐＣ ＤＭ７）のバックグラウンドレベルと比較して約二桁上昇していることを示して いる。一方、人工ｒＴＨＹ−１の発現は実質的にもとの遺伝子の発現よりも弱か った（ピークが低いチャンネル番号へ移動していることからわかる）。 ｍＲＮＡの分解を促進する負の配列要素がたまたま導入されてしまったという 可能性を否定するために、人工ｇｐ１２０遺伝子の３’末端にｒＴＨＹ−１ｅｎ ｖ遺伝子を連結された構造体を作製した（図９Ｂ）。この実験では、ｓｙｎｇｐ １２０ｍｎ遺伝子あるいはｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ／ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ融合遺伝 子（ｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ．ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ）のいずれかを２９３Ｔ細胞に トランスフェクトした。発現はＣＤ４／ＴｇＧ融合蛋白質とプロテインＡ−アガ ロースとを用いた免疫沈降によって測定した。この実験手順は後に詳述する。 人工ｇｐ１２０遺伝子はＵＡＧ停止コドンを持つので、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖが この転写産物から翻訳されることはない。もし分解の亢進に関わる負の要素がｒ ＴＨＹ−１ｅｎｖの配列に存在するならば、この構造体から発現するｇｐ１２０ 蛋白質のレベルは、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖを持たないｓｙｎｇｐ１２０ｍｎよりも 低下するはずである。図９Ａで示すように、両者の発現量は類似していたので、 低発現の原因が翻訳過程にあることが強く示唆された。Ｒｅｖに依存した、エンベロープのコドンを持つ人工ｒＴＨＹ−１遺伝子の発現 ｒｅｖが、エンベロープのコドンを持つｒＴＨＹ−１遺伝子の発現を制御可能 かどうかを探索するために、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖのオープンリーディングフレー ムの３’末端にｒｅｖ結合部位をもつ構造体を構築した。３’ＲＲＥを持つｒＴ ＨＹ−１ｅｎｖのｒｅｖ対する応答性を測定するために、ヒト２９３Ｔ細胞に、 ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｒｒｅと、ＣＤＭ７またはｐＣＭＶｒｅｖのいずれかとを同 時にトランスフェクトした。トランスフェクト後６０時間で、細胞を１ｍＭ Ｅ ＤＴＡを含むＰＢＳにて浮遊させ、抗ｒＴＨＹ−１マウスモノクローナル抗体Ｏ Ｘ−７とＦＩＴＣ標識二次抗体にて染色した。蛍光強度はＥＰＩＣＳ ＸＬサイ トフルオロメータにて測定した。これらの手順は後に詳述する。 実験を繰り返した結果、ｒｅｖとｒＴＨＹ−１ｅｎｖとを同時にトランスフェ クトした場合に、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖの発現がわずかに上昇することがわかった 。測定系の感度をさらに上げるために、分泌型ｒＴＨＹ−１ｅｎｖを発現する構 造体を作製した。これを用いることで、より信頼性の高いデータを得ることがで きる。なぜなら、表面発現蛋白質が測定する瞬間の産生率を反映すると思われる のに対して、培養上清中の分泌蛋白質の蓄積量は、ある一定期間の蛋白質産生を 反映するからである。分泌型を発現することができる遺伝子を、内在性リーダー 配列の３’末端と、フォスファチヂルイノシトール−グリカン・アンカーの配列 モチーフの５’側に、それぞれアニールする順向きプライマーと逆向きプライマ ーを用いたＰＣＲにて作製した。ＰＣＲ産物をＣＤ５リーダー配列をすでに含む プラスミドにクローニングすることにより、膜アンカーが除かれ、リーダー配列 が異種の（おそらくより効率的な）リーダー配列に置き換わったものが得られた 。 分泌型ｒＴＨＹ−１ｅｎｖのｒｅｖに対する応答性を、ＲＲＥ配列をシスに持 つ分泌型ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ（ｒＴＨＹ−１ｅｎｖＰＩ−ｒｒｅ）と、ｐＣＤＭ ７またはｐＣＭＶｒｅｖのいずれかとが同時にトランスフェクトされたヒト２９ ３Ｔ細胞の培養上清の免疫沈降によって測定した。ｒＴＨＹ１ｅｎｖＰＩ−ＲＲ Ｅは、オリゴヌクレオチド：cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac（配列番号３ ８）を順向きプライマー、オリゴヌクレオチド：cgcggatcccttgtattttgtactaata （配列番号３９）を逆向きプライマーとして用い、人工ｒＴＨＹ１ｅｎｖを鋳型 としたＰＣＲにて作製した。ＰＣＲ産物は、ＮｈｅＩとＮｏｔＩにて消化後、Ｃ Ｄ５リーダー配列およびＲＲＥ配列を含むプラスミドにクローニングした。³⁵Ｓ で標識した細胞の培養上清をトランスフェクト後７２時間で回収後、ｒＴＨＹ− １に対するマウスモノクローナル抗体ＯＸ−７および抗マウスＩｇＧ−セファロ ースによる沈殿物を１２％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。 この実験に於いて、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖのｒｅｖによる誘導が、先述の実験に 比べて顕著ではっきりしていたことから、ｒｅｖが、低頻用コドンにより抑制さ れている転写産物の翻訳を制御可能であるということが強く示唆された。ｒｅｖに依存しないｒＴＨＹ−１／免疫グロブリン融合蛋白質の発現 ｒｅｖへの応答性に関与する低頻用コドンを含む領域が、コード領域全体にわ たらなければならないか、または短い領域で十分なのか、を確かめるために、ｔ ＴＨＹ−１／免疫グロブリン融合蛋白質を作製した。すなわち、ｒＴＨＹ−１ｅ ｎｖ遺伝子（フォスファチヂルイノシトール−グリカン・アンカーに重要な配列 モチーフを持たない）をヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインに連結し た。これは、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩの制限酵素部位を付加したプライマー、およ び、鋳型としてｒＴＨＹ−１ｅｎｖを用いたアンカーＰＣＲにて作製した。ＰＣ Ｒ断片をＣＤ５表面分子のリーダー配列、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ 、ＣＨ２、ＣＨ３部分を含むプラスミドにクローニングした。続いて、ｒＴＨＹ −１ｅｎｖｅｇ１挿入断片を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＥａｇＩ断片をＲＲＥ配列を 持つｐＣＤＭ７由来のプラスミドにクローニングした。 ｒＴＨＹ−１ｅｎｖ／免疫グロブリン融合遺伝子（ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇ１ ｒｒｅ）の、ｒｅｖに対する応答を測定するために、ヒト２９３Ｔ細胞にｒTHＹ −１ｅｎｖｅｇ１ｒｒｅと、ｐＣＤＭ７またはｐＣＭＶｒｅｖのいずれかとを同 時にトランスフェクトした。ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇ１ｒｒｅは、ＮｈｅＩ部位 とＢａｍＨＩ部位をそれぞれ付加した順向きプライマーと逆向きプライマーを用 いたアンカーＰＣＲにて作製した。ＰＣＲ断片をＣＤ５表面分子のリーダー配列 、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含むプラス ミドにクローニングした。³⁵Ｓで標識した細胞の培養上清をトランスフェクト後 ７２時間で回収後、ｒＴＨＹ−１に対するマウスモノクローナル抗体ＯＸ−７お よび抗マウスＩｇＧ−セファロースによる沈殿物を１２％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ にかけた。これらの手順は後に詳述する。 ｒＴＨＹ−１ｅｎｖＰＩ−ｒｒｅ遺伝子産物の場合と同じく、ｒＴＨＹ−１ｅ ｎｖ／免疫グロブリン融合蛋白質は培養上清中に分泌された。それ故、この遺伝 子はｒｅｖによる誘導がかかると考えられる。しかしながら、ｒＴＨＹ−１ｅｎ ｖＰＩ−ｒｒｅの場合とは異なり、ｒｅｖをトランスに同時にトランスフェクト した場合では、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇ１の発現は全く、あるいはほとんど誘導 されなかった。 天然のｒＴＨＹ−１のコドンをもつ ｒＴＨＹ−１／免疫グロブリン融合蛋白 質と、ＨＩＶエンベロープのコドンをもつ融合蛋白質の発現を免疫沈降によって 測定した。すなわち、ヒト２９３Ｔ細胞にｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇ１（エンベロ ープのコドン）か、ｒＴＨＹ−１ｗｔｅｇ１（天然のコドン）のいずれかをトラ ンスフェクトした。ｒＴＨＹ−１ｗｔｅｇ１は、鋳型として天然のｒＴＨＹ−１ 遺伝子を含むプラスミドを用いた以外は、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇ１と同様の方 法にて作成した。³⁵Ｓで標識した細胞の培養上清をトランスフェクト後７２時間 で回収後、ｒＴＨＹ−１に対するマウスモノクローナル抗体ＯＸ−７および抗マ ウスＩｇＧ−セファロースによる沈殿物を１２％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた 。