DE69434019T2

DE69434019T2 - Zusammensetzung von transdominanten varianten von virus- proteinen zur antiviralen wirkung

Info

Publication number: DE69434019T2
Application number: DE69434019T
Authority: DE
Inventors: Majid Mehtali; Tania Guss
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1993-12-13
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2014-12-14
Also published as: ES2229232T3; FR2713651B1; WO1995016780A1; ATE277186T1; AU685560B2; EP0682708A1; EP0682708B9; AU1275095A; FR2713651A1; DE69434019D1; EP0682708B1; CA2155844A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die aus der Kombination von transdominanten Varianten von zwei viralen Proteinen, welche von dem gleichen Virus stammen, resultiert. Die Kombination von diesen beiden Varianten erlaubt, eine Resistenz gegen die Infektion oder die Vermehrung des fraglichen Virus zu verleihen. Die Erfindung findet eine interessante Anwendung bei der Behandlung oder Verhütung von Infektionen durch HIV (Human Immunodeficiency Virus), welches für AIDS (erworbenes Immundefektsyndrom) verantwortlich ist.
Im Rahmen der Forschung nach und der Entwicklung von Arzneimitteln, welche Virusinfektionen hemmen, bildet die somatische Gentherapie durch intrazelluläre Immunisierung einen der vielversprechenden Ansätze für die Zukunft. Dieses Konzept, welches von Baltimore (1988, Nature, 335, 395–396) definiert worden ist, besteht darin, Zellen genetisch zu modifizieren, um sie eine heterologe Nukleinsäure oder ein heterologes Protein, welches) diesen eine Resistenz gegen die Virusinfektion verleiht, exprimieren zu lassen. Einer der möglichen Wege, um diese Resistenz zu erwerben, besteht darin, die Wirtszelle Gene, die inhibitorisch auf einen Schritt des viralen Zyklus wirken, synthetisieren zu lassen. Obgleich alle Schritte des viralen Zyklus zum Ziel erklärt werden können, um eine solche Therapie auszuführen, bilden die Gene, die an einem frühen Schritt beteiligt sind, ein potentiell interessantes Ziel. Dies ist der Fall bei den Genen tat und rev des HIV-Virus, die eine essentielle Rolle bei der Initiation der Virusreplikation spielen.
Das tat-Gen kodiert ein TAT-Protein, das die Expression der Gesamtheit der Gene des HIV transaktiviert (Arya et al., 1985, Science, 229, 69–73). Es scheint, dass TAT sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene eingreift. Es zeigt eine spezifische Wechselwirkung mit einer kurzen Nukleotidsequenz, welche sich am 5'-Ende des Virusgenoms und der viralen Transkripte befindet und welche als TAR-Sequenz (für „Trans-activation Responsive Region") bezeichnet wird (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813–823).
Das REV-Protein, ein Expressionsprodukt des rev-Gens, begünstigt den Transport der Boten-RNAs (mRNA) von großer Größe in Richtung des Zytoplasmas, damit diese dort translatiert werden können. REV erkennt seinerseits spezifisch eine RRE-Sequenz (für „REV responsive element"), auf den mRNAs. Jene befindet sich in der Nähe einer anderen, als CRS („cis-acting Repression Sequence") bezeichneten Sequenz, welche an der Zurückhaltung der mRNAs, die diese tragen, im Zellkern beteiligt ist. Es wird vermutet, dass die Anheftung des REV-Proteins auf der Höhe von dessen RRE-Zielsequenz zur Wirkung hat, dass der inhibitorischen Wirkung der CRS auf die Passage der großen viralen mRNAs in Richtung des Zytoplasmas entgegengewirkt wird.
Obgleich deren Expressionsprodukte in Hinblick auf Molekülmasse, Sequenz und Wirkungsmechanismus sehr unterschiedlich sind, wurden regulatorische Gene, die eine ähnliche Funktion wie TAT und/oder REV ausüben, im Genom von anderen infektiösen Viren, wie den Retroviren HTLV-I und -II („human T-cell leukemia virus"), welche für schwere Formen von Leukämien verantwortlich sind, und den Herpes-Viren (Varicella-, Zona-(Herpes zoster-) und Epstein-Barr-Virus) identifiziert.
Seit einigen Jahren sind negative und dominante (transdominante) Mutanten von verschiedenen viralen Proteinen in der Literatur beschrieben worden. Insbesondere haben mehrere Gruppen transdominante Varianten der Proteine TAT und REV, welche in der Lage sind, sich an ihre Zielsequenz anzuheften, aber nicht in der Lage sind, die Funktion des nativen Proteins auszuüben, erzeugt. Wurde auch deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Wirkung des nativen Proteins gezeigt, bleibt nichtsdestotrotz deren Wirksamkeit in den durch HIV-infizierten Zellen nachzuweisen.
Es wurde jetzt gefunden, dass die Expression von wenigstens zwei Genen, welche transdominante Varianten der Proteine TAT bzw. REV des HIV-Virus kodieren, in einer durch HIV infizierten Zelle es erlaubt, die Vermehrung des Virus zu blockieren. Die Autoren haben gezeigt, dass die Inhibition der Virusinfektion, welche aus der gleichzeitigen Expression der beiden Gene resultiert, insgesamt höher ist als jene, welche während der Expression von irgendeinem von diesen Genen beobachtet wird. Dieser synergistische Effekt bildet einen unerwarteten Vorteil.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, der Öffentlichkeit eine besonders wirksame und folglich in Hinblick auf eine Verwendung beim Menschen sicherere pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die erlaubt, die Replikation eines Virus auf verschiedenen Ebenen des viralen Zyklus zu hemmen.
Aus diesem Grund hat die Erfindung eine Zusammensetzung zum Gegenstand, welche wenigstens umfasst:

(a) eine erste transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus; und
(b) eine zweite transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass dass die transdominante Variante des REV-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest in der Position +74 durch eine Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist; nachfolgend bezeichnet als REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser).

Im Rahmen der Erfindung leiten sich eine erste und eine zweite transdominante Variante von HIV ab. Man fasst unter der Bezeichnung „HIV" die verschiedenen Virusstämme und -isolate des viralen ätiologischen Agens von AIDS zusammen.
Unter „transdominanter Mutante" versteht man eine negative und dominante Mutante, d. h. eine nicht-funktionsfähige Mutante (welche nicht in der Lage ist, die Funktion des nativen Proteins, von welchem sie sich ableitet, auszuüben), die aber in der Lage ist, auf kompetitive und dominante Weise die Funktion von diesem Letzteren zu hemmen. In der Praxis kann eine transdominante Variante durch Deletion, Substitution und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren des nativen Proteins oder eines funktionsfähigen Fragments von diesem erhalten werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die Techniken, die erlauben, diese Modifikationen auszuführen, sowie die Regionen, die je nach den betreffenden viralen Proteinen modifiziert werden müssen.
