DE60026199T2

DE60026199T2 - Synthetische Gene für gagpol und deren Verwendungen

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Publication number: DE60026199T2
Application number: DE60026199T
Authority: DE
Inventors: Ralf Wagner; Markus Graf; Ludwig Deml; Kurt Bieler
Original assignee: Geneart AG
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Geneart GmbH
Priority date: 2000-05-18
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2020-05-19
Also published as: EP1156112A1; US8287881B2; AU2001281781A1; EP1156112B1; BR0110706A; ATE318908T1; US20130122585A1; DE60026199D1; CA2408433A1; US20070293448A1; WO2001088141A3; US7378515B2; US20040152069A1; WO2001088141A2; HK1042319B; ATE333503T1; DE60121572D1; HK1053853A1; EP1282712B1; CN1429270A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische gag- und gagpol-Gene, die mittels Kodon-Optimierung für eine starke Expression optimiert wurden, und deren Verwendungen für die wirkungsvolle Erzeugung von Vektorpartikeln. Die Erfindung betrifft weiter die Erzeugung von Verpackungszellen und Vakzinen, die auf den synthetischen gag- und gagpol-Genen basieren.
Auf Retroviren beruhende Vektoren zur DNA-Vakzinierung oder Gentherapie sollten die Fähigkeit behalten, strukturelle Gene und Enzymfunktionen in hohen Mengen zu exprimieren, um ihre maximale Effektivität zu erreichen und doch, zur gleichen Zeit, ein geringstmögliches Risiko und die wenigsten Nebeneffekte für den Empfänger aufweisen. Die effiziente Herstellung von strukturellen oder enzymatischen Proteinen aus komplexen Retroviren wie HTLV-1 und -2, Lentiviren und Spumaviren ist durch ihre komplexen regulatorischen Mechanismen der Transkription, nukleären RNA-Translokation und Expression beschränkt. Zum Beispiel ist die Expression der späten Genprodukte von SIV und HIV-1 sowohl auf transkriptioneller als auch post-transkriptioneller Ebene stark reguliert, und hängt daher von dem Vorliegen und der Funktion der Proteine der frühen Phase wie Tat und Rev ab. Während die Anti-Repressorfunktion von Tat leicht durch die Verwendung heterologer transkriptioneller Kontrolle mittels viralen und/oder zellulären Promotor/Enhancer-Einheiten verhindert werden kann, hängt die Expression der späten Gene, die für strukturelle oder enzymatische Funktionen (gag, env, pol) kodieren, von der Anwesenheit des transaktiven Rev-Proteins ab, von dem man weiß, dass es den Export von nicht- und teilweise gesplicten RNAs aus dem Zellkern in das Zytoplasma durch die Interaktion mit seiner RNA-Erkennungsstelle Rev-reaktives-Element (RRE), einem Komplex einer 351 Nukleotide (nt) langen RNA-Stamm-Schleifenstruktur, die sich innerhalb des offenen Leserasters des env befindet, fördert. Obwohl die Aktion von Rev/RRE mittlerweile als eine notwendige Voraussetzung für die Expression der späten Gene von HIV-1 gut akzeptiert ist, wird der kritische Beitrag verschiedener cis-wirkender Elemente innerhalb der nicht- und einzel-gesplicten Transkripte zur der Rev-Abhängigkeit und der rechtzeitig regulierten Expression immer noch kontrovers diskutiert. Demgemäß wird der Rev-abhängige und rechtzeitig regulierte Export von späten einzel- oder ungesplicten lentiviralen mRNAs in den meisten Berichten entweder durch eine ineffiziente Bildung einer Splicesite erklärt oder inhibitorischen Sequenzen zugerechnet, die sich innerhalb des kodierenden Bereichs befinden (als INS-Elemente bezeichnet).
Während die exakte Natur und Funktion der sogenannten INS-Elemente zur Zeit nicht vollständig klar ist, scheint der Rev-abhängige nukleäre Export und die Expression der un- und einzel-gesplicten lentiviralen mRNAs, zumindest wenn sie von heterologen Promotoren aus exprimiert werden, die große Splice-Donor-Stelle in der nicht-translatierten Region 5' der kodierenden Sequenz für Gag zu betreffen und zu benötigen (5'-UTR). Diese 5'-UTR enthält auch einen Teil des RNA-Verpackungssignals (ψ), das – im Gegensatz zu den ψ-Stellen herkömmlicher C- und D-Typ Retroviren – sich auch in den kodierenden Bereich der lentiviralen Genome einschließlich der Gag- und Pol-Leseraster, hinein erstreckt.
Obwohl lentivirale Vektoren, die von komplexen Retroviren wie HTLV-1 und -2, Lentiviren und Spumaviren abgeleitet sind, auf dem Gebiet der DNA-Vakzinierung und/oder der Gentherapie viel versprechen, gibt es dennoch Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit in Menschen, aufgrund des ins-Auge-stechenden pathogenen Potentials von HTLVs und Lentiviren wie HIV-1 oder HIV-2. Darüber hinaus ist die effiziente Expression aufgrund der komplexen viralen regulatorischen Mechanismen, die der Gag- und GagPol-Expression zugrunde liegen, entweder limitiert durch oder sehr abhängig von der Anwesenheit cis-agierender Elemente (UTR, RRE) und transaktiver Proteine (Rev, Tat). Tat-unabhängige Transkription kann leicht erreicht werden, indem ein konstitutiver Säugetier-Promotor wie die Cytomegalovirus immediate early Promotor/Enhancer-Einheit verwendet wird. Eine Rev-unabhängige Expression der späten HIV-1-Gene, wie diejenigen, die für strukturelle oder enzymatische Proteine kodieren, wäre sehr geschätzt, um die Effizienz und Sicherheit Lentivirus-basierter Vektoren und DNA-Vakzine zu verbessern sowie für die Antigen-Produktion in einem Säugetier-Expressionsystem. Im Allgemeinen können zwei Systeme angewendet werden: (a) Das Mason-Pfitzer-Affenvirus (MPMV) konstitutive Transportelement (CTE), ein cis-wirkendes RNA-Element, das sich innerhalb der 3'-nicht-translatierten Region (UTR) des viralen Genoms befindet, kann das HIV-1 Rev/RRE-regulatorische System ersetzen. Darüber hinaus wurden mehrere andere cis-wirkende RNA-Elemente einer Vielzahl von Viren entdeckt, die ebenfalls den nukleären Export von Intron-haltigen RNAs fördern (z.B. Rous Sarcoma-Virus, Affen-Retrovirus TypD, Vogelleukämie-Virus, HBV). Demzufolge beseitigt die Zugabe des MPMV-CTE-Elements oder von funktionalen Analogen cis-agierender RNA-Elemente den Effekt sogenannter INS-Elemente, von denen angenommen wird, dass sie für die nukleäre Sequestration später lentiviraler RNAs verantwortlich sind, wenn Rev fehlt. (b) Eine geringe oder keine Genexpression von späten HIV-1-Genprodukten bei Fehlen von Rev wurde teilweise überwunden, indem einzelne Punktmutationen innerhalb der Wobble-Positionen ausgewählter Kodons innerhalb der kodierenden DNA-Sequenzen angesammelt wurden (Schwartz et al., 1992a J. Virol. 66: 7176–7182; Schneider et al., 1997, J. Virol. 71: 4892–4903; Haas et al., 1996, Curr. Biol.: 6: 315–324). Dieser Ansatz zielte darauf ab, die sogenannten INS-Elemente zu zerstören, um die Expression des resultierenden Gag-Gens von Rev unabhängig zu machen. Allerdings wird das Vorliegen, die Natur und Funktion von INS-Elementen immer noch kontrovers diskutiert, was anzeigt, dass ein vollständiger Knock-out schlecht charakterisierter INS-Elemente auf der Basis von einzelnen Punktmutationen schwierig zu erreichen sein könnte. Diese Sichtweise wird durch die Beobachtung von Qiu und seinen Kollegen bestätigt (Qiu et al., 1999 J. Virol. Nov; 73(11): 9145–52), die zeigt, dass die Zugabe eines CTE-Elements zum (nur teilweise) veränderten Gag-Gen zu einem weiteren Anstieg der Gag-Expression führt. Dieses Phänomen gilt nicht für ein vollständig Rev-unabhängiges Gag-Expressionskonstrukt.
Eine bevorzugte Anwendung von HTLV-1- und -2- sowie Lentivirus-abgeleiteter Gag- und GagPol-basierter Expressionsvektoren ist die DNA-Vakzinierung und die Herstellung von Antigenen, vorzugsweise von Virus-ähnlichen Partikeln, in höheren eukaryotischen Expressionssystemen wie in Säugetier- und Insektenzellen. Von zellvermittelten Immunreaktionen auf Gag- und Pol-Produkte von HIV-1 wurde gezeigt, dass sie vor der Erkrankung schützen oder zumindest an einer effizienten Kontrolle der Virusreplikation beteiligt sind. Demgemäß waren in Personen mit chronischer Infektion die HIV-1-spezifischen proliferativen Reaktionen auf p24 sowie die Anzahl von Gag-spezifischen CTL-Vorläufern invers proportional zu der ermittelten Viruslast. Darüber hinaus scheinen CTL-Reaktionen, die gegen hochkonservierte Epitope innerhalb von Gag oder Pol gerichtet sind, auf kritische Weise an der Kontrolle der Virusreplikation in HIV-infizierten Individuen beteiligt zu sein, in denen die Virusinfektion lange Zeit nicht voranschreitet.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Formate entwickelt, um Gag- und Pol-enthaltende Immunogene dem Immunsystem zu präsentieren, wobei darunter auch virusähnliche Partikel (VLPs) und Gag/Pol-enthaltende DNA- oder RNA-Konstrukte vorhanden waren. VLPs wurden üblicherweise in einem Baculovirus-angetriebenen Insektenzell-Expressionsystem hergestellt, welches es erlaubt, die komplexe Regulation der Gag- und Pol-Expression zu umgehen, die in dem natürlichen Wirt oder in den Säugetier-Zellen gesehen wird. Solche VLPs erwiesen sich als hochimmunogen in Nagetieren sowie in nicht-humanen Primaten. Allerdings, um den Regularien des Good Manufacturing Practice (GMP) zu entsprechen und um eine gute post-translationale Modifikation der Gag/Pol-Polypeptide zu erreichen (einschließlich co-exprimierter Proteine, die in VLPs verpackt oder durch VLPs präsentiert werden könnten), wäre eine Expression von GagPol und von Derivaten davon in Säugetierzelllinien sehr geschätzt.
Die Vakzinierung durch direkte Injektion von DNA ist ein neuartiges und vielversprechendes Verfahren, um spezifische Antigene für die Immunisierung bereitzustellen. Die Immunisierung mit Plasmid-DNA weist im Vergleich zur herkömmlichen Proteinvakzinierung mögliche Vorteile auf, die auf den induzierten starken T-Helfer 1 (Th1)- und CTL-Reaktionen beruhen, die verlängerte Antigen-Expression und die lang dauernde Effektoraktivität, und kann daher für die Vakzinierung verwendet werden. In Tiermodellen wurde von der DNA-Vakzinierung gezeigt, dass sie eine schützende Immunität gegenüber einer Vielzahl von viralen und parasitären Pathogenen induziert. In den meisten Fällen wurden starke, jedoch hochvariable, Antikörper- und zytotoxische T-Zeil-Reaktionen mit einer Kontrolle der Infektion assoziiert. Von Plasmid-DNAs, die Gene exprimieren, die von HIV-1 abgeleitet wurden, wurde kürzlich gezeigt, dass sie in Nagetieren, in nicht-humanen Primaten und während Phase I-Studien in Menschen humorale und zelluläre Immunreaktionen induzieren. Obwohl diese Konstrukte in der Lage waren, eine Immunreaktion zu induzieren, waren sowohl die zirkulierenden Antikörpertiter als auch die HIV-1-spezifischen CTL-Spiegel transient und niedrig.
Allerdings unterliegt die Entwicklung von DNA-Konstrukten und infektiösen, obwohl nicht notwendigerweise Replikations-kompetenten, Vektoren, die Gag oder GagPol oder Derivate davon kodieren, für die Antigenherstellung in eukaryotischen Zellen und für Vakzinierungszwecke mehreren Beschränkungen hinsichtlich Sicherheit und Effizienz. Die Gag- und GagPol-Expression unter Verwendung von Wildtypgenen in der Rev-abhängigen Situation ist limitiert durch (a) die komplexen viralen regulatorischen Mechanismen, die mehrere cis-wirkende Elemente (RRE, UTR) und trans-wirkende Proteine (Rev, Tat) involvieren. Wenn UTR, RRE oder Rev fehlt, wird/werden kein oder nur geringe Mengen von Gag- oder GagPol-Protein produziert. Die Gag- oder Gag/Pol-Expression benötigt daher die gleichzeitige Expression des Rev-Proteins entweder ausgehend von einem bicistronischen Konstrukt oder von einem separaten Plasmid. Beide Strategien begrenzen die Effizienz, in vitro Zelllinien zu erzeugen, oder reduzieren die Effizienz von DNA-Vakzinkonstrukten in vivo entweder aufgrund einer größeren Plasmidgröße oder der Notwendigkeit, eine einzelne Zelle gleichzeitig mit beiden Plasmiden zu transfizieren/transduzieren; und durch (b) die Anwesenheit des Rev-Proteins selbst, das als ein RNA-Shuttle zwischen dem Zellkern wirkt und daher ein intrinsisches Risiko beherbergt. Darüber hinaus könnte Rev, wenn es als eine therapeutische Vakzinierung von chronisch HIV-infizierten Individuen verwendet wird, zur Reaktivierung latenter Viren beitragen, wobei die Infektion, die Virusreplikation und Krankheit verstärkt wird.