これらの手順は後に詳述する。 ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇ１の発現レベルは、野生型ｒＴＨＹ−１を融合蛋白質 の相手とした同様の構造体と比較して低下していたものの、なおもｒＴＨＹ−１ ｅｎｖよりは顕著に上昇していた。従って、融合蛋白質を構成する２つの蛋白質 の領域がともに発現レベルに影響を与えていると考えられた。ｒＴＨＹ−１ｅｎ ｖを加えた場合でも、その発現レベルは、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖのみ場合のレベル までには低下しない。それ故、ｒｅｖによる制御は、蛋白質の発現がほとんど完 全に抑制されている場合以外には効率的に働かないと思われる。ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子におけるコドンの選択性 ＨＩＶエンベロープ遺伝子と、高頻度発現しているヒト遺伝子とのあいだで、 コドンの使用頻度を直接比較したところ、２０個のアミノ酸すべてについて明確 な相違が見られた。ＨＩＶエンベロープ遺伝子では、２倍のコドン重複（縮重） がある９個のアミノ酸すべてにおいて、３番目の塩基にＡかＵが好んで使用され ているが、このことは、コドン選択性に統計的な有意差があることを示している 。つまり、９個が、等確率で２個を選んだときにそれがすべて同じものになる確 率は、およそ０．００４であることから、通常の基準からすれば３番目の塩基は ランダムに選択されているはずはないと考えられた。重複（縮重）度がさらに高 いコドンにおいてはアデニンを持つトリプレットへの強い選択性がみられるが、 これはコドンの選択性に偏りがあることのさらなる証明となる。一方、高頻度発 現している遺伝子では、３倍以上の重複度を持つコドンの３番目の位置ではＣや 、Ｃよりは低頻度にしろＧが使用されることが多く、ＨＩＶエンベロープ遺伝子 のコドン選択性とは全く異なっている。 天然のｇｐ１２０遺伝子のコドンを、高発現しているヒトの遺伝子のコドンへ 系統的に変換することによって、ｇｐ１２０の発現を劇的に上昇させることがで きた。ＥＬＩＳＡによる定量的な分析の結果、ヒト２９３Ｔ細胞へ一時的にトラ ンスフェクトされたあとの人工遺伝子の発現は、天然のｇｐ１２０と比較して少 なくとも２５倍以上になった。ＥＬＩＳＡ実験における濃縮のレベルはむしろ低 めであった。ＥＬＩＳＡはｇｐ１２０のＣＤ４への結合を指標にした定量法なの で、天然の、変性していないものだけが検出される。これが明らかな低発現の理 由かもしれない。細胞質中のｍＲＮＡレベルを測定した結果、蛋白質の発現量の 相違は翻訳時の相違に起因し、ｍＲＮＡの安定性に起因しないことがわかった。 ＨＩＶで見られたようなＡとＴへの選択性は、レトロウイルスでは一般的では ない。しかし、この科をレンチウイルスとレンチウイルス以外の二つの亜科に分 けると、レンチウイルスのコドンの３番目の塩基ではＡと、低頻度だがＴの選択 性が認められた。それ故、レンチウイルスが特徴的なエンベロープのコドンを有 しているのは逆転写や複製時にその塩基が受け継がれやすいからではなく、その ウイルスのクラスに特有な生理的理由によるのであろう。すでに触れたように、 レンチウイルスと複雑でないレトロウイルスとの間の主要な相違は、レンチウイ ルス特有の付加的な制御遺伝子や必須ではない付属遺伝子であるので、このよう な付加的な遺伝子の発現制御機構と、エンベロープの発現を制限する機構は密接 に関係している、と単純に考えることもできる。そのような制御機構に関わる蛋 白質としてもっとも可能性の高いｒｅｖは、実際にレンチウイルス特有の付加的 な遺伝子の一つで、全てのレンチウイルスが持っている。それ故、適切なコドン を使用するウイルスのｍＲＮＡは、ｒｅｖの促進的な作用を受けやすい転写産物 のクラスを形成すると考えられる。上記と同様の方法でこの仮説を検証したが、 今度はコドン使用法を逆向きに変換した。高頻度発現している細胞性遺伝子のコ ドンを、ＨＩＶエンベロープでもっとも頻用されるコドンに置き換えた。予想通 り、発現レベルは元の分子よりも顕著に低下し、とくに、表面発現分子の免疫蛍 光の分析ではほぼ二桁低下した。ｒｅｖをトランスに同時に発現させるか、ＲＲ Ｅ要素をシスに存在させた場合、表面分子の誘導はほとんどかからなかった。し かし、ＴＨＹ−１を分泌型分子として発現させた場合、ｒｅｖによる誘導はずっ と顕著であり、先の仮説を支持した。このことは、ｒｅｖの効果を著しく増幅さ せる分泌蛋白質が培養上清に蓄積することでおそらく説明できる。もし一般的に ｒｅｖの誘導が表面分子に対してほとんどかからないのならば、ｒｅｖによるＨ ＩＶエンベロープの誘導は、細胞表面ではなく細胞内のｇｐ１２０レベルを増加 させるのが目的であるに違いない。なぜそうなのかは今のところ全く不明である 。 ある遺伝子中のわずかの要素が、発現の制限や、ｒｅｖ依存性を与えるのに十 分であるか否かを確かめるために、エンベロープのコドンが遺伝子全体の３分の １しかないｒＴＨＹ−１ｅｎｖ／免疫グロブリン融合蛋白質を作製した。この融 合蛋白質の発現レベルは中間的な値であったので、ｒＴＨＹ−１ｅｎｖの負の配 列要素は免疫グロブリン部分に対して優性ではないことがわかった。この融合蛋 白質は、ｒｅｖに対してほとんど応答しなかったので、ほぼ完全に抑制されてい る遺伝子のみがｒｅｖ応答性でありうることがわかった。 コドン頻度表で見つかった他の特徴が、ＣｐＧトリプレットがほとんど使われ ていないということである。大腸菌、酵母、ショウジョウバエ、霊長類でのコド ン使用法の比較研究において分析された多数の霊長類の遺伝子において、もっと も使用頻度の低い８つのコドンは、いずれもＣｐＧ二塩基配列を含むコドンであ った。この二塩基モチーフを含むコドンは、他のレトロウイルスにおいてもほと んど使われていなかった。ＣｐＧを含むトリプレットが使われない理由が、Ｃｐ Ｇのシトシンのメチル化による遺伝子のサイレンシングの回避と何らかの関係が あると考えるのは妥当である。ＨＩＶ全体でＣｐＧ二塩基の予想される数は、そ の塩基構成から予想される値の約５分の１である。このことは、高い発現が回復 するという可能性と、実際にウイルスの病原性の過程で、ある遺伝子が高頻度発 現しなければならないという可能性を示しているのかもしれない。 ここで示した結果は、コドンの選択が蛋白質レベルに著しく影響することをは っきりと示しており、また、翻訳伸長反応が哺乳動物の遺伝子発現を制御してい ることを示唆している。しかしながら、他の因子も関与しうる。第一に、真核細 胞において、翻訳に供されないｍＲＮＡが多量に存在することは、ある場合には 、開始段階が翻訳の段階であることを示している。もしそうでなければ全ての転 写産物がリボソームで完全に覆われてしまうからである。また、もしリボソーム の停止とそれに続くｍＲＮＡの分解が蛋白質レベルを決定する機構であるとする と、 滅多に使われないコドンによって抑制された発現は、ここで示してきた方法では 回復しないと考えられる。翻訳が、開始と伸長の両方に影響を受けるとすると、 翻訳開始の速度あるいはリボソームへの会合速度が、ｍＲＮＡが発するシグナル によって制御されている、たとえばレンチウイルスのあるコドンが、翻訳開始の 効率が悪いＲＮＡをどこかに貯蔵し、蓄積させるように働いている、という可能 性が考えられる。なお、この機構による発現抑制は必ずしも速度論的である必要 はなく、例えば、一旦開始した翻訳反応が完了不能に陥る確率が、そこで使用さ れているコドンによって影響を受けることがあるかもしれない。このような機構 にあっては、あまり好ましくないコドンが多く含まれていると、後に続くポリペ プチド鎖を完成させる可能性が累積的に低下するのかもしれない。一方で、貯蔵 されていたＲＮＡが、ｒｅｖの作用により翻訳開始速度の改善に寄与するのであ ろう。ｒｅｖ応答性の転写産物ではアデニンが多く含まれるので、ＲＮＡアデニ ンのメチル化がこの翻訳抑制に関わっているのかもしれない。詳細な手法 以下の手法を上記の実験で用いた。 シークエンス解析 シークエンス解析にはウィスコンシン大学コンピュータグループにより開発さ れたソフトウェアを用いた。 プラスミドの構築 プラスミドの構築は以下の方法で行った。ベクターとインサートＤＮＡは、適 当な制限酵素の緩衝液中、０．５μｇ／１０μｌの濃度でにて１時間から４時間 消化した（総反応液量はおよそ３０μｌ）。消化したベクターは、ゲル電気泳動 前に１μｇ／ｍｌの仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼで１０％（ｖ／ｖ） にて、３０分間処理した。ベクターとインサートの消化物（各５μｌから１０μ １）を１．５％の低融点アガロースゲルでＴＡＥ緩衝液にて泳動した。必要なバ ンドを含むゲル切片を１．５ｍｌ反応チューブへ移したあと６５℃で溶解し、ア ガロースを除去することなく直接ライゲーション液に加えた。典型的なライゲー ションは、１×Ｌｏｗ緩衝液、１×Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｄｄｉｔｉｏｎｓ、２ ００から４００ユニットのリガーゼ、１μｌのベクター、４μｌのインサートか らなる２５μｌの反応液中で行った。必要に応じて、熱失活あるいはフェノール 抽出した消化物に１０分の１量の２５０μＭ ｄＮＴＰｓと２から５ユニットの Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを加えて室温に約２０分間おき、５’突出末端を平滑 化した。必要に応じて、熱失活あるいはフェノール抽出した消化物に１０分の１ 量の２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓと５から１０ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ を加えて３７℃に３０分間おき、３’突出末端を平滑化した。以下の緩衝液をこ れらの反応に用いた。１０×Ｌｏｗ緩衝液（６０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ ７． ５、６０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、４ｍｇ／ｍｌＢ ＳＡ、７０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．０２％アジ化ナトリウム）、 １０×Ｍｅｄｉｕｎ緩衝液（６０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、６０ｍＭ 塩 化マグネシウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、７０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．０２％アジ化ナトリウム）、１０×Ｈｉｇｈ 緩衝液（６０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、６０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ ０ｍＭ 塩化ナトリウム、４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、７０ｍＭ β−メルカプトエ タノール、０．０２％アジ化ナトリウム）、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｄｄｉ ｔｉｏｎｓ（１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ ｍＭ スペルミジン）、５０×ＴＡＥ（２Ｍトリス酢酸、５０ｍＭ ＥＤＴＡ） 。 オリゴヌクレオチド合成及び精製 オリゴヌクレオチドはＭｉｌｌｉｇｅｎ ８７５０合成機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ ｅ）にて合成した。カラムから３０％アンモニア水１ｍｌにてオリゴヌクレオチ ドを溶出し、５５℃で６から１２時間脱保護を行った。脱保護した１５０μｌの オリゴヌクレオチドを、１０倍量のｎ−ブタノールを加えたあと微量遠心機にて 毎分１５０００回転で沈殿させた。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、５０μｌ の水に溶解した。３３３分の１に希釈して２６０ｎｍにおける光学密度を測定す ることにより濃度を求めた（１ＯＤ₂₆₀＝３０μｇ／ｍｌ）。 以下のオリゴヌクレオチドを合成ｇｐ１２０遺伝子の構築に用いた（文中のす べての塩基配列は５’から３’の方向である）。 ポリメラーゼ連鎖反応 両端にアニールする、１５から２５塩基がオーバーラップしている短いオリゴ ヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による長いオリゴヌクレオチ ドの増幅に用いた。典型的なＰＣＲ条件は、３５サイクル、アニーリング温度５ ５℃、伸長時間０．２秒、である。ＰＣＲ産物は、ゲルから精製し、フェノール 抽出を行い、続いて、２つの隣接する小断片からなる、より長い断片を作製する ためのＰＣＲに用いた。この長い断片を、ＣＤ５表面分子のリーダー配列とそれ に続くＮｈｅＩ／ＰｓｔＩ／ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩポリリンカーを 含むｐＣＤＭ７由来のプラスミドにクローニング化た。 以下の溶液をこれらの反応に用いた。１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ塩化カ リウム、１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、８ｍＭ塩化マグネシウム、各２ｍ Ｍ ｄＮＴＰｓ）。Ｔａｑポリメラーゼの忠実度を上げるために、最終的な緩衝 液には１０％ ＤＭＳＯを補った。 少量のＤＮＡ調製 形質転換した大腸菌を３ｍｌ ＬＢ培養液にて６時間以上または一晩生育させ た。約１．５ｍｌの各菌液を１．５ｍｌ遠心チユーブに移し、２０秒間遠心して 細胞を沈殿させ、２００μｌの溶液Ｉに懸濁した。続いて、４００μｌの溶液Ｉ Ｉと３００μｌの溶液ＩＩＩを加えた。遠心チユーブに蓋をして混合し、３０秒 以上遠心した。上清を新しいチューブに移し、フェノール抽出を１回行った。チ ューブにイソプロパノールを加えて混合し、２分以上速心してＤＮＡを沈殿させ た。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、１０μｌ ＲＮａｓｅＡを含む脱イオン 水５０μｌに溶解した。以下の培地と溶液をこれらの手順で用いた。ＬＢ培地（ １．０％ 塩化ナトリウム、０．５％ 酵母エキス、１．０％ トリプトン）、 溶液Ｉ（１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）、溶液ＩＩ（０．２Ｍ 水酸化ナ トリウム、１．０％ ＳＤＳ）、溶液ＩＩＩ（２．５Ｍ酢酸カリウム、２．５Ｍ 氷酢酸）、フェノール（ｐＨ６．０に調整し、ＴＥを重層）、ＴＥ（１０ｍＭト リス塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）。 ＤＮＡの大量調製 形質転換した大腸菌を１リットルの培養液で２４から３６時間（ｐＣＤＭ誘導 体にて形質転換したＭＣ１０６１ｐ３）または１２から１６時間（ｐＵＣ誘導体 にて形質転換したＭＣ１０６１）、３７℃にて、Ｍ９培地（ｐＣＤＭ誘導体）ま たはＬＢ（ｐＵＣ誘導体）にて培養した。大腸菌を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ６遠心 機を用い、毎分４２００回転、２０分間にて１リットルのボトルで遠心した。沈 殿を４０ｍｌの溶液Ｉに懸濁した。続いて、８０ｍｌの溶液ＩＩと４０ｍｌの溶 液ＩＩＩを加え、２から３ｍｍの塊になるまでやや勢いよくボトルを振盪した。 ボトルを毎分４２００回転で１０分間遠心し、上清をチーズクロスで濾しつつ２ ５０ｍｌのボトルに移した。 イソプロパノールをボトルの上端まで注ぎ、毎分４２００回転で１０分間遠心 した。沈殿を４．１ｍｌの溶液Ｉに溶解し、４．５ｇの塩化セシウム、０．３ｍ ｌの１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム、０．０ｍｌの１ ％ トリトンＸ１００を 加えた。チューブをＢｅｃｋｍａｎ Ｊ２高速遠心機にて、毎分１００００回転 で５分間遠心した。上清をＢｅｃｋｍａｎクイックシール超遠心チューブへ移し てシールし、ＮＶＴ９０固定角ロータを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心機で毎分 ８００００回転にて２．５時間以上遠心した。２０Ｇ針を付けた１ｍｌシリンジ にて、可視光下のバンドを抽出し、等量の脱イオン水を加えた。ＤＮＡを１Ｍ塩 化ナトリウムで飽和したｎ−ブタノールにて一回抽出し、等量の１０Ｍ酢酸アン モニウム／１ｍＭＥＤＴＡを加えた。１３ｍｌチューブに移し、エタノールを上 端まで加えて混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２遠心機で毎分１００００回転で１０ 分間遠心した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、０．５から１ｍｌの水に溶解 した。２００分の１に希釈して２６０ ｎｍにおける光学密度を測定することに より濃度を求めた（１ＯＤ₂₆₀＝５０μｇ／ｍｌ）。 以下の培地及び緩衝液を上記手順において用いた。Ｍ９培地（１０ｇ Ｍ９ｓ ａｌｔｓ、１０ｇカザミノ酸（水和物）、１０ｍｌ Ｍ９ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓ、７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（１５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を５０ ０μｌ）、１２．５μｇ／ｍｌアンピシリン（１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を １２５μｌ）、Ｍ９ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ（１０ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍ Ｍ硫酸マグネシウム、２００μｇ／ｍｌチアミン、７０％グリセリン）、ＬＢ培 地（１．０％ 塩化ナトリウム、０．５ ％ 酵母エキス、１．０％ トリプト ン）、溶液Ｉ（１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）、溶液ＩＩ（０．２Ｍ 水酸 化ナトリウム、１．０％ ＳＤＳ）、溶液ＩＩＩ（２．５Ｍ 酢酸カリウム、２ ．５ Ｍ氷酢酸）。 塩基配列の決定 人工遺伝子の塩基配列は、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ法にて決定した。すなわ ち、２０から５０μｇの二本鎖ＤＮＡを、０．５Ｍ水酸化ナトリウム、５分で変 性させた。続いて、１０分の１量の酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）、２倍量の エタノールを加え、５分間遠心してＤＮＡを沈殿させた。ペレットを７０ ％エ タノールで洗浄し、１μｇ／μｌの濃度になるように溶解した。アニーリング反 応は、１×アニーリング緩衝液中、４μｇの鋳型ＤＮＡと４０ｎｇのプライマー にて、１０μｌの反応液中でおこなった。反応液は６５℃から３７℃へゆっくり と冷却した。 別々のチューブに０．１Ｍ ＤＴＴを１μｌ、ラベリングミックスを２μｌ、 脱イオン水を０．７５μｌ、［³⁵Ｓ］ ｄＡＴＰ（１０μＣｉ）を１μｌ、Ｓｅ ｑｕｅｎａｓｅ^TM（１２ユニット／μｌ）を０．２５μｌを、それぞれの反応に ついて加えた。５μｌの混合液を、アニール済みのプライマー／鋳型の入ったチ ューブへ加え、室温にて５分間おいた。各ラベリング反応につき、４種のターミ ネーションミックスを２．５μｌずつ、テラサキプレートに加え、前もって３７ ℃で保温しておいた。３．５μｌのラベリング反応液を４種のターミネーション ミックスにそれぞれ加えた。５分後、ストップ溶液を４種のターミネーションミ ックスの各チューブに加え、テラサキプレートをオーブン中で８０℃で１０分間 保温した。シーケンシング反応液を５％変性ポリアクリルアミドゲルにて泳動し た。アクリルアミド溶液は、２００ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液、９５７ ｍｌの 脱イオン水を、１００ｇのアクリルアミド：ビスアクリルアミド（２９：１）に 加えて調製した。５％ポリアクリルアミド／４６％ 尿素／１×ＴＢＥゲルは、 ３８ｍｌのアクリルアミド溶液と２８ｇの尿素を混合して調製した。重合反応は ４００μｌの１０％ 過硫酸アンモニウムと６０μｌのＴＥＭＥＤを加えて開始 させた。シラン処理したガラス板とシャークティース型のコームを用いてゲル板 を作製し、１×ＴＢＥ緩衝液にて６０から１００Ｗで、２から４時間（読みたい 領域による）泳動した。ゲルをワットマンブロッティングペーパーに移し、８０ ℃で約一時間乾燥させたあと、室温にてＸ線フィルムを露光した。通常、１２時 間を露光時間とした。以下の緩衝液をこれらの手順で用いた。５×アニーリング 緩衝液（２００ｍＭトリス塩酸ｐＨ ７．５、１００ｍＭ塩化マグネシウム、２ ５０ｍＭ塩化ナトリウム）、ラベリングミックス（各７．５μＭのｄＣＴＰ、ｄ ＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、ターミネーションミックス（各８０μＭのｄＮＴＰ、５０ ｍＭ塩化ナトリウム、各８μＭのｄｄＮＴＰ）、ストップ溶液（９５ ％ ホル ムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ブロモフェノールブルー、０．０ ５％ キシレンシアノール）、５×ＴＢＥ（０．９Ｍトリスホウ酸、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ポリアクリルアミド溶液（９６．７ｇポリアクリルアミド、３．３ ｇビスアクリルアミド、２００ｍｌ １×ＴＢＥ、９５７ｍｌ脱イオン水）。 ＲＮＡの単離 リン酸カルシウムにてトランスフェクト後３６時間の２９３Ｔ細胞およびワク シニア感染後１６時間のＨｅｌａ細胞の、細胞質中のＲＮＡは、Ｇｉｌｍａｎが 述べている方法にて単離した（Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from t issue culture cells．In Current Protocol in Molecular Biology，Ausbel et al.，eds，Wiley & Sons，New York，１９９２）。手短に言えば、細胞を４０ ０μｌの溶解緩衝液にて溶解し、遠心して核を除去し、ＳＤＳとプロテイナーゼ Ｋをそれぞれ０．２ ％と０．２ｍｇ／ｍｌになるように加えた。細胞質抽出液 を３７℃で２０分間保温し、フェノール／クロロホルム抽出を二回行ったあと、 沈殿させた。ＲＮＡは１００μｌの緩衝液Ｉに溶解し、３７℃で２０分間保温し た。２５μｌのストップ緩衝液を加え、再度沈殿させることで反応を止めた。 以下の緩衝液をこれらの手順で用いた。溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８． ０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％ ＮＰ４０ を含むＴＲＵＳＴＥＥ）、緩衝液Ｉ（１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ＤＴ Ｔ、０．５ユニット／μｌ 胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、０．１ユニット／μｌ Ｒ Ｎａｓｅ除去ＤＮａｓｅ Ｉを含むＴＲＵＳＴＥＥ緩衝液）、ストップ緩衝液（ ５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５Ｍ酢酸ナトリウム、１．０％ ＳＤＳ）。 スロットブロット解析 細胞質ＲＮＡの１０μｇを５０μｌの脱イオン水に溶解し、１５０μｌの１０ ×ＳＳＣ／１８％ホルムアミドを加え、スロットブロット解析に供した。ＲＮＡ を６５℃で１５分間保温し、スロットブロット装置上に滴下した。１．５ｋｂの ｇｐ１２０ＩＩＩｂとｓｙｎｇｐ１２０ｍｎ断片を放射能標識してハイブリダイ ゼーションのプローブとした。２つの断片のおのおのを、５×オリゴ標識緩衝液 、８μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、４μｌの［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰ （２ ０μＣｉ／μｌ； ６０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、５ユニットのＫｌｅｎｏｗ断 片を含む５０μｌの反応液中でランダム標識した。３７℃で１から３時間保温し た後、１００μｌのＴＲＵＳＴＥＥを加え、取り込まれなかった［α−³²Ｐ］− ｄＣＴＰをＧ５０スピンカラムを用いて取り除いた。活性をＢｅｃｋｍａｎベー タカウンターで測定し、同じ比放射能をハイブリダイゼーションに用いた。メン ブレンは、プレハイブリダイゼーションを２時間、ハイブリダイゼーションを１ ２から２４時間、ハイブリダイゼーション液１ｍｌあたり０．５×１０⁶ｃｐｍ のプローブを添加して、４２℃にて行った。メンブレンは洗浄緩衝液Ｉにて室温 で二回（５分間）、洗浄緩衝液ＩＩにて６５℃で１時間、それぞれ洗浄し、Ｘ線 フィルムに露光した。同様の結果は、３’非翻訳領域を含むｐＣＤＭ７のＮｏｔ Ｉ／ＳｆｉＩの１．１ｋｂ断片を用いても得られた。ヒトβアクチンプローブを 用いた対照のハイブリダイゼーションも並行して行った。ＲＮＡの発現は、Ｍａ ｇｎｅｔｉｃ Ｄｙｎａｍｉｃｓのフォスフォイメージャーにてハイブリダイズ 済のニトロセルロースメンブレンをスキャンすることで定量した。 以下の緩衝液をこれらの手順で用いた。５×オリゴ標識緩衝液（２５０ｍＭト リス塩酸ｐＨ ８．０、２５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ β−メルカプトエ タノール、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＴＴＰ、１Ｍ Ｈ ｅｐｅｓ ｐＨ６．６、１ｍｇ／ｍｌ ヘキサヌクレオチド［ｄＮＴＰ］６）、 ハイブリダイゼーション液（０．０５ Ｍリン酸ナトリウム、２５０ ｍＭ塩化 ナトリウム、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ 硫酸デキストラン、５０ ％ ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）、洗浄緩衝液Ｉ（２ ×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）、洗浄緩衝液ＩＩ（０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）、２０×ＳＳＣ（３Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍ クエン酸三ナトリ ウム、ｐＨ７．０に調整）。 ワクシニアの組換え ワクシニアの組換えはＲｏｍｅｏとＳｅｅｄの方法（Ｒｏｍｅｏ ａｎｄ Ｓ ｅｅｄ， Ｃｅｌｌ， ６４：１０３７， １９９１）を改変して行った。手短 に言えば、７０から９０％コンフルエントなＣＶ１細胞に１から３μｌの野生型 ワクシニアＷＲ（２×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ）を一時間、仔牛血清を含まない培地 中で感染させた。２４時間後、該細胞にディッシュあたり２５μｇのＴＫＧプラ スミドＤＮＡを、リン酸カルシウムにてトランスフェクトした。さらに２４から ４８時間経過後、該細胞をプレートから剥がして遠心し、１ｍｌになるように懸 濁した。冷凍／融解を三回繰り返したあと０．０５ｍｇ／ｍｌになるようにトリ プシンを加え、ライセートを２０分間置いた。１０、１、０．１μｌのライセー トを、小プレート（６ｃｍ）上のＣＶ１細胞の感染に用いた。このＣＶ１細胞は 、１２．５μｇ／ｍｌマイコフェノール酸、０．２５ｍｇ／ｍｌキサンチン、１ ．３６ｍｇ／ｍｌヒポキサンチン、で６時間前処理した。感染した細胞は、２か ら３日培養したあと、ｇｐ１２０に対するＮＥＡ９３０１モノクローナル抗体と アルカリフォスファターゼ標識二次抗体にて染色した。細胞を０．３３ｍｇ／ｍ ｌ ＮＢＴと０．１６ｍｇ／ｍｌ ＢＣＩＰを含むＡＰ緩衝液中に置き、ＰＢＳ で作製した１％ アガロースを重層した。陽性のプラークを拾って１００μｌの トリスｐＨ ９．０に懸濁した。プラークの精製をもう一度繰り返した。高力価 のストックを得るために、感染の規模を徐々に大きくしていった。最終的に、一 枚の大プレートでその前の回の半分のウイルスをＨｅｌａ細胞に感染させた。感 染した細胞は３ｍｌのＰＢＳ中で剥がし、Ｄｏｕｎｃｅ破砕機にて破砕し、大き な塊を遠心で除いて透明な液にした。ＶＰＥ−８組換えワクシニアはＡＩＤＳ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから供与された。また、７． ５混合早期／後期プロモーターの制御下でＨＩＶ−ＩＴＩｂ ｇｐ１２０を発現 させた（Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， ６５：３１， １９ ９１）。組換えワクシニアをを用いたすべての実験では、細胞は多重感染度１０ 以上で感染させた。 以下の溶液をこの手順で用いた。ＡＰ緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ９． ５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム）。 細胞培養 サル腎臓癌腫細胞株ＣＶｌ、ＣＯＳ７、ヒト腎臓癌腫細胞株２９３Ｔ、ヒト子 宮頚癌細胞株Ｈｅｌａ、はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得、サプリメンティッドＩＭＤＭにて継代した。１０ｃ ｍの組織培養プレート上で維持し、通常、３から４日ごとに５分の１から２０分 の１希釈した。以下の培地をここでの手順に用いた。サプリメンティッドＩＭＤ Ｍ（９０％ Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｅｄ ｉｕｍ、１０％ 仔牛血清、鉄分添加、熱失活５６℃３０分、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．５ ｍＭ β−メルカ プトエタノール（５ Ｍ 水酸化ナトリウム０．５ｍ１にてｐＨを調整）。 トランスフェクション ２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウムによるトランスフェクションでは、ゆっくり とボルテックスで攪拌しつつ０．２５Ｍ塩化カルシウム２５０μｌ中の１０μｇ のプラスミドＤＮＡを等量の２×ＨＥＢＥＳ緩衝液へ加えた。１０から３０分間 室温に置いたあと、ＤＮＡの沈殿を５０から７０％コンフルエントの細胞を含む 小プレートに加えた。ｒｅｖと同時にトランスフェクションする場合は、１０μ ｇのｇｐ１２０ＩＩＩｂ、ｇｐ１２０ＩＩＩｂｒｒｅ、ｇｐ１２０ｍｎｒｒｅ、 ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｅｇｒｒｅと、１０μｇのｐＣＭＶまたはｐＣＤＭ７プラス ミドＤＮＡを用いた。 以下の溶液をここでの手順に使用した。２×ＨＥＢＥＳ緩衝Ｍ（２８０ｍＭ塩 化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、フィルター滅 菌）、０．２５ｍＭ塩化カルシウム（オートクレーブ滅菌）。 免疫沈降 培地交換から４８から６０時間後、２００μＣｉの³⁵Ｓをを含むシステイン／ メチオニン除去培地にてさらに１２時間培養した。培養上清を回収し、毎分３０ ００回転で１５分間遠心し、塊を除いた。プロテアーゼ阻害剤であるロイペプチ ン、アプロチニン、ＰＭＳＦを２．５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌになるよう に添加後、１ｍｌの上清を１０μｌのパック済みプロテインＡ−セファロースの み（ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｒｇ１ｒｒｅ）、またはプロテインＡ−セファロースと ３μｇの精製したＣＤ４／免疫グロブリン融合蛋白質（Ｂｅｈｒｉｎｇより供与 ）（すべてｇｐ１２０由来）とを回転機上で４℃で１２時間置いた。続いて、該 プロテインＡ粒子を５から１５分間ずつ、５回洗浄した。最後の洗浄のあと１０ μｌのローディング緩衝液を加え、３分間沸騰水に浸け、７％（すべてｇｐ１２ ０由来）または１０％（ｒＴＨＹ−１ｅｎｖｒｇ１ｒｒｅ）ポリアクリルアミド ゲル（分離ゲルではトリスｐＨ８．８緩衝液、濃縮ゲルではトリスｐＨ６．８緩 衝液、トリス−グリシン泳動緩衝液、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｓｕ ｐｒａ １９８９）に供した。ゲルは１０％ 酢／１０％ メタノールで固定し たあと、Ａｍｐｌｉｆｙにて２０分間処理し、乾燥させ１２時間露光した。 以下の緩衝液と溶液をここでの手順に使用した。洗浄緩衝液（１００ ｍＭト リスｐＨ ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、１ ％ ＮＰ−４０）、５×泳動緩衝液（１２５ ｍＭトリス、１．２５ Ｍグリシン 、０．５％ ＳＤＳ）、ローディング緩衝液（１０％ グリセリン、４％ ＳＤ Ｓ、４％ β−メルカプトエタノール、０．０２％ ブロモフェノールブルー） 。 免疫蛍光 ２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウム共沈にてトランスフェクトしてから３日後の 、表面ＴＨＹ−１の発現を解析した。１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて浮遊させた 細胞を、２５０分の１希釈したＯＸ−７モノクローナル抗体で４℃、２０分間処 理したあと、ＰＢＳで洗浄し、次に５００分の１希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マ ウス免疫グロブリン抗血清と反応させた。再度細胞を洗浄し、０．５ｍｌの固定 液に懸濁し、ＥＰＩＣＳ ＸＬサイトフルオロメータ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）にて解 析した。 以下の溶液をここでの手順に使用した。ＰＢＳ（１３７ｍＭ 塩化ナトリウム 、 ２．７ｍＭ 塩化カリウム、４．３ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、１．４ｍＭ リン酸二水素カリウム、ｐＨ ７．４に調整）、固定液（ＰＢＳで作製した２ ％ ホルムアミド）。 ＥＬＩＳＡ 培養上消中のｇｐ１２０の濃度はＣＤ４でコートしたＥＬＴＳＡプレートと、 ヤギ抗ｇｐ１２０抗血清とを用い、可溶層にて決定した。リン酸カルシウム法に てトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清を４日後に回収し、毎分３００ ０回転で１０分遠心して塊を除去したあと、プレート上で４℃、１２時問置いた 。ＰＢＳで６回洗浄したあと、２００分の１希釈したヤギ抗ｇｐ１２０抗血清を １００μｌ加え、２時間置いた。再度プレートを洗浄し、１０００分の１希釈し たペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗血清にて２時間処理した。次に、 プレートを洗浄し、クエン酸ナトリウム緩衝液中にｏ−フェニレンジアミンを２ ｍｇ／ｍｌの濃度で含む１００μｌの基質溶液を加えて、３０分間置いた。反応 は１００μｌの４Ｍ硫酸にて最終的に停止させた。Ｃｏｕｌｔｅｒマイクロプレ ートリーダで４９０ｎｍにてプレートを読みとった。以下の緩衝液及び溶液をこ こでの手順で使用した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ中にＮＰ４０を０．１％ の濃度で 含む）、基質溶液（クエン酸ナトリウム緩衝液中にｏ−フェニレンジアミンを２ ｍｇ／ｍｌの濃度で含む）。 ［実施例２］人工緑色蛍光蛋白質 ｇｐ１２０においてコドンを置換することが効果的だったので、哺乳動物細胞 において他の蛋白質、例えば他の真核生物の蛋白質を発現させる際にも、好まし くないコドンを、やや好ましいものや好ましいものへの置換（また、やや好まし いものを好ましいものへの置換）を行うことで発現を増加させることができると 考えられる。 クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）（Ｗ ａｒｄ， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ４：１， １９７９ ； Ｐｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １１１：２２９， １９９２ ； Ｃｏｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：１２１２， １９９ ３）は、トランスフェクションや系列研究でのマーカーやレポーターとしての有 用性が期待されるため、最近話題となっている（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２， １９９４）。 天然のＧＦＰのコード配列から作ったコドン使用表を調べたところ、ＧＦＰの コドンの３番目の位置では、ＡかＵのどちらかが選択的に使用されていることが わかった。この場合の偏りはｇｐ１２０でみられた偏りよりはＡの選択性は低い ものの、かなりのものである。天然のＧＦＰの配列をｇｐ１２０と同じように操 作した人工遺伝子を作製した（図１１、配列番号４０）。加えて、ＧＦＰの翻訳 開始配列を共通の翻訳開始配列に置き換えた。その結果得られた蛋白質の発現は 、翻訳開始配列だけが最適になるように操作した野生型配列のものと大きく異な っていた（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。さらに、４９０ｎｍにおける励起効率を改善 することが報告され、それ故蛍光顕微鏡を用いた研究に盛んに使用されている、 ６５番目のセリンのスレオニンへの変異（Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕ ｒｅ ３７３：６６３， １９９５）を含めたときの効果を調べた（図１０Ｄ） 。コドンを操作することで、発現効率（トランスフェクションしたとき明らかに 陽性の細胞が含まれる割合）が顕著に上昇し、６５番目のセリンのスレオニンへ の変異とコドンの最適化を組み合わせることで、高い視認性をもつ哺乳動物のマ ーカー蛋白質をコードするＤＮＡ断片を得ることができた（図１０Ｄ）。 上述の人工緑色蛍光蛋白質をコードする塩基配列は、ｇｐ１２０の場合と同様 に、各々約１２０ｂｐの６つの断片から構築した。その際、制限酵素ＢｓａＩ、 ＢｂｓＩがその認識配列の外側を切断することを利用した。ＧＦＰのコード配列 の一部分を含み、フランキング配列の一端にＥｃｏＲＩとＢｓａＩ、他の一端に ＢａｍＨＩとＢｂｓＩをつけた長いオリゴヌクレオチドを合成した。それ故、各 オリゴヌクレオチドの配置は、ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩ／ＧＦＰ断片／ＢｂｓＩ／ ＢａｍＨＩとなる。ＢｓａＩ部位とＢｂｓＩ部位によって生まれる制限酵素部位 の末端は、隣に続くＧＦＰ断片の連結に適した末端ができるように設計した。合 成した各ＤＮＡ断片は、ＰＣＲで増幅し、ｐＵＣ９のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの 間にクローニングした後、塩基配列を決定した。続いて、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ処 理した６つの断片をライゲーションして、正しいコード配列を構築した。ライゲ ーションの結果得られた６つのプラスミドのうち、２つが正しい大きさのインサ ートを持ち、そのうち１つが求める配列の全長を含んでいた。６５番目のセリン のスレオニンへの変異はＰＣＲを用いた一般的な変異導入法にて導入した。その 際、人工ＧＦＰ中で唯一存在するＢｓｓＳＩ部位にオーバーラップするプライマ ーを用いた。哺乳動物細胞における発現を改善する戦略としてのコドンの最適化 ここで提示したデータは、哺乳動物および哺乳動物以外の真核生物の遺伝子を 哺乳動物細胞において発現させる際に、その発現を改善するために、コード配列 の再操作を行うことが普遍的に有用である可能性を示している。ＨＩＶ ｇｐ１ ２０、ラット細胞表面抗原ＴＨＹ−１、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの 緑色蛍光蛋白質、という３つの無関係な蛋白質から得られた結果や、ヒト第ＶＩ １１因子から得られた結果（後述）は、コドンの最適化という戦略が、哺乳動物 細胞における、あらゆる真核生物の遺伝子の発現を改善させるために有効である 、ということを証明しているのかもしれない。 ［実施例３］中央Ｂドメインを欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子を発現する、コドンを最適化した 遺伝子の設計 ７６０番目から１６３９番目のアミノ酸残基（前駆体の７７９番目から１６５ ８番目）を欠失した、成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする人工遺伝子を設計し た。高頻度発現しているヒト遺伝子で選択的に使用されているコドンを選択して 人工遺伝子を作製した。後の操作を考え、該遺伝子中で唯一であるような制限酵 素部位を導入するために、好ましい塩基のパターンにはそれほど固執しないこと にした。人工遺伝子を調製するために、該遺伝子を１５０ｂｐからなる２８個の 断片と、１６１ｂｐからなる２９番目の断片に分割した。 中央Ｂドメインを欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子を発現する人工遺伝子を、以下 のように構築した。２９対の鋳型オリゴヌクレオチド（後述）を合成した。５’ の鋳型のオリゴは１０５塩基、３’の鋳型のオリゴは１０４塩基からなる（１２ ５塩基からなるの最後の３’のオリゴを除く）。５’オリゴと３’オリゴで構成 される各アニール対が、１９ｂｐの二本鎖領域を形成するように鋳型オリゴを設 計した。 ＰＣＲとそれに続く操作を簡便にするために、各オリゴの対の５’末端の１８ 残基が変化しないように設計した。これによって、ＰＣＲの際に共通のプライマ ーペアで増幅させることができるだけでなく、ＰＣＲ条件を統一することができ る。５’末端の１８残基はｃｇｃ ｇａａ ｔｔｃ ｇｇａ ａｇａ ｃｃｃ（ 配列番号１１０）各鋳型の３’末端の１８残基はｇｇｇ ｇａｔ ｃｃｔ ｃａ ｃ ｇｔｃ ｔｃａ（配列番号４３）とした。 オリゴの対をアニールさせたあと、以下の反応液にてＰＣＲによる伸長、増幅 を行った。各鋳型をそれぞれ２００μｇ／ｍｌにて、ＰＣＲ緩衝液中（１０ｍＭ トリス塩酸、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ ／ｍｌゼラチン、ｐＨ８．３）でアニールさせた。ＰＣＲ反応液には、アニール 済みの鋳型２ｎｇ、１８塩基のプライマー２つ（後述）各０．５μｇ、ｄＮＴＰ ｓ各２００μＭ、ＤＭＳＯ １０％（ｖ／ｖ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｂｃｈｅｍｉｃａｌｓ社添付のＰＣＲ緩衝液、をそれぞれ加 え、最終量を５０μｌにした。Ｔａｑポリメラーゼ（２．５ユニット０．５μｌ ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を 添加後、Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにて２５サ イクル（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）の増幅を行った。最終サ イクルのあと、７２℃１０分伸長させた。 増幅した断片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（断片の５’と３’をそれぞれ切断す る）にて消化し、ｐＵＣ９をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断したものとライゲー ションした。 各クローンの塩基配列を決定し、目的の配列をすべて含むプラスミドを集めた 。増幅した断片のすぐとなりの、ＰＣＲプライマーの３’末端にある制限酵素部 位を利用して、各クローンの複数の断片を同時にライゲーションした。５’側Ｐ ＣＲプライマーに含まれるＢｂｓ１部位、３’側ＰＣＲプライマーに含まれるＢ ｓｍＢＩ部位は、それぞれの酵素が、増幅される部分の最初の塩基の手前を切断 す ることによって、増幅される部分の最初の４塩基からなる５’の突出末端ができ るように配置されている。ＢｂｓＩとＢｓｍＢＩとで同時に消化し、４塩基の５ ’の突出の配列が両末端でそれぞれ異なり、プライマー配列を含まない増幅断片 を得た。５’突出の配列自休は相補的ではないので、複数の断片を同時にライゲ ーションして高い効率で目的の産物を得ることができると考えられた。最初の２ ８本のオリゴヌクレオチド対の増幅産物のなかで、それぞれ独特の部分は１５４ ｂｐであり、消化後にはおのおのが独特の末端を持つ、１５０ｂｐの断片になっ た。最初と最後の断片はこのような方法を採らなかったが、これは構築した配列 を適当な哺乳動物細胞の発現ベクターに挿入するのを容易にするために、他の制 限酵素部位を導入したためである。実際の構築の過程は以下に示す。人工ヒト第ＶＩＩＩ因子の構築 第一段階：２９個の断片を連結して、１０個の断片にする アニールするとセグメント１から２９になる、２９対のオリゴヌクレオチドに ついて以下に述べる。 セグメント１、５、９、１２、１６、２０、２４、２７を持つプラスミドをＥ ｃｏＲＩとＢｓｍＢＩで消化して１７０ｂｐの断片を単離し、セグメント２、３ 、６、７、１０、１３、１７、１８、２１、２５、２８を持つプラスミドをＢｂ ｓＩとＢｓｍＢＩで消化して１７０ｂｐの断片を単離し、セグメント４、８、１ １、１４、１９、２２、２６、２９を持つプラスミドをＥｃｏＲＩとＢｂｓＩで 消化して１７０ｂｐの断片と２４４０ｂｐのベクター断片を単離した。セグメン ト１、２、３、４を含む断片をライゲーションし、セグメント「Ａ」を得、セグ メント５、６、７、８を含む断片をライゲーションし、セグメント「Ｂ」を得、 セグメント９、１０、１１を含む断片をライゲーションし、セグメント「Ｃ」を 得、セグメント１２、１３、１４を含む断片をライゲーションし、セグメント「 Ｄ」を得、セグメント１６、１７、１８、１９を含む断片をライゲーションし、 セグメント「Ｆ」を得、セグメント２０、２１、２２を含む断片をライゲーショ ンし、セグメント「Ｇ」を得、セグメント２４、２５、２６を含む断片をライゲ ーションし、セグメント「Ｉ」を得、セグメント２７、２８、２９を含む断片を ライゲーションし、セグメント「Ｊ」を得た。第二段階：第一段階で得られた１０個の断片を連結して、３個の断片にする セグメント「Ａ」、「Ｄ」、「Ｇ」を持つプラスミドをＥｃｏＲＩとＢｓｍＢ Ｉで消化し、セグメント「Ｂ」、１５、２３、「Ｉ」を持つプラスミドをＢｂｓ ＩとＢｓｍＢＩで消化し、セグメント「Ｃ」、「Ｆ」、「Ｊ」を持つプラスミド をＥｃｏＲＩとＢｂｓＩで消化した。セグメント「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」を含む 断片をライゲーションしセグメント「Ｋ」を得、セグメント「Ｄ」、１５、「Ｆ 」を含む断片をライゲーションしセグメント「Ｏ」を得、セグメント「Ｇ」、２ ３、「Ｉ」、「Ｊ」を含む断片をライゲーションしセグメント「Ｐ」を得た。 第三段階：最後に３つの断片を連結する セグメント「Ｋ」を持つプラスミドをＥｃｏＲＩとＢｓｍＢＩで消化し、セグ メント「Ｏ」を持つプラスミドをＢｂｓＩとＢｓｍＢＩで消化し、セグメント「 Ｐ」を持つプラスミドをＥｃｏＲＩとＢｂｓＩで消化した。得られた３つの断片 をライゲーションしてセグメント「Ｓ」を得た。 第四段階：哺乳動物の発現ベクターに人工遺伝子を挿入する セグメント「Ｓ」を持つプラスミドをＮｈｅＩとＮｏｔＩで消化し、プラスミ ドＣＤ５１ＮｅｇｌのＮｈｅＩ部位とＥａｇＩ部位との間に挿入し、プラスミド ｃｄ５ｌｓｆ８ｂ−を得た。人工第ＶＩＩＩ因子遺伝子の塩基配列の決定と修正 人工遺伝子を構築したあと、その塩基配列中にコードされるアミノ酸のうち、 ２つの望ましくない残基があることがわかった。ひとつは７４９番目のアルギニ ン残基で、これはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社がＧｅｎＢａｎｋに登録した配列には存 在するが、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社が文献にて報告した配列には存在しない。もう ひとつは１４６番目のアラニン残基である。これらはプロリンであるべきもので ある。２９個の構成断片の塩基配列を決定したあとのどこかの段階でこの変異が 起こったらしい。７４９番目のプロリンのアルギニンへの変異は、必要な塩基置 換を導入したＰＣＲプライマー(ctg ctt ctg acg cgt gct ggg gtg gcg gga gtt ：配列番号４４）を用いて修正した。このプライマーは後述する塩基配列中（Ｈ ｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ部分）、塩基番号２３３５のＭｌｕＩ部位を含む。この プライマーと、塩基番号２２２５のＳｇｒＡＩ部位の５’側のプライマー （ctg ctg aaa gtc tcc agc tgc：配列番号４５）とで挟まれる領域を増幅して 得られるＳｇｒＡＩ−ＭｌｕＩ断片を、もとの発現ベクターの同じ断片と置き換 えた。正しく修正されているかどうかは塩基配列を決定して確認した。１４６番 目のプロリンのアラニンへの変異は、必要な塩基置換を導入したオリゴヌクレオ チド（ggc agg tgc tta agg aga acg gcc cta tgg cca：配列番号４６）を用い て修正した。このプライマーは塩基番号５０４のＡｆＩＩＩ部位を含む。このプ ライマーと、cgt tgt tct tca tac gcg tct ggg gct cct cgg ggc（配列番号１ ０９）の配列を持つプライマーとで挟まれる領域をＰＣＲにて増幅した。得られ たＰＣＲ産物をＡｆＩＩＩとＡｖｒＩＩ（塩基番号９８９）で切断し、修正され た断片をもとの発現ベクターの断片と置き換えた。正しく修正されているかどう かは塩基配列を決定して確認した。中央Ｂ領域を欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子を発現する、天然遺伝子と同等な遺伝 子の構築 第ＶＩＩＩ因子の中央Ｂ領域が欠失しているが、天然のコドン配列をもつ蛋白 質の発現プラスミドを成熟蛋白質のコード配列の５’末端にＮｈｅＩを導入する プライマーcgc caa ggg cta gcc gcc acc aga aga tac tac ctg ggt（配列番号 ４７）を用いて構築した。該プライマーとプライマーatt cgt agt tgg ggt tcc tct gga cag（後述の塩基配列の塩基番号１０６７から１０９３）とを用いて増 幅させた。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩとＡｆＩＩＩ（下記配列の塩基番号３４５）に て切断し、得られた断片をあらかじめ適切に切断しておいた天然の第ＶＩＩＩ因 子を持つプラスミドに挿入した。Ｂ領域を欠失させるために、オーバーラップＰ ＣＲを行った。その際、オーバーラップの５’側のプライマーとしては、ctg ta t ttg atg aga acc g（後述の塩基配列の塩基番号１８１３から１８３１）とcaa gac tgg tgg ggt ggc att aaa ttg ctt t（配列番号４８）（下記配列の塩基配 列の塩基番号２３４２から２３７２の相補鎖）を用い、３’側のプライマーとし ては、aat gcc acc cca cca gtc ttg aaa cgc ca（配列番号４９）（下記配列の 塩基番号２３５２から２３８０）とcat ctg gat att gca ggg ag（配列番号５０ ）（塩基番号３１４５から３１６４の相補鎖）を用いた。別々に行った２つのＰ ＣＲ産物を混合し、一番外側のプライマーを用いて再度増幅させた。ＰＣＲ産 物をＡｓｐ７１８（ＫｐｎＩのイソ制限酵素、下記配列の塩基番号１８３７）と ＰｆｌＭＩ（下記配列の塩基番号３１００）にて切断し、得られた断片を、あら かじめ適切に切断しておいた天然の第ＶＩＩＩ因子を持つプラスミドに挿入した 。 天然のコドンを持つ、中央Ｂ領域を欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする 遺伝子の全塩基配列（配列番号４１）を、図１２に示す。中央Ｂ領域を欠失した 第ＶＩＩＩ因子をコードする人工遺伝子の全塩基配列（配列番号４２）を、図１ ３に示す。発現プラスミドの調製と検定 第ＶＩＩＩ因子をコードする天然遺伝子の発現プラスミドについては２つ、人 工遺伝子の発現プラスミドについては４つの、独立な大腸菌の形質転換体を増殖 させ、ＤＮＡを塩化セシウム密度勾配遠心にて調製した後フェノール抽出した。 プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の培養上清の解析から、人工遺伝 子は天然遺伝子のおよそ４倍量の第ＶＩＩＩ因子を産生することがわかった。 おのおのの第ＶＩＩＩ因子の発現プラスミドを６ｃｍディッシュ毎に５μｇず つ、ＤＥＡＥ−デキストラン法にてＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トラン スフェクト後７２時間で１０％仔牛血清を含む新鮮な培地を各プレートに４ｍｌ ずつ加えた。さらに１２時間後、各プレートから培養液のサンプルを回収した。 サンプルはマウス抗ヒト第ＶＩＩＩ因子軽鎖モノクローナル抗体と、ペルオキシ ダーゼ標識ヤギ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリクローナル抗体とを用いたＥＬＩＳＡ にて検定した。精製したヒト血漿第ＶＩＩＩ因子を標準物質として用いた。人工 第ＶＩＩＩ因子遺伝子は１３８±２０．２ｎｇ／ｍｌ（欠失のない第ＶＩＩＩ因 子のｎｇ／ｍｌ等量）の第ＶＩＩＩ因子を発現していたのに対し（ｎ＝４）、天 然第ＶＩＩＩ因子遺伝子は３３．５±０．７ｎｇ／ｍｌ（欠失のない第ＶＩＩＩ 因子のｎｇ／ｍｌ等量）の第ＶＩＩＩ因子を発現していたに過ぎなかった（ｎ＝ ２）。 以下の鋳型オリゴヌクレオチドを使用して人工第ＶＩＩＩ因子遺伝子を構築し た。 上述した天然及び人工遺伝子に使用されているコドンは、次の表３及び表４に 示した。 表３ 人工第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失遺伝子におけるコドン頻度 表４ 天然第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失遺伝子におけるコドン頻度 応用 本発明の人工遺伝子は、哺乳動物細胞で正常に発現している蛋白質を培養細胞 で発現させる際に有用である（例えばヒト成長ホルモン、組織プラスミノーゲン アクチベータ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子といったヒト蛋白質を商業的に生産 する際に）。本発明の人工遺伝子は遺伝子治療にも有用である。例えば、ある選 ばれた蛋白質をコードする人工遺伝子を細胞に導入して発現可能である場合、細 胞が、その蛋白質を必要としている患者に貢献できる可能性がある。そのような 、細胞を用いた遺伝子治療技術は、当業者には周知である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら 米国特許第５３９９３４９号、ＭｕｉｌｌｉｇａｎとＷｉｌｓｏｎ米国特許第５ ４６０９５９号などを参照のこと。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年９月１日（１９９８．９．１） 【補正内容】 請求の範囲 １．緑蛍光蛋白質をコードした人工遺伝子であって、 前記蛋白質をコードした天然遺伝子中の好ましくない又は好ましさの低いコド ンが同一アミノ酸をコードした好ましいコドンに置換され、 前記人工遺伝子が、インビトロ哺乳類細胞培養システムにおいて、同一条件下 における前記天然遺伝子の発現レベルと比べて少なくとも１１０％の発現レベル で前記蛋白質を発現させる能力を有することを特徴とする人工遺伝子。 ２．中央Ｂ領域ドメインが欠失した第VIII因子蛋白質をコードした人工遺伝子 であって、 前記蛋白質をコードした天然遺伝子中の好ましくない又は好ましさの低いコド ンが同一アミノ酸をコードした好ましいコドンに置換され、 前記人工遺伝子が、インビトロ哺乳類細胞培養システムにおいて、同一条件下 における前記天然遺伝子の発現レベルと比べて少なくとも１１０％の発現レベル で前記蛋白質を発現させる能力を有することを特徴とする緑蛍光蛋白質をコード した人工遺伝子。 ３．前記人工遺伝子が、インビトロの細胞培養システムにおいて、同一の条件 下で前記天然遺伝子の発現レベルに比べて少なくとも１５０％の発現レベルにお いて前記蛋白質を発現させる能力を有する請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子 。 ４．前記人工遺伝子が、インビトロの細胞培養システムにおいて、同一の条件 下で前記天然遺伝子の発現レベルに比べて少なくとも２００％の発現レベルにお いて前記蛋白質を発現させる能力を有する請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子 。 ５．前記人工遺伝子が、インビトロの細胞培養システムにおいて、同一の条件 下で前記天然遺伝子の発現レベルに比べて少なくとも５００％の発現レベルにお いて前記蛋白質を発現させる能力を有する請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子 。 ６．前記人工遺伝子が、インビトロの哺乳類細胞培養システムにおいて、同一 の条件下で前記天然遺伝子の発現レベルに比べて少なくとも１０００％の発現レ ベルにおいて前記蛋白質を発現し得る請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子。 ７．前記人工遺伝子の配列中にＣＧ配列の出現が５未満である請求の範囲１又 は２記載の人工遺伝子。 ８．前記天然遺伝子に含まれるコドンの少なくとも１０％が好ましくないコド ンである請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子。 ９．前記天然遺伝子に含まれるコドンの少なくとも５０％が好ましくないコド ンである請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子。 １０．前記天然遺伝子に存在する好ましくない又は好ましさの低いコドンの少な くとも５０％が好ましいコドンに置換されている請求の範囲１又は２記載の人工 遺伝子。 １１．前記天然遺伝子に存在する好ましくない又は好ましさの低いコドンの少な くとも９０％が好ましいコドンに置換されている請求の範囲１又は２記載の人工 遺伝子。 １２．前記コドンの２０％が好ましいコドンである請求の範囲１又は２記載の人 工遺伝子。 １３．前記遺伝子が配列番号４０のコード配列を有している請求の範囲１記載の 人工遺伝子。 １４．前記人工遺伝子が配列番号４２のコード配列を有している請求の範囲２記 載の人工遺伝子。 １５．請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子を有する発現ベクター。 １６．前記発現ベクターが哺乳類の発現ベクターである請求の範囲１５記載の発 現ベクター。 １７．請求の範囲１又は２記載の人工遺伝子を保持する哺乳動物細胞。 １８．人工緑蛍光遺伝子を調整する方法であって、 前記天然の緑蛍光蛋白質遺伝子中の好ましくない又は好ましさの低いコドンを 同定する工程と、 前記好ましくない又は好ましさの低いコドンの一つ以上を、置換用コドンとし て同一アミノ酸をコードした好ましいコドンで置換する工程とを含む人工緑蛍光 遺伝子の調整方法。 １９．中央Ｂ領域ドメインが欠失した第VIII因子蛋白質をコードした人工遺伝子 を調整する方法であって、 前記中央Ｂ領域ドメインが欠失した第VIII因子蛋白質をコードした天然遺伝子 中の好ましくない又は好ましさの低いコドンを同定する工程と、 前記好ましくない又は好ましさの低いコドンの一つ以上を、置換用コドンとし て同一アミノ酸をコードした好ましいコドンで置換する工程とを含むを人工遺伝 子の調整方法。 【図１】【図１】【図１】【図１】【図２】【図３】 【図４】【図５】【図６】【図７】【図８】 【図９】【図１０】【図１１】【図１２】【図１２】【図１３】【図１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．真核細胞で正常に発現する蛋白質をコードした人工の遺伝子であって、 前記蛋白質をコードした天然遺伝子における好ましくない又は好ましさの低い 少なくとも一つのコドンが同一のアミノ酸をコードした好ましいコドンに置換さ れ、 前記人工の遺伝子が、インビトロでの哺乳類の細胞培養システムにおいて、同 一の条件下で前記天然遺伝子おける発現レベルの少なくとも１１０％の発現レベ ルにおいて前記蛋白質を発現させる能力を有する人工遺伝子。 ２．前記人工遺伝子が、インビトロの細胞培養システムにおいて、同一の条件 下で前記天然遺伝子おける発現レベルの少なくとも１５０％の発現レベルにおい て前記蛋白質を発現させる能力を有する請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ３．前記人工遺伝子が、インビトロの細胞培養システムにおいて、同一の条件 下で前記天然遺伝子おける発現レベルの少なくとも２００％の発現レベルにおい て前記蛋白質を発現させる能力を有する請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ４．前記人工遺伝子が、インビトロの細胞培養システムにおいて、同一の条件 下で前記天然遺伝子おける発現レベルの少なくとも５００％の発現レベルにおい て前記蛋白質を発現させる能力を有する請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ５．前記人工遺伝子の配列中にＣＧ配列が５末満である請求の範囲１記載の人 工遺伝子。 ６．前記人工遺伝子が、前記天然遺伝子に含まれるコドンの１０％が好ましく ないコドンである請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ７．前記人工遺伝子が、前記天然遺伝子に含まれるコドンの５０％が好ましく ないコドンである請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ８．前記人工遺伝子が、前記天然遺伝子に存在する好ましくない又は好ましさ の低いコドンの５０％が好ましいコドンに置換されている請求の範囲１記載の人 工遺伝子。 ９．前記人工遺伝子が、前記天然遺伝子に存在する好ましくない又は好ましさ の低いコドンの９０％が好ましいコドンに置換されている請求の範囲１記載の人 工遺伝子。 １０．前記蛋白質が哺乳類の細胞において正常に発現されている請求の範囲１記 載の人工遺伝子。 １１．前記蛋白質がレトロウイルスの蛋白質である請求の範囲１記載の人工遺伝 子。 １２．前記蛋白質がレンチウイルスの蛋白質である請求の範囲１記載の人工遺伝 子。 １３．前記蛋白質がＨＩＶの蛋白質である請求の範囲１１記載の人工遺伝子。 １４．前記蛋白質が、ｇａｇ蛋白質、ｐｏｌ蛋白質及びｅｎｖ蛋白質からなる群 より選択される請求の範囲１３記載の人工遺伝子。 １５．前記蛋白質がｇｐ１２０蛋白質である請求の範囲１３記載の人工遺伝子。 １６．前記蛋白質がｇｐ１６０蛋白質である請求の範囲１３記載の人工造伝子。 １７．前記蛋白質がヒト由来の蛋白質である請求の範囲１記載の人工遺伝子。 １８．ヒト蛋白質が第ＶＩＩＩ因子である請求の範囲１記載の人工遺伝子。 １９．コドンの２０％が好ましいコドンである請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ２０．前記遺伝子が配列番号４２記載のコード配列を有している請求の範囲１８ 記載の人工遺伝子。 ２１．前記蛋白質が緑蛍光蛋白質である請求の範囲１記載の人工遺伝子。 ２２．前記人工遺伝子が、インビトロの哺乳類細胞培養システムにおいて、同一 の条件下で前記天然遺伝子おける発現レベルの少なくとも２００％の発現レベル において緑蛍光蛋白質を発現し得る請求の範囲２０記載の人工遺伝子。 ２３．前記人工遺伝子が、インビトロの哺乳類細胞培養システムにおいて、同一 の条件下で前記天然遺伝子おける発現レベルの少なくとも１０００％の発現レベ ルにおいて緑蛍光蛋白質を発現し得る請求の範囲２０記載の人工遺伝子。 ２４．図１１（配列番号４０）に記載の塩基配列を有する請求の範囲２１記載の 人工遺伝子。 ２５．請求の範囲１に記載の人工遺伝子を有する発現ベクター。 ２６．発現ベクターが哺乳類の発現ベクターである請求の範囲２５記載の発現ベ クター。 ２７．請求の範囲１記載の人工造伝子を保持する哺乳動物細胞。 ２８．哺乳類細胞において正常に発現する蛋白質をコードした人工遺伝子を調整 する方法であって、 前記蛋白質をコードした天然遺伝子中の好ましくない又は好ましさの低いコド ンを同定する工程と、 前記好ましくない又は好ましさの低いコドンの一つ以上を、置換用コドンとし て同一アミノ酸をコードした好ましいコドンで置換する工程とを含むを人工遺伝 子の調整方法。