DE60125927T2

DE60125927T2 - Impfstoffe gegen hiv

Info

Publication number: DE60125927T2
Application number: DE60125927T
Authority: DE
Inventors: Benjamin Thornhill ROVINSKI; James Schenectady TARTAGLIA; Shi-Xian Etobicoke CAO; Roy Toronto PERSSON; H. Michel Toronto KLEIN
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: CA2416725A1; EP1280551A2; US20050287174A1; WO2001082962A3; US20040013684A1; DK1280551T3; WO2001082962A2; AU2001254561A1; EP1280551B1; US20090142373A1; US20020051770A1; DE60125927D1; ES2282251T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, und insbesondere Verwendungen von Materialien zum Immunisieren eines Wirts gegen Infektion mit HIV-1.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Human-Immundefektvirus ist ein bekanntes Retrovirus und ist das ätiologische Agens des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS). Es wird geschätzt, dass mehr als 33 Millionen Leute mit HIV weltweit per Dezember 1999 infiziert waren (Ref 1 – auf verschiedene Referenzen wird in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik noch ausführlicher zu beschreiben, auf welchen diese Erfindung sich bezieht. Vollständige bibliographische Informationen für jedes Zitat sind am Ende der Patentschrift unmittelbar vor den Ansprüchen zu finden. Die Offenbarung dieser Referenzen ist hiermit durch die Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung eingeschlossen).
Da die HIV-Epidemie sich weltweit weiter ausbreitet, bleibt weiterhin dringender Bedarf an einem wirksamen Impfstoff. Anstrengungen zur Entwicklung eines solchen Impfstoffs sind durch mehrere Faktoren behindert worden, wobei drei davon die folgenden sind: (a) die außergewöhnliche Fähigkeit des Virus zu mutieren; (b) die Unfähigkeit der meisten bekannten Spezifitäten von Anti-HIV-Antikörpern, primäre HIV-Isolate ständig zu neutralisieren; und (c) mangelndes Verständnis der Korrelate von Schutzimmunität gegenüber HIV-Infektion. Im Verlauf der letzten 10 Jahre sind mehrere Kandidaten-HIV-Impfstoffe bei Primaten auf ihre Immunschutzfähigkeiten getestet worden (Ref. 2). Diese Studien deuten darauf hin, dass sowohl neutralisierende Antikörper als auch zellvermittelte Immunität eine Rolle bei der Verleihung einer sterilisierenden Immunität und einer Verhinderung des Forschreitens zu einer Erkrankung spielen (Ref. 3, 4). Während die Korrelate für den Immunschutz gegen HIV-1-Infektion derzeit unbekannt sind, sollte ein wirksamer HIV-Impfstoff sowohl einen starken neutralisierenden Antikörper als auch cytotoxische T-Lymphozyt-(CTL-)Responseantworten hervorrufen.
Die Hülluntereinheit-Impfstoffe induzieren, wie sich gezeigt hat, hochtitrierte humorale Responseantworten, waren aber ineffizient in der Hervorrufung von CTL-Responseantworten (Ref 5). Lebende rekombinante Poxvektoren rufen sehr starke CTL-Responseantworten hervor, wie gezeigt wurde, jedoch waren diese Vektoren unwirksam für die Erzeugung einer signifikanten Antikörper-Responseantwort (Ref. 6). In Versuchen, die zwei Immunisierungstypen zu kombinieren, beinhalteten mehrere klinische Versuche eine Prime-Boost (Auffrischungs)-Strategie, bestehend aus einer anfänglichen viralen Vektorimmunisierung, gefolgt von Boosts mit rekombinanten HIV-1-Hülluntereinheiten (Ref. 7, 8), führten zu einem begrenzten Erfolg hinsichtlich der CTL-Responseantworten. Andere Ansätze mit Impfstoff verwendeten nicht-infektiöse, sich nicht replizierende, immunogene virusähnlicher Teilchen (VLP) zur Immunisierung gegen HIV-Infektion (Ref. 9, 10). Dieser Typ eines Immunogens führte zur Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern gegenüber einem Labor-HIV-1-Stamm (Ref. 10).
Ein Prime-Boost-Ansatz ist untersucht worden unter Verwendung nicht-infektiöser VLPs zur Verstärkung HIV-spezifischer CTL-Responseantworten bei Mäusen, die mit HIV-1gp 120 (MN-Stamm) codierendem rekombinanten Canarypoxvektor vCP205 geprimt wurden (Ref. 11). Diese Studie zeigte, dass VLPs die CTL-Responseantwort auf den Canarypoxvektor verstärken könnten. Eine weitere Arbeit beschreibt die Anwendung einer DNA, die env codiert, als Impfstoff-Primer, gefolgt von einem Booster mit einem env exprimierenden Vaccinia-Virus (Ref. 11b). Allerdings wurde kein Material von primären Isolaten verwendet, und es wurden keine neutralisierenden Konzentrationen von Antikörpern erhalten.
Neuerdings ist von einer Studie berichtet worden, welche die Induzierung von neutralisierenden Antikörpern gegen ein primäres HIV-1-Isolat bei Schimpansen zeigt (Ref. 12). In dieser Studie wurde rekombinantes Adenovirus, das gp160 exprimiert, als Primirig-Agens verwendet und es wurde rekombinantes gp120 für das Boosting der Affen verwendet.
Es besteht immer noch Bedarf an Impfstoffen und Immunisierungs-Therapieschemata, sowohl eine starke CTL-Responseantwort als auch neutralisierende Antikörper gegen primäre HIV-Isolate zu induzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff für die Erzeugung in einem Wirt, insbesondere in einem Humanwirt, einer virusneutralisierenden Konzentration an Antikörpern gegen ein primäres HIV-1-Isolat bereitgestellt. Das Verabreichungsschema umfasst wenigstens die Verabreichung eines Priming-Antigens an den Wirt, wobei das Priming-Antigen ein DNA-Molekül, welches ein Hüllglycoprotein eines primären HIV-1-Isolats codiert, umfasst; das Ruhenlassen des Wirts für wenigstens eine spezifische Ruheperiode, um für eine klonale Expansion einer HIV-1-Antigen-spezifischen Population von Vorläufer-B-Zellen darin zu sorgen; und wenigstens eine Verabreichung eines Boosting-Antigens an den geprimten Wirt, um die neutralisierenden Konzentrationen von Antikörpern bereitzustellen, umfasst, wobei das Boosting-Antigen ein attenuierter viraler ALVAC-Vektor ist, welcher wenigstens einen Teil ei nes Hüllglycoproteins eines primären Isolats von HIV-1 exprimiert. Ebenfalls offenbart ist zu Vergleichszwecken ein Impfstoff, bei welchem das Boosting-Antigen ein nicht-infektiöses, sich nicht replizierendes immunogenes HIV-ähnliches Teilchen (VLP) mit wenigstens einem Teil des Hüllglycoproteins eines primären isolierten HIV-1 ist.