Darüber hinaus ist die Gag- und GagPol-Expression – unabhängig davon, ob sie durch das Rev/RRE-System erreicht wird oder unabhängig von Rev/RRE durch die Hinzugabe eines konstitutiven Transportelements (CTE) oder Analoga cis-wirkender Stellen vermittelt wird – limitiert durch das Vorhandensein von UTR, RRE und mehrerer Bereiche in den GagPol-kodierenden Bereichen, von denen bekannt ist, dass sie das HIV-1-Verpackungssignal ψ oder andere RNA-Elemente umfassen, die für die Verpackung der genomischen RNA in virale Partikel verantwortlich sind. Vektoren, die solche RNA-Elemente umfassen, könnten in endogene retrovirale Partikel verpackt und durch diese verbreitet werden und zur Mobilisierung endogener Retroviren beitragen. Darüber hinaus würden Gag- oder GagPol-abgeleitete VLPs, die entweder in Zellkultur oder in vivo nach einer DNA-Vakzinierung erzeugt wurden, ihre eigene RNA selbst verpacken, was jegliche sichere Anwendung solcher DNA-Vakzin-Konstrukte zu Vakzinierungszwecken in Menschen verhindern würde.
Darüber hinaus ist jede Art der Gag- und GagPol-Expression – unabhängig davon, ob sie (i) durch das Rev/RRE-System, (ii) durch Zugabe von CTE oder analogen Stellen oder (iii) nach Einführen einzelner Punktmutationen in das Gag- oder GagPol-Gen erreicht wird – durch die Wildtyp-Sequenz im Falle eines Gag- oder GagPol-DNA-Vakzins beschränkt. Zwischen dem Vakzin-Konstrukt selbst (UTR, RRE, Wildtyp-ORF) und endogenen retroviralen Sequenzen oder, wenn es als therapeutisches Vakzin verabreicht wird, zwischen den Nukleinsäuren des Vakzinkonstrukts und der genetischen Information des Virus, das innerhalb des Patienten zirkuliert, könnten Rekombinationsereignisse auftreten. Beides könnte zur Rekonstitution von potenziell infektiösen oder chimären Partikeln führen, die unbekannte Risiken beinhalten.
Eine weitere bevorzugte Anwendung lentiviraler Gag- und GagPol-basierter Vektoren ist der Gentranfer in verschiedene Typen von sich teilenden, ruhenden oder postmitotischen Zellen. Im Gegensatz zum üblichen retroviralen Gentransfer, wie er z.B. durch Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV)-basierten Vektoren vermittelt wird, kann ein lentiviraler Gentransfer für die Genzufuhr zu einer Vielzahl von ruhenden oder sich nicht teilenden Zellen wie neuronalen, Muskel- und Leber- sowie hämatopoetischen Stammzellen verwendet werden, und kann daher beträchtlich zur Verhinderung und Behandlung von Gendefekten, Tumorerkrankungen und Infektionen beitragen. Die Transduktion von sich nicht-teilenden, ruhenden oder postmitotischen Zellen wie neuronale, Lebergewebe- oder hämatopoetische Vorläuferzellen für die Behandlung einer Vielzahl von Gendefekten oder erworbenen Erkrankungen. Die lentiviralen Vektorpartikel werden zur Zeit in Säugetierzelllinien mittels einer 3-fach-Transfektion eines GagPol-Expressionsplasmids zusammen mit einem Transferkonstrukt (welches das Verpackungssignal und das Transfergen enthält; flankiert durch LTRs) und einem Expressionsplasmid zubereitet, das ein Hüllprotein kodiert, welches von einem amphotropen oder xenotropen Retrovirus wie dem Moloney Murine Leukemia Virus oder dem vesikulären Stomatitis Virus abgeleitet wurde. Lentivirale Vektorpartikel aus dem Überstand solcher transfizierter Zellen waren in der Lage, eine große Vielzahl verschiedener Zellen sogar nach einem in vivo Gentransfer zu transduzieren. Um die Sicherheit dieser Vektoren zu erhöhen, wurden die meisten der akzessorischen Gene von HIV-1 vom Verpackungskonstrukt und den Vektoren entfernt, wobei das Risiko des Auftretens potenzieller pathogener Replikations-kompetenter Rekombinanten minimiert wurde.
Allerdings unterliegt die Entwicklung lentiviraler Gag- und GagPol-basierter Vektoren zum Gentransfer in ruhende oder sich nicht teilende Zellen mehreren Beschränkungen hinsichtlich der Sicherheit und Effizienz.
Die zur Zeit verwendeten HIV-1- oder SIV-abgeleiteten GagPol-Expressionsplasmide enthalten Teile der 5'-nicht translatierten Region, welche das RNA-Verpackungssignal ψ umfasst. Obwohl in das vermeintliche Verpackungssignal kleine Deletionen eingeführt wurden, ist es unwahrscheinlich, dass diese Deletionen die Verpackung vollständig verhindern, da ähnliche Deletionen im Kontext einer intakten 5'-Leadersequenz die Verpackung um weniger als den Faktor 25 reduzierten (Luban und Goff, 1994 J. Virol. Jun; 68(6): 3784–93).
Darüber hinaus können, wenn das GagPol-Expressionsplasmid in der Tat verpackt werden kann, homologe oder nicht-homologe Rekombinationsereignisse zwischen der Vektor-RNA und der GagPol-RNA während oder nach der reversen Transkription nicht ausgeschlossen werden. Dies könnte zu einem – aufgrund von Sicherheitsüberlegungen – unerwünschten Transfer des GagPol-Gens (oder Teilen von diesem) in Zielzellen führen.
Darüber hinaus gibt es zwei Homologieregionen zwischen den GagPol-Expressionsplasmiden und den lentiviralen transgenen Vektorkonstrukten: (1) Die Rev-abhängige wie auch die CTE-vermittelte, Rev-unabhängige, GagPol-Expression (Verpackungsproteine) erfordern entweder die vollständige UTR oder wenigstens einen Teil davon für eine effiziente Expression. Auch die transgenen Vektorkonstrukte hängen für eine effiziente Verpackung von dem RNA-Verpackungssignal ab, das mit der 5'-UTR überlappt. (2) Da in HIV-1, SIV und anderen Lentiviren das Verpackungssignal von der UTR in das gag-Gen reicht (besprochen in: Swanstrom-R und Wills-JW, 1997, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 263–334), ist der 5'-Teil des gag-Gens Teil vieler Lentivirus-abgeleiteter transgener Vektorkonstrukte. (3) Zuletzt enthalten sowohl das transgene Vektorkonstrukt als auch die Rev-abhängigen GagPol-Expressionsplasmide das Rev-reaktive Element, da (i) für RRE vorgeschlagen wurde, dass es RNA-Verpackungsfunktionen enthält, und (ii) der Transport der transgenen Vektor-RNA und der GagPol-RNA vom Zellkern in das Zytoplasma Rev-abhängig ist. Diese Regionen extensiver Homologie könnten homologe Rekombinationsereignisse entweder während der Vektorproduktion oder der reversen Transkription erleichtern.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist die Entwicklung von Retrovirus-beruhenden Expressionsvektoren, die eine Proteinherstellung auf hohem Niveau bei Fehlen von transaktiven Proteinen und bei einem geringsten Risiko der Selbst-Verpackung des Vektors oder von Rekombinationsereignissen erlauben, wobei das Risiko der Rekonstitution potenziell infektiöser oder auf andere Weise gefährlicher Partikel verhindert wird. Eine weitere Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist die Bereitstellung von Vakzinen gegen Erkrankungen, die von Lentiviren verursacht werden.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch den Gegenstand, wie er in den Ansprüchen definiert ist, gelöst.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die Figuren dargestellt.
1: Schematische Darstellung der wildtypischen und synthetischen gag-kodierenden Expressionsplasmide. Offene Kästen zeigen Wildtyp-gag (wtgag)-kodierende Gene einschließlich 3'- und 5'-gelegener cis-wirkender Sequenzen an, wohingegen syngag ohne jegliche 3'- oder 5'-nicht translatierte Regionen (UTR) schwarz eingekastet ist. Wtgag-offene Leseraster wurden an die cis-wirkenden 5'-gelegenen UTR-Sequenzen, an das Rev-reaktive Element (RRE), das konstitutive Transportelement (CTE) oder Kombinationen davon fusioniert. Um den Einfluss des wichtigsten Splice-Donors (SD) auf die CTE-vermittelte Rev-unabhängige Gag-Expression zu untersuchen, wurde die UTR mutiert, um die Splice-Donor- Konsensussequenz innerhalb dieser stromaufwärts gelegenen Sequenz zu zerstören, was in mutiertem ΔSD-wtgag-CTE resultierte.
2: Darstellung der offenen Leseraster von syngag- und wildtypischem gag. (A) Die Gag-kodierende Sequenz wurde an eine Kodon-Benutzung angepasst, die in hochexprimierten Säugetiergenen auftritt und an die entsprechende Wildtypsequenz, die unten gezeigt ist, aligned. Die Sequenzidentität zwischen dem synthetischen und dem wildtypischen Gen ist durch Linien angezeigt. (B) Die Tabelle zeigt die unterschiedlichen Sequenzzusammensetzungen des offenen Leserasters von wildtypischem und synthetischem gag an. Das vollsynthetische gag-Gen mit einer optimierten Kodon-Benutzung zeigt einen deutlichen Anstieg des G/C-Gehalts, während der allgemeine A/U-Gehalt reduziert ist. Darüber hinaus steigerte die Kodon-Benutzungsanpassung die Menge immun-stimulatorischer CpG-Inseln (Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr) innerhalb der kodierenden Region von nur 1 auf 5.
3: H1299-Zellen wurden transient mit den angezeigten Plasmiden transfiziert. Für die Standardisierung wurde die Gag-Expression mit der wildtypischen, wie der Rev/RRE-abhängigen, Expression durch einen Rev-Expressionsvektor verglichen, während Rev-unabhängige Expressionsplasmide mit Vektor co-transfiziert wurden (als + bzw. -angezeigt). (A) Rev/RRE-vermittelte wildtypische Expression. (B) CTE-vermittelte wildtypische Expression. (C) Synthetische Expression unter Verwendung eines Kondon-optimierten Leserasters. Zellen wurden nach 48 Stunden nach der Transfektion geerntet, lysiert, und 50 μg Gesamtprotein wurden einer Western-Blot-Analyse unterworfen (A–C, untere Teilabbildung). Ausbeuten von Pr55^gag wurden gemessen, indem unterschiedliche Verdünnungen des Zelllysats in einem Capture-ELISA getestet wurden, indem aufgereinigtes Pr55^gag für die Standardisierung (A–C, obere Teilabbildung) verwendet wurde, und sie wurden normalisiert durch die Pr55^gag-Produktion, die durch autologe Rev/RRE-abhängige Expression erhalten wurde. Gag-Expressionsspiegel, die mit der Transfektion verschiedener Zelllinien erhalten wurden, wurden ausgeführt, um Zelltyp-spezifische Effekte auszuschließen (D). Balken stellen relative Pr55^gag-Expressionsspiegel dar (wobei UTR-wtgag-RRE + Rev als 100% angenommen wurden) und sind als der Mittelwert von 3-fach-Bestimmungen angegeben.
4: Immunologische Analyse eines HIV-1 DNA Gag Vakzins, das auf synthetischen und wildtypischen Sequenzen beruht. 80 μg wildtypischer (wt-gag) und synthetischer (syngag) kodierender DNA-Expressionsplasmide wurden intramuskulär (i.m.) in BLAB/c-Mäuse injiziert und zweimal nach 3 Wochen und 6 Wochen geboostet, und die Mäuse wurden nach 7 Wochen getötet. (A) Stärke von humoralen Reaktionen, die in immunisierten BALB/c induziert wurden. Jeder Balken stellt den Gruppenmittelwert (n = 4) für anti-gag IgG1, anti-gag IgG2 und Gesamt-IgG dar, wie er mittels eines Endpunktverdünnungs-ELISA-Assays bestimmt wurde. Endpunkttiter der Immunseren wurden als das Reziprok der höchsten Plasmaverdünnung definiert, die in einem Absorptionswert (OD 492) resultierte, der drei Mal größer war als der eines Prä-Immunserums mit einem Ausschlusswert von 0,05. (B) Zytotoxische T-Zell-Aktivität in Milzzellen aus Mäusen, die intramuskulär oder subkutan mittels einer Partikelkanone (P. K.) mit gag-Expressionsvektoren immunisiert wurden. Lymphoide Zellen wurden aus den Mäusen 5 Tage nach der Boost-Injektion erhalten und mit gag-Peptid gepulsten syngenischen P815 Mastozytoma-Zellen (die mit 20.000 rad bestrahlt wurden) co-kultiviert. Kontrollassays beinhalteten Milzzellen von nicht-immunisierten und wt-gag-immunisierten Mäusen, die in vitro mit Peptid gepulsten P815-Zellen stimuliert wurden. Zytotoxische Effektorpopulationen wurden 5 Tage nach einer in vitro-Kultur geerntet. Die zytotoxische Reaktion wurde gegen gag-Peptid gepulste A20-Zellen und unbehandelte A20-negative Zielzellen in einem Standard-⁵¹Cr-Freisetzungsassay ermittelt. Die gezeigten Daten sind als der Mittelwert von 3-fach-Kulturen angegeben.
5: Karten der (B) SIV-abgeleiteten Verpackungskonstrukte, die auf optimierten GagPol-Leserastern von SIV und HIV und (A) (A) und HIV-1SIV-abgeleiteten (B) Transgenvektoren oder Verpackungskonstrukten beruhen. Aus dem SIV-Genom deletierte Regionen sind mit schattierten Kästchen markiert, wobei das erste und letzte deletierte Nukleotid, nach dem „Δ"-Zeichen angegeben ist (Nummerierung entspricht Genbank-Eingabe LM33262). Punktmutationen, welche die Leseraster inaktivieren, sind durch Sternchen markiert, inaktivierte Leseraster sind in schwarz markiert. Synthetische GagPol-Leseraster sind schraffiert. BGHpAd: Bovines Wachstumshormon Polyadenylierungssignal; CMV: immediate early Promotor/Enhancer-Region aus humanem Cytomegalievirus; SFFV-Pr: U3-Region des Milzfocus-bildenen Virus; GFP: Gen für das grün fluoreszierende Protein;
6: Immunoblot-Analyse von Zellkulturüberständen, die 3 Tage nach der Transfektion von H1299-Zellen mit den angegebenen lentiviralen (HIV-1: Hgp^syn und SIV_mac239: Sgp^syn) GagPol-Expressionskonstrukten und proviralen DNAs geerntet wurden. Freigesetzte GagPol-Partikel wurden mittels kontinuierlicher Sucrose-Dichtegradient-Sedimentation angereichert. Peak-Fraktionen des Antigens wurden auf einer denaturierenden 12,5%-SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblots unter Verwendung von HIV-1 p24 (A) oder SIV p27-spezifischen (B) monoklonalen Antikörpern analysiert. Protease-Aktivität und Funktionalität der Polyprotein-Prozessierung wurde mittels Fehlen (–) oder Vorliegen (+) von Saquinavir gezeigt. Molekulargewichte der nachgewiesenen Vorläuferproteine (Pr) und der reifen Spaltprodukte sind angezeigt. (C) Darüber hinaus wurden Peak-Fraktionen des Antigens auch auf ihren Gehalt an HIV-1 p24 Capsidantigen getestet, indem ein kommerziell erhältliches Capture-ELISA-Format (DuPont, Boston, USA) verwendet wurde.
