PT781329E - Sobre-expressão de proteínas de mamífero e virais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "SOBRE-EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MAMÍFERO E VIRAIS"

Campo da Invenção A invenção refere-se a genes e métodos para expressar proteínas do HIV a níveis elevados, em células eucariotas.

Antecedentes da Invenção A expressão de produtos génicos eucariotas em procariotas é, por vezes, limitada pela presença de codões que são pouco frequentemente utilizados em E. coli. A expressão desses genes pode ser intensificada pela substituição sistemática dos codões endógenos por codões sobre-representados em genes procariotas altamente expressos (Robinson et al. 1984). É normalmente suposto que os codões raros causem a pausa do ribossoma, o que origina uma deficiência na finalização da cadeia polipeptídica nascente e um desacoplamento entre a transcrição e a tradução. A extremidade 3' do ARNm do ribossomas parado é exposto a ribonucleases celulares, que reduzem a estabilidade do transcrito. 1

Sumário da Invenção A invenção refere-se a um gene sintético, de acordo com as reivindicações em anexo.

Os codões preferidos são: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac) Cys (tgc); Gin (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (ate); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (age); Thr (acc) ; Tyr (tac) e Vai (gtg) . Os codões menos preferidos são: Gly (ggg) ; Ile (att) ; Leu (ctc) ; Ser (tcc) ; Vai (gtc) . Todos os codões que não cabem na descrição dos codões preferidos ou dos codões menos preferidos são codões não preferidos.

Em formas de realização preferidas, o gene sintético tem capacidade de expressar a referida proteína de mamífero a um nível que é, pelo menos, 110%, 150%, 200%, 500%, 1000% ou 10000% do expresso pelo referido gene natural num sistema de cultura in vitro de células de mamífero, sob condições idênticas (i. e., o mesmo tipo de célula, as mesmas condições de cultura, o mesmo vector de expressão). São descritos abaixo sistemas de cultura celular adequados à medição da expressão do gene sintético e do gene natural correspondente. São bem conhecidos dos especialistas na técnica outros sistemas de expressão adequados que utilizam células de mamífero e encontram-se descritos, por exemplo, nos trabalhos de referência da biologia molecular padrão apresentados abaixo. São descritos abaixo e nos trabalhos de referência padrão descritos abaixo, vectores adequados para expressar os genes sintéticos e naturais. Por "expressão" pretende-se significar expressão de proteína. A expressão pode ser medida utilizando um anticorpo específico para a proteína de interesse. Esses anticorpos e 2 técnicas de medição são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Por "gene natural" pretende-se significar a sequência génica que codifica naturalmente a proteína.

Noutras formas de realização preferidas, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% dos codões no gene natural são codões não preferidos.

Numa forma de realização preferida, a proteína é uma proteína do HIV. Em outras formas de realização preferidas, a proteína é gag, pol, env, gpl20 ou gpl60. A invenção refere-se, igualmente, a um método de preparação de um gene sintético, codificando uma proteína normalmente expressa por células de mamífero. O método inclui a identificação de codões não preferidos e menos preferidos no gene natural codificando a proteína e a substituição de, pelo menos, 50% dos codões não preferidos e menos preferidos, por um codão preferido, codificando o mesmo aminoácido que o codão substituído.

Em algumas circunstâncias (e. g., para permitir a introdução de um local de restrição) pode ser pretendido substituir um codão não preferido por um codão menos preferido, em vez de um codão preferido. Não é necessário substituir todos os codões menos preferidos ou não preferidos por codões preferidos. A expressão aumentada pode ser obtida, mesmo com substituição parcial. 3

Noutras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a vectores (incluindo vectores de expressão) compreendendo o gene sintético.

Por "vector" pretende-se significar uma molécula de ADN, derivada, e. g., de um plasmídeo, bacteriófago ou virus de mamífero ou de insecto, no qual podem ser inseridos ou clonados fragmentos de ADN. Um vector irá conter um ou mais locais de restrição únicos e pode ter capacidade de replicação autónoma num hospedeiro ou organismo transportador definido, de forma a que a sequência clonada seja reproduzível. Deste modo, por "vector de expressão" pretende-se significar qualquer elemento autónomo com capacidade de controlar a síntese de uma proteína. Esses vectores de expressão de ADN incluem plasmídeos e vírus de mamífero. A invenção refere-se, igualmente, a fragmentos de genes sintéticos os quais codificam uma porção pretendida da proteína. Estes fragmentos de genes sintéticos são semelhantes aos genes sintéticos da invenção, excepto por estes codificarem, apenas, uma porção da proteína. De um modo preferido, esses fragmentos de genes codificam, pelo menos, 50, 100, 150 ou 500 aminoácidos contíguos da proteína.

Na construção dos genes sintéticos da invenção pode ser pretendido evitar sequências CpG, uma vez que estas sequências podem causar o silenciamento de genes. A força do codão presente no gene da gpl20 do invólucro do HIV está, igualmente, presente nas proteínas gag e pol. Deste modo, a substituição de uma porção dos codões não preferidos e menos preferidos, encontrados nestes genes, por codões 4 preferidos, deve produzir um gene com capacidade de expressão num nível mais elevado. Uma grande parte dos codões nos genes humanos codificando o Factor VIII e o Factor IX são codões não preferidos ou codões menos preferidos. A substituição de uma porção destes codões por codões preferidos deve produzir genes com capacidade de expressão num nível mais elevado em cultura de células de mamífero. Pelo contrario, pode ser pretendido substituir codões preferidos num gene de ocorrência natural por codões menos preferidos, como uma forma de baixar a expressão.

Os trabalhos de referência padrão que descrevem os princípios gerais da tecnologia de ADN recombinante incluem Watson, J.D. et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I e II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., editores, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J.E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Editores, Nova Iorque, N.Y. (1986); Old, R.W., et al., Principies of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2a edição, University of Califórnia Press, Editores, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989) e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, Nova Iorque, NY (1989).

Descrição Detalhada

Descrição dos Desenhos

A Figura 1 representa a sequência do gene sintético da gpl20 (SEQ ID N°; 34) e de um gene sintético da gp!60 (SEQ ID 5 Ν°: 35), nos quais os codões foram substituídos pelos encontrados em genes humanos altamente expressos. A Figura 2 é um desenho esquemático do gene sintético da gpl20 (HIV-1 MN). As porções sombreadas assinaladas vl a v5 indicam as regiões hipervariáveis. A caixa a cheio indica o local de ligação ao CD4. É mostrado um número limitado de locais de restrição únicos: H (Hind3), Nh (Nhel), P (Pstl), Na (Nael), M (Mlul), R (EcoRl), (Agel) e No (Notl). Os fragmentos de ADN sintetizados quimicamente que serviram como moldes para PCR são mostrados abaixo da sequência da gpl20, juntamente com as posições dos iniciadores utilizados para a sua amplificação. A Figura 3 é uma fotografia dos resultados dos ensaios de transfecção transiente utilizados para medir a expressão da gpl20. Electroforese em gel dos sobrenadantes imunoprecipitados das células 293T transfectadas com plasmídeos expressando a gpl20 codificada pelo isolado IIIB do HIV-1 (gpl20 Illb), pelo isolado MN (gpl20mn), pelo isolado MN modificado pela substituição do péptido líder endógeno pelo do antigénio CD5 (gpl20mn CD5L) ou pelo gene quimicamente sintetizado codificando a variante MN com as CDS líder humanas (syngpl20mn). Os sobrenadantes foram recolhidos após um período de marcação de 12 horas, 60 horas após a transfecção e foram imunoprecipitados com proteína de fusão CD4:IgGl e proteína A sepharose. A Figura 4 é um gráfico que representa os resultados de ensaios ELISA utilizados para medir os níveis de proteína em sobrenadantes de células 293T transfectadas transientemente. Os sobrenadantes das células 293T transfectadas com 6 plasmídeos expressando a gpl20 codificada pelo isolado IIIB do HIV-1 (gpl20IIIb), pelo isolado MN (gpl20mn), pelo isolado MN modificado pela substituição do péptido lider endógeno pelo do antigénio CD5 (gpl20mn CD5L) ou pelo gene quimicamente sintetizado codificando a variante MN com as CDS lider humanas (syngpl20mn), foram recolhidos após 4 dias e testados num ELISA com gpl20/CD4. 0 nivel da gpl20 é expresso em ng/mL. 0 painel A da Figura 5, é uma fotografia de um gel que ilustra os resultados de um ensaio de imunoprecipitação utilizado para medir a expressão da gpl20 nativa e sintética, na presença da rev em trans e da RRE em cis. Nesta experiência, as células 293T foram transfectadas transientemente por co-precipitação com fosfato de cálcio de 10 pg do plasmideo expressando: (A) a sequência sintética da gpl20MN e a RRE em cis, (B) a porção da gpl20 do HIV-1 IIIB, (C) a porção da gpl20 do HIV-1 IIIB e a RRE em cis, a totalidade na presença ou na ausência de expressão da rev. As construções qpl20IIIbRRE e syngpl2OmnRRE da RRE foram produzidas utilizando um fragmento Eagl/Hpal da RRE clonado por PCR a partir de um clone proviral HXB2 do HIV-1. Cada plasmideo de expressão da gpl20 foi co-transfectado com 10 pg de ADN, quer do plasmideo pCMVrev, quer do CDM7. Os sobrenadantes foram recolhidos 60 horas após a transfecção, imunoprecipitados com proteína de fusão CD4:IgG e proteína A agarose e separados numa SDS-PAGE redutora a 7%. O tempo de exposição do gel foi aumentado de forma a permitir que fosse demonstrada a indução da gpl20IIIbrre pela rev. O painel B da Figura 5, é uma exposição mais curta de uma experiência semelhante, na qual a syngp!2Omnrre foi co-transfectada com 7 ou sem o pCMVrev. 0 painel C da Figura 5, é um diagrama esquemático das construções utilizadas no painel A. A Figura 6 é uma comparação entre a sequência do gene da THY-1 de tipo selvagem de rato (wt) (SEQ. ID. N°: 37) e um gene sintético da THY-1 de rato (env) (SEQ. ID. N°: 36) construído por síntese química e tendo os codões mais frequentes do gene env do HIV-1. A Figura 7 é um diagrama esquemático do gene sintético da THY-1 de rato. A caixa preenchida a negro indica o péptido sinal. A caixa sombreada indica as sequências no precursor que controlam a ligação de uma âncora de fosfatidilinositol glicano. Os locais de restrição únicos utilizados para a montagem das construções THY-1 são indicados como H (Hind3), M (MluI), S (Saci) e No (Notl). A posição dos oligonucleótidos sintéticos utilizados na construção é mostrada no final da Figura. A Figura 8 é um gráfico representando os resultados da análise de citometria de fluxo. Nesta experiência foram transfectadas transientemente células 293T, com THY-1 de tipo selvagem de rato (linha escura), com THY-1 de rato com codões do invólucro (linha clara) ou com apenas vector (linha tracejada). As células 293T foram transfectadas com os diferentes plasmídeos de expressão, por co-precipitação com fosfato de cálcio e coradas com anticorpo monoclonal 0X7 anti THY-1 de rato, seguido por um anticorpo IgG policlonal anti-murganho conjugado com FITC, 3 dias após a transfecção. 0 painel A da Figura 9, é uma fotografia de um gel ilustrando os resultados da análise por imunoprecipitação dos sobrenadantes das células 293T humanas, transfectadas, quer com syngpl2 0mn (A) , quer com uma construção syngpl20mn.rTHY-Ienv, o qual tem o gene rTHY-Ienv na região 3' não traduzida do gene syngpl20mn (B). A construção syngpl20mn.rTHY-Ienv foi produzida inserindo um adaptador Notl no local rombo Hind3 do plasmídeo rTHY-Ienv. Subsequentemente, foi clonado um fragmento Notl com 0,5 kb, contendo o gene rTHY-Ienv, no local Notl do plasmídeo syngpl20mn e foi testado para a orientação correcta. Os sobrenadantes das células marcadas com 35S foram recolhidos, 72 horas após a transfecção, precipitados com proteína de fusão CD4:IgG e proteína A agarose e separados por SDS-PAGE redutora a 7%. O painel B da Figura 9, é um diagrama esquemático da construção utilizada nas experiências representadas no painel A desta figura.

Descrição das Formas de Realização Preferidas

Construção de um Gene Sintético da gp!20 Tendo Codões Encontrados em Genes Humanos Altamente Expressos

Foi produzida uma tabela de frequência de codões, para o precursor do invólucro do subtipo LAV do HIV-1, utilizando o programa informático desenvolvido pelo Grupo de Computação em Genética da Universidade do Wisconsin. Os resultados daquela tabulação são comparados na Tabela 1 com o padrão de utilização de codões de uma colecção de genes humanos altamente expressos. Para qualquer aminoácido codificado por codões degenerados, o codão mais favorecido dos genes altamente expressos é diferente do codão mais favorecido do precursor do invólucro do HIV. Para além disso, o padrão de codões favorecidos do invólucro é descrito por uma regra simples, onde quer que esta se aplique: os codões preferidos maximizam o número de resíduos de adenina no ARN virai. Na totalidade dos casos, excepto num, isto significa que o codão no qual a terceira posição é A, é o mais frequentemente utilizado. No caso especial da serina, três codões contribuem, de modo igual, com um resíduo A para o ARNm; em conjunto, estes três compreendem 85% dos codões actualmente utilizados nos transcritos do invólucro. Um exemplo particularmente notório de preferência para A é encontrado na escolha de codões para a arginina, na qual o tripleto AGA compreende 88% da totalidade dos codões. Para além da preponderância de resíduos A, é verificada uma preferência significativa para a uridina, entre os codões degenerados cujo terceiro resíduo tem que ser uma pirimidina. Finalmente, as inconsistências entre as variantes menos frequentemente utilizadas podem ser explicadas pela observação de que o dinucleótido CpG se encontra subrepresentado; Deste modo, é menos provável que a terceira posição seja G, sempre que a segunda posição for C, como nos codões de alanina, prolina, serina e treonina; e os tripletos CGX da arginina não são quase utilizados em absoluto. TABELA 1: Frequência de Codões no gene env do HIV-1 Illb e em genes humanos altamente expressos.

Alto Env Alto Env Ala GC C 53 27 Cys TG C 68 16 T 17 18 T 32 84 A 13 50 G 17 5 Gin CA A 12 55 Arg CG C 37 0 G 88 45 T 7 4 Glu 10 (continuação)

Alto Env Alto Env A 6 0 GA A 25 67 G 21 0 G 75 33 AG A 10 88 G 18 8 Gly GG C 50 6 Asn T 12 13 AA C 78 30 A 14 53 T 22 70 G 24 28 Asp GA C 75 33 His CA C 79 25 T 25 67 Ile T 21 75 AT C 77 25 T 18 31 A 5 44 Leu Ser CT C 26 10 TC C 28 8 T 5 7 T 13 8 A 3 17 A 5 22 G 58 17 G 9 0 TT A 2 30 AG C 34 22 G 6 20 T 10 41 Lys AA A 18 68 Thr AC C 57 20 G 82 32 T 14 22 A 14 51 G 15 7 Pro CC C 48 27 Tyr TA C 74 8 T 19 14 T 26 92 A 16 55 G 17 5 Phe Vai TT C 80 26 GT C 25 12 T 20 74 T 7 9 A 5 62 G 64 18 A frequência de codões foi calculada utilizando o programa GCG criado pelo Grupo de Computação em Genética da Universidade do Wisconsin. Os números representam a 11 percentagem de casos nos quais é utilizado um codão em particular. As frequências de utilização de codões de genes do invólucro de outros isolados do virus HIV-1 são comparáveis e mostram uma preferência semelhante.

Para produzir um gene da gpl20 com capacidade de expressão de nivel elevado em células de mamífero, foi construído um gene sintético codificando o segmento da gpl20 do HIV-1 (syngpl20mn), com base na sequência do subtipo Norte-Americano mais comum, HIV-1 MN (Shaw et ai. 1984; Gallo et ai. 1986). Neste gene sintético da gpl20, a quase totalidade dos codões nativos foi sistematicamente substituída por codões utilizados mais frequentemente em genes humanos altamente expressos (FIG. 1) . Este gene sintético foi montado a partir de oligonucleótidos quimicamente sintetizados com 150 a 200 bases de comprimento. Se forem quimicamente sintetizados oligonucleótidos excedendo 120 a 150 bases, a percentagem de produtos completos pode ser baixa e a grande maioria do material consistir em oligonucleótidos mais curtos. Uma vez que estes fragmentos mais curtos inibem a clonagem e processos da PCR, podem ser muito difíceis de utilizar oligonucleótidos que excedam um determinado comprimento. As misturas de oligonucleótido de cadeia simples foram amplificadas por PCR, antes da clonagem, de forma a utilizar o material de síntese em bruto, sem purificação prévia. Os produtos de PCR foram purificados em géis de agarose e utilizados como moldes no passo de PCR seguinte. Podem ser co-amplifiçados dois fragmentos adjacentes devido à sobreposição das sequências na extremidade de qualquer um dos fragmentos. Estes fragmentos, que se situaram entre 350 e 400 pb de tamanho, foram subclonados num plasmídeo derivado do pCDM7, contendo a sequência líder da molécula CD5 da superfície seguida por um local de clonagem múltipla Nhel/Pstl/Mlul/EcoRl/BamHl. Cada uma 12 das enzimas de restrição neste local de clonagem múltipla representa um local que está presente na extremidade 5' ou 3' dos fragmentos produzidos por PCR. Deste modo, foi montada a totalidade do gpl20 gene pela subclonagem sequencial de cada um dos 4 fragmentos longos. Para cada fragmento, foram subclonados e sequenciados 3 a 6 clones diferentes, antes da montagem. Na FIG. 2 é mostrado um desenho esquemático do método utilizado para a construção do gpl20 sintético. Na FIG. 1 é apresentada a sequência do gene sintético da gpl20 (e de um gene sintético da gpl60, criado utilizando a mesma abordagem). A taxa de mutação foi considerável. As mutações mais frequentemente encontradas eram eliminações curtas (1 nucleótido) e longas (até 30 nucleótidos). Em alguns casos, foi necessário permutar partes, quer por adaptadores sintéticos, quer por elementos de outros subclones sem mutação nessa região em particular. Foram realizados alguns desvios da aderência estrita à utilização de codões optimizados, para acomodar a introdução de locais de restrição no gene resultante, de forma a facilitar a substituição de vários segmentos (FIG. 2) . Estes locais de restrição únicos foram introduzidos no gene em intervalos de, aproximadamente, 100 pb. A sequência líder do HIV nativo foi permutada com o péptido líder altamente eficiente do antigénio CD5 humano, para facilitar a secreção. O plasmídeo utilizado na construção é um derivado do vector de expressão de mamífero pCDM7, transcrevendo o gene inserido sob o controlo de um promotor imediato precoce forte do CMV humano.

Para comparar as sequências codificantes, sintéticas e de tipo selvagem, da gpl20, a sequência codificante sintética da gpl20 foi inserida num vector de expressão de mamífero e testada em ensaios de transfecção transiente. Foram utilizados vários 13 genes diferentes da gpl20 nativa, como controlos para excluir variações nos níveis de expressão, entre os diferentes isolados de vírus e os artefactos induzidos pelas distintas sequências líder. A construção da gpl20 do HIV Illb, utilizada como controlo, foi produzida por PCR, utilizando um fragmento Sall/Xhol do invólucro do HIV 1 HXB2 como molde. Um fragmento Kpnl/Earl contendo, aproximadamente, 1,2 kb do gene, foi permutado com a respectiva sequência do clone proviral, de forma a excluir mutações induzidas por PCR. As construções da gpl20mn de tipo selvagem utilizadas como controlos foram clonadas por PCR, a partir de células C8166 infectadas com HIV-1 MN (AIDS Repository, Rockville, MD) e expressaram a gpl20, quer com um invólucro nativo, quer com uma sequência líder da CD5. Neste caso, uma vez que os clones provirais não se encontravam disponíveis, foram testados dois clones de cada construção, para evitar artefactos de PCR. Os sobrenadantes das células 293T, transfectadas transientemente por co-precipitação com fosfato de cálcio, foram imunoprecipitadas com proteína de fusão CD4:imunoglobulina solúvel e proteína A sepharose, para determinar, semi-quantitativamente, a quantidade de gpl20 secretada.

Os resultados desta análise (FIG. 3) mostram que o produto do gene sintético é expresso num nível muito elevado, em comparação com o dos controlos da gpl20 nativa. 0 peso molecular do gene sintético da gpl20 foi comparável ao das proteínas de controlo (FIG. 3) e pareceu estar na gama entre 100 e 110 kd. A migração ligeiramente mais rápida pode ser explicada pelo facto de, em algumas linhas celulares tumorais, como a 293T, a glicosilação ser, até certo ponto, quer incompleta, quer alterada. 14

Os níveis da proteína gpl20 foram quantificados utilizando um ELISA para a gpl20 com CD4 em fase desmobilizada, de forma a comparar expressão de uma forma mais precisa. Esta análise mostra (FIG. 4) que os dados de ELISA foram comparáveis aos dados de imunoprecipitação, com uma concentração da gpl20 de, aproximadamente, 125 ng/mL para o gene sintético da gpl20 e inferiores a o limite do fundo (5 ng/mL) para todos os genes nativos da gpl20. Deste modo, a expressão do gene sintético da gpl20 parece ser, pelo menos, uma ordem de grandeza mais elevada do que a dos genes da gpl20 de tipo selvagem. Na experiência apresentada o aumento foi de, pelo menos, 25 vezes. 0 Papel da rev na Expressão da gp!20

Uma vez que a rev parece exercer o seu efeito em vários passos da expressão de um transcrito virai, foi testado o possível papel de efeitos não relacionados com a tradução, na expressão melhorada do gene sintético da gpl20. Em primeiro lugar, foram testados os níveis de ARNm citoplasmático, de forma excluir a possibilidade dos elementos de sinais negativos, conferindo, quer degradação aumentada do ARNm, quer retenção nucleica, terem sido eliminados por modificação da sequência nucleotídica. 0 ARN citoplasmático foi preparado por lise com NP40 de células 293T transfectadas transientemente e subsequente eliminação dos núcleos por centrifugação. 0 ARN citoplasmático foi, subsequentemente, preparado a partir dos lisados, através de múltiplas extracções com fenol e precipitação, transferido para nitrocelulose, utilizando um aparelho de transferência em fenda e, finalmente, hibridado com uma sonda específica para o invólucro. 15

Resumidamente, foi isolado ARNm citoplasmático de células 293 transfectadas com CDM&, gpl20 IIIB ou syngpl20, 36 horas após a transfecção. 0 ARN citoplasmático de células Hela infectadas com virus vaccinia de tipo selvagem ou com virus recombinante expressando gpl20 Illb ou o gene sintético da gpl20, encontrava-se sob controlo do promotor 7,5 e foi isolado 16 horas após a infecção. Foram transferidas quantidades iguais para nitrocelulose, utilizando um dispositivo de transferência em fenda e foram hibridadas com fragmentos com 1,5 kb, marcados aleatoriamente, de gpl20IIIb e de syngpl20 ou de beta-actina humana. Os níveis de expressão do ARN foram quantificados através do rastreio das membranas hibridadas com um visualizador de fósforo. Os processos utilizados são descritos abaixo com maior detalhe.

Esta experiência demonstrou que não se verificou qualquer diferença significativa nos níveis de ARNm das células transfectadas, quer com o gene nativo da gpl20, quer com o sintético. De facto, em algumas experiências, o nível do ARNm citoplasmático do gene sintético da gpl20 foi mesmo inferior ao do gene nativo da gpl20.

Estes dados foram confirmados por medição da expressão a partir de vírus vaccinia recombinantes. Foram infectadas células 293 humanas ou células Hela com o vírus vaccinia expressando de gpl20 Illb de tipo selvagem ou syngpl20mn, numa multiplicidade de infecção de, pelo menos, 10. Os sobrenadantes foram recolhidos 24 horas após a infecção e foram imunoprecipitados com proteína de fusão CD4:imunoglobina e proteína A sepharose. Os processos utilizados nesta experiência são descritos abaixo com maior detalhe. 16

Esta experiência demonstrou que a expressão aumentada do gene sintético era ainda observada quando o produto do gene endógeno e o produto do gene sintético foram expressos a partir de vírus vaccinia recombinantes, sob controlo do promotor forte misto precoce e tardio, com 7,5k. Uma vez que os mRNAs do virus vaccinia são transcritos e traduzidos no citoplasma, a expressão aumentada do gene sintético do invólucro, nesta experiência, não pode ser atribuída à exportação melhorada a partir do núcleo. Esta experiência foi repetida em dois tipos de células humanas adicionais, a linha de células 293 de cancro do rim e as células HeLa. Como com células 293T transfectadas, os níveis de ARNm foram semelhantes em células 293 infectadas com qualquer vírus vaccinia recombinante.

Utilização de Codões em Lentivirus

Uma vez que é aparente que a utilização de codões tem um impacto significativo sobre a expressão em células de mamífero, foi examinada a frequência de codões nos genes do invólucro de outros retrovírus. Este estudo não encontrou qualquer padrão evidente de preferência de codões entre os retrovírus em geral. No entanto, se forem separadamente analisados os vírus do género lentivirus, ao qual o HIV-1 pertence, é encontrada uma preferência de utilização de codões quase idêntica à do HIV-1. Foi preparada uma tabela de frequência de codões a partir das glicoproteínas do invólucro de vários retrovírus (predominantemente do tipo C) excluindo lentivirus e foi comparada uma tabela de frequência de codões criada a partir das sequências do invólucro de quatro lentivirus não intimamente relacionados com o HIV-1 (vírus da encefalite da artrite caprina, vírus da anemia infecciosa equina, virus da 17 imunodeficiência felina e vírus visna) (Tabela 2) . 0 padrão de utilização de codões para os lentivírus é surpreendentemente semelhante ao do HIV-1, na totalidade dos casos excepto num, o codão preferido para o HIV-1 é o mesmo do que o codão preferido para outros lentivírus. A excepção é a prolina, a qual é codificada por CCT em 41% dos resíduos do invólucro lentiviral não-HIV e por CCA em 40% dos resíduos, uma situação que, claramente, reflecte, também, uma preferência significativa para o tripleto que termina em A. O padrão de utilização de codões pelas proteínas do invólucro não-lentiviral não apresenta uma predominância semelhante de resíduos A e, igualmente, não é tão enviesado para os resíduos C e G na terceira posição, como é a utilização de codões dos genes humanos altamente expressos. Em geral os retrovírus não-lentivirais parecem explorar os diferentes codões de um modo mais igual, um padrão que estes partilham com genes humanos menos altamente expressos. TABELA 2: Frequência de codões no gene do invólucro de lentivírus (lenti) e retrovírus não-lentivirais (outros). outros Lenti Outros Lenti Ala GC C 45 13 Cys TG C 53 21 T 26 37 T 47 79 A 20 46 G 9 3 Gin CA A 52 69 Arg CG C 14 2 G 48 31 T 6 3 Glu A 16 5 GA A 57 68 G 17 3 G 43 32 AG A 31 51 G 15 26 Gly GG C 21 8 18 (continuação) outros Lenti Outros Lenti Asn T 13 9 AA c 49 31 A 37 56 T 51 69 G 29 26 Asp His GA c 55 33 CA C 51 38 T 51 69 Ile T 49 62 AT C 38 16 T 31 22 A 31 61 Leu Ser CT c 22 8 TC C 38 10 T 14 9 T 17 16 A 21 16 A 18 24 G 19 11 G 6 5 TT A 15 41 AG C 13 20 G 10 16 T 7 25 Lys Thr AA A 60 63 AC C 44 18 G 40 37 T 27 20 A 19 55 Pro G 10 8 CC C 42 14 T 30 41 Tyr A 20 40 TA C 48 28 G 7 5 T 52 72 Phe Vai TT C 52 25 GT C 36 9 T 48 75 T 17 10 A 22 54 G 25 27

A frequência de codões foi calculada utilizando o programa GCG criado pelo Grupo de Computação em Genética da Universidade do Wisconsin. Os números representam a percentagem em que é utilizado um codão em particular. A utilização de codões de retrovirus não-lentivirais foi compilada a partir das sequências do precursor do invólucro do virus da leucemia bovina, do vírus da leucemia felina, do vírus da leucemia de tipo I das células T humanas, do vírus linfotrópico de tipo de II das células T 19 humanas, do isolado do vírus da leucemia murina (MuLV) formador de focos em células de marta, do isolado formador de focos no baço de Rauscher, do isolado 10A1, do isolado 4070A anfotrópico e do isolado do vírus da leucemia mieloproliferativa e do vírus da leucemia do rato, vírus do sarcoma símio, vírus da leucemia de células T de símio, retrovírus leucemogénico T1223/B e vírus da leucemia do gibão. As tabelas de frequência de codões para os lentivírus não-HIV, não-SIV foram compilados a partir das sequências do precursor do invólucro do vírus da encefalite da artrite caprina, vírus da anemia infecciosa equina, vírus de imunodeficiência felina e vírus visna.

Para além da prevalência de codões contendo A, os codões lentivirais aderem ao padrões de forte subrepresentação de CpG do HIV, de forma a que a terceira posição dos tripletos de alanina, prolina, serina e treonina seja raramente G. Os tripletos do invólucro retroviral apresentam uma subrepresentação semelhante, mas menos pronunciada, de CpG. A diferença mais óbvia entre os lentivírus e outros retrovírus, no que respeita à prevalência de CpG reside na utilização da variante CCX de tripletos da arginina, a qual se encontra razoavelmente frequentemente representada entre as sequências codificantes do invólucro retroviral, mas quase nunca está presente entre as sequências lentivírus comparáveis.

Diferenças na Dependência da rev Entre a gp!20 Nativa e Sintética

Para examinar se a regulação pela rev se encontra ligada à utilização de codões do HIV-1, foi investigada a influência da rev na expressão, tanto do gene nativo como do sintético. Uma 20 vez que a regulação pela rev requer o local RRE da ligação da rev em cis, foram produzidas construções nas quais este local de ligação foi clonado na região 3' não traduzida, tanto do gene nativo como do sintético. Estes plasmideos foram co-transfectados em células 293T, com a rev ou com um plasmídeo de controlo em trans e os níveis de expressão da gpl20 foram medidos, semiquantitativamente, nos sobrenadantes, por imunoprecipitação. Os processos utilizados nesta experiência são descritos abaixo com maior detalhe.

Como mostrado nos painéis A e B da FIG. 5, a rev regula positivamente o gene nativo da gpl20, mas não tem qualquer efeito sobre a expressão do gene sintético da gpl20. Deste modo, a acção da rev não é evidente num substrato que não apresenta a sequência codificante de sequências do invólucro virai endógenas.

Expressão de um gene sintético da THY-1 de rato com codões do invólucro do HIV A experiência acima descrita sugere que, de facto, as "sequências do invólucro" tenham que estar presentes para a regulação da rev. Foi preparada uma versão sintética do gene que codifica uma proteína pequena da superfície celular, tipicamente, altamente expressa, o antigénio THY-1 de rato, de forma a testar esta hipótese. A versão sintética do gene da THY-1 de rato foi concebida de forma a ter uma utilização de codões semelhante à da gpl20 do HIV. Na concepção deste gene sintético, foram evitadas as sequências AUUUA, as quais se encontram associadas com a instabilidade do ARNm. Para além disso, foram introduzidos dois locais de restrição para 21 simplificar a manipulação do gene resultante (FIG. 6). Este gene sintético, com a utilização de codões do invólucro do HIV (rTHY-lenv), foi produzido utilizando três oligonucleótidos 150 a 170 meros (FIG. 7). Ao contrário do gene syngpl20mn, os produtos de PCR foram directamente clonados e montados no pUC12 e, posteriormente, clonados no pCDM7.

Os níveis de expressão da rTHY-1 nativa e da rTHY-1 com os codões do invólucro do HIV foram quantificados pela imunofluorescência das células 293T transientemente transfectadas. A FIG. 8 mostra que a expressão do gene nativo da THY-1 situa-se quase duas ordens de grandeza acima do nível de fundo das células transfectadas de controlo (pCDM7). Pelo contrário, a expressão da THY-1 sintética de rato é substancialmente mais baixa do que a do gene nativo (demonstrado pelo deslocamento do pico em direcção a um número mais baixo de canais) .

Foi produzida uma construção na qual o gene rTHY-lenv foi clonado na extremidade 3' do gene sintético da gpl20 (FIG. 9, painel B) , para comprovar que não foram inadvertidamente introduzidos quaisquer elementos de sequência negativos que promovam a degradação do ARNm. Nesta experiência, as células 293T foram transfectadas, quer com o gene syngpl20mn, quer com o gene de fusão syngpl20/THY-l env de rato (syngpl20mn.rTHY-lenv). A expressão foi medida por imunoprecipitação com proteína de fusão CD4:IgG e proteína A agarose. Os processos utilizados nesta experiência são descritos abaixo com maior detalhe.

Uma vez que o gene sintético da gpl20 tem um codão de terminação UAG, a rTHY-lenv não é traduzida a partir deste transcrito. Se na sequência estiverem presentes elementos 22 negativos que confiram uma degradação intensificada, os níveis de proteína gpl20 expressos a partir desta construção devem ser diminuídos, em comparação com a construção syngpl20mn sem rTHY-lenv. 0 painel A da FIG. 9, mostra que a expressão de ambas as construções é semelhante, indicando que a baixa expressão deve estar ligada à tradução.

Expressão dependente da rev do gene sintético da THY-1 de rato com codões do invólucro

Foi realizada uma construção, com um local de ligação da rev na extremidade 3' da a grelha de leitura aberta da rTHYIenv, de forma a averiguar se a rev tem capacidade de regular a expressão de um gene da THY-1 de rato, tendo codões da env. Foram co-transfectadas células 293T humanas com THY-Ienvrre de rato e, quer CDM7, quer pCMVrev, de forma a medir a reactividade à rev de uma construção THY-Ienv de rato, tendo RRE 3' . Às 60 horas após a transfecção, as células foram destacadas com EDTA 1 mM em PBS e foram coradas com o anticorpo monoclonal de murganho OX-7 anti rTHY-1 e um anticorpo secundário conjugado com FITC. A intensidade da fluorescência foi medida utilizando o citofluórometro EPICS XL. Estes processos são descritos abaixo com maior detalhe.

Foi detectado, em experiências repetidas, um ligeiro aumento da expressão da rTHY-lenv, quando a rev foi co- transfectada com o gene da rTHY-lenv. Foi produzida uma construção expressando uma versão secretada da rTHY-lenv, de forma a aumentar, adicionalmente, a sensibilidade do sistema de ensaio. Esta construção deve produzir dados mais fiáveis, uma vez que a quantidade acumulada da proteína secretada no 23 sobrenadante reflecte o resultado da produção de proteína ao longo de um período extenso, em contraste com a proteína expressa à superfície, a qual parece reflectir mais proximamente a taxa de produção actual. Foi preparado, por PCR, um gene com capacidade de expressar uma forma secretada, utilizando iniciadores directos e inversos que emparelham, respectivamente, com a região 3' da sequência líder endógena e com a região 5' do motivo de sequência necessário para a ancoragem do fosfatidilinositol glicano. 0 produto de PCR foi clonado num plasmídeo que já continha uma sequência líder da CD5, produzindo deste modo, uma construção na qual a âncora da membrana foi eliminada e a sequência líder foi permutada com um péptido líder heterólogo (e, provavelmente, mais eficiente). A reactividade à rev da forma secretada da THY-Ienv de rato foi medida por imunoprecipitação de sobrenadantes de células 293T humanas co-transfectadas com um plasmídeo expressando uma forma secretada da THY-Ienv de rato e a sequência da RRE em cis (rTHY-IenvPI-rre) e CDM7 ou pCMVrev. A construção rTHY-IenvPI-RRE foi produzida por PCR, utilizando os oligonucleótidos cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac como iniciador directo e cgcggatcccttgtattttgtactaata a como inverso e a construção sintética rTHY-Ienv como molde. Após digestão com Nhel e Notl, o fragmento de PCR foi clonado num plasmídeo contendo sequências líder da CD5 e RRE. Os sobrenadantes de células marcadas com 35S foram recolhidos 72 horas após a transfecção, precipitados com anticorpo monoclonal 0X7 de murganho contra rTHY-1 e IgG sepharose anti murganho e foram separados por SDS-PAGE redutora a 12%.

Nesta experiência, a indução da rTHY-lenv pela rev foi muito mais evidente e bem definida do que na experiência acima 24 descrita e sugere decididamente que a rev tem capacidade de regular, através da tradução, os transcritos que são suprimidos por codões de baixa utilização.

Expressão independente da rev de uma proteína de fusão rTHY-Ienv:imunoglobulina

Foi produzida uma proteína de fusão rTHY-Ienv:imunoglobulina, para testar se têm que estar presentes codões de baixa utilização ao longo da totalidade da sequência codificante ou se é suficiente uma região curta para conferir reactividade à rev. Nesta construção, o gene rTHY-Ienv (sem o motivo de sequência responsável pela ancoragem de fosfatidilinositol glicano) encontra-se ligado à charneira da IgGl humana, os domínios CH2 e CH3. Esta construção foi produzido por PCR âncora utilizando iniciadores com locais de restrição Nhel e BamHI e rTHY-Ienv como molde. 0 fragmento de PCR foi clonado num plasmídeo contendo a sequência líder da molécula CD5 da superfície e a charneira, as partes CH2 e CH3 da imunoglobulina IgGl humana. Foi, subsequentemente, clonado um fragmento Hind3/Eagl contendo a inserção rTHY-Ienvegl, num plasmídeo derivado do pCDM7 com a sequência RRE.

Foram co-transfectadas células 293T humanas com rTHY-Ienveglrre e com, quer pCDM7, quer pCMVrev, de forma a medir a resposta à rev do gene de fusão rTHY-Ienv/imunoglobina (rTHY-Ienveglrre) . A construção rTHY-Ienveglrre foi realizada por PCR âncora, utilizando iniciadores directos e inversos com, respectivamente locais de restrição Nhel e BamHI. 0 fragmento de PCR foi clonado num plasmídeo contendo um líder da CD5 e a charneira da IgGl humana, os domínios CH2 e CH3. Os sobrenadantes das células marcadas com 35S foram recolhidos 72 25 horas após a transfecção, precipitados com o anticorpo monoclonal 0X7 de murganho contra rTHY-1 e IgG sepharose anti murganho e foram separados por SDS-PAGE redutora 12%. Os processos utilizados são descritos abaixo com maior detalhe.

Como com o produto do gene rTHY-IenvPI-, esta proteína de fusão rTHY-Ienv/imunoglobulina é secretada para o sobrenadante. Deste modo, este gene deve responder à indução pela rev. No entanto, ao contrário da rTHY-IenvPI-, a co-transfecção da rev em trans não induziu de todo ou induziu, apenas, um aumento insignificante da expressão da rTHY-lenvegl. A expressão da proteína de fusão rTHY-1:imunoglobulina com rTHY-1 nativa ou com codões do invólucro do HIV, foi medida por imunoprecipitação. Resumidamente, foram transfectadas células 293T humanas, quer com rTHY-lenvegl (codões da env) ou rTHY-lwtegl (codões nativos). A construção rTHY-lwtegl foi produzida de forma semelhante à utilizada para a construção rTHY-lenvegl, excepto pelo facto de ter sido utilizado um plasmídeo contendo o gene rTHY-1 nativo como molde. Os sobrenadantes das células marcadas com 35S foram recolhidos, 72 horas após a transfecção, precipitados com um anticorpo monoclonal 0X7 de murganho contra rTHY-1 e IgG sepharose anti murganho e foram separados em SDS-PAGE redutora a 12%. Os processos utilizados nesta experiência são descritos abaixo com maior detalhe.

Os níveis de expressão da rTHY-lenvegl foram reduzidos em comparação com os de uma construção semelhante com rTHY-1 de tipo selvagem como parceiro de fusão, mas foram, ainda, consideravelmente mais elevados do que os da rTHY-Ienv.

Consequentemente, ambas as partes da proteína de fusão 26 influenciaram os níveis de expressão. A adição de rTHY-Ienv não restringiu a expressão num nível equivalente ao observado para rTHY-Ienv apenas. Deste modo, a regulação pela rev parece ser ineficaz se a expressão da proteína não se encontrar quase completamente suprimida.

Preferência de codões nos genes do invólucro do HIV-1 A comparação directa entre a frequência de utilização de codões do invólucro do HIV e dos genes humanos altamente expressos, revela uma diferença significativa para a totalidade de todos os vinte aminoácidos. Uma simples medição do significado estatístico desta preferência de codões é a verificação de que de entre os nove aminoácidos com uma degenerescência de codões de duas vezes, o terceiro resíduo favorecido é A ou U na totalidade dos nove. A probabilidade da que a totalidade das nove de duas escolhas igualmente prováveis sejam iguais é de, aproximadamente, 0,004 e, deste modo, por qualquer medida convencional a escolha do terceiro resíduo não pode ser considerada aleatória. São encontrados indícios adicionais de uma preferência de codões enviesada entre os codões mais degenerados, em que pode ser observada uma forte selecção para tripletos que apresentam adenina. Isto contrasta com o padrão para os genes altamente expressos, o qual favorece codões que apresentam C ou, menos frequentemente, G, na terceira posição de codões com uma degenerescência de três ou mais vezes. A permuta sistemática de codões nativos por codões de genes humanos altamente expressos aumentou dramaticamente a expressão de gpl20. Uma análise quantitativa por ELISA mostrou que a expressão do gene sintético foi, pelo menos, 25 vezes mais 27 elevado em comparação com a gpl20 nativa, após a transfecção transiente em células 293 humanas. Os níveis de concentração na experiência de ELISA apresentada, foram bastante baixos. Uma vez que foi utilizado um ELISA para a quantificação, o qual é baseado na ligação da gpl20 à CD4, apenas foi detectado material nativo, não-desnaturado. Isto pode explicar a aparente baixa expressão. A medição dos níveis do ARNm citoplasmático demonstraram que a diferença na expressão das proteínas é devida a diferenças de tradução e não à estabilidade do ARNm.

Os retrovirus, em geral, não apresentam uma preferência semelhante para A e T, como a encontrada para o HIV. No entanto, quando esta família foi dividida em dois subgrupos, lentivírus e retrovirus não-lentivirais, foi detectada uma preferência semelhante para A e, menos frequentemente, para T, na terceira posição dos codões de lentivírus. Deste modo, os indícios disponíveis sugerem que os lentivírus retenham um padrão característico de codões do invólucro, não devido a uma vantagem inerente à transcrição reversa ou à replicação desses resíduos, mas antes devido a qualquer razão característica da fisiologia daquela classe de vírus. A diferença principal entre lentivírus e retrovirus não complexos reside nos genes reguladores e acessórios não essenciais adicionais dos lentivírus, como já referido. Deste modo, uma explicação simples para a restrição da expressão do invólucro poderia consistir num importante mecanismo regulador de uma destas moléculas adicionais ser baseado neste. De facto, é conhecido que uma destas proteínas, a rev, tem, muito provavelmente, homólogos em todos os lentivírus. Deste modo a utilização de codões no ARNm virai é utilizado para criar uma classe de transcritos que é susceptível à acção estimuladora da rev. Esta hipótese foi comprovada utilizando uma estratégia semelhante como anteriormente, mas, neste caso, a 28 utilização de codões foi modificada na direcção inversa. A utilização de codões de um gene celular altamente expresso foi substituída pela dos codões mais frequentemente utilizados no invólucro do HIV. Como assumido, os níveis de expressão foram consideravelmente mais baixos, em comparação com a molécula nativa, quase duas ordens de grandeza quando analisados por imunofluorescência da molécula expressa à superfície (ver 4.7). Quando a rev foi co-expressa em trans e se encontrava presente um elemento RRE em cis foi observada, apenas, uma ligeira indução para a molécula da superfície. No entanto, quando a THY-1 foi expressa sob a forma de uma molécula secretada, a indução pela rev foi muito mais proeminente, apoiando a hipótese anteriormente referida. Isto pode ser, provavelmente, explicado pela acumulação de proteína secretada no sobrenadante, que amplifica, consideravelmente, o efeito da rev. Se a rev induzir, apenas, um aumento pouco significativo das moléculas da superfície, de um modo geral, a indução do invólucro do HIV pela rev não pode ter o objectivo de uma abundância aumentada à superfície, mas antes de um nível da gpl60 intracelular aumentado. De momento, é completamente pouco evidente que este deva ser o caso.

Foram produzidas proteínas de fusão rTHYlenv:imunoglobulina, nas quais apenas cerca de um terço do gene total apresentava a utilização de codões do invólucro, de forma a testar se elementos pequenos subtotais de um gene são suficientes para restringir a expressão e torná-la dependente da rev. Os níveis de expressão desta construção situaram-se num nível intermédio, indicando que o elemento da sequência rTHY-Ienv negativa não é dominante sobre a parte imunoglobulina. Esta proteína de fusão não foi ou foi apenas ligeiramente 29 reactiva à completamente rev, indicando suprimidos podem que apenas ser reactivos à os rev. genes quase

Outra caracteristica distintiva que foi encontrada nas tabelas de frequência de codões é significativa subrepresentação de tripletos CpG. Num estudo comparativo da utilização de codões em E. coli, levedura, drosophila e primatas foi demonstrado que, num número elevado de genes de primata analisados, os 8 codões menos utilizados contêm todos os codões com a sequência dinucleotidica CpC. Foi, igualmente, verificado o evitamento de codões contendo este motivo dinucleotídico na sequência de outros retrovirus. Parece ser plausível que o motivo para a subrepresentação de tripletos apresentando CpG está relacionado com o evitamento de silenciamento de genes por metilação das citosinas do CpG. 0 número esperado de dinucleótidos CpC para o HIV, no seu conjunto, é cerca de um quinto do esperado, com base na composição em, bases. Isto poderia indicar que é restabelecida a possibilidade de expressão elevada e que, de facto, o gene tem que ser altamente expresso em algum momento durante a patogénese virai.

Os resultados aqui apresentados indicam, claramente, que a preferência de codões tem um efeito severo sobre os níveis de proteína e sugerem que o alongamento da tradução esteja a controlar a expressão génica nos mamíferos. No entanto, esse papel pode ser desempenhado por outros factores. Em primeiro lugar, abundância de mRNAs não maximamente presentes em células eucariotas, indica que a iniciação é limitante da velocidade da tradução em, pelo menos, alguns casos, uma vez que, de outra forma, a totalidade dos transcritos seria completamente abrangida pelos ribossomas. Para além disso, se o mecanismo consistir na paragem dos ribossomas e na subsequente degradação 30 do ARNm, a supressão por codões raros pode, muito provavelmente, não ser invertida por qualquer mecanismo requlador, como o aqui apresentado. Uma explicação possível para a influência, tanto da iniciação, como do alonqamento, sobre a actividade de tradução, consiste na taxa de iniciação ou de acesso aos ribossomas, ser controlada, parcialmente, por sinais distribuídos ao longo do ARN, de forma a que os codões lentivirais predisponham o ARN a acumular-se numa mistura de ARNs deficientemente iniciados. No entanto, não é necessário que esta limitação seja cinética; por exemplo, a escolha de codões pode influenciar a probabilidade de um determinado produto de tradução, uma vez iniciado, ser adequadamente concluído. De acordo com este mecanismo, a abundância de codões menos favorecidos poderá implicar uma significativa probabilidade cumulativa de fracasso na conclusão da cadeia polipeptídica nascente. 0 ARN sequestrado seria, então, fornecido de uma taxa de iniciação melhorada por acção da rev. Uma vez que os resíduos de adenina são abundantes nos transcritos reactivos à rev, é possível que a metilação da adenina do ARN medeie esta supressão da tradução.

Processos Detalhados

Foram utilizados os seguintes processos nas experiências acima descritas.

Análise das Sequências

Nas análises das sequências, foi utilizado o programa informático desenvolvido pelo Grupo de Computação da

Universidade do Wisconsin. 31

Construções plasmídicas

Foram utilizados os métodos seguintes nas construções plasmídicas. Os vectores e a inserção de ADN foram digeridos numa concentração de 0,5 pg/10 pL no tampão de restrição

adequado durante 1-4 horas (volume total de reacção de, aproximadamente, 30 pL) . O vector digerido foi tratado com 10% (v/v) de fosfatase alcalina de intestino de vitelo 1 pg/mL durante 30 min, antes da electroforese em gel. Tanto o vector como as digestões das inserções (5 a 10 pL cada) foram separados num gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5%, com tampão TAE. As faixas de gel contendo as bandas de interesse foram transferidas para um tubo de reacção de 1,5 mL, fundidas a 65 °C e adicionadas, directamente, à ligação sem remoção da agarose. As ligações foram tipicamente realizadas num volume total de 25 pL em Tampão Baixo lx Adições de Ligação lx com 200-400 U de ligase, 1 pL de vector e 4 pL de inserção. Quando necessário, as extremidades 5' protuberantes foram preenchidas, pela adição de 1/10 volume de dNTPs 250 pM e 2-5 U de polimerase de Klenow, a digestões inactivadas pelo calor ou extraídas com fenol e incubando durante, aproximadamente, 20 min à temperatura ambiente. Quando necessário, as extremidades 3' protuberantes foram preenchidas, pela adição de 1/10 volume de dNTPs 2,5 mM e 5-10 U de polimerase de ADN de T4, a digestões inactivadas pelo calor ou extraídas com fenol, seguidos pela incubação a 37 °C, durante 30 min. Foram utilizados os seguintes tampões nestas reacções: tampão Baixo lOx (Tris HC1 60 mM, pH 7,5, MgCl2 60 mM, NaCl 50 mM, BSA 4 mg/mL, β-mercaptoetanol 70 mM, NaN3 0,02%); tampão Médio lOx (Tris HC1 60 mM, pH 7,5, MgCl2 60 mM, NaCl 50 mM, BSA 4 mg/mL, β-mercaptoetanol 70 mM, NaN3 0,02%); tampão 32

Elevado 10x (Tris HC1 60 mM, pH 7,5, MgCl2 60 mM, NaCl 50 mM, BSA 4 mg/mL, β-mercaptoetanol 70 mM, NaN3 0,02%); adições de Ligação ΙΟχ (ATP 1 mM, DTT 2 0 mM, BSA 1 mg/mL, espermidina 10 mM) ; TAE 50x (Tris acetato 2 M, EDTA 50 mM). Síntese de Oligonucleótidos e purificação

Os oligonucleótidos foram produzidos num sintetizador Milligen 8750 (Millipore) . As colunas foram eluídas com 1 mL de hidróxido de amónio a 30% e os oligonucleótidos eluídos foram desbloqueados a 55 °C, durante 6 a 12 horas. Após o desbloqueamento, foram precipitados 150 pL de oligonucleótidos com um volume de n-butanol insaturado lOx em tubos de reacção de 1,5 mL, seguidos pela centrifugação a 15000 rpm numa microcentrífuga. O sedimento foi lavado com o etanol a 70% e ressuspenso em 50 pL de H20. A concentração foi determinada pela medição da densidade óptica a 2 60 nm numa diluição de 1:333 (1 OD26o = 30 pg/mL) .

Foram utilizados os seguintes oligonucleótidos para a construção do gene sintético da gpl20 (a totalidade das sequências apresentadas neste texto estão na direcção 5' a 3' ) · oligonucleótido 1 directo (Nhel) : cgc ggg cta gcc acc gag aag ctg (SEQ id N°: 1) . oligonucleótido 1: acc gag aag ctg tgg gtg acc gtg tac tac ggc gtg ccc gtg tgg aag ag ag gcc acc acc acc ctg ttc tgc gcc age gac gcc aag gcg tac gac acc gag gtg cac aac gtg tgg gcc acc cag gcg tgc gtg ccc acc gac ccc aac ccc cag

gag gtg gag ctc gtg aacgtg acc gag aac ttc aac atg (SEQ ID N°: 2) . 33 oligonucleótido 1 inverso: Cca cca tgt tgt tct tcc aca tgt tga agt tct c (SEQ ID N°: 3) . oligonucleótido 2 directo: gac cga gaa ctt caa cat gtg gaa gaa caa cat (SEQ ID N°: 4) . oligonucleótido 2: tgg aag aac aac atg gtg gag cag atg cat gag gac ate ate age ctg tgg gac cag age ctg aag ccc tgc gtg aag ctg acc cc ctg tgc gtg acc tg aac tgc acc gac ctg agg aac acc acc aac acc aac ac age acc gee aac aac aac

age aac age gag ggc acc ate aag ggc ggc gag atg (SEQ ID ........ 5). ' oligonucleótido 2 inverso (Pstl) : gtt gaa gct gea gtt ctt cat etc gee gee ctt (SEQ ID N°: 6) . oligonucleótido 3 directo (Pstl) : gaa gaa ctg cag ctt caa cat cac cac cag c (SEQ ID N°: 7). oligonucleótido 3 aac ate acc acc age ate ege gac aag atg cag aag gag tac gee ctg ctg tac aag ctg gat ate gtg age ate gac aac gac age acc age tac ege ctg ate tcc tgc aac acc age gtg ate acc cag gee tgc ccc aag ate age ttc gag ccc ate ccc ate cac tac tgc gee ccc gee ggc ttc gee (SEQ ID N°: 8). oligonucleótido 3 inverso: gaa ctt ctt gtc ggc ggc gaa gee ggc ggg (SEQ ID N°: 9) . oligonucleótido 4 directo: gcg ccc ccg ccg gct teg cca tcc tga agt gea acg aca aga agt te (SEQ ID N°: 10) 34 oligonucleótido 4: gcc gac aag aag ttc age ggc aag ggc age tgc aag aac gtg age acc gtg cag tgc acc cac ggc ate cgg ccg gtg gtg age acc cag etc ctg ctg aac ggc age ctg gcc gag gag gag gtg gtg ate ege age gag aac ttc acc gac aac gcc aag acc ate ate gtg cac ctg aat gag age gtg cagate (SEQ ID N°: 11) oligonucleótido 4 inverso (Mlul) : agt tgg gac gcg tgc agt tga tet gea ege tet c (SEQ ID N°: 12). oligonucleótido 5 directo (Mlul) : gag age gtg cag ate aac tgc acg cgt ccc (SEQ ID N°: 13) . oligonucleótido 5: aac tgc acg cgt ccc aac tac aac aag ege aag ege ate cac ate ggc ccc ggg ege gcc ttc tac acc acc aag aac ate ate ggc acc ate etc cag gcc cac tgc aac ate tet aga (seq id n°: 14). oligonucleótido 5 inverso: gtc gtt cca ctt ggc tet aga gat gtt gea (SEQ id n°: 15). oligonucleótido 6 directo: gea aca tet cta gag cca agt gga acg ac (SEQ ID N°: 16). oligonucleótido 6 gcc aag tgg aac gac acc ctg ege cag ate gtg age aag ctg aag gag cag ttc aag aac aag acc ate gtg ttc ac cag age age ggc ggc gac ccc gag ate gtg atg cac age ttc aac tgc ggc ggc (SEQ id N°: 17) . oligonucleótido 6 inverso (EcoRl) : gea gta gaa gaa ttc gcc gcc gea gtt ga (SEQ ID N°: 18). 35 oligonucleótido 7 directo (EcoRl) : tca act gcg gcg gcg aat tct tct act gc (seq id n° : 19). oligonucleótido 7: ggc gaa ttc ttc tac tgc aac acc age ccc ctg ttc aac age acc tgg aac ggc aac aac acc tgg aac aac acc acc ggc age aac aac aat att acc etc cag tgc aag ate aag cag ate ate aac atg tgg cag gag gtg ggc aag gee atg tac gee ccc ccc ate gag ggc cag ate cgg tgc age age (seq ID N°: 20). oligonucleótido 7 inverso: gea gac cgg tga tgt tgc tgc tgc acc gga tct ggc cct c (SEQ id N°: 21) . oligonucleótido 8 directo: cga ggg cca gat ccg gtg cag cag caa cat cac cgg tct g (SEQ ID N°: 22). oligonucleótido 8: aac ate acc ggt ctg ctg ctg acc ege gac ggc ggc aag gac acc gac acc aac gac acc gaa ate ttc ege ccc ggc ggc ggc gac atg ege gac aac tgg aga tct gag ctg tac aag tac aag gtg gtg acg ate gag ccc ctg ggc gtg gee ccc acc aag gee aag ege ege gtg gtg cag ege gag aag ege (SEQ ID N°: 23). oligonucleótido 8 inverso (Notl) : ege ggg cgg ccg ctt tag ege ttc teg ege tgc acc ac (seq id n°: 24).

Foram utilizados os seguintes oligonucleótidos na construção do gene THY-Ienv de rato. 36 oligonucleótido 1 directo (BamHl/Hind3): cgc ggg gga tcc aag ctt acc atg att cca gta ata agt (SEQ id N°: 25). oligonucleótido 1: atg aat cca gta ata agt ata aca tta tta tta agt gta tta caa atg agt aga gga caa aga gta ata agt tta aca gca tct tta gta aat caa aat ttg aga tta gat tgt aga cat gaa aat aat aca aat ttg cca ata caa cat gaa ttt tca tta acg (SEQ ID N° : 26) . oligonucleótido 1 inverso (EcoRl/Mlul) : cgc ggg gaa ttc acg cgt taa tga aaa ttc atg ttg (SEQ ID N°: 27) . oligonucleótido 2 directo (BamHl/Mlul) : cgc gga tcc acg cgt gaa aaa aaa aaa cat (SEQ ID N°: 28). oligonucleótido 2: cgt gaa aaa aaa aaa cat gta tta agt gga aca tta gga gta cca gaa cat aca tat aga agt aga gta aat ttg ttt agt gat aga ttc ata aaa gta tta aca tta gca aat ttt aca aca aaa gat gaa gga gat tat atg tgt gag (SEQ id N° : 29) . oligonucleótido 2 inverso (EcoRl/Sacl) : Cgc gaa ttc gag ctc aca cat ata ate tcc (seq id n°: 30) . oligonucleótido 3 directo (BamHl/Sacl) : cgc gga tcc gag ctc aga gta agt gga caa (SEQ id N°: 31). oligonucleótido 3: ctc aga gta agt gga caa aat cca aca agt agt aat aaa aca ata aat gta ata aga gat aaa tta gta aaa tgt ga gga ata agt tta tta gta caa aat aca agt tgg tta ttatta tta tta tta agt tta agtttt ttacaa gca aca gat ttt ata agt tta tga (seq id N°: 32). 37 oligonucleótido 3 inverso (EcoRl/Notl) : cgc gaa ttc gcg gcc gct tca taa act tat aaa ate (SEQ ID N°: 33) .

Reacção em Cadeia da Polimerase

Foram utilizados oligonucleótidos curtos, sobreponiveis 15 a 25 meros, emparelhando em ambas as extremidades, para amplificar os oligonucleótidos longos, através da reacção em cadeia da polimerase (PCR). As condições típicas de PCR foram: 35 ciclos, temperatura de emparelhamento de 55 °C, tempo de extensão de 0,2 seg. Os produtos de PCR foram purificados em gel, extraídos com fenol e utilizados numa PCR subsequente, para produzir fragmentos mais longos, consistindo em dois fragmentos pequenos adjacentes. Estes fragmentos mais longos foram clonados num plasmídeo derivado do CDM7, contendo uma sequência líder da molécula CD5 da superfície, seguida pelo local de clonagem múltipla Nhel/Pstl/MluI/EcoRl/BamHl.

Nestas reacções foram utilizadas as seguintes soluções: tampão de PCR lOx (KC1 500 mM, Tris HC1 100 mM, pH 7,5, MgCl2 8 mM, dNTP 2 mM cada). O tampão final foi suplementado com DMSO a 10%, para aumentar a fidelidade da polimerase Taq.

Preparação de ADN em pequena escala

As bactérias transformadas foram cultivadas em culturas de 3 mL de LB, durante mais de 6 horas ou durante a noite. Foram transferidos, aproximadamente, 1,5 mL de cada cultura para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, centrifugados durante 20 segundos, 38 para sedimentar as células e ressuspensos em 200 pL de solução I. Subsequentemente, foram adicionados 400 pL da solução II e 300 pL da solução III. Os tubos de microcentrífuga foram fechados, misturados e centrifugados durante >30 seg. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos e extraídos uma vez com fenol. O ADN foi precipitado enchendo os tubos com isopropanol, misturando e centrifugando numa microcentrífuga durante >2 min. Os sedimentos foram lavados em etanol a 70% e ressuspensos em 50 pL de dlRO contendo 10 pL de ARNase A. Nestes processos foram utilizados os seguintes meios e soluções: meio LB (NaCl a 1,0%, extracto de levedura a 0,5%, triptona a 1,0%); solução I (EDTA 10 mM, pH 8,0); solução II (NaOH 0,2 M, SDS 1,0%); solução III (KOAc 2,5 M, ácido acético glacial 2,5 M) ; fenol (pH ajustado para 6,0, coberto por TE); TE (Tris HC1 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0).

Preparação de ADN em grande escala

Foram cultivadas culturas de um litro de bactérias transformadas, 24 a 36 horas (MC1061p3 transformada com derivados do pCDM) ou 12 a 16 horas (MC1061 transformada com derivados do pUC), a 37 °C, quer em meio bacteriano M9 (derivados do pCDM), quer em LB (derivados do pUC). As bactérias foram centrifugadas em garrafas de 1 litro utilizando uma centrífuga Beckman J6 a 4200 rpm, durante 20 min. O sedimento foi ressuspenso em 40 mL da solução I. Subsequentemente, foram adicionados 80 mL da solução II e 40 mL da solução III e as garrafas foram agitadas semivigorosamente, até se formarem pedaços com um tamanho de 2 a 3 mm. A garrafa foi centrifugada a 4200 rpm durante 5 min e o sobrenadante foi passado através de gaze numa garrafa de 250 mL. Foi adicionado isopropanol ao cimo 39 e a garrafa foi centrifugada a 4200 rpm durante 10 min. o sedimento foi ressuspenso em 4,1 mL de solução I e adicionado de 4,5 g de cloreto de césio, 0,3 mL de brometo de etidio 10 mg/mL e 0,1 mL de uma solução de Triton X100 a 1%. Os tubos foram centrifugados numa centrífuga Beckman J2 de velocidade elevada a 10000 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi transferido para tubos de ultracentrífuga Beckman Quick Seal, os quais foram, seguidamente, selados e centrifugados numa ultracentrifuga Beckman utilizando o rotor NVT90 de ângulo fixo a 80000 rpm, durante >2,5 horas. A banda foi extraída à luz visível, utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de medida 20. Foi adicionado um volume igual de dH20 ao material extraído. O ADN foi extraído uma vez com n-butanol saturado com cloreto de sódio 1 M, seguido pela adição de um volume igual de acetato de amónio 10 M/EDTA 1 mM. O material foi transferido para um tubo de 13 mL de fecho rápido, o qual foi, seguidamente, cheio até ao cimo com etanol absoluto, misturado e centrifugado numa centrífuga Beckman J2 a 10000 rpm, durante 10 min. o sedimento foi lavado com etanol a 70% e ressuspenso em 0,5 a 1 mL de H2O. A concentração do ADN foi determinada pela medição da densidade óptica a 260 nm, numa diluição de 1:200 (1 OD260 = 50 pg/mL) .

Nestes processos foram utilizados os seguintes meios e tampões: meio bacteriano M9 (10 g de sais M9, 10 g de casaminoácidos (hidrolizados), 10 mL de adições de M9, tetraciclina 7,5 pg/mL (500 pL de uma solução de armazenamento 15 mg/mL), ampicilina 12,5 pg/mL (125 pL de uma solução de armazenamento de 10 mg/mL); adições de M9 (CaCl2 10 mM, MgS04 100 mM, tiamina 200 pg/mL, glicerol a 70%); meio LB (NaCl a 1,0%,

extracto de levedura a 0,5%, triptona a 1,0%); Solução I (EDTA 10 mM, pH 8,0); Solução II (NaOH 0,2 M, SDS a 1,0%); Solução III (KOAc 2,5 M, HOAc 2,5 M) 40

Sequenciação

Os genes sintéticos foram sequenciados pelo o método dos didesoxinucleótidos de Sanger. Resumidamente, foram desnaturados 20 a 50 pg de ADN plasmídico de cadeia dupla em NaOH 0,5 M, durante 5 min. Subsequentemente, o ADN foi precipitado com 1/10 de volume de acetato de sódio (pH 5,2) e 2 volumes de etanol e centrifugado durante 5 min. O sedimento foi lavado com etanol a 70% e ressuspenso numa concentração de 1 pg/pL. A reacção de emparelhamento foi realizada com 4 pg de ADN molde e 40 ng de iniciador em tampão de emparelhamento lx, num volume final de 10 pL. A reacção foi aquecida a 65 °C e arrefecida, lentamente, até 37 °C. Num tubo separado foram adicionados 1 pL de DTT 0,1 M, 2 pL de mistura de marcação, 0,75 pL de dfbO, 1 pL de [35S]dATP (10 pCi) e 0,25 pL de Sequenase™ (12 U/pL) , para cada reacção. Foram adicionados cinco destes seis pL a cada tubo com iniciador-molde emparelhados e foram incubados durante 5 minutos à tempreratura ambiente. Para cada reacção de marcação, foram adicionados 2,5 pL de cada uma das 4 misturas de terminação, numa placa de Terasaki e foram pré-aquecidas a 37°C. No final do período de incubação, foram adicionados 3,5 pL de reacção de marcação a cada uma das 4 misturas de terminação. Após 5 min, foram adicionados 4 pL de solução de terminação a cada reacção e a placa de Terasaki foi incubada a 80°C, durante 10 min, num forno. As reacções de sequenciação foram separadas em gel de poliacrilamida desnaturante a 5%. Foi preparada uma solução de acrilamida, pela adição de 200 mL de tampão TBE lOx e 957 mL de dH20 a 100 g de acrilamida:bisacrilamida (29:1). Foi preparado um gel de poliacrilamida a 5%, ureia a 46% e TBE lx combinando 38 mL de solução de acrilamida e 28 g de ureia. A polimerização foi 41 iniciada pela adição de 400 pL de peroxodissulfato de amónio a 10% e 60 pL de TEMED. Os géis foram vertidos utilizando placas de vidro silanizado e pentes de dentes de tubarão e forma separados em tampão TBE lx a 60 a 100 W, durante 2 a 4 horas (dependendo da região a ser lida). Os géis foram transferidos para papel de transferência Whatman, secos a 80°C, durante cerca de 1 hora e expostos a película de raios-x, à temperatura ambiente. Tipicamente, o tempo de exposição foi de 12 horas. Nestes processos foram utilizadas as seguintes soluções: 5x Tampão de emparelhamento (Tris HC1 200 mM, pH 7,5, MgCl2 100 mM, NaCl 250 mM) ; Mistura de Marcação (7,5 pM cada dCTP, dGTP e dTTP); Misturas de Terminação (80 pM cada dNTP, NaCl 50 mM, 8 pM ddNTP (um cada)); Solução de Terminação (formamida a 95%, EDTA 20 mM, azul bromofenol a 0,05%, xilenocianol a 0,05%); TBE 5x (Tris borato 0,9 M, EDTA 20 mM) ; solução de poliacrilamida (96,7 g de poliacrilamida, 3,3 g de bisacrilamida, 200 mL de TBE lx, 957 mL de df^O) .

Isolamento do ARN O ARN citoplasmático foi isolado a partir de células 293T transfectadas com fosfato de cálcio, 36 horas após a transfecção e de células Hela infectadas com vaccinia 16 horas após a infecção, essencialmente como descrito por Gilman. (Gilman, Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. Em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Wiley & Sons, Nova Iorque, 1992). Resumidamente, as células foram lisadas em 400 pL de tampão de lise, os núcleos foram eliminados por centrifugação e foram adicionados SDS e proteinase K, respectivamente, a 0,2% e 0,2 mg/mL. Os extractos citoplasmáticos foram incubados a 37 °C, durante 20 min, 42 extraídos duas vezes com fenol/clorofórmio e precipitados. 0 ARN foi dissolvido em 100 pL de tampão I e foi incubado a 37 °C, durante 20 min. A reacção foi terminada adicionando 25 pL de tampão de terminação e foi novamente precipitada.

Neste processo foram utilizadas as seguintes soluções: Tampão de Lise (TE contendo Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, NP40 a 0,5%); Tampão I (tampão TE com MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, inibidor de ARNase de placenta 0,5 U/pL, ADNase I isenta de ARNase 0,1 U/pL); Tampão de inactivação a (EDTA 50 mM NaOAc 1,5 M, SDS 1,0%).

Análise de transferência em fenda

Para a análise de transferência em fenda, foram dissolvidos 10 pg do ARN citoplasmático em 50 pL de dfbO, aos quais foram adicionados 150 pL de SSC 1 Ox/f ormaldeído a 18%. O ARN solubilizado foi, seguidamente, incubado a 65 °C, durante 15 min e transferido para um aparelho de transferência em fenda. Foram utilizadas os sondas marcadas radioactivamente com os fragmentos com 1,5 kb de gpl20IIIb e de syngpl20mn na hibridação. Cada um dos dois fragmentos foi marcado aleatoriamente numa reacção de 50 pL com 10 pL de tampão de marcação de oligonucleótidos 5x, 8 pL de BSA 2,5 mg/mL, 4 pL de a[32p]-dCTP (20 pCi/L; 6000 Ci/mmol) e 5 U de fragmento de Klenow. Após uma incubação de 1 a 3 horas a 37 °C, foram adicionados 100 pL de TE e o a[32p]-dCTP não incorporado foi eliminado utilizando uma coluna de centrifugação gG50. A actividade foi medida num contador beta Beckman e foram utilizadas actividades específicas iguais na hibridação. As membranas foram pré-hibridadas durante 2 horas e hibridadas durante 12 a 24 horas a 42 °C, com 0,5 x 106 cpm de 43 sonda por mL de fluido de hibridação. A membrana foi lavada duas vezes (5 min) com tampão I de lavagem à temperatura ambiente, durante uma hora em tampão II de lavagem a 65 °C e, seguidamente, foi exposta a película de raios-x. Foram obtidos resultados semelhantes, utilizando o fragmento Notl/Sfil do pCDM7 com 1,1 kb, contendo a região 3 não traduzida. Foram realizadas, paralelamente, hibridações de controlo com uma sonda de beta-actin humana marcada aleatoriamente. A expressão do ARN foi quantificada através do rastreio das membranas de nitrocelulose hibridadas, com um visualizador de fósforo Magnetic Dynamics.

Neste processo foram utilizadas as seguintes soluções: 5x de tampão de marcação de oligonucleótidos (Tris HC1 250 mM , pH 8,0 , MgCl2 25 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, dATP 2 mM, dGTP 2 mM, dTTP 2 mM, Hepes 1 M, pH 6,6, hexanucleótidos [dNTP]6 1 mg/mL); Solução de Hibridação (_M fosfato de sódio, NaCl 250 mM, SDS a 7%, EDTA 1 mM, sulfato de dextrano a 5%, formamida a 50%, ADN de esperma de salmão desnaturado 100 pg/mL); Tampão I de lavagem (SSC 2x, SDS a 0,1%); Tampão II de lavagem (SSC 0,5x, SDS a 0,1%); SSC 20x (NaCl 3 M, citrato de Na3 0,3 M, pH ajustado para 7,0).

Recombinação de vaccinia A recombinação de vaccinia utilizou uma modificação do método descrito por Romeo e Seed (Romeo e Seed, Cell, 64: 1037, 1991). Resumidamente, foram infectadas células CV1, numa confluência de 70 a 90%, com 1 a 3 pL de um armazenamento de vaccinia de tipo selvagem WR (2 x 108 pfu/mL), durante 1 hora, em 44 meio de cultura sem soro de vitelo. Após 24 horas, as células foram transfectadas com fosfato de cálcio, com 25 pg de ADN de plasmideo TKG por placa. Após 24 a 48 horas adicionais, as células foram raspadas da placa, centrifugadas e ressuspensas num volume de 1 mL. Após 3 ciclos de congelação/descongelação, foi adicionada tripsina 0,05 mg/mL e os lisados foram incubados durante 20 min. Foi utilizada uma diluição seriada de 10, 1 e 0,1 pL, deste lisado, para infectar placas pequenas (6 cm) de células CV1, que tinham sido pré-tratadas com 12,5 pg/mL de ácido micofenólico, xantina 0,25 mg/mL e hipoxantina 1,36 mg/mL, durante 6 horas. As células infectadas foram cultivadas durante 2 a 3 dias e, subsequentemente, coradas com o anticorpo monoclonal NEA9301 contra a gpl20 e um anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina. As células foram incubadas com NBT 0,33 mg/mL e BCIP 0,16 mg/mL em tampão AP e, finalmente, cobertas com agarose a 1% em PBS. Foram seleccionadas as placas positivas e foram ressuspensas em 100 pL de Tris pH 9,0. A purificação das placas foi, novamente, repetida. Foi lentamente aumentada a escala da infecção, de forma a produzir armazenamentos de titulo mais elevado. Finalmente, foi infectada uma placa grande com células Hela, com metade do virus da sessão anterior. As células infectadas foram destacadas em 3 mL de PBS, lisadas com um homogenizador de Dounce e libertadas dos detritos maiores por centrifugação. Os armazenamentos VPE-8 de vaccinia recombinantes foram gentilmente cedidos pelo AIDS repository, Rockville, MD e expressam a gpl20 do HIV 1 IIIB, sob o controlo do promotor 7,5 misto, precoce/tardio (Earl et al., J. Virol., 65:31, 1991). As células foram infectadas numa multiplicidade de infecção de, pelo menos, 10, na totalidade das experiências com vaccina recombinante. 45

Neste processo foi utilizada a seguinte solução: Tampão AP (Tris HC1 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM)

Cultura celular

As linhas CV1 e Cos7 de células de carcinoma do rim de macaco, a linha de células 2 93T do carcinoma do rim humano e a linha de células Hela do carcinoma do cérvix humano, foram obtidas da American Tissue Typing Collection e mantidas em IMDM suplementado. Estas foram mantidas em placas de cultura de tecidos com 10 cm e, tipicamente, foram divididas 1:5 a 1:20 cada 3 a 4 dias. Neste processo foi utilizado o seguinte meio: IMDM suplementado (Meio de Dulbecco modificado de Iscove a 90%, soro de vitelo a 10%, suplementado com ferro, inactivado pelo calor 30 min a 56 °C, L-glutamina 0,3 mg/mL, gentamicina 25 pg/mL β-mercaptoetanol 0,5 mM (pH ajustado com 0,5 mL de NaOH 5 M)).

Transfecção A transfecção com fosfato de cálcio das células 293T foi realizada pela adição lenta e sob vórtice de 10 pg de ADN plasmidico em 250 pL de CaCl2 0,25 M, ao mesmo volume de tampão HEBS 2x sob vórtice. Após incubação durante 10 a 30 min à temperatura ambiente, o ADN precipitado foi adicionado a uma pequena placa com células confluentes a 50 a 70%. Nas experiências de co-transfecção com a rev, as células foram transfectadas com 10 pg de gpl20IIIb, gpl20IIIbrre, 46 syngpl20mnrre ou rTHY-Ienveglrre e 10 gg de ADN do pCMVrev ou do plasmideo CDM7.

Neste processo foram utilizadas as seguintes soluções: tampão HEBS 2x (NaCl 280 mM, KC1 10 mM, esterilizado por filtração 1,5 mM) ; CaCl2 0,25 mM (autoclavado) .

Imunoprecipitação O meio foi renovado, após 48 a 60 horas e as células foram incubadas durante 12 horas adicionais em meio isento de Cys/Met contendo 200 gCi de transmarcação de 35S. Os sobrenadantes foram recolhidos e centrifugados durante 15 min a 3000 rpm, para remover os detritos. Após a adição dos inibidores de proteases leupeptina, aprotinina e PMSF, respectivamente, a 2,5 gg/mL, 50 gg/mL, 100 pg/mL, foi incubado 1 mL do sobrenadante guer com 10 pL de proteína A sepharose empacotada apenas (rTHY-Ienveglrre) ou com proteína A sepharose e 3 mg de uma proteína de fusão CD4/imunoglobulina purificada (gentilmente cedida por Behring) (a totalidade das construções da gpl20) a 4 °C, durante 12 horas num rotor. Subsequentemente, as esferas de proteína A foram lavadas 5 vezes durante 5 a 15 min cada vez. Após a lavagem final foram adicionados 10 pL contendo tampão de aplicação, as amostras foram fervidas durante 3 min e aplicadas em géis de poliacrilamida com SDS a 7% (a totalidade das construções da gpl20) ou 10% (rTHY-Ienveglrre) (tampão TRIS pH 8,8 no gel de separação, tampão TRIS pH 6,8 no de empacotamento, tampão de separação TRIS-glicina, Maniatis et al. 1989). Os géis foram fixados em ácido acético a 10% e metanol a 10%, incubados com Amplify durante 20 min, secos e expostos durante 12 horas. 47

Neste processo foram utilizados os seguintes tampões e soluções: Tampão de lavagem (Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCÍ2 5 mM, NP-40 a 1%) ; Tampão de separação 5x (Tris 125 mM, Glicina 1,25 M, SDS a 0,5%); Tampão de aplicação (glicerol a 10%, SDS a 4%, β-mercaptoetanol a 4%, azul bromfenol a 0,02%) .

Imunofluorescência

Foram transfectada células 293T por co-precipitação com fosfato de cálcio e foram analisadas para a expressão da THY-1 superficial, após 3 dias. Após o destacamento com EDTA/PBS 1 mM, as células foram coradas com o anticorpo monoclonal OX-7 numa diluição de 1:250 a 4 °C, durante 20 min, lavadas com PBS e, subsequentemente, incubadas com uma diluição 1:500 de um antisoro de imunoglobulinas de cabra anti-murganho, conjugado com FITC. As células foram lavadas novamente, ressuspensas em 0,5 mL de uma solução de fixação e analisadas num citofluórometro EPICS XL (Coulter).

Neste processo foram utilizadas as seguintes soluções: PBS (NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HP04 4,3 mM, KH2P04 1,4 mM, pH ajustado para 7,4); Solução de fixação (formaldeido a 2% em PBS).

ELISA A concentração da gpl20 nos sobrenadantes das culturas foi determinada utilizando placas de ELISA revestidas com CD4 e antisoros de cabra anti-gp!20 na fase solúvel. Os sobrenadantes 48 das células 293T transfectadas com fosfato de cálcio foram recolhidos após 4 dias, centrifugados a 3000 rpm durante 10 min para remover os detritos e foram incubados durante 12 horas a 4 °C nas placas. Após 6 lavagens com PBS foram adicionados, durante 2 horas, 100 pL de antisoros cabra anti-gpl20 diluídos 1:200. As placas foram novamente lavadas e incubadas durante 2 horas com um antisoro de IgG de coelho anti-cabra conjugado com peroxidase 1:1000. Subsequentemente, as placas foram lavadas e incubadas durante 30 min com 100 pL de solução de substrato contendo o-fenilenodiamina 2 mg/mL em tampão de citrato de sódio. A reacção foi finalmente terminada com 100 pL de ácido sulfúrico 4 M. As placas foram lidas a 490 nm com o leitor de microplacas Coulter. Foi utilizada Gpl20IIIb recombinante purificada como um controlo. Neste processo foram utilizados os seguintes tampões e soluções: Tampão de lavagem (NP40 0,1% em PBS); solução de substrato (o-fenilenodiamina 2 mg/mL em tampão citrato de sódio).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL

(i) REQUERENTE: SEED, BRIAN

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: SOBRE-EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MAMÍFERO E VIRAIS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 37 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: 49 (A) DESTINATÁRIO: Fish & Richardeon (B) RUA: Franklin Street, 225 (C) CIDADE: Boston (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 02110-2804 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patent In Release #1,0, Versão 1.30B (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/308286 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 19-SET-1994 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE:

(A) NOME: CLARK, PAUL T (B) NÚMERO DE REGISTO: 30162 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE PROCESSO: 00786/226001

(ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE: (617)542-5070 (B) TELEFAX: (617)542-8906 (C) TELEX: 200154 50 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:l: CGCGGGCTAG CCACCGAGAA GCTG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 196 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:2: 60 120 180 196

ACCGAGAAGC TGTGGGTGAC CGTGTACTAC GGCGTGCCCG TGTGGAAGAG AGCCCACCAC CACCCTGTTC TGCGCCAGCG ACGCCAACGC GTACGACACC GAGGTGCACA ACGTGTGGGC CACCCAGGCG TGCGTGCCCA CCGACCCCAA CCCCCAGGAG GTGGAGCTCG TGAACGTGAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 51 (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:3: CCACCATGTT GTTCTTCCAC ATGTTGAAGT TCTC 34 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA SEQ ID N°:4: GACCGAGAAC TTCAACATGT GGAAGAACAA CAT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO 192 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°:5: 60 120 1Θ0

TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GCGTGAAGCT GACCCCCTGT GCGTGACCTG AACTGCACCG ACCTGAGGAA CACCACCAAC ACCAACACAG CACCGCCAAC AACAACACCA ACAGCGAGGG CACCATCAAG GGCGGCGAGA TG 52 192 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA SEQ ID N°:6 GTTGAAGCTG CAGTTCTTCA TCTCGCCGCC CTT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA SEQ ID N°:7 GAAGAACTGC AGCTTCAACA TCACCACCAG C 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO 195 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 53 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:8:

AACATCACCA GATATCGTGA GTGATCACCC CCCGCCGGCT

CCAGCATCCG GCATCGACAA AGGCCTGCCC TCGCC

CGACAAGATG CGACAGCACC CAAGATCAGC

CACAAGGACT AGCTACCGCC TTCGAGCCCA

ACGCCCTGCT TGATCTCCTG TCCCCATCCA

GTACAACCTG CAACACCAGC CTACTGCGCC 60 120 180 195 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9: GAACTTCTTG TCGGCGGCGA AGCCGGCGGG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:10: GCGCCCCCGC CGGCTTCGCC ATCCTGAAGT GCAACGACAA GAAGTTC 47 54 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:ll: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 198 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°:ll: GCCGACAAGA AGTTCAGCGG CAAGGGCAGC TGCAAGAACG TGAGCACCGT CCAGTGCACC CACGGCATCC GGCCGGTGGT GAGCACCCAG CTCCTGCTGA ACCGCAGCCT GGCCGAGGAG GAGGTGGTGA TCCGCAGCGA GAACTTCACC GACAACGCCA AGACCATCAT CGTCCACCTG AATGAGAGCG TGCAGATC 60 120 160 198 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12: AGTTGGGACG CGTGCAGTTG ATCTGCACGC TCTC 34 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 55 (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° : 13: GAGAGCGTGC AGATCAACTG CACGCGTCCC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 120 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:14: 60 120

AACTGCACGC GTCCCAACTA CAACAAGCGC AAGCGCATCC ACATCGGCCC CGGGCGCGCC TTCTACACCA CCAAGAACAT CATCGGCACC ATCCTCCAGG CCCACTGCAA CATCTCTAGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 56 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:15: GTCGTTCCAC TTGGCTCTAG AGATGTTGCA 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:16: GCAACATCTC TAGAGCCAAG TGGAACGAC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 131 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°:17: 60 120

GCCAACTGGA ACGACACCCT GCGCCAGATC GTGACCAAGC TGAAGGAGCA CTTCAAGAAC AAGACCATCG TGTTCACCAG AGCAGCGGCG GCGACCCCGA GATCGTGATG CACAGCTTCA ACTGCGGCGG C 57 131 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18: GCAGTAGAAG AATTCGCCGC CGCAGTTGA 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° : 19 TCAACTCCGG CGGCGAATTC TTCTACTGC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 195 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 58 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:20:

GCACCTGGAA OGGCAACAAC TCCAGTGCAA GATCAAGCAG CCCCCCCCAT CGAGGGCCAG

CACCAGCCCC CTCTTCAACA CAGCAACAAC AATATTACCC GGTGGGCAAG GCCATGTACG

GGCGAATTCT TCTACTGCAA ACCTGGAACA ACACCACCGG ATCATCAACA TGTGGCAGGA ATCCGGTGCA GCAGC 60 lio: 180 191 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:21: GCAGACCGGT GATGTTGCTG CTGCACCGGA TCTGGCCCTC 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:22: CGAGGGCCAG ATCCGGTGCA GCAGCAACAT CACCGGTCTG 40 59 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 242 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:23: AACATCACCG GTCTGCTGCT GCTGCTGACC CGGACGGCGG CAAGGACACC GACACCAACG 60 ACACCGAAAT CTTCCGCGAC GGCGGCAACG ACACCAACCA CACCGAAATC TTCCGCCCCG 120 GCGGCGGCGA CATGCCCCAC AACTGCAGAT CTGAGCTGTA CAAGTACAAG GTGGTGACGA 180 TCGAGCCCCT GGGCGTGGCC CCCACCAAGG CCAAGCGCCC GGTGCTGCAG CGCGAGAACC 240 CC 242 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:24: CGCGGGCGGC CGCTTTAGCG CTTCTCGCGC TGCACCAC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 60 (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:25: CGCGGGGGAT CCAAGCTTAC CATGATTCCA GTAATAAGT 39 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 165 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°:26: ATGAATCCAG TAATAAGTAT AACATTATTA TTAAGTGTAT TACAAATGAG TAGAGGACAA AGAGTAATAAGTTTAACAGC ATCTTTAGTA AATCAAAATT TGAGATTAGA TTGTAGACAT GAAAATAATA CAAATTTGCC AATACAACAT GAATTTTCAT TAACG 60 120 165 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 61 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:27: CGCGGGGAAT TCACGCGTTA ATGAAAATTC ATGTTG 36 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:28: CGCGGATCCA CGCGTGAAAA AAAAAAACAT 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 149 base paire (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:29:

CGTGAAAAAA AAAAACATGT. ATTAAGTGGA ACATTAGGAC TACCAGAACA TACATATAGA AGTAGAGTAA TTTGTTTAGT GATAGATTCA TAAAAGTATT AACATTAGCA AATTTTACAA CAAAAGATGA AGGAGATTAT ATGTGTGAG 60 120 149 62 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:30 CGCGAATTCG AGCTCACACA TATAATCTCC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:31 CGCGGATCCG AGCTCAGAGT AAGTGGACAA 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 170 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 63 (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°:32: CTCACAGTAA GTGCACAAAA TCCAACAAGT AGTAATAAAA CAATAAATGT AATAAGAGAT AAATTAGTAA AATGTGAGGA ATAAGTTTAT TAGTACAAAA TACAAGTTGG TTATTATTAT TATTATTAAG TTTAAGTTTT TTACAAGCAA CAGATTTTAT AAGTT7ATGA 60 120 170 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:33: CGCGAATTCG CGGCCGCTTC ATAAACTTAT AAAATC 36 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1632 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 64 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 34 : CTCGAGATCC ATTGTGCTCT AAAGGAGATA CCCGGCCAGA CACCCTCACC TGCGGTCCCC 60 AGCTGCCCAG GCTGAGGCAA GAGAAGGCCA GAAACCATGC CCATGGGGTC TCTGCAACCG 120 CTCCCCACCT TGTACCTGCT GGGGATGCTC GTCGCTTCCG TCCTAGCCAC CGAGAAGCTG 180 TGGGTGACCG TCTACTACGG cgtgcccgtg TGGAAGGACG CCACCACCAC CCTGTTCTGC 240 GCCAGCGACG CCAAGGCGTA CGACACCGAG GTGCACAACG TGTGGGCCAC CCAGGCGTGC 300 GTGCCCACCG ACCCCAACCC CCAGGAGGTG GAGCTCGTGA ACGTGACCGA GAACTTCAAC 360 ATGTGGAAGA ACAACATGGT GGAGCAGATG CATGAGGACA TCATCAGCCT GTGGGACCAG 420 AGCCTGAAGC CCTGCGTGAA GCTGACCCCC CTGTCCGTGA CCCTGAACTG CACCGACCTC 480 AGGAACACCA CCAACACCAA CAACAGCACC GCCAACAACA ACAGCAACAG CGAGGGCACC 540 ATCAAGGG CG GCGAGATGAA CAACTGCAGC TTCAACATCA CCACCAGCAT CCGCGACAAG 600 ATGCAGAAGG AGTACGCCCT GCTGTACAAG CTGGATATCG TGAGCATCGA CAACGACAGC 660 ACCAGCTACC GCCTGATCTC CTGCAACACC AGCGTGATCA CCCAGGCCTG GCCCAAGATC 720 AGCTTCGAGC CCATCCCCAT CCACTACTGC GCCCCCGCCG GCTTCGCCAT CCTGAAGTGC 780 AACGACAAGA AGTTCAGCCG CAAGGGCAGC TCCAAGAACG TGAGCACCCT GCAGTGCACC 840 CACGGCATCC CGCCCGTGGT GAGCACCCAG CTCCTGCTCA ACGGCAGCCT GGCCGAGGAG 900 GAGGTGGTGA TCCGCAGCGA GAACTTCACC GACAACGCCA AGACCATCAT CGTGCACCTG 960 AATGAGAGCG TGCAGATCAA CTGCACGCGT CCCAACTACA ACAAGCGCAA GCGCATCCAC 1020 ATCGGCCCCG CGCGCGCCTT CTACACCACC AACAACATCA TCGCCACCAT CCGCCAGGCC 1080 CACTGCAACA TCTCTAGAGC CAAGTGCAAC GACACCCTGC GCCAGATCGT GAGCAAGCTG 1140 AAGGAGCAGT TCAAGAACAA GACCATCGTG TTCAACCAGA CCACCGCCGG CGACCCCGAG 1200 ATCGTGATGC ACAGCTTCAA CTGCGGCGGC GAATTCTTCT ACTGCAACAC CACCCCCCTC 1260 TTCAACAGCA CCTGGAACGG CAACAACACC TGGAACAACA CCACCGGCAG CAACAACAAT 1320 ATTACCCTCC AGTGCAAGAT CAAGCAGATC ATCAACATGT GGCAGGAGGT GGGCAAGGCC 1380 ATGTACCCCC CCCCCATCGA GGGCCAGATC CGGTGCAGCA GCAACATCAC CGGTCTGCTC 1440 CTGACCCGCG ACGGCGGCAA GGACACCGAC ACCAACGACA CCGAAATCTT CCGCCCCGGC 1500 GGCGGCGACA TGCGCGACAA CTGGAGATCT GAGCTGTACA AGTACAAGGT GGTGACGATC 1560 GAGCCCCTGG GCGTGGCCCC CACCAAGGCC AAGCGCCCCG TCGTCCAGCG CGAGAAGCGC 1620 TAAAGCGGCC GC 1632 65 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2481 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:35: ACCGAGAAGC TGTGGGTGAC CGTGTACTAC GGCGTGCCCG TGTGGAAGGA GGCCACCACC 60 ACCCTGTTCT GCGCCAGCGA CGCCAAGGCG TACGACACCG AGGTGCACAA CGTGTGGGCC 120 ACCCAGGCGT GCGTGCCCAC CGACCCCAAC CCCCAGGAGG TCGAGCTCGT GAACGTGACC180 GAGAACTTCA ACATCTGCAA GAACAACATG CTCGAGCAGA TGCATCAGGA CATCATCACC 240 CTGTGGGACC AGAGCCTGAA GCCCTGCGTG AAGCTGACCC CCCTGTGCGT GACCCTGAAC 300 TGCACCGACC TGAGGAACAC CACCAACACC AACAACAGCA CCGCCAACAA CAACAGCAAC 360 AGCGAGGGCACCATCAAGGG CGGCGAGATG AAGAACTGCA GCTTCAACAT CACCACCAGC 420 ATCCGCGACA AGATGCAGAA GGAGTACGCC CTGCTGTACA AGCTGGATAT CGTGAGCATC 480 CACAACGACA GCACCAGCTA CCGCCTGATC TCCTGCAACA CCAGCGTGAT CACCCAGGCC 540 TGCCCCAAGA TCAGCTTCGA GCCCATCCCC ATCCACTACT GCGCCCCCGC CGGCTTCGCC 600 ATCCTGAAGT GCAACGACAA GAAGTTCACC GGCAAGGGCA GCTGCAAGAA CGTGACCACC 660 GTGCAGTGCA CCCACGGCAT CCGGCCGGTG GTGAGCACCC AGCTCCTGCT GAACGGCAGC 720 CTGGCCGAGG AGGAGGTGGT GATCCGCAGC GAGAACTTCA CCGACAACGC CAAGACCATC 780 ATCGTGCACC TGAATGAGAG CGTGCAGATC AACTGCACGC GTCCCAACTA CAACAAGCGC 840 AAGCGCATCC ACATCGGCCC CGGGCGCGCC TTCTACACCA CCAAGAACAT CATCGGCACC 900 ATCCGCCAGG CCCACTGCAA CATCTCTAGA GCCAAGTGGA ACGACACCCT GCGCCAGATC 960 CTGACCAACC TGAAGGAGCA GTTCAAGAAC AAGACCATCG TCTTCAACCA GAGCAGCGGC 1020 GGCCACCCCG AGATCGTGAT GCACACCTTC AACTGCGGCG GCGAATTCTT CTACTGCAAC 1080 ACCAGCCCCC TGTTCAACAG CACCTGGAAC GGCAACAACA CCTGGAACAA CACCACCGGC 1140 AGCAACAACA ATATTACCCT CCAGTGCAAG ATCAAGCAGA TCATCAACAT GTGGCAGGAC 1200 GTGGGCAAGG CCATGTACGC CCCCCCCATC GAGGGCCAGA TCCGGTGCAG CACCAACATC 1260 66 ACCGGTCTGC TCCTGACCCG CGACGGCGGC AAGGACACCG ACACCAACGA CACCGAAATC 1320 TTCCGCCCCG GCGGCGGCGA CATGCGCGAC AACTGGAGAT CTGAGCTGTA CAAGTACAAG 1380 GTGGTGACGA TCGAGCCCCT GGGCGTGGCC CCCACCAAGG CCAAGCGCCG CGTGGTGCAG 1440 CGCGAGAAGC GGGCCGCCAT CGGCGCCCTG TTCCTGGGCT TCCTGGGGGC GGCGGGCAGC 1500 ACCATGGGGG CCGCCAGCGT GACCCTGACC CTGCAGGCCC GCCTGCTCCT GAGCGGCATC 1560 GTGCAGCAGC AGAACAACCT CCTCCGCGCC ATCGAGGCCC AGCAGCATAT GCTCCAGCTC 1620 ACCGTGTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCC CGCGTGCTGG CCGTGGAGCG CTACCTGAAG 1680 CACCAGCAGC TCCTGGCCTT CTGGGGCTGC TCCGGCAAGC TGATCTGCAC CACCACGGTA 1740 CCCTGGAACG CCTCCTCGAG CAACAAGAGC CTGGACGACA TCTGGAACAA CATGACCTGC 1800 ATGCAGTGCG agcgcgagat CGATAACTAC ACCAGCCTGA TCTACAGCCT GCTGGAGAAG 1860 AGCCAGACCC AGCAGGAGAA GAACGAGCAG GACCTGCTGG AGCTGGACAA CTGGGCGAGC 1920 CTCTGCAACT CCTTCCACAT CACCAACTGG CTGTCCTACA TCAAAATCTT CATCATCATT 1980 GTGGGCGGCC TGGTGGGCCT CCG CATCCTG TTCGCCGTGC TCAGCATCGT GAACCGCGTG 2040 CGCCAGGGCT ACAGCCCCCT GAGCCTCCAG ACCCGGGCCC CCGTGCCGCG CGGGCCCGAC 2100 CGCCCCGAGG GCATCGAGGA GGAGGGCGGC GAGCGCGACC GCGACACCAG CGGCAGGCTC 2160 GTGCACGGCT TCCTGGCGAT CATCTGGGTC GACCTCCGCA GCCTGTTCCT GTTCAGCTAC 2220 CACCACCGCG ACCTGCTGCT GATCGCCGCC CGCATCGTGG aactcctagg CCGCCGCGGC 2280 TGGGAGGTGC TGAAGTACTG GTGGAACCTC CTCCAGTATT GGAGCCAGGA GCTGAAGTCC 2340 AGCGCCGTGA GCCTGCTGAA CGCCACCGCC ATCGCCGTGG CCGAGGGCAC CGACCGCGTG 2400 ATCGAGGTGC TCCAGAGGGC CGGGAGGGCG ATCCTGCACA TCCCCACCCC CATCCGCCAG 2460 GGGCTCCAGA GGGCGCTGCT C 2481 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 486 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 67 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:36: ATGAATCCAG TAATAAGTAT AACATTATTA TTAAGTGTAT TACAAATGAG TAGAGGACAA 60 AGAGTAATAA GTTTAACAGC ATCTTTAGTA AATCAAAATT TGAGATTACA TTGTAGACAT 120 GAAAATAATA CACCTTTGCC AATACAACAT GAATTTTCAT TAACGCGTGA AAAAAAAAAA 180 CATGTATTAA GTGGAACATT AGGAGTACCA GAACATACAT ATAGAAGTAG AGTAAATTTG 240 T7TAGTGATA GATTCATAAA AGTATTAACA TTAGCAAATT TTACAACAAA AGATGAAGGA 300 GATTATATGT GTGAGCTCAG AGTAAGTGGA CAAAATCCAA CAAGTAGTAA TAAAACAATA 360 AATGTAATAA GAGATAAATTiAGTAAAATGT GGAGGAATAA CTTTATTAGT ACAAAATACA 420 AGTTGGTTAT TATTATTATT:ATTAAGTTTA AGTTTTTTAC AAGCAACAGA TTTTATAAGT 480 TTATGA 486 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 485 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:37: ATGAACCCAG TCATCAGCAT CACTCTCCTG CTTTCAGTCT TGCAGATGTC CCGAGGACAG 60 AGGGTGATCA GCCTGACAGC CTGCCTGGTG AACAGAACCT TCGACTGCAC TGCCGTCATG 120 AGAATAACAC CAACTTGCCC ATCCAGCATG AGTTCAGCCT CACCCGAGAG AAGAAGAAGC 180 ACGTGCTGTC AGGCACCCTG GGGGTTCCCG AGCACACTTA CCGCTCCCGC GTCAACCTTT 240 TCACTGACCG CTTTATCAAG GTCCTTACTC TAGCCAACTT GACCACCAAG GATGAGGGCG 300 ACTACATGTG TGAACTTCGA GTCTCCGGCC AGAATCCCAC AAGCTCCAAT AAAACTATCA 360 ATGTGATCAG AGACAAGCTC GTCAAGTGTG GTGGCATAAG CCTGCTGGTT CAAAACACTT 420 CCTGGCTGCT GCTGCTCCTG CTTTCCCTCT CCTTCCTCCA AGCCACGGAC TTCATTTCTC 480 TGTGA 485

Lisboa, 26 de Outubro de 2006 68

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de um gene sintético codificando uma proteína normalmente expressa em células de mamífero, em que, pelo menos, 50% dos codões não preferidos e codões menos preferidos presentes no gene natural codificando a referida proteína foram substituídos por codões preferidos, codificando os mesmos aminoácidos, sendo os referidos codões preferidos seleccionados do grupo consistindo em gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, ate, ctg, aag, ccc, ttc, age, acc, tac e gtg, sendo os referidos codões menos preferidos seleccionados do grupo consistindo em ggg, att, ctc, tcc e gtc e sendo os referidos codões não preferidos todos os outros codões para além dos referidos codões preferidos e dos referidos codões menos preferidos.
2. 2. Gene sintético obtenível por um método de acordo com reivindicação 1, em que a referida proteína é uma proteína do HIV.
3. 3. Gene sintético da reivindicação 2 em que a referida proteína é seleccionada do grupo consistindo em gag., pol e env.
4. 4. Gene sintético da reivindicação 2 em que a referida proteína é a gpl20 ou a gpl60. Lisboa, 26 de Outubro de 2006 1