Das primäre HIV-Isolat ist ein HIV-1-Isolat, welches von dem Klades-B-HIV-1 klinisches Isolat HIV-1_BX0 ₈ einschließt, obwohl jegliches andere primäre HIV-1-Isolat in den Immunisierungsprozeduren der Erfindung zur Anwendung kommen kann.
Das DNA-Molekül, welches das Hüllglycoprotein eines primären Isolats von HIV-1 codiert, kann in einem Plasmidvektor unter der Kontrolle eines heterologen Promotors, vorzugsweise eines Cytomegalovirus-Promotors, zur Expression des Hüllglycoproteins in dem Wirt enthalten sein, welcher ein Humanwirt sein kann.
Vorzugsweise besitzt der Vektor die identifizierenden Charakteristika von pCMV3Bx08, wie in 2 gezeigt, wobei solche identifizierenden Charakteristika die Nukleinsäuresegmente und Restriktionsstellen sind, die in 2 identifiziert sind.
Eine Priming-Verabreichung von Antigen kann in einer einzelnen oder in mehreren Verabreichungen des Priming-Antigens durchgeführt werden. Im letzteren Falle kann die wenigstens eine spezifische Ruheperiode, um die klonale Expression von Vorläufer-B-Zellen einer HIV-Antigen-spezifischen Population zu ermöglichen, nach jeder Priming-Verabreichung durchgeführt werden. Die wenigstens eine spezifische Ruheperiode kann zwischen etwa 2 und etwa 12 Monaten betragen.
Wo das Boosting-Antigen ein nicht-infektiöses, sich nicht replizierendes, immunogenes HIV-ähnliches Teilchen ist, kann ein solches Teilchen eine Anordnung von:

(i) einem env-Genprodukt,
(ii) einem pol-Genprodukt, und
(iii) einem gag-Genprodukt

Das nicht-infektiöse, sich nicht replizierende, immunogene HIV-ähnliche Teilchen kann in Verbindung mit einem Adjuvans verabreicht werden. Es kann jedes geeignete Adjuvans verwendet werden, wie QS21, DC-chol, RIBI oder Alum. Solche nicht-infektiösen, sich nicht replizierenden immunogenen HIV-Teilchen können durch Expression von einem geeigneten Vektor in Säugerzellen gebildet werden.
Es wird ein Vektor beschrieben, welcher ein modifiziertes HIV-Genom umfasst, das in den langen terminalen Sequenzwiederholungen defizient ist, und ein heterologer Promotor, der mit dem Genom zur Expression des Genoms in Säugerzellen funktionell verbunden ist, um das nicht-infektiöse, sich nicht replizierende und immunogene Teilchen zu erzeugen, wobei wenigstens das env-Gen des modifizierten HIV-Genoms das von einem primären Isolat von HIV ist. Die gag- und pol-Gene des modifizierten HIV-Genoms können jene von dem gleichen primären Isolat oder jene von einem anderen Isolat sein, welches ein primäres Isolat sein kann.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Plasmidvektor, während das primäre Isolat vorzugsweise BX08 ist. Der Promotor kann der Metallothionein-Promotor sein. Der Vektor besitzt vorzugsweise die identifizierenden Charakteristika von Plasmid p133B1, wie in 3 gezeigt, wobei solche identifizierenden Charakteristika die Nukleotidsegmente und Restriktionsstellen sind, wie in 3 identifiziert.
Das Boosting-Antigen der Erfindung ist ein attenuierter viraler Vektor, das heißt der attenuierte Canarypoxvirus ALVAC. Der attenuierte virale Vektor kann ein modifiziertes HIV-Genom enthalten, das in den langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs) defizient ist, wobei wenigstens das env-Gen dasjenige von primärem Isolat BX08 ist. Die gag- und pol-Gene des modifizierten Genoms können jene von dem gleichen primären Isolat sein oder können aus anderem HIV-Isolat gewählt werden.
Der auf attenuiertem Canarypoxvirus basierende Vektor ALVAC ist ein Plaquekloniertes Derivat des lizensierten Canarypox-Impfstoffs, Kanapox, und ist in der Referenz 19 beschrieben. Der attenuierte Canarypoxvektor besitzt vorzugsweise die identifizierenden Charakteristika von vCP 1579, wie in 4 gezeigt, wobei solche identifizierenden Charakteristika die Nukleinsäuresegmente und Restriktionsstellen sind, die in 4 identifiziert sind.
Die wenigstens eine Verabreichung eines Boosting-Antigens kann in einer einzelnen Verabreichung oder in wenigstens zwei Verabreichungen des Boosting-Antigens durchgeführt werden.