7: Transduktion von Wachstums-arretierten Zellen. 293T-Zellen wurden mit ViGΔBH, pHIT-G und den angegebenen lentiviralen GagPol-Expressionsplasmiden transfiziert. Der MLV-Vektor wurde mittels Transfektion der Plasmide pLEGFP-N1, pHIT60, und pHIT-G erzeugt. Vektortiter in dem Überstand transfizierter Zellen wurden auf 293-Zellen in Anwesenheit der angegebenen Konzentrationen von Aphidicolin bestimmt. Die Titration wurde in 3-fach- oder 4-fach-Untersuchungen ausgeführt. Die Mittelwerte und Standardabweichungen sind angegeben. GFU: grüne Fluoreszenz-ausbildende Einheiten.
8: Nachweis von Replikations-kompetenten Rekombinanten. CEM × 174-SIV-SEAP-Zellen wurden mit dem Überstand von 293T-Zellen infiziert, die mit SIV-GFPΔBP (A) oder SIV-GFPΔBP (B) und den angegebenen gag-pol-Expressionsplasmiden co-transfiziert wurden. RLE: Relative Lichteinheiten.
9: Schematische Darstellung eines Kodon-optimierten GagPol-Derivats, das für eine DNA-Vakzinierung verwendet werden kann. Aufgrund von Sicherheits- und regulatorischen Überlegungen wurde das Verpackungssignal ψ entfernt, die Integrase deletiert und das Gen für die reverse Transkriptase (RT) mittels Insertion eines ungeordneten nef-Gens an das 3'-Ende der DNA-Sequenz, die für die RT-aktive Stelle kodiert, disrumpiert. Das nef-Gen wurde durcheinander gebracht, indem seine 5'-Hälfte an seine 3'-Hälfte fusioniert wurde. Die Myristylierung der GagPolNef-Partikel wird durch eine Glycin nach Alanin-Mutation an der Myristylierungsstelle des gag-Gens inhibiert.
Der Begriff „Verpackungsproteine", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet GagPol-Proteine von Retroviren, Spumaviren, vorzugsweise HTLV-1 und -2, noch bevorzugter aller Lentiviren, am meisten bevorzugt HIV-1, HIV-2, SIV, FIV und insbesondere Gene, die von SEQ ID NR: 2 (GagPol HIV-1_IIIB) und SEQ ID NR: 1 (GagPolSIV_mac239) kodiert werden, die in der Lage sind, eine RNA zu verpacken, die die Verpackungsstelle ψ enthält wie ein retrovirales, vorzugsweise lentivirales am meisten bevorzugt HIV-1-, HIV-2-, SIV-, FIV-Genom und/oder ein so genanntes „Transferkonstrukt", das im Folgenden detailliert beschrieben ist.
Der Begriff „Verpackungskonstrukt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Expressionsplasmid oder Vektorsystem, das verwendet wird, um in eukaryotischen Zellen Verpackungsproteine herzustellen.
Der Begriff „Transferkonstrukt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Expressionsplasmid oder Vektorsystem, das verwendet wird, um eine RNA herzustellen, die die Verpackungsstelle ψ, das Transfergen umfasst und von LTRs flankiert wird. Diese RNA kann in ein transduzierendes Partikel inkorporiert werden, das selbst von einer eukaryotischen Zelle hergestellt wurde, welche die Verpackungsproteine exprimiert. Die LTRs und die Verpackungsstelle ψ ist von retroviralem, vorzugsweise spumaviralem oder lentiviralem und am meisten bevorzugt von HIV-1-, HIV-2-, SIV- oder FIV-Ursprung.
Der Begriff „Vektorpartikel", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Transduktionskompetentes virales Partikel, das Verpackungsproteine, Hüllproteine wie sie auf der Oberfläche des viralen Partikels exponiert sind, sowie ein inkorporiertes Transferkonstrukt umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Nukleinsäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR: 4 dargestellt ist.
Wir waren in der Lage zu zeigen, dass eine konsequente und genaue Kodon-Optimierung der Gag- und GagPol-Leseraster, die von dem Affenimmundeffizienz-Virus SIV_mac239 oder dem humanen Immundeffizienz-Virus HIV-1_IIIB abgeleitet sind, eine hohe Expression von Gag, GagPol und Derivaten davon bei vollständiger Abwesenheit von Rev/RRE, CTE und UTR erlaubt, welche direkt für eine DNA-Vakzinierung verwendet werden kann.
Darüber hinaus waren wir in der Lage zu zeigen, dass eine konsequente und genaue Kodon-Optimierung von GagPol-Leserastern von SIV_mac239 oder HIV-1_IIIB, es sei denn die Gag- und Pol-Leseraster überlappen sich, eine hohe Expression von GagPol und Derivaten davon bei vollständiger Abwesenheit von Rev/RRE, CTE und UTR erlaubt und als Verpackungskonstrukte für die Genzufuhr verwendet werden können.
Daher erlaubt die sichere und wirkungsvolle Zufuhr und Expression von Gag- oder GagPol-Genen gemäß der vorliegenden Erfindung (i) die Expression von hohen Ausbeuten nativen Proteins in höheren Eukaryoten wie Säugetier- oder Insektenzellen und (ii) die Unterstätzung der Erzeugung von Transduktions-kompetenten Partikeln zu Zwecken der Vakzinierung und Gentherapie, die zur Zeit durch die komplexen regulatorischen Mechanismen der späten Gag- und GagPol-Expression beschränkt ist.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass die Kodon-Verwendung, z.B. im HIV-Genom (A/T-Gehalt 55,88%), signifikant von der hoch exprimierter Säugetiergene abweicht (üblicherweise nicht über 50%), was eine regulatorische Funktion der Kodon-Verwendung für rechtzeitig zu regulierende lentivirale Genexpression anzeigt.
Darüber hinaus waren wir in der Lage zu zeigen, dass eine CTE-vermittelte, ähnlich zu der Rev/RRE-vermittelten, Expression der wildtypischen späten Genprodukte von HIV-1 (beispielsweise gag) im Wesentlichen von dem Vorliegen des 5'-untranslatierten Bereichs (UTR) von HIV-1 oder wenigstens von Teilen davon abhängt, der auch einen RNA-Bereich enthält, der für die Verpackung der genomischen RNA in die viralen Partikel verantwortlich ist und daher sensible Sicherheitsbelange berührt.
Um inhibitorische oder auf andere Weise regulatorische Sequenzen innerhalb der lentiviralen Gag- und GagPol-Gene zu elimieren, wurden Leseraster gemäß der Kodon-Verwendung, wie sie in hoch exprimierten Säugetier-Genen gefunden wird, optimiert. Vorzugsweise wurden Kodons, die häufig in hoch exprimierten Säugetier-Genen gefunden werden (Ausubel et al. 1994: Current Protocolls in Molecular Biology 2, A1.8–A1.9), verwendet, um ein vollständig synthetisches Leseraster zu erzeugen, das in der Natur nicht vorkommt, das allerdings das identische Produkt wie das ursprüngliche wildtypische Genkonstrukt kodiert. Zu diesem Zweck wurde eine Matrix erzeugt, wobei fast ausschließlich nur die Kodons in Erwägung gezogen wurden, die am häufigsten verwendet werden, und, weniger bevorzugt, diejenigen, die am zweithäufigsten in hoch exprimierten Säugetier-Genen verwendet werden, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind. Tabelle 1: Kodon, das am häufigsten (Kodon 1) und am zweithäufigsten (Kodon 2) in hoch exprimierten Säugetier-Genen gefunden wird.
(Ausubel et al. 1994 Current Protocols in Molecular Biology 2, A1.8–A1.9).
Basierend auf dieser Matrix wurde das Wisconsin genetics computer group (gcg) Software-Paket angewandt, um den synthetischen Leseraster zu erzeugen, indem die Aminosäuresequenz der lentiviralen Gag- und GagPol-Polypeptide in das Kodon-optimierte synthetische Leseraster zurückübersetzt wurde.
Von der Befolgung der Verwendung der am häufigsten gefundenen Kodons können wenige Abweichungen erfolgen, um (i) das Einführen einzigartiger Restriktionsstellen in Intervallen von etwa 250 bis 300 nt zu bewerkstelligen (siehe z.B. 2), (ii) um G- oder C-Bereiche, die länger als 7 Basenpaare sind zu unterbrechen, um eine konsekutive PCR-Amplifikation und Sequenzierung des synthetischen Genprodukts zu erlauben. Dies kann auch für die auf Gag- und Pol-beruhenden Expressionsplasmide, die für DNA-Vakzinierung verwendet werden, sowie für die Verpackungskonstrukte ausgeführt werden, die für einen Gentransfer verwendet werden, mit Ausnahme des Letzteren, wo gag- und pol-Leseraster überlappend sind. Insbesondere wird es bevorzugt, dass der überlappende Bereich der gag- und pol-Leseraster der Verpackungskonstrukte, die für einen Gentransfer verwendet werden, an den Positionen 1298–1558 der SEQ ID NR: 2 und an den Positionen 1175–1532 der SEQ ID NR: 1 nicht verändert werden können, um beide Leseraster zu erhalten.
Insbesondere erlaubt daher die Verwendung von synthetischen Gag- und Pol-Genen, die die GagPol-Gene aller Retroviren, humanem T-Zell-Leukämie-Virus-1 und -2, Spuma- und vorzugsweise Lentiviren, insbesondere abgeleitet von HIV und SIV wie sie durch SEQ ID NR: 2 (GagPol HIV-1_IIIB) und SEQ ID NR: 1 (GagPol SIV_mac239) kodiert werden, die sichere und effiziente Produktion von Verpackungsproteinen für die Zufuhr genetischer Information an Zellen, während Kodons der Gag- und GagPol-Leseraster an hoch exprimierte Säugetier-Gene, mit Ausnahme der Bereiche, wo die Gag- und Pol-Leseraster überlappend sind, wie oben beschrieben angepasst wurden.
Die vorliegende Erfindung erlaubt daher die sichere und effiziente Produktion von Verpackungsproteinen durch ansteigende Ausbeuten der GagPol-Synthese im Vergleich zu Expressionsraten, die beim wildtypischen Gen oder bei Wildtyp-ähnlichen Genen erreicht werden, gekennzeichnet durch geclusterte Punktmutationen – wenn sie durch dieselbe zelluläre oder virale Promotor-/Enhancer-Einheit angetrieben werden – als ein Ergebnis einer konsequenten Anpassung der Kodon-Verwendung zu der von häufig exprimierten Säugetier-Genen.
Die vorliegende Erfindung erlaubt die sichere und effiziente Produktion von Verpackungsproteinen bei vollständigem Fehlen von bekannten cis-wirkenden Elementen (UTR, RRE) oder transaktiven Proteinen wie Rev und Tat.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter retrovirale auf gag- oder gagpol-beruhende Partikel, die durch Nukleinsäure-Moleküle erzeugt werden, welche die Nukleinsäure-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, mit wenigstens einer 25-fach reduzierten Einbaurate dieser Nukleinsäure-Moleküle, welche die gag- und pol-Polypeptide kodieren, im Vergleich zu retroviralen Partikeln, die von wildtypischen Nukleinsäure-Sequenzen erzeugt werden, welche die gag- und pol-Polypeptide kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter retrovirale auf gag- oder gagpol-beruhende Partikel, die von Nukleinsäure-Molekülen hergestellt werden, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz umfassen, die wenigstens eine 100-fach reduzierte Rekombinationsrate zwischen diesen Nukleinsäure-Molekülen, welche die gag- und pol-Polypeptide kodieren, und einem auf dem Wildtyp-Genom beruhenden Transgenkonstrukt aufweisen, das von denselben oder einem anderen Retrovirus abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung erlaubt die effiziente Herstellung von sicheren Vektorpartikeln, indem die Möglichkeiten zur Rekonstitution infektionskompetenter hybrider retroviraler Partikel durch Rekombinationsereignisse zwischen Nukleinsäuren, welche die Verpackungsproteine kodieren, und Sequenzen, welche die endogenen Retroviren kodieren, vermindert werden.
Die vorliegende Erfindung erlaubt die effiziente Herstellung von sicheren Vektorpartikeln, indem das Risiko des Einbaus der RNA-Spezies, welche die Verpackungsproteine kodieren, in Vektorpartikel um mehr als das 25-fache reduziert wird, im Vergleich zu Expressionskonstrukten, welche die 5'-UTR enthalten oder das wildtypische GagPol-Gen kodieren, oder durch Absenkung des Risikos der Verpackung derselben RNA in endogene retrovirale Partikel.
Die vorliegende Erfindung erlaubt die effiziente Herstellung von sicheren Vektorpartikeln, indem das Risiko einer Rekombination zwischen dem Verpackungskonstrukt und dem Gentransferkonstrukt um mehr als das 100-fache reduziert wird, indem ein synthetisches Gen, das die GagPol-Verpackungsfunktion von einem Retro-, Spuma- oder Lentivirus kodiert, mit dem auf dem wildtypischen Genom beruhenden Transgenkonstrukt, welches von (i) demselben oder (ii) einem anderem Retro-, Spuma- oder Lentivirus abgeleitet ist, kombiniert wird.
Genauer gesagt erlaubt die vorliegende Erfindung die effiziente Herstellung sicherer Vektorpartikel, indem das synthetische Gen, das die Verpackungsproteine, die von HIV-1 abgeleitet sind, kodiert, mit dem wildtypischen Transgenkonstrukt, das auf dem Genom eines wildtypischen HIV-1-Genoms beruht, kombiniert wird, oder indem das synthetische Gen, das die Verpackungsproteine, die von SIV_mac239 abgeleitet sind, kodiert, mit dem Transgenkonstrukt, das auf dem Genom eines wildtypischen SIV_mac239-Genoms beruht, oder Kombinationen davon, kombiniert wird.
Vorzugsweise werden durch die Kombination des synthetischen Gens, das die Verpackungsproteine, die von HIV-1 abgeleitet sind, kodiert, mit dem Transgenkonstrukt, das auf dem Genom eines wildtypischen SIV_mac239-Genoms beruht, oder durch die Kombination des synthetischen Gens, das die Verpackungsproteine, die von SIV_mac239 abgeleitet sind, kodiert, mit dem Transgenkonstrukt, das auf dem Genom eines wildtypischen HIV-1-Genoms beruht, Homologien zwischen dem Transfervektor und dem Verpackungsvektor (wie z.B. in Tabelle 1 von Beispiel 4 dargestellt ist) reduziert, was in sicheren und effizienten Verpackungskonstrukten resultiert, die für die Herstellung von sicheren lentiviralen Vektoren und Gen-Zufuhr-Systemen nützlich sind.
Synthetische GagPol-Gene können die aktive Integrase kodieren oder auch nicht. Im letzteren Fall kann das Integrasegen vollständig deletiert sein. Alternativ kann die enzymatische Aktivität durch eine einzelne Deletion oder mehrere kurze kontinuierliche im Leseraster vorliegende Deletionen verschiedener Länge, die vorzugsweise nicht mehr als 5 Aminosäuren betragen und, noch mehr bevorzugt ein einzelnes Kodon umfassen, ausgeknockt werden. Die Integrase kann ebenfalls durch Punktmutationen an verschiedenen Stellen, vorzugsweise durch eine einzelne Punktmutation (z.B. Position 3930–3932 in SEQ ID NR: 2 und Position 3957–3959 in SEQ ID NR: 1, die in Glutamin-kodierende Nukleotide geändert werden) inaktiviert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter retrovirale Verpackungszellen für die Erzeugung der erfindungsgemäßen retroviralen Partikel bereit, die mit Nukleinsäure-Molekülen transformiert sind, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz umfassen.
GagPol-Verpackungsproteine können stabil, induzierbar oder transient in jeder beliebigen primären oder Labor-angepassten Zelle oder Zelllinie humanen, Säugetier- oder nicht-Säugetierursprungs exprimiert werden. Die synthetischen GagPol-Gene können innerhalb dieser Zellen episomal oder chromosomal vorliegen und können zusätzliche rekombinante Gene enthalten, vorzugsweise jedes beliebige spezifische fusogene Gen, noch mehr bevorzugt jedes beliebige Gen für die virale Hülle, noch mehr bevorzugt ein Gen für die retrovirale Hülle. Diese Zellen können auch entweder einen episomalen oder chromosomalen Transfervektor enthalten, dürfen jedoch keine zusätzlichen viralen Wildtyp-Sequenzen beinhalten.
Die GagPol-Expression kann von jedem beliebigen Gewebe- oder Zelltyp-spezifischen Promotor/Enhancer angetrieben werden, beispielsweise dem Muskel-Kreatinkinase- oder MHC-Klasse I-Promotor/Enhancer oder von jedem beliebigen viralen, z.B. dem CMV-immediate early-, Rous Sarcoma-Virus-Promotor/Enhancer, Adenovirus Haupt-/spätem Promotor/Enhancer oder nicht-viralen, z.B. einem synthetischen Promotor/Enhancer.
Die GagPol-Expression kann entweder konstitutiv oder induzierbar sein, z.B. durch Zugabe eines spezifischen Induktors wie Ecdyson im Fall eines Hormon-induzierbaren Promotor/Enhancers oder durch das Entfernen eines Repressorproteins (Tet on/off) oder Repressorgens (Cre/Lox).
Die auf GagPol-beruhende Genzufuhr in Zellen kann durch jegliches Mittel der Transfektion oder Einführung eines Plasmids oder Plasmidderivats wie „midges" (geschlossene lineare DNA) in Zellen vermittelt werden, die das synthetische GagPol-Gen oder die oben dargestellten Varianten davon kodieren.
GagPol-beruhende Genzufuhr in Zellen kann auch durch infektiöse rekombinante (i) virale Vektoren wie rekombinante Retroviren, Vakzinia- oder Pockenviren, Adenoviren, Alphaviren, Herpesviren, Baculoviren oder jedes andere rekombinante Virus, (ii) subvirale Bestandteile, welche die Transfektions- und Infektionsverfahren überbrücken, wie Virosome, die Nukleinsäure/Protein-Aggregate umfassen, die beispielsweise Influenza-Hämagglutinin enthalten, (iii) bakterielle Vektoren wie rekombinante Listerien oder Salmonellen oder jeden anderen Typ eines infektiösen replizierenden oder nicht-replizierenden Vektors vermittelt werden.
Jedes Mittel für die Einführung von GagPol-Genen und Derivaten davon in Zellen kann zu einer transienten Expression von GagPol führen. Die Einführung der oben angegebenen GagPol-Gene in Zellen kann auch die Etablierung stabiler Zelllinien erlauben, die entweder eine konstitutive oder induzierbare GagPol-Expression unterstützen.
Retrovirale, vorzugsweise spumavirale und lentivirale, genauer gesagt HIV- oder SIV-abgeleitete Vektorpartikel, welche die Transgen-RNA tragen und in der Lage sind, sich nicht-teilende, ruhende oder postmitotische Zellen verschiedener Spezies zusätzlich zu sich-teilenden oder prolieferierenden Zellen zu transduzieren, können durch Co-Expression synthetischer GagPol-Konstrukte zusammen mit jedem geeigneten amphotropen Hüllprotein wie dem vestikulären Stomatitis-Virus G-Protein, xenotropen Hüllprotein, wie dem env-Protein der aviären oder murinen Sarcoma-Viren, z.B. dem Rous Sarcoma-Virus (RSV) Env-Protein oder Zelltyp-spezifischem Rezeptorprotein, wie dem HIV-1 Env-Protein, in Gegenwart jedes geeigneten Gentransferkonstrukts erzeugt werden, welches die erwünschte verpackungskompetente transgene RNA kodiert.
Transduktions-kompetente Vektorpartikel können mittels Co-Transfektion oder Co-Infektion oder Transfektion/Infektion primärer Zellen oder Zelllinien verschiedenen Ursprungs, wie Säuger-Verozellen, HeLa-, Cos-, CHO- oder H1299-Zellen oder Insekten-SF9-, High-5- oder DS-2-Zellen mit Vektorkonstrukten, welche die von synGagPol-abgeleiteten Verpackungsproteine und jede geeignete Hüll- oder Rezeptorstruktur sowie das erwünschte Transgen kodieren.
Alternativ können Transduktions-kompetente Vektorpartikel von stabilen Zelllinien erzeugt werden, die GagPol ausgehend von dem erfindungsgemäßen synthetischen GagPol-Gen entweder induzierbar oder konstitutiv exprimieren, wobei die stabilen Zelllinien mit Vektorkonstrukten co-transfiziert oder co-infiziert oder transfiziert/infiziert werden können, die jede Hüll- oder Rezeptorstruktur sowie das erwünschte Transgen kodieren.
Vorzugsweise können Transduktions-kompetente Vektorpartikel von stabilen Zelllinien erzeugt werden, die GagPol ausgehend von dem erfindungsgemäßen synthetischen GagPol-Gen zusammen mit jeder geeigneten Hüll- oder Rezeptorstruktur entweder induzierbar oder konstitutiv exprimieren, wobei die stabilen Zelllinien mit Vektorkonstrukten transfiziert oder infiziert werden können, die das erwünschte Transgen kodieren.
Idealerweise können Transduktions-kompetente Vektorpartikel von einer stabilen Zelllinie erhalten werden, welche die Expression des synthetischen GagPol-Gens und jeder geeigneten Rezeptor- oder Hüll-Funktion zusammen mit der Erzeugung der Verpackungs-kompetenten transgenen RNA, entweder auf eine induzierbare Weise oder konstitutiv oder in einer Kombination davon, vermittelt.
Am bevorzugtesten werden Transduktions-kompetente Vektorpartikel durch Transfektion von Zellen mit einem Plasmid oder einem Derivat davon erzeugt oder durch Infektion von Zellen mit jedem infektiösen, obwohl nicht notwendigerweise Replikations-kompetenten Vektor, der die von synGagPol-abgeleiteten Verpackungsproteine kodiert, und mit jeder geeigneten Hüll- oder Rezeptorstruktur sowie dem erwünschten Transgen.
Sowohl Transduktions-kompetente Vektorpartikel als auch infektiöse, obwohl nicht notwendigerweise Replikations-kompetente Vektoren, welche die von synGagPol-abgeleiteten Verpackungsproteine kodieren, und jede geeignete Hüll- oder Rezeptorstruktur sowie das erwünschte Transgen können für eine ex vivo- und in vivo-Anwendung verwendet werden.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäure-Moleküle, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz umfassen, für die Verwendung als eine aktive pharmazeutische Substanz.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung von Nukleinsäure-Molekülen, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz umfassen, für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, die von Retroviren verursacht werden.
Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung zu Vakzinierungszwecken verwendet werden, insbesondere, wenn sie als Nukleinsäure-beruhende Vakzinierungskonstrukte verwendet wird, von denen gezeigt wurde, dass sie eine starke humorale und Th-1-ähnliche zelluläre Immunreaktion in Mäusen hervorrufen. Auf Grundlage der erfindungsgemäßen GagPol-Gene ist es jetzt möglich, effektive retrovirale, HTLV-1- und -2-abgeleitete sowie lentivirale und insbesondere auf HIV und SIV beruhende Gag- und GagPol-Vakzine herzustellen, die alle bekannten HIV- und SIV-Claden und Sequenzen sowie Derivate davon umfassen, wodurch die Ausbeuten der GagPol-Produktion durch die Verwendung von Kodon-optimierten GagPol-Genen oder Derivaten davon erhöht werden, wenn sie mit den Expressionsraten verglichen werden, die von wildtypischen Genen oder Wildtyp-ähnlichen Genen, die durch geclusterte Punktmutationen gekennzeichnet sind, verglichen werden – wenn sie von derselben zellulären oder viralen Promotor/Enhancer-Einheit angetrieben werden – als ein Ergebnis einer konsequenten Anpassung der Kodon-Verwendung an die von häufig exprimierten Säugetier-Genen.
Ein bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Konstruktion von auf GagPol-beruhenden Vakzinen und insbesondere von auf HIV und SIV beruhenden Vakzinen, die besonders modifiziert sind, um die Sicherheit von GagPol-abgeleiteten Kandidatenvakzinen zu verbessern, wenn sie z.B. als ein DNA-Vakzin zugeführt werden, durch jede Art von infektiösem, replizierendem oder nicht-replizierendem Vektor, oder wenn sie als von GagPol-abgeleitete virusähnliche Partikel verabreicht werden, durch konsequente und strikte Anpassung der Kodon-Verwendung unter vollständiger Abwesenheit von bekannten cis-wirkenden Elementen oder transaktiven Proteinen wie Rev und Tat.
Ein weiteres bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Konstruktion von auf GagPol-beruhenden Vakzinen, indem die Möglichkeiten zur Rekonstitution von Infektions-kompetenten hybriden retroviralen Partikeln durch Rekombinationsereignisse zwischen Nukleinsäuren, welche die Verpackungsproteine kodieren, und Sequenzen, die endogene Retroviren kodieren, reduziert werden.
Ein weiteres bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Konstruktion von auf GagPol-basierenden Vakzinen, indem das Risiko der Inkorporierung von RNA-Spezies, die Gag, GagPol oder Derivate davon in subvirale Gag- oder GagPol-abgeleitete Partikel um mehr als das 25-fache reduziert wird, im Vergleich zu Expressionskonstrukten, welche die 5'-UTR enthalten oder die wildtypischen Gag- und GagPol-abgeleiteten Gene kodieren, und indem das Risiko der Verpackung derselben RNA in endogene retrovirale Partikel verringert wird, wobei das Risiko der Rekombination zwischen der Nukleinsäure, die von einem Vakzinkonstrukt, das erfindungsgemäßes Gag, GagPol oder Derivate davon kodiert, mit DNA oder RNA, die von einer Infektion mit HIV, SIV oder jedem anderen Lenti- oder Retrovirus oder anderweitig verwandten Virus abstammt.
Dies resultiert in sicheren und effizienten DNA-Konstrukten, die für die Produktion und Zufuhr von sicheren von GagPol-abgeleiteten Vakzinkonstrukten nützlich sind.
Um die Sicherheit der Vakzinkonstrukte weiter zu erhöhen, werden die Kodon-optimierten Gag- oder GagPol-Leseraster an bestimmten Stellen modifiziert.
Das auf Gag- oder GagPol-beruhende synthetische Leseraster wird so modifiziert, dass die Myristylierung des Gag-Vorläufers inhibiert wird (z.B. wird Position 4–6 in SEQ ID NR: 2 und Position 4–6 in SEQ ID NR: 1 in Alanin oder Valin kodierende Nukleotide geändert), wobei die Ausknospung von Gag- oder GagPol-abgeleiteten Partikeln verhindert wird und die Menge des endogen hergestellten Antigens erhöht wird.
Das Gag- oder GagPol-beruhende sythetische Leseraster wird so modifiziert, dass die Gag- und Pol-kodierenden Bereiche das selbe Leserraster verwenden, indem eine ribosomale Leserasterverschiebung eingeführt wird z.B. entweder durch die Einführung eines Nukleotids oder die Deletion von zwei Nukleotiden an jeder beliebigen Position, ohne dass ein vorzeitiges Stop-Kodon innerhalb des Gag-kodierenden Bereichs erzeugt wird, vorzugsweise zwischen der Position der natürlichen Leserasterverschiebungsstelle (rutschige Sequenz; entsprechend den Positionen 1297 SEQ ID NR: 1 und Position 1294 SEQ ID NR: 2) und dem Gag-Stopkodon (spezifiziert durch SEQ ID NR: 3), wobei die Menge des synthetisierten pol-Genprodukts erhöht wird.
Das auf Gag- oder GagPol-beruhende synthetische Leseraster wird so modifiziert, dass die Protease-Aktivität inaktiviert wird, indem eine Deletion, die das vollständige oder einen Teil des PR-Gens umfasst, eingeführt wird oder indem eine oder mehrere kurze kontinuierliche Deletionen innerhalb des Leserasters von verschiedener Länge, vorzugsweise nicht mehr als 5 Aminosäuren und noch mehr bevorzugt umfassend ein einzelnes Kodon, am meisten bevorzugt das Kodon, das den Asparaginsäure-Rest an der aktiven Stelle der PR kodiert, eingeführt werden. Die PR kann auch durch Punktmutationen an verschiedenen Stellen, vorzugsweise durch eine einzelne Punktmutation an einer beliebigen Position, am meisten bevorzugt an der aktiven Stelle, inaktiviert werden (z.B. Positionen 1632–1635 in SEQ ID NR: 2 und Position 1575–1577 in SEQ ID NR: 1 werden in Asparagin- oder Alanin-kodierende Nukleotide geändert).
Das auf Gag- oder GagPol-beruhende synthetische Leseraster wird so modifiziert, dass die aktive Stelle des Reversetranskriptase-Gens (RT) inaktiviert wird, indem eine Deletion, die das vollständige oder einen Teil des RT-Gens umfasst, eingeführt wird oder indem eine oder mehrere kurze kontinuierliche Deletionen im Leseraster von verschiedener Länge, vorzugsweise nicht mehr als 5 Aminosäuren und noch mehr bevorzugt, umfassend ein einzelnes Kodon, das eine Aminosäure an einer beliebigen Position kodiert, am meisten bevorzugt innerhalb der aktiven Stelle, die für die RT-Funktion kritisch ist, eingeführt werden. Die RT kann auch durch Punktmutationen an verschiedenen Stellen, vorzugsweise durch eine einzelne Punktmutation an der aktiven Stelle inaktiviert werden (z.B. Positionen 2349–2351 in SEQ ID NR: 2 und Position 2136–2138 in SEQ ID NR: 1 werden in Aparagin- oder Glutaminsäure-kodierende Nukleotide geändert).
Das auf Gag- oder GagPol-beruhende synthetische Leseraster wird so modifiziert, dass die aktive Stelle des Reversetranskriptase-Gens (RT) in ihrer Position verändert wird, z.B. zum C-Terminus des synthetischen GagPol-Gens, um die Polymeraseaktivität zu inhibieren, wobei die Produktion von möglicherweise gefährlichen Nukleotidsequenzen und/oder die Rekonstitution von infektiösen oder auf andere Weise gefährlichen Viruspartikeln verhindert wird.
Das auf Gag- oder GagPol-beruhende synthetischer Leseraster wird so modifiziert, dass die anderen lentiviralen Gene wie nef, rev, tat, die biologisch inaktiviert werden (z.B. durch Gendurcheinanderbringung), in ausgewählte Teile der Gag- oder GagPol-Leseraster eingefügt werden, vorzugsweise in die aktive Stelle von RT, um die Immunogenizität und Sicherheit zu erweitern.
Das auf Gag- oder GagPol-beruhende synthetische Leseraster wird so modifiziert, dass die möglicherweise gefährlichen Gene, wie die Integrase (IN), deletiert werden. Alternativ kann die Enzymaktivität durch eine Deletion oder mehrere kurze kontinuierliche im Leserraster liegende Deletionen verschiedener Länge, vorzugsweise von nicht mehr als 5 Aminosäuren und noch mehr bevorzugt, umfassend ein einzelnes Kodon, ausgeknockt werden. Die Integrase kann auch durch Punktmutationen an verschiedenen Stellen, vorzugsweise durch eine einzelne Punktmutation inaktiviert werden (z.B. die Positionen 3930–3932 in SEQ ID NR: 2 und Position 3957–3959 in SEQ ID NR: 1 werden in Glutamin-kodierende Nukleotide geändert).
Die strikte Befolgung der Kondon-Verwendung von hoch exprimierten Säugetier-Genen führt auch zu einem Anstieg des gesamten GC-, GG- und CC-Gehalts und führt dadurch potenziell immun-modulatorische Nukleinsäuremotive ein, die humorale und zelluläre Immunreaktionen um wenigstens das 2-fache erhöhen, im Vergleich zum entsprechenden wildtypischen Gen oder Wildtyp-ähnlichen Genen, die durch geclusterte Punktmutationen teilweise von Rev unabhängig gemacht worden sind.
Das GagPol-Produkt oder Derivate davon, die von den erfindungsgemäßen gagpol-Genen kodiert werden, können stabil, induzierbar oder transient in jeder primären oder an das Labor angepassten Zelle oder Zelllinie von humanem, Säugetier- oder nicht-Säugetier-Ursprung exprimiert werden, um GagPol-Antigene, GagPol-enthaltende Virus-ähnliche Partikel oder Derivate davon herzustellen.
Die Expression von Kodon-optimiertem GagPol oder Derivaten davon in Zellkultur sowie in vivo nach Immunisierung mit DNA- oder RNA-Konstrukten, die weiter unten spezifiziert sind, kann von jedem Gewebe- oder Zelltyp-spezifischen zellulären Promotor/Enhancer angetrieben werden, wie dem Muskel-Kreatinkinase- oder MHC-Klasse I-Promotor/Enhancer oder durch jedem viralen (z.B. CMV immediate early; Rous Sarcoma Virus Promotor/Enhancer, Adenovirus Haupt/Spätpromotor/Enhancer) oder nicht-viralen, z.B. synthetischen, Promotor/Enhancer.
Die GagPol-Expression kann entweder konstitutiv oder induzierbar sein, z.B. durch Zugabe eines spezifischen Induktors wie Ecdyson im Fall eines Hormon-induzierbaren Promotor/Enhancers oder durch Entfernung eines Repressors (Tet on/off) oder Repressorgens (Cre/Lox).
Die Zufuhr von Kodon-optimierten GagPol-Genen oder Derivaten davon in Zellen in vitro kann durch jedes Mittel der Transfektion oder Einführung eines Plasmids oder Plasmidderivats wie „midges" (geschlossene lineare DNA) in Zellen vermittelt werden, die das synthetische GagPol-Gen oder die oben genannten Varianten davon kodieren.
Die Zufuhr von Kodon-optimierten GagPol-Genen oder Derivaten davon in vivo kann durch Injektion des Plasmids, Plasmidderivats oder infektiösen, replizierenden oder nicht-replizierenden Vektors an jede Stelle, vorzugsweise intramuskulär, subkutan oder intradermal, zusammen verabreicht mit jeder Art von Adjuvans, z.B. Liposomen, ISCOMS, Alaun oder mittels biodegradierbarer Partikel, entweder direkt oder unter Verwendung technischer Vorrichtungen wie eine Partikelkanone, Biojektor oder durch jedes andere Mittel vermittelt werden.
Die Zufuhr von Kodon-optimierten GagPol-Genen oder Derivaten davon in Zellen in vitro und in vivo kann auch durch infektiöse oder nicht-infektiöse rekombinante virale Vektoren wie rekombinante Retroviren, Vakzinia- oder Pockenviren, Adenoviren, Alphaviren, Herpesviren, Baculoviren oder jeden anderen rekombinanten Virus, subvirale Bestandteile, welche die Transfektions- und Infektionsverfahren überbrücken, beispielsweise Virosome, die Nukleinsäure/Protein-Aggregate umfassen, die z.B. Influenzahämagglutinin enthalten, oder bakterielle Vektoren wie rekombinante Listerien oder Salmonellen oder jede andere Art eines infektiösen, replizierenden oder nicht-replizierenden Vektors vermittelt werden.
Beispiel 1:
Konstruktion des synthetischen gag-Gens. Alle nachfolgenden Nummerierungen der Wildtyp-Nukleotidsequenzen von HIV-1 entsprechen dem HIV-1-Isolat BH10 (GenBank Accession: M15654). Alle nachfolgenden Nummerierungen von synthetischen Gag-kodierenden Leserastern von HIV-1 entsprechen dem Start-Kodon des entsprechenden kodierenden Bereichs. Die Position von Restriktionsstellen ist durch ihre Spaltungsstelle definiert.
Es wurde eine synthetische Sequenz, die für das Pr55^gag-Polyprotein von HIV-1_IIIB kodiert, erzeugt, indem die Aminosäuresequenz des gag-kodierenden Bereichs (Nukleotide 112–1650) in eine synthetische gag (syngag)-kodierenden Sequenz übersetzt wurde, wobei eine Kodon-Verwendung verwendet wurde, die am häufigsten in Säugetier-Zellen vorkommt, wie sie in SEQ ID NR: 5 dargestellt ist. Um den Leseraster von syngag zu fragmentieren, wurden an den Positionen 5 (NarI), 290 (StyI), 487 (StuI), 696 (SacII), 852 (EcoRV), 1107 (BstEII) und 1307 (BglI) durch stille Mutationen einzigartige Restriktionsstellen erzeugt. Zum Klonieren wurden die zusätzlichen Restriktionsstellen KpnI (95), BamHI, XhoI und SacI innerhalb der nicht-kodierenden Bereiche eingeführt. Synthetische Fragmente, welche die Bereiche zwischen den Restriktionsstellen KpnI/StyI (F1), StyI/StuI (F2), StuI/EcoRV (F3), EcoRV/BstEII (F4), BstEII/BglII (F5) und BglI/SacI (F6) umspannen, wurden durch eine schrittweise PCR-Amplifizierung mit überlappenden 60 nt langen Oligonukleotiden erzeugt und unter Verwendung des pCR-Skript^TM Amp SK(+) Cloning Kit (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) gemäß der Anweisungen des Herstellers subkloniert. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, StyI, StuI, EcoRV, BstEII, SauI und SacI wurden verwendet, um die Fragmente in einen vollständigen Leseraster zu assemblieren. Zuletzt wurde das syngag voller Länge in die KpnI- und XhoI-Restriktionsstellen des pcDNA3.1(+)-Expressionsvektors (Invitrogen, Leek, Niederlande) unter die transkriptionelle Kontrolle des immediate early Promotor/Enhancers des Cytomegalievirus (CMV) platziert, der in Säugetier-Zellen eine konstitutive Transkription erlaubt.
Um inhibitorische Sequenzen innerhalb des gag-Leserasters von HIV-1 zu eliminieren, wurde, wie oben beschrieben, ein synthetisches Gen konstruiert, welches das gesamte Pr55^gag- Polyprotein mittels einer Kodon-Verwendung kodiert, die am häufigsten in hochexprimierten Säugetier-Genen auftritt. Es wurden wenige Abweichungen von der genauen Befolgung der optimierten Kodon-Verwendung gemacht, um die Einführung einzigartiger Restriktionsstellen in etwa 250 bis 300 nt langen Intervallen zu ermöglichen (SEQ ID NR: 5). Ein Vergleich der synthetischen und wildtypischen Gag-kodierenden Sequenzen ist in 2A gezeigt, was zeigt, dass fast jede Wobble-Position innerhalb des wildtypischen kodierenden Bereichs durch die Konstruktion des synthetischen Gens verändert wurde. Das Wisconsin genetics computer group (gcg)-Software-Packet wurde verwendet, um die abweichende Zusammensetzung des wildtypischen und synthetischen gag-Leserasters zu vergleichen. Die Kodon-Optimierung resultierte in einem erhöhten G/C- und erniedrigten A/U(T)-Gehalt sowie in einem 5-fachen Anstieg von immunstimulatorischen CpG-Motiven (2B).
Mehrere wildtypische Expressionsvektoren wurden durch standard-molekularbiologische Techniken etabliert, um die Expression von synthetischen und wildtypischen gag-Leserastern zu vergleichen. Subgenomische Wildtypsequenzen von HIV-1 wurden durch PCR-Amplifikation oder Restriktionsverdau von HX10 Provirus-DNA kloniert (Ratner et al. 1987, AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1987 3: 57–69). Die wildtypische gag-Sequenz (Nukleotide 9–1640), die einen 5'-gelegenen 103 bp langen UTR enthält, wurde in die KpnI- und XhoI-Restriktionsstellen des pcDNA3.1 (Stratagene)-Expressionsvektors kloniert, nachdem eine PCR-Amplifikation eines 1667 nt langen Fragments mit den Primern utr-1 (5'-gcg GGT ACC GAA TTC cga cgc agg act cgg ctt gc-3') und gag-2 (5'-gcc GAG CTC CTC GAG GGA TCC tta ttg tga cga ggg gtc gtt gcc aaa gag-3') erfolgt ist, was pCMV-UTR-wtgag ergab. Wildtypisches gag wurde in die KpnI- und XhoI-Restriktionsstellen des pcDNA3.1 (Stratagene)-Expressionsvektors kloniert, indem ein 1537 nt-langes Fragment (103–1640) mit dem Primern gag-1 (5'-gcg GGT ACC GAA TTC agg aga gag atg ggt gcg aga gcg tca gta tta agc-3') und gag-2 ausgeführt wurde, was pCMV-wtgag ergab. Die PCR-Amplifikation des UTR mit den Primern utr-1 und utr-2 (5'-gga TGG CGC CCA tct ctc tcc ttc tag cct cc-3') resultierte in einem 103 nt langen Fragment (9–112), das in die KpnI- und NarI-Restriktionsstellen von pCMV-syngag kloniert wurde, wodurch der UTR direkt in 5'-Orientierung des Start-Kodons von syngag platziert wurde, was pCMV-UTR-syngag ergab. Ein BglII- und BamHI-Verdau von HX10 proviraler DNA setzte ein 854 nt-Fragment (6976–7830) frei, das das RRE und eine ineffizient verwendete Splice-Akzeptorstelle (Pos. 7734) enthielt. Dieses RRE-enthaltende Fragment wurde in die BamHI-Restriktionsstelle der Plasmide pCMV-UTR-wtgag, pCMV-wtgag und pCMV-UTR-syngag kloniert, was pCMV-UTR-wtgag-RRE, pCMV-wtgag-RRE beziehungsweise pCMV-UTR-syngag-RRE ergab. Unter Verwendung von MPMV proviraler DNA als Matrize und den Primern cte-1 (5'-gct aGG ATC Ccc att atc atc gcc tgg aac 3') und cte-2 (5' cga aCT CGA Gca aac aga ggc caa gac atc 3') wurde ein DNA-Fragment amplifiziert, das für das konstitutive Transportelement (CTE)-RNA-Element des Affen-Mason-Pfizer D-Typ Retrovirus kodiert (MPMV, Accession Nr. M12349, Nukleotide 7886 bis 8386). Das 500 bp lange Fragment wurde in die BamHI- und XhoI-Restriktionsstellen von pCMV-wtgag und pCMV-UTR-wtgag kloniert, was die Konstrukte pCMV-wtgag-CTE beziehungsweise pCMV-UTR-wtgag-CTE ergab. Eine schematische Darstellung aller Konstrukte ist in 1A zusammengefasst.
Beispiel 2:
Transfektion von Gag-kodierenden Expressionskonstrukten in Säugetier-Zellen. Zellen wurden mittels der Kalzium-Co-Präzipitationstechnik transfiziert (Graham und Van der EB 1973, Virol. 52, 456–467). Am Tag vor der Transfektion wurden 2 × 10⁶-Zellen auf 100 mm-Durchmesser-Kultur-Platten platiert und 24 Stunden lang inkubiert. Für die Transfektion wurden 30 μg des Pr55^gag-exprimierenden Plasmids verwendet, und die Gesamtmenge der DNA wurde mit entweder pcDNA3.1(+)-Vektor oder für Co-Transfektionsexperimente mit pCMV-rev auf 45 μg angepasst. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, zwei Mal in PBS gewaschen und anschließend weiter analysiert. Western-Blot-Analyse von Zellen, die mit Gag-kodierenden Expressionskonstrukten transfiziert wurden. Die geernteten Zellen wurden in 0,5% Triton X-100, 100 mM Tris/HCl (pH 7,4) lysiert, wiederholten Einfrieren/Auftauen-Zyklen unterworfen, mittels Zentrifugation (20800 × g für 5 min.) geklärt, und die Gesamtmenge von Protein wurde gemäß der Anweisungen des Herstellers mittels eines BIO-RAD Protein-Assays (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) gemessen. 50 μg Gesamtprotein wurden durch Elektrophorese auf einem denaturierenden SDS 12,5% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und mittels Elektroblots auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Expression von Pr55^gag wurde mit dem HIV-1 p24-spezifischen monoklonalen Antikörper 13–5 (Wolf et al. 1990, AIFO 1: 24–29) nachgewiesen und durch chromogene Färbung visualisiert.
Gag-Capture-ELISA von Zellen, die mit Gag-kodierenden Expressionskonstrukten transfiziert wurden. Die p24-Capture-ELISA-Antikörper wurden freundlicherweise von Dr. Matthias Niedrig (RKI, Berlin, Deutschland) zur Verfügung gestellt. 96-Loch-MaxiSorp ELISA-Platten (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) wurden über Nacht mit 100 μl p24-spezifischem monoklonalen Antikörper 11-G-7, der 1:170 mit 0,1 M Karbonatpuffer (pH 9,5) verdünnt wurde, beschichtet. Die Platten wurden 6 Mal mit Waschpuffer (0,1% Tween 20, 300 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄2H₂O, 1,5 mM NaH₂PO₄H₂O) gewaschen. Unterschiedliche Mengen des Zelllysats wurden in 0,5% BSA in Waschpuffer verdünnt, in die Löcher gefüllt und über Nacht bei 4°C mit einem sekundären Meerrettich-Peroxidase-konjugierten monoklonalen Antikörper (1:600 in 0,5% BSA in Waschpuffer verdünnt), der ein anderes Epitop innerhalb von p24 erkennt, inkubiert. Nachdem die Platten 6 Mal mit Waschpuffer gewaschen wurden, wurden die Antikörper-Konjugate mit OPD-Lösung (Abbott, Wiesbaden, Deutschland) gefärbt, und die Absorption OD (495 nm) wurde mit einem ELISA-Lesegerät gemessen. Die Konzentration von Pr55^gag wurde mittels einer Kalibrierungskurve unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von aufgereinigtem Pr55^gag bestimmt, das in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems hergestellt wurde (Wagner et al. 1994, Virology 200: 162–175).
Wie erwartet war in Abwesenheit von RRE und Rev die von dem wildtypischen gag-Gen (wtgag) ausgehende Synthese von Pr55^gag extrem niedrig (3A, Spuren 5, 6). Die Pr55^gag-Produktion stieg nach einer Fusion von RRE stromabwärts des wtgag-Gens und Co-Transfektion von Rev nur um einen Faktor von 1,5–2 an, was nahe legt, dass das Rev/RRE-System per se nicht ausreichend war, um eine wesentliche Gag-Expression zu fördern (3A, Spuren 7,8). Im Gegensatz dazu resultierte die Hinzufügung der authentischen 103 bp langen UTR 5' zum gag-Gen in einem 4–5-fachen Anstieg in der Proteinproduktion, sogar in Abwesenheit von Rev (3A, Spuren 1, 3 und 4). Darüber hinaus führte die Rev/RRE-Interaktion zu einem weiteren Anstieg in der Pr55^gag-Produktion um einen Faktor von 5 bis 8 (2–4 ng/μg Gesamtprotein; 3A, Spur 2) und um mehrere Größenordnungen im Vergleich zu wtgag-RRE, das mit Rev co-transfiziert wurde. Die Substitution von Rev/RRE durch einen CTE-vermittelten nukleären Export hing auf dieselbe Weise von der Anwesenheit des authentischen UTR ab, was in einer hohen Gag-Expression resultierte. Allerdings erreichte die CTE-vermittelte Pr55^gag-Produktion (3B, Spur 3) nur 70% bis 80% (1,3–1,6 ng/μg Gesamtprotein) der Rev-abhängigen Gag-Expression unter Verwendung von Rev/RRE (3B, Spur 1), während bei Fehlen des UTR nur eine sehr geringe Menge von Gag produziert wurde (3B, Spuren 4, 5).
Eine hohe Expression von Pr55^gag wurde in allen Fällen nach transienter Transfektion des syngag-kodierenden Plasmids (3C, Spuren 1–4) erreicht. Die Expressionsniveaus wurden durch Einführung des Rev/RRE-Systems nicht wesentlich verändert und waren weder abhängig noch beeinflusst von der Anwesenheit eines UTR (3C, Spuren 3–4). Die Pr55^gag-Expressionsniveaus übertrafen diejenigen, die durch eine CTE-vermittelte wtgag-Expression erreicht wurden, um mehr als 130% und um etwa 50% bis 100% durch die Co-Transfektion von UTR-wtgag-RRE mit Rev (3C, Spur 6) und um Größenordnungen im Vergleich zu denjenigen, die mit wtgag-RRE erreicht wurden, sei es mit oder ohne Rev-Co-Transfektion (3C, Spur 7, 8). Daher erlaubt eine Anpassung der Kodon-Verwendung eine Rev-unabhängige Expression bei Abwesenheit von allen cis-wirkenden regulatorischen Elementen, was in hohen Ausbeuten der Pr55^gag-Produktion resultiert (3,5–6,5 ng/μg Gesamtprotein).
Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung verschiedener Zelllinien (Cos7, HeLa) bestätigt, was ausschließt, dass Zelltyp-spezifische Faktoren in kritischer Weise an den beobachteten Wirkungen beteiligt sind (3D).
Beispiel 3:
Immunogenizität von Gag-Expressionsvektoren nach Vakzinierung mit nackter DNA. Weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen untergebracht und im Alter von 6 bis 12 Wochen injiziert. Um die Wirksamkeit und die Art der Immunreaktion, die durch entweder die wildtypischen oder synthetischen Leseraster nach DNA-Vakzinierung induziert wurden, zu bewerten, erhielten Gruppen von je 3 Mäusen eine subkutane (s.c.) primäre Injektion, an der Schwanzbasis, einer Lösung, die 100 μg Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 100 μl PBS enthielt. In den Wochen 3 bzw. 6 nach der primären Injektion erhielten die Mäuse eine Boost-Injektion.
In der Woche 2 nach der Boost-Injektion wurde von den Mäusen durch Blutentnahme am Schwanz Serum gewonnen. Antikörper, die für das HIV Pr55^gag-Polypeptid spezifisch sind, wurden durch einen Endpunkt-Verdünnungs-ELISA-Assay (in 2-facher Ausführung) mit Proben von den einzelnen Tieren quantifiziert. Kurz gesagt, wurde eine feste Phase von PrepCell-aufgereinigten Pr55^gag-Proteinen (100 μl von 1 μg/ml pro Loch, über Nacht bei 4°C in einem Kühlschrank) verwendet, um Pr55^gag-reaktive Antikörper aus dem Serum einzufangen (2 h bei 37°C), die anschließend mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Ziege-Anti-Maus IgG1, IgG2a und gesamten IgG-Antikörpern (1:2000 in PBS, 2% Tween 20, 3% FCS; 100 μl/Loch; PharMingen, Hamburg, Deutschland), gefolgt von einer o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid-Lösung (100 μl/Loch, 20 min. bei Raumtemperatur im Dunklen; Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) nachgewiesen. Die Endpunkttiter wurden als die höchste Serumverdünnung definiert, die in einem Absorptionswert (OD 492) resultierte, der drei Mal größer war als der derselben Verdünnung eines nicht-Immunserums. Das Serum jeder Maus wurde untersucht, und diese Werte wurden verwendet, um den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Gruppe von fünf Mäusen zu berechnen.
Einzelne Zellsuspensionen wurden aus Milzdrüsen von Mäusen 5 Tage nach der Boost-Immunisierung aseptisch zubereitet. Zellen wurden in einem α-MEM-Medium (Gibco) suspendiert, das mit 10 mM HEPES-Puffer, 5 × 10^–5 β-Mercaptoethanol und 10% FCS supplementiert war. 5% eines ausgewählten Batches von Überständen von mit Con Astimulierten Milzzellen der Ratte (Poggi et al. 1994, Eur J Immunol. 1994 Sep; 24(9): 2258–61) wurde zum Kulturmedium als eine Quelle von Wachstumsfaktoren hinzugefügt. Responder-Zellen (3 × 10⁷) wurden mit 1,5 × 10⁶ syngenischen, V3_LAI-Peptid-gepulsten P815-Zellen (die mit 20.000 rad bestrahlt wurden) in 10 ml Gewebekultur-Medium in aufrechten 25 cm³ Gewebekultur-Flaschen in einer feuchten Atmosphäre mit 7% CO₂ bei 37°C co-kultiviert. Zytotoxische Effektorpopulationen wurden nach 6 Tagen der in vitro-Kultur geerntet. Serielle Verdünnungen von Effektorzellen wurden mit 2 × 10³ Zielzellen in 200 μl Rundbodenlöchern kultiviert. Ziele waren autologe A20-Zellen (2 × 10⁴/ml), die über Nacht bei 37°C mit 10^–8 M eines 18-mer V3_LAI-Peptid oder einem 23-mer p24CA_LAI-Peptid inkubiert wurden. Nicht mit einem Peptid gepulste Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet. Ziel- und Kontroll-A20-Zellen wurden mit ⁵¹Cr markiert (1 Stunde bei 37°C, 20 μCi/10⁶ Zellen), bevor sie zu den Effektorzellen hinzugefügt wurden. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37°C wurden für eine γ-Zählung 100 μl des Überstands gesammelt. Der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung wurde als [(experimentelle Freisetzung – Spontanfreisetzung)/(Gesamtfreisetzung – Spontanfreisetzung)] × 100 berechnet. Gesamtzählungen wurden nach Hinzufügung von 1% Triton X-100 zu den markierten Zielzellen gemessen. Spontan-freigesetzte Zählungen waren immer weniger als 20% der Gesamtzählungen. Die gezeigten Daten sind ein Mittelwert von 3-fach-Kulturen. Standardfehler der Mittelwerte der 3-fach-Daten betrugen immer weniger als 20% des Mittelwerts.
Wie in 4 dargestellt, sind von lentviralen Pathogenen abgeleitete Gene in der Lage, eine starke humorale und zelluläre Immunreaktion zu induzieren. Nur in Mäusen, die mit synthetischen gag-Plasmiden immunisiert wurden, konnten hohe Spiegel von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Es ist wahrscheinlicher, dass eine Th-1-Antwort eine zelluläre Immunreaktion hervorruft, was mittels eines CTL-Chrom-Freisetzungs-Assays mit frisch zubereiteten Milzzellen der immunisierten Mäuse verifiziert wurde. Wiederum waren nur Mäuse, die mit einem Gag-Expressionsplasmid immunisiert wurden, das mit einer optimierten Kodon-Verwendung kodiert wurde, in der Lage, eine starke zytolytische Aktivität zu induzieren und daher eine zellvermittelte Immunreaktion hervorzurufen.
Beispiel 4:
Konstruktion von synthetischen Genen, die für Verpackungsfunktionen eines lentiviralen Gentransvektorsystems kodieren. Die nachfolgende Nummerierung von Nukleotidsequenzen, die sich auf synthetische GagPol-Sequenzen von HIV-1 oder -SIV beziehen, entsprechen dem Startkodon des entsprechenden kodierenden Bereichs. Die Position von Restriktionsstellen ist durch ihre Spaltungsstelle definiert.
Entwurf eines Kodon-optimierten HIV-1 GagPol-Gens, das Verpackungsfunktionen kodiert. Eine synthetische Sequenz, die für das HIV-1_IIIB (BH10, GenBank Zugangs-Nr.: M15654) Pr160^GagPol-Polyprotein kodiert, wurde durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz des GagPol-kodierenden Bereichs (Nukleotide 1–4343) erzeugt, ausgenommen der Bereich, wo die gag- und pol-Leseraster überlappend sind (Nukleotide 1298–1539), und unter Verwendung einer Kodon-Verwendung, die am häufigsten in Säugetierzellen auftritt (wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt). Um diesen synthetischen GagPol-Leseraster (Hgp^syn) zu fragmentieren, wurden Restriktionsstellen an Positionen 290 (StyI), 487 (StuI), 1056 (PflMI), 1107 (BstEII), 1549 (BalI), 1852 (SauI), 2175 (AccI), 2479 (BstXI), 2682 (EcoNI), 2867 (SphI), 3191 (PflMI), 3370 (BclI), 3588 (BalI), 3791 (XmaIII), und 4105 (StyI) durch stille Mutationen eingeführt. Für die Klonierung wurden zusätzliche Restriktionsstellen KpnI, XhoI und SacI in die nicht-kodierenden Bereiche eingeführt. Synthetische Fragmente, welche die Bereiche zwischen den Restriktionsschnittstellen KpnI/StyI (F1), StyI/StuI (F2), StuI/BstEII (F3), BstEII/BalI (F4), BalI/SauI (F5), SauI/AccI (F6), AccI/BstXI (F7), BstXI/EcoNI (F8), EcoNI/SphI (F9), SphI/PflMI (F10), PflMI/BclI (F11), BclI/BalI (F12), BalI/XmaIII (F13), XmaIII/StyI (F15) und StyI/SacI (F16) umspannen, wurden durch eine schrittweise PCR-Amplifizierung von überlappenden 60 nt langen Oligonukleotiden erzeugt und unter Verwendung des pCR-Script^TM Amp SK(+) Cloning Kits (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) subkloniert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, StyI, StuI, BstEII, und SacI wurden verwendet, um die Fragmente F1 bis F4 in ein Zwischenfragment (F1–4) zusammenzufügen. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, BalI, SauI und SacI wurden verwendet, um die Fragmente F5 bis F7 in ein zweites Zwischenfragment (F5–7) zusammenzufügen. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, BstXI, EcoNI, SphI, PflMI, BclI, BalI, XmaIII, StyI und SacI wurden verwendet um die Fragmente F8 bis F16 in ein drittes Zwischenfragment (F8–F16) zusammenzufügen. Die Zwischenfragmente (F1–4, F5–7 und pF8–16) wurden schließlich zu dem synthetischen GagPol-Leseraster voller Länge zusammengesetzt, wobei die Restriktionsstellen KpnI/BstEII, BstEII/AccI, beziehungsweise AccI/SacI verwendet wurden, und in die KpnI und SacI-Restriktionsstellen des pCR-Script^TM Amp SK(+)-Klonierungsvektors (Statagene, Heidelberg, Deutschland) gesetzt. Um eine hohe, konstitutive Expression in Säugetierzellen zu erhalten, wurde der synthetische kodierende Bereich von GagPol in die KpnI- und XhoI-Restriktionsstellen des pcDNA3.1(+)-Expressionsvektors Invitrogen, Leek, Niederlande) unter die transkriptionelle Kontrolle des immediate-early Promotor-Enhancers des Cytomegalievirus (CMV) gesetzt, was das Plasmid Hgp^syn ergab (welches das GagPol von HIV-1 kodiert).
Entwurf eines Kodon-optimierten SIV GagPol-Gens, das die Verpackungsfunktionen kodiert. Eine synthetische Sequenz, die für das SIV_mac239 (SIVmm239, GenBank Zugangs-Nr.: M33262) Pr160^GagPol-Polyprotein kodiert, wurde durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz des GagPol-kodierenden Bereichs (Nukleotide 1–4358) erzeugt, ausgenommen der Bereich, wo die gag- und pol-Leseraster überlappend sind (Nukleotide 1299–1533), und unter Verwendung einer Kodon-Verwendung, die am häufigsten in Säugetierzellen auftritt. Um dieses synthetische von SIV abgeleitete GagPol-Leseraster zu fragmentieren, wurden Restriktionsstellen an Positionen 190 (BstXI), 387 (XmaIII), 650 (PstI), 888 (NdeI), 1224 (ApaI), 1422 (NspI), 1583 (EheI), 1899 (SauI), 2019 (BsaBI), 2372 (EcoNI), 2651 (SacII), 2785 (BclI), 3025 (BamHI), 3268 (StyI), 3573 (BalI), 3745 (SauI), 3923 (PflMI) und 4188 (ApaI) durch stille Mutationen eingeführt. Für die Klonierung wurden zusätzliche Restriktionsstellen KpnI, XhoI und SacI in die nicht-kodierenden Bereiche eingeführt. Synthetische Fragmente, welche die Bereiche zwischen den Restriktionsschnittstellen KpnI/BstXI (F1), BstXI/XmaIII (F2), XmaIII/PstI (F3), PstI/NdeI (F4), NdeI/ApaI (F5), ApaI/NspI (F6), NspI/EheI (F7), EheI/SauI (F8), SauI/BsaBI (F9), BsaBI/EcoNI (F10), EcoNI/SacII (F11), SacII/BclI (F12), BclI/BamHI (F13), BamHI/StyI (F14), StyI/BalI (F15) BalI/SauI (F16), SauI/PflMI (F17), PflMI/ApaI (F18) und ApaI/SacI (F19) umspannen, wurden durch eine schrittweise PCR-Amplifizierung von überlappenden 60 nt langen Oligonukleotiden erzeugt und unter Verwendung des pCR-Script^TM Amp SK(+) Cloning Kits (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) subkloniert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, BstXI, XmaIII, PstI, NdeI, ApaI und SacI wurden verwendet, um die Fragmente f1 bis f6 in ein Zwischenfragment (f1–6) zusammenzufügen. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, EheI, SauI, BsaBI, EcoNI und SacI wurden verwendet, um die Fragmente f7 bis f11 in ein zweites Zwischenfragment (f7–f11) zusammenzufügen. Die einzigartigen Restriktionsstellen KpnI, BclI, BamHI, StyI, BalI, SauI, PflMI, ApaI und SacI wurden verwendet, um die Fragmente f12 bis f19 in ein drittes Zwischenfragment (f12–f19) zusammenzufügen. Die Zwischenfragmente f1–6, f7–11 und f12–19 wurden schließlich zu dem synthetischen GagPol-Gen von SIV voller Länge zusammengesetzt, wobei die Restriktionsstellen KpnI/NspI, NspI/SacII, beziehungsweise SacII/SacI verwendet wurden, und in die KpnI- und SacI-Restriktionsstellen des pCR-Script^TM Amp SK(+)-Klonierungsvektors (Statagene, Heidelberg, Deutschland) gesetzt. Um eine hohe, konstitutive Expression in Säugetierzellen zu erhalten, wurde das von SIV abgeleitete GagPol-Gen in die KpnI- und XhoI-Restriktionsstellen des pcDNA3.1(+)-Expressionsvektors Invitrogen, Leek, Niederlande) unter die transkriptionelle Kontrolle des immediate-early Promotor-Enhancers des Cytomegalievirus (CMV) gesetzt, was das Plasmid Sgp^syn ergab (welches das GagPol von SIV_mac239 kodiert).
Die Kodon-Verwendung des 4.3 kb langen GagPol-Gens von HIV-1 und SIV wurde hinsichtlich der Expression in humanen Zellen optimiert, indem der gesamte Leseraster aus synthetischen Oligonukleotiden zusammengesetzt wurde. Die synthetischen Gene kodieren GagPol-Proteine, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie das wildtypische GagPol von SIV oder HIV-1 haben. Auf Nukleotidebene liegt für das synthetische und wildtypische GagPol von HIV-1 eine Gesamtidentität von 69,27% vor und von 73,24% bezüglich des synthetischen und wildtypischen GagPol-Gens von SIV (Tabelle 1).
Tabelle 1: Genetische Abstände zwischen den unterschiedlichen GagPol-kodierenden Sequenzen von SIV und HIV-1
Distanzmatrix von SIV_mac239- und HIV_IIIB-abgeleiteten synthetischen (syn) und wildtypischen (wt) GagPol kodierende Sequenzen. Die Nummern zeigen den Prozentsatz von nicht-übereinstimmenden Positionen zwischen den verglichenen GagPol-Sequenzen.
Die Optimierung der Kodon-Verwendung von GagPol von HIV-1 reduziert die Homologie zu wildtypischem GagPol von SIV um 41,48% und umgekehrt (Tabelle 1). Der längste Bereich der Nukleotididentität zwischen synthetischem und wildtypischem GagPol beträgt 357 bp in SIV und 306 bp in HIV-1. Dieser Bereich liegt in dem überlappenden Bereich von p6^gag/p6^pol, der die rutschige Sequenz und eine Stamm-Loop-Struktur enthält, was beides für eine korrekte ribosomale Leserasterverschiebung benötigt wird.
Beispiel 5:
Expression von synthetischen GagPol-Genen. Rev-unabhängige Expression von synthetischen GagPol-Genen von HIV-1 und SIV wurde in transienten Transfektionsexperimenten untersucht, gefolgt von einer Charakterisierung der GagPol-Partikel mittels üblicher Immunoblot-Analyse. Kurz gesagt wurden einen Tag vor der Transfektion 2 × 10⁶ H1299-Zellen auf 100 mm-Durchmesser-Kulturschalen plattiert und 24 Stunden lang inkubiert. Zellen wurden mit 45 μg eines Plasmids, das synthetisches GagPol exprimiert, oder proviraler DNA (HX10 und SIV_mac239) unter Verwendung des Kalziumphosphat-Copräzipitationsverfahrens wie beschrieben transfiziert (Graham und Van der EB 1973, Virol. 52, 456–467). Zellkulturüberstände wurden 72 Stunden nach der Transfektion geerntet. Um die Prozessierung von GagPol zu blockieren, wurden die plattierten Zellen in Anwesenheit von 10 μM Saquinavir kultiert und transfiziert. GagPol-Partikel wurden durch Separierung der Kulturüberstände auf 10–60% Sucrosegrandienten wie zuvor beschrieben aufgereinigt (Wagner et al. 1994, Virology 200: 162–175). GagPol-Partikel versammelten sich in der Bande der erwarteten Dichte von 1,13 bis 1,19 g/cm², was für HIV-Virions üblich ist. Die Fraktionen mit dem höchsten Partikelgehalt wurden gegen PBS dialysiert und weiter mittels Elektrophorese auf einem denaturierenden SDS 12,5%-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt, bevor sie mittels Elektroblot auf Nitrozellulose-Membranen transferiert wurden. HIV-1 p24 Capsid (CA) und SIV p27 CA sowie deren Vorläuferproteine wurden durch die monoklonalen Antikörper 13–5 (Wolf et al. 1990, AIFO 1: 24–29) bzw. 55-2F12 (NIH, Rockville, USA), nachgewiesen.
Western-Blot-Analysen von Zellüberständen, die mit Expressionsplasmiden für die synthetischen GagPol-Gene von HIV-1 und SIV (Hgp^syn, Sgp^syn in 5B) zeigten eine effiziente Expression von GagPol in Abwesenheit von Rev (5A, B). Die mit den synthetischen Genen erhaltenen GagPol-Spiegel waren signifikant höher als die Spiegel, die durch Transfektion von infektiösen proviralen Konstrukten in Gegenwart von Rev erhalten wurden, wie dies durch kommerzielle Capture-ELISA-Tests bestimmt wurde. Subvirale Partikel wurden leicht aus den Zellen freigesetzt, die mit den synthetischen GagPol-Expressionplasmiden transfiziert wurden, und sedimentieren bei einer Dichte von etwa 1,16 g/ml, was vergleichbar mit wildtypischen SIV- oder HIV-1-Virions ist. In der Prozessierung der GagPol-Vorläuferproteine, die von den wildtypischen Viren oder den entsprechenden synthetischen GagPol-Genen kodiert werden, wurden keine Unterschiede beobachtet (5A, B).
Beispiel 6:
Vektorproduktion und Infektion von Zielzellen. Die 293T-Zellen wurden wie beschrieben mit dem Kalziumphosphat-Copräzipitationsverfahren transfiziert (Graham und Van der EB 1973, Virol. 52, 456–467). Die Plasmide pHIT60 (MLV-GagPol-Expressionsplasmid), pHIT-G (VSV-G-Expressionsplasmid), SgpΔ2 (SIV-GagPol-Expressionsplasmid, das auch vif, vpr, vpx, tat und rev exprimiert) und ViGΔBH (selbstinaktivierender SIV-Vektor, der das grünfluoreszierende Protein (GFP)-Gen unter der Kontrolle des Promotors und Enhancers des Milzfocus-bildenden Virus exprimiert) wurden zuvor beschrieben (Graham und Van der EB 1973, Virol. 52, 456–467; Fouchier et al. 1997, EMBO 16, 4531–4539). Der Mäuseleukämie-Virus (MLV)-Vektor pLEGFP-N1, der das GFP-Gen unter der Kontrolle eines internen CMV-Promotors enthält, wurde von Clontech erhalten. Der Überstand der transfizierten Zellen wurde durch einen 0,45 μm-Filter filtriert und in Aliquots bei –80°C gelagert. Die Vektorstocks wurden auf CA-Antigen-Spiegel unter Verwendung eines HIV p24 Enzym-gekoppelten Immunosobent-Assays (ELISA)-Kit (Innogenetics, Gent, Belgien) gemessen. Der Standard, der in dem ELISA-Kit beinhaltet ist, wurde für die Quantifizierung von HIV-1 p24 CA-Antigen-Spiegeln verwendet. Rekombinantes SIV p28 CA-Antigen aus dem SIV p28 Antigen Capture-Assay des AIDS-Vakzinprogramms (NCI-Frederic cancer research and development center) diente als Standard für die Quantifizierung von SIV p28-Spiegeln.
Um Vektortiter zu bestimmen, wurden 293-Zellen in einer Zelldichte von 2,5 × 10⁴ Zellen pro Loch in einer 24-Loch-Platte ausgesät. Einen Tag später wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 2 bis 4 Stunden lang mit seriellen Verdünnungen der Vektorpräparationen in einem Gesamtvolumen von 200 μl inkubiert. Frisches Medium wurde hinzugefügt und die Anzahl der GFP-positiven Zellen wurde 2 Tage nach der Infektion bestimmt. Um 293-Zellen in der G1/S-Phase des Zellzyklus zu arettieren wurden die Zellen in eine 96-Loch-Platte in einer Zelldichte von 2 bis 5 × 10⁴ Zellen pro Loch bei einer Konzentration von 1, 3 oder 5 μg Aphodicolin/ml (Sigma) ausgesät. Der Titer der Vektorstocks wurde mit diesen Zellen wie oben beschrieben bestimmt, wobei Aphidicolin während der gesamten Kultivierungszeit anwesend war.
Die funktionale Integrität der GagPol-Proteine, die von den synthetischen Genen kodiert werden, wurde durch Co-Transfektion der synthetischen GagPol-Expressionsplasmide und eines Expressionsplasmids für VSV-G (pHIT-G) mit dem SIV-Vektor ViGΔBH (6) analysiert. Dies ist ein selbst-inaktivierender Vektor, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP)-Gen unter der Kontrolle eines internen Promotors exprimiert. Die Vektortiter im Überstand der transfizierten Zellen lagen im Bereich von 1 × 10⁶ GFP-bildenden Einheiten/ml Überstand (Tabelle 2). Ähnliche Titer wurden nach Co-Transfektion von ViGΔBH mit einem wildtypischen GagPol-Expressionsplasmid von SIV (SgpΔ2) erhalten. Das synthetische HIV-1 GagPol-Expressionsplasmid erlaubte auch einen effizienten Transfer des SIV-Vektors (Tabelle 2). Die Infektiosität der Vektorpartikel variierte um weniger als das 2-fache zwischen den verschiedenen GagPol-Expressionsplasmiden, die verwendet wurden (Tabelle 2). Daher muss das GagPol von HIV-1 alle cis-wirkenden Sequenzen von SIV, die für die Verpackung, reverse Transkription und Integration notwendig sind, mit ähnlicher Effizienz erkennen wie SIV. Was die Verwendung von Verpackungsfunktionen betrifft, übertreffen die Ergebnisse deutlich einen früheren Bericht über die Verpackung von RNA von HIV-2, die zu SIV_mac nahe verwandt ist, in HIV-1-Partikel (Kaye und Lever, 1998, J. Virol. 72, 5877–5885). Tabelle 2: Titer und Infektiosität eines SIV-Vektors, der von synthetischen GagPol-Expressionsplasmiden für SIV und HIV-1 verpackt wurde.

^a GFP-bildende Einheiten (GFE) pro ml Überstand von 293T-Zellen, die mit den angegebenen Plasmiden transfiziert wurden; ^b GFE/ng CA-Antigen in dem Überstand von transfizierten 293T-Zellen; n.a.: nicht anwendbar.

Das Weglassen des GagPol-Expressionsplasmids reduzierte den Titer unter die Nachweisgrenze (Tabelle 2), was gegen eine VSV-G-vermittelte Pseudotransduktion spricht. Darüber hinaus sank der Prozentsatz von GFP-positiven Zellen, die mit ViGΔBH transduziert wurden und die von Sgp^syn, Hgp^syn oder SgpΔ2 verpackt wurden, während eines Beobachtungszeitraums von 6 Wochen nicht signifikant ab (Daten nicht gezeigt), was eine Integration des Vektors in das Wirtsgenom nahe legt. Wie bereits früher bei einem anderen SIV-Vektor, der von SgpΔ2 und pHIT-G verpackt wurde, beobachtet wurde, konnten während eines Beobachtungszeitraums von 8 Wochen in ViGΔBH-Vektorpräparationen, die von SgpΔ2, Sgp^syn oder Hgp^syn und pHIT-G verpackt wurden, keine Replikations-kompetenten Rekombinanten nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die Transduktionseffizienz von Vektoren, die mit den synthetischen GagPol-Genen hergestellt wurden, in sich nicht-teilenden Zellen wurde ermittelt, indem die Zielzellen in der G1-Phase des Zellzyklus durch Aphidicolin-Behandlung arretiert wurden. Der Titer eines auf MLV-beruhenden Vektors in Wachstums-arretierten Zellen wurde auf die Nachweisgrenze reduziert (7). Im Gegensatz dazu wurde der SIV-Vektortiter durch eine Aphidicolin-Behandlung nur leicht reduziert. Sich nicht-teilende Zellen konnten mit dem SIV-Vektor unabhängig von dem GagPol-Expressionsplasmid, das für die Herstellung der Vektorpartikel verwendet wurde, transfiziert werden (7).
Beispiel 7:
CEM × 174-Zellen (5 × 10⁵) wurden 4 Stunden lang mit 0,5 ml der Vektorzubereitung infiziert. Die Zellen wurden drei Mal mit PBS gewaschen und anschließend in 5 ml Medium kultiviert. Infizierte Kulturen wurden 1:5 bis 1:10 zwei Mal wöchentlich acht Wochen lang aufgeteilt. Die Capsid-Antigenspiegel in diesen Kulturen wurden an den Tagen 1 und 4 und 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der Infektion unter Verwendung des HIV-Innogenetics-ELISA und des rekombinanten SIV p28-Antigens als ein Standard bestimmt. Um das Auftreten von RCR auf CEM × 174-SIV-SEAP-Zellen (Means et al., 1997, J. Virol, 71, 7895–7902) zu bestimmen, wurden 1 × 10⁵-Zellen mit 1 ml Überstand der transfizierten Zellen zwei Stunden lang infiziert und einmal in PBS gewaschen. Infizierte Kulturen wurden in 5 ml Medium kultiviert und zwei Mal wöchentlich 1:5 bis 1:10 vier Wochen lang aufgespalten. Die Aktivität der sekretierten alkalischen Phosphatase im Überstand dieser Kulturen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion mit dem Phospha-Light-Kit (Tropix, Bedford, MA, USA) wie vom Hersteller beschrieben bestimmt. Der RCR-Titer wurde mittels limitierender Verdünnung bestimmt. CEM × 174-SIV-SEAP-Zellen (2 × 10⁵) wurden mit 1 ml Überstand in einem Endvolumen von zwei ml inkubiert. Nach zwei Stunden wurden sechs 200 μl-Aliquots auf eine 96-Loch-Platte übertragen und als Startpunkt für eine 4-fache serielle Verdünnung verwendet. Nach einer Woche wurden die Kulturen 1:10 aufgespalten. Die Syncytium-Bildung wurde 1 und 2 Wochen nach der Infektion bewertet und die TCID₅₀ der RCRs wurde wie beschrieben berechnet (Johnson und Byington, 1990, Quantitative assays for virus infectivity. In Techniques in HIV research. A. Aldovini und B. D. Walker, Hrs. (New York, Stockton Press), S. 71–76, 1990).
Nachweis von Replikations-kompetenten Rekombinanten. Das mögliche Auftreten von Replikations-kompetenten Rekombinanten (RCR) aus unserer Vektorzubereitung wurde in CEM × 174-Zellen untersucht, was die Replikation von SIV- und SIV-Hybrid-Viren stützt, wobei ein heterologes env-Gen verwendet wurde (Reiprich et al., 1997, J. Virol. 71, 3328–3331). Diese Zellen wurden mit 0,5 ml ViGΔBH-Vektorzubereitungen (für die Titer siehe Beispiel 6, Tabelle 2), die von SgpΔ2, Sgp^syn oder Hgp^syn und pHIT-G verpackt wurden, infiziert. Leicht erhöhte Capsid-Antigenspiegel (< 400 pg SIVp27CA/ml) konnten einen und vier Tag(e) nach der Infektion nachgewiesen werden. Dies wurde bereits früher beobachtet und beruht wahrscheinlich auf einer Übertragung des CA-Antigens aus der Vektorzubereitung (Schnell et al., 2000, Hum. Gene Ther. 11, 439–447). Wichtiger jedoch ist zu bemerken, dass die CA-Antigenspiegel 2 bis acht Wochen nach Infektion in allen Kulturen unter der Nachweisgrenze von 20 pg SIVp27/ml lagen und keine zytopathischen Effekte beobachtet werden konnten. Daher ist der Titer eines potenziellen RCR unter zwei infektiösen Einheiten/ml. Da mit dem wildtypischen SIV-gag-pol-Expressionsplasmid, SgpΔ2, keine RCR nachgewiesen werden konnten, deckte dieser Assay keine möglichen Vorteile der synthetischen gag-pol-Expressionsplasmide auf. Daher testeten wir die Frequenz des Auftretens von RCR in einem Assay-System, das nur zwei homologe Rekombinationsereignisse benötigen würde. SgpΔ2, Sgp^syn oder Hgp^syn wurden mit entweder zwei SIV-Vektoren, die immer noch env, vif, vpr, vpx, tat und rev zusätzlich zum GFP-Reportergen, aber große Deletionen in gag-pol, enthielten, co-transfiziert. Die CEM × 174-SIV-SEAP-Zellen, die SEAP nach Infektion mit SIV aufgrund der Tat-Transaktivierung freisetzen (Means et al., 1997, J. Virol. 71, 7895–7902), wurden mit 1 ml des Überstands der transfizierten Zellen infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurde eine erhöhte SEAP-Aktivität in Kulturen beobachtet, die mit den SIV-Vektoren infiziert wurden, die von den synthetischen gag-pol-Expressionsplasmiden verpackt wurden (8). Dies sollte auf einer Transkomplementation von gag-pol und einem nachfolgenden Transfer des SIV-Vektors beruhen. Allerdings kehrte die SEAP-Aktivität während der folgenden drei Wochen auf Hintergrundwerte zurück (8), was das Fehlen von RCR anzeigt. Im Gegensatz dazu deckte eine ansteigende SEAP-Aktivität drei bis zehn Tage nach der Infektion ein schnelles Auftreten von RCR bei SIV-Vektoren auf, die von SgpΔ2 verpackt wurden. Dies wurde von einer extensiven Syncytium-Bildung und Zelltod begleitet. Unter Verwendung eines limitierenden Verdünnungsansatzes wurde der Titer der RCR im Überstand von Zellen, die mit SgpΔ2 und SIV-GFPΔDP bzw. SgpΔ2 und SIV-GFPΔBP transfiziert wurden, auf 130 bzw. 75 TCID₅₀/ml bestimmt. Dies zeigt, dass, wenn RCR mit dem synthetischen gag-pol-Genen überhaupt auftreten, die Frequenz zumindest um einen Faktor von etwa 100 im Vergleich zu einem wildtypischen gag-pol-Expressionsplasmid verringert ist.

Claims

Nukleinsäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist.
Retrovirales gag- oder gagpol-basiertes Vektorpartikel, wodurch die Verpackungsproteine nur durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß Anspruch 1 kodiert werden, und wobei das Transgenkonstrukt, das aus einer retroviralen Verpackungsstelle ψ, einem Transfergen und retroviralen LTRs an den 5'- und 3'-terminalen Enden besteht, von einem anderen Retrovirus abstammt und nicht Kodon-optimiert ist.
Retrovirales gag- oder gagpol-basiertes Vektorpartikel gemäß Anspruch 2, wobei das Retrovirus aus Onkoviren, HTLV-1 oder -2, Spumaviren, Lentiviren, insbesondere HIV, insbesondere HIV-1, HIV-1_IIIB, HIV-2, und SIV, insbesondere SIV_mac239 ausgewählt wird.
Retrovirales gag- oder gagpol-basiertes Vektorpartikel gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, mit wenigstens 25-fach reduzierter Inkorporierungsrate der Nukleinsäuremoleküle gemäß Anspruch 1 im Vergleich zu retroviralen Partikeln, die durch Wildtyp-Nukleinsäuresequenzen, die gag- und pol-Polypeptide kodieren, erzeugt werden.
Retrovirales gag- oder gagpol-basiertes Vektorpartikel gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, mit wenigstens einer 100-fach reduzierten Rekombinationsrate zwischen den Nukleinsäuremolekülen gemäß Anspruch 1 und einem Wildtypgenom-basierten Transgenkonstrukt, das vom selben oder einem anderen Retrovirus abstammt.
Verfahren zur Herstellung retroviraler gag- oder gagpol-basierter Vektorpartikel, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transfektion oder Infektion einer Zelllinie, um ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 einzuführen, und b) Transfektion oder Infektion der Zelllinie, um ein weiteres Nukleinsäuremolekül einzuführen, das eine Sequenz aufweist, die eine retrovirale Verpackungsstelle ψ, ein Transfergen, retrovirale LTRs an den 5'- und 3'-terminalen Enden kodiert, und wobei die Verpackungsstelle ψ und die LTRs von einem anderen Retrovirus abstammen und nicht Kodon-optimiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Zelllinie eine primäre Zell- oder eine Labor-angepasste Zelllinie ist, die von einem Säugetier oder einem nicht-Säugetier stammt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die primäre Zelle humanen Ursprungs ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Nukleinsäure, die die Hüll- oder Rezeptorstrukturen der retroviralen gag- oder gagpol-basierten Vektorpartikel kodiert, und die weitere Nukleinsäure aus Schritt b) mit dem Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 co-transfiziert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 6 bis 9, wobei die Zelllinie eine stabile Zelllinie ist, die das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 alleine oder in Kombination mit dem Nukleinsäuremolekül, das die Hüll- oder Rezeptorstruktur der retroviralen gag- oder gagpol-basierten Vektorpartikel kodiert, exprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Nukleinsäuren induzierbar oder konstitutiv exprimiert werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei die Retroviren aus Onkoviren, HTLV-1 oder -2, Spumaviren, Lentiviren, insbesondere HIV, insbesondere HIV-1, HIV-1_IIIB, HIV-2, und SIV, insbesondere SIV_mac239 ausgewählt werden.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als eine aktive pharmazeutische Substanz.
Verwendung des Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1 für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, die durch Retroviren verursacht werden.
Verpackungszelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz wie sie in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist.