ES2282251T3 - Vacunas contra la infeccion por vih. - Google Patents
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Abstract
Uso de (i) una molécula de ADN que codifica para una glucoproteína de envuelta de un aislado primario de VIH-1 y (ii) un virus ALVAC atenuado que expresa al menos una glucoproteína de envuelta de un aislado primario de VIH-1 en la fabricación de un medicamento para generar un nivel de anticuerpos que neutraliza el virus para el VIH-1 en un huésped mediante un tratamiento que comprende: (a) al menos una administración de la molécula de ADN que codifica para una glucoproteína de envuelta de un aislado primario de VIH-1 como antígeno de cebado, (b) dejar que el huésped repose para permitir la expansión clonal de las células B precursoras específicas para el antígeno de cebado, (c) al menos una administración al huésped cebado del virus ALVAC atenuado que expresa al menos una glucoproteína de envuelta de un aislado primario de VIH-1 como antígeno de refuerzo para proporcionar los niveles neutralizantes de anticuerpos
Description
Vacunas contra la infección por VIH.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología y, en particular, a los usos de materiales para
inmunizar un huésped contra la infección por
VIH-1.
El virus de inmunodeficiencia humana es un
retrovirus humano y es el agente etiológico del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se estima que más de 33
millones de personas se han infectado por VIH en todo el mundo desde
diciembre de 1999 (Ref 1- diversas referencias se ponen entre
paréntesis para describir de una manera más completa el estado de
la técnica a la que concierne esta invención. La información
bibliográfica completa de cada cita se encuentra al final de la
memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones.
La descripción de estas referencias se incorpora por el presente
documento como referencia en la presente descripción).
Ya que la epidemia de VIH sigue extendiéndose
por todo el mundo, la necesidad de una vacuna eficaz sigue siendo
urgente. Se han impedido los esfuerzos para desarrollar tal vacuna
por varios factores, tres de los cuales son: (a) la extraordinaria
capacidad del virus para mutar; (b) la incapacidad de la mayoría de
las especificidades conocidas de anticuerpos
anti-VIH para neutralizar los aislados primarios de
VIH constantemente; y (c) la falta de comprensión de la correlación
de la inmunidad protectora con la infección por VIH. Durante los 10
últimos años se han sometido a prueba varias vacunas candidatas
contra VIH en primates para determinar sus capacidades
inmunoprotectoras (Ref. 2). Estos estudios sugieren que tanto los
anticuerpos neutralizantes como la inmunidad mediada por células
desempeñan un papel en conferir inmunidad esterilizante y prevenir
la progresión hacia la enfermedad (Ref. 3 y 4). Aunque se
desconocen actualmente las correlaciones de la protección
inmunitaria frente a la infección por VIH-1, una
vacuna eficaz contra VIH debe lograr tanto anticuerpos
neutralizantes fuertes como respuestas de los linfocitos T
citotóxicos (CTL, cytotoxic T lymphocyte).
Se ha demostrado que las vacunas de subunidades
de la envuelta inducen respuestas humorales de títulos elevados,
pero fueron ineficaces en lograr respuestas de CTL (Ref 5). Se ha
demostrado que los vectores vivos de viruela recombinante logran
respuestas de CTL muy potentes, sin embargo estos vectores fueron
ineficaces en la generación de una respuesta de anticuerpos
significativa (Ref 6). En intentos de combinar los dos tipos de
inmunización, varios ensayos clínicos que implicaban una estrategia
de vacuna principal, que consistía en una inmunización inicial con
un vector viral seguida de refuerzos con subunidades de envuelta de
VIH-1 recombinante, (Ref 7, 8), han conducido a una
satisfacción limitada con respecto a las respuestas de CTL. Otros
enfoques de vacunas han usado partículas similares a virus
inmunogénicas, no replicantes, no infecciosas (VLP,
virus-like particles) para la inmunización frente a
la infección por VIH (Ref 9, 10). Este tipo de inmunógeno ha
conducido a la generación de anticuerpos neutralizantes frente a
una cepa de VIH-1 de laboratorio. (Ref 10).
Se ha investigado un enfoque de vacuna principal
usando VLP no infecciosas para aumentar las respuestas de los CTL
específicas del VIH en ratones cebados con el vector de la viruela
del canario recombinante vCP205 que codifica para la gp 120 de
VIH-1 (cepa MN) (Ref 11). Este estudio demostró que
las VLP pueden reforzar la respuesta de los CTL al vector de la
viruela del canario. Otro trabajo describe el uso de un ADN que
codifica para env como un cebador de vacuna, seguido por un
refuerzo con un virus vaccinia que expresa env (Ref. 11 b). Sin
embargo, no se usó material procedente de aislados primarios, y no
se obtuvieron niveles neutralizantes de anticuerpos.
Recientemente, se ha notificado un estudio que
muestra la inducción de anticuerpos neutralizantes frente a un
aislado primario de VIH-1 en chimpancés (Ref. 12).
En este estudio, se usó un adenovirus recombinante que expresa
gp160 como agente de cebado y se usó gp120 recombinante para
reforzar a los monos.
Aún existe una necesidad de vacunas y
tratamientos de inmunización para inducir tanto una respuesta fuerte
de los CTL como anticuerpos neutralizantes frente a los aislados
primarios de VIH.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una vacuna para generar, en un huésped, particularmente
un huésped humano, un nivel de anticuerpos que neutraliza el virus
frente a un aislado primario de VIH-1. El régimen
de administración comprende al menos una administración de un
antígeno de cebado al huésped, en el que el antígeno de cebado
comprende una molécula de ADN que codifica para una glucoproteína de
envuelta de un aislado primario de VIH-1; dejar que
el huésped repose durante al menos un periodo de reposo específico
para proporcionar la expansión clonal de una población de células B
precursoras específicas de antígenos de VIH-1 en el
mismo para proporcionar un huésped cebado; y al menos una
administración de un antígeno de refuerzo al huésped cebado para
proporcionar dichos niveles neutralizantes de anticuerpos, en el que
el antígeno de refuerzo es un vector viral ALVAC atenuado que
expresa al menos parte de una glucoproteína de envuelta de un
aislado primario de VIH-1. También se describe para
un fin comparativo una vacuna en la que el antígeno de refuerzo es
una partícula similar a VIH inmunogénica, no replicante, no
infecciosa que tiene al menos parte de la glucoproteína de envuelta
de un aislado primario de VIH-1.
El aislado primario de VIH será un aislado de
VIH-1 que incluye el VIH-1_{Bx08}
del aislado clínico de VIH-1 del clado B, aunque
puede emplearse cualquier otro aislado primario de
VIH-1 en los procedimientos de inmunización de la
invención.
La molécula de ADN que codifica para la
glucoproteína de envuelta de un aislado primario de
VIH-1 puede estar contenida en un vector plasmídico
bajo el control de un promotor heterólogo preferiblemente un
promotor de citomegalovirus, para la expresión de la glucoproteína
de envuelta en el huésped, que puede ser un huésped humano.
Preferiblemente, el vector tiene las
características identificativas de pCMV3Bx08 mostradas en la figura
2, siendo tales características identificativas los segmentos de
ácido nucleico y sitios de restricción identificados en la figura
2.
Una administración de cebado de antígeno puede
efectuarse en una administración única o en administraciones
múltiples del antígeno de cebado. En el ultimo caso, el al menos un
periodo de reposo específico para permitir la expresión clonal de
las células B precursoras de la población específica de antígenos de
VIH puede efectuarse tras cada administración de cebado. El al
menos un periodo de reposo específico puede ser de entre
aproximadamente 2 y aproximadamente 12 meses.
Cuando el antígeno de refuerzo es una partícula
similar a VIH-1 inmunogénica, no replicante, no
infecciosa, tal partícula puede comprender una unión de:
- (i)
- un producto del gen env,
- (ii)
- un producto del gen pol, y
- (iii)
- un producto del gen gag.
codificándose la partícula por un
genoma de VIH modificado con déficit en repeticiones terminales
largas (LTR, long terminal repeats) y que contiene gag, pol y env
en su disposición genómica natural. Tales partículas y la obtención
de las mismas se describen en la patente de los EE.UU. nº 5.439.809,
cedida al cesionario de la misma y cuya descripción se incorpora en
el presente documento como referencia. Tales partículas pueden
incluir mutaciones en gag y pol para reducir adicionalmente la
infectividad potencial, tal como se describe de una manera más
completa en la patente de los EE. UU. nº 6.080.408, cedida al
cesionario de la misma y la descripción de la cual se incorpora en
el presente documento como referencia (WO 96/06177). El gen
env es preferiblemente el que procede del aislado primario
BX08. El gen gag y el gen pol pueden ser del mismo aislado primario
o pueden elegirse de otros aislados de VIH-1, que
pueden ser aislados
primarios.
La partícula similar a VIH inmunogénica, no
replicante, no infecciosa puede administrarse junto con un
adyuvante. Puede usarse cualquier adyuvante adecuado, tales como
QS21, DC-chol, RIBI o Alum. Tales partículas de VIH
inmunogénicas, no replicantes, no infecciosas pueden formarse
mediante la expresión a partir de un vector adecuado en células de
mamífero.
Existe un vector descrito que comprende un
genoma de VIH modificado con déficit en repeticiones terminales
largas y un promotor heterólogo conectado de manera funcional a
dicho genoma para la expresión de dicho genoma en células de
mamífero para producir la partícula inmunogénica, no replicante y no
infecciosa, en la que al menos el gen env del genoma de VIH
modificado es el que procede de un aislado primario de VIH. Los
genes gag y pol del genoma de VIH modificado pueden
proceder del mismo aislado primario o de otro aislado, que puede
ser un aislado primario.
Preferiblemente el vector es un vector
plasmídico mientras que el aislado primario preferiblemente es BX08.
El promotor puede ser el promotor de metalotioneína. El vector
preferiblemente tiene las características identificativas del
plásmido p133B1 mostrado en la figura 3, siendo tales
características identificativas los segmentos de nucleótidos y los
sitios de restricción identificados en la figura 3.
El antígeno de refuerzo de la invención es un
vector viral atenuado, concretamente el virus atenuado de la
viruela del canario ALVAC. El vector viral atenuado puede contener
un genoma de VIH modificado con déficit en repeticiones terminales
largas (LTR), en el que al menos el gen env es el procedente del
aislado primario BX08. Los genes gag y pol del genoma
modificado pueden ser los procedentes del mismo aislado primario o
pueden elegirse a partir de otro aislado de VIH.
El vector basado en el virus de la viruela del
canario atenuado ALVAC es un derivado clonado en placa de la vacuna
de la viruela del canario autorizada, Kanapox, y se describe en la
referencia 19. El vector de la viruela del canario atenuado
preferiblemente tiene las características identificativas de vCP1579
mostrado en la figura 4, siendo tales características
identificativas los segmentos de ácido nucleico y los sitios de
restricción identificados en la
figura 4.
figura 4.
La al menos una administración de un antígeno de
refuerzo puede efectuarse en una única administración o al menos
dos administraciones del antígeno de refuerzo.
La invención incluye además composiciones que
comprenden los inmunógenos tal como se proporcionan en el presente
documento y su uso en la fabricación y formulación de composiciones
inmunogénicas incluyendo vacunas.
La presente invención se entenderá mejor a
partir de la siguiente descripción en referencia a los dibujos, en
los que:
la figura 1 muestra los detalles de los
elementos del plásmido pCMVgDtat vpr Bx08.
La figura 2 muestra los detalles de los
elementos del plásmido pCMV3Bx08.
La figura 3 muestra los detalles de los
elementos del plásmido p133B1.
La figura 4 muestra los detalles de las
inserciones en ALVAC (2) para proporcionar el vector vCP1579.
Las figuras 5A y 5B contienen una representación
en forma de línea temporal del régimen de inmunización usado en el
que los grupos de estudio se describen en la tabla 1. Los números
bajo las líneas se refieren a semanas.
La figura 6 muestra la inmunorreactividad frente
a los antígenos de VIH-1 antígenos del suero
diluidos 1:100 de los macacos inmunizados con las diversas
preparaciones tal como se describe en la tabla 1.
La figura 7 muestra la inmunorreactividad frente
a los antígenos de VIH-1 del suero diluido 1:1000 de
los macacos inmunizados con las diversas preparaciones tal como se
describe en la tabla 1.
La figura 8 muestra los detalles de los
elementos de pMPC6H6K3E3.
La figura 9 muestra los detalles de los
elementos de pMPC5H6PN.
La figura 10 muestra los detalles de los
elementos de pHIV76.
La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 1) para el casete del epítopo H6/VIH Pol/Nef en el
sitio C5 de ALVAC de vCP1579.
La figura 12 contiene la secuencia de
nucleótidos de la región C6 (hebra codificante SEQ ID NO: 16, hebra
complementaria SEQ ID NO: 17, secuencia de aminoácidos K3L SEQ ID
NO: 18, secuencia de aminoácidos E3L SEQ ID NO: 19).
Tal como se ha señalado anteriormente, la
presente invención implica la administración de antígenos de VIH
para lograr niveles de anticuerpos que neutralizan el virus frente a
un aislado primario de VIH.
Se preparó un constructo de ADN que incorporaba
el gen env del aislado primario Bx08 bajo el control del promotor
de citomegalovirus y se muestra el constructo, pCMV3Bx08, en la
figura 2. El constructo pCMV3Bx08 se deriva a partir del plásmido
pCMVgDtat vpr Bx08 que se observa en la figura 1. Se usó el
constructo de ADN pCMV3Bx08 en una etapa de inmunización de cebado
en un huésped, siendo los monos macaco el modelo animal elegido.
Tras la etapa de inmunización de cebado, que
puede efectuarse en una o más administraciones del constructo de
ADN, se permite reposar al huésped para proporcionar la expresión
clonal de una población específica de antígenos de VIH de células B
precursoras proporcionando de este modo un huésped cebado.
La administración de refuerzo se efectúa o bien
con una partícula similar a VIH inmunogénica, no replicante, no
infecciosa (VLP) (con fines comparativos) o un vector viral atenuado
(según la invención).
Para este fin, se construyó un plásmido de
expresión de VLP que contenía un genoma de VIH modificado al que le
faltaban repeticiones terminales largas en el que el gen env
se deriva a partir del aislado primario BX08, en el que el genoma
de VIH modificado está bajo el control de un promotor de
metalotioneína. El constructo, p133B1, mostrado en la figura 3, se
usó para efectuar la expresión de partículas similares a VIH
inmunogénicas, no replicantes, no infecciosas en células de
mamífero en las que el producto del gen env, es el procedente
del aislado primario BX08.
En el caso del vector viral atenuado, se
construyó un vector viral de la viruela del canario atenuado
recombinante para contener el gen env del aislado primario
BX08. El vector viral vCP1579 (figura 4) se preparó mediante una
variedad de manipulaciones del plásmido pHIV76 (figura 10), tal como
se muestra descrito en detalle a conti-
nuación.
nuación.
Estos productos se utilizaron en una
administración de refuerzo a los macacos cebados. La administración
de refuerzo puede efectuarse en una o más inmunizaciones. En un
aspecto preferido de la invención las partículas similares a VIH
inmunogénicas, no replicantes, no infecciosas pueden administrarse
conjuntamente con el constructo de ADN en la administración de
cebado y el constructo de ADN puede administrarse conjuntamente con
las partículas similares a virus en la administración de
refuerzo.
Las inmunizaciones se efectuaron según el
procedimiento descrito en el presente documento y los resultados
obtenidos se compararon con los obtenidos usando otros protocolos
según los protocolos expuestos en la tabla 1. Los regímenes de
administración usados se muestran como líneas temporales en las
figuras 5A y 5B.
Los resultados obtenidos siguiendo los diversos
protocolos mostraron que, en particular, una vacunación con ADN
primaria en combinación con un refuerzo de o bien la VLP o el virus
de la viruela del canario atenuado aumentaba los niveles de
anticuerpos neutralizantes, tal como se indica mediante la reducción
detectable en los niveles de p24 en las células infectadas con
aislados de VIH primarios.
Algunos vectores que se describen y a los que se
hace referencia en el presente documento se han depositado en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture
Collection), ubicada en 10801 University Boulevard Manassas,
Virginia 20110-2209, EE.UU., conforme al Tratado de
Budapest y anteriormente a la presentación de esta solicitud. Las
muestras de los vectores depositados estarán disponibles para el
público y todas las restricciones impuestas sobre el acceso a los
depósitos de eliminarán tras la concesión de una patente basada en
esta solicitud de patente. Además, se sustituirá el depósito si no
pueden dispensarse muestras viable por el depositario. La invención
descrita y reivindicada en el presente documento no está limitada en
alcance por los materiales biológicos depositados ya que la
realización depositada está concebida sólo como una ilustración de
la invención. Cualquier vector equivalente o similar que contenga
ácidos nucleicos que codifiquen para antígenos equivalentes o
similares tal como se describieron en esta solicitud está dentro del
alcance de la invención.
Sumario de depósito | ||
Plásmido | ATCC | Fecha de depósito |
pMT-VIH | 40912 | 12 de octubre de 1990 |
pCMVgDtat vpr | 209446 | 11 de noviembre de 1997 |
La descripción anterior describe de forma
general la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más
completa en referencia a los ejemplos específicos siguientes. Estos
ejemplos se describen únicamente con fines de ilustración y no
están concebidos para limitar el alcance de la invención. Se
contemplan cambios obvios en la forma y la sustitución de
equivalentes según lo puedan sugerir o hacer conveniente las
circunstancias.
Ejemplo
1
Este ejemplo describe la construcción del
plásmido pCMV3BX08.
El plásmido, pCMV3BX08, contiene segmentos de
secuencia de diversas fuentes y los elementos de construcción se
representan en la figura 2.
El vector procariota pBluescript SK (Stratagene)
es la estructura principal del plásmido pCMV3.BX08 y se modificó
mediante la sustitución del gen Amp^{R} con
Kan^{R} y la deleción de la región de fl y de LacZ. Para
lograr las modificaciones deseadas, se delecionó la secuencia entre
Ahdl (nucleótido 2.041) y Sacl (nucleótido 759) de
pBluescript SK, que contiene el Amp^{R}, el origen de fl y
el LacZ. Un fragmento de Pstl de 1,2 kb del plásmido
pUC-4k (Pharmacia) que contiene el gen
Kan^{R}, se ligó por extremos romos al sitio Ahdl de
de pBluescript SK en una orientación en sentido contrario de las
agujas del reloj en relación con su transcripción. Se ligó un
fragmento de ADN de Ssp1/Pst1 de 1,6 kb que contiene
las secuencias del promotor de los genes
inmediatos-tempranos del citomegalovirus humano,
del potenciador y del intrón A (CMV) al otro extremo del gen
Kan^{R} de manera que la transcripción a partir del
promotor de CMV se produce en la orientación del sentido de las
agujas del reloj. Se usó un segmento de oligonucleótidos sintético
que contenía la secuencia de iniciación de la traducción y las
secuencias que codifican para el péptido señal activador del
plasminógeno de tejido humano (TPA, tissue plasminogen activator)
para ligar el promotor de CMV y las secuencias que codifican para el
gen de la envuelta del aislado primario
VIH-1_{BX08}.
Se aisló el gen de la envuelta del aislado
primario de VIH-1 BX08 del plásmido pCMVgDtat vpr
Bx08 ilustrado en la figura 1. Se derivó el plásmido pCMVgDtat vpr
Bx08 a partir del plásmido depositado pCMVgDtat vpr, la
construcción del cual se describe en la solicitud de patente en
tramitación junto con la presente de los EE.UU. nº 08/991.773
presentada el 16 de diciembre de 1997, cedida al cesionario del
presente documento y la descripción de la cual se incorpora al
presente documento como referencia, (WO 99/31250). Se derivó el
plásmido pCMVgDtat vpr Bx08 mediante la sustitución de la secuencia
de la envuelta de BX08 del aislado clínico de
VIH-1_{BX08} del clado B por la secuencia de
genoma de VIH modificado presente en el pCMVgDtat vpr. Se restringió
el plásmido pCMVgDtat vpr Bx08 con la enzima de restricción
Xho I y se hicieron romos sus extremos con tratamiento con
Klenow. Después se llevó a cabo una digestión parcial con Not
I y se aisló el fragmento resultante de 6,3 kb que contenía el gen
env. Se restringió el plásmido pCMV3 (Invitrogen) con Bam HI
y se hicieron romos sus extremos con tratamiento con Klenow.
Después se restringió el plásmido pCMV3 con Not I y se aisló
el fragmento resultante de 4,4 kb. Se ligaron juntos los fragmentos
de 6,3 y 4,4 kb para producir el plásmido pCMV3BX08 (figura 2).
Se introdujo el constructo pCMV3BX08 en células
competentes HB101 según las recomendaciones del fabricante
(GibcoBRL). Se identificaron los clones moleculares correctos
mediante análisis de restricción y secuenciación y se examinó su
expresión de la glucoproteína de envuelta en transfecciones
transitorias seguidas de análisis de transferencia de tipo
Western.
Todos los ADN usados para las inmunizaciones se
prepararon usando el kit EndoFree Plasmid (Qiagen). Se inyectaron o
bien 3 mg o bien 600 \mug de pCMVBX08, en 100 ml de PBS para las
inmunizaciones intramusculares.
El ADN proviral del aislado clínico
VIH-1_{BX08} del VIH-1 del clado B
se originó en Transgene (Estrasburgo, Francia) y se aisló del ADN
genómico de células infectadas con el virus.
Ejemplo
2
Este ejemplo describe la construcción del
plásmido p133B1.
Se modificó mediante ingeniería genética un
vector de expresión de plásmido Bx08 (p133B1, figura 3) usado para
transfectar las células de mamíferos en diferentes estadios usando
pUC18 como plásmido inicial huésped. En primer lugar se aisló un
fragmento de 8,3 kpb del provirus VIH-1_{LAI} que
codifica para las proteínas gag, pol y env. A este fragmento le
faltaban los elementos reguladores de la transcripción y los
elementos de repetición terminales largos de cada extremo del
genoma proviral para garantizar que las partículas similares a
virus fueran incompetentes para la replicación. Se ligó este
fragmento a un promotor de metalotioneína de tipo IIA (MTIIA)
humano inducible (Ref. 13) y también a una secuencia de terminación
de transcripción/adición de poliadenilación (poliA) del virus de
simio 40 (SV40) del plásmido pSV2dhfr (Ref 14). Después se insertó
el fragmento modificado en el vector huésped pUC18. Se usó el
constructo de expresión depositado resultante, denominado
pMT-VIH, para transfectar células COS de riñón de
mono y células de riñón de mono verde africano (Vero). El
procedimiento para obtener el pMT-HIV se describe
adicionalmente en la patente de los EE.UU. nº 5.439.809 mencionada
anteriormente. Ambas líneas celulares transfectadas produjeron
partículas similares a virus no replicantes cuando se inducían con
iones de metal (Ref 15).
Se hicieron dos modificaciones adicionales al
ADN proviral en el pMT-HIV para proporcionar
características de seguridad adicionales para proteger a las
células humanas frente a los eventos de recombinación con el ADN
retrotranscrito
1) inactivación de las secuencias empaquetadoras
de ARN; y
2) deleción de una sección grande del gen
pol que codifica para la integrasa y la transcriptasa
inversa.
Para delecionar la primera señal de
empaquetamiento de ARN, se sustituyó parte del ADN correspondiente a
la secuencia líder sin traducir del ARNm con un ADN sintético al
que le faltaba un motivo de 25 pb correspondiente a los nucleótidos
753-777 (la secuencia psi). Para inactivar la
segunda señal de empaquetamiento de ARN se cambiaron dos residuos
de adenosina de una secuencia dedo de zinc del gen gag por
dos residuos de timidina. Cada una de estas sustituciones tuvo el
efecto de sustituir residuos de cisteína en una serie de
Cys-His por una serina en el producto del gen.
La deleción del gen pol se efectuó
mediante la sustitución de un fragmento de 1,9 kpb con un ADN
sintético que contenía codones de parada en los tres marcos de
lectura. Esto evitó la traducción ultralectura de la secuencia
codificante de la integrasa residual en el lado 3' de la deleción.
La deleción de 1,9 kpb en pol también eliminó la expresión
de las enzimas integrasa y transcriptasa inversa. Sin embargo, la
deleción dejó intacto el gen que codifica para la proteasa viral,
que es tanto un componente inmunogénico de las partículas virales
de VIH-1 como permite la expresión de partículas con
antígenos gag procesados que se parecen mucho a los viriones
nativos (Ref 16). La proteasa también contiene epítopos que se
conservan en todos los clados de VIH-1. Las
modificaciones descritas con respecto a los genes gag y
pol se describen de una manera más completa en la patente de
los EE.UU. nº 6.080.408 mencionada anteriormente (WO 96/06177).
Finalmente, el gen env de
VIH-1_{LAI} que se encontraba en
pMT-HIV se sustituyó con el de
VIH-1_{Bx08}. Para efectuar esta sustitución, se
amplificó un fragmento de 2440 pb que contenía el gen env de Bx08
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de
células aisladas con este aislado. Después se usó el producto de la
PCR para sustituir la región correspondiente presente en
pMT-HIV. Sin embargo, el fragmento insertado de
VIH-_{1Bx08} era 125 pb más corto que la región
original VIH_{LAI} debido a una deleción en la región sin
traducir entre el codón de parada del gen env y la secuencia de
terminación/adición de poliA. El constructo resultante sustituyó
todo excepto once residuos de aminoácidos de las proteínas gp120 y
gp41 de la envuelta de LAI. De estos once, sólo los primeros tres
difieren entre los aislados LAI y Bx08, y estos son todos cambios
conservadores de carga, lo que significa que el vector de expresión
final (p133B1) codificaba para una proteína env de
VIH-1_{Bx08} casi auténtica.
Ejemplo
3
Este ejemplo describe la producción de
partículas similares a VIH-1 con fines
comparativos.
Se recogieron células de riñón de mono verde
africano (Vero) y se cultivaron en medio Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) que contiene suero fetal bovino (SFB) al 10% v/v,
denominado en adelante medio completo. En el pase 141, se
transfectaron las células con p133B1 usando el método del fosfato de
calcio cuando alcanzaron aproximadamente el 30% de confluencia. Se
sometieron las células a choque con glicerol 8 horas tras la
transfección. Para esta etapa se prepararon seis placas de 10 cm
que contenían aproximadamente 3,0 x 10^{6} células cada una en
10,0 ml de medio completo. Cada placa recibió 25,0 \mug de vector
de expresión y 2,0 \mug de plásmido pSV2neo (Ref 17). El pSV2neo
contiene un gen marcador seleccionable que le confiere resistencia
al antibiótico geneticina (G418). Dos días después de la
transfección, se recogieron las células de cada placa mediante
tripsinización y se las resembró en veinticinco placas nuevas en
medio completo complementado con 0,5 mg/ml de G418.
En total, se aislaron 394 colonias de las placas
usando cilindros de clonación. Cada colonia se recogió mediante
tripsinización y se dividió en dos pocillos de una placa de
serocultivo, uno de los pocillos por clon se indujo tras alcanzar
del 50% al 90% de confluencia. Antes de la inducción, se trataron
los pocillos mediante sustitución de todo el medio con medio
completo nuevo que contenía 5-azacitidina 10 \muM.
Tras incubar durante entre 18 horas y 22 horas, se eliminó el medio
y se sustituyó con DMEM nuevo que contenía SFB al 0,2% v/v,
CdCl_{2} 2,0 \muM y ZnCl_{2} 200,0 \muM. Se incubaron los
pocillos durante de 20 horas a 24 horas adicionales tiempo en el
cual se eliminaron las muestras del medio y se sometieron a la
prueba de ELISA en p24.
Se eligieron los veinte clones que más
producían, basándose en el título de la p24, y se subcultivaron las
células de los pocillos sin inducir correspondientes en un frasco
T-25 y uno T-150 por clon. Se
cultivaron ambos frascos hasta la confluencia. Se recogieron las
células del T-150 mediante tripsinización y se
conservaron en frío en el pase número 145. Se recogieron las
células del T-25 mediante tripsinización cada de 3
días a 4 días y se mantuvieron hasta el pase 153. Se indujeron las
células tal como anteriormente y volvieron a someterse las muestras
a la prueba de ELISA en p24 en dos pases diferentes antes del pase
153.
Se seleccionaron los dos mayores productores y
se recogieron mediante tripsinización cada de 3 días a 4 días hasta
el pase 163. Se sometieron las muestras de los clones a la prueba de
ELISA en gp120 y p24 desde el pase 158 y a ELISA en p24 en el pase
163, para evaluar la estabilidad clonal. Se eligió la más adecuada
de estas dos líneas celulares, denominada 148 a 391, para una
subclonación adicional. La nomenclatura del clon define el número
del experimento de este procedimiento, que fue el 148, y el número
del clon que fue el número 391 de los 394 aislados originales.
Se cultivaron las células vero durante
aproximadamente de 100 h a 103 h y después se cambió el medio con
medio de crecimiento que contenía 5-azacitidina.
Después se incubaron las botellas durante de 20 h a 22 h
adicionales, tiempo en el que el medio se sustituyó por medio sin
suero que contenía CdCl_{2} y ZnCl_{2}. Después se incubaron
las botellas durante de 29 h a 31 h, tiempo en el que se recogió,
reunió y almacenó el medio a de 2ºC a 8ºC antes de la
purificación.
El día siguiente después de la recogida, se
aclaró, concentró y diafiltró la solución con tampón fosfato. Se
pasó el concentrado a través de una columna de hidroxiapatito (tipo
I) cerámica y se recogió la fracción no retenida. Se reunió la
fracción no retenida de dos sublotes y se bombeó sobre un gradiente
de densidad de sacarosa en un rotor de ultracentrífuga zonal
continua. Se recogieron y reunieron las fracciones que contenían
pseudoviriones. Se diafiltraron las fracciones de los pseudoviriones
con PBS que contenía un 2,5% de sacarosa para reducir el contenido
de sacarosa, se concentró y se diafiltró de nuevo. Se filtró en
condiciones estériles el material usando un filtro de 0,2 mm. En
este estadio los materiales se designaron como un sublote purificado
y se almacenaron a de 2 a 8°C.
Se prepararon los adyuvantes por separado y se
esterilizaron por filtro antes de rellenar los viales de dosis
única. El QS21 se almacenó a -20°C.
Ejemplo
4
Este ejemplo describe la producción del virus de
la viruela recombinante vCP1579.
El virus de la viruela recombinante vCP1579
(figura 4) contiene los genes de la proteasa y gag de
VIH-1 derivados del aislado VIH-1
IIIB aislado, las secuencias de la envuelta de gp120 derivadas del
aislado VIH-1 Bx08, y secuencias que codifican
para un polipéptido que abarca los epítopos de CTL humanos conocidos
de VIH-1 Nef y Pol.
Se generó el vCP1579 recombinante (figura 4)
mediante la inserción de las secuencias modificantes del vector de
pMPC6H6K3E3 (figura 8) que codifican para E3L y K3L en el sitio C6
del vCP1566 recombinante (figura 4). Se generó el vCP1566
recombinante mediante la inserción de un casete de expresión que
codifica para un polipéptido sintético que contiene epítopos Pol
CTL y epítopos Nef CTL (figura 11) y el plásmido pMPC5H6PN (figura
9) en el vCP1453 en el sitio de inserción conocido como C5. Se
generó el vCP1453 recombinante mediante inserción conjunta de genes
que codifican para los productos génicos de env y gag/proteasa de
VIH-1, el plásmido pHIV76 (figura 10), en el genoma
de ALVAC en el sitio de inserción conocido como C3.
\newpage
La construcción de vectores de viruela
recombinantes que contienen los genes E3lL y K3L se ha descrito en
la patente de los EE.UU. nº 6.004.777 expedida el 21 de diciembre de
1999 a Tartaglia et al. y los vectores de viruela
recombinantes que describen la inserción de genes de VIH se ha
descrito en la patente de los EE.UU. nº 5.766.598, expedida el 16
de junio de 1998 a Paoletti et al.
Se usó el locus denominado C3 para la inserción
de las secuencias de los genes env y gag en el vector
ALVAC (2), y el locus denominado C5 fue el sitio de inserción para
las secuencias que codifican para los epítopos de CTL de Nef y Pol
de VIH-1. En virtud de los loci C3 y C5 que existen
dentro de las repeticiones terminales invertidas (ITR, inverted
terminal repetitions) extensas del genoma del virus (aproximadamente
41 kpb), la inserción en estos loci da como resultado la producción
de dos copias de las secuencias de VIH-1
insertadas.
Brevemente, se modificó mediante ingeniería
genética el casete de expresión pHIV76 (figura 10) de la siguiente
manera. Se usó el plásmido p133B1 (figura 3) que contiene el gen
gp160 de VIH-Bx08 como plásmido inicial. Se clonó
el extremo 3' del promotor H6 en el sentido de 5' del gen gp160 y se
modificaron tres secuencias señal de terminación de la
transcripción temprana (T_{5}NT) del virus de la viruela. Esto se
consiguió mediante la clonación de un fragmento de PCR digerido con
BamHI de 2.600 pb, que contenía el extremo 3' del promotor
H6 y el gen gp160 del VIH-1 (BX08) modificado por
T_{5}NT, en el sitio de BamHI de pBS-SK. Se
generó este fragmento de PCR a partir de cuatro fragmentos de PCR
solapantes (un fragmento de 570 pb, un fragmento de 140 pb, un
fragmento de 500 pb y un fragmento de 1.450 pb) y los
oligonucleótidos, RW835
(5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTCGC
GATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAAGTGAAGGAC C-3'-SEQ ID NO: 2) y RW836 (5'-ATCATCATCG
GATCCCGGGGTT ATAGCAAAGCCCTTTC-3' - SEQ ID NO: 3). El fragmento de PCR de 570 pb, que contenía el extremo 3' del promotor H6 y el extremo 5' del gen gp160, se generó a partir del plásmido, p133B1, con los oligonucleótidos, RW835 (5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATG AAAGTGAAGGAGAC-3') y RW868 (5'-ATCAAGACTATAGAAGA GTGCATATTCTCTCTTCATC-3'). El fragmento de PCR de 140 pb, que contenía una porción interior del gen gp160, se generó a partir del plásmido p133-B1 con los oligonucleótidos, RW864 (5'-GCACTCTTCTATAGTCTTGATATAGTAC-3'-SEQ ID NO: 4) y RW865 (5'-AGCCGGGGCGCAGAAATGTATG GGAATTGGCAC-3' SEQ ID NO: 5). El fragmento de PCR de 500 pb, que contenía una porción interior del gen gp160, se generó a partir del 133-3 con los oligonucleótidos RW866 (5'- ATACATTTCTGCGCCCCGGCTGGT TTTGCGATTC-3'-SEQ ID NO: 6) y RW867 (5'-GAAGAATTC CCCTCCA
CAATTAAAAC-3'-SEQ ID NO: 7). El fragmento de PCR de 1.450 pb, que contenía el extremo 3' del gen gp160, se generó a partir del p133-B1 con los oligonucleótidos, RW869 (5'-TGTGGAGGGGAATTCT45 TCTACTGTAATAC AACACAAC-3'-SEQ ID NO: 8) y RW836 (5'-ATCATCATCGGAT CCCGGGGTTATAGCAAAGCCCTTTC3'-SEQ ID NO: 9). El extremo 3' del fragmento de PCR de 570 pb PCR solapa con el extremo 5' del fragmento de PCR de 140 pb. El extremo 3' del fragmento de PCR de 140 pb PCR solapa con el extremo 5' del fragmento de PCR de 500 pb. El extremo 3' del fragmento de PCR de 500 pb solapa con el extremo 5' del fragmento de PCR de 1.450 pb. El plásmido generado mediante esta manipulación se denomina pRW997.
GATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAAGTGAAGGAC C-3'-SEQ ID NO: 2) y RW836 (5'-ATCATCATCG
GATCCCGGGGTT ATAGCAAAGCCCTTTC-3' - SEQ ID NO: 3). El fragmento de PCR de 570 pb, que contenía el extremo 3' del promotor H6 y el extremo 5' del gen gp160, se generó a partir del plásmido, p133B1, con los oligonucleótidos, RW835 (5'-ATCATCATCGGATCCCGGGGTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATG AAAGTGAAGGAGAC-3') y RW868 (5'-ATCAAGACTATAGAAGA GTGCATATTCTCTCTTCATC-3'). El fragmento de PCR de 140 pb, que contenía una porción interior del gen gp160, se generó a partir del plásmido p133-B1 con los oligonucleótidos, RW864 (5'-GCACTCTTCTATAGTCTTGATATAGTAC-3'-SEQ ID NO: 4) y RW865 (5'-AGCCGGGGCGCAGAAATGTATG GGAATTGGCAC-3' SEQ ID NO: 5). El fragmento de PCR de 500 pb, que contenía una porción interior del gen gp160, se generó a partir del 133-3 con los oligonucleótidos RW866 (5'- ATACATTTCTGCGCCCCGGCTGGT TTTGCGATTC-3'-SEQ ID NO: 6) y RW867 (5'-GAAGAATTC CCCTCCA
CAATTAAAAC-3'-SEQ ID NO: 7). El fragmento de PCR de 1.450 pb, que contenía el extremo 3' del gen gp160, se generó a partir del p133-B1 con los oligonucleótidos, RW869 (5'-TGTGGAGGGGAATTCT45 TCTACTGTAATAC AACACAAC-3'-SEQ ID NO: 8) y RW836 (5'-ATCATCATCGGAT CCCGGGGTTATAGCAAAGCCCTTTC3'-SEQ ID NO: 9). El extremo 3' del fragmento de PCR de 570 pb PCR solapa con el extremo 5' del fragmento de PCR de 140 pb. El extremo 3' del fragmento de PCR de 140 pb PCR solapa con el extremo 5' del fragmento de PCR de 500 pb. El extremo 3' del fragmento de PCR de 500 pb solapa con el extremo 5' del fragmento de PCR de 1.450 pb. El plásmido generado mediante esta manipulación se denomina pRW997.
Después se sustituyó la secuencia que codifica
para gp41 con la secuencia que codifica para la región transmembrana
(TM) de gp 160. Se consiguió esta modificación mediante la
clonación de un fragmento de PCR digerido con
MfeI-HindIII de 200 pb, que contenía el extremo 3'
del gen gp 120 y la secuencia TM, en el fragmento de
MfeI-HindIII de 4.400 pb. Se generó este fragmento de
PCR a partir de dos fragmentos de PCR solapantes (un fragmento de
170 pb y un fragmento de 125 pb) con los oligonucleótidos, HIVP97
(5'-TAGTGGGAAAGAGATCTTCAGACC-3'-SEQ
ID NO: 10) y HIVP101
(5'-TTTTAAGCTTTTATCCCTGCCTAACTCTATTCAC
TAT-3'-SEQ ID NO: 11). Se generó el
fragmento de PCR de 170 pb a partir de pRW997 con los
oligonucleótidos, HIVP97 (5'-TAGTGGGAAAGA
GATCTTCAGACC-3'-SEQ ID NO: 12) y HIVP100 (5'-CCTCCTACTATCATTATGAATATTCTTTTTTCTCTCTG
CACCACTCT-3'-SEQ ID NO: 13). Se generó el fragmento de PCR de 125 pb a partir de pRW997 con los oligonucleótidos, HIVP99 (5'-AGAGTGGTGCAGAGAGAAAAA AGAATATTCATAATGATAGTAGGAGGC-3' - SEQ ID NO: 14) y HIVP101 (5'-TTTTAAGCTTTTA TCCCTGCCTAACTCTATTCACTAT-3'-SEQ ID NO: 15). El plásmido generado mediante esta manipulación se denomina pHIV71.
GATCTTCAGACC-3'-SEQ ID NO: 12) y HIVP100 (5'-CCTCCTACTATCATTATGAATATTCTTTTTTCTCTCTG
CACCACTCT-3'-SEQ ID NO: 13). Se generó el fragmento de PCR de 125 pb a partir de pRW997 con los oligonucleótidos, HIVP99 (5'-AGAGTGGTGCAGAGAGAAAAA AGAATATTCATAATGATAGTAGGAGGC-3' - SEQ ID NO: 14) y HIVP101 (5'-TTTTAAGCTTTTA TCCCTGCCTAACTCTATTCACTAT-3'-SEQ ID NO: 15). El plásmido generado mediante esta manipulación se denomina pHIV71.
Después se clonó el gen gp120+TM con el promotor
H6 entre los brazos flanqueantes de C3, en un plásmido que contiene
el gen gag/(pro) de VIH-1 con el promotor I3L. Se
llevó a cabo esta modificación mediante clonación del fragmento de
NruI-XhoI de 1.600 pb de pHIV71, que contenía el gen
gp120+TM con el promotor H6, en el fragmento de
NruI-XhoI de 8.200 pb de pHIV63. El plásmido generado
mediante esta manipulación se denomina pHIV76 (figura 10). Se usó
el plásmido pHIV76 en experimentos de recombinación in vivo
con ALVAC (CPpp) como virus de rescate para dar vCP1453.
La secuencia de las regiones nef/pol se muestra
en la figura 12 y las secuencias E3L y K3L se muestran en la figura
13. Para generar ALVAC(2)120(BX08)GNP
(vCP1579), se subclonan los casetes de expresión que consistían en
las combinaciones del gen VIH-1/promotor en un
plásmido donador ALVAC, que después se usó para insertar los
casetes de expresión en sitios definidos en el genoma de ALVAC
mediante la recombinación in vitro tal como se ha descrito
previamente (Ref 20).
\newpage
Ejemplo
5
Este ejemplo describe los resultados de los
regímenes de inmunización.
Se asignaron al azar grupos de cuatro animales
(macacos) cada uno a siete grupos de vacunas tal como se ilustra en
la tabla 1. En esta tabla, "ADN BX08" se refiere a pCMV3BX08,
preparado tal como se describe en el ejemplo 1, "VLP BX08" se
refiere a los pseudoviriones producidos mediante el vector de
expresión p133B1 in las células Vero, tal como se describe en el
ejemplo 3, y "ALVAC(2) BX08" se refiere a vCP1579,
preparado tal como se describe en el ejemplo 4. Se recogieron
muestras de suero de referencia (presangrado) en las semanas -6 y
-2 antes de la vacunación. Se administraron las inmunizaciones
primarias con las diversas vacunas en las semanas 0 y 4 con
refuerzos en las semanas 24 y 44 (figuras 5A, 5B). Se inmunizaron
las vacunas intramuscularmente en un cuadriceps de cada mono
macaco.
Se prepararon los sueros a partir de sangre
completa usando tubos de recogida SST y se analizaron usando
transferencias de tipo Western para VIH-1
disponibles comercialmente. Los grupos 1, 2 y 7 mostraron niveles
bajos de anticuerpos anti-Env tras el primer
refuerzo (figuras 6 y 7). Basándose en los valores de ELISA, los
niveles de anticuerpos anti-env estaban por debajo
de 1 \mug/ml de IgG específicas. Se detectaron altos niveles de
anticuerpos anti-gag en los grupos 1, 2, 3, 4, y 7
(figuras 6 y 7). No se detectaron anticuerpos específicos de
VIH-1 en los grupos 5 y 6 (figura 6).
Se realizó un ensayo para comprobar la capacidad
de los anticuerpos obtenidos a partir de los monos inmunizados para
neutralizar el virus VIH-1BX08 en CMSP humanas
basándose en la reducción de los niveles de p24.
Se llevó acabo el ensayo de neutralización
esencialmente tal como se describe en la referencia 18. Brevemente,
se mezclaron las diluciones de suero con VIH-1 BX08
y se incubaron las mezclas durante 1 hora, después se añadieron a
células CMSP humanas sensibles. Se registraron los títulos como la
dilución de suero a la que p24 se redujo en un 80%. Se sometieron a
ensayo las muestras de suero en diluciones del virus 1:2, 1:8 y 1:32
(diluciones 1:6, 1:24 y 1:26 tras la adición de las células). Se
evaluaron los niveles de p24 mediante un ensayo de ELISA específico
para
p24.
p24.
La vacunación de ADN por sí misma, grupo 5, y la
de ALVAC por sí misma, grupo 6, no tenía monos que mostraran una
reducción de los niveles de p24 mayores del 80%. El grupo 4, con
baja cantidad de ADN (600 mg) más ALVAC, tampoco mostró monos con
más de un 80% de reducción de los títulos de p24. Las VLP más ADN, o
bien a dosis altas o bien a dosis bajas (grupos 1 y 2) mostraron un
aumento en la reducción de los niveles de p24 comparado con las VLP
solas, grupo 7. Una dosis alta de ADN, grupo 3, en combinación con
ALVAC aumentó la capacidad para obtener anticuerpos neutralizantes
del virus o de la p24 con respecto a una dosis baja, grupo 4 o a
ALVAC solo, grupo 6. Estos resultados indican que la vacunación con
ADN en combinación con VLP o ALVAC aumenta los niveles de
anticuerpos neutralizantes del virus tal como se indica mediante la
reducción de los niveles de p24 en los sueros de los monos
inmunizados.
Se calcula el porcentaje de reducción de p24 en
relación a la cantidad de p24 producida en presencia de la
correspondiente dilución de las muestras de la semana 2.
Como sumario de esta descripción, la presente
invención proporciona composiciones inmunogénicas novedosas para
generar niveles de anticuerpos neutralizantes del virus frente a un
aislado primario de VIH, que ha de usarse según los procedimientos
de inmunización específicos. Los vectores usados en ello y para la
generación de los componentes para su uso en dichas composiciones
también se describen. Las modificaciones obvias son posibles dentro
del alcance de esta invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Claims (10)
1. Uso de (i) una molécula de ADN que codifica
para una glucoproteína de envuelta de un aislado primario de
VIH-1 y (ii) un virus ALVAC atenuado que expresa al
menos una glucoproteína de envuelta de un aislado primario de
VIH-1 en la fabricación de un medicamento para
generar un nivel de anticuerpos que neutraliza el virus para el
VIH-1 en un huésped mediante un tratamiento que
comprende:
(a) al menos una administración de la molécula
de ADN que codifica para una glucoproteína de envuelta de un
aislado primario de VIH-1 como antígeno de
cebado,
(b) dejar que el huésped repose para permitir la
expansión clonal de las células B precursoras específicas para el
antígeno de cebado,
(c) al menos una administración al huésped
cebado del virus ALVAC atenuado que expresa al menos una
glucoproteína de envuelta de un aislado primario de
VIH-1 como antígeno de refuerzo para proporcionar
los niveles neutralizantes de anticuerpos.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
aislado primario de VIH-1 es BX08.
3. Uso según las reivindicaciones 1 o 2, en el
que el huésped reposa durante un periodo de 2 a 12 meses.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 en el que el antígeno de refuerzo se administra al menos dos
veces.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en el que dicha molécula de ADN está contenida en un vector
plasmídico bajo el control de un promotor heterólogo para la
expresión de la glucoproteína de envuelta en el huésped.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el
promotor heterólogo es el promotor del citomegalovirus.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, en el que el vector es pCMV3Bx08 mostrado en la figura
2.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el antígeno de cebado se
administra al menos dos veces y en el que el huésped reposa para
permitir la expansión clonal de la población de células B
precursoras específicas para el antígeno de cebado tras cada
administración de dicha administración de cebado.
9. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el vector de virus de la viruela
aviar atenuado contiene un genoma de VIH modificado con déficit en
repeticiones terminales largas, en el que al menos el gen
env es el del aislado primario BX08.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
virus ALVAC atenuado es vCP1579.
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