Die Erfindung schließt weiter Zusammensetzungen ein, welche die Immunogene wie hierin bereitgestellt umfassen, und deren Verwendung bei der Herstellung und Formulierung von immunogene Zusammensetzungen beinhaltenden Impfstoffen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgende Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen verstanden, in welchen:
die 1 die Details der Elemente von Plasmid pCMVgDtat^-vpr^-Bx08 zeigt;
die 2 die Details der Elemente von Plasmid pCMV3Bx08 zeigt;
die 3 die Details der Elemente von Plasmid p133B1 zeigt;
die 4 die Details der Insertionen in ALVAC(2) zur Bereitstellung des Vektors vCP1579 zeigt;
die 5A und 5B eine Darstellung in Zeitlinienform des angewandten Immunisierungsschemas enthalten, wobei die Studiengruppen in Tabelle 1 beschrieben sind. Die Zahlen unter den Linien beziehen sich auf Wochen;
die 6 die Immunoreaktivität gegenüber HIV-1-Antigenen des 1:100 verdünnten Serums von den Makaken, die mit den verschiedenen Präparaten immunisiert wurden, wie in Tabelle 1 beschrieben, zeigt;
die 7 die Immunoreaktivität gegenüber HIV-1-Antigenen des 1:1000 verdünnten Serums von den Makaken, die mit den verschiedenen Präparaten immunisiert wurden, wie in Tabelle 1 beschrieben, zeigt;
die 8 die Details der Elemente von pMPC6H6K3E3 zeigt;
die 9 die Details der Elemente von pMPC5H6PN zeigt;
die 10 die Details der Elemente von pHIV76 zeigt;
die 11 die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.: 1) für die H6/HIV Pol/Nef-Epitop-Kassette an der ALVAC C5-Stelle von vCP 1579 zeigt;
die 12 die Nukleotidsequenz der C6-Region (codierender Strang SEQ ID Nr.: 16, komplementärer Strang SEQ ID Nr.: 17, K3L-Aminosäuresequenz SEQ Nr.: 18, E3L-Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 19) enthält.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie zuvor erwähnt, beinhaltet die vorliegende Erfindung die Verabreichung von HIV-Antigenen, um virusneutralisierende Konzentrationen von Antikörpern gegen ein primäres HIV-Isolat hervorzurufen.
Ein DNA-Konstrukt wurde unter Einbindung des env-Gens von dem primären Isolat Bx08 unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors hergestellt, und das Konstrukt, pCMV3Bx08, ist in 2 gezeigt. Das Konstrukt pCMV3Bx08 wird von Plasmid pCMVgDtat^-vpr^-Bx08, das in 1 zu sehen ist, abgeleitet. Das DNA-Konstrukt pCMV3Bx08 wurde in einem Priming-Immunisierungsschritt auf einen Wirt, angewandt, wobei Makakenaffen das gewählte Tiermodell waren.
Im Anschluss an den Priming-Immunisierungsschritt, welcher in einer oder mehreren Verabreichungen des DNA-Konstrukts durchgeführt werden kann, lässt man den Wirt ruhen, um die klonale Expression einer HIV-Antigen-spezifischen Population von Vorläufer-B-Zellen darin vorzusehen, zur Bereitstellung eines geprimten Wirts.
Die Boosting-Verabreichung wird entweder mit einem nicht-infektiösen, sich nicht replizierenden, immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen (VLP) (zu Vergleichszwecken) oder einem attenuierten viralen Vektor (gemäß der Erfindung) durchgeführt.
Zu diesem Zweck wurde ein VLP-Expressionsplasmid konstruiert, welches ein modifiziertes HIV-Genom enthält, dem es an langen terminalen Sequenzwiederholungen fehlt, bei dem das env-Gen von primärem Isolat BX08 abgeleitet wird, wobei das modifizierte HIV-Genom sich unter der Kontrolle eines Metallothionein-Promotors befindet. Das Konstrukt, p133B1, das in 3 gezeigt ist, wurde zur Durchführung der Expression in Säugerzellen der nichtinfektiösen, sich nicht replizierenden, immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen verwendet, wobei das env-Genprodukt dasjenige von dem primären Isolat BX08 ist.
Im Falle des attenuierten Virusvektors wurde ein rekombinanter attenuierter Canarypoxvirusvektor konstruiert, um das env-Gen von primärem Isolat BX08 aufzunehmen. Der virale Vektor vCP1579 (4) wurde durch eine Vielzahl an Manipulationen von Plasmid pHIV76 (10) hergestellt, wie ausführlich weiter unten beschrieben wird.
Diese Produkte wurden bei der Boosting-Verabreichung an die geprimten Makaken verwendet. Die Boosting-Verabreichung kann in einer oder in mehreren Immunisierungen durchgeführt werden. Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung können die nicht-infektiösen, sich nicht replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen gemeinsam mit dem DNA-Konstrukt bei der Priming-Verabreichung verabreicht werden, und das DNA-Konstrukt kann gemeinsam mit den HIV-ähnlichen Teilchen bei der Boosting-Verabreichung verabreicht werden.
Immunisierungen wurden gemäß der hierin beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt und die erhaltenen Resultate wurden mit den unter Verwendung anderer Protokolle gemäß den in Tabelle 1 aufgeführten Protokollen verglichen. Die angewandten Immunisierungsschemata sind als Zeitlinien in den 5A und 5B gezeigt.
Die unter Befolgung der verschiedenen Protokolle erzielten Resultate zeigten, dass insbesondere eine primäre DNA-Impfung in Kombination mit einem Boost entweder von dem VLP oder dem attenuierten Canarypoxvirus die Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern erhöhte, wie durch die Verringerung nachweisbarer p24-Konzentrationen in mit primären HIV-Isolaten infizierten Zellen, angezeigt wird.
Biologische Hinterlegungen
Bestimmte Vektoren, die hierin beschrieben sind und auf die hierin Bezug genommen wird, sind bei der American Typ Culture Collection (ATCC) mit Sitz in 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209, USA, entsprechend dem Budapester Vertrag und vor der Einreichung dieser Anmeldung hinterlegt worden. Proben der hinterlegten Vektoren werden für die Öffentlichkeit zugänglich, und alle auferlegten Restriktionen auf den Zugang zu der Hinterlegungen werden bei Erteilung eines Patents auf Basis dieser Patentanmeldung aufgehoben. Außerdem wird die Hinterlegung ersetzt, wenn keine lebensfähigen Proben durch die hinterlegende Stelle herausgegeben werden können. Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung ist in ihrem Umfang durch die hinterlegten biologischen Materialien nicht beschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen soll. Jedes Äquivalent von ähnlichen Vektoren, welche Nukleinsäuren enthalten, die äquivalente oder ähnliche Antigene codieren, wie in dieser Anmeldung beschrieben, liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Zusammenfassung der Hinterlegung
BEISPIELE
Die obige Offenlegung beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden einzig und allein zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Offensichtliche Änderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden eingehend betrachtet, wie es die Umstände nahe legen oder zweckdienlich machen können.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmid pCMV3BX08.
Das Plasmid, pCMV3BX08, enthält Sequenzsegmente aus verschiedenen Quellen und die Elemente der Konstruktion sind in 2 dargestellt.
Der prokaryotische Vektor pBluescript SK (Stratagene) ist das Grundgerüst des Plasmids pCMV3.BX08 und wurde durch den Austausch des Amp^®- durch das Kan^®-Gen und die Deletion der fl- und der LacZ-Region modifiziert. Um die gewünschten Modifikationen zu erreichen, wurde die Sequenz zwischen Ahd1 (Nukleotid 2 041) und Sac1 (Nukleotid 759) des pBluescript SK, das das Amp^®, den fl-Ursprung und das LacZ enthielt, deletiert. Ein 1,2 kb großes Pst1-Fragment aus dem Plasmid pUC-4K (Pharmacia), das das Kan^®-Gen enthielt, wurde mit dem glatten Ende an die Ahd1-Stelle des pBluescript SK in einer Orientierung entgegen dem Uhrzeigersinn bezüglich seiner Transkription ligiert. Ein 1,6 kb großes Ssp1/Pst1-DNA-Fragment, das den humanen unmittelbar-frühen Cytomegalovirus-Genpromotor, einen Enhancer und Intron-A-Sequenzen (CMV) enthielt, wurde an das andere Ende des Kan^®-Gens ligiert, so dass die Transkription vom CMV-Promotor in der Orientierung im Uhrzeigersinn fortschreitet. Ein synthetisches Oligonukleotid-Segment, das eine Translations-Initiations-Sequenz und Sequenzen, die das menschliche Gewebeplasminogen-Aktivator-Signalpeptid (TPA) codieren, enthielt, wurde verwendet, um den CMV-Promotor und die Sequenzen, die das Hüll-Gen des primären HIV-1_BX08-Isolats codieren, zu verbinden.
Das Hüll-Gen aus dem primären HIV-1-Isolat BX08 wurde aus dem in 1 dargestellten Plasmid pCMVgDtat^-vpr^-Bx08 isoliert. Das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^-Bx08 wurde von dem hinterlegten Plasmid pCMVgDtat^-vpr^- abgeleitet, dessen Konstruktion in der gleichzeitig abhängigen Patentanmeldung der Vereinigten Staaten Nr. 08/991 773, eingereicht am 16. Dezember, 1997, die dem Rechtsnachfolger hiervon zugewiesen wurde, beschrieben wird und dessen Offenlegung hierin durch Bezugnahme (WO 99/31250) einbezogen ist. Das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^- Bx08 wurde abgeleitet, in dem die BX08-Hüllsequenz aus Klades-B HIV-1 klinischem Isolat HIV-1_BX0 ₈ durch die modifizierte HIV-Genomsequenz, die in pCMVgDtat^-vpr^- vorliegt, ersetzt wurde. Das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^-Bx08 wurde mit dem Restriktionsenzym Xho I geschnitten und durch eine Klenow-Behandlung zu einem glatten Ende gemacht. Ein partieller NotI-Verdau wurde anschließend durchgeführt, und das resultierende das env-Gen enthaltende 6,3 kb große Fragment wurde isoliert. Plasmid pCMV3 (Invitrogen) wurde mit Bam HI geschnitten und durch eine Klenow-Behandlung zu einem glatten Ende gemacht. Das Plasmid pCMV3 wurde dann mit Not I geschnitten und das resultierende 4,4 kb große Frgament wurde isoliert. Die 6,3 und 4,4 kb großen Fragmente wurden aneinander ligiert, um das Plasmid pCMV3BX08 (2) zu erzeugen.
Das pCMV3BX08-Konstukt wurde in kompetente HB101-Zellen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (GibcoBRL) eingeführt. Korrekte molekulare Klone wurden durch Restriktion und Sequenzierungsanalyse identifiziert und ihre Expression des Hüllglycoproteins wurde in transienten Transfektionen untersucht, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse.
Alle DNAs, die für Immunisierungen verwendet wurden, wurden unter Verwendung eines EndoFree Plasmid-Kits (Qiagen) präpariert. Für intramuskuläre Immunisierungen wurden entweder 3 mg oder 600 μg von pCMV3BX08 in 100 μl PBS injiziert.
Provirale DNA für Stamm B HIV-1 klinisches Isolat HIV-1_BX08 stammte von Transgene (Straßburg, Frankreich) und wurde aus der genomischen DNA von Zellen, die mit dem Virus infiziert waren, isoliert.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plas,id p133B1.
Ein Bx08 Plasmid-Expressionsvektor (p133B1, 3), der verwendet wurde, um die Säugerzellen zu transfizieren, wurde in mehreren Stufen unter Verwendung von pUC18 als das initiale Wirtsplasmid konstruiert. Zuerst wurde ein 8,3 kbp großes Fragment des HIV-1_LAI-Provirus, das die gag-, pol- und env-Proteine codiert, isoliert. Diesem Fragment fehlten die regulatorischen Elemente der Transkripition und die langen terminalen Sequenzwiederholelemente an jedem Ende des proviralen Genoms, um sicherzustellen, dass die virusartigen Partikel für die Replikation inkompetent sein würden. Dieses Fragment wurde an einen induzierbaren humanen Typ IIA Metallothionein (MTIIA)-Promotor (Ref. 13) und auch an eine Polyadenylierungs(polyA)-Additions-/Transkriptions-Terminationssequenz des Simian Virus 40 aus dem Plasmid pSV2dhfr (Ref. 14) gebunden. Das modifizierte Fragment wurde dann in den pUC18-Wirtsvektor insertiert. Das resultierende hinterlegte Expressions-Konstrukt, bezeichnet als pMT-HIV, wurde verwendet, um in Zellen von afrikanischen Grünaffennieren (Vero) und COS-Affennieren zu transfizieren. Die Prozedur zum Erhalt von pMT-HIV wird ferner in dem oben genannten US-Patent Nr. 5 439 809 beschrieben. Beide transfizierten Zell-Linien produzierten sich nicht replizierende virusartige Partikel, wenn sie mit Metallionen induziert wurden (Ref. 15).
Zwei weitere Modifikationen wurden an der proviralen DNA in pMT-HIV vorgenommen, um zusätzliche Sicherheitsmerkmale bereit zu stellen, um menschliche Zellen gegen Rekombinationsereignisse mit der revers transkribierten DNA zu schützen:

1) Inaktivierung der RNA-Verpackungssequenzen; und
2) Deletion eines großen Abschnitts des pol-Gens, das die reverse Transkriptase und die Integrase codiert.

Um das erste RNA-Verpackungs-Signal zu deletieren, wurde ein Teil der DNA der der nicht-translatierten Leader-Sequenz der mRNA entspricht, durch synthetische DNA ersetzt, der ein 25 bp großes Motiv, das den Nukleotiden 753–777 (der psi-Sequenz) entspricht, fehlt. Um das zweite RNA-Verpackungs-Signal zu inaktivieren, wurden zwei Adenosin-Reste innerhalb einer Zinkfingersequenz des gag-Gens zu Thymidin-Resten getauscht. Jeder dieser Resteaustausche hatte den Effekt, dass Cystein-Reste in einem Cys-His-Array durch ein Serin im Genprodukt ersetzt wurden.
Die Deletion des pol-Gens wurde bewirkt, indem ein 1,9 kbp großes Fragment mit synthetischer DNA ersetzt wurde, die Stop-Codons in allen drei Leserastern enthielt. Dies verhinderte ein bis zum Ende ablesende Translation der verbleibenden die Integrase codierenden Sequenz auf der 3'-Seite der Deletion. Die 1,9-kbp-Deletion im pol eliminierte auch die Expression der reversen Transkriptase- und der Integrase-Enzyme. Jedoch ließ die Deletion das Gen, das die virale Protease codiert, intakt, welche sowohl eine immunogene Komponente von HIV-1-Viruspartikeln ist als auch die Expression von Partikeln mit prozessierten gag-Antigenen ermöglicht, die nativen Virionen stark ähnlich sind (Ref. 16). Die Protease enthält auch Epitope, die über HIV-1-Klades konserviert sind. Die Modifikationen, die mit Bezug auf die gag- und pol-Gene beschrieben wurden, werden vollständiger im oben genannten Patent der Vereinigten Staaten Nr. 6 080 408 (WO 96/06177) beschrieben.
Schließlich wurde das env-Gen von HIV-1_L _AI, innerhalb des pMT-HIV durch das von HIV-1_BX08 ersetzt. Um diesen Austausch zu bewirken, wurde ein 2440 bp großes Fragment, das das env-Gen von Bx08 enthielt, durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus Zellen, die mit diesem Isolat infiziert waren, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde dann verwendet, um den entsprechenden im pMT-HIV vorhandenen Bereich zu ersetzen. Jedoch war das hereinkommende Fragment aus HIV-1_BX08 125 bp kürzer als der ursprüngliche HIV-1_LAI-Bereich, auf Grund einer Deletion im nicht-translatierten Bereich zwischen dem Stop-Codon des env-Gens und der Terminations/polyA-Additions-Sequenz. Das resultierende Konstrukt tauschte alle bis auf elf Aminosäure-Reste der LAI-Hüllproteine gp120 und gp41 aus. Von diesen elf unterschieden sich nur die ersten drei zwischen den LAI- und den Bx08-Isolaten, und diese sind alle die Ladung bewahrende Austausche, was bedeutet, dass der endgültige Expressionsvektor (p133B1) ein nahezu authentisches env-Protein von HIV-1_BX08 codierte.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von HIV-artigen Partikeln für vergleichende Zwecke.
Zellen afrikanischer Grünaffenniere (Vero) wurden gewonnen und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10 % v/v fötales Rinderserum (FBS) enthielt, unten als Komplettmedium bezeichnet, kultiviert. Bei Durchgangsschritt 141 wurden die Zellen mit p133B1 unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode transfiziert, als sie bei etwa 30 % Konfluenz waren. Die Zellen wurden mit Glycerin 8 Stunden nach der Transfektion geschockt. Für diesen Schritt wurden sechs 10-cm-Schalen, die jeweils etwa 3,0 × 10⁶ Zellen in 10,0 ml des Komplettmediums enthielten, präpariert. Jede Schale erhielt 25,0 μg des Expressionsvektors und 2,0 μg des Plasmids pSV2neo (Ref. 17). Das pSV2neo enthält ein wählbares Marker-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Geneticin (G418) verleiht. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen aus jeder Schale durch Trypsinisierung gewonnen und in fünfundzwanzig frische Schalen in Komplettmedium, das mit 0,5 mg/ml G418 ergänzt war, erneut plattiert.
Insgesamt wurden 394 Kolonien aus den Schalen unter Verwendung von Klonierungszylindern isoliert. Jede Kolonie wurde durch Trypsinisierung gewonnen und in zwei Clusterschalenmulden aufgeteilt, eine der Mulden pro Klon wurde nach Erreichen von 50 % bis 90 % Konfluenz induziert. Vor der Induktion wurden die Mulden behandelt, indem das ganze Medium mit frischem Komplettmedium, das 10,0 μM 5-Azacytidin enthielt, ersetzt wurde. Nach Inkubieren zwischen 18 und 22 Stunden wurde das Medium entfernt und durch frisches DMEM, das 0,2 % v/v FBS, 2,0 μM CdCl₂ und 200,0 μM ZnCl₂ enthielt, ersetzt. Die Mulden wurden für weitere 20 Stunden bis 24 Stunden inkubiert, zu welchem Zeitpunkt Proben des Mediums entfernt und durch p24-ELISA untersucht wurden.
Die zwanzig am stärksten produzierenden Klone, auf der Grundlage des p24-Titers, wurden ausgewählt, und Zellen aus den entsprechenden nicht-induzierten Mulden wurden in einen T-25- und einen T-150-Kolben pro Klon subkultiviert. Beide Kolben wurden zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen aus dem T-150 wurden durch Trypsinisierung gewonnen und bei Durchgangsschritt Nummer 145 kryokonserviert. Die Zellen aus dem T-25 wurden durch Trypsinisierung alle 3 Tage bis 4 Tage gewonnen und bis zum Durchgangsschritt 153 aufbewahrt. Die Zellen wurden wie oben induziert und Proben durch p24-ELISA bei zwei unterschiedlichen Durchgangsschritten vor dem Durchgangsschritt 153 erneut getestet.
Die beiden höchsten p24-Produzenten wurden ausgewählt und wurden durch Trypsinisierung alle 3 Tage bis 4 Tage bis zum Durchgangsschritt 163 gewonnen. Proben von den Klonen wurden durch p24- und gp120-ELISA aus Durchgangsschritt 158 und durch p24-ELISA bei Durchgangsschritt 163 untersucht, um die klonale Stabilität zu bestimmen. Die am meisten geeignete dieser beiden Zelllinien, mit 148 zu 391 bezeichnet, wurde für das weitere Subklonen ausgewählt. Die K1on-Nomenklatur definiert die Experimentnummer für diese Prozedur, welche 148 war, und die Nummer des Klons, welcher Nummer 391 der ursprünglich 394, die isoliert wurden, war.
Die Vero-Zellen wurden etwa 100 h bis 103 h wachsen gelassen, und das Medium wurde dann durch Wachstumsmedium, das 5-Azacytidin enthielt, ersetzt. Die Flaschen wurden dann für weitere 20 h bis 22 h inkubiert, zu welchem Zeitpunkt das Medium durch serumfreies Medium, das CdCl₂ und ZnCl₂ enthielt, ersetzt wurde. Die Flaschen wurden dann 29 h bis 31 h lang inkubiert, zu welchem Zeitpunkt das Medium geerntet, vereinigt und bei 2°C bis 8°C vor der Reinigung gelagert wurde.
Am nächsten Tag nach dem Ernten wurde die Lösung geklärt, konzentriert und gegen Phosphatpuffer diafiltriert. Das Konzentrat wurde durch eine keramische Hydroxyapatit-(Typ I)-Säule laufen gelassen und der Durchlauf wurde gesammelt. Der Durchlauf aus zwei aufeinander folgenden Unterchargen wurde miteinander vereinigt und auf einen Saccharose-Dichtegradienten in einem kontinuierlichen zonalen Ultrazentrifugenrotor gepumpt. Pseudovirion enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt. Die vereinigten Pseudovirion-Fraktionen wurden gegen PBS, das 2,5 % Saccharose enthielt, diafiltriert, um den Saccharosegehalt zu verringern, aufkonzentriert und nochmals diafiltriert. Das Material wurde unter Verwendung eines 0,2 μm Filters steril filtriert. Auf dieser Stufe wurden die Materialien als eine gereinigte Untercharge bezeichnet und wurden bei 2 bis 8°C gelagert.
Die Adjuvantien wurden separat präpariert und über einen Filter sterilisiert, bevor sie in Einzeldosen-Fläschchen abgefüllt wurden. QS21 wurde bei –20°C gelagert.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des rekombinanten Pox-Virus vCP1579.
Rekombinantes Poxvirus vCP1579 (4) enthält die gag- und Protease-Gene von HIV-1, abgeleitet aus dem HIV-1 IIIB-Isolat, die gp120-Hüllsequenzen, abgeleitet aus dem HIV-1 Bx08-Isolat, und Sequenzen, die ein Polypeptid kodieren, das die bekannten menschlichen CTL-Epitope von HIV-1 Nef und Pol umfassen.
Rekombinantes vCP1579 (4) wurde durch Insertion von den Vektor modifizierenden Sequenzen aus pMPC6H6K3E3 (8), die E3L und K3L codieren, in die C6-Stelle von rekombinantem vCP1566 (4) erzeugt. Rekombinantes vCP 1566 wurde durch Insertion einer Expressions-Kassette, die ein synthetisches Polypeptid codiert, das Pol CTL-Epitope und Nef CTL-Epitope (11) enthält, und des Plasmids pMPC5H6PN (9) in vCP1453 an der als C5 bekannten Insertionsstelle erzeugt. Rekombinantes vCP1453 wurde durch gemeinsame Insertion von Genen, die env- und gag/Protease-Genprodukte von HIV-1 codieren, und Plasmid pHIV76 (10) in das ALVAC-Genom an der als C3 bekannten Insertionsstelle erzeugt.
Die Konstruktion von rekombinanten Poxvektoren, die die E3L- und K3L-Gene enthalten, wurde im Patent der Vereinigten Staaten 6 004 777, erteilt am 21. Dez., 1999 an Tartaglia et a1. Beschrieben, und die rekombinanten Poxvektoren, die die Insertion von HIV-Genen beschreiben, wurde im Patent der Vereinigten Staaten 5 766 598, erteilt am 16. Juni 1998 an Paoletti et a1. beschrieben.
Der als C3 bezeichnete Locus wurde für die Insertion der env- und gag-Gensequenzen von HIV-1 in den ALVAC(2)-Vektor verwendet, und der als C5 bezeichnete Locus war die Insertionsstelle für die Sequenzen, die die HIV-1 Nef- und Pol-CTL-Epitope codieren. Auf Grund der C3- und C5-Loci, die innerhalb der weitreichenden invertierten terminalen Repetitionen (ITRs) des Virus-Genoms (etwa 41 kbp) existieren, führt die Insertion in diese Loci zum Auftreten von zwei Kopien der insertierten HIV-1-Sequenzen.
Kurz gesagt wurde die Expressions-Kassette pHIV76 (10) in der folgenden Weise konstruiert. Das Plasmid p133B1 (3), das das HIV-1Bx08 gp160-Gen enthielt, wurde als das Ausgangs-Plasmid verwendet. Das 3'-Ende des H6-Promotors wurde stromaufwärts des gp160-Gens kloniert, und drei frühe Transkriptions-Terminationssignal-Sequenzen (T₅NT) des Poxvirus wurden modifiziert. Dies wurde erreicht, indem ein 2 600 bp großes, BamHI-verdautes PCR-Fragment, das das 3'-Ende des H6-Promotors und das T₅NT-modifizierte HIV-1 (BX08) gp160-Gen enthielt, in die BamHI-Stelle von pBS-SK kloniert wurde. Dieses PCR-Fragment wurde aus vier überlappenden PCR-Fragmenten (ein 570 bp großes Fragment, ein 140 bp großes Fragment, ein 500 bp großes Fragment und ein 1 450 bp großes Fragment) und den Oligonukleotiden, RW835 (5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAAGTGAAGGACC-3' – SEQ ID Nr.: 2) und RW836 (5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTTATAGCAAAGCCCTTTC-3' – SEQ ID Nr.: 3) erzeugt. Das 570 bp PCR-Fragment, das das 3'-Ende des H6-Promotors und das 5'-Ende des gp160-Gens enthielt, wurde aus dem Plasmid, p133B1, mit den Oligonukleotiden RW835 (5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAAGTGAAGGAGACC-3') und RW868 (5'-ATCAAGACTATAGAAGAGTGCATATTCTCTCTTCATC-3') erzeugt. Das 140 bp große PCR-Fragment, das einen innen liegenden Teil des gp160-Gens enthielt, wurde aus dem Plasmid p133-B1 mit den Oligonukleotiden, RW864 (5'-GCACTCTTCTATAGTCTTGATATAGTAC-3' – SEQ ID Nr.: 4) und RW865 (5'-AGCCGGGGCGCAGAAATGTATGGGAATTGGCAC-3' – SEQ ID Nr.: 5) erzeugt. Das 500 bp große PCR-Fragment, das einen innen liegenden Teil des gp160-Gens enthielt, wurde aus 133-3 mit den Oligonukleotiden, RW866 (5'-ATACATTTCTGCGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTC-3' – SEQ ID Nr.: 6) und RW867 (5'-GAAGAATTCCCCTCCACAATTAAAAC-3' – SEQ ID Nr.: 7) erzeugt. Das 1 450 bp große PCR-Fragment, das das 3'-Ende des gp160-Gens enthielt, wurde aus p133-B1 mit den Oligonukleotiden, RW869 (5'-TGTGGAGGGGAATTCTTCTACTGTAATACAACACAAC-3' – SEQ ID Nr.: 8) und RW836 (5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTTATAGCAAAGCCCTTTC-3' – SEQ ID Nr.: 9) erzeugt. Das 3'-Ende des 570 bp großen PCR-Fragments überlappt mit dem 5'-Ende des 140 bp großen PCR-Fragments. Das 3'-Ende des 140 bp großen PCR-Fragments überlappt mit dem 5'-Ende des 500 bp großen PCR-Fragments. Das 3'-Ende des 500 bp großen PCR-Fragments überlappt mit dem 5'-Ende des 1450 bp großen PCR-Fragments. Das durch diesen Arbeitsgang erzeugte Plasmid wird als pRW997 bezeichnet.
Die Sequenz, die gp41 codiert, wurde anschließend durch die Sequenz, die die gp160 Transmembran(TM)-Region codiert, ersetzt. Diese Modifizierung wurde erreicht, indem ein 200 bp MfeI-HindIII-verdautes PCR-Fragment, das das 3'-Ende des gp120-Gens und die TM-Sequenz enthielt, in das 4 400 bp große MfeI-HindIII-Fragment von pRW997 kloniert wurde. Dieses PCR-Fragment wurde aus zwei überlappenden PCR-Fragmenten (ein 170 bp großes Fragment und ein 125 bp großes Fragment) mit den Oligonukleotiden, HIVP97 (5'-TAGTGGGAAAGAGATCTTCAGACC-3' – SEQ ID Nr.: 10) und HIVP101 (5'-TTTTAAGCTTTTATCCCTGCCTAACTCTATTCACTAT-3' – SEQ ID Nr.: 11) erzeugt. Das 170 bp große PCR-Fragment wurde aus pRW997 mit den Oligonukleotiden, HIVP97 (5'-TAGTGGGAAAGAGATCTTCAGACC-3' – SEQ ID Nr.: 12) und HIVP100 (5'-CCTCCTACTATCATTATGAATATTCTTTTTTCTCTCTGCACCACTCT-3' – SEQ ID Nr.: 13) erzeugt. Das 125 bp große PCR-Fragment wurde aus pRW997 mit den Oligonukleotiden HIVP99 (5'-AGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAATATTCATAATGATAGTAGGAGGC-3'-SEQID Nr.: 14) und HIVP101 (5'-TTTTAAGCTTTTA TCCCTGCCTAACTCTATTCACTAT-3' – SEQ ID Nr.: 15) erzeugt. Das durch diesen Arbeitsgang erzeugte Plasmid wird pHIV71 genannt.
Das H6-promotete gp120+TM-Gen wurde dann zwischen C3 flankierende Arme in ein Plasmid, das das I3L-promotete HIV 1 gag/(pro)-Gen enthielt, kloniert. Diese Modifizierung wurde erreicht, indem das 1 600 bp große NruI-XhoI-Fragment von pHIV71, das das H6-promotete gp 120+TM-Gen enthielt, in das 8 200 bp große NruI-XhoI-Fragment von pHIV63 kloniert wurde. Das durch diesen Arbeitsgang erzeugte Plasmid wird als pHIV76 (10) bezeichnet. Das Plasmid pHIV76 wurde bei in vivo-Rekombinationsexperimenten mit ALVAC (CPpp) als Rettungsvirus verwendet, um vCP1453 zu erhalten.
Die Sequenz der nef-/pol-Bereiche ist in 12 gezeigt, und die E3L- und K3L-Sequenzen sind in 13 gezeigt. Um ALVAC(2)120(BX08)GNP (vCP1579) zu erzeugen, wurden Expressions-Kassetten, die aus den Promotor-/HIV-1-Gen-Kombinationen bestanden, in ein ALVAC-Donorplasmid subkloniert, das anschließend verwendet wurde, um die Expressionskassetten in definierte Stellen im ALVAC-Genom durch eine in vitro-Rekombination, wie früher beschrieben (Ref. 20), zu insertieren.
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von Immunisierungs-Therapieschemata
Gruppen von jeweils vier Tieren (Makaken) wurden zufällig zu sieben Impfstoff-Gruppen zugeordnet, wie in Tabelle 1 veranschaulicht. In dieser Tabelle bezeichnet „BX08 DNA" pCMV3BX08, das wie in Beispiel l beschrieben präpariert wurde, „BX08 VLP" bezeichnet die Pseudovirionen, die durch den Expressionsvektor p133B1 in Vero-Zellen hergestellt wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, und „ALVAC(2) BX08" bezeichnet vCP1579, das wie in Beispiel 4 beschrieben präpariert wurde. Referenz- (Vor-Aderlaß) Seren wurden bei -6 und -2 Wochen vor der Impfung als Probe genommen. Primär-Immunisierungen mit den verschiedenen Impfstoffen wurden in den Wochen 0 und 4 gegeben mit Boosts in den Wochen 24 und 44 ( 5A, 5B). Die Impfstoffe wurden intramuskulär in einen Quadrizeps von jedem Makaken-Affen immunisiert.
Die Seren wurden aus Voll-Blut mittels SST-Sammelröhrchen präpariert und unter Verwendung von kommerziell erhältlichen HIV-1 Western-Blots analysiert. Die Gruppen 1, 2 und 7 zeigten niedrige Spiegel an anti-Env-Antikörpern nach dem ersten Boost (6 und 7). Auf der Grundlage der ELISA-Werte waren die anti-env-Antikörperspiegel unter 1 μg/ml von spezifischem IgG. Hohe Spiegel an anti-gag-Antikörpern wurden in den Gruppen 1, 2, 3, 4 und 7 nachgewiesen (6 und 7). Keine HIV-1-spezifischen Antikörper wurden in den Gruppen 5 und 6 nachgewiesen (6).
Die Fähigkeit der Antikörper, die in den immunisierten Affen erzeugt wurden, das HIV-1 BX08-Virus in menschlichem PBMC zu neutralisieren, wurde auf der Grundlage der Reduzierung der p24-Gehalte bestimmt.
Das Neutralisierungs-Assay wurde im Wesentlichen wie in Literaturhinweis 18 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden Serumverdünnungen mit HIV-1 BX08 gemischt und die Mischungen 1 Stunde lang inkubiert, dann zu anfälligen menschlichen PBMC-Zellen hinzugegeben. Die Titer wurden als die Verdünnung des Serums erfasst, bei der p24 um 80 % reduziert war. Serum-Proben wurden in einer 1:2-, 1:8- und 1:32-Verdünnung auf den Virus (1:6-, 1:24- und 1:26-Verdünnungen nach der Zugabe der Zellen) untersucht. p24-Konzentrationen wurden durch einen p24-spezifischen ELISA-Assay bestimmt.
Eine DNA-Impfung für sich allein, Gruppe 5, und ALVAC für sich allein, Gruppe 6, wiesen keine Affen auf, die eine Verringerung der p24-Gehalte von mehr als 80 % zeigten. Die geringe DNA (600 μg) plus ALVAC, Gruppe 4, zeigten ebenfalls keine Affen mit mehr als 80 % Verringerung der p24-Titer. VLP plus DNA, entweder in einer hohen oder niedrigen Dosis (Gruppe 1 und 2), zeigte eine verstärkte Verringerung der p24-Gehalte verglichen mit den VLPs allein, Gruppe 7. DNA in hoher Dosis, Gruppe 3, in Kombination mit ALVAC verstärkte die Fähigkeit, p24- oder virusneutralisierende Antikörper über die geringe Dosis, Gruppe 4, oder ALVAC allein, Gruppe 6, auszulösen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine DNA-Impfung in Kombination mit VLPs oder ALVAC die Konzentrationen der virusneutralisierenden Antikörper erhöhte, wie es durch die Verringerung der p24-Gehalte in den Seren der immunisierten Affen gezeigt wurde.
Die prozentuale Verringerung von p24 wird relativ zu der Menge an p24 berechnet, die in der Gegenwart der entsprechenden Verdünnung von Proben der Woche 2 produziert wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENLEGUNG
In Zusammenfassung dieser Offenlegung stellt die vorliegende Erfindung neue immunogene Zusammensetzungen für die Erzeugung von virusneutralisierenden Konzentrationen an Antikörpern gegen ein primäres HIV-1-Isolat zur Verwendung gemäß spezifischer Immunisierungs-Prozeduren bereit. Vektoren, die darin verwendet werden und für die Erzeugung von Komponenten für eine Anwendung in den Zusammensetzungen werden ebenfalls offenbart. Nahe liegende Modifikationen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung möglich.
Tabelle 1 Studiendesign
Tabelle 2 Anzahl an Affen, die eine > 80%ige Reduktion vom p24-Titer zeigen
REFERENZEN

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Claims

Verwendung (i) eines DNA-Moleküls, das ein Hüllglycoprotein eines primären HIV-1-Isolats codiert, und (ii) eines attenuierten ALVAC-Virus, das wenigstens ein Hüllglycoprotein eines primären HIV-1-Isolats exprimiert, zur Herstellung eines Medikaments für die Erzeugung einer virusneutralisierenden Konzentration an Antikörpern gegen primäres HIV-1 in einem Wirt mittels eines Therapieschemas, umfassend: (a) wenigstens eine Verabreichung des DNA-Moleküls, welches ein Hüllglycoprotein eines primären HIV-1-Isolats als Priming-Antigen codiert, (b) Ruhenlassen des Wirts, um eine klonale Expansion der für das Priming-Antigen spezifischen Vorläufer-B-Zellen zu ermöglichen, (c) wenigstens eine Verabreichung des attenuierten ALVAC-Virus, das wenigstens ein Hüllglycoprotein eines primären HIV-1-Isolats exprimiert, als Boosting-Antigen an den geprimten Wirt, um die neutralisierenden Konzentrationen an Antikörpern bereitzustellen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das primäre HIV-1-Isolat BX08 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirt für eine Zeitdauer von 2 bis 12 Monaten ruht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Boosting-Antigen wenigstens zweimal verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das DNA-Molekül in einem Plasmidvektor unter der Kontrolle eines heterologen Promotors zur Expression des Hüllglycoproteins in dem Wirt enthalten ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der heterologe Promotor der Cytomegalovirus-Promotor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Vektor der in 2 gezeigte Vektor pCMV3Bx08 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Priming-Antigen wenigstens zweimal verabreicht wird und wobei der Wirt nach jeder Verabreichung der Priming-Verabreichung ruht, um eine klonale Expansion der für das Priming-Antigen spezifischen Vorläufer-B-Zellpopulation zu ermöglichen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der attenuierte Avipoxvirusvektor ein modifiziertes HIV-Genom enthält, das in den langen terminalen Sequenzwiederholungen defizient ist, wobei wenigstens das env-Gen dasjenige des primären Isolats Bx08 ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das attenuierte ALVAC-Virus vCP1579 ist.