Indessen und gemäß einem vorteilhaften Modus leiten sich die erste und zweite transdominante Variante, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden, von viralen Proteinen ab, welche in einem frühen Stadium der Infektion ihre Wirkung entfalten, und insbesondere von Proteinen, die in der Lage sind, auf spezifische Weise mit einer bestimmten Nukleotidsequenz (sogenannte Zielsequenz), welche in dem Genom und/oder den Transkripten des Virus, von dem diese abstammen, vorhanden ist, wechselzuwirken.
Man setzt eine erste transdominante Variante ein, welche sich von dem Protein TAT von HIV ableitet (siehe unten). Als zweite transdominante Variante wird man eine Variante einsetzen, die sich von einem viralen Protein ableitet, welches an einem anderen, vorzugsweise frühen Schritt der Virusreplikation, beispielsweise auf der Ebene des Transports der viralen mRNAs in Richtung des Zytoplasmas der Wirtszelle, beteiligt ist.
Die Auswahl einer transdominante Variante des TAT-Proteins ist sehr umfänglich. Es kann sich um jene handeln, die im Stand der Technik und insbesondere in Green et al. (1989, Cell, 58, 215–233) und Pearson et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5079–5083) beschrieben wurden. Es kann sich aber auch um andere transdominante Varianten handeln, insbesondere eine Variante mit einer solchen Sequenz, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 1 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend mit der Aminosäure +86 gezeigt ist, in welcher:

(1) der Phenylalaninrest an Position +38 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist;
(2) der Threoninrest an Position +40 durch einen Alaninrest ersetzt ist;
(3) der Lysinrest an Position +41 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist;
(4) der Isoleucinrest an Position +45 durch einen Serinrest ersetzt ist; und/oder
(5) der Tyrosinrest an Position +47 durch einen Argininrest ersetzt ist.

Selbstverständlich kann eine transdominante TAT-Variante mehrere Mutationen vereinigen.
Als Beispiele von transdominanten Varianten des REV-Proteins kann man jene aufführen, die in Malim et al. (1989, Cell, 58, 205–214) und Venkatesh und Chinnadurai (1990, Virology, 178, 327–330) erwähnt worden sind. Andererseits kann sich der Einsatz von Varianten, die auf der Ebene von drei Aminosäuren und mehr, insbesondere auf der Ebene der Reste Leu an Position 75, 78 und 81 modifiziert worden sind, als vorteilhaft erweisen. Um diese Ausführungsweise zu veranschaulichen, kann man eine REV-Variante erwähnen, welche an 5 Positionen mutiert ist, wobei die die Reste Gln⁷⁴, Leu⁷⁵, Leu⁷⁸, Glu⁷⁹ und Leu⁸¹ kodierenden Codons durch Codons, welche die Reste Gly, Ser, Glu, Phe bzw. Asp kodieren, ersetzt worden sind.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine erfindungsgemäße Zusammensetzung als Kombinationsprodukt für eine gleichzeitige, getrennte oder zeitlich gestaffelte Verwendung für die Behandlung oder Verhütung von Infektionen, die auf das Virus, von welchem die fraglichen viralen Proteine stammen, zurückzuführen sind. Die Verwendung einer solchen Zusammensetzung ist insbesondere für die anti-AIDS-Therapie bestimmt.
Gemäß den durch die Erfindung verfolgten Zielen können eine erste und eine zweite transdominante Variante auf rekombinantem Wege in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung ausgehend von geeigneten Expressionsvektoren hergestellt werden. Man wird vorteilhafterweise auf virale Vektoren zurückgreifen, die sich von Retroviren, Adenoviren oder Adenovirusassoziierten Viren ableiten, in welche man wenigstens eine DNA-Sequenz, welche eine transdominante Variante, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kodiert, inseriert hat. Das Genom dieser viralen Vektoren weist vorzugsweise einen Mangel hinsichtlich der Replikation auf. Es wird angegeben, dass im Rahmen der Erfindung die retroviralen Vektoren und insbesondere jene, die sich von dem MoMuLV („Moloney murine leukemia virus") ableiten, besonders bevorzugt sind. Solche Vektoren wie auch ihre Herstellungstechniken sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Die DNA-Sequenzen, die eine transdominante Variante eines viralen Proteins kodieren, können gemäß den klassischen Techniken der Molekularbiologie erhalten werden. Eine der möglichen Strategien besteht zuallererst darin, die das virale Protein kodierende Sequenz aus dem Virus genom zu isolieren, dies durch Klonierung oder PCR (Polymerasekettenreaktion), dann diese durch zielgerichtete Mutagenese zu modifizieren, um eine gewünschte transdominante Variante zu erzeugen. Alternativ kann man die DNA-Sequenz von Interesse durch chemische Synthese herstellen.
Natürlich können die DNA-Sequenzen, welche eine erste bzw. eine zweite transdominante Variante, welche im Rahmen der Erfindung verwendet werden, kodieren, in ein und denselben rekombinanten Vektor oder in zwei unterschiedliche Vektoren inseriert werden. Außerdem können diese ein der Selektion dienendes Gen, welches die Isolierung der durch diese Vektoren transfizierten Klone erleichtert, umfassen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls einen rekombinanten Vektor, umfassend:

(a) eine erste DNA-Sequenz, die eine transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus kodiert und unter die Kontrolle von Elementen gestellt ist, die für ihre konstitutive Expression erforderlich sind; und
(b) eine zweite DNA-Sequenz, die eine transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus kodiert und die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend mit der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest an Position +74 durch eine Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest an Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist und die unter die Kontrolle von Elementen gestellt ist, die für ihre konstitutive Expression erforderlich sind.

Selbstverständlich sind die erste und die zweite DNA-Sequenz unter die Kontrolle von Elementen, die für deren Expression erforderlich sind, gestellt. Diese Elemente umfassen insbesondere die Elemente für die Regulation der Transkription einer DNA-Sequenz zu mRNA wie auch die Initiations- und Terminationssignale für die Translation der mRNA zu Protein. Unter diesen Elementen kommt der Promotorregion eine besondere Bedeutung zu.
Allgemein setzt man eine Promotorregion ein, welche in den eukaryotischen Zellen, welche man zu behandeln wünscht, und vorzugsweise in humanen Zellen funktionsfähig ist. Eine Promotorregion kann aus eukaryotischen oder viralen Genen stammen, konstitutiv oder, insbesondere in Reaktion auf bestimmte gewebespezifische und insbesondere Lymphozyten-spezifische zelluläre Signale, regulierbar sein. Als Beispiele kann in Betracht gezogen werden, die Promotorregionen des SV40-Virus (Simian Virus 40), des PGK (Phosphoglyceratkinase)-Gens, des HMG (Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A)-Gens, des TK(Thymidinkinase)-Gens von HSV-1, der LTR („Long Terminal Repeat") des RSV (Rous-Sarkom-Virus), des MoMuLV und des HIV und die Promotoren der Gene E1A, E3 und MLP („Major Late Promoter") von Adenovirus einzusetzen. Es wird angegeben, dass diese Beispiele nicht einschränkend sind.
Die Erfindung erstreckt sich auf die eukaryotischen Zellen, in deren Genom eine erste und eine zweite Sequenz, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden, inseriert sind. Der oder die Vektor(en), welche(r) die Sequenzen trägt bzw. tragen, können entweder in vitro in eine dem Patienten entnommene Zelle oder direkt in vivo eingeschleust werden. Die Zelle ist vorzugsweise eine humane Zelle und ganz und gar bevorzugt eine Stammzelle der hämopoetischen Linie oder ein Lymphozyt.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die Verwendung einer Zusammensetzung, eines Vektors oder einer Zelle gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Medikamentes, welches für die Behandlung oder Verhütung von Virusinfektionen durch Gentherapie und insbesondere von auf HIV zurückzuführenden Infektionen bestimmt ist.
Die Erfindung zielt gleichfalls auf eine pharmazeutische Zusammensetzung ab, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel eine Zusammensetzung, einen Vektor oder eine Zelle gemäß der Erfindung in Kombination mit einem unter einem pharmazeutischen Gesichtspunkt annehmbaren Vehikel umfasst.
Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann gemäß den allgemein angewendeten Techniken hergestellt und gemäß einem jeglichen bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden. Man kombiniert das therapeutische oder prophylaktische Mittel in einer therapeutisch wirksamen Menge beispielsweise mit einem annehmbaren Träger, einem annehmbaren Verdünnungsmittel oder einem annehmbaren Hilfsstoff oder Adjuvans. Die zu verabreichende Menge wird abhängig von verschiedenen Kriterien, insbesondere von dem gewählten Verabreichungsweg, der betreffenden Pathologie, den zu exprimierenden ersten und zweiten DNA-Sequenzen oder ferner von dem Patient und der gewünschten Behandlungsdauer ausgewählt.
Außerdem bezieht sich die Erfindung auf einen Kit, umfassend:

(a) eine erste transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus; und
(b) eine zweite transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass die transdominante Variante des REV-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend mit der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest an Position +74 durch einen Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist;

Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen und insbesondere solchen, die auf HIV zurückzuführen sind, gemäß welchem man eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, eines Vektors oder einer Zelle gemäß der Erfindung einem Patienten, welcher eine solche Behandlung benötigt, verabreicht.
Zur Unterrichtung sind die essentiellen Schritte für eine antivirale Behandlung durch Gentherapie die folgenden:

– man nimmt eine Entnahme von Knochenmark oder Blut von einem Patienten, welcher eine solche Behandlung benötigt, vor;
– man kultiviert die entnommenen Zellen (Stammzellen oder Lymphozyten) gemäß den Techniken dieses Fachgebiets;
– man führt einen erfindungsgemäßen Vektor, in den die Sequenzen, die eine erste und eine zweite transdominante Variante kodieren, inseriert sind, durch Transfektion ein. Es ist indessen gleichfalls möglich, jeden der Vektoren, welche die Expression der einen oder der anderen der transdominanten Varianten erlauben, durch Cotransfektion oder alternativ durch Transfektion auf getrennte oder zeitlich gestaffelte Weise einzuführen. Man führt gegebenenfalls einen ergänzenden Schritt einer Kultivierung in selektivem Medium aus; und
– man injiziert die so modifizierten Zellen zurück in den Patienten.

Natürlich können die Modalitäten dieses Therapieprotokolls zahlreichen Varianten, die durch die Kliniker bestimmt werden, unterworfen werden.
Die Erfindung wird nachfolgend durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren veranschaulicht.
Die 1 zeigt schematisch den Vektor pTG2350, welcher die Expression einer transdominanten Variante TAT (Phe³⁸→Asp) von HIV (TAT38) unter der Kontrolle der retroviralen 5'-LTR erlaubt.
Die 2 veranschaulicht den Vektor pTG2428, welcher die Expression der transdominanten Variante REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser) (REV*) von HIV unter der Kontrolle der retroviralen 5'-LTR erlaubt.
Die 3 zeigt die Effekte der gleichzeitigen Expression der transdominanten TAT- und REV-Varianten (♦) auf die Entwicklung der Infektion in durch HIV infizierten Zellen verglichen mit der Expression einer transdominanten TAT-Variante (
) oder jener einer transdominanten REV-Variante (☐).
Die 4 zeigt schematisch den retroviralen Vektor pTG4367, welcher die Sequenzen umfasst, die die transdominanten Varianten TAT (Phe³⁸→Asp) und REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵, Leu⁷⁸, Glu⁷⁹ und Leu⁸¹→Gly, Ser, Glu, Phe und Asp), nachfolgend als REV** bezeichnet, unter der Kontrolle des PGK-Promotors aus der Maus (PGKpro) und der retroviralen 5'-LTR kodieren.
Die 5 veranschaulicht den Vektor pTG8301, in welchem die Sequenzen, die die REV**-Mutante und das TAT (Gln⁵⁴→STOP)(TAT54) – Neo-Fusionsprodukt kodieren, unter die Kontrolle der retroviralen 5'-LTR (LTR) bzw. des PGK-Promotors aus der Maus (PGK pro) gestellt sind.
Die 6 veranschaulicht den Vektor pTG8313, in welchem die Sequenzen, die die REV**-Mutante und das TAT (Phe³⁸→Asp) – Neo-Fusionsprodukt kodieren, unter die Kontrolle der retroviralen 5'-LTR (LTR) bzw. des PGK-Promotors aus der Maus (PGK pro) gestellt sind.
Die 7 veranschaulicht den Vektor pTG8315, in welchem die Sequenzen, die einerseits die REV**-Mutante und andererseits die Produkte TAT38 und neo kodieren, unter die Kontrolle der retroviralen 5'-LTR (LTR) bzw. des PGK-Promotors aus der Maus (PGK pro) gestellt sind.
Die 8 veranschaulicht den Vektor pTG8323, in welchem die Sequenzen, die einerseits die REV**-Mutante und das Produkt Neo und andererseits die TAT-Mutante (Gln⁵⁴→STOP) kodieren, unter die Kontrolle der Mini-LTR von HIV bzw. der retroviralen 5'-LTR gestellt sind.
BEISPIELE
Die nachfolgend beschriebenen Konstruktionen erfolgen gemäß den allgemeinen Techniken der Gentechnologie und der molekularen Klonierung, die detailliert in Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben worden sind. Die Gesamtheit der Klonierungsschritte unter Einsatz von bakteriellen Plasmiden erfolgt durch Passage in dem Stamm Escherichia coli (E. coli) 1106, BJ5183 oder XL-1-Blue, wohingegen jene, die von dem Phagen M13 abgeleitete Vektoren einsetzen, in E. coli NM522 ausgeführt werden.
Was die zielgerichteten Mutagenesen durch synthetische Oligodesoxynukleotide angeht, wendet man das von Zoller und Smith (1982, Nucleic Acids Res., 10, 6487) beschriebene Protokoll an oder man setzt einen Kit kommerzieller Herkunft gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein. Handelt es sich um die Reparatur von Restriktionsstellen, können das Auffüllen von überhängenden Enden mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase von E. coli und der Abbau von überhängenden 3'-Enden in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 oder durch Behandlung durch S1-Nuklease, gefolgt von einer Reparatur durch Klenow, ausgeführt werden. Die PCR-Techniken sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und umfassend in „PCR Protocols, a guide to methods and applications" (Hrsg.: Innis, Gelfand, Sninsky und White, Academic Press Inc.) beschrieben.
Andererseits wird die Sequenz einer transdominanten TAT- oder REV-Variante gegenüber jener des TAT- oder REV-Proteins des HIV-1-Virus, Isolat Lai, wie von Wain-Hobson et al. (1985, Cell, 40, 9–17) offenbart, durch Alignment (Ausrichtung aufgrund von Sequenzhomologie oder- identität) ausgerichtet. In der Praxis wird die Nummerierung der Aminosäuren in der Sequenz einer transdominanten Variante von jener, die für das native Protein etabliert worden ist, übernommen, einer Sequenz, wie sie in den Sequenzidentifizierungen NO: 1 für das TAT-Protein und NO: 2 für das REV-Protein gezeigt ist.
Außerdem werden die Zelllinien gemäß den Empfehlungen des Lieferanten kultiviert. Allgemein werden die Zellen gemäß der Calciumphosphat-Technik (Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory) transfiziert bis auf die CEM-A3-Zellen, bei denen man die Elektroporation einsetzt. Indessen können andere Protokolle, welche erlauben, eine Nukleinsäure in eine Zelle einzuschleusen, gleichfalls eingesetzt werden. Vor einer jeglichen Transfektion wird die DNA auf einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt.
BEISPIEL 1: Etablierung einer Zelllinie, welche die transdominanten TAT- und REV-Varianten coexprimiert
A. Konstruktion des retroviralen Vektors pTG2350 für die Expression der transdominanten Variante TAT (Phe³⁸→Asp) und Charakterisierung von deren transdominantem Phänotyp
Ein DNA-Fragment, welches die Kopie-DNA (cDNA), welche den 2 Exons des tat-Gens des HIV-Genoms, Isolat Lai (Wain-Hobson et al., 1985, Cell, 40, 9–17; Sodroski et al., 1985, Science, 229, 74–77) entspricht, umfasst, wird modifiziert, um eine BamHI-Stelle 5' von dem ATG-Startcodon zu erzeugen. Außerdem existiert eine BamHI-Stelle natürlicherweise 3' von dem Stop-Codon. Das BamHI-Fragment von 300 bp, welches die nicht mutierte tat-cDNA umfasst, wird in den Vektor M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91–99) inseriert. Man erhält den Vektor M13TG2306.
Man erzeugt eine transdominante TAT-Variante, indem man den Phenylalaninrest (Phe) an Position 38 des nativen TAT-Proteins durch eine Asparaginsäure (Asp) ersetzt. M13TG2306 wird einer zielgerichteten Mutagenese unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Amersham, RPN 1523) und unter Einsatz des in der Sequenzidentifizierung SEQ ID NO: 3 beschriebenen Oligonukleotids unterworfen, wodurch M13TG2316 erhalten wird.
Das aus dem vorangegangenen Vektor isolierte BamHI-Fragment wird dann in den eukaryotischen Vektor pSG5 (Green et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16, 369) transferiert. Man erhält pTG2332, in welchem die Expression der Variante TAT (Phe³⁸→Asp) unter der Kontrolle des SV40-Promotors steht.
Man wertet die Fähigkeit der Variante TAT (Phe³⁸→Asp) aus, die Expression des CAT (Chloramphenicolacetyltransferase)-Gens, welches unter die Kontrolle der LTR von HIV einschließlich der TAR-Sequenz gestellt ist (LTR-CAT; Emerman et al., 1987, EMBO J., 6, 37–55), zu transaktivieren. Die transaktivierende Aktivität wird durch transitorische Transfektion von HeLa-Zellen (ATCC CCL2) (4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung) mit 1 μg des Expressionsvektors pTG2332 mit 0,5 μg des Reporter-Vektors LTR-CAT bestimmt. Man führt eine Transfektion unter den gleichen Bedingungen mit 1 μg pHMG-Tat und 0,5 μg LTR-CAT, was die positive Vergleichsprobe für die Transaktivierung (100%) bildet, aus. pHMG-Tat ist der Expressionsvektor des nativen TAT-Proteins und resultiert aus der Klonierung des BamHI-Fragments von M13TG2306 in die BamHI-Stelle des pHMG-Vektors (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179–184).
48 h nach den Transfektionen misst man das Expressionsniveau des CAT-Gens an einem Aliquot Zellextrakt, welches 10 bis 20 μg Proteinen entspricht, gemäß der in Gorman et al. (1982, Mol. Cell. Biol., 2, 1044–1051) beschriebenen Technik. Die Konzentration an Proteinen wird mit Hilfe eines kommerziellen Kits bestimmt, indem dem durch den Lieferanten angegebenen Protokoll gefolgt wird. Der Prozentsatz von transaktivierender Aktivität der Variante wird bezogen auf den Wert, welcher mit der positiven Vergleichsprobe (pHMG-Tat + LTR-CAT), wobei jene 100% transaktivierende Aktivität repräsentiert, gemessen wird, berechnet.
Dann wird die Fähigkeit der Variante TAT (Phe³⁸→Asp), die transaktivierende Funktion des nativen TAT-Proteins zu hemmen, durch transitorische Transfektion von HeLa-Zellen mit dem Expressionsvektor pTG2332 (10 μg) mit dem Reporter-Vektor LTR-CAT (0,5 μg) und dem Vektor pHMG-Tat (1 μg) bestimmt. Wie zuvor, misst man die Expression des CAT-Reportergens an einem Aliquot Extrakt, welches 10 bis 20 μg Proteinen entspricht. Der Prozentsatz von Hemmung/Inhibition des nativen TAT-Proteins durch die Variante TAT (Phe³⁸→Asp) wird bezogen auf die Vergleichsprobe, welche aus der Cotransfektion mit pHMG-Tat und LTR-CAT resultiert, welche 0% inhibitorische Aktivität repräsentiert, berechnet.
Die Variante TAT (Phe³⁸→Asp) ist eine wirksame transdominante Variante, denn ihre transaktivierende Aktivität ist verringert (Expression des CAT-Gens unter 10% bezogen auf jene, die mit dem nativen TAT-Protein gemessen wird) und da sie die Aktivität des nativen TAT-Proteins stark hemmt (wenigstens 90% Hemmung).
Das BamHI-Fragment von 300 bp, welches aus M13TG2316 isoliert worden ist, wird in die BamHI-Stelle des retroviralen Vektors pLXSP inseriert, wodurch pTG2350 erzeugt wird (1). Der Vektor pLXSP leitet sich von pLXSN (Miller und Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980–988) nach Ersetzen des Neomycin-Gens (neo) durch ein Gen, welches eine Resistenz gegen Puromycin verleiht, und der 3'-LTR von MSV (Myelosarkom-Virus) durch die 3'-LTR von MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus) ab.
B. Konstruktion der retroviralen Vektoren pTG2428 und pTG2430 für die Expression der transdominanten REV-Variante (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser) und Charakterisierung von deren transdominantem Phänotyp
Ein SalI-Fragment von 830 bp, welches die Kopie-DNA entsprechend den beiden kodierenden Exons des rev-Gens des HIV-1-Isolats Lai umfasst, wird in den Vektor M13TG130 inseriert, wodurch der Vektor M13TG2309 erzeugt wird. Jener wird durch zielgerichtete Mutagenese (Kit Amersham) modifiziert, um zwei BglII-Stellen einzuführen, die die REV kodierende Sequenz einrahmen, die erste stromaufwärts des ATG-Startcodons und die zweite stromabwärts von dem Stop-Codon. Die Anwesenheit dieser BglII-Stellen erlaubt es, die späteren Klonierungsschritte zu vereinfachen. Es hätte aber auch eine jegliche andere geeignete Restriktionsstelle ausgewählt werden können.
Der so erhaltene Vektor wird einer zielgerichteten Mutagenese unter Einsatz des Oligonukleotids OTG4672, welches in der Sequenzidentifizierung NO: 4 angegeben ist, unterworfen mit dem Ziel, die Reste Gln und Leu an Position 74 und 75 des nativen REV-Proteins durch die Reste Gly und Ser zu ersetzen. Der daraus resultierende Vektor wird durch BglII verdaut und das Fragment von 390 bp wird in den eukaryotischen Expressionsvektor pSG5 inseriert, wodurch das Plasmid pTG REV.TD erhalten wird, an welchem man den transdominanten Phänotyp der Mutante REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser) auswertet.
Ihre Aktivität auf den Transport der mRNAs wird durch transitorische Transfektion der Zelllinie HeLa mit pTG REV.TD (1 μg) und dem Reportervektor pTG1335 (0,5 μg) bestimmt. Dieser Letztere entspricht dem CAT-Gen, welches unter die Kontrolle des SV40-Promotors und der RRE/CRS-Elemente des HIV1-Genoms, welche stromabwärts von dem CAT-Gen inseriert sind, gestellt ist. So wird in Abwesenheit eines funktionsfähigen REV-Proteins das CRS-Element die mRNAs in dem Kern halten und man weist kein Expressionsprodukt des CAT-Gens nach. Im Gegensatz dazu wird in Gegenwart eines funktionsfähigen REV-Proteins sich dieses an seine RRE-Zielsequenz anheften und den Transport der mRNAs in Richtung des Zytoplasmas und deren Translation induzieren.
Man bestimmt die Expression des CAT-Gens an einem Aliquot Zellextrakt unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Der Prozentsatz von Aktivität der REV-Mutante (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser) wird bezogen auf den Wert, welcher mit einer positiven Vergleichsprobe, welche aus der Cotransfektion mit dem Vektor pHMG-Rev, welcher die Expression des nativen REV-Proteins erlaubt, und mit dem Reporter-Vektor pTG1335 resultiert und welche 100% REV-Aktivität repräsentiert, gemessen wird, berechnet.
Parallel dazu wertet man deren Fähigkeit, die Funktion des nativen REV-Proteins zu hemmen, durch transitorische Transfektion mit dem Expressionsvektor pTG REV.TD (10 μg) und mit dem Reporter-Vektor pTG1335 (0,5 μg) in Gegenwart von 1 μg des Vektors pHMG-Rev aus. Das Expressionsniveau des CAT-Gens wird bezogen auf die Vergleichsprobe, die aus der Cotransfektion mit pHMG-Rev und pTG1335 resultiert und die 0% Hemmung/Inhibition repräsentiert, gemessen.
Die Variante REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser) erweist sich als eine wirkungsvolle transdominante Variante, die praktisch keine Aktivität beim Transport der mRNAs in Richtung des Zytoplasmas mehr aufweist, aber in der Lage ist, die native REV-Funktion auf dominante Weise zu hemmen.
Das BglII-Fragment von 390 bp, welches die die transdominante REV-Mutante kodierende Sequenz trägt, wird in die BamHI-Stelle von pTG5192 subkloniert. Dieser Letztere leitet sich von pLXSN ab, in welchem die aus dem MSV stammende 3'-LTR durch die 3'-LTR des MPSV ersetzt ist. Man erzeugt den retroviralen Vektor pTG2428 (2), welcher gleichfalls den Neomycin-Selektionsmarker, welcher Resistenz gegen G418 verleiht, trägt.
Andererseits wird das gleiche BglII-Fragment in den retroviralen pLXSP-Vektor inseriert, wodurch pTG2430, welches das Puromycinresistenzgen trägt, erhalten wird.
C. Etablierung einer Zelllinie CEM-A3, welche die transdominanten Mutanten TAT (Phe³⁸→Asp) und REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵→Gly, Ser) exprimiert
Man etabliert eine stabile Zelllinie, welche die beiden transdominanten Varianten coproduziert, ausgehend von von Natur aus durch HIV infizierbaren Zellen, beispielsweise der humanen Lymphozytenlinie CEM-A3, welche von CCRF-CEM (ATCC CCL119) abgeleitet ist und die den als HIV-Rezeptor dienenden Oberflächenmarker CD4 stark exprimiert.
Man führt einen Transfer durch Elektroporation von 20 μg pTG2350-Plasmid-DNA in 2 × 10⁷ CEM-A3-Zellen (Gene pulser Biorad, Spannung 210 V, Kapazität 960 μF) aus. Dann werden die Zellen in RPMI-Medium (Gibco-BRL) bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ erneut in Kultur genommen. Zwei Tage später gibt man die Zellen in selektives Medium (Puromycin, 0,5 μg/ml) und man isoliert die resistenten Klone (CEM-A3 2350-Zellen).
Man kann die Expression der transdominanten Variante in den verschiedenen Klonen detektieren durch transitorische Transfektion durch die Vektoren LTR-CAT und pHMG-Tat und durch Messen der Auslöschung der Expression des CAT-Gens bezogen auf eine Vergleichsprobe von Zellen von CEM-A3-Ursprung, die mit diesen beiden Vektoren transfiziert worden sind.
Man selektioniert einen gegen Puromycin resistenten Klon, in welchen man 20 μg pTG2428 gemäß dem oben angegebenen Elektroporationsprotokoll einführt. Man gibt die Zellen in doppelt selektives Medium (Puromycin 0,5 μg/ml und G418 1 mg/ml). Der Pool von gegen die beiden Antibiotika resistenten Zellen wird nachfolgend als CEM-A3 2350 + 2428 bezeichnet.
Als Vergleich etabliert man gleichfalls eine CEM-A3-Linie, welche die transdominante REV-Variante produziert, durch Transfektion mit dem Vektor pTG2430. Die gegen Puromycin resistenten Zellen werden als CEM-A3 2430 bezeichnet.
BEISPIEL 2: Auswertung der Resistenz der CEM-A3 2350 + 2428-Zellen gegenüber einer Infektion durch HIV
Man zentrifugiert ungefähr 10⁶ CEM-A3 2350 + 2428-Zellen bei niedriger Geschwindigkeit. Nach dem Waschen wird der Zell-Bodensatz in 200 μl RPMI-Medium in Abwesenheit von Serum wieder aufgenommen. Die Zellen werden durch ein HIV-Präparat mit einer TCID₅₀ zwischen 1 und 1000 und vorzugsweise 50 bis 100 infiziert. Die TCID₅₀ wird gemäß der in Reed et al. (1938, Am. J. Hyg., 27, 493–497) beschriebenen Methode an durch HIV infizierbaren Zelllinien, wie beispielsweise den CEM-A3-Zellen, bestimmt und entspricht der Dosis, bei welcher 50% der Zellen infiziert werden und 50% dies nicht werden. Sie wird für jede eingesetzte HIV-Charge verifiziert. Die Infektion wird 1 h bei 37°C betrieben.
Die Zellen werden dann zweimal in RPMI gewaschen und in 5 ml eben dieses Mediums, ergänzt mit 10% SVF (fötalem Kälberserum) in Kultur genommen. Dieser Schritt bildet den Zeitpunkt T = 0 des Experiments. Das Medium wird zwei- oder dreimal pro Woche erneuert. Die Vermehrung des Virus wird durch Messung der reverse Transkriptase-Aktivität in regelmäßigen Zeitabständen im Kulturüberstand gemäß der in Spire et al. (1985, Lancet i, 188–189) beschriebenen Methode ausgewertet.
Die in 3 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass die reverse Transkriptase-Aktivität der CEM-A3 2350 + 2428-Überstände sich während wenigstens 35 Tagen Kultivierung auf einem sehr niedrigen Niveau befindet. Es wird angegeben, dass man in den durch HIV infizierten normalen Zellen normalerweise eine reverse Transkriptase-Aktivität am Ende von 5 bis 6 Tagen detektiert aufgrund des Auftretens von neuen Viruspartikeln im Medium, das im Verlauf der Zeit bis zum Zelltod schnell zunimmt.
Zum Vergleich führt man das Experiment an Aliquots von CEM-A3 2350- und CEM-A3-2430-Zellkulturen unter streng identischen Bedingungen durch. In diesem Falle beobachtet man eine Verzögerung bei der Vermehrung des Virus, welche durch eine verringerte reverse Transkriptase-Aktivität während der ersten 20 Tage Kultur zum Ausdruck kommt, aber von einer Erhöhung gefolgt wird, wenn die Kultur fortgesetzt wird.
BEISPIEL 3: Konstruktion von retroviralen Vektoren die transdominante TAT- und REV-Varianten coexprimieren, und Etablierung von entsprechenden amphotropen Linien
A. Konstruktion des Vektors pTG4367
Der Vektor M13TG2309 wird einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen mit Hilfe des in der Sequenzidentifizierung NO: 5 angegebenen Oligonukleotids OTG5254, welches erlaubt, die das native REV-Protein kodierende DNA-Sequenz an fünf Stellen zu modifizieren, um eine transdominante REV-Variante zu erzeugen (Ersetzen der Codons, welche die folgenden Reste kodieren: Gln⁷⁴ durch Gly, Leu⁷⁵ durch Ser, Leu⁷⁸ durch Glu, Glu⁷⁹ durch Phe und Leu⁸¹ durch Asp). Man erhält den Vektor M13TG4303.
Der retrovirale Vektor pLXSP wird durch EcoRI-HpaI verdaut. Man isoliert ein EcoRI-PstI-Fragment, welches den PGK-Promotor aus der Maus, welcher in Adra et al. (1987, Gene, 60, 65–74) beschrieben ist, enthält, wobei die PstI-Stelle durch Behandlung mit T4-Polymerase mit glatten Enden versehen wird. Aus dem so erhaltenen Vektor wird die Expressionskassette des Puromycinresistenzgens deletiert. Um dies zu tun, wird nach Verdau durch ClaI-BamHI und Behandlung durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase dieser mit sich selbst religiert, um pTG2673 zu erzeugen.
Man führt das aus M13TG2316 isolierte BamHI-Fragment in den Vektor pTG2673, welcher vorab durch BamHI verdaut worden ist, ein. Dann wird der erhaltene Vektor durch EcoRI verdaut und durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt. Parallel dazu wird M13TG4303 durch BglII verdaut, mit Klenow behandelt, dann durch PvuII verdaut. Man isoliert das Fragment, welches die die fünffach mutierte transdominante REV-Variante kodierende Sequenz enthält, das man in den auf diese Weise behandelten Vektor pTG2673 inseriert. Man erhält pTG4367 (4), in welchem die TAT (Phe³⁸→Asp) kodierende Sequenz unter die Kontrolle des PGK-Promotors und jene, die transdominantes REV kodiert, unter die Kontrolle der 5'-LTR des retroviralen Vektors gestellt ist.
Man etabliert eine amphotrope Linie ausgehend von einer sogenannten Verkapselungszelllinie, in welche ein env-Gen eines amphotropen Retrovirus inseriert ist, beispielsweise die Linie PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 2895–2902) oder Gp. Env. Am. 12 (Markowitz et al., 1988, Virology 167, 400–406). Man führt eine Transfektion durch den Vektor pTG4367 und irgendeinen der Selektion dienenden Vektor, wie beispielsweise einen Vektor, welcher das Puromycinresistenzgen unter der Kontrolle des SV40-Promotors umfasst, aus. An dem der Transfektion folgenden Tag werden die Zellen in selektives Medium (Puromycin 6 μg/ml) gegeben. Man isoliert die resistenten Zellen, welche amphotrope Viruspartikel produzieren, welche in der Lage sind, humane Zellen zu infizieren.
Man kann eine Virusstammkultur bilden, die bei der Gentherapie für die Infektion von hämopoetischen Stammzellen oder von Lymphozyten eines Patienten eingesetzt werden könnte.
B. Konstruktion des Vektors pTG8301 (Expression von TAT (Gln⁵⁴→STOP) fusioniert mit dem Produkt des Gens neo und von REV, welches auf der Höhe der Reste 74, 75, 78, 79 und 81 mutiert ist)
Die Konstruktion der transdominanten TAT-Variante, in welcher der Glutaminrest (Gln) an Position 54 des nativen Proteins durch ein Stop-Codon ersetzt ist, ist in der Europäischen Anmeldung EP 0614 980 beschrieben. Als Zusammenfassung wird der Vektor M13TG2306 (Beispiel 1) einer zielgerichteten Mutagenese (Kit Amersham) mit Hilfe des Oligonukleotids OTG4376 (siehe SEQ ID NO: 3 von EP 0614 980 ) unterworfen. Man erhält M13TG2330. Um die Fusion mit dem der Selektion dienenden Gen auszuführen, wird jenes erneut einer zielgerichteten Mu tagenese unterworfen mit dem Ziel, das STOP-Codon des tat-Gens zu zerstören und dahinein einen Sequenzabschnitt aus drei Alaninresten, entsprechend einer NotI-Stelle, zu inserieren. Man setzt das mutagene Oligonukleotid OTG4413 (SEQ ID NO: 6) ein und man erzeugt M13TG2330*.
Parallel dazu wird das der Selektion dienende Gen neo durch PCR ausgehend von dem Vektor pAG60 (Colbère-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150, 1–14) amplifiziert. Man setzt dafür herkömmliche Primer ein, die an ihren 5'-Enden mit NotI-Stellen ausgestattet sind. Das so erhaltene PCR-Fragment wird in durch Notl linearisiertes M13TG2330* kloniert, wodurch M13TG6389 erhalten wird. Nach Verdau dieses letzteren durch BamHI reinigt man das Fragment von 1,2 kb, welches das fusionierte Gen enthält, welches das hybride Produkt TAT gefolgt von neo kodiert. Jenes wird in die BamHI-Stelle des retroviralen Vektors pTG2673 eingeführt, wodurch pTG6392 erhalten wird.
Der Vektor M13TG4303 wird einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen, um eine BglII-Stelle stromabwärts des Stop-Codons des transdominanten REV zu erzeugen mit dem Ziel, die späteren Klonierungsschritte zu vereinfachen. Man setzt zu diesem Zweck das Oligonukleotid OTG 4370 (SEQ ID NO: 7) ein. Dann wird das so erzeugte BglII-Fragment (0,38 kb) schließlich in den Vektor pTG6392 inseriert. Man erhält pTG8301 (5), in welchem das die transdominante REV-Mutante kodierende Gen unter die Kontrolle der 5'-LTR des retroviralen Vektors gestellt ist, wohingegen die Expression der transdominanten TAT-Variante, welche mit dem Produkt des neo-Gens fusioniert ist, von dem PGK-Promotor aus der Maus abhängt.
C. Konstruktion des Vektors pTG 8313 (Expression von TAT (Phe³⁸→Asp) fusioniert mit dem Produkt des Gens neo, und von REV, welches auf der Höhe der Reste 74, 75, 78, 79 und 81 mutiert ist)
Der Vektor M13TG6390 resultiert aus der Insertion des NotI-Fragments von M13TG6389, welches das Gen neo trägt, in M13TG2316. Vorab war eine NotI-Stelle in diesem Letzteren stromaufwärts des STOP-Codons der TAT38-Mutante mit Hilfe des zuvor beschriebenen mutagenen Oligonukleotids OTG4413 erzeugt worden. Dann wird das aus M13TG6390 gereinigte BamHI-Fragment (1,2 kb) in den vorab durch BamHI verdauten Vektor pTG2673 eingeführt, wodurch pTG 8305 erhalten wird. Schließlich wird das das mutierte rev-Gen umfassende BglII-Fragment von 0,38 kb in die EcoRI-Stelle (mit Klenow behandelt) des in dem vorangegangenen Schritt erhaltenen Vektors kloniert, wodurch pTG8313 (6) erzeugt wird.
D. Konstruktion der retroviralen Vektoren pTG8315 und pTG8316
Das aus M13TG2316 (welches TAT (Phe³⁸→Asp) enthält) oder aus M13TG2330 (TAT (Gln⁵⁴→STOP)) stammende BamHI-Fragment von 0,3 kb wird in die BamHI-Stelle von p polyIII-I* (Lathe et al., Gene, 1987, 57, 193–201) inseriert, wodurch p poly-2316 oder p poly-2330 erzeugt wird. Jene werden durch EcoRI und PvuII gespalten und man führt ein EcoRI-NcoI-Fragment (bei welchem die Stellen durch Behandlung durch Klenow mit glatten Enden versehen worden sind), welches den IRES-Elementen des EMCV-Virus (Eucephalomyocarditis-Virus) entspricht, ein. Dieses leitet sich von dem Vektor IRES-βgeo, welcher in der Internationalen Anmeldung WO 94/24301 beschrieben worden ist, ab.
Dann wird das neo-Gen stromaufwärts des IRES-Elements in Form eines Fragments mit glatten Enden, welches aus pAG60 isoliert worden ist, kloniert. Der Fachmann weiß, wie ein glattes Fragment ausgehend von einem Plasmid des Standes der Technik zu erzeugen ist. Es wird in die AccI-Stelle (mit Klenow behandelt) des vorangegangenen Konstrukts eingeführt. Man erhält die Vektoren pTG6399 und pTG6398, welche die bicistronischen Kassetten TAT (Phe³⁸→Asp) – IRES – neo bzw. TAT(Gln⁵⁴→STOP) – IRES – neo umfassen.
Parallel dazu wird das aus mutiertem M13TG4303 gereinigte BglII-Fragment (0,38 kb) durch Klenow behandelt, dann in den durch EcoRI verdauten und gleichfalls durch Klenow behandelten Vektor pTG2673 inseriert. Der so erhaltene Vektor wird schließlich durch XhoI verdaut, um das aus pTG6399 oder pTG6398 erhaltene XhoI-Fragment zu klonieren. Man erzeugt so die Vektoren pTG8315 (7) und pTG8316, in welchen das modifizierte rev-Gen (5 Mutationen) unter der Kontrolle der retroviralen 5'-LTR steht und die bicistronische Kassette, welche TAT (Phe³⁸→Asp) oder TAT (Gln⁵⁴→STOP) und das Produkt des neo-Gens kodiert, unter der Kontrolle des PGK-Promotors steht.
E. Konstruktion der durch das native TAT-Protein von HIV induzierbaren Vektoren
Das BglII-Fragment (0,38 kb), welches das transdominante rev-Gen enthält, wird aus mutiertem M13TG4303 gereinigt und in die BamHI-Stelle von p polyIII-I* subkloniert. Der daraus resultierende Vektor wird durch SmaI linearisiert und man führt dahinein das EcoRI*-NcoI*-Fragment, welches das IRES-Element enthält, ein. Dann inseriert man in die EcoRV-Stelle des so erzeugten Vektors das neo-Gen in Form eines Fragments mit glatten Enden, welches oben beschrieben worden ist, derart, dass eine bicistronische Kassette erzeugt wird, welche die REV (Gln⁷⁴, Leu⁷⁵, Leu⁷⁸, Glu⁷⁹ und Leu⁸¹→Gly, Ser, Glu, Phe, Asp) kodierenden Sequenzen und das Produkt des Gens neo, dessen Translation durch das IRES-Element EMCV reinitiiert wird, enthält.
Diese Kassette wird durch XhoI-XbaI-Verdau isoliert, gefolgt von einer Behandlung durch Klenow, und in die BalI-Stelle des Vektors pTG4347 inseriert. Dieser Letztere resultiert aus der Klonierung eines Fragments, welches den 3'-Abschnitt der 5'-LTR von HIV (Isolat Lai), nachfolgend als „mini-LTR" bezeichnet, und das Polyadenylierungssignal des SV40-Virus umfasst, in p polyIII-I*. Zur Unterrichtung entspricht die „mini-LTR" dem ScaI-HindIII-Fragment der 5'-LTR von HIV und weist die Elemente auf, welche die Transkription und die Transaktivierung durch das native TAT-Protein sicherstellen. Der so erzeugte Vektor wird pTG8314 genannt.
Parallel dazu werden die BamHI-Fragmente von M13TG2316 und M13TG2330, welche die Sequenzen umfassen, welche die transdominanten Varianten TAT (Phe³⁸→Asp) bzw. TAT (Gln⁵⁴→STOP) kodieren, in den Vektor pTG2682, welcher pTG2673, welchem der PGK-Promotor fehlt, entspricht, inseriert. Dann wird das aus pTG8314 isolierte, durch Klenow behandelte NotI-Fragment schließlich in die XhoI-Stelle (durch Behandlung mit Klenow mit glatten Enden versehen) des einen und des anderen der vorangegangenen, aus pTG2682 hervorgegangenen Konstrukte eingeführt. Man erhält Vektoren, in welchen die jeweiligen transdominanten tat-Gene auf konstitutive Weise unter der Kontrolle der retroviralen 5'-LTR exprimiert werden, wohingegen das transdominante rev-Gen auf durch das native TAT-Protein von HIV induzierbare Weise unter der Kontrolle der „mini-LTR" von HIV exprimiert wird. Man selektioniert vorzugsweise Klone, in denen die beiden Expressionskassetten in umgekehrter Orientierung bezogen aufeinander vorliegen (8: pTG8323).
F. Auswertung der Funktionsfähigkeit der vorangegangenen Konstrukte
Die transdominante Aktivität der TAT- und REV-Produkte, welche durch jedes der Konstrukte des Beispiels 3 erzeugt wird, kann wie zuvor ausgewertet werden durch transitorische Cotransfektion von humanen Zellen (beispielsweise A549-Zellen, ATCC CCL185) mit einem Reporter-Vektor (LTR-CAT, abhängig von TAT, oder pTG1335, abhängig von REV) und einem Expressionsvektor des Wildtyp-TAT- oder -REV-Proteins (pHMG-Tat oder pHMG-Rev).
G. Bildung von infektiösen Viruspartikeln
Man kann auf konventionelle Weise Stammkulturen von infektiösen Viruspartikeln herstellen, welche jedes der Konstrukte des Beispiels 3 enthalten. Kurz zusammengefasst, werden die ekotropen Verpackungs- oder Enkapsidationszellen GP + E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120–1124) mit den retroviralen Vektoren transfiziert. Nach Selektion der gegen Neomycin resistenten Zellen werden die Kulturüberstände gesammelt, um eine amphotrope Verkapselungs- oder Enkapsidationslinie, beispielsweise die Linie PA317, zu transduzieren. Die so erhaltenen Linien werden Produzentenzellen für infektiöse Viruspartikel, welche im Rahmen einer anti-AIDS-Gentherapie eingesetzt werden können, bilden. Ihr Vermögen, eine Resistenz gegen die Infektion durch HIV zu induzieren, kann in vivo und in vitro ausgewertet werden, wie in Beispiel 2 angegeben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, mindestens umfassend: (a) eine erste transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus; und (b) eine zweite transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass die transdominante Variante des REV-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest in der Position +74 durch einen Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der transdominanten Variante des REV-Proteins darüber hinaus der Leucinrest in der Position +78 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist, der Glutaminsäurerest in der Position +79 durch einen Phenylalaninrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +81 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die transdominante Variante des TAT-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 1 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +86 gezeigt ist, in der: (1) der Phenylalaninrest in der Position +38 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist; (2) der Threoninrest in der Position +40 durch einen Alaninrest ersetzt ist; (3) der Lysinrest in der Position +41 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist; (4) der Isoleucinrest in der Position +45 durch einen Serinrest ersetzt ist; und/oder (5) der Tyrosinrest in der Position +47 durch einen Argininrest ersetzt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Kombinationsprodukt für eine gleichzeitige, getrennte oder über die Zeit verteilte Verwendung, die zur Behandlung oder Verhütung von auf HIV zurückzuführenden Infektionen bestimmt ist.
Rekombinanter Vektor, umfassend: (a) eine erste DNA-Sequenz, die eine transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus kodiert und unter die Kontrolle von Elementen gestellt ist, die für ihre konstitutive Expression erforderlich sind; (b) eine zweite DNA-Sequenz, die eine transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus kodiert und die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest in der Position +74 durch einen Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist und die unter die Kontrolle von Elementen gestellt ist, die für ihre konstitutive Expression erforderlich sind.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei der transdominanten Variante des REV-Proteins darüber hinaus der Leucinrest in der Position +78 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist, der Glutaminsäurerest in der Position +79 durch einen Phenylalaninrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +81 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist.
Rekominanter Vektor nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die transdominante Variante des TAT-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 1 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +86 gezeigt ist, in der: (1) der Phenylalaninrest in der Position +38 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist; (2) der Threoninrest in der Position +40 durch einen Alaninrest ersetzt ist; (3) der Lysinrest in der Position +41 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist; (4) der Isoleucinrest in der Position +45 durch einen Serinrest ersetzt ist; und/oder (5) der Tyrosinrest in der Position +47 durch einen Argininrest ersetzt ist.
Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Elementen, die für die konstitutive Expression erforderlich sind, um den PGK-Promotor oder die LTR des MoMuLV-Virus handelt.
Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass er von einem Virus abstammt, das aus Retroviren, Adenoviren und Adenovirusassoziiertem Virus ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle, in deren Genom inseriert sind: (a) eine erste DNA-Sequenz, die eine transdominante Variante des TAT-Proteins des HIV-Virus kodiert und unter die Kontrolle von Elementen gestellt ist, die für ihre konstitutive Expression erforderlich sind; und (b) eine zweite DNA-Sequenz, die eine transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus kodiert und die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest in der Position +74 durch einen Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist und die unter die Kontrolle von Elementen gestellt ist, die für ihre konstitutive Expression erforderlich sind.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass bei der transdominanten Variante des REV-Proteins darüber hinaus der Leucinrest in der Position +78 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist, der Glutaminsäurerest in der Position +79 durch einen Phenylalaninrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +81 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist.
Eukaryotische Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die transdominante Variante des TAT-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 1 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +86 gezeigt ist, in der: (1) der Phenylalaninrest in der Position +38 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist; (2) der Threoninrest in der Position +40 durch einen Alaninrest ersetzt ist; (3) der Lysinrest in der Position +41 durch einen Glutaminsäurerest ersetzt ist; (4) der Isoleucinrest in der Position +45 durch einen Serinrest ersetzt ist; und/oder (5) der Tyrosinrest in der Position +47 durch einen Argininrest ersetzt ist.
Eukaryotische Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Elementen, die für eine konstitutive Expression erforderlich sind, um den PGK-Promotor oder die LTR des MoMuLV-Virus handelt.
Verwendung eines rekombinanten Vektors nach einem der Ansprüche 5 bis 9 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 13 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung oder Verhütung von auf HIV zurückzuführenden Virusinfektionen bestimmt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die darüber hinaus ein unter einem pharmazeutischen Gesichtspunkt annehmbares Vehikel umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 9 oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 13 in Verbindung mit einem unter einem pharmazeutischen Gesichtspunkt annehmbaren Vehikel.
Kit, umfassend (a) eine erste transdominante Variante eines TAT-Proteins des HIV-Virus und (b) eine zweite transdominante Variante des REV-Proteins des HIV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass die transdominante Variante des REV-Proteins die Sequenz aufweist, wie sie in der Identifizierung der Sequenz NO: 2 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend bei der Aminosäure +116 gezeigt ist, in der der Glutaminrest in der Position +74 durch einen Glycinrest ersetzt ist und der Leucinrest in der Position +75 durch einen Serinrest ersetzt ist; mit Instruktionen für deren gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung.