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Bei
der multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine demyelinisierende
Krankheit des Zentralnervensystems (ZNS), deren vollständige Ursache
noch immer unbekannt ist.
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In
zahlreichen Arbeiten wurde die Hypothese einer viralen Ätiologie
der Krankheit vorgebracht, es hat sich aber keines der bekannten
Viren, die geprüft
wurden, als das gesuchte verursachende Agens erwiesen: eine Übersicht über die
Viren, die im Lauf der Jahre bei MS untersucht wurden, wurde von
E. Norrby und R. T. Johnson erstellt.
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In
jüngster
Zeit wurde bei MS-Patienten ein Retrovirus, das sich von den bekannten
menschlichen Retroviren unterscheidet, isoliert. Die Autoren konnten
auch zeigen, daß dieses
Retrovirus in vitro übertragen werden
konnte, daß MS-Patienten
Antikörper
produzierten, die Proteine, die mit der Infektion von leptomeningealen
Zellen mit diesem Retrovirus assoziiert sind, erkennen können, und
daß die
Expression dieses Retrovirus massiv durch die unmittelbar-frühen Gene
von gewissen Herpesviren stimuliert werden kann.
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Alle
diese Ergebnisse sprechen dafür,
daß mindestens
ein unbekanntes Retrovirus oder ein Virus mit einer nach dem von
H. Perron publizierten Verfahren nachweisbaren reverse Transkriptase
(RT)-Aktivität,
die mit der Bezeichnung "LM7-Typ-RT-Aktivität" bezeichnet wird,
bei MS ein Rolle spielen.
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Die
Arbeiten der Anmelderin haben es ermöglicht, mit einem Kulturverfahren
wie in dem Dokument WO-A-93/20188 beschrieben, auf das hiermit ausdrücklich Bezug
genommen wird, zwei kontinuierliche Zellinien, die mit natürlichen
Isolaten von zwei verschiedenen MS-Patienten infiziert waren, zu erhalten.
Diese zwei Linien, die von menschlichen Plexus-choroideus-Zellen stammten
und LM7PC und PLI-2 genannt wurden, wurden am 22. Juli 1992 bzw.
am 8. Januar 1993 unter den Nummern 92072201 und 93010817 in Übereinstimmung
mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei ECACC hinterlegt.
Weiterhin wurden auch die Virusisolate mit LM7-Typ-RT-Aktivität bei ECACC
unter der allgemeinen Bezeichnung "Stämme" hinterlegt. Der "Stamm" bzw. das Isolat,
das von der Linie PLI-2 geborgen wird und die Bezeichnung POL-2
trägt,
wurde bei ECACC am 22. Juli 1992 unter der Nr. V92072202 hinterlegt.
Der "Stamm" bzw. das Isolat,
das von der Linie LM7PC geborgen wird und die Bezeichnung MS7PG
trägt,
wurde bei ECACC am 8. Januar 1993 unter der Nr. V93010816 hinterlegt.
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Ausgehend
von den oben genannten Kulturen und Isolaten, die aufgrund von biologischen
und morphologischen Kriterien charakterisiert wurden, hat man sich
anschließend
bemüht,
das mit den in diesen Kulturen produzierten Viruspartikeln assoziierte
Nukleinsäurematerial
zu charakterisieren.
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Die
bereits charakterisierten Teile des Genoms wurden für die Durchführung von
molekularen Nachweistests des Virusgenoms und von immunserologischen
Tests verwendet, wobei die von den Nukleotidsequenzen des Virusgenoms
kodierten Aminosäuresequenzen
dazu verwendet wurden, um die gegen die mit der Infektion eingehenden
Epitope und/oder die Virusexpression gerichtete Immunreaktion nachzuweisen.
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Das
von der Anmelderin entdeckte Virussystem weist jedoch Ähnlichkeit
mit einem komplexen Retrovirussystem auf. Die gefundenen Sequenzen,
die in den von den verschiedenen Zellkulturen von MS-Patienten produzierten
extrazellulären
Viruspartikeln verkapselt sind, zeigen deutlich, daß eine gemeinsame
Verkapselung von Retrovirusgenomen, die verwandt sind, sich jedoch
von dem "wilden" Retrovirusgenom,
das die infizierenden Viruspartikel produziert, unterscheiden, stattfindet.
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Dieses
Phänomen
wurde bei replizierenden Retroviren und bei endogenen Retroviren,
die zu der gleichen Familie gehören,
ja so sogar heterolog sind, beobachtet. Der Begriff des endogenen
Retrovirus ist sehr wichtig. Bei MSRV-1 wurde beobachtet, daß endogene
Retrovirussequenzen, die Sequenzen umfassen, welche zu dem MSRV-1-Genom
homolog sind, in normaler menschlicher DNA existieren. Die Existenz
von endogenen Retroviruselementen (ERV), die in bezug auf die Gesamtheit
oder einen Teil ihres Genoms eine Ähnlichkeit mit MSRV-1 aufweisen,
erklärt
die Tatsache, daß die
Expression des Retrovirus MSRV-1 in den menschlichen Zellen mit
nahe verwandten endogenen Sequenzen wechselwirken kann.
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An
der Pathologie könnten
defektive Klone, die lediglich Proteine exprimieren, beteiligt sein.
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Die
Anmelderin hat eine unerwartete Entdeckung gemacht, nach der die
RU5-Region einer retroviraleb LTR, die in der vorliegenden Erfindung
definiert ist, für
die Expression wenigstens eines Proteins kodiert. Dies ist ungewöhnlich für LTRs,
insbesondere in der RU5-Region.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Nukleotidfragment
einer LTR-RU5-Region, das eine Nukleotidsequenz enthält, die
für die
Expression eines Proteins kodiert, wobei das Protein wenigstens
sechs, vorzugsweise wenigstens acht und besonders bevorzugt wenigstens
zwölf Aminosäuren einer
Peptidsequenz ausgewählt
aus der aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 bestehenden
Gruppe, und ein komplementäres
Nukleotidfragment enthält.
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Vorzugsweise
enthält
ein erfindungsgemäßes Nukleotid- bzw. das dazu komplementäre Nukleotidfragment
eine Nukleotidsequenz, die für
die Expression eines Proteins kodiert, wobei das Protein eine Peptidsequenz
ausgewählt
aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4, und ein komplementäres Nukleotidfragment
enthält.
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Vorzugsweise
besteht das Protein aus SEQ ID NR: 3 oder enthält oder besteht aus SEQ ID
NR: 2 und SEQ ID NR: 4.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die folgenden Gegenstände:
- – eine
Nukleinsäuresonde
zum Nachweis des MSRV-1-Retrovirus,
wobei die Sonde 10 bis 1000 Monomere enthält und unter hochstringenten
Bedingungen spezifisch mit dem erfindungsgemäßen Nukleotidfragment hybridisiert;
- – einen
Primer für
die Amplifikation einer retroviralen Nukleinsäuresequenz des MSRV-1-Virus
durch Polymerisation, wobei der Primer 10 bis 30 Monomere umfaßt und unter
hochstringenten Bedingungen mit dem erfindungsgemäßen Nukleotidfragment
hybridisiert;
- – ein
Protein, kodiert durch ein erfindungsgemäßes Nukleotidfragment; vorzugsweise
enthält
das Protein eine Peptidsequenz ausgewählt aus der aus SEQ ID NR:
2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 bestehenden Gruppe oder besteht
aus einer Peptidsequenz ausgewählt
aus der aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 bestehenden
Gruppe;
- – ein
gegen ein erfindungsgemäßes Protein
oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid
gerichteter polyklonaler oder monoklonaler Antikörper;
- – ein
Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins des MSRV-1-Retrovirus
in einer biologischen Probe, bei dem man:
eine erfindungsgemäße Sonde
mit der biologischen Probe in Kontakt bringt,
bestimmt, ob
die Sonde sich an eine Nukleinsäure
in der biologischen Probe bindet, wobei eine Bindung das Vorhandensein
des MSRV-1-Virus anzeigt; dieses Verfahren kann einen Amplifikationsschritt
umfassen, bei dem die Nukleinsäure
mit einem erfindungsgemäßen Primer
amplifiziert wird;
- – ein
Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins des MSRV-1-Retrovirus
in einer biologischen Probe, bei dem man:
einen erfindungsgemäßen Antikörper mit
der biologischen Probe in Kontakt bringt,
bestimmt, ob der
Antikörper
sich an ein Protein in der biologischen Probe bindet, wobei eine
Bindung das Vorhandensein des MSRV-1-Virus anzeigt;
- – ein
Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins des MSRV-1-Retrovirus
in einer biologischen Probe, bei dem man die antigenen oder biologischen
Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments
davon nachweist; vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Proteinfragment
um ein erfindungsgemäßes Polypeptid.
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Bevor
die Erfindung genauer dargelegt wird, werden nun verschiedene Begriffe,
die in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet werden, definiert:
- – der
in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "MSRV" bezeichnet jegliches
pathogene und/oder infizierende Agens, das mit MS assoziiert ist,
insbesondere eine Virusart, die attenuierten Stämme dieser Virusart, oder die
defizienten, interferierenden Partikel, die miteingekapselte Genome
oder auch Genome, die mit einem Teil des MSRV-1-Genoms rekombiniert
haben, die sich von dieser Art ableiten, umfassen. Es ist bekannt,
daß Viren,
vor allem Viren, die RNA enthalten, insbesondere infolge relativ
hoher spontaner Mutationsraten eine Variabilität aufweisen;
- – unter
menschlichem Virus versteht man ein Virus, das den Menschen infizieren
bzw. vom Menschen geborgen werden kann;
- – erfindungsgemäß ist ein
Nukleotidfragment oder ein Oligonukleotid oder ein Polynukleotid
eine Aneinanderreihung von Monomeren, oder ein Biopolymer, die bzw.
das durch die informationstragende Sequenz der natürlichen
Nukleinsäuren
charakterisiert sind bzw. ist und fähig sind bzw. ist, mit einem
beliebigen anderen Nukleotidfragment unter vorbestimmten Bedingungen
zu hybridisieren, wobei die Aneinanderreihung Monomere mit unterschiedlichen
chemischen Strukturen enthalten kann und ausgehend von einem natürlichen
Nukleinsäuremolekül und/oder
durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese
erhalten werden kann; ein Nukleotidfragment kann mit einem Genomfragment
des MSRV-1-Virus, mit dem sich die vorliegende Erfindung befaßt, identisch
sein;
- – somit
kann ein Monomer ein natürliches
Nukleinsäurenukleotid
sein, dessen Bausteine ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine
Stickstoffbase sind; bei der RNA handelt es sich bei dem Zucker
um Ribose, bei der DNA handelt es sich bei dem Zucker um Desoxy-2-ribose;
je nachdem, ob es sich um DNA oder RNA handelt, stammt die Stickstoffbase
aus der Gruppe Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin, Thymin; das Nukleotid kann
jedoch auch in mindestens einem der drei Bausteine modifiziert sein;
so kann die Modifikation zum Beispiel bei den Basenansätzen auftreten,
wodurch modifizierte Basen wie Inosin, Methyl-5-desoxycytidin, Desoxyuridin,
Dimethylamino-5-desoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Brom-5-desoxyuridin und
jegliche sonstige modifizierte Basen, die die Hybridisierung begünstigen,
geschaffen werden; beim Zucker kann die Modifikation darin bestehen,
daß man
mindestens eine Desoxyribose durch ein Polyamid ersetzt, und bei
der Phosphatgruppe kann die Modifikation darin bestehen, daß man sie
durch Ester, insbesondere Ester aus der Gruppe Diphosphatester,
Alkyl- und Arylphosphonat sowie Phosphorthioat, ersetzt;
- – unter "informationstragende
Sequenz" versteht
man jegliche geordnete Anreihung von Monomeren, deren chemische
Natur und Ordnung in einer Bezugsrichtung gegebenenfalls eine funktionsfähige Information
von der gleichen Qualität
wie der der natürlichen
Nukleinsäuren
darstellt;
- – unter
Hybridisierung versteht man den Vorgang, bei dem unter entsprechenden
Arbeitsbedingungen zwei Nukleotidfragmente mit ausreichend komplementären Sequenzen
zu einer komplexen Struktur, insbesondere einer Doppel- oder Dreifachstruktur,
vorzugsweise in Form einer Helix, unter hochstringenten Bedingungen
paaren (siehe Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor,
1982); im allgemeinen sind diese Bedingungen je nach Länge der
verwendeten Sonden die folgenden: die Temperatur für die Hybridisierungsreaktion
liegt zwischen ungefähr
20°C und
65°C und
insbesondere zwischen 35°C
und 65°C,
in einer Kochsalzlösung
bei einer Konzentration von ungefähr 0,8 bis 1 M;
- – eine
Sonde umfaßt
ein chemisch synthetisiertes oder mittels Verdauung oder enzymatischer
Restriktion eines längeren
Nukleotidfragments erhaltenes Nukleotidfragment, das mindestens
sechs Monomere, vorteilhafterweise 10 bis 100 Monomere, vorzugsweise
10 bis 30 Monomere umfaßt
und eine Hybridisierungsspezifität
unter hochstringenten Bedingungen aufweist; vorzugsweise wird eine
Sonde, die weniger als 10 Monomere besitzt, nicht allein verwendet,
sondern in Gegenwart von anderen Sonden, die genauso kurz sind oder
nicht; unter gewissen spezifischen Bedingungen kann es nützlich sein,
Sonden mit einer Größe von über 100
Monomeren zu verwenden; eine Sonde kann insbesondere für diagnostische
Zwecke verwendet werden, wobei es sich zum Beispiel um Fang- und/oder Nachweissonden
handeln wird;
- – die
Fangsonde kann auf jede beliebige Art und Weise, also direkt oder
indirekt, zum Beispiel kovalent oder durch passive Adsorption, auf
einem festen Träger
immobilisiert sein;
- – die
Nachweissonde kann mit einem Marker, insbesondere aus der Gruppe
der radioaktiven Isotope, mit Enzymen, insbesondere aus der Gruppe
Peroxidase und alkalische Phosphatase und denjenigen, die ein chromogenes,
fluorogenes oder lumineszierendes Substrat zu hydrolysieren vermögen, mit
chemischen chromophoren Verbindungen, mit chromogenen, fluorigenen
oder lumieszierenden Verbindungen, mit Nukleotidbasenanalogen und
mit Biotin markiert sein;
- – die
Sonden, die erfindungsgemäß für diagnostische
Zwecke verwendet werden können,
können
bei allen bekannten Hybridisierungstechniken verwendet werden, insbesondere
bei den Techniken, die unter den Bezeichnungen "DOT-BLOT", "SOUTHERN-BLOT", "NORTHERN-BLOT", wobei es sich um
eine Technik handelt, die mit der "SOUTHERN-BLOT"-Technik identisch ist, bei der jedoch
RNA als Angriffspunkt verwendet wird, und SANDWICH-Technik bekannt
sind; vorteilhafterweise verwendet man bei der vorliegenden Erfindung
die SANDWICH-Technik, die eine spezifische Fangsonde und/oder spezifische
Nachweissonde umfaßt,
wobei gilt, daß die
Fangsonde und die Nachweissonde eine zumindest teilweise unterschiedliche
Nukleotidsequenz aufweisen müssen;
- – ein
Primer ist eine Sonde, die mindestens sechs Monomere, vorteilhafterweise
10 bis 30 Monomere, umfaßt,
die eine Hybridisierungsspezifität
unter hochstringenten Bedingungen aufweisen, mit dem Zweck, eine enzymatische
Polymerisation zu initiieren, zum Beispiel bei einer Amplifikationstechnik
wie der PCR (Polymerase Chain Reaction), bei einem Elongationsvorgang
wie der Sequenzierung, bei einer reversen Transkriptionsmethode
oder ähnlichem.
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In
Anbetracht der Tatsache, daß ein
Virus mit der enzymatischen Aktivität einer reversen Transkriptase genetisch
sowohl in RNA-Form als auch in DNA-Form charakterisiert werden kann,
wird sowohl auf virale DNA als auch auf virale RNA für die Charakterisierung
der Sequenzen, die sich auf ein Virus beziehen, das eine solche
reverse Transkriptase-Aktivität
aufweist, erfindungsgemäß MSRV-1
genannt, Bezug genommen werden.
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Unter
Nachweis einer Substanz oder eines Agens versteht man im folgenden
Text nicht nur eine Identifikation, sondern auch eine quantitative
Bestimmung oder eine Abtrennung oder Isolation von dieser Substanz
oder diesem Agens.
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Die
Erfindung wird beim Durchlesen der folgenden detaillierten Beschreibung,
die auf die beigelegten Abbildungen Bezug nimmt, besser verstanden
werden, wobei die Abbildungen folgendes darstellen:
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1 zeigt
eine 5'-Nukleotidsequenz,
die Regionen entspricht, die von den Klonen LB15 (wiedergegeben
in nt 1 bis 623) in der RU5-Region und den Klonen CL2 (wiedergegeben
in nt 624 bis 1680) und CL17 (wiedergegeben in nt 1681 bis 2052)
in gag umfaßt
werden. Die Aminosäure-(AA-)Translation
ist bei den gag-Nukleotidsequenzen gezeigt. Die Polyadenylierungsstelle
in R ist von einem Kästchen
umrahmt und das Polyadenylierungssignal stromabwärts in U5 ist unterstrichen.
(//) bedeutet eine Leserasterverschiebung und (.) ein Stop-Codon.
AA in Fettdruck entspricht einer Major Homology Region (MHR) im
Kapsid. Unterstrichene AA entsprechen den konservierten Positionen
im Nukleocapsid.
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2 zeigt
die 5'-env-Region
von Klon C15 (nt 1 bis 1479) und die 3'-env- und LTR-Sequenzen von Klon CL6
(nt 1480 bis 2030). Die env-Region und die U3R-Substrukturen sind durch senkrechte
Pfeile gekennzeichnet. In der env-Region sind das Peptidsignal und
das putative immunosuppressive Peptid unterstrichen, die N-gebundenen
Glycosylierungsstellen sind mit einem Kästchen eingerahmt und die beiden
putativen Schnittstellen sind durch senkrechte Pfeile gekennzeichnet.
Bei der U3R-Region sind auch das CAAT-regulatorische Element und
die TATA-Box unterstrichen; die Cap-Stelle und das PolyA-Signal
sind ebenfalls gekennzeichnet.
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3 zeigt
die Promotoraktivität
von aus MS-Plasma-RNA
(CL6), normaler Plazenta-RNA (PH74, Zugangsnummer AF072506) und
der DNA humaner Zellen (5M6) erhaltenen U3R-Klone. Die U3R-Sequenzen wurden
in einen pCAT3-Enhancer-Reportervektor kloniert. Nach einer 48stündigen Inkubation
wurde die CAT-Aktivität,
die die Promotoreffizienz der entsprechenden Sequenzen wiedergibt,
bewertet. Der Wert entspricht dem Mittelwert von 3 unabhängigen Experimenten.
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Beispiel 1: Bestimmung
von MSRV-LTR-Regionen
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Mit
in der gag-Region befindlichen antisense-3'-Primern und mit einem 5'-sense-Primer definiert
aus der im 3'-Terminus erhaltenen
R-Sequenz (Klon 6, unten beschrieben) wurde eine RT-PCR-Amplifikation durchgeführt. Der
R- (87 bp), U5- (456 bp), PBS- und 5'-gag-Regionen umfassende Klon LB15 (SEQ
ID NR: 1) wurde so aus konzentrierten Kulturpartikeln erhalten.
Eine Polyadenylierungsstelle ist kompatibel mit dem an der Verbindung
der R- und U5-Regionen befindlichen "CA"-Dinukleotidmotiv,
und ein putatives Poly(A)-Signal befindet sich stromabwärts in einer
Entfernung von 24 Nukleotiden vom Poly(A)-Signal, mit der Konsensussequenz "YGTGTTYY". Die putative Primer-Bindungsstelle
(PBS), die stromab wärts
von der U5-Region identifiziert wurde, hat sich als verwandt mit
dem 3'-Terminus
der tRNATrP-komplementären Sequenz von Vögeln erwiesen.
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Anmerkenswert
ist weiterhin, daß in
der RU5-Region 2 relativ kurze in-frame orfs (SEQ ID NR: 2 und SEQ
ID NR: 3) gefunden wurden.
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Die
3'-LTR-U3R-Region
wurde im durch Amplifikation von aus MS-Plasma extrahierter RNA,
die mit DNAse behandelt worden war, erhaltenen CL6-Klon (2)
identifiziert. Durch Vergleich mit den durch 5'-Verlängerung an MSRV-RNA erhaltenen 5'-LTR-Sequenzen wurde
eine 299 bp-lange U3-Region und eine 84 bp-lange R-Region in der
CL6-LTR-Region,
die sich stromabwärts
vom env orf befindet und mit dem PolyA-Schwanz endet, identifiziert.
Das typische regulatorische Element CAAT-Box wurde an zwei Stellen
in der putativen U3-Region gefunden, mit der Transcription-Factor-Datei
(Heinemeyer, T, Wingender, E, Reuter, I, Hermjakob, H, Kel, AE,
Kel, OV, Ignatieva, EV, Ananko, EA, Podkolodnaya, OA, Kolpakov,
FA, Podkolodny, NL und Kolchanov, NA (1998). Databases on transcriptional
regulation: TRANSFAC, TRRD, and COMPEL. Nucleic Acids Res. 26, 364–370) wurden
jedoch auch andere putative Bindungsstellen für mehrere Transkriptionsfaktoren
entdeckt.
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In
der U3-Region wurde eine TATA-Box (TATAAA) gefunden, wie dies für zahlreiche
Retroviren beschrieben ist. Schließlich wurde 83 bp stromabwärts von
der TATA-Box ein Poly(A)-Signal (AATAAA) gefunden.
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Zur
Bewertung der Promotoraktivität
von LTR-Klonen verschiedenen Ursprungs wurden CAT-Assays mit subklonierten
U3R-Regionen von aus MS-Plasma-RNA (CL6) und aus verwandten HERV-W-Kopien
in Nicht-MS-DNA (5M6) und in Nicht-MS-Plazenta-RNA (PH74) erhaltenen
LTR-Klonen durchgeführt.
Wie aus 3 hervorgeht, war mit der LTR-Sequenz
im CL6-Klon aus MS-Plasma eine starke Aktivität assoziiert, während bei
den 5M6- und PH74- Klonen
eine schwache bzw. mäßige Promotoraktivität festgestellt
wurde. Mit anderen Zelltypen wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.
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Beispiel 2: In Beispiel
1 eingesetzte Materialien und Methoden
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Gesamt-RNA
wurde aus MS-Plasma oder aufgereinigten Partikeln durch die Standard-Vorschrift
mit angesäuertem
Guanidiumthiocyanat oder mit dem "viral RNA extraction kit" (Boehringer Mannheim)
extrahiert. Nach einer Behandlung mit DNase I wurde die RNA einer
reversen Transkription (ExpandTM RT, Boehringer Mannheim)
entweder mit zufällig
ausgewählten
Hexanukleotid-Primern,
mit einem spezifischen MSRV-Primer oder mit einem verankerten Oligo-dT-Primer
unterzogen und durch nested oder semi-nested PCR (Long Expand PCR
kit – Boehringer
Mannheim) amplifiziert. Bei jedem Assay wurde eine no-RT-Kontrolle
durchgeführt. 5'- und 3'-Verlängerungen
aus der MSRV-pol-Region wurden durchgeführt, so daß man Klone mit den unten angegebenen
Primern erhielt.
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PCR-Fragmente
wurden in ein pCR2.1 des TA cloningTM-Kit
(Invitrogen) kloniert und mit dem 'Prism ready reaction kit dye deoxyterminator
cycle sequencing kit' (Applied Biosystems)
mit den automatischen DNA-Sequenziergeräten Applied Biosystem 377 und
373A in beide Richtungen sequenziert.
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U3R-Regionen
aus CL6- (wie in WO-99/02666 im Namen der Anmelderin gezeigt), PH74-
(wie in WO-99/02696 im Namen der Anmelderin gezeigt) und 5M6- (wie
in WO-99/02666 im Namen der Anmelderin gezeigt) Klonen (die aus
MS-Plasma-RNA, Plazenta-RNA
beziehungsweise humaner DNA erhalten worden waren) wurden für CAT-Assays
in pCAT3 (Promega-Biotech, Madison, WI, USA) geklont. An Hela-,
PG4-, BeWo- oder Jurkat-Zellen wurden unter Verwendung des Superfect-Transfektionskits
(Qiagen GmbH, Deutschland) mit 2 μg
aufgereinigtem rekombinantem Plasmid Transfektionsexperimente durchgeführt. Nach
einer 48-stündigen Inkubation
wurden die Zellen geerntet, um die CAT-Aktivität unter Anwendung des CAT Enzyme Assay
Systems (Promega-Biotech) zu bewerten. Hierfür wurde das Liquid Scintillation
Counting (LSC)-Protokoll nach den Empfehlungen des Herstellers befolgt.
Die positive Kontrolle bestand aus mit 2 μg pCAT3 Contol' (Promega-Biotech) transfizierten
Zellen.
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