JPH0191786A - Ｃｉｓ作用抑制配列、ｃｉｓ作用抗抑制配列、ベクター、その調製方法及び使用 - Google Patents
Ｃｉｓ作用抑制配列、ｃｉｓ作用抗抑制配列、ベクター、その調製方法及び使用Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、（１つ又は複数の）ｃｉｓ作用（ｃｉｓ−ａ
ｃＬｉＢ）抑制ＤＮＡ配列、ｃｉｓ作用抗抑制ＤＮＡ配
列を含むベクター、形質転換体及び細胞系の使用に係り
、また、タンパク質の合成をコントロールするためのか
かる（１つ又は複数の）ＤＮＡ配列の使用に係る。特に
好ましくは、外来性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝
子産物の発現を調節しコントロールするためにｃｉｓ作
用抑制配列がｃｉｓ作用抗抑制配列とａｒｔ３１伝子産
物と共に使用される。
ｃＬｉＢ）抑制ＤＮＡ配列、ｃｉｓ作用抗抑制ＤＮＡ配
列を含むベクター、形質転換体及び細胞系の使用に係り
、また、タンパク質の合成をコントロールするためのか
かる（１つ又は複数の）ＤＮＡ配列の使用に係る。特に
好ましくは、外来性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝
子産物の発現を調節しコントロールするためにｃｉｓ作
用抑制配列がｃｉｓ作用抗抑制配列とａｒｔ３１伝子産
物と共に使用される。
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１、これはまたＨＴＬ
Ｖ−Ｉ［Ｉ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ ／ＬＡＶ
トも指称されル）ハ後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）
及び関連疾患の病因物質である［Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏ
ｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０−１８６８−８７
１（１９８３） ；Ｇａｌ Ｉｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ
２２４．５００−５０３（１９８４） ；Ｌａｎｅ等、
１９８４ ；Ｌｅｖｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２５：８
４０−８４２（１９８４）；Ｐｏｐｏｖｉｃ等、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２４．４９７−５００（１９８４） ；Ｓ
ａｒｎ−ｇａｄｂａｒａｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４
：５０６−５０８（１９８４）；Ｓｉｅｇａｌ等、Ｌｌ
Ｌ上ム虹厖猥−：１４３９−１４４４（１９８１）］、
この疾患の特徴は、長い無症状期間後の免疫系と中枢神
経系における進行性退化である。ウィルスの研究の結果
、その複製は極めて調節されており、組織培養物中でＣ
Ｄ４陽性ヘルパ−Ｔリンパ球サブセットの潜伏感染及び
溶菌感染が発生することが判明した［Ｚａｇｕｒｙ等、
５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：８５０−８５３（１９８６）
］。
Ｖ−Ｉ［Ｉ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ ／ＬＡＶ
トも指称されル）ハ後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）
及び関連疾患の病因物質である［Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏ
ｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０−１８６８−８７
１（１９８３） ；Ｇａｌ Ｉｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ
２２４．５００−５０３（１９８４） ；Ｌａｎｅ等、
１９８４ ；Ｌｅｖｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２５：８
４０−８４２（１９８４）；Ｐｏｐｏｖｉｃ等、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２４．４９７−５００（１９８４） ；Ｓ
ａｒｎ−ｇａｄｂａｒａｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４
：５０６−５０８（１９８４）；Ｓｉｅｇａｌ等、Ｌｌ
Ｌ上ム虹厖猥−：１４３９−１４４４（１９８１）］、
この疾患の特徴は、長い無症状期間後の免疫系と中枢神
経系における進行性退化である。ウィルスの研究の結果
、その複製は極めて調節されており、組織培養物中でＣ
Ｄ４陽性ヘルパ−Ｔリンパ球サブセットの潜伏感染及び
溶菌感染が発生することが判明した［Ｚａｇｕｒｙ等、
５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：８５０−８５３（１９８６）
］。
病気の進行中に感染性ウィルスの力価が低い値に維持さ
れるので、感染患者においてもウィルスの発現が調節さ
れていると考えられる。 ＨＩＶ−１の複製及びゲノム
構成の分子的研究によって、ＨＩＶ−（が少なくとも７
つの遺伝子をコードすることが判明した［Ｒａｔｎｅｒ
等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８４（１９８５
）；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２２７：４８４−４９２（１９８５）；Ｍｕｅｓ
ｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４５０−４５７（１
９８５） Ｊａｉｎ−１１０ｂ−ｓｏｎ等、（１９８５
）］、このうちの３つの遺伝子、即ちｇａｇ、ｐｏｌ及
びｅｎｖ遺伝子はすべてのレトロウィルスに共通である
。しかしなから、ゲノムは、はとんどのレトロウィルス
に共通でない更に４つの遺伝子、即ちｓｏｒ、 ｔａｔ
、 ａｒｔ及び３″ｏｒｆ遺伝子をコードしている［５
ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５４
９−１５５３（１９８６） ；Δｒｙａ等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２２９：６９−７３（１９８５）；５ｏｄｒｏ−
ｓｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７：１７１−１７３（
１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２
上：４１２−４１７（１９８８） ；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
等、Ｃｅ１ｌ ４６：８０７−８１７（１９８６）］。
れるので、感染患者においてもウィルスの発現が調節さ
れていると考えられる。 ＨＩＶ−１の複製及びゲノム
構成の分子的研究によって、ＨＩＶ−（が少なくとも７
つの遺伝子をコードすることが判明した［Ｒａｔｎｅｒ
等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８４（１９８５
）；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２２７：４８４−４９２（１９８５）；Ｍｕｅｓ
ｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４５０−４５７（１
９８５） Ｊａｉｎ−１１０ｂ−ｓｏｎ等、（１９８５
）］、このうちの３つの遺伝子、即ちｇａｇ、ｐｏｌ及
びｅｎｖ遺伝子はすべてのレトロウィルスに共通である
。しかしなから、ゲノムは、はとんどのレトロウィルス
に共通でない更に４つの遺伝子、即ちｓｏｒ、 ｔａｔ
、 ａｒｔ及び３″ｏｒｆ遺伝子をコードしている［５
ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５４
９−１５５３（１９８６） ；Δｒｙａ等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２２９：６９−７３（１９８５）；５ｏｄｒｏ−
ｓｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７：１７１−１７３（
１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２
上：４１２−４１７（１９８８） ；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
等、Ｃｅ１ｌ ４６：８０７−８１７（１９８６）］。
これらの遺伝子の２つ、即ち２３ｋｄのタンパク質をコ
ードするｓｏｒ遺伝子［５ｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ、等、
Ｓｃ １ｅｎｃｅ２３１：１５４９−１５５３（１９８
６）、Ｌｅｅ、 Ｔ、Ｈ，等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１
：１５４６−１５’４９（１９８６）］と２７１ｃｄの
タンパク質をコードする３°ｏ＋（遺伝子［＾１１ａｎ
、 Ｊ、Ｓ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３０：８１０−８
１２（１９８５）］とにおける変異ではＴリンパ球内で
のウィルスの複製能及び該リンパ球に傷害を与えるウィ
ルスの能力は阻害されない［５ｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ。
ードするｓｏｒ遺伝子［５ｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ、等、
Ｓｃ １ｅｎｃｅ２３１：１５４９−１５５３（１９８
６）、Ｌｅｅ、 Ｔ、Ｈ，等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１
：１５４６−１５’４９（１９８６）］と２７１ｃｄの
タンパク質をコードする３°ｏ＋（遺伝子［＾１１ａｎ
、 Ｊ、Ｓ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３０：８１０−８
１２（１９８５）］とにおける変異ではＴリンパ球内で
のウィルスの複製能及び該リンパ球に傷害を与えるウィ
ルスの能力は阻害されない［５ｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ。
等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１、上掲］。
ｔｒａｎｓ活性化（ｔａｔｎ［）遺伝子は、ウィルスメ
ツセージのリーダー中の特異的標的配列ＴＡＲとの相互
作用を介して［Ｒｏｓｅｎ、 Ｃ，へ９等、Ｃｅ１ｌ
４１：８１３−８２３（１９８５）］、ＨＩＶ−Ｉ （
７） ＬＴＲに支配される遺伝子発現を転写後に刺激す
る１４ｋｄのタンパク質をコードしている［１９８５年
１２月６日出願の米国特許出願第８０６２６３号；Ｒｏ
ｓｅｎ、 Ｃ，＾９等、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５５５
−５５９（１９８６）；５ｏｃｌ−ｒｏｓｋｉ、 Ｊ、
Ｇ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７：１７１−１７３（１
９８５）；＾ｒｙａ 。
ツセージのリーダー中の特異的標的配列ＴＡＲとの相互
作用を介して［Ｒｏｓｅｎ、 Ｃ，へ９等、Ｃｅ１ｌ
４１：８１３−８２３（１９８５）］、ＨＩＶ−Ｉ （
７） ＬＴＲに支配される遺伝子発現を転写後に刺激す
る１４ｋｄのタンパク質をコードしている［１９８５年
１２月６日出願の米国特許出願第８０６２６３号；Ｒｏ
ｓｅｎ、 Ｃ，＾９等、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５５５
−５５９（１９８６）；５ｏｃｌ−ｒｏｓｋｉ、 Ｊ、
Ｇ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７：１７１−１７３（１
９８５）；＾ｒｙａ 。
Ｓｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９、上掲及び５ｏｄｒｏ
ｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９−１上掲］
、２分節系（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ｔａｔ ［１遺伝子
の第１コードエキソンの５”部分の突然変異は、構造タ
ンパク質を有効に合成し複製するウィルスの能力を破壊
する［米国特許出願第８０６２６３号；Ｄａｙｔｏｎ、
＾１等飄旦−４４：９４１−４９７（１９８６）］。こ
れらの突然変異はｔａＬｌ［タンパク質を構成的に発現
する細胞系においてｔｒａｎｓ様に補完される。
ｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９−１上掲］
、２分節系（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ｔａｔ ［１遺伝子
の第１コードエキソンの５”部分の突然変異は、構造タ
ンパク質を有効に合成し複製するウィルスの能力を破壊
する［米国特許出願第８０６２６３号；Ｄａｙｔｏｎ、
＾１等飄旦−４４：９４１−４９７（１９８６）］。こ
れらの突然変異はｔａＬｌ［タンパク質を構成的に発現
する細胞系においてｔｒａｎｓ様に補完される。
また、キャプシド及びエンベロープタンパク質の発現に
ａｒｔＩｌ伝子が必要であることも知見された［１９８
６年５月２０日出願の米国特許出願第８６５１５１号；
５ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：４１２
−４１７（１９８６）］、機能的ｔａｔ遺伝子産物がａ
ｒｔ欠失プロウィルスによって製造され得るという我々
の観察はａｒｔ遺伝子が転写後調節物質として作用する
ことを示す。
ａｒｔＩｌ伝子が必要であることも知見された［１９８
６年５月２０日出願の米国特許出願第８６５１５１号；
５ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：４１２
−４１７（１９８６）］、機能的ｔａｔ遺伝子産物がａ
ｒｔ欠失プロウィルスによって製造され得るという我々
の観察はａｒｔ遺伝子が転写後調節物質として作用する
ことを示す。
所望タンパク質の発現を調節する系をもつことは極めて
有用であろう、高レベルの外来性遺伝子産物を産生ずる
ためにｔａｔ Ｉ［［遺伝子産物を使用することが可能
ではあるが、ｅｎｖタンパク質のごときある種の遺伝子
産物の産生はその結果として細胞の溶解を生起する。そ
の結果、細胞は多量の所望タンパク質を産生ずる前に死
滅してしまう。
有用であろう、高レベルの外来性遺伝子産物を産生ずる
ためにｔａｔ Ｉ［［遺伝子産物を使用することが可能
ではあるが、ｅｎｖタンパク質のごときある種の遺伝子
産物の産生はその結果として細胞の溶解を生起する。そ
の結果、細胞は多量の所望タンパク質を産生ずる前に死
滅してしまう。
更に、ある種の細胞は外来性タンパク質を分解するタン
パク質分解酵素をもち多量の外来性タンパク質の蓄積を
妨げる。
パク質分解酵素をもち多量の外来性タンパク質の蓄積を
妨げる。
本発明者等は、ａｒｔ遺伝子産物によってｃｉｓ作用負
調節配列の効果を消去しこれにより所望タンパク質の発
現をコントロールできる方法を発見した。
調節配列の効果を消去しこれにより所望タンパク質の発
現をコントロールできる方法を発見した。
ｃｉｓ作用阻害特性を生じる特異的配列の産生方法及び
その実用化は強く要望されている。特に、阻害配列がａ
ｒｔ遺伝子産物のごとき別のタンパク質による抑制に反
応性であるような場合が望ましい、これらの特性を与え
る不連続配列が知見されれば、調節系中のウィルスゲノ
ムに対応するヌクレオチドのより小さい部分を使用する
ことが可能になる。
その実用化は強く要望されている。特に、阻害配列がａ
ｒｔ遺伝子産物のごとき別のタンパク質による抑制に反
応性であるような場合が望ましい、これらの特性を与え
る不連続配列が知見されれば、調節系中のウィルスゲノ
ムに対応するヌクレオチドのより小さい部分を使用する
ことが可能になる。
更に、ＨＩＶ−１ウイルスがどのように複製するかがわ
かれば、構造タンパク質を有効に合成し複製するウィル
スの能力に対する新しい解明方法を開発することが可能
である。
かれば、構造タンパク質を有効に合成し複製するウィル
スの能力に対する新しい解明方法を開発することが可能
である。
発明者等は、外来性遺伝子の発現を抑圧するある種のＤ
ＮＡ配列を発見し、また所望タンパク質の発現を調節す
る方法を発見した。
ＮＡ配列を発見し、また所望タンパク質の発現を調節す
る方法を発見した。
本明細書では、外来性遺伝子産物の発現を抑圧し得るＤ
ＮＡ配列をｃｉｓ作用抑制（ｃｒｔｓ）配列と相称する
。 ａｒｔタンパク質の存在下にＣＳＲ配列の抑圧に拮
抗する（即ち抑制する）配列をｃｉｓ作用抗抑制（ＣＡ
Ｒ）配列と相称する。これらのＤＮＡ配列の多くはａｒ
ｔ調節領域エンベロー１（＾ＲＥ）と相称されるより大
きいＤＮＡセグメントの一部分を形成している。
ＮＡ配列をｃｉｓ作用抑制（ｃｒｔｓ）配列と相称する
。 ａｒｔタンパク質の存在下にＣＳＲ配列の抑圧に拮
抗する（即ち抑制する）配列をｃｉｓ作用抗抑制（ＣＡ
Ｒ）配列と相称する。これらのＤＮＡ配列の多くはａｒ
ｔ調節領域エンベロー１（＾ＲＥ）と相称されるより大
きいＤＮＡセグメントの一部分を形成している。
いくつかの具体例においてこれらの配列は、ＨＩＶ−Ｉ
ゲノム中のヌクレオチド配列に実質的に対応するヌクレ
オチド配列に由来し得る。特に、＾ＲＥ領域は、ｃｉｓ
作用抑制調節特性を有しａｒｔ遺伝子産物の抗ｃｉｓ作
用調節特性に反応するに十分な数のヌクレオチド６３７
６−７７６０に対応する。＾ＲＥ領域に対応する配列の
使用が好ましい。
ゲノム中のヌクレオチド配列に実質的に対応するヌクレ
オチド配列に由来し得る。特に、＾ＲＥ領域は、ｃｉｓ
作用抑制調節特性を有しａｒｔ遺伝子産物の抗ｃｉｓ作
用調節特性に反応するに十分な数のヌクレオチド６３７
６−７７６０に対応する。＾ＲＥ領域に対応する配列の
使用が好ましい。
ＣＲＳ 、はｅｉｓ作用抑制性を与えるに十分な数のＨ
ＩＶ−Ｉゲノムの６３７６−６７２５内のヌクレオチド
に対応する。 ＣＲＳ２はｃｉｓ作用抑制性を与えるに
十分な数の７２８３−７３２５内のヌクレオチドに対応
する。 ＣＲＳ３はｃｉｓ作用抑制性を与えるに十分な
数の領域５８９３−６５３８内のヌクレオチドに対応す
る。 ＣＲＳ、はｃｉｓ作用抑制性を与えるに十分な数
の領域８２０４−８５９７内のヌクレオチドに対応する
。
ＩＶ−Ｉゲノムの６３７６−６７２５内のヌクレオチド
に対応する。 ＣＲＳ２はｃｉｓ作用抑制性を与えるに
十分な数の７２８３−７３２５内のヌクレオチドに対応
する。 ＣＲＳ３はｃｉｓ作用抑制性を与えるに十分な
数の領域５８９３−６５３８内のヌクレオチドに対応す
る。 ＣＲＳ、はｃｉｓ作用抑制性を与えるに十分な数
の領域８２０４−８５９７内のヌクレオチドに対応する
。
ＣＡＲ、はａｒｔ遺伝子産物の存在下にＣＲＳのｃｉｓ
作用抑制性に拮抗するに十分な数の領域６９６９−７１
６３内のヌクレオチドに対応する。領域ＣＡＲ２はａｒ
ｔ遺伝子産物の存在下にＣＲＳ配列による抑制を解除す
るＣＲＳ２の一部分く即ち７２８３−７３２５）に対応
する。
作用抑制性に拮抗するに十分な数の領域６９６９−７１
６３内のヌクレオチドに対応する。領域ＣＡＲ２はａｒ
ｔ遺伝子産物の存在下にＣＲＳ配列による抑制を解除す
るＣＲＳ２の一部分く即ち７２８３−７３２５）に対応
する。
ＣＲＳ、は、ｅｎｖ遺伝子の外部に存在し３’ｏｒｆ３
ｉ伝子配列の内部に存在するＨＩＶ−１のゲノムの領域
に対応する。この配列は外来性遺伝子産物の発現に強い
影響を与えるが、ＨＩＶｉウィルスタンパク質に同様の
影響を与えることは証明されていない。タンパク質発現
に最大阻害効果を与えるためにはＣＲＳ 、及びＣＲＳ
、配列が好ましい。これらは野性型細胞に比較して外来
性遺伝子産物の発現を約１００倍抑圧し得る。この阻害
はａｒｔ遺伝子産物の存在によって相殺され得る。
ｉ伝子配列の内部に存在するＨＩＶ−１のゲノムの領域
に対応する。この配列は外来性遺伝子産物の発現に強い
影響を与えるが、ＨＩＶｉウィルスタンパク質に同様の
影響を与えることは証明されていない。タンパク質発現
に最大阻害効果を与えるためにはＣＲＳ 、及びＣＲＳ
、配列が好ましい。これらは野性型細胞に比較して外来
性遺伝子産物の発現を約１００倍抑圧し得る。この阻害
はａｒｔ遺伝子産物の存在によって相殺され得る。
これらの調節配列はベクター内で発現をコンｌ−ロール
すべき遺伝子の下流で非翻訳メツセージ内に存在する。
すべき遺伝子の下流で非翻訳メツセージ内に存在する。
これらの配列は所望の遺伝子産物の産生をコントロール
するために使用され得る。該方法は、（ａ）ａｒｔ３Ｊ
ｉ伝子産物に父子産物ｃｉｓ作用抑制配列とｃｉｓ作用
抗抑制配列との上流に融合した所望の外来性遺伝子を含
むベクターを予め選択された細胞系にトランスフェクト
し、 （ｂ）ｃｉｓ作用抑制配列を抑制して所望の外来性遺伝
子産物を発現させるべくｃｉｓ作用抗抑制系を活性化す
るに十分な量のａｒｔ′ｉｉ伝子産物とｃｉｓ作用抗抑
制配列とを所定の時間接触させる段階を含む。
するために使用され得る。該方法は、（ａ）ａｒｔ３Ｊ
ｉ伝子産物に父子産物ｃｉｓ作用抑制配列とｃｉｓ作用
抗抑制配列との上流に融合した所望の外来性遺伝子を含
むベクターを予め選択された細胞系にトランスフェクト
し、 （ｂ）ｃｉｓ作用抑制配列を抑制して所望の外来性遺伝
子産物を発現させるべくｃｉｓ作用抗抑制系を活性化す
るに十分な量のａｒｔ′ｉｉ伝子産物とｃｉｓ作用抗抑
制配列とを所定の時間接触させる段階を含む。
非構造遺伝子は構造遺伝子（例えばｇａｇ及びｅｎｖ）
に使用されるメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）とは異
なる種類のメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）によって
合成される［Ｍｕｅｓｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３
：４５０−４５７（１９８５） ；へｒｙａ等、１掲］
、 ｔａｔ及びａｒｔ遺伝子はピリオン構造タンパク質
をコードする情報の大部分がスプライシングによって除
去されたｍＲＮＡから合成される（第１図）。
に使用されるメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）とは異
なる種類のメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）によって
合成される［Ｍｕｅｓｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３
：４５０−４５７（１９８５） ；へｒｙａ等、１掲］
、 ｔａｔ及びａｒｔ遺伝子はピリオン構造タンパク質
をコードする情報の大部分がスプライシングによって除
去されたｍＲＮＡから合成される（第１図）。
第１図は図示のＨＩＶ−１ｍＲＮＡを産生するために使
用されたスプライシング過程を示す＊ ｇａｇ、 ｅｎ
ｖ、ｔａｔ及びａｒｔのｍＲＮＡ内に存在するエキソン
が実線で示される。これらのエキソンは旧Ｖ−１ｃＤＮ
Δクローンの分析によって決定された０点線は最終転写
物からスプライスされたイントロン配列を示す。
用されたスプライシング過程を示す＊ ｇａｇ、 ｅｎ
ｖ、ｔａｔ及びａｒｔのｍＲＮＡ内に存在するエキソン
が実線で示される。これらのエキソンは旧Ｖ−１ｃＤＮ
Δクローンの分析によって決定された０点線は最終転写
物からスプライスされたイントロン配列を示す。
＾ｒｔ３Ｉ！ｌ伝子の突然変異体は複製欠陥を示す。あ
る種のウィルスＲＮ＾はａｒｔ遺伝子の欠失したプロウ
ィルスを感受性細胞にトランスフェクトしたときに形成
され得るので、この複製欠陥は怒染の後期に生じると考
えられる。突然変異プロウィルスでトランスフェクトさ
れた細胞中ではキャプシド遺伝子タンパク質及びエンベ
ロープ遺伝子タンパク質はいずれも検出されなＩｖ’）
［５ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ凪、１掲；Ｆｅ
ｉｎｂｅｒｇ、上掲］、注目すべきは、機能的ｔａｔ遺
伝子産物がａｒｔ欠失プロウィルスによって形成される
ことである［５ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３
２１．１掲］、これは、すべてのウィルスタンパク質が
同じ一次転写物のスプライシングに由来のｍＲＮＡから
合成されるのでａｒｔ遺伝子がピリオン構造遺伝子の転
写後調節物質として作用することを示す（第１図）、
［Ｋｎｉｇｈｔ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３６：８３７−
８４０（１９８７）参照］。
る種のウィルスＲＮ＾はａｒｔ遺伝子の欠失したプロウ
ィルスを感受性細胞にトランスフェクトしたときに形成
され得るので、この複製欠陥は怒染の後期に生じると考
えられる。突然変異プロウィルスでトランスフェクトさ
れた細胞中ではキャプシド遺伝子タンパク質及びエンベ
ロープ遺伝子タンパク質はいずれも検出されなＩｖ’）
［５ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ凪、１掲；Ｆｅ
ｉｎｂｅｒｇ、上掲］、注目すべきは、機能的ｔａｔ遺
伝子産物がａｒｔ欠失プロウィルスによって形成される
ことである［５ｏｄｒｏｓｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３
２１．１掲］、これは、すべてのウィルスタンパク質が
同じ一次転写物のスプライシングに由来のｍＲＮＡから
合成されるのでａｒｔ遺伝子がピリオン構造遺伝子の転
写後調節物質として作用することを示す（第１図）、
［Ｋｎｉｇｈｔ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３６：８３７−
８４０（１９８７）参照］。
我々は、外来性遺伝子の発現を抑圧するために使用され
得る特殊ＤＮＡ配列を発見した。これらの抑制配列は、
ｔａｔＩ［遺伝子産物と違ってｃｉｓ作用配列なので、
その産生を調節すべき遺伝子の下流に配置される必要が
ある０発現阻害効果をもつ配列をｃｉｓ作用抑制（又は
調節）配列（ＣＢＳ）と指体する。
得る特殊ＤＮＡ配列を発見した。これらの抑制配列は、
ｔａｔＩ［遺伝子産物と違ってｃｉｓ作用配列なので、
その産生を調節すべき遺伝子の下流に配置される必要が
ある０発現阻害効果をもつ配列をｃｉｓ作用抑制（又は
調節）配列（ＣＢＳ）と指体する。
これらの配列は一般にＨＩＶ−１，■ＩＶ−１１、向ヒ
トＴ−リンパ球ウィルス（ＨＴＬＶ）タイプ４及び向サ
ルＴリンパ球ウィルス（ＳＴＬＶ）タイプ３のゲノムの
３′部分内の配列に対応する。また、夫々のａｒｔ遺伝
子産物に反応性の不連続配列も存在し、該配列は十分量
の該ａｒｔ３ｆｔ伝子産物の存在下にＣＲＳによる抑制
に拮抗する。これをｃｉｓ作用抗抑制（ＣＡＲ）配列と
指体する０本発明の開示に基づき当業者に公知の技術を
使用してＣＳＲ配列とＣＡＲ配列と所望の遺伝子とを含
むベクターを構築することが可能である。これらのベク
ターは完全ウィルスゲノムを含まない。好ましい具体例
ではベクターはａｒｔ遺伝子を含まない、好ましくは、
ｃｉｓ作用調節下の所望遺伝子が外来性遺伝子である。
トＴ−リンパ球ウィルス（ＨＴＬＶ）タイプ４及び向サ
ルＴリンパ球ウィルス（ＳＴＬＶ）タイプ３のゲノムの
３′部分内の配列に対応する。また、夫々のａｒｔ遺伝
子産物に反応性の不連続配列も存在し、該配列は十分量
の該ａｒｔ３ｆｔ伝子産物の存在下にＣＲＳによる抑制
に拮抗する。これをｃｉｓ作用抗抑制（ＣＡＲ）配列と
指体する０本発明の開示に基づき当業者に公知の技術を
使用してＣＳＲ配列とＣＡＲ配列と所望の遺伝子とを含
むベクターを構築することが可能である。これらのベク
ターは完全ウィルスゲノムを含まない。好ましい具体例
ではベクターはａｒｔ遺伝子を含まない、好ましくは、
ｃｉｓ作用調節下の所望遺伝子が外来性遺伝子である。
好ましくは、ＣＲＳ及びＣＡＲ配列は旧Ｖ−１ゲノム内
のヌクレオチド配列に対応する。しがしなから、別のウ
ィルスゲノムに対応するヌクレオチド配列の使用も可能
である。 ＩＩ（Ｖ−２もまた、その構造遺伝子に加え
てｔａｔ及びａｒｔ調節配列を含みｔｒａｎｓ活性化作
用を示す［Ｇｕｙａｄｅｒ、 Ｍ、等、Ｎａｔｕｒｅ
３２Ｂ＋６６２−６６９（１９８７）］、 、：、 ノ
ウィルスニ基づ＜ ＣＲＳ及ヒＣＡＲ配列は好ましくは
ｅｎｖ領域内のヌクレオチドに対応し、ＣＢＳは遺伝子
の非翻訳メツセージ中に存在するときに上流遺伝子のｃ
ｉｓ作用阻害（調節）効果を与えるに十分な数の該ヌク
レオチドに対応し、ＣＡＲはａｒｔ遺伝子産物の存在下
で前記阻害効果に拮抗するに十分な数の該ヌクレオチド
に対応する。
のヌクレオチド配列に対応する。しがしなから、別のウ
ィルスゲノムに対応するヌクレオチド配列の使用も可能
である。 ＩＩ（Ｖ−２もまた、その構造遺伝子に加え
てｔａｔ及びａｒｔ調節配列を含みｔｒａｎｓ活性化作
用を示す［Ｇｕｙａｄｅｒ、 Ｍ、等、Ｎａｔｕｒｅ
３２Ｂ＋６６２−６６９（１９８７）］、 、：、 ノ
ウィルスニ基づ＜ ＣＲＳ及ヒＣＡＲ配列は好ましくは
ｅｎｖ領域内のヌクレオチドに対応し、ＣＢＳは遺伝子
の非翻訳メツセージ中に存在するときに上流遺伝子のｃ
ｉｓ作用阻害（調節）効果を与えるに十分な数の該ヌク
レオチドに対応し、ＣＡＲはａｒｔ遺伝子産物の存在下
で前記阻害効果に拮抗するに十分な数の該ヌクレオチド
に対応する。
ＳＴＬＶ−：ｌびＨＴＬＶ−ＩＶ ハｔ タ、ＨＩＶ−
Ｉト構造的ニも機能的にも同様であること考えられるｔ
ａｔ及びａｒｔ調節配列と構造遺伝子とをもつ［Ｈｉｒ
ｓｃｈ、 Ｖ、等、旺肚姓：３０７−３１９（１９８７
）］。これらのウィルスに基づ＜ ＣＲＳ及びＣＡＲ配
列は好ましくはｅｎｖ領域内のヌクレオチドに対応し、
ＣＲＳは遺伝子の非翻訳メツセージに存在するときに上
流遺伝子にｃｉｓ作用抑制効果を与えるに十分な数の該
ヌクレオチドに対応し、ＣＡＲはａｒｔ遺伝子産物の存
在下にＣＲＳの阻害効果に拮抗するに十分な量のヌクレ
オチドに対応する。好ましくは、ＣＡＲ配列を誘導した
特定ウィルスによって産生されたａｒｔ３ｆ！伝子産物
に封子産物ａｒｔタンパク質とＣＡＲ配列とを接触させ
る。
Ｉト構造的ニも機能的にも同様であること考えられるｔ
ａｔ及びａｒｔ調節配列と構造遺伝子とをもつ［Ｈｉｒ
ｓｃｈ、 Ｖ、等、旺肚姓：３０７−３１９（１９８７
）］。これらのウィルスに基づ＜ ＣＲＳ及びＣＡＲ配
列は好ましくはｅｎｖ領域内のヌクレオチドに対応し、
ＣＲＳは遺伝子の非翻訳メツセージに存在するときに上
流遺伝子にｃｉｓ作用抑制効果を与えるに十分な数の該
ヌクレオチドに対応し、ＣＡＲはａｒｔ遺伝子産物の存
在下にＣＲＳの阻害効果に拮抗するに十分な量のヌクレ
オチドに対応する。好ましくは、ＣＡＲ配列を誘導した
特定ウィルスによって産生されたａｒｔ３ｆ！伝子産物
に封子産物ａｒｔタンパク質とＣＡＲ配列とを接触させ
る。
当業者に公知の技術を用いベクターを細胞にトランスフ
ェクトする。好ましくは、ベクターが更に、対応するウ
ィルスＬＴＩＩを含む、トランスフェクト細胞は所望遺
伝子産物を発現するため゛のｍＲＮ八を蓄積するが、ａ
ｒｔ遺伝子産物が添加されるまでは遺伝子産物を発現し
ない。好ましい具体例において、対応するウィルスＬＴ
Ｒとｔａｔタンパク買とを使用すると所望遺伝子産物の
発現が促進される。
ェクトする。好ましくは、ベクターが更に、対応するウ
ィルスＬＴＩＩを含む、トランスフェクト細胞は所望遺
伝子産物を発現するため゛のｍＲＮ八を蓄積するが、ａ
ｒｔ遺伝子産物が添加されるまでは遺伝子産物を発現し
ない。好ましい具体例において、対応するウィルスＬＴ
Ｒとｔａｔタンパク買とを使用すると所望遺伝子産物の
発現が促進される。
ａｒｔ遺伝子産物は当業者に公知の種々の方法で添加さ
れ得る０例えば、ａｒｔ逍伝遺伝物を発現するベクター
と細胞とを所定時間コトランスフェクトしてもよい、（
合成によって又は培養と精製とによって産生された）ａ
ｒｔ遺伝子産物は、所望時点で細胞に直接添加されても
よい。または、出発ベクターがａｒｔ遺伝子を含みこの
ａｒｔ遺伝子が二次因子のコントロール下にあってもよ
い。
れ得る０例えば、ａｒｔ逍伝遺伝物を発現するベクター
と細胞とを所定時間コトランスフェクトしてもよい、（
合成によって又は培養と精製とによって産生された）ａ
ｒｔ遺伝子産物は、所望時点で細胞に直接添加されても
よい。または、出発ベクターがａｒｔ遺伝子を含みこの
ａｒｔ遺伝子が二次因子のコントロール下にあってもよ
い。
好ましい方法においては、ａｒｔ遺伝子がａｒｔ細胞系
中に既に存在しており前記のごとく二次因子のコントロ
ール下にある。
中に既に存在しており前記のごとく二次因子のコントロ
ール下にある。
本明細書の説明ではＨＩＶ−１ゲノムを代表例として使
用したが、この説明が前記に列挙したその他のウィルス
ゲノム全般にも当てはまることは理解されよう。
用したが、この説明が前記に列挙したその他のウィルス
ゲノム全般にも当てはまることは理解されよう。
遺伝子の非翻訳メツセージ中で遺伝子の下流に挿入され
たときに所望遺伝子にｃｉｓ作用抑制効果を与えるに十
分な数の旧Ｖ−１ゲノム内のヌクレオチドに対応するヌ
クレオチドを含む以下のＤＮＡ配列を使用し得る。
たときに所望遺伝子にｃｉｓ作用抑制効果を与えるに十
分な数の旧Ｖ−１ゲノム内のヌクレオチドに対応するヌ
クレオチドを含む以下のＤＮＡ配列を使用し得る。
（ａ）領域６３７６−６７２５内の十分な数のヌクレオ
チドに対応するＣＢＳ、。
チドに対応するＣＢＳ、。
（ｂ）領域７２８３−７３２５内の十分な数のヌクレオ
チドに対応するＣＲＳ２： （ｃ）領域５８９３−６５３８内の十分な数のヌクレオ
チドに対応するＣＲＳ、；及び （ｄ）領域８２０４−８５９７内の十分な数のヌクレオ
チドに対応するＣＲＳ、。
チドに対応するＣＲＳ２： （ｃ）領域５８９３−６５３８内の十分な数のヌクレオ
チドに対応するＣＲＳ、；及び （ｄ）領域８２０４−８５９７内の十分な数のヌクレオ
チドに対応するＣＲＳ、。
タンパク質発現に最大の阻害効果を与えるのでＣＲＳ
、又はＣＲＳ、が好ましい、遺伝子が発現できるために
はＣＡＲ配列とＣＲＳ配列との双方を使用する必要があ
る。
、又はＣＲＳ、が好ましい、遺伝子が発現できるために
はＣＡＲ配列とＣＲＳ配列との双方を使用する必要があ
る。
ＣＡＲ配列は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２，ＳＴＬＶ−３
及びＨＴＬＶ−■に由来し、十分な量のａｒｔ遺伝子産
物の存在下にＣＲＳの阻害効果に拮抗するに十分な数の
ヌクレオチドに対応する。例えば、ＨＩＶ−Ｉ中のＣＡ
Ｒ，は、ａｒｔ遺伝子産物の存在下にｃｉｓ作用調節効
果に拮抗する領域６９６９−７１６３内の十分な数のヌ
クレオチドに対応する。ＣＡＲ２は、有効量のａｒｔ遺
伝子産物の存在下にＣＲＳ配列による抑制を解除する。
及びＨＴＬＶ−■に由来し、十分な量のａｒｔ遺伝子産
物の存在下にＣＲＳの阻害効果に拮抗するに十分な数の
ヌクレオチドに対応する。例えば、ＨＩＶ−Ｉ中のＣＡ
Ｒ，は、ａｒｔ遺伝子産物の存在下にｃｉｓ作用調節効
果に拮抗する領域６９６９−７１６３内の十分な数のヌ
クレオチドに対応する。ＣＡＲ２は、有効量のａｒｔ遺
伝子産物の存在下にＣＲＳ配列による抑制を解除する。
ＣＲＳ２の部分に対応する。ＨＩＶ−１ではＣＡＲ２
の使用が好ましい。
の使用が好ましい。
第２図（Δ）は遺伝子内ＨＩＶ−１配列中の前記１１１
Ｖ−ＩＣＳＲとＣＡＲとの対応する場所を示す。
Ｖ−ＩＣＳＲとＣＡＲとの対応する場所を示す。
我々は、）ＩＩＶ−１欠失突然変異体を使用することに
よって前記調節配列が上述のごとく機能することを証明
することに成功した。ＣＲＳはクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及びヒト成長ホル
モン（ｈＧＩ＋）のごとき外来性遺伝子の発現を負に調
節する。これらＣＲＳの効果はａｒｔ遺伝子産物の存在
下にＣＡＲ配列によって阻害される。
よって前記調節配列が上述のごとく機能することを証明
することに成功した。ＣＲＳはクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及びヒト成長ホル
モン（ｈＧＩ＋）のごとき外来性遺伝子の発現を負に調
節する。これらＣＲＳの効果はａｒｔ遺伝子産物の存在
下にＣＡＲ配列によって阻害される。
これらＣＲＳ及びＣＡＲ配列の多くは、ＨＩＶ−１ゲノ
ムの領域６３７６−７７６０、即ちｅｎｖｎ列配のイン
トロンに完全に内蔵されている。これらの配列を含むイ
ントロンはａｒｔ調節領域ｅｎｖ（＾ＲＥ）と指体され
る。
ムの領域６３７６−７７６０、即ちｅｎｖｎ列配のイン
トロンに完全に内蔵されている。これらの配列を含むイ
ントロンはａｒｔ調節領域ｅｎｖ（＾ＲＥ）と指体され
る。
コントロールに影響を与えることなく ５’ ＬＴＲは
外来性遺伝子プロモータエレメントで置換でき３’ Ｌ
ＴＲは外来性ポリアゾニレ−ジョンシグナルで置換でき
るので、ＣＡＴのごとき外来性遺伝子発現に対するｅｎ
ｖ遺伝子配列の調節効果はＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列に
左右されない。
外来性遺伝子プロモータエレメントで置換でき３’ Ｌ
ＴＲは外来性ポリアゾニレ−ジョンシグナルで置換でき
るので、ＣＡＴのごとき外来性遺伝子発現に対するｅｎ
ｖ遺伝子配列の調節効果はＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列に
左右されない。
外来性遺伝子の発現レベルを低下させる少な°くとも４
つの領域がＨＩＶ−１プロウイルスの３′半分内部で検
出された。プラスミド対ｐｌ［［＾Ｒ／ｐＡＲ−２及び
ｐ＾−６３７６／、＾−６７２５で示されるようにヌク
レオチド６３７６と６７２５との間の配列が除去される
とＣＡＴ遺伝子の発現は１０倍以上も増加し、従ってｃ
ｉｓ作用を負に調節する配列（ＣＲＳ、）を示す、外来
性遺伝子の発現に対する第２の強力な阻害効果は、例え
ばプラスミド対ｐｍ＾Ｒ／ｐＡＲ−７で示されるヌクレ
オチド８２０４と８５９７との間の配列（ＣＲＳ、）で
観察された。その他のより効果の小さい阻害配列は夫々
、プラスミド対ｐ＾−７２８３／ｐＡ−７３２５及びｐ
ＡＲ−２ＳＶ／ｐＡＲ−３ＳＶテ示されるようにヌクレ
オチド７２８３と７３２５との間（ＣＢＳ２）及びヌク
レオチド５８９３と６５３８との間（ＣＲＳ、）に存在
する。これらの抑制エレメントの１つ（ＣＲＳ、）は、
３’ ＬＴＲの近傍の３’ ｏｒｆ道伝子内部でエンベ
ロープ遺伝子の外部に存在する０機能的ｔａｔ及びａｒ
ｔ遺伝子の双方がＣＲＳ、を含むがＣＡＲ配列の欠失し
たｃＤＮ＾クローンから産生され得るので、ＣＢＳの効
果、特にＣＲＳ、の効果は配列の前後関係に依存する。
つの領域がＨＩＶ−１プロウイルスの３′半分内部で検
出された。プラスミド対ｐｌ［［＾Ｒ／ｐＡＲ−２及び
ｐ＾−６３７６／、＾−６７２５で示されるようにヌク
レオチド６３７６と６７２５との間の配列が除去される
とＣＡＴ遺伝子の発現は１０倍以上も増加し、従ってｃ
ｉｓ作用を負に調節する配列（ＣＲＳ、）を示す、外来
性遺伝子の発現に対する第２の強力な阻害効果は、例え
ばプラスミド対ｐｍ＾Ｒ／ｐＡＲ−７で示されるヌクレ
オチド８２０４と８５９７との間の配列（ＣＲＳ、）で
観察された。その他のより効果の小さい阻害配列は夫々
、プラスミド対ｐ＾−７２８３／ｐＡ−７３２５及びｐ
ＡＲ−２ＳＶ／ｐＡＲ−３ＳＶテ示されるようにヌクレ
オチド７２８３と７３２５との間（ＣＢＳ２）及びヌク
レオチド５８９３と６５３８との間（ＣＲＳ、）に存在
する。これらの抑制エレメントの１つ（ＣＲＳ、）は、
３’ ＬＴＲの近傍の３’ ｏｒｆ道伝子内部でエンベ
ロープ遺伝子の外部に存在する０機能的ｔａｔ及びａｒ
ｔ遺伝子の双方がＣＲＳ、を含むがＣＡＲ配列の欠失し
たｃＤＮ＾クローンから産生され得るので、ＣＢＳの効
果、特にＣＲＳ、の効果は配列の前後関係に依存する。
より好ましくは、ａｒｔ遺伝子産物の非存在下にｃｉｓ
作用抑制効果を所望遺伝子に与えるに十分な数ノＡＲＥ
領域（即ちＨＩＶ−１ゲ／ ムノ６３７６−７７６０）
Ｇ：対応するヌクレオチドを含むセグメントを使用する
。このｃｉｓ作用調節効果ａｒｔ遺伝子産物の存在下に
阻害される。このセグメントは非翻訳メツセージ中でそ
の発現をコントロールすべき遺伝子の下流に配置される
。このセグメントはｅｎｖ遺伝子内の主要スプライスの
供与配列と受容配列との間の配列に完全に対応する。へ
ＲＥ領域は旧ｖ−２，ＳＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−ＩＶ
ゲノムの対応部分に存在すると予想される。
作用抑制効果を所望遺伝子に与えるに十分な数ノＡＲＥ
領域（即ちＨＩＶ−１ゲ／ ムノ６３７６−７７６０）
Ｇ：対応するヌクレオチドを含むセグメントを使用する
。このｃｉｓ作用調節効果ａｒｔ遺伝子産物の存在下に
阻害される。このセグメントは非翻訳メツセージ中でそ
の発現をコントロールすべき遺伝子の下流に配置される
。このセグメントはｅｎｖ遺伝子内の主要スプライスの
供与配列と受容配列との間の配列に完全に対応する。へ
ＲＥ領域は旧ｖ−２，ＳＴＬＶ−３及びＨＴＬＶ−ＩＶ
ゲノムの対応部分に存在すると予想される。
少なくとも２つの異なる領域が、ＣＲＳによる発現の抑
制に拮抗するａｒｔ反応性配列であることが判明した。
制に拮抗するａｒｔ反応性配列であることが判明した。
ＣＡＲ２領域をｃｉｓ作用マイナス調節配列と共に使
用するのが好ましい。この配列（ＣＡＲ２）の少なくと
も一部が、プラスミド対ｐ＾−７２８３／ｐ＾−７３２
５で示されたようにヌクレオチド７２８３と７３２５と
の間に存在する４２個のヌクレオチド領域（ＣＲＳ ２
）内に存在する。しかしなから、これらの配列の欠失
したいくつかのプラスミドもａｒｔ遺伝子産物（例えば
ｐＡＲ−ＩＳＶ、ｚｓｖ及び３Ｓｖ）ニ反応性テアルコ
トカラ、少なくとも１つの別のａｒｔ反応性配列の存在
が予想される。プラスミドｐＡＲ−３ＳＶはａｒｔ遺伝
子産物に反応性でありこのプラスミドと同じ３′プロウ
ィルス配列、ヌクレオチド６３７６−６９６９を含むプ
ラスミドｐＢ−６３７６はａｒｔ反応性でないので、第
２ニレメン） （ＣＡＲ，）はヌクレオチド６９６９と
７１６３との間に存在する。
用するのが好ましい。この配列（ＣＡＲ２）の少なくと
も一部が、プラスミド対ｐ＾−７２８３／ｐ＾−７３２
５で示されたようにヌクレオチド７２８３と７３２５と
の間に存在する４２個のヌクレオチド領域（ＣＲＳ ２
）内に存在する。しかしなから、これらの配列の欠失
したいくつかのプラスミドもａｒｔ遺伝子産物（例えば
ｐＡＲ−ＩＳＶ、ｚｓｖ及び３Ｓｖ）ニ反応性テアルコ
トカラ、少なくとも１つの別のａｒｔ反応性配列の存在
が予想される。プラスミドｐＡＲ−３ＳＶはａｒｔ遺伝
子産物に反応性でありこのプラスミドと同じ３′プロウ
ィルス配列、ヌクレオチド６３７６−６９６９を含むプ
ラスミドｐＢ−６３７６はａｒｔ反応性でないので、第
２ニレメン） （ＣＡＲ，）はヌクレオチド６９６９と
７１６３との間に存在する。
ＣＡＲ２は４２個のヌクレオチドを含むＣＲＳ、領域の
一部であると定義した（第２図）、この配列中のヌクレ
オチド組成は極めてプリンに富む領域を含むので普通で
はない、このプリンに富む配列はウィルスの種々の菌株
中で保存されている（第２図）。ＣＡＲ。
一部であると定義した（第２図）、この配列中のヌクレ
オチド組成は極めてプリンに富む領域を含むので普通で
はない、このプリンに富む配列はウィルスの種々の菌株
中で保存されている（第２図）。ＣＡＲ。
を含む領域内部に別のプリンに富む配列が保存されてい
る。しかしなから、ＣＡＲ、のプリンに富む領域内部の
配列は第２図に示すＣＡＲ２の配列と同じではない。
る。しかしなから、ＣＡＲ、のプリンに富む領域内部の
配列は第２図に示すＣＡＲ２の配列と同じではない。
本発明によれば、多段階的（ｍｕｌｔｉ−ｔｉｅｒｅｄ
）３１１伝子発現系の作成が可能である。例えば、所望
の遺転子、好ましくは外来性遺伝子をＣＲＳのコントロ
ール下に配置すると、 ＣＡＲが十分な量のａｒｔ遺伝
子産物に暴露されることによって活性化（ｔｕｒｎ ｏ
ｎ）されＣＲＳの阻害効果に拮抗するようになるまで所
望遺伝子の発現を阻止し得る。理論的に確認されてはい
ないが、ＣＲＳは該ＣＲＳを含むｍＲＨＡの翻訳を停止
させると考えることが可能である。ＣＡＲ配列はａｒｔ
タンパク質の存在下にＣＲＳを含むメツセージの翻訳を
再開させる。第１１図及び第１２図参照、第１１図は２
０Ｋｄのａｒｔタンパク質と遺伝子のｍＲＨＡのＣＡＲ
領域との間の推定される相互作用を示す、第１２図はＣ
ＲＳとＣＡＲとを含むｍＲＮへの翻訳がａｒｔタンパク
質の非存在下に停止されａｒｔタンパク質の存在下に開
始されることを示す。
）３１１伝子発現系の作成が可能である。例えば、所望
の遺転子、好ましくは外来性遺伝子をＣＲＳのコントロ
ール下に配置すると、 ＣＡＲが十分な量のａｒｔ遺伝
子産物に暴露されることによって活性化（ｔｕｒｎ ｏ
ｎ）されＣＲＳの阻害効果に拮抗するようになるまで所
望遺伝子の発現を阻止し得る。理論的に確認されてはい
ないが、ＣＲＳは該ＣＲＳを含むｍＲＨＡの翻訳を停止
させると考えることが可能である。ＣＡＲ配列はａｒｔ
タンパク質の存在下にＣＲＳを含むメツセージの翻訳を
再開させる。第１１図及び第１２図参照、第１１図は２
０Ｋｄのａｒｔタンパク質と遺伝子のｍＲＨＡのＣＡＲ
領域との間の推定される相互作用を示す、第１２図はＣ
ＲＳとＣＡＲとを含むｍＲＮへの翻訳がａｒｔタンパク
質の非存在下に停止されａｒｔタンパク質の存在下に開
始されることを示す。
ｅｎｖａ伝子中封子ＲＳに加えてｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子
封子少なくとも１つのＣＲＳが存在する。第１３図はＨ
ＩＶ−ｌゲノムの概略説明図である。第１４図は＾ＲＥ
領域及びＧＡＧ−ＰＯＬ領域のＣＲＳ配列を示す、調節
遺伝子及び構造遺伝子のメツセンジャーＲＮ＾も図示さ
れている＊ ｇａｇ、 ｐｏｌ及びｅｎＶは、ａｒｔと
ＣＡＲとが共存する場合以外は発現を阻止するＣＲＳ及
びＣＡＲ配列を含むが、ｔａｔ、 ａｒｔ及び３°ｏｒ
ｆはかかる配列を含ますａｒｔとは無関係に発現する。
封子少なくとも１つのＣＲＳが存在する。第１３図はＨ
ＩＶ−ｌゲノムの概略説明図である。第１４図は＾ＲＥ
領域及びＧＡＧ−ＰＯＬ領域のＣＲＳ配列を示す、調節
遺伝子及び構造遺伝子のメツセンジャーＲＮ＾も図示さ
れている＊ ｇａｇ、 ｐｏｌ及びｅｎＶは、ａｒｔと
ＣＡＲとが共存する場合以外は発現を阻止するＣＲＳ及
びＣＡＲ配列を含むが、ｔａｔ、 ａｒｔ及び３°ｏｒ
ｆはかかる配列を含ますａｒｔとは無関係に発現する。
ＣＲＳによる阻害効果がａｒｔ逍伝遺封子によって解除
されるためには同じ遺伝子内にＣＡＲが存在しなければ
ならない。
されるためには同じ遺伝子内にＣＡＲが存在しなければ
ならない。
好ましくは遺伝子産物はＨＩＶｉ ＬＴｒｌ配列のコ
ントロール下にある。その後、発現が最終的に行なわれ
るときに、ｔａｔ ［１遺伝子産物が存在していると極
めて高レベルのタンパク質産生が生じる。しかしなから
、これ−らのＬＴＲは置換可能であり、例えば５°ＬＴ
Ｒは外来性プロモーターエレメントで置換され、３°Ｌ
ＴＲは外来性ポリアゾニレ−ジョンシグナルで置換され
得る。かかる系の好ましい具体例においてはＨＴＬＶ−
１又は■のＬＴＲが使用される。
ントロール下にある。その後、発現が最終的に行なわれ
るときに、ｔａｔ ［１遺伝子産物が存在していると極
めて高レベルのタンパク質産生が生じる。しかしなから
、これ−らのＬＴＲは置換可能であり、例えば５°ＬＴ
Ｒは外来性プロモーターエレメントで置換され、３°Ｌ
ＴＲは外来性ポリアゾニレ−ジョンシグナルで置換され
得る。かかる系の好ましい具体例においてはＨＴＬＶ−
１又は■のＬＴＲが使用される。
かかるＬＴＲはまた、ｔａｔ Ｉ又はｔａｔＩＩ遺伝子
産物によってｔｒａｎｓ活性化され所望遺伝子産物の発
現を増加し得る。
産物によってｔｒａｎｓ活性化され所望遺伝子産物の発
現を増加し得る。
例えば、ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列を含み、ポリアゾニ
レ−ジョン配列が削除された所望遺伝子が該配列の下流
に存在し、ＣＲＳ及びＣＡＲ配列が該遺伝子の非翻訳メ
ツセージ中で融合している前記タイプの発現ベクターを
使用し得る。このベクターは、ａｒｔ遺伝子が二次因子
のコントロール下にない限り機能的ａｒｔ遺伝子を含ま
ないであろう、ベクターがａｒｔ遺伝子を含まないのが
好ましい。好適具体例において、ベクターは＾ＲＥ配列
に対応する十分なヌクレオチドを含む。好ましくはまた
、機能的ｔａｔ ｌ［遺伝子産物を発現するに十分なｔ
ａｔ ｍ遺伝子のヌクレオチドが存在する。かかるベク
ターは当業者によって容易に構築され得る。
レ−ジョン配列が削除された所望遺伝子が該配列の下流
に存在し、ＣＲＳ及びＣＡＲ配列が該遺伝子の非翻訳メ
ツセージ中で融合している前記タイプの発現ベクターを
使用し得る。このベクターは、ａｒｔ遺伝子が二次因子
のコントロール下にない限り機能的ａｒｔ遺伝子を含ま
ないであろう、ベクターがａｒｔ遺伝子を含まないのが
好ましい。好適具体例において、ベクターは＾ＲＥ配列
に対応する十分なヌクレオチドを含む。好ましくはまた
、機能的ｔａｔ ｌ［遺伝子産物を発現するに十分なｔ
ａｔ ｍ遺伝子のヌクレオチドが存在する。かかるベク
ターは当業者によって容易に構築され得る。
次に、ベクターを細胞にトランスフェクトする。
使用ベクターがｔａｔ ［１配列を含まないときは、細
胞をｔａｔｌ［遺伝子産物と接触させるのが好ましい。
胞をｔａｔｌ［遺伝子産物と接触させるのが好ましい。
かかる接触は種々の方法で行なうことができる。
例えば、米国特許出願第８０６２６３号に記載のごとく
ベクターをｔａｔｌＬＪｌ胞系にトランスフェクトして
もよい、または、トランスフェクトした細胞をＬａｔＩ
［［ａ封子とコトランスフェクトしてもよく、またはｔ
ａｔＩ［［遺伝子産物を細胞に添加してもよい。
ベクターをｔａｔｌＬＪｌ胞系にトランスフェクトして
もよい、または、トランスフェクトした細胞をＬａｔＩ
［［ａ封子とコトランスフェクトしてもよく、またはｔ
ａｔＩ［［遺伝子産物を細胞に添加してもよい。
ＣＢＳの結果として、所望遺伝子の多量のｍＲＨＡが得
られるが、この遺伝子はＣＡＲがＣＲＳの効果に拮抗す
るまで発現されない、この抗ＣＲＳ効果は、ＣＡＲが十
分な量のａｒｔ遺伝子産物に暴露されるまで生じない。
られるが、この遺伝子はＣＡＲがＣＲＳの効果に拮抗す
るまで発現されない、この抗ＣＲＳ効果は、ＣＡＲが十
分な量のａｒｔ遺伝子産物に暴露されるまで生じない。
ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−ＩＶ及びＳＴＬＶ−３のｔａｔ
及びａｒｔ配列は既知であり、機能的遺伝子を含むベク
ターは、これらのウィルスゲノムに対応するＣＢＳ及び
ＣへＲ領域を使用し本明細書の開示に基づいて当業者に
よって容易に調製され得る。
及びａｒｔ配列は既知であり、機能的遺伝子を含むベク
ターは、これらのウィルスゲノムに対応するＣＢＳ及び
ＣへＲ領域を使用し本明細書の開示に基づいて当業者に
よって容易に調製され得る。
ａｒｔ遺伝子産物にＣＡＲを暴露するためには種々のメ
カニズムを使用できる。例えば、予め選択された所望時
点で細胞培地にａｒｔ遺伝子産物を直接添加してもよい
。または、ａｒｔ遺伝子を二次因子のコントロール下に
維持し、予め選択された所望の時点まで活性化（ｔｕｒ
ｎ ｏｎ）されないようにしてもよい、かかるａｒｔ遺
伝乎はａｒｔ細胞系の使用によって細胞内に既に存在し
てもよく、又はａｒｔ遺伝子がベクターに存在していて
もよい、二次因子は例。
カニズムを使用できる。例えば、予め選択された所望時
点で細胞培地にａｒｔ遺伝子産物を直接添加してもよい
。または、ａｒｔ遺伝子を二次因子のコントロール下に
維持し、予め選択された所望の時点まで活性化（ｔｕｒ
ｎ ｏｎ）されないようにしてもよい、かかるａｒｔ遺
伝乎はａｒｔ細胞系の使用によって細胞内に既に存在し
てもよく、又はａｒｔ遺伝子がベクターに存在していて
もよい、二次因子は例。
えば、温度依存性で所定の温度に到達するまでタンパク
質を発現させない因子でもよく又はホルモンのごとき化
学因子でもよい。また、予め選択された所望の時点でａ
ｒｔ遺伝子を含むベクターを細胞にトランスフェクトし
てもよく、又はトランスフェクト細胞とａｒｔ細胞系と
を共生培養してもよい、米国特許出願第８６５１５１号
参照。
質を発現させない因子でもよく又はホルモンのごとき化
学因子でもよい。また、予め選択された所望の時点でａ
ｒｔ遺伝子を含むベクターを細胞にトランスフェクトし
てもよく、又はトランスフェクト細胞とａｒｔ細胞系と
を共生培養してもよい、米国特許出願第８６５１５１号
参照。
十分な量のａｒｔ遺伝子産物に暴露されるとＣＡＲはＣ
ＲＳの阻害効果を抑制し、所望のタンパク質が迅速に発
現されるであろう、高レベルの輸ＲＮ＾が既に蓄積され
ているので所望の遺伝子産物の高レベル発現が短時間で
得られる。この発現がｔａｔＩ［［遺伝子産物の存在下
にＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲの支配下で行なわれるときは極
めて高レベルのタンパク質発現が生じる。従って、細胞
の死又は外来性タンパク質に対する酵素の攻撃のごとき
外来性遺伝子の発現に伴う問題が極めて発生し難い。更
に、これらの不連続ＣＲＳ及びＣＡＲ配列を使用するこ
とによって、ｅｎｖ（及び／又はｇａｇ）所望遺伝子産
物融合タンパク質の形成が阻止される。
ＲＳの阻害効果を抑制し、所望のタンパク質が迅速に発
現されるであろう、高レベルの輸ＲＮ＾が既に蓄積され
ているので所望の遺伝子産物の高レベル発現が短時間で
得られる。この発現がｔａｔＩ［［遺伝子産物の存在下
にＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲの支配下で行なわれるときは極
めて高レベルのタンパク質発現が生じる。従って、細胞
の死又は外来性タンパク質に対する酵素の攻撃のごとき
外来性遺伝子の発現に伴う問題が極めて発生し難い。更
に、これらの不連続ＣＲＳ及びＣＡＲ配列を使用するこ
とによって、ｅｎｖ（及び／又はｇａｇ）所望遺伝子産
物融合タンパク質の形成が阻止される。
理論的に確認されてはいないが、エンベロープ遺伝子内
部のｃｉｓ作用阻害配列及びａｒｔ反応性配列の存在が
ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子発現のａｒｔ依存性を説明し得
る。ｇａｇ及びｅｎｖタンパク質の合成を誘導するｍＲ
Ｎ＾はいずれもＣＡＲｌ、２．１及び、を含むので、へ
ＲＥ領域内部のＣＲＳはｇａｇ及びｅｎｖタンパク質の
発現を抑圧するのであろう＊ ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子
の発現の抑圧はａｒｔ産物の存在下にＣＡＲ、及びＣＡ
Ｒ，配列によって解除されるであろう。その他の■ＩＶ
コード領域、例えばｇａｇ及びｐａｌ遺伝子の内部にも
同様の調節配列が存在すると推測される０本文中で報告
された調節効果のいくつかは外来性遺伝子アッセイで使
用されたときにのみ明らかになるという考え方もある。
部のｃｉｓ作用阻害配列及びａｒｔ反応性配列の存在が
ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子発現のａｒｔ依存性を説明し得
る。ｇａｇ及びｅｎｖタンパク質の合成を誘導するｍＲ
Ｎ＾はいずれもＣＡＲｌ、２．１及び、を含むので、へ
ＲＥ領域内部のＣＲＳはｇａｇ及びｅｎｖタンパク質の
発現を抑圧するのであろう＊ ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子
の発現の抑圧はａｒｔ産物の存在下にＣＡＲ、及びＣＡ
Ｒ，配列によって解除されるであろう。その他の■ＩＶ
コード領域、例えばｇａｇ及びｐａｌ遺伝子の内部にも
同様の調節配列が存在すると推測される０本文中で報告
された調節効果のいくつかは外来性遺伝子アッセイで使
用されたときにのみ明らかになるという考え方もある。
しかしなから、ＣＡＴ及びｈＧＨ遺伝子の調節がｇａｇ
及びｅｎｖ遺伝子の調節と極めて類似しているのでその
可能性は少ないと考えられる。
及びｅｎｖ遺伝子の調節と極めて類似しているのでその
可能性は少ないと考えられる。
本発明で使用したアッセイにおいて、ＨｒＶ−ＩＣＲＳ
が欠失したプラスミドではａｒｔ遺伝子産物の存在下で
外来性遺伝子発現の有意な付加的増加は全く観察されな
いので、ＣＡＲの表現型はＣＲＳの効果を除去する機能
をもつ。遺伝子内ｃｉｓ作用調節配列の存在は先例がな
いわけではない０例えば、ラウス肉腫ウィルスのｇａｇ
遺伝子内部の配列はエンハンサ−エレメントとして機能
する［＾ｒｒｉｇｏ等、Ｈｏｔ。
が欠失したプラスミドではａｒｔ遺伝子産物の存在下で
外来性遺伝子発現の有意な付加的増加は全く観察されな
いので、ＣＡＲの表現型はＣＲＳの効果を除去する機能
をもつ。遺伝子内ｃｉｓ作用調節配列の存在は先例がな
いわけではない０例えば、ラウス肉腫ウィルスのｇａｇ
遺伝子内部の配列はエンハンサ−エレメントとして機能
する［＾ｒｒｉｇｏ等、Ｈｏｔ。
Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、７：３８８−３９７（１９８７
）］、 Ｌがしなから発明者等の得た結果は、ＣＡＲ配
列は転写エンハンサ−エレメントに特有の特性をもたな
いことが証明された。 ＣＡＲ２配列の活性はプラスミ
ド対ｐＡＲ−１ｓＶ／ｐ＾Ｒ−ＩＳＶＲで証明されるよ
うに方向依存性である。
）］、 Ｌがしなから発明者等の得た結果は、ＣＡＲ配
列は転写エンハンサ−エレメントに特有の特性をもたな
いことが証明された。 ＣＡＲ２配列の活性はプラスミ
ド対ｐＡＲ−１ｓＶ／ｐ＾Ｒ−ＩＳＶＲで証明されるよ
うに方向依存性である。
更に、ＣＡＲ配列はａｒｔの有無にかかわりな（ＨＴＬ
Ｖ−■プロモーターのエンハンサ−エレメントの代わり
となることはできない。
Ｖ−■プロモーターのエンハンサ−エレメントの代わり
となることはできない。
公知のａｒｔ−ＡＲＥ系による調節経路は、調節タンパ
ク質相メツセージと及びピリオン構造タンパク質用メツ
セージとを区別して使用し得る。この調節においてＣＲ
Ｓがｃｉｓ形（ｉｎ ｃｉｓ）遺伝子発現を阻害する重
要な役割を果たすことが判明した。 ＣＡＲ配列が存在
しないときＣＲＳ配列の阻害効果は強く、ａｒｔ産物の
影響を受けない、 ＣＲＳ配列はｍＲＮ＾の翻訳を遮断
すべく機能するか又はｍＲＮ＾の安定性を失わせる。
ｍＲＮ＾の半減期を短縮させる配列の存在が最近報告さ
れている［Ｋａｍｅｎ等、Ｃｅ１ｌ ４Ｂ＋６５９−６
６７（１９８６）］、ヒトリンホカイン遺伝子ＧＭＣＳ
Ｆの３°非コード領域に由来のヌクレオチド５１個の八
Ｔに富む配列をウサギβグロブリン遺伝子の３°非翻訳
領域に導入するとβグロブリンｍＲＮ＾の半減期ががな
り短縮される［Ｋａｍｃｎ等、玉揚］０本文中に記載の
ＣＲＳ領域内部の配列が同様の活性を与えている可能性
もある０例えば、ＣＡＲ配列をｃｉｓ作用調節配列と共
に３′非翻訳領域に配置すると、このＧＭＣＳＦ ｃｉ
ｓ作用配列はａｒｔタンパク質の存在下でＧＭＣＳＦ
ｃｉｓ作用阻害に拮抗するであろう、また、遺伝予肉転
写末端配列の存在も報告されている［Ｊｏｈｎｓｏｎ等
、Ｍｏｌ。
ク質相メツセージと及びピリオン構造タンパク質用メツ
セージとを区別して使用し得る。この調節においてＣＲ
Ｓがｃｉｓ形（ｉｎ ｃｉｓ）遺伝子発現を阻害する重
要な役割を果たすことが判明した。 ＣＡＲ配列が存在
しないときＣＲＳ配列の阻害効果は強く、ａｒｔ産物の
影響を受けない、 ＣＲＳ配列はｍＲＮ＾の翻訳を遮断
すべく機能するか又はｍＲＮ＾の安定性を失わせる。
ｍＲＮ＾の半減期を短縮させる配列の存在が最近報告さ
れている［Ｋａｍｅｎ等、Ｃｅ１ｌ ４Ｂ＋６５９−６
６７（１９８６）］、ヒトリンホカイン遺伝子ＧＭＣＳ
Ｆの３°非コード領域に由来のヌクレオチド５１個の八
Ｔに富む配列をウサギβグロブリン遺伝子の３°非翻訳
領域に導入するとβグロブリンｍＲＮ＾の半減期ががな
り短縮される［Ｋａｍｃｎ等、玉揚］０本文中に記載の
ＣＲＳ領域内部の配列が同様の活性を与えている可能性
もある０例えば、ＣＡＲ配列をｃｉｓ作用調節配列と共
に３′非翻訳領域に配置すると、このＧＭＣＳＦ ｃｉ
ｓ作用配列はａｒｔタンパク質の存在下でＧＭＣＳＦ
ｃｉｓ作用阻害に拮抗するであろう、また、遺伝予肉転
写末端配列の存在も報告されている［Ｊｏｈｎｓｏｎ等
、Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ６：４００８−４０１８（１
９８６）］、 Ｌかしなから、ｔａｔ産物は完全長さの
プロウィルス種に由来のスプライス転写物から製造され
ｔａｔの発現はａｒｔに依存しないので、ＣＲＳが転写
ターミネータとして機能するという可能性は薄い。
９８６）］、 Ｌかしなから、ｔａｔ産物は完全長さの
プロウィルス種に由来のスプライス転写物から製造され
ｔａｔの発現はａｒｔに依存しないので、ＣＲＳが転写
ターミネータとして機能するという可能性は薄い。
ピリオン構造遺伝子及び調節遺伝子の区別的発現（ｄｉ
ＩＶｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、Ｔ
４＋リンパ球に致死性のｅｎｖのごときウィルス遺伝子
産物が発現されないときに調節遺伝子を発現させること
によってウィルス潜伏期の成立に重要な役割を果たすか
もしれない、また、調節遺伝子と構造遺伝子との区別的
発現は、ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子産物の合成に先立って
ｔａｔｌ［のごとき遺伝子産物を蓄積させるので溶菌サ
イクルで重要な役割を果たすかもしれない。
ＩＶｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、Ｔ
４＋リンパ球に致死性のｅｎｖのごときウィルス遺伝子
産物が発現されないときに調節遺伝子を発現させること
によってウィルス潜伏期の成立に重要な役割を果たすか
もしれない、また、調節遺伝子と構造遺伝子との区別的
発現は、ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子産物の合成に先立って
ｔａｔｌ［のごとき遺伝子産物を蓄積させるので溶菌サ
イクルで重要な役割を果たすかもしれない。
これらの配列によってＣＡＲ配列を不活性化する方法を
研究することも可能である。かかる結果を利用し、構造
遺伝子産物の発現を阻止しウィルスを潜伏期間に維持す
ることが可能である。
研究することも可能である。かかる結果を利用し、構造
遺伝子産物の発現を阻止しウィルスを潜伏期間に維持す
ることが可能である。
本発明はまた弱毒生ワクチンの製造に使用することも可
能である。 ＣＡＲ領域全部が除去されたプロウィルス
を使用することによって、ウィルスは調節タンパク質を
産生ずるが構造タンパク質を産生ぜず、従って病気を発
症させることができない。
能である。 ＣＡＲ領域全部が除去されたプロウィルス
を使用することによって、ウィルスは調節タンパク質を
産生ずるが構造タンパク質を産生ぜず、従って病気を発
症させることができない。
しかしなから、調節タンパク質に対する抗原反応は生じ
る可能性がある。
る可能性がある。
本発明を実施例に基づいて以下に詳細に説明する。これ
らの実施例は本発明の理解を容易にするために例示され
たものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定さ
れると解釈してはならない。
らの実施例は本発明の理解を容易にするために例示され
たものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定さ
れると解釈してはならない。
１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰ旧−１６４０培地でＪ
ｕｒｋａｔ Ｌａｔｌ［Ｉ ｆｔ！ｉ胞を増殖した。１
０％ウシ胎児血清を加えたダルベツコ改質イーグル培地
（ＤＭＥ）で１１ｅｌａ ｔａｔｌ［［とＣＨＯｔａｔ
ｎ［細胞とを増殖した。米国特許出願第８０６２６３号
に教示された方法でＪｕｒｋａｔ、！１ｅｌａ及びＣＩ
Ｉ Ｏ＋！ＩＩＩ胞に欠失両栄養性（ａｍｐｈｏｔｒｏ
ｐｉｃ）レトロウィルスｔａｔｌ［発現ベクターを感染
させることによってｔａｔｎ１３ｆｔ伝子の安定な発現
を達成した［Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５
５５−５５９（１９８６）も参照コ。
ｕｒｋａｔ Ｌａｔｌ［Ｉ ｆｔ！ｉ胞を増殖した。１
０％ウシ胎児血清を加えたダルベツコ改質イーグル培地
（ＤＭＥ）で１１ｅｌａ ｔａｔｌ［［とＣＨＯｔａｔ
ｎ［細胞とを増殖した。米国特許出願第８０６２６３号
に教示された方法でＪｕｒｋａｔ、！１ｅｌａ及びＣＩ
Ｉ Ｏ＋！ＩＩＩ胞に欠失両栄養性（ａｍｐｈｏｔｒｏ
ｐｉｃ）レトロウィルスｔａｔｌ［発現ベクターを感染
させることによってｔａｔｎ１３ｆｔ伝子の安定な発現
を達成した［Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５
５５−５５９（１９８６）も参照コ。
これらの細胞系の樹立に使用したレトロウィルスベクタ
ーは完全形（ｉｎｔａｃｔ）ａｒｔ逍伝遺封子まずその
ままでａｒｔ発現することはできない、ここで使用した
Ｊｕｒｋａｔ ｔａＬ ｍ及びＣＨＯｔａｔ ｍ細胞系
のｔａｔ ｌ［の安定な発現は、標準方法を使用し両栄
養性レトロウィルスｔａｔ ｌ［ｃＤＮＤＮＡベクター
を感染させることによって得られた。このベクターは、
ｔａｔｌ［［ｃＤＮ＾ＤＮＡメント［＾ｒｙａ等、玉揚
］をプラスミドｐＺＩＰＮＥＯｓＶ（ｘ）１［Ｃｅｐｋ
ｏ等、Ｃｅ１ｌ ３７：１０５３−１０６２（１９８４
）］のＢａｍＨｒ部位に挿入することによって構築され
た。これらの細胞系中の機能的ｔａＬ産物の存在は、■
ＩＶ−Ｉ ＬＴＲに支配されるＣＡＴ遺伝子発現レベ
ルがｔａｔ陰性細胞系で得られる発現レベルに比較して
高いことによって確認される。使用されたｔａｔ［［ｃ
ＤＮＤＮＡベクターではａｒｔ遺伝子の第２エキソンが
欠失している。
ーは完全形（ｉｎｔａｃｔ）ａｒｔ逍伝遺封子まずその
ままでａｒｔ発現することはできない、ここで使用した
Ｊｕｒｋａｔ ｔａＬ ｍ及びＣＨＯｔａｔ ｍ細胞系
のｔａｔ ｌ［の安定な発現は、標準方法を使用し両栄
養性レトロウィルスｔａｔ ｌ［ｃＤＮＤＮＡベクター
を感染させることによって得られた。このベクターは、
ｔａｔｌ［［ｃＤＮ＾ＤＮＡメント［＾ｒｙａ等、玉揚
］をプラスミドｐＺＩＰＮＥＯｓＶ（ｘ）１［Ｃｅｐｋ
ｏ等、Ｃｅ１ｌ ３７：１０５３−１０６２（１９８４
）］のＢａｍＨｒ部位に挿入することによって構築され
た。これらの細胞系中の機能的ｔａＬ産物の存在は、■
ＩＶ−Ｉ ＬＴＲに支配されるＣＡＴ遺伝子発現レベ
ルがｔａｔ陰性細胞系で得られる発現レベルに比較して
高いことによって確認される。使用されたｔａｔ［［ｃ
ＤＮＤＮＡベクターではａｒｔ遺伝子の第２エキソンが
欠失している。
７ラノ、 ９ Ｆ復潴−
すべてのＤＮＡ操作は本質的にＨａｎｉａｔｉｓ等（１
９８３）に記載の方法で行なわれた。プラスミド構築物
の各々を以下に簡単に説明する。ヌクレオチド位置の番
号はＲＮ＾開始部位＋１に対する番号である。どのプロ
ウィルス配列もプラスミド１ｌＸＢｃ２［Ｆｉｓｈｅｒ
等、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：２６２−２６５（１９８５
）１から得られたものである。
９８３）に記載の方法で行なわれた。プラスミド構築物
の各々を以下に簡単に説明する。ヌクレオチド位置の番
号はＲＮ＾開始部位＋１に対する番号である。どのプロ
ウィルス配列もプラスミド１ｌＸＢｃ２［Ｆｉｓｈｅｒ
等、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：２６２−２６５（１９８５
）１から得られたものである。
（ｉ ）ｐ）１３−ａｒｔ、 ｃＤＮ＾ＤＮＡン［＾ｒ
ｙａ等、玉揚］を出発材料とし、Ｂａｌ ３１エキソヌ
クレアーゼ［Ｌｅｇａｒｓｋｉ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ、 ５：１４４５−１４６０（１９
８７）コで部分消化し次に５ａｌｔで開裂することによ
ってａｒｔコード領域を得た。 ａｒｔコード領域を含
むフラグメントを、ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲヌクレオチド
−１６７〜＋８１とプラスミドｐＳＶ２−β［Ｍｕｌｌ
ｇａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８−１１４（１
９７７）］の１１３ｇ１ＩＩ −ＥｃｏＲｌフラグメン
トから得られたＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル
との間に存在する５ｐ６４マルチプル制限酵素リンカ−
（Ｐｒｏ−ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ＞にクローニング
した。 ｐＨ３−ａｒｔを第４図（＾）に示す、 ａｒ
ｔ遺伝子の境界は、ｅｎｖ遺伝子の５゛側とｅｎｖ遺伝
子の３゛部分の内部とに位置する突然変異体がいずれも
ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子発現に対して同様の表現型を与
えるという観察に基づいて発見された。別の読取枠によ
ってａｒｔ遺伝子はｔａｔｌ［［の第１及び第２のエキ
ソンと部分的にオーバーラツプする２つのコードエキソ
ンから成る。第１エキソンは位置５５５０のメチオニン
コドンから開始してヌクレオチド５６２５の既知のスプ
ライス供与部位に延びており、ヌクレオチド７９５６の
スプライス受容部位の次にヌクレオチド８２７７の終結
コドンで終結するｉｒｒｆｒａｍｅ読取枠が続く、この
実験では、ｔａｔｌｌｌ及びａｒｔの双方のコード配列
を含むＨＩＶ−１のｃＤＮ＾（＾ｒｙａ等、玉揚、但し
ＨＩＶ−Ｊ ｃＤＮ＾の任意のソースを使用できる）
をＢａｔ ３１エキソヌクレアーゼで処理して、予想さ
れたａｒｔ開始コドンの５′側に存在するＬａｔｌｎ＾
ＴＧコドンを除去した。完全形ａｒｔコード領域を含み
ｔａｔｌ［［＾ＴＧコドンが欠失したｃＤＮＡフラグメ
ントを標準一過性発現ベクターｐＨ３にサブクローニン
グした。このベクターは、エンハンサ；しロモーターと
ＴＡＲ配列（ｔａｔに反応性の配列）を含むＨＩＶ−Ｉ
ＬＴＲの一部分とＳＶ４０ウィルスから得られたポ
リアゾニレ−ジョンシグナルとを含む。ｐ）Ｉ３−ａｒ
ｔ中に存在する配列が図の下部に示されている。高レベ
ルのａｒｔ遺伝子発現を達成するために、ｔａｔｌ［産
物を構成的に発現するがａｒｔ遺伝子産物を合成できな
いＪｕｒｋａｔ細胞中で一過性発現実験を行なった［米
国特許出願第８６５１５１号；Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１主、玉揚コ、 ａｒｔ陰性プロウィルスＨＸ
Ｂｃ２−Ｂｆｓ［５ｏｄｒｏｓｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：４１２−４１７（１９８６）］とのコトランス
フェクション後にｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の発現を補完
する能力を検査することによってｐＨ３−ａｒｔの活性
を評価した。第４図（Ｂ）参照、対照実験では、Ｉ（Ｘ
Ｂｃ２−ＢｆｓとゲノムＤＮ＾フラグメント内のａｒｔ
を発現するプラスミドｐＥｘ５４９８ｖｅｎｖとをコト
ランスフェクトした［米国特許出願第８６５１５１号］
。
ｙａ等、玉揚］を出発材料とし、Ｂａｌ ３１エキソヌ
クレアーゼ［Ｌｅｇａｒｓｋｉ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ、 ５：１４４５−１４６０（１９
８７）コで部分消化し次に５ａｌｔで開裂することによ
ってａｒｔコード領域を得た。 ａｒｔコード領域を含
むフラグメントを、ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲヌクレオチド
−１６７〜＋８１とプラスミドｐＳＶ２−β［Ｍｕｌｌ
ｇａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８−１１４（１
９７７）］の１１３ｇ１ＩＩ −ＥｃｏＲｌフラグメン
トから得られたＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル
との間に存在する５ｐ６４マルチプル制限酵素リンカ−
（Ｐｒｏ−ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ＞にクローニング
した。 ｐＨ３−ａｒｔを第４図（＾）に示す、 ａｒ
ｔ遺伝子の境界は、ｅｎｖ遺伝子の５゛側とｅｎｖ遺伝
子の３゛部分の内部とに位置する突然変異体がいずれも
ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子発現に対して同様の表現型を与
えるという観察に基づいて発見された。別の読取枠によ
ってａｒｔ遺伝子はｔａｔｌ［［の第１及び第２のエキ
ソンと部分的にオーバーラツプする２つのコードエキソ
ンから成る。第１エキソンは位置５５５０のメチオニン
コドンから開始してヌクレオチド５６２５の既知のスプ
ライス供与部位に延びており、ヌクレオチド７９５６の
スプライス受容部位の次にヌクレオチド８２７７の終結
コドンで終結するｉｒｒｆｒａｍｅ読取枠が続く、この
実験では、ｔａｔｌｌｌ及びａｒｔの双方のコード配列
を含むＨＩＶ−１のｃＤＮ＾（＾ｒｙａ等、玉揚、但し
ＨＩＶ−Ｊ ｃＤＮ＾の任意のソースを使用できる）
をＢａｔ ３１エキソヌクレアーゼで処理して、予想さ
れたａｒｔ開始コドンの５′側に存在するＬａｔｌｎ＾
ＴＧコドンを除去した。完全形ａｒｔコード領域を含み
ｔａｔｌ［［＾ＴＧコドンが欠失したｃＤＮＡフラグメ
ントを標準一過性発現ベクターｐＨ３にサブクローニン
グした。このベクターは、エンハンサ；しロモーターと
ＴＡＲ配列（ｔａｔに反応性の配列）を含むＨＩＶ−Ｉ
ＬＴＲの一部分とＳＶ４０ウィルスから得られたポ
リアゾニレ−ジョンシグナルとを含む。ｐ）Ｉ３−ａｒ
ｔ中に存在する配列が図の下部に示されている。高レベ
ルのａｒｔ遺伝子発現を達成するために、ｔａｔｌ［産
物を構成的に発現するがａｒｔ遺伝子産物を合成できな
いＪｕｒｋａｔ細胞中で一過性発現実験を行なった［米
国特許出願第８６５１５１号；Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１主、玉揚コ、 ａｒｔ陰性プロウィルスＨＸ
Ｂｃ２−Ｂｆｓ［５ｏｄｒｏｓｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：４１２−４１７（１９８６）］とのコトランス
フェクション後にｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の発現を補完
する能力を検査することによってｐＨ３−ａｒｔの活性
を評価した。第４図（Ｂ）参照、対照実験では、Ｉ（Ｘ
Ｂｃ２−ＢｆｓとゲノムＤＮ＾フラグメント内のａｒｔ
を発現するプラスミドｐＥｘ５４９８ｖｅｎｖとをコト
ランスフェクトした［米国特許出願第８６５１５１号］
。
上記の１ラスミドＤＮＡとのコトランスフエクションの
４８時間後にエイズ患者抗血清を使用して細胞溶解物か
らｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子封子パク質を免疫沈降させた
。ピリオンｅｎｖ（ｇｐ１６０）及びキャプシド（ｐ５
５）タンパク質が示される。
４８時間後にエイズ患者抗血清を使用して細胞溶解物か
らｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子封子パク質を免疫沈降させた
。ピリオンｅｎｖ（ｇｐ１６０）及びキャプシド（ｐ５
５）タンパク質が示される。
（ｉｉ ）ＨＩＶ−１及びＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ／Ｃ
ＡＴ／ＨＩＶハイブリッド構築物、第３図（Ａ）参照。
ＡＴ／ＨＩＶハイブリッド構築物、第３図（Ａ）参照。
終結コドンに後続しポリアゾニレ−ジョンシグナルに先
行するＢａ１ｌｌ制限部位を含むＣＡＴ遺伝子フラグメ
ント（Ｄ、Ｃｅ１ａｎｄｅｒより入手）［Ｇｏｒｍａｎ
、Ｃ，Ｍ、等、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ２：１
０４４−１０５１ （１９８２）も参照］を、Ｂｇｌｌ
ｌで開裂後にＤＮＡポリメラーゼＩで処理し合成５ａｌ
ｌリンカ−に結合した。１Ｉｉｎｄｌ［及びＳａｌ Ｉ
で開裂後、ポリ＾−ＣＡＴ遺伝子フラグメントをＨＩＶ
−Ｉ ＬＴＲの配列−１６７〜＋８１の３′側に存在
するＳｐ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ ｌ１ｉｏｔｅｃｈ）マ
ルチプル制限ポリリンカーの旧ｎｄＩ［ｒ −５ａｌ
ｒ部位にクローニングした。従って、得られたプラスミ
ドｐｍはポリアゾニレ−ジョン配列の欠失したＣＡＴ３
ｊｔ伝子）５′側に旧Ｖ−Ｉ ＬＴＲを含ム、ＣＡＴ
遺封子ノ３′側にＨＩＶ−１配列を組み込むために、Ｈ
ＩＶ−１ヌクレオチド５４６２−９１７７を包含するＳ
ａｔ Ｉ −Ｘｂａ ｌフラグメントを、プラスミドｐ
ｌ［［中に存在するＣＡＴ遺伝子の３°側に存在するＳ
ａｌ Ｉ −Ｘｂａ １部位にクローニングした。ａｒ
ｔの第２コードエキソン内部のＢａｍ８１部位にフレー
ムシフト突然変異を含みｔａＬの第１コードエキソンの
５′末端が欠失したクローンから５ａ１１−Ｘｂａ Ｉ
プロウィルスセグメントが得られた［５ｏｄ−ｒｏｓｋ
ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１掲］、 ｐｉｌｌ＾
ＲからｐＲＩΔ＾Ｒを生成すべく遺伝子向配列を欠失さ
せるために、Ｋｐｎ ｌを用いて標準法で消化し再度環
形成して欠失プラスミドを再編成した。プラスミドｐｌ
、ｐｉ＾Ｒ及びｐｌΔ＾Ｒは夫々のＨＩＶ／ＣＡＴハイ
ブリッド構築物ｐｍ、ｐｉｌｌ＾Ｒ及びｐＩ［［Ａ＾Ｒ
に等しいが、ＨＩＶ−Ｉ ５゜ＬＴＲがプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−１から得られた）ＩＴＬＶ−ＩＬＴＲ配列（ヌ
クレオチド−３５０〜＋３２５）で置換されている。
行するＢａ１ｌｌ制限部位を含むＣＡＴ遺伝子フラグメ
ント（Ｄ、Ｃｅ１ａｎｄｅｒより入手）［Ｇｏｒｍａｎ
、Ｃ，Ｍ、等、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ２：１
０４４−１０５１ （１９８２）も参照］を、Ｂｇｌｌ
ｌで開裂後にＤＮＡポリメラーゼＩで処理し合成５ａｌ
ｌリンカ−に結合した。１Ｉｉｎｄｌ［及びＳａｌ Ｉ
で開裂後、ポリ＾−ＣＡＴ遺伝子フラグメントをＨＩＶ
−Ｉ ＬＴＲの配列−１６７〜＋８１の３′側に存在
するＳｐ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ ｌ１ｉｏｔｅｃｈ）マ
ルチプル制限ポリリンカーの旧ｎｄＩ［ｒ −５ａｌ
ｒ部位にクローニングした。従って、得られたプラスミ
ドｐｍはポリアゾニレ−ジョン配列の欠失したＣＡＴ３
ｊｔ伝子）５′側に旧Ｖ−Ｉ ＬＴＲを含ム、ＣＡＴ
遺封子ノ３′側にＨＩＶ−１配列を組み込むために、Ｈ
ＩＶ−１ヌクレオチド５４６２−９１７７を包含するＳ
ａｔ Ｉ −Ｘｂａ ｌフラグメントを、プラスミドｐ
ｌ［［中に存在するＣＡＴ遺伝子の３°側に存在するＳ
ａｌ Ｉ −Ｘｂａ １部位にクローニングした。ａｒ
ｔの第２コードエキソン内部のＢａｍ８１部位にフレー
ムシフト突然変異を含みｔａＬの第１コードエキソンの
５′末端が欠失したクローンから５ａ１１−Ｘｂａ Ｉ
プロウィルスセグメントが得られた［５ｏｄ−ｒｏｓｋ
ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１掲］、 ｐｉｌｌ＾
ＲからｐＲＩΔ＾Ｒを生成すべく遺伝子向配列を欠失さ
せるために、Ｋｐｎ ｌを用いて標準法で消化し再度環
形成して欠失プラスミドを再編成した。プラスミドｐｌ
、ｐｉ＾Ｒ及びｐｌΔ＾Ｒは夫々のＨＩＶ／ＣＡＴハイ
ブリッド構築物ｐｍ、ｐｉｌｌ＾Ｒ及びｐＩ［［Ａ＾Ｒ
に等しいが、ＨＩＶ−Ｉ ５゜ＬＴＲがプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−１から得られた）ＩＴＬＶ−ＩＬＴＲ配列（ヌ
クレオチド−３５０〜＋３２５）で置換されている。
第３図（＾）はハイブリッド構築物の各々に存在するプ
ロウィルス配列のオリジンを示す概略図である。図示の
ごと（ＣＡＴ３ｆｉ伝子の５°末端側にＨＴＬＶ−１又
はＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列が結合している。図示のＨ
ＩＶ−■配列及びポリ＾配列を、終結コドンを含むがポ
リアゾニレ−ジョン配列の欠失したＣＡＴ遺伝子（斜線
ブロック）の３′側にサブクローニングした。ポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルは３’ ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ（
黒色ブロック）から得られた。制限酵素部位には以下の
略号を使用した。ＩＩ、ｌｌ１ｎｃｌ［［；Ｓ、Ｓａｔ
Ｉ ；に、Ｋｐｎｌ；ＳＴ、 ５ｔｕｌ；Ｂｇ、 Ｂ
ｇｌ ■；Ｂ、 ［ｌａｍＨｌ 、 ＳＤ及びＳ＾は既
知のスプライス供与部位及び受容部位の場所を夫々示す
［ＭｕｅｓｉＢ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４５０−４
４７（１９８５）；Ａｒｙａ等、１掲］。
ロウィルス配列のオリジンを示す概略図である。図示の
ごと（ＣＡＴ３ｆｉ伝子の５°末端側にＨＴＬＶ−１又
はＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列が結合している。図示のＨ
ＩＶ−■配列及びポリ＾配列を、終結コドンを含むがポ
リアゾニレ−ジョン配列の欠失したＣＡＴ遺伝子（斜線
ブロック）の３′側にサブクローニングした。ポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルは３’ ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ（
黒色ブロック）から得られた。制限酵素部位には以下の
略号を使用した。ＩＩ、ｌｌ１ｎｃｌ［［；Ｓ、Ｓａｔ
Ｉ ；に、Ｋｐｎｌ；ＳＴ、 ５ｔｕｌ；Ｂｇ、 Ｂ
ｇｌ ■；Ｂ、 ［ｌａｍＨｌ 、 ＳＤ及びＳ＾は既
知のスプライス供与部位及び受容部位の場所を夫々示す
［ＭｕｅｓｉＢ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４５０−４
４７（１９８５）；Ａｒｙａ等、１掲］。
（ｉｉｉ）プラスミドｐｌ［ｌ＾Ｒ中のＨＩＶインサー
トの欠失体。
トの欠失体。
Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼで制限消化するか（Ｌｅ
−ｇａｒｓｋｉ等、１掲）又は利用可能な制限酵素部位
を使用して、プラスミドｐＩ［［＾Ｒ内部に存在するＨ
ＩＶ−■プロウィルス配列内部の内部欠失を形成した。
−ｇａｒｓｋｉ等、１掲）又は利用可能な制限酵素部位
を使用して、プラスミドｐＩ［［＾Ｒ内部に存在するＨ
ＩＶ−■プロウィルス配列内部の内部欠失を形成した。
Ｍａｘａｍ＆Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、 ＵＳ
Ａ−７４：５６０−５６４（１９７７）に記載の方法で
各欠失の末端をＤＮＡ配列分析で決定した。第３図（＾
）に示すプラスミド中の欠失プロウィルス配列の５゛及
び３境界の夫々を以下に示す。
Ａ−７４：５６０−５６４（１９７７）に記載の方法で
各欠失の末端をＤＮＡ配列分析で決定した。第３図（＾
）に示すプラスミド中の欠失プロウィルス配列の５゛及
び３境界の夫々を以下に示す。
ｐＡＲ−１はヌクレオチド５４３２−５８９３が欠失し
ている。
ている。
ｐＡＲ−２はヌクレオチド５８９３−６３７６が欠失し
ている。
ている。
ｐＡＲ−３はヌクレオチド６５８３−７１６３が欠失し
ている。
ている。
ｐＡＲ−４はヌクレオチド６３７８−７６８３が欠失し
ている。
ている。
、八Ｒ−５はヌクレオチド５８９３−８０２０が欠失し
ている。
ている。
、八Ｒ−６はヌクレオチド７７８１−８２３５が欠失し
ている。
ている。
ｐＡＲ−７はヌクレオチド８２０４−８５６０が欠失し
ている（第６［Ｚ （Ａ）参照）、 ７ ラスミＦ ｐ
ＡＲ−ＩＳＶ、 ｐＡＲ−２ＳＶ及びｐＡＲ−３ＳＶ＜
第６図（Ｂ））ｊ、ｔ ）ＩＩＶ−１ヌクレ、ｔ チト
８５６１Ｇ、： ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナ
ルを含む、各プラスミドはＨＩＶ−１ヌクレ、ｉ チ）
’ ７１６３−７６８３ノ内部欠失を含む。付加的欠失
はヌクレオチド７２３６−６５３６、プラスミドｐＡＲ
−２ＳＶ又ハヌク’ｖオ’ｒ ト５８９３−６５３６、
プラスミドｐＡＲ−３ＳＶを包含する。プラスミドｐ＾
Ｒ−ＩＳＶＲは、ｐＡＲ−ＩＳＶに等しいがｐＡＲ−Ｉ
ＳＶ中に存在するＩＩＩＴ／−Ｉ Ｋｐｎフラグメン
トが逆位になっている。
ている（第６［Ｚ （Ａ）参照）、 ７ ラスミＦ ｐ
ＡＲ−ＩＳＶ、 ｐＡＲ−２ＳＶ及びｐＡＲ−３ＳＶ＜
第６図（Ｂ））ｊ、ｔ ）ＩＩＶ−１ヌクレ、ｔ チト
８５６１Ｇ、： ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナ
ルを含む、各プラスミドはＨＩＶ−１ヌクレ、ｉ チ）
’ ７１６３−７６８３ノ内部欠失を含む。付加的欠失
はヌクレオチド７２３６−６５３６、プラスミドｐＡＲ
−２ＳＶ又ハヌク’ｖオ’ｒ ト５８９３−６５３６、
プラスミドｐＡＲ−３ＳＶを包含する。プラスミドｐ＾
Ｒ−ＩＳＶＲは、ｐＡＲ−ＩＳＶに等しいがｐＡＲ−Ｉ
ＳＶ中に存在するＩＩＩＴ／−Ｉ Ｋｐｎフラグメン
トが逆位になっている。
第６図はプラスミドｐｌ［［八代中に存在するＨＩＶ−
１配列内部の欠失の相対位置を示す、第６図（Ｂ）のプ
ラスミドは３’ ＬＴＲ（黒色ブロック）が欠失し、Ｓ
Ｖ４０の初期領域に由来のＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョ
ン配列（斑点ブロック）を含む、制限酵素部位の略号は
第３図と同じ略号である。
１配列内部の欠失の相対位置を示す、第６図（Ｂ）のプ
ラスミドは３’ ＬＴＲ（黒色ブロック）が欠失し、Ｓ
Ｖ４０の初期領域に由来のＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョ
ン配列（斑点ブロック）を含む、制限酵素部位の略号は
第３図と同じ略号である。
（ｉｖ）ｐＡ−６３７６中のＨＩＶ−Ｉインサートの５
′欠失体。
′欠失体。
７’ ラ：２． ミＦ ｐＡ−６３７６ハ１ｌｌＶ−Ｉ
ＬＴＲＣＡＴ配列ト５ｖ４０ポリアゾニレ−ジョン
配列との間に存在するＨＩＶ−１ヌクレオチド６３７６
−７７６１を含む、第８図楊に示す構築物はＳａｌ Ｉ
（ヌクレオチド６３７６）で開裂し次にｐＡ−６３７
６をＢａ１３１エキソヌクレアーゼで処理することによ
って形成したものである。制限フラグメントのオーバー
ラツプ末端をＴ４ ＤＮΔポリメラーゼで充填し、合成
Ｃ１ａ ｌリンカ−に結合した。Ｃ１ａｉ及Ｘｈｏ ｌ
で開裂後、標準方法によって完全形のＬＴＲ−ＣＡ７３
ｆｔ伝子を欠失プラスミドの各々に再クローニングした
。各構築物の５゛境界をＤＮＡ配列分析によって確認し
た。各プラスミドの名称は各々の内部に存在する旧Ｖ−
１の最も５゛位のヌクレオチドを示す。
ＬＴＲＣＡＴ配列ト５ｖ４０ポリアゾニレ−ジョン
配列との間に存在するＨＩＶ−１ヌクレオチド６３７６
−７７６１を含む、第８図楊に示す構築物はＳａｌ Ｉ
（ヌクレオチド６３７６）で開裂し次にｐＡ−６３７
６をＢａ１３１エキソヌクレアーゼで処理することによ
って形成したものである。制限フラグメントのオーバー
ラツプ末端をＴ４ ＤＮΔポリメラーゼで充填し、合成
Ｃ１ａ ｌリンカ−に結合した。Ｃ１ａｉ及Ｘｈｏ ｌ
で開裂後、標準方法によって完全形のＬＴＲ−ＣＡ７３
ｆｔ伝子を欠失プラスミドの各々に再クローニングした
。各構築物の５゛境界をＤＮＡ配列分析によって確認し
た。各プラスミドの名称は各々の内部に存在する旧Ｖ−
１の最も５゛位のヌクレオチドを示す。
第８図は、これらの構築物を概略的に示す、各クローン
の３°境界はｔｌｔＶ−１ヌクレオチド７７６０に存在
する、 ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列（黒色フロック）、
ＣＡＴ遺伝子配列（斜線ブロック）、ＩＩＴＶ−１遺伝
子自記列（単線）及びＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシ
グナル（斑点ブロック）が図示されている。制限酵素部
位の略号は第３図と同じである。
の３°境界はｔｌｔＶ−１ヌクレオチド７７６０に存在
する、 ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列（黒色フロック）、
ＣＡＴ遺伝子配列（斜線ブロック）、ＩＩＴＶ−１遺伝
子自記列（単線）及びＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシ
グナル（斑点ブロック）が図示されている。制限酵素部
位の略号は第３図と同じである。
（ｖ ）ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ／ヒト成長ホルモンハイ
ブリッドプラスミド、プラスミドｐｃ、ｈＧＨ８００（
Ｄｒ、 ＮｏｒｍａｎＥｂｅｒｈａｒｄｔから入手した
が公知の任意のｈＧＨ遺伝子ソースの使用が可能である
）中に存在するｈＧＨｃＤＮ＾ＤＮＡメントからヒト成
長ホルモン（ｈＧｌｌ）遺伝子を得た。ポリアゾニレ−
ジョンシグナルを除去するためにプラスミドｐｃ、ｈＧ
ＩＩ８００をまず終結コドンの３′側から８個目のヌク
レオチドに存在する５ＩＩｌａ １部位で開裂した０次
にＳｍａ Ｉ部位を５ａｌＩ部位に転化し、ｈＧＩＩコ
ード配列を含むＨｉｎｄｌＩ［−５ａｌ Ｉフラグメン
トを１ラスミドｐｌ［［（上記参照）の構築に使用され
たＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ／ＣＡＴ遺伝子フラグメントの
３′側にクローニングした。得られたプラスミドｐｍＧ
Ｈの上のＬＴＲ／ｈＧｆｌ配列をプラスミドｐｌ［［八
Ｒに存在する！＋１Ｖ ＬＴＲ／ＣＡＴ配列と置換し−
（１ｐＨＧ１１−八Ｒを生成した。
ブリッドプラスミド、プラスミドｐｃ、ｈＧＨ８００（
Ｄｒ、 ＮｏｒｍａｎＥｂｅｒｈａｒｄｔから入手した
が公知の任意のｈＧＨ遺伝子ソースの使用が可能である
）中に存在するｈＧＨｃＤＮ＾ＤＮＡメントからヒト成
長ホルモン（ｈＧｌｌ）遺伝子を得た。ポリアゾニレ−
ジョンシグナルを除去するためにプラスミドｐｃ、ｈＧ
ＩＩ８００をまず終結コドンの３′側から８個目のヌク
レオチドに存在する５ＩＩｌａ １部位で開裂した０次
にＳｍａ Ｉ部位を５ａｌＩ部位に転化し、ｈＧＩＩコ
ード配列を含むＨｉｎｄｌＩ［−５ａｌ Ｉフラグメン
トを１ラスミドｐｌ［［（上記参照）の構築に使用され
たＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ／ＣＡＴ遺伝子フラグメントの
３′側にクローニングした。得られたプラスミドｐｍＧ
Ｈの上のＬＴＲ／ｈＧｆｌ配列をプラスミドｐｌ［［八
Ｒに存在する！＋１Ｖ ＬＴＲ／ＣＡＴ配列と置換し−
（１ｐＨＧ１１−八Ｒを生成した。
プラスミドｐｌ［ＩＧｌ［−ＳＶはプラスミドｐＨ［Ｇ
Ｉ＋に存在するｈＧＨフラグメントの３°側にＳＶ４０
ポリアゾニレ−ジョン配列を含む、これらの構築物を第
３図（Ｂ）に示す。
Ｉ＋に存在するｈＧＨフラグメントの３°側にＳＶ４０
ポリアゾニレ−ジョン配列を含む、これらの構築物を第
３図（Ｂ）に示す。
（ｖｉ）エンハンサ−テストプラスミド。ＨＩＶ−Ｉヌ
クレオチド６９フＯ−８４４０（ｐＣ−５５／ Ｉ［［
１４７０）と５９６３−８４４２（ｐＣ−５５／２４７
９）とを第９図ニ示す配向テＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ配
列−５５〜＋３２５の５′側に存在するマルチプル制限
部位ポリリンカー（ＰｒｏｍｅＨａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
にクローニングした［Ｒｏｓｅｎ等、Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、
８２：６５０２−６５０６トに反応性であることが予
め証明されていた［Ｒｏｓｅｎ等、Ｊ、Ｖｉｏｌ、 １
５７：３７９−３８４（１９８６）：米国特許第６１４
２９７号］、ヌクレオチド−５５〜＋３２５に存在する
ＨＴｆ、Ｖ−Ｉ ＬＴＲ配列はｃｉｓ作用エンハンサ
−エレメントに反応性である。プラスミドｐＣ−５５／
１１２４７９及びｐＣ５５／ ｍ １４７０は夫々、
第９図の方向でクローニングされた２４７９及び１４７
０の旧Ｖ−１ヌクレオチドを含む。
クレオチド６９フＯ−８４４０（ｐＣ−５５／ Ｉ［［
１４７０）と５９６３−８４４２（ｐＣ−５５／２４７
９）とを第９図ニ示す配向テＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ配
列−５５〜＋３２５の５′側に存在するマルチプル制限
部位ポリリンカー（ＰｒｏｍｅＨａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
にクローニングした［Ｒｏｓｅｎ等、Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、
８２：６５０２−６５０６トに反応性であることが予
め証明されていた［Ｒｏｓｅｎ等、Ｊ、Ｖｉｏｌ、 １
５７：３７９−３８４（１９８６）：米国特許第６１４
２９７号］、ヌクレオチド−５５〜＋３２５に存在する
ＨＴｆ、Ｖ−Ｉ ＬＴＲ配列はｃｉｓ作用エンハンサ
−エレメントに反応性である。プラスミドｐＣ−５５／
１１２４７９及びｐＣ５５／ ｍ １４７０は夫々、
第９図の方向でクローニングされた２４７９及び１４７
０の旧Ｖ−１ヌクレオチドを含む。
（ｖｉｉ）５°ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子ハイブリッド構
築物、プラスミドｐｌｅｎｖ−３１７、ｐｌｅｎｖ−３
１４及びｐｌｅｎｖ−１００を構築するためにヌクレオ
チド５５７２−５８９３を内包する１ｌｉｎｄＩ［［−
Ｋｐｎ Ｉ ＨＩＶ−１プロウイルスフラグメン）ヲ
ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列−１６７〜＋８１ノ３°側に
存在する５Ｄ６４ポリリンカーにクローニングした。に
ｐｎＩ（ヌクレオチド５８９３）で開裂し、次にＢａｌ
３１エキソヌクレアーゼで消化することによって欠失
が生じた。
築物、プラスミドｐｌｅｎｖ−３１７、ｐｌｅｎｖ−３
１４及びｐｌｅｎｖ−１００を構築するためにヌクレオ
チド５５７２−５８９３を内包する１ｌｉｎｄＩ［［−
Ｋｐｎ Ｉ ＨＩＶ−１プロウイルスフラグメン）ヲ
ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列−１６７〜＋８１ノ３°側に
存在する５Ｄ６４ポリリンカーにクローニングした。に
ｐｎＩ（ヌクレオチド５８９３）で開裂し、次にＢａｌ
３１エキソヌクレアーゼで消化することによって欠失
が生じた。
ＤＮＡ末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで充填し、Ｋｐ
ｎ ｌリンカ−に結合し、次にＫｐｎ ＩとＩｌａｍ■
■とによって開裂した。直線化したＤＮＡを、ＣＡＴ遺
伝子とＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルとを含む
ＤＮＡのＫｐｎ １−ＢａｍＨＩセグメントに結合した
。各プラスミドの番号及び名称はヌクレオチド５５７２
の３゛に存在する１［Ｖ−Ｉヌクレオチドの数を示す。
ｎ ｌリンカ−に結合し、次にＫｐｎ ＩとＩｌａｍ■
■とによって開裂した。直線化したＤＮＡを、ＣＡＴ遺
伝子とＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルとを含む
ＤＮＡのＫｐｎ １−ＢａｍＨＩセグメントに結合した
。各プラスミドの番号及び名称はヌクレオチド５５７２
の３゛に存在する１［Ｖ−Ｉヌクレオチドの数を示す。
プラスミドＩＩ Ｘ Ｂ ｃ ２（ヌクレオチド８１−
６３０）の旧ｎｄｌ［［フラグメントをプラスミドｐ１
１３Ｒ−１１１のＢｉｎｄｌ［部位にサブクローニング
することによってプラスミドｐＬｇａｇ−４０４及びｐ
Ｌｇａｇ−３２１を構築した。欠失を生じさせるために
プラスミドＤＮＡをＣＡＴ遺伝子内部のＥｃｏＲ１部位
で開裂し、次に［ｌａｌ ３１エキソヌクレアーゼで処
理した。
６３０）の旧ｎｄｌ［［フラグメントをプラスミドｐ１
１３Ｒ−１１１のＢｉｎｄｌ［部位にサブクローニング
することによってプラスミドｐＬｇａｇ−４０４及びｐ
Ｌｇａｇ−３２１を構築した。欠失を生じさせるために
プラスミドＤＮＡをＣＡＴ遺伝子内部のＥｃｏＲ１部位
で開裂し、次に［ｌａｌ ３１エキソヌクレアーゼで処
理した。
得られたＬＴＲ／リーダーフラグメントを完全形ＣＡＴ
逍伝遺封子接してサブクローニングした。
逍伝遺封子接してサブクローニングした。
ＤＮＡトーンスフェ ジョン ＣＡＴｈＧ１１アッセイ
０．５〜１．０μｓのＣｓＣ１バンドした指示プラスミ
ドＤＮＡを付着細胞にトランスフェクトした。３μｇの
ＤＮＡをリンパ球にトランスフェクトした。３μｇのｐ
Ｈ３−ａｒｔ又は３μｇの対照ＤＮＡ［プラスミドｐＬ
１３Ｒ−ｍβ；Ｒｏｓｅｎ等、虹」仕：８１３−８２３
（１９８５）］と共にコトランスフェクションを行なっ
た。プラスミドｐＩＩＩ＾Ｒを使用し各細胞系毎にＤＮ
Ａ用量反応アッセイを行なった。各トランスフェクショ
ンのために選択した最終量のＤＮＡは用量反応アッセイ
で直線反応を与える量であった（データ図示せず）、
Ｌｏｐａｔａ等、Ｎｕｃ ｌ 、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、
１２：５７０７−５７１７（１９８４）（付着細胞）、
及びＱｕｅｅｎ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｃｅ１ｌ
３３ニア４ｌ−７４８（１９８３）（リンパ球）、に記
載のＤＥＡＥデキストラン法を使用してトランスフェク
ションを行なった。既に公表されている方法（Ｇｏｒｍ
ａｎ等、１掲）でトランスフェクションした４８時間後
にＣＡＴアッセイを行なった。アセチル化物質に転化し
た１４Ｃ−クロラムフェニコールの量を薄層クロマトグ
ラフィープレートから切り出したスポットの液体シンチ
レーションカウンティングによって測定した。
０．５〜１．０μｓのＣｓＣ１バンドした指示プラスミ
ドＤＮＡを付着細胞にトランスフェクトした。３μｇの
ＤＮＡをリンパ球にトランスフェクトした。３μｇのｐ
Ｈ３−ａｒｔ又は３μｇの対照ＤＮＡ［プラスミドｐＬ
１３Ｒ−ｍβ；Ｒｏｓｅｎ等、虹」仕：８１３−８２３
（１９８５）］と共にコトランスフェクションを行なっ
た。プラスミドｐＩＩＩ＾Ｒを使用し各細胞系毎にＤＮ
Ａ用量反応アッセイを行なった。各トランスフェクショ
ンのために選択した最終量のＤＮＡは用量反応アッセイ
で直線反応を与える量であった（データ図示せず）、
Ｌｏｐａｔａ等、Ｎｕｃ ｌ 、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、
１２：５７０７−５７１７（１９８４）（付着細胞）、
及びＱｕｅｅｎ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｃｅ１ｌ
３３ニア４ｌ−７４８（１９８３）（リンパ球）、に記
載のＤＥＡＥデキストラン法を使用してトランスフェク
ションを行なった。既に公表されている方法（Ｇｏｒｍ
ａｎ等、１掲）でトランスフェクションした４８時間後
にＣＡＴアッセイを行なった。アセチル化物質に転化し
た１４Ｃ−クロラムフェニコールの量を薄層クロマトグ
ラフィープレートから切り出したスポットの液体シンチ
レーションカウンティングによって測定した。
ｈＧ１１アッセイのためには、トランスフェクションの
４８時間後に細胞から得られた培地（１００μりを使用
して分泌されたヒト成長ホルモンのレベルを測定した。
４８時間後に細胞から得られた培地（１００μりを使用
して分泌されたヒト成長ホルモンのレベルを測定した。
ｈＧＩｌレベルのレベル測定には公知のラジオイムノア
ッセイキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、
Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、Ｃ＾）を使
用した。
ッセイキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、
Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、Ｃ＾）を使
用した。
急速ｍ
各５ｕｇの各プラスミドＤＮ＾をＪｕｒｋａｔ ｔａｔ
［１細胞（１ｘｌＯ’）にトランスフエフ１− した
。トランスフェクションの約４０時間後に細胞を３ｓｓ
−システィンで更に８〜１２時間代謝的に標識した０ｍ
胞溶解物を調製し、ｔ＋ｒｖ−特異的タンパク質を［Ｇ
ｏｈ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。
［１細胞（１ｘｌＯ’）にトランスフエフ１− した
。トランスフェクションの約４０時間後に細胞を３ｓｓ
−システィンで更に８〜１２時間代謝的に標識した０ｍ
胞溶解物を調製し、ｔ＋ｒｖ−特異的タンパク質を［Ｇ
ｏｈ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。
５９：１８１−１８４（１９８Ｂ）の方法で］エイズ患
者抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降可能な物質をＳＯ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ｌａｅｍｍ ｌ
ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ■７：６８０−６８５（１９７０）
］で分析した。
者抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降可能な物質をＳＯ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ｌａｅｍｍ ｌ
ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ■７：６８０−６８５（１９７０）
］で分析した。
＾ｒｊ３ − によるタ − の舌。節
感染性ＨｒＶ−Ｊプロウィルスの３゛半分を前記のごと
く細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の３′側に配置した（第３図（＾
））、この結合で、ｏｒｖ−１配列がＣＡＴ遺伝子転写
物の非コード部分に組み込まれる。プロウィルスのセグ
メントは米国特許出願第８６５１５１号に開示されたａ
ｒｔ遺伝子の３゛コードエキソンのフレームシフト突然
変異を含むａｒｔ欠失突然変異体に由来しり、ＣＡＴ遺
伝遺伝子０唸現ハＨＩＶ１ ノＬＴＲ配列−１６７〜＋
８１によって支配された。また、ＳＶ４０ボリアデ二１
／−シＥｌ ンシク＋ルノ５’側４：ＨＩＶ−Ｉ Ｌ
ＴＩＣＡＴ遺伝子とを含む対照プラスミドを使用した実
験も行なった［プラスミドｐＵ３Ｒ−１［；５ｏｄｒｏ
ｓｋｉ等、針上−旺姐■７：１７１−１７３（１９８５
）参照］。
感染性ＨｒＶ−Ｊプロウィルスの３゛半分を前記のごと
く細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の３′側に配置した（第３図（＾
））、この結合で、ｏｒｖ−１配列がＣＡＴ遺伝子転写
物の非コード部分に組み込まれる。プロウィルスのセグ
メントは米国特許出願第８６５１５１号に開示されたａ
ｒｔ遺伝子の３゛コードエキソンのフレームシフト突然
変異を含むａｒｔ欠失突然変異体に由来しり、ＣＡＴ遺
伝遺伝子０唸現ハＨＩＶ１ ノＬＴＲ配列−１６７〜＋
８１によって支配された。また、ＳＶ４０ボリアデ二１
／−シＥｌ ンシク＋ルノ５’側４：ＨＩＶ−Ｉ Ｌ
ＴＩＣＡＴ遺伝子とを含む対照プラスミドを使用した実
験も行なった［プラスミドｐＵ３Ｒ−１［；５ｏｄｒｏ
ｓｋｉ等、針上−旺姐■７：１７１−１７３（１９８５
）参照］。
前記のごと（ａｒｔ遺伝子産物を発現するように設計さ
れたプラスミド（ｐＨ３−ａｒｔ）を構築した（第４図
（八））、 ａｒｔ欠失プロウィルスのｇａｇ及びｅｎ
ｖ合成における欠陥を補完するこのプラスミドの能力を
コトランスフェクション実験で分析した（第４図（Ｂ）
）ａｒｔ３ｆｉ伝子中のフレームシフト突然変異を含む
プラスミドｐＨＸＢｃ２−Ｂｆｓと恣受性細胞とのコト
ランスフェクション後に検出可能なｇａｇ又はｅｎｖ遺
伝子産物は検出されなかった。しかしなから、プラスミ
ドｐＨＸＢｃ２−Ｂｆｓと、ａｒｔ機能を発現すること
が既に証明されているプラスミドｐＥｘ５４９６ｅｎｖ
［米国特許出願第８５６１５１号ＨＳｏｄｒｏｓｋｉ等
、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１掲］又はｐ ＩＩ ３−
ａ ｒ ｔとのコトランスフエクションの結果、ｇａｇ
タンパク質及びｅｎｖタンパク質の双方が合成された（
第４図（Ｉｔ））、これらの実験はプラスミドｐＨ３−
ａｒｔが機能的ａｒｔ遺伝子産物を発現することを示す
。
れたプラスミド（ｐＨ３−ａｒｔ）を構築した（第４図
（八））、 ａｒｔ欠失プロウィルスのｇａｇ及びｅｎ
ｖ合成における欠陥を補完するこのプラスミドの能力を
コトランスフェクション実験で分析した（第４図（Ｂ）
）ａｒｔ３ｆｉ伝子中のフレームシフト突然変異を含む
プラスミドｐＨＸＢｃ２−Ｂｆｓと恣受性細胞とのコト
ランスフェクション後に検出可能なｇａｇ又はｅｎｖ遺
伝子産物は検出されなかった。しかしなから、プラスミ
ドｐＨＸＢｃ２−Ｂｆｓと、ａｒｔ機能を発現すること
が既に証明されているプラスミドｐＥｘ５４９６ｅｎｖ
［米国特許出願第８５６１５１号ＨＳｏｄｒｏｓｋｉ等
、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１掲］又はｐ ＩＩ ３−
ａ ｒ ｔとのコトランスフエクションの結果、ｇａｇ
タンパク質及びｅｎｖタンパク質の双方が合成された（
第４図（Ｉｔ））、これらの実験はプラスミドｐＨ３−
ａｒｔが機能的ａｒｔ遺伝子産物を発現することを示す
。
このプラスミドはｔａｔ遺伝子産物又は別の公知のいか
なるウィルス遺伝子タンパク質産物をも発現しない。
なるウィルス遺伝子タンパク質産物をも発現しない。
プラスミドｐＨ３−ａｒｔの存在下又は非存在下に前記
ハイブリッドＨＩＶ／ＣＡＴ構築物を細胞系にトランス
フェクトした。 ）ＩＩＶ ＬＴＲに支配されるａｒｔ
遺伝子の高い発現レベルを得るために、これらの実験で
はｔａｔ ■遺伝子を構成的に発現する細胞系（Ｈｅｌ
ａｔａｔ［［、ＪｕｒｋａＬ ｔａｔｌ［及びＣｌｌ０
ｔａｔｌ［［）を使用しな［Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１９−１上掲（１９８６）］、前記のごと＜１
ヘランスフエクシヨンの４８時間後にＣＡＴ酵素活性レ
ベルを測定した。
ハイブリッドＨＩＶ／ＣＡＴ構築物を細胞系にトランス
フェクトした。 ）ＩＩＶ ＬＴＲに支配されるａｒｔ
遺伝子の高い発現レベルを得るために、これらの実験で
はｔａｔ ■遺伝子を構成的に発現する細胞系（Ｈｅｌ
ａｔａｔ［［、ＪｕｒｋａＬ ｔａｔｌ［及びＣｌｌ０
ｔａｔｌ［［）を使用しな［Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１９−１上掲（１９８６）］、前記のごと＜１
ヘランスフエクシヨンの４８時間後にＣＡＴ酵素活性レ
ベルを測定した。
プラスミドｐＵ３Ｒ−１［［をトランスフエフｌ−した
全部の細胞でＣＡＴ遺伝子の高レベル発現を検出した（
表Ｉ、第５図）。
全部の細胞でＣＡＴ遺伝子の高レベル発現を検出した（
表Ｉ、第５図）。
表土
ａｒｔタンパク質の存在下及び非存在下におけるハイブ
リ・ソド旧Ｖ／ＣＡＴ遺伝子の発現 貼ｌユ０ 細胞系 実験プラスミド ｔｌｅｌａ−ｔａｔ−ＤＩ Ｊｕ
ｒｋａｔ−ｔａｔ−１［Ｉ Ｃｌ０−ｔａｔ−Ｉ１
１１ｐυ３Ｒ−ＩＩＩ ３．１６２．９１（０，９
） １．９３１．８６（１，０） １，８６２．２１
（１，２）ｐｍ−＾ＲＯ，１３３，９０（３０） ０．
０２０．５３（２６） ０．３０１．４６（４９）ｐ
ｍΔ＾Ｒ１，６７１，７２（１，０） １．４１１．３
６（１，０）ｐＩ［［＜、０１ （，０１＜、０１
、＜、０１２ ｐＵ３Ｒ−１６，４１５，６（０，９
） ５．０６１．７８（０，４）ｐｌＡＲＯ，０４１，
２６（３２） ０．０６ ０．フッ（１３）ｐ ｒ
ＡＡＲ４，０６４，６６（１，１） ２．５３１．２
０（０，５）ｐ Ｉ ＜、０１ ＜
、０１ ＜、０１ ＜、０１３ ｐＵ３
Ｒｎｌ ３．０６２．４０（０，８） １．２０１
．１４（０，９） ６．６０５．５０（０，８）ｐｎ
ｌ＾ＲＯ，１０２，４０（２４） ０．０４１．３６
（３４） ０．２３５．８０（２５）ｐＡＲ−１０
，０３０，３６（１２） ＜、０１０．４０ｐ＾Ｒ−２
０，１６２，６３（１６） ０．０３０．８０（２７
）ｐＡＲ−３１，２０３，２１（２，７） ０．２４２
．２Ｈ９，２）ｐＡＲ−４０，１２０，１５（１，２）
０．２７０．２４（０，９）ｐＡＲ−５１，７０２，
２０（１，３） ０．４１０．４６（１，１）ｐＡＲ−
６０，１２２，２２（１９） ０．０５１．９３（３
９）ｐＡＲ−７１，８４４，６４（２，５＞ ０．８３
４．３０（５，２）ｐＡＲ−ＩＳＶ ０．０５１．
５０（３０） ０．０６０．５４（９，０） ０．
４１６．７１（１６）ｐＡＲ−２ＳＶ ０．０８１
．８０（２３） ０．１３１．４３（１１） ０
．２６５．７２（２２）ｐＡＲ−３ＳＶ Ｏ，３２
２，３０（７，２） ０．５２３．５１（６，７）
１．１０８．１２（７，４）ｐＵ３Ｒ−ＩＩＩ ２
．６６２．５３（０，９） １．８
６１．５３（０，８）ｐｍΔＲＯ，０８１，８０（２３
） ０．０５１．４０（２８）ｐ
Ｉ［［＾１５Ｖ Ｏ，５９１，２６（２，１）
０．５３０．８６（１，６）ｐ＾−６
３７６０，０３０，４６（１５）
０．０３０．３６（１２）ｐ＾−６７２５０，７１３，
４０（４，８） ０．３１１．８６
（６，０）ｐ＾−７００００，６８３，７０（５，４）
０．３４１．７６（５，２）ｐ＾
−７１２６０，６６２，４０（３，６＞
０．８０３．６０（４，５）ｐ＾−７２０１０，
２６２，０６（８，０） ０．２４２
．４６（１０） Ｉｉｐ＾−７２０５０，４６２，
２６（５，０） ０．３１２．８
０（９，０） 。
リ・ソド旧Ｖ／ＣＡＴ遺伝子の発現 貼ｌユ０ 細胞系 実験プラスミド ｔｌｅｌａ−ｔａｔ−ＤＩ Ｊｕ
ｒｋａｔ−ｔａｔ−１［Ｉ Ｃｌ０−ｔａｔ−Ｉ１
１１ｐυ３Ｒ−ＩＩＩ ３．１６２．９１（０，９
） １．９３１．８６（１，０） １，８６２．２１
（１，２）ｐｍ−＾ＲＯ，１３３，９０（３０） ０．
０２０．５３（２６） ０．３０１．４６（４９）ｐ
ｍΔ＾Ｒ１，６７１，７２（１，０） １．４１１．３
６（１，０）ｐＩ［［＜、０１ （，０１＜、０１
、＜、０１２ ｐＵ３Ｒ−１６，４１５，６（０，９
） ５．０６１．７８（０，４）ｐｌＡＲＯ，０４１，
２６（３２） ０．０６ ０．フッ（１３）ｐ ｒ
ＡＡＲ４，０６４，６６（１，１） ２．５３１．２
０（０，５）ｐ Ｉ ＜、０１ ＜
、０１ ＜、０１ ＜、０１３ ｐＵ３
Ｒｎｌ ３．０６２．４０（０，８） １．２０１
．１４（０，９） ６．６０５．５０（０，８）ｐｎ
ｌ＾ＲＯ，１０２，４０（２４） ０．０４１．３６
（３４） ０．２３５．８０（２５）ｐＡＲ−１０
，０３０，３６（１２） ＜、０１０．４０ｐ＾Ｒ−２
０，１６２，６３（１６） ０．０３０．８０（２７
）ｐＡＲ−３１，２０３，２１（２，７） ０．２４２
．２Ｈ９，２）ｐＡＲ−４０，１２０，１５（１，２）
０．２７０．２４（０，９）ｐＡＲ−５１，７０２，
２０（１，３） ０．４１０．４６（１，１）ｐＡＲ−
６０，１２２，２２（１９） ０．０５１．９３（３
９）ｐＡＲ−７１，８４４，６４（２，５＞ ０．８３
４．３０（５，２）ｐＡＲ−ＩＳＶ ０．０５１．
５０（３０） ０．０６０．５４（９，０） ０．
４１６．７１（１６）ｐＡＲ−２ＳＶ ０．０８１
．８０（２３） ０．１３１．４３（１１） ０
．２６５．７２（２２）ｐＡＲ−３ＳＶ Ｏ，３２
２，３０（７，２） ０．５２３．５１（６，７）
１．１０８．１２（７，４）ｐＵ３Ｒ−ＩＩＩ ２
．６６２．５３（０，９） １．８
６１．５３（０，８）ｐｍΔＲＯ，０８１，８０（２３
） ０．０５１．４０（２８）ｐ
Ｉ［［＾１５Ｖ Ｏ，５９１，２６（２，１）
０．５３０．８６（１，６）ｐ＾−６
３７６０，０３０，４６（１５）
０．０３０．３６（１２）ｐ＾−６７２５０，７１３，
４０（４，８） ０．３１１．８６
（６，０）ｐ＾−７００００，６８３，７０（５，４）
０．３４１．７６（５，２）ｐ＾
−７１２６０，６６２，４０（３，６＞
０．８０３．６０（４，５）ｐ＾−７２０１０，
２６２，０６（８，０） ０．２４２
．４６（１０） Ｉｉｐ＾−７２０５０，４６２，
２６（５，０） ０．３１２．８
０（９，０） 。
ｐ＾−７２８３０，２４０，８０（３，３）
０．３３１．５５（４，６＞ −ｐ＾
−７３２５１，００１，００（１，０）
０．８６０．７８（０，９） 。
０．３３１．５５（４，６＞ −ｐ＾
−７３２５１，００１，００（１，０）
０．８６０．７８（０，９） 。
ρ＾−７４４１ １．１３ ０．８０（０，７
） ０．７２
０．７８（１，１） −ｐ八−７５１０１，
００１，１２（１，１）
１．２８ ０．９３（０，７） 幻ｐ
＾−７５９５０，５６０，４８（０，８）
０．４６０．５１（１，１）ｐＢ−６３７６
０，４６０，３８（０，８） ０
．４３０．４１（０，９）注 ａ１表示プラスミドＤＮＡの１＃（Ｈｅｌａ ｔａｔＩ
［［及びＣｌ０ｔａｔｌ［［）又は３μＦＩ（Ｊｕｒｋ
ａｔ Ｌａｔ Ｉ［［）を細胞にトランスフェクトした
。 ＤＮＡの使用量を各細胞系毎に作成したＤＮＡ用量
反応曲線から決定した。薄層クロマ １トゲラフ
イープレートから切り出したスポットの液体シンチレー
ションカラティングによって絶対ＣＡＴ活性を測定した
。クロラムフェニコールがアセチル形に転化する毎分の
転化パーセントを示す。
） ０．７２
０．７８（１，１） −ｐ八−７５１０１，
００１，１２（１，１）
１．２８ ０．９３（０，７） 幻ｐ
＾−７５９５０，５６０，４８（０，８）
０．４６０．５１（１，１）ｐＢ−６３７６
０，４６０，３８（０，８） ０
．４３０．４１（０，９）注 ａ１表示プラスミドＤＮＡの１＃（Ｈｅｌａ ｔａｔＩ
［［及びＣｌ０ｔａｔｌ［［）又は３μＦＩ（Ｊｕｒｋ
ａｔ Ｌａｔ Ｉ［［）を細胞にトランスフェクトした
。 ＤＮＡの使用量を各細胞系毎に作成したＤＮＡ用量
反応曲線から決定した。薄層クロマ １トゲラフ
イープレートから切り出したスポットの液体シンチレー
ションカラティングによって絶対ＣＡＴ活性を測定した
。クロラムフェニコールがアセチル形に転化する毎分の
転化パーセントを示す。
各実験グループ（１〜４）の結果はすべて同じ日に１じ
細胞セットで行なったものである。各実験をνなくとも
２回繰り返した。報告された結果は単一実験で得られた
ＣＡＴ活性レベルを示す。ＣＡＴ活性つレベルは実験毎
に２倍以内のばらつきを示すがｒラスミドに支配される
ＣＡＴ活性の相対誤差の実験毎のばらつきは２０％以内
である。
細胞セットで行なったものである。各実験をνなくとも
２回繰り返した。報告された結果は単一実験で得られた
ＣＡＴ活性レベルを示す。ＣＡＴ活性つレベルは実験毎
に２倍以内のばらつきを示すがｒラスミドに支配される
ＣＡＴ活性の相対誤差の実験毎のばらつきは２０％以内
である。
ｂ６表示プラスミドを３μＳのプラスミドｐＨ３−ａｒ
ｔ（＋）又は均等量の非特異的コンペテイターＤＮＡ（
−）（プラスミドｐＵ３Ｒ−ｍβ；Ｒｏｓｅｎ等、Ｃｅ
１ｌ ４１：８１３−８２３（１９８５）とコトランス
フェクトした。
ｔ（＋）又は均等量の非特異的コンペテイターＤＮＡ（
−）（プラスミドｐＵ３Ｒ−ｍβ；Ｒｏｓｅｎ等、Ｃｅ
１ｌ ４１：８１３−８２３（１９８５）とコトランス
フェクトした。
Ｃ１括弧内の誘導値はａｒｔの存在下に得られたＣＡＴ
活性パーセントをａｒｔの非存在下に得られたＣＡＴ活
性パーセントで除算することによって決定された。
活性パーセントをａｒｔの非存在下に得られたＣＡＴ活
性パーセントで除算することによって決定された。
第５図は、ハイブリッドＨＩＶ／ＣＡＴｔＦｉ築物によ
って支配されるＣＡＴ遺伝子発現に対するａｒｔ遺伝子
産物の影響を示す、プラスミドｐ ＩＩ ３− ａ ｒ
ｔの存在下（＋）及び非存在下（−）にＪｕｒｋａＬ
−ｔａＬ ＩｌＩ細胞に３μｓの各ハイブリッドプラス
ミドを１〜ランスフェクｌ−した。
って支配されるＣＡＴ遺伝子発現に対するａｒｔ遺伝子
産物の影響を示す、プラスミドｐ ＩＩ ３− ａ ｒ
ｔの存在下（＋）及び非存在下（−）にＪｕｒｋａＬ
−ｔａＬ ＩｌＩ細胞に３μｓの各ハイブリッドプラス
ミドを１〜ランスフェクｌ−した。
トランスフェクションに使用したＤＮＡの量はＤＮＡ用
量反応曲線から決定されたような直線範囲内に存在した
。実験手順で説明したようにトランスフェクションの４
８時間後にＣＡＴアッセイを行なった。
量反応曲線から決定されたような直線範囲内に存在した
。実験手順で説明したようにトランスフェクションの４
８時間後にＣＡＴアッセイを行なった。
経時的アッセイの直線範囲内の種々の時点から得られた
ＣＡＴアッセイのオートラジオダラムを示す。
ＣＡＴアッセイのオートラジオダラムを示す。
選択された時点は各対のアッセイで同じである。
第５図（＾）は、プラスミドｐｔ１３Ｒ−１１１（レー
ン１）、ｐｉｌｌ（レーン２）、ｐｌｌ［Δ＾Ｒ（レー
ン３）及びｐｌ［（＾Ｒ（レーン４）をトランスフェク
トしたＪｕｒｋａｔ−ｔａｔ［ｌ細胞のＣＡＴアッセイ
を示す、第５図（Ｂ）は、プラスミドｐυ３Ｒ−Ｉ（レ
ーン１）、ｐｌ（レーン２）、ｐｌΔ＾Ｒ（レーン３）
及びｐＩ＾Ｒ（レーン４）をトランスフェクトしたＪｕ
ｒ−ｋａｔ−ｔａｔｌ［細胞のＣＡＴアッセイを示す。
ン１）、ｐｉｌｌ（レーン２）、ｐｌｌ［Δ＾Ｒ（レー
ン３）及びｐｌ［（＾Ｒ（レーン４）をトランスフェク
トしたＪｕｒｋａｔ−ｔａｔ［ｌ細胞のＣＡＴアッセイ
を示す、第５図（Ｂ）は、プラスミドｐυ３Ｒ−Ｉ（レ
ーン１）、ｐｌ（レーン２）、ｐｌΔ＾Ｒ（レーン３）
及びｐＩ＾Ｒ（レーン４）をトランスフェクトしたＪｕ
ｒ−ｋａｔ−ｔａｔｌ［細胞のＣＡＴアッセイを示す。
第５図（Ｂ）に示す実験の場合、ＨＴＬＶ−１ｔｒａｎ
ｓ活性物質を発現する３μｇのプラスミドｐ Ｉ ｔａ
ｔ Ｉを細胞に同時にトランスフェクトした。
ｓ活性物質を発現する３μｇのプラスミドｐ Ｉ ｔａ
ｔ Ｉを細胞に同時にトランスフェクトした。
ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲとＣＡＴ遺伝子とだけを含むプラ
スミドｐＨ［をトランスフェクトした細胞中では酵素活
性が検出されないので、ＣＡＴ遺伝子の発現はポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルの存在に依存した。これらのプラ
スミドによって発現されるＣＡＴ活性のレベルはプラス
ミドｐ ｔｌ ３− ａ ｒ ｔとのコトランスフエク
ションによって影響を受けなかった。ＨＩＶ−１プロウ
イルスの３′部分がＣＡＴ遺伝子のコード配列の３゛側
に配置されているプラスミドｐ■＾Ｒによって発現され
るＣＡＴ酵素活性のレベルは、同じ細胞にプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−［［をトランスフェクトして検出されたレベル
に比較して顕著に減少していた。しかしなから、ａｒｔ
タンパク質を発現するプラスミドｐＨ３−ａｒｔとｐＨ
［＾ＲとのコトランスフェクションはＣＡＴ遺伝子の発
現レベルをかなり（２６〜４９倍）増加させた。ａｒｔ
の存在下にプラスミドｐＨ［＾Ｒによって支配されるＣ
ＡＴ酵素のレベルは、Ｈｅ１ａ ｔａＬＩｎ細胞中のプ
ラスミドｐＵ３Ｒ−ＩＩＩで得られるレベルにほぼ等し
いが、Ｊｕｒｋａｔ ｔａｔ １１及びＣＨＯｔａｔＩ
［［細胞で得られるレベルよりやや低い、これは、ウィ
ルスの３゛半分がＣＡＴ遺伝子発現をマイナスに調節す
る配列をもちこの阻害効果がａｒｔ３１１伝子産物によ
って克服され得ることを示す、これらの結果はまた、３
′プロウィルス配列の調節効果及びａｒｔ遺伝子機能に
対して組織又は種特異的因子が全く不要であることも示
す。
スミドｐＨ［をトランスフェクトした細胞中では酵素活
性が検出されないので、ＣＡＴ遺伝子の発現はポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルの存在に依存した。これらのプラ
スミドによって発現されるＣＡＴ活性のレベルはプラス
ミドｐ ｔｌ ３− ａ ｒ ｔとのコトランスフエク
ションによって影響を受けなかった。ＨＩＶ−１プロウ
イルスの３′部分がＣＡＴ遺伝子のコード配列の３゛側
に配置されているプラスミドｐ■＾Ｒによって発現され
るＣＡＴ酵素活性のレベルは、同じ細胞にプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−［［をトランスフェクトして検出されたレベル
に比較して顕著に減少していた。しかしなから、ａｒｔ
タンパク質を発現するプラスミドｐＨ３−ａｒｔとｐＨ
［＾ＲとのコトランスフェクションはＣＡＴ遺伝子の発
現レベルをかなり（２６〜４９倍）増加させた。ａｒｔ
の存在下にプラスミドｐＨ［＾Ｒによって支配されるＣ
ＡＴ酵素のレベルは、Ｈｅ１ａ ｔａＬＩｎ細胞中のプ
ラスミドｐＵ３Ｒ−ＩＩＩで得られるレベルにほぼ等し
いが、Ｊｕｒｋａｔ ｔａｔ １１及びＣＨＯｔａｔＩ
［［細胞で得られるレベルよりやや低い、これは、ウィ
ルスの３゛半分がＣＡＴ遺伝子発現をマイナスに調節す
る配列をもちこの阻害効果がａｒｔ３１１伝子産物によ
って克服され得ることを示す、これらの結果はまた、３
′プロウィルス配列の調節効果及びａｒｔ遺伝子機能に
対して組織又は種特異的因子が全く不要であることも示
す。
ＣＡＴ遺伝子で得られた結果の普遍性は、第２の外来性
遺伝子、即ちヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする
遺伝子［５ｅｌｄｅｎ等、Ｎｏ１．Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ
、 ６：３１７３−３１７９（１９８Ｂ）コに対する３
′プロウィルス配列の影響を測定することによって証明
される。ｈＧ■遺伝子をコードするｃＤＮ＾ＤＮＡＨＩ
Ｖ−Ｉ ＬＴＲ配列と＋１１Ｖ−１プロウイルスの３
°末端との間に挿入した（プラスミドｐ ｍ ＧＨＡＲ
；第３図（Ｂ））、このプラスミドに使用されたｈＧＨ
配列は細胞ｂ Ｇ ＩＩプロモーターとポリアゾニレ−
ジョン配列とをもたない。更に２つのプラスミドを作成
した。１つはポリアゾニレ−ジョンシグナルをもたない
■ＩＶ−Ｉ ＬＴの３′側に配置されたヒト成長ホル
モン遺伝子を含むプラスミド（ｐＩ［［ＧＩＩ）テあり
、１つはｈ Ｇ １１３ｆｉ伝子の３°側４：ｍＳＶ４
０ポリアゾニレ−ジョン配列を含むプラスミド（ｐｌ［
ＩＧＨ３ｖ）である０表■のデータはプラスミド＋１１
１１にＨＳＶがＨｅ１ａ ｔａｔｌＩ［及びＣｆ１Ｏｔ
ａｔＩ［ｌ細胞の双方においてｈａｌ＋の合成を支配す
ることを示した。プラスミドｐｌ［ＧＩＩをトランスフ
ェクトした細胞中で有意なｈＧＨ活性は検出されなかっ
た。これらのプラスミドによって支配されるｈＧＨ活性
のレベルはプラスミドρ＋１３−ａｒｔとのコトランス
フェクションによって影響されなかった。
遺伝子、即ちヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする
遺伝子［５ｅｌｄｅｎ等、Ｎｏ１．Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ
、 ６：３１７３−３１７９（１９８Ｂ）コに対する３
′プロウィルス配列の影響を測定することによって証明
される。ｈＧ■遺伝子をコードするｃＤＮ＾ＤＮＡＨＩ
Ｖ−Ｉ ＬＴＲ配列と＋１１Ｖ−１プロウイルスの３
°末端との間に挿入した（プラスミドｐ ｍ ＧＨＡＲ
；第３図（Ｂ））、このプラスミドに使用されたｈＧＨ
配列は細胞ｂ Ｇ ＩＩプロモーターとポリアゾニレ−
ジョン配列とをもたない。更に２つのプラスミドを作成
した。１つはポリアゾニレ−ジョンシグナルをもたない
■ＩＶ−Ｉ ＬＴの３′側に配置されたヒト成長ホル
モン遺伝子を含むプラスミド（ｐＩ［［ＧＩＩ）テあり
、１つはｈ Ｇ １１３ｆｉ伝子の３°側４：ｍＳＶ４
０ポリアゾニレ−ジョン配列を含むプラスミド（ｐｌ［
ＩＧＨ３ｖ）である０表■のデータはプラスミド＋１１
１１にＨＳＶがＨｅ１ａ ｔａｔｌＩ［及びＣｆ１Ｏｔ
ａｔＩ［ｌ細胞の双方においてｈａｌ＋の合成を支配す
ることを示した。プラスミドｐｌ［ＧＩＩをトランスフ
ェクトした細胞中で有意なｈＧＨ活性は検出されなかっ
た。これらのプラスミドによって支配されるｈＧＨ活性
のレベルはプラスミドρ＋１３−ａｒｔとのコトランス
フェクションによって影響されなかった。
艮１
ａｒｔタンパク質の存在下及び非存在下におけるハイブ
リッド旧■分泌ｈＧＨ（ｃｐｍ）” 細胞系 ■ｅｌａ−ｔａｔ−ＩＩＩ ＣＨＯ−ｔａｔ−１［
プラスミドｐＨ３−ａｒｔｂ−＋（）’ −＋（）
ｃｐｎｌＧＩｌｓＶ ６８２６６４２３
（０，９） １３２８９１３５６７（１，０）ｐＩ［
ＧＩＩＡＲ３１２６０８３（２０） ８９０ ９６
９５（１１）注 ａ、プラスミドｐＨ３−ａｒｔの存在下（＋）又は非存
在下（−）に２μｇの表示プラスミドＤＮＡを細胞にト
ランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間
後に１００μｌの培地を採取しｈＧＨ活性を検定した。
リッド旧■分泌ｈＧＨ（ｃｐｍ）” 細胞系 ■ｅｌａ−ｔａｔ−ＩＩＩ ＣＨＯ−ｔａｔ−１［
プラスミドｐＨ３−ａｒｔｂ−＋（）’ −＋（）
ｃｐｎｌＧＩｌｓＶ ６８２６６４２３
（０，９） １３２８９１３５６７（１，０）ｐＩ［
ＧＩＩＡＲ３１２６０８３（２０） ８９０ ９６
９５（１１）注 ａ、プラスミドｐＨ３−ａｒｔの存在下（＋）又は非存
在下（−）に２μｇの表示プラスミドＤＮＡを細胞にト
ランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間
後に１００μｌの培地を採取しｈＧＨ活性を検定した。
固体支持体に結合した＋ ２５■標識抗ｂＧＨ抗体の毎
分カウント数（ＣＰＭ）を、合計ＣＰＭを測定し模擬ト
ランスフェクトした細胞の培地から得られたパックグラ
ウンドＣＰＭを減算することによって補正した。
分カウント数（ＣＰＭ）を、合計ＣＰＭを測定し模擬ト
ランスフェクトした細胞の培地から得られたパックグラ
ウンドＣＰＭを減算することによって補正した。
ｂ、括弧内に示す誘導値はａｒｔの存在下に得られた補
正ＣＰＭをａｒｔの非存在下に得られた補正ＣＩ’Ｍで
除算した値を示す。
正ＣＰＭをａｒｔの非存在下に得られた補正ＣＩ’Ｍで
除算した値を示す。
ａｒｔ遺伝子産物の非存在下にプラスミドｐｉｌｌ（：
ＨＡＲによって支配されるｂ Ｇ ＩＩのレベルはＨｃ
Ｌａ Ｌａｔ Ｉ［［及びＣＨＯｔａｔ Ｉ［［のいず
れの細胞系においても極めて低かった。ｐＩＩＩ（：Ｈ
ＡＲとプラスミドｐＨ３−ａｒｔとのコトランスフェク
ションの結果、ｈＧＩ＋活性は顕著に増加した（１１〜
２０倍）、 ａｒｔ産物の存在下にプラスミドｐｌ［ｌ
Ｇ■＾Ｒによって産生されたｈ Ｇ １１のレベルはプ
ラスミドｐｌ［［ＧｔｌｓＶで得られたレベルと同様で
あった。
ＨＡＲによって支配されるｂ Ｇ ＩＩのレベルはＨｃ
Ｌａ Ｌａｔ Ｉ［［及びＣＨＯｔａｔ Ｉ［［のいず
れの細胞系においても極めて低かった。ｐＩＩＩ（：Ｈ
ＡＲとプラスミドｐＨ３−ａｒｔとのコトランスフェク
ションの結果、ｈＧＩ＋活性は顕著に増加した（１１〜
２０倍）、 ａｒｔ産物の存在下にプラスミドｐｌ［ｌ
Ｇ■＾Ｒによって産生されたｈ Ｇ １１のレベルはプ
ラスミドｐｌ［［ＧｔｌｓＶで得られたレベルと同様で
あった。
ＣＡＴ遺伝子に関して観察されたように、ＩＩＴＶ−１
プロウイルスの３°半分はｈＧＩ＋遺伝子の発現に阻害
効果をもつ配列を含み、これらの配列の抑制効果はａｒ
ｔ遺伝子産物によって解除される。従って、）ＩＩＶ−
■プロウィルス配列に結合したＣＡＴ及びｈ Ｇ Ｉ＋
遺伝子の発現はｇａｇ及びｃｎｖ遺伝子自体の調節に酷
似する。
プロウイルスの３°半分はｈＧＩ＋遺伝子の発現に阻害
効果をもつ配列を含み、これらの配列の抑制効果はａｒ
ｔ遺伝子産物によって解除される。従って、）ＩＩＶ−
■プロウィルス配列に結合したＣＡＴ及びｈ Ｇ Ｉ＋
遺伝子の発現はｇａｇ及びｃｎｖ遺伝子自体の調節に酷
似する。
＾ｒｔ； にお番る５° ＬＴＲの
５’ ）ＩＩＶ−Ｉ ＬＴＲを向ヒトＴリンパ球ウィ
ルスタイ７” Ｉ （）ＩＴＬＶ−１）ノＬＴＲ（第３
図（Ａ））テ置換しタフラスミドを構築した。遺伝子発
現がＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲによって引き起こされるす
べての実験において、ＨＴＬＶ−Ｉのｔｒａｎｓ活性タ
ンパク質を発現するプラスミドｐＩ ｔａｔ Ｉを細胞
に同時にトランスフェクトした。
ルスタイ７” Ｉ （）ＩＴＬＶ−１）ノＬＴＲ（第３
図（Ａ））テ置換しタフラスミドを構築した。遺伝子発
現がＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲによって引き起こされるす
べての実験において、ＨＴＬＶ−Ｉのｔｒａｎｓ活性タ
ンパク質を発現するプラスミドｐＩ ｔａｔ Ｉを細胞
に同時にトランスフェクトした。
）ＩＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲのコントロール下にＣＡＴ遺
伝子の３′側に位置するＨＩＶ−１ゲノムの３°半分を
含むプラスミドｐｌΔ＾Ｒによって支配されるＣＡＴ酵
素活性のレベルは、ＣＡＴ遺伝子の３′側に位置するＳ
Ｖ４０のポリアゾニレ−ジョン配列を含むプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−１のレベルよりはるかに低かった（第５図及び
表■）。
伝子の３′側に位置するＨＩＶ−１ゲノムの３°半分を
含むプラスミドｐｌΔ＾Ｒによって支配されるＣＡＴ酵
素活性のレベルは、ＣＡＴ遺伝子の３′側に位置するＳ
Ｖ４０のポリアゾニレ−ジョン配列を含むプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−１のレベルよりはるかに低かった（第５図及び
表■）。
しかしなから、ｐＨ３−ａｒｔとのコトランスフェクシ
ョンの結果、プラスミドｐＩΔ＾Ｒに支配されるＣＡＴ
活性のレベルは盟著に増加した（１３〜３０倍）、レシ
ピエンドとしてＪｕｒｋａｔ細胞を使用するときも同様
の結果が得られたりこれらの実＠ｉま、１ＩｒＶｌの５
゛ＬＴＲがＨＩＶ−１プロウイルスの３°部分によって
与えられるｃｉｓ作用抑制効果又はｃｉｓ作用抗抑制効
果に不要であることを示す。
ョンの結果、プラスミドｐＩΔ＾Ｒに支配されるＣＡＴ
活性のレベルは盟著に増加した（１３〜３０倍）、レシ
ピエンドとしてＪｕｒｋａｔ細胞を使用するときも同様
の結果が得られたりこれらの実＠ｉま、１ＩｒＶｌの５
゛ＬＴＲがＨＩＶ−１プロウイルスの３°部分によって
与えられるｃｉｓ作用抑制効果又はｃｉｓ作用抗抑制効
果に不要であることを示す。
ＣＲＳＣＡＲの １ 打 ・・−エンベロープ遺
伝子配列の大部分が欠失したプラスミドｐｌΔ＾Ｒ及び
ｐｍΔ＾Ｒの誘導体を構築しくｐ１１１Δ＾Ｒ及びｐｉ
Δ＾Ｒ；第３図（Ｂ））、ａｒｔ３ｆｉ伝子産物の存在
下及び非存在下にＣＡＴ活性を試験した。ｅｎｖ遺伝子
の大部分の欠失の結果、これらの双方のプラスミドによ
って支配されるＣＡＴ遺伝子の活性レベルは、夫々の対
照プラスミドｐ ｒ ＡＲ及びｐｉｌｌ＾Ｒに比較して
増加を示した。プラスミドｐＨ３−ａｒｔとのコトラン
スフェクションによって酵素活性の増加は検出されなか
った。従って、ヌクレオチド５８９３−８５６１間に存
在するＨＩＶ−１ｉ＆列の欠失は阻害性調節効果を解除
し、ＨＩＶ−１配列によって伝えられるａｒｔ反応性抗
阻害効果を除去する。
伝子配列の大部分が欠失したプラスミドｐｌΔ＾Ｒ及び
ｐｍΔ＾Ｒの誘導体を構築しくｐ１１１Δ＾Ｒ及びｐｉ
Δ＾Ｒ；第３図（Ｂ））、ａｒｔ３ｆｉ伝子産物の存在
下及び非存在下にＣＡＴ活性を試験した。ｅｎｖ遺伝子
の大部分の欠失の結果、これらの双方のプラスミドによ
って支配されるＣＡＴ遺伝子の活性レベルは、夫々の対
照プラスミドｐ ｒ ＡＲ及びｐｉｌｌ＾Ｒに比較して
増加を示した。プラスミドｐＨ３−ａｒｔとのコトラン
スフェクションによって酵素活性の増加は検出されなか
った。従って、ヌクレオチド５８９３−８５６１間に存
在するＨＩＶ−１ｉ＆列の欠失は阻害性調節効果を解除
し、ＨＩＶ−１配列によって伝えられるａｒｔ反応性抗
阻害効果を除去する。
また、より小さい一連の欠失をプラスミドｐｌ［＾Ｒに
存在するプロウィルス配列に導入しプラスミドｐＡＲ−
１からｐＡｒｌ−７で示す（第６図）。これらのプラス
ミドに支配されるＣＡＴ活性のレベルを、プラスミドｐ
Ｈ３−ａｒｔの存在下又は非存在下にＨｅＬａ−ｔａｔ
ｍ細胞及びＪｕｒｋａｔ−ｔａｔ ｌｌ［細胞中で測
定した。 ＣＡＴ酵素活性のレベルに対するこれらの欠
失の影響を第７図及び表Ｉに示す。プロウィルスセグメ
ントの５°配列、ｔａｔ及びａｒｔ遺伝子の５′コード
エキソンを含む領域、ｅｎＶ遺伝子の５′末端及びイン
トロンのスプライス供与部位（ｐＡＲ−１）の欠失が存
在するとき、ＣＡＴ酵素活性のレベルはプラスミドｐｌ
［ｒ＾Ｒでトランスフェクトした同じ１ｌｅＬａ ｔａ
ｔｌ［細胞のレベルの約１７３に低下する。 ａｒｔの
存在下でＣＡＴ酵素活性のレベルは少なくとも１２倍増
加した。これらの結果は、スプライス供与部位を含むプ
ロウィルスインサートの５°末端から欠失した配列はａ
ｒｔ産物に対するＨＩＶ−１配列の反応に必須ではない
ことを示す。
存在するプロウィルス配列に導入しプラスミドｐＡＲ−
１からｐＡｒｌ−７で示す（第６図）。これらのプラス
ミドに支配されるＣＡＴ活性のレベルを、プラスミドｐ
Ｈ３−ａｒｔの存在下又は非存在下にＨｅＬａ−ｔａｔ
ｍ細胞及びＪｕｒｋａｔ−ｔａｔ ｌｌ［細胞中で測
定した。 ＣＡＴ酵素活性のレベルに対するこれらの欠
失の影響を第７図及び表Ｉに示す。プロウィルスセグメ
ントの５°配列、ｔａｔ及びａｒｔ遺伝子の５′コード
エキソンを含む領域、ｅｎＶ遺伝子の５′末端及びイン
トロンのスプライス供与部位（ｐＡＲ−１）の欠失が存
在するとき、ＣＡＴ酵素活性のレベルはプラスミドｐｌ
［ｒ＾Ｒでトランスフェクトした同じ１ｌｅＬａ ｔａ
ｔｌ［細胞のレベルの約１７３に低下する。 ａｒｔの
存在下でＣＡＴ酵素活性のレベルは少なくとも１２倍増
加した。これらの結果は、スプライス供与部位を含むプ
ロウィルスインサートの５°末端から欠失した配列はａ
ｒｔ産物に対するＨＩＶ−１配列の反応に必須ではない
ことを示す。
第７図はこれらの実験の結果を示す。細胞に１μｇの表
示プラスミドＤＮＡと３μｇの非特異的コンペティター
ＤＮ＾（−）（プラスミドルＵ３１１−１１１β；玉揚
）又は３μＪのｐＨ３−ａｒｔ（＋ ）とをコトランス
フエクトシた。トランスフェクションの４８時間後にＣ
ＡＴアッセイを行なった９図示のオートラジオダラムは
経時的アッセイの直線部分から得られた。実験１ではＣ
０Ｏ−Ｌａｔ■細胞にプラスミドｐＵ３Ｒ−ＩＩＩ（レ
ーンａ）、ｐＩ［［八Ｒ（レーンｂ）％ｐＡＲ−１（レ
ーンｃ）、ｐＡＲ−６（レーンｄ）及びｐＡＲ−３（レ
ーンＣ）をトランスフェクトしな、実験２ではＨｅＬａ
−ｔａｔ ＩＩ［細胞にプラスミドｐｔ１３Ｒ−Ｉ［１
（レーンａ）、ｐ■＾Ｒ（レーンｂ）、ｐｉｌｌ＾ＲＳ
Ｖ （レーンＣ）、ｐ＾−６３７６（レーンｄ）及びｐ
＾−７１２６（レーンｅ）をトランスフェクトした。実
験３ではｌ１ｅＬａ−ｔａｔｌ［［細胞にプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−ＩＩＩ（レーンａ）、ｐＩ［［＾Ｒ（レーンｂ
）及びｐＢ−６３７６（レーンＣ）をトランスフェクト
した。実験４ではＩＩ ｅ Ｌ ａ −Ｌａｔ［［細胞
にプラスミドｐｌＩ［＾Ｒ（レーンａ）、ｐＡＲ−ＩＳ
Ｖ（レーンｂ）及びｐＡＲ−ＩＳＶＲ（レーンＣ）をト
ランスフェクションた。
示プラスミドＤＮＡと３μｇの非特異的コンペティター
ＤＮ＾（−）（プラスミドルＵ３１１−１１１β；玉揚
）又は３μＪのｐＨ３−ａｒｔ（＋ ）とをコトランス
フエクトシた。トランスフェクションの４８時間後にＣ
ＡＴアッセイを行なった９図示のオートラジオダラムは
経時的アッセイの直線部分から得られた。実験１ではＣ
０Ｏ−Ｌａｔ■細胞にプラスミドｐＵ３Ｒ−ＩＩＩ（レ
ーンａ）、ｐＩ［［八Ｒ（レーンｂ）％ｐＡＲ−１（レ
ーンｃ）、ｐＡＲ−６（レーンｄ）及びｐＡＲ−３（レ
ーンＣ）をトランスフェクトしな、実験２ではＨｅＬａ
−ｔａｔ ＩＩ［細胞にプラスミドｐｔ１３Ｒ−Ｉ［１
（レーンａ）、ｐ■＾Ｒ（レーンｂ）、ｐｉｌｌ＾ＲＳ
Ｖ （レーンＣ）、ｐ＾−６３７６（レーンｄ）及びｐ
＾−７１２６（レーンｅ）をトランスフェクトした。実
験３ではｌ１ｅＬａ−ｔａｔｌ［［細胞にプラスミドｐ
Ｕ３Ｒ−ＩＩＩ（レーンａ）、ｐＩ［［＾Ｒ（レーンｂ
）及びｐＢ−６３７６（レーンＣ）をトランスフェクト
した。実験４ではＩＩ ｅ Ｌ ａ −Ｌａｔ［［細胞
にプラスミドｐｌＩ［＾Ｒ（レーンａ）、ｐＡＲ−ＩＳ
Ｖ（レーンｂ）及びｐＡＲ−ＩＳＶＲ（レーンＣ）をト
ランスフェクションた。
ａｒｔの非存在下に、プラスミドｐＡＲ−２及びｐＡＲ
−６をトランスフェクトした細胞中で観察されたＣＡＴ
活性のレベルは親プラスミドｐＨｌΔＲで得られたレベ
ルと同様であった。これらの３つのプラスミド全部が同
様のレベルのＣＡＴ活性を支配し、プラスミドｐ ＩＩ
３− ａ ｒ ｔとのコトランスフエクション後には
ＣＡＴ酵素活性レベルのかなりの増加を示す（ＨｅＬａ
−ｔａｔ１１１ｉ胞で１６〜２４倍、Ｊｕｒｋａｔ−ｔ
ａｔｌ［Ｉ ！胞で１７〜３９倍に増加）。プラスミド
ｐＡＲ−６に存在する欠失はｅｎＶ遺伝子イントロンの
スプライス受容部位を除去し、またｔａｔ及びａｒｔ遺
伝子の３゛コードエキソンを除去する。これらの領域の
除去はＣＢＳ配列にもＣへＲ配列にも影響を与えない、
実験によれば、阻害調節作用及びａｒｔ反応性抗阻害効
果の双方にｅｎｖＥｆｌｔ伝子内部に存封子るスプライ
ス供与部位もスプライス受容部位も不要であることが判
明した。
−６をトランスフェクトした細胞中で観察されたＣＡＴ
活性のレベルは親プラスミドｐＨｌΔＲで得られたレベ
ルと同様であった。これらの３つのプラスミド全部が同
様のレベルのＣＡＴ活性を支配し、プラスミドｐ ＩＩ
３− ａ ｒ ｔとのコトランスフエクション後には
ＣＡＴ酵素活性レベルのかなりの増加を示す（ＨｅＬａ
−ｔａｔ１１１ｉ胞で１６〜２４倍、Ｊｕｒｋａｔ−ｔ
ａｔｌ［Ｉ ！胞で１７〜３９倍に増加）。プラスミド
ｐＡＲ−６に存在する欠失はｅｎＶ遺伝子イントロンの
スプライス受容部位を除去し、またｔａｔ及びａｒｔ遺
伝子の３゛コードエキソンを除去する。これらの領域の
除去はＣＢＳ配列にもＣへＲ配列にも影響を与えない、
実験によれば、阻害調節作用及びａｒｔ反応性抗阻害効
果の双方にｅｎｖＥｆｌｔ伝子内部に存封子るスプライ
ス供与部位もスプライス受容部位も不要であることが判
明した。
プラスミドｐＡＲ−３及びｐＡＲ−７をトランスフェク
トした細胞中のａｒｔの非存在下に得られたＣＡＴ酵素
活性のレベルとプラスミドｐｉｌｌ＾Ｒのトランスフェ
クションによって得られたレベルとを比較すると、双方
の欠失の場合にＣＡＴ活性のレベルが約１０倍に増加す
ることが判明した。しかしなから、プラスミドｐＨ３−
ａｒｔとのコトランスフェクションによってＣＡＴ活性
のレベルは更に増加し、ＨｅＬａ−ｔａｔ Ｉ［ｌ Ｒ
ｍ胞で約２．５倍、Ｊｕｒｋａｔ−ｔａｔｌｌ細胞で約
５〜９倍になる。ＣＡＴ遺伝子発現をマイナスに調節す
る配列は明らかにこれらのプラスミドから除去されてい
る。
トした細胞中のａｒｔの非存在下に得られたＣＡＴ酵素
活性のレベルとプラスミドｐｉｌｌ＾Ｒのトランスフェ
クションによって得られたレベルとを比較すると、双方
の欠失の場合にＣＡＴ活性のレベルが約１０倍に増加す
ることが判明した。しかしなから、プラスミドｐＨ３−
ａｒｔとのコトランスフェクションによってＣＡＴ活性
のレベルは更に増加し、ＨｅＬａ−ｔａｔ Ｉ［ｌ Ｒ
ｍ胞で約２．５倍、Ｊｕｒｋａｔ−ｔａｔｌｌ細胞で約
５〜９倍になる。ＣＡＴ遺伝子発現をマイナスに調節す
る配列は明らかにこれらのプラスミドから除去されてい
る。
しかしなから、これらの２つの欠失はａｒｔ遺伝子産物
に対する反応を完全には除去しない。これらの実験は、
プラスミドｐｌ［Ｉ＾Ｒ中に存在するプロウィルス配列
が外来性遺伝子の発現レベルを低下させる少なくとも２
つの異なる配列を含むことを示す。
に対する反応を完全には除去しない。これらの実験は、
プラスミドｐｌ［Ｉ＾Ｒ中に存在するプロウィルス配列
が外来性遺伝子の発現レベルを低下させる少なくとも２
つの異なる配列を含むことを示す。
ｔａｔ及びａｒｔ ｍＲＮ八から除去されたイントロン
の中央領域に大きい欠失を含むプラスミドｐＡＲ−４及
びｐＡＲ−５によって支配されるＣＡＴ活性のレベルは
ａｒｔ遺伝子産物の存在の影響を受けなかった（表り。
の中央領域に大きい欠失を含むプラスミドｐＡＲ−４及
びｐＡＲ−５によって支配されるＣＡＴ活性のレベルは
ａｒｔ遺伝子産物の存在の影響を受けなかった（表り。
これらの欠失は明らかにプロウィルスの３′半分のＣＡ
Ｒ配列を完全に除去する。従ってＣＡＲ配列はヌクレオ
チド６３７６と７６８３との間に存在する。
Ｒ配列を完全に除去する。従ってＣＡＲ配列はヌクレオ
チド６３７６と７６８３との間に存在する。
ａｒｔ遺伝子産物の非存在下にプラスミドｐＡＲ−４に
よって支配されるＣＡＴ活性のレベルはｐｍ八へによっ
て支配されるレベルと同様であった（表Ｉ）。しかしな
から、プラスミドｐＡＲ−５でトランスフェクトされた
細胞はプラスミドｐＡＲ−４又はｐｌ［ＩＡＲでトラン
スフェクトされた細胞の１０倍のＣＡＴ酵素活性のレベ
ルを示した。この結果は、ＣＡＴ遺伝子の活性を抑制す
るプラスミドｐＡＲ−４に存在するＣＲＳはプラスミド
ｐＡＲ−５に存在する大きい欠失によって除去されてい
ることを示す。
よって支配されるＣＡＴ活性のレベルはｐｍ八へによっ
て支配されるレベルと同様であった（表Ｉ）。しかしな
から、プラスミドｐＡＲ−５でトランスフェクトされた
細胞はプラスミドｐＡＲ−４又はｐｌ［ＩＡＲでトラン
スフェクトされた細胞の１０倍のＣＡＴ酵素活性のレベ
ルを示した。この結果は、ＣＡＴ遺伝子の活性を抑制す
るプラスミドｐＡＲ−４に存在するＣＲＳはプラスミド
ｐＡＲ−５に存在する大きい欠失によって除去されてい
ることを示す。
八ｒｔ に・ る３’ ＬＴＲの
３’ ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ配列が前記のごト＜ ＳＶ
４０ウィルスのポリアゾニレ−ジョンシグナルで置換さ
れた一連のプラスミドを構築したく第６図（Ｂ））、こ
れらのプラスミドは更に、プロウィルスｅｎｖｉ封子配
列の付加的欠失を含む。ａｒｔ遺伝子産物の非存在下に
プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶ又はｐＡＲ−２ＳＶによって
支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、すべてのレシピ
エンド細胞系中で親プラスミドｐｌ［ＡＲによって支配
される活性のレベルと同様である（表Ｉ）。これらのプ
ラスミドによって支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは
、プラスミドｐＨ３−ａｒｔを同時にトランスフェクト
した細胞中で２０〜４０倍に増加した。プロウィルスの
付加的領域が除去されたプラスミドｐ＾−３ＳＶをトラ
ンスフェクトした細胞中でａｒｔの非存在下に得られる
ＣＡＴ活性は、プラスミドｐＨｌ＾１５ｐＡＲ−ＩＳＶ
又！、ｔｐＡＲ−２ＳＶテｆＱ！察された活性より大き
カッた。しかしなから、このプラスミドに支配されるＣ
ＡＴ活性のレベルはａｒｔの存在下に約７倍に増加しな
、これらの結果は、ａｒｔ調節に３″ＬＴＲが不要なこ
と、及び、プラスミドｐＡＲ−３ＳＶ中に存在する配列
がＣＡＲエレメントを保持していることを示す。
４０ウィルスのポリアゾニレ−ジョンシグナルで置換さ
れた一連のプラスミドを構築したく第６図（Ｂ））、こ
れらのプラスミドは更に、プロウィルスｅｎｖｉ封子配
列の付加的欠失を含む。ａｒｔ遺伝子産物の非存在下に
プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶ又はｐＡＲ−２ＳＶによって
支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、すべてのレシピ
エンド細胞系中で親プラスミドｐｌ［ＡＲによって支配
される活性のレベルと同様である（表Ｉ）。これらのプ
ラスミドによって支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは
、プラスミドｐＨ３−ａｒｔを同時にトランスフェクト
した細胞中で２０〜４０倍に増加した。プロウィルスの
付加的領域が除去されたプラスミドｐ＾−３ＳＶをトラ
ンスフェクトした細胞中でａｒｔの非存在下に得られる
ＣＡＴ活性は、プラスミドｐＨｌ＾１５ｐＡＲ−ＩＳＶ
又！、ｔｐＡＲ−２ＳＶテｆＱ！察された活性より大き
カッた。しかしなから、このプラスミドに支配されるＣ
ＡＴ活性のレベルはａｒｔの存在下に約７倍に増加しな
、これらの結果は、ａｒｔ調節に３″ＬＴＲが不要なこ
と、及び、プラスミドｐＡＲ−３ＳＶ中に存在する配列
がＣＡＲエレメントを保持していることを示す。
ヌクレオチド７６８３からヌクレオチド８５６１までの
同し３”プロウィルス配列を含むプラスミドｐＡＲ−４
がａｒｔ反応性でないので、ｐＡＲ−３ＳＶ中のａｒｔ
反応性ＣＡＲエレメントはヌクレオチド６５８３と７１
６３との間に存在する配列中に位置すると考えられる。
同し３”プロウィルス配列を含むプラスミドｐＡＲ−４
がａｒｔ反応性でないので、ｐＡＲ−３ＳＶ中のａｒｔ
反応性ＣＡＲエレメントはヌクレオチド６５８３と７１
６３との間に存在する配列中に位置すると考えられる。
ＣΔＲ１の 確ｆｔｈｂ・・
ヌクレオチド６３７６〜７７６０ （第８図）、ＣＲＳ
配列とＣＡＲ配列との双方を含むプロウィルスの領域を
含むプラスミドルへ−６３７６を出発材料として次第に
拡張する（ｎｅｓｔｅｄ＞一連の欠失を作成した（表Ｉ
）。このプラスミドにおいてＳＶ４０ポリアゾニレ−ジ
ョン配列はプロウィルス配列の３′に位置していた。ａ
ｒｔ遺伝子の非存在下にプラスミドｐ＾−６３７６によ
って支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、５′及び３
′のプロウィルス配列の長い（ｃｘｔｅｎｓｉｖｅ）欠
失を含むｐＡＲ−ＳＶＩプラスミドで観察されたレベル
と同様であった。プラスミドｐΔＲ−ＳＶ１及びｐＡ−
６３７６によって支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは
ＰＨ３−ａｒｔプラスミドとのコトランスフエクション
によって実質的に増加した。
配列とＣＡＲ配列との双方を含むプロウィルスの領域を
含むプラスミドルへ−６３７６を出発材料として次第に
拡張する（ｎｅｓｔｅｄ＞一連の欠失を作成した（表Ｉ
）。このプラスミドにおいてＳＶ４０ポリアゾニレ−ジ
ョン配列はプロウィルス配列の３′に位置していた。ａ
ｒｔ遺伝子の非存在下にプラスミドｐ＾−６３７６によ
って支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、５′及び３
′のプロウィルス配列の長い（ｃｘｔｅｎｓｉｖｅ）欠
失を含むｐＡＲ−ＳＶＩプラスミドで観察されたレベル
と同様であった。プラスミドｐΔＲ−ＳＶ１及びｐＡ−
６３７６によって支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは
ＰＨ３−ａｒｔプラスミドとのコトランスフエクション
によって実質的に増加した。
プラスミドｐＡ−６７２５（第８図）を得るために、プ
ラスミドｐ＾−６３７６のプロウィルス配列の５′末端
から更に約３５０個のヌクレオチドを欠失させると、ａ
ｒｔ産物の非存在下のＣＡＴ活性のレベルがｐＡ−６３
７６に比較して約１０〜２０倍増加しなく表Ｉ）。ＣＡ
Ｔ遺伝子の発現レベルはａｒｔの存在下に更に５〜６倍
増加した。別のプラスミドからプロウィルス配列の同様
の領域が欠失すると（ρ■＾ＲとｐＡＲ−３ＳＶとの比
較、表Ｉ）、ＣＡＴ酵素活性のレベルはプラスミドｐｍ
ΔＲに比較して増加した（表■）。これらの観察は、ヌ
クレオチド６５Ｓ３と６７２５との間に位置するＣＲＳ
、即ちｅｎｖ遺伝子のコード領域内部に完全に内包され
る配列の存在を示す。
ラスミドｐ＾−６３７６のプロウィルス配列の５′末端
から更に約３５０個のヌクレオチドを欠失させると、ａ
ｒｔ産物の非存在下のＣＡＴ活性のレベルがｐＡ−６３
７６に比較して約１０〜２０倍増加しなく表Ｉ）。ＣＡ
Ｔ遺伝子の発現レベルはａｒｔの存在下に更に５〜６倍
増加した。別のプラスミドからプロウィルス配列の同様
の領域が欠失すると（ρ■＾ＲとｐＡＲ−３ＳＶとの比
較、表Ｉ）、ＣＡＴ酵素活性のレベルはプラスミドｐｍ
ΔＲに比較して増加した（表■）。これらの観察は、ヌ
クレオチド６５Ｓ３と６７２５との間に位置するＣＲＳ
、即ちｅｎｖ遺伝子のコード領域内部に完全に内包され
る配列の存在を示す。
プラスミドｐ＾−７０００からｐＡ−７２８３（第８図
）を得るために更に別のヌクレオチドを順次欠失させて
もａｒｔ非存在下のトランスフェクト細胞で観察された
ＣＡＴ酵素活性のレベルはプラスミドｐ＾−６７２５（
表１）に支配される酵素活性に比較して有意に変化しな
かった。これらのプラスミドをトランスフエフ）・シた
細胞中で観察された遺伝子発現のレベルはプラスミドｐ
Ｈ３−ａｒｔとのコトランスフエクションによって実質
的に増加した。プラスミドｐＡＲ−３ＳＶ中のＣＡＲエ
レメント、即ちヌクレオチド６５８３−７１６３を含む
領域の１つが１ラスミドｐ＾−７２０１及びｐ＾−７２
８３では完全に欠失しているときにもａｒｔ反応は維持
されていた。
）を得るために更に別のヌクレオチドを順次欠失させて
もａｒｔ非存在下のトランスフェクト細胞で観察された
ＣＡＴ酵素活性のレベルはプラスミドｐ＾−６７２５（
表１）に支配される酵素活性に比較して有意に変化しな
かった。これらのプラスミドをトランスフエフ）・シた
細胞中で観察された遺伝子発現のレベルはプラスミドｐ
Ｈ３−ａｒｔとのコトランスフエクションによって実質
的に増加した。プラスミドｐＡＲ−３ＳＶ中のＣＡＲエ
レメント、即ちヌクレオチド６５８３−７１６３を含む
領域の１つが１ラスミドｐ＾−７２０１及びｐ＾−７２
８３では完全に欠失しているときにもａｒｔ反応は維持
されていた。
ｐ＾−７２８３から更に４２個のヌクレオチドを欠失さ
せて得られたプラスミドρ＾−７３２５はａｒｔ存在下
に遺伝子発現レベルの増加を示さなかった。プラスミド
ｐ＾−７３２５によって支配されるＣＡＴ酵素活性のレ
ベルは、ａｒｔの非存在下にプラスミドρＡ−６７２５
からｐ＾−７２８３までによって支配される酵素活性よ
りもやや高いレベルを示した。より大きい欠失を含むプ
ラスミドｐ＾−７４４１、ｐ＾−７５１０及びｐ＾−７
５４５はプラスミドｐ＾−７３２５と同様の活性レベル
を示した。更に、プラスミドｐＨ３−ａｒｔとのコトラ
ンスフェクション後にもこれらのプラスミドによって支
配されるＣＡＴ酵素活性が増加しないことが検出された
。これらの実験において、ａｒｔ３ｆｉ伝子に反応性の
ＣへＲ配列を含む最小セグメントは、ヌクレオチド７２
８３と７７６０との間に位置する４００個のヌクレオチ
ドから成るプロウィルスフラグメントである。
せて得られたプラスミドρ＾−７３２５はａｒｔ存在下
に遺伝子発現レベルの増加を示さなかった。プラスミド
ｐ＾−７３２５によって支配されるＣＡＴ酵素活性のレ
ベルは、ａｒｔの非存在下にプラスミドρＡ−６７２５
からｐ＾−７２８３までによって支配される酵素活性よ
りもやや高いレベルを示した。より大きい欠失を含むプ
ラスミドｐ＾−７４４１、ｐ＾−７５１０及びｐ＾−７
５４５はプラスミドｐ＾−７３２５と同様の活性レベル
を示した。更に、プラスミドｐＨ３−ａｒｔとのコトラ
ンスフェクション後にもこれらのプラスミドによって支
配されるＣＡＴ酵素活性が増加しないことが検出された
。これらの実験において、ａｒｔ３ｆｉ伝子に反応性の
ＣへＲ配列を含む最小セグメントは、ヌクレオチド７２
８３と７７６０との間に位置する４００個のヌクレオチ
ドから成るプロウィルスフラグメントである。
ヌクレオチド６３７６から６９７０までのプロウィルス
配列とＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルとを順次
に含む別のプラスミドｐＢ−６３７６を構築した。表Ｉ
のデータと第７図とは、ＨｅＬａ−ｔａｔＩ［［及びＣ
ＨＯ−Ｌａｔ Ｉｌｌにおいてこのプラスミドによって
支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルが、プラスミドｐ
ＩＩ ３− ａ ｒ ｔとのコトランスフェクションに
よって影響をうけないことを証明した。Ｃｌ０３Ｒ−１
［に関する低い基礎活性は、領域６３７６から６９７０
までの内部にＣＲＳが存在することを示す、 ａｒｔ反
応性の欠如は、ヌクレオチド６５８３から７１６３まで
の内部に存在するａｒｔ反応性ＣＡＲエレメントがプラ
スミドｐＢ−６３７６中では崩壊していることを示す。
配列とＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルとを順次
に含む別のプラスミドｐＢ−６３７６を構築した。表Ｉ
のデータと第７図とは、ＨｅＬａ−ｔａｔＩ［［及びＣ
ＨＯ−Ｌａｔ Ｉｌｌにおいてこのプラスミドによって
支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルが、プラスミドｐ
ＩＩ ３− ａ ｒ ｔとのコトランスフェクションに
よって影響をうけないことを証明した。Ｃｌ０３Ｒ−１
［に関する低い基礎活性は、領域６３７６から６９７０
までの内部にＣＲＳが存在することを示す、 ａｒｔ反
応性の欠如は、ヌクレオチド６５８３から７１６３まで
の内部に存在するａｒｔ反応性ＣＡＲエレメントがプラ
スミドｐＢ−６３７６中では崩壊していることを示す。
プラスミドＨＸＢｃ２（菌株３Ｂ）中で地図作成された
ＣＡＲ２機能に必要な配列を第２図（Ｂ）に示す、プリ
ンに富む部分に上線を付しである。菌株３Ｂ中で同定さ
れたＣＡＲ２配列［Ｒａｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３
１３：２７７−２８４（１９８５）］を菌株ＩＩＲＵ［
１ｉ１ａｉｎ−ｔｌｏｂｓｏｎ等、Ｃｅ１ｌ ４０：９
−１７（１９８５）］ 、ＭＡＬ［Ｍ、＾１ｉｚｏｎ、
ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ］、Ｅ
ＬＩ［Ｍ、Δ１ｉｚｏｎ、 ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ］及び＾ＲＶ−２［５ａｎｃｈｅ
ｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２７７：４
８４−４９２（１９８５）］に存在する夫々の領域と整
列させた。
ＣＡＲ２機能に必要な配列を第２図（Ｂ）に示す、プリ
ンに富む部分に上線を付しである。菌株３Ｂ中で同定さ
れたＣＡＲ２配列［Ｒａｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３
１３：２７７−２８４（１９８５）］を菌株ＩＩＲＵ［
１ｉ１ａｉｎ−ｔｌｏｂｓｏｎ等、Ｃｅ１ｌ ４０：９
−１７（１９８５）］ 、ＭＡＬ［Ｍ、＾１ｉｚｏｎ、
ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ］、Ｅ
ＬＩ［Ｍ、Δ１ｉｚｏｎ、 ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ］及び＾ＲＶ−２［５ａｎｃｈｅ
ｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２７７：４
８４−４９２（１９８５）］に存在する夫々の領域と整
列させた。
＾ｒｔ の 口
前記のごとく、プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶによって支配
されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、ａｒｔ遺伝子産物の
存在下にかなり増加した（１６〜４３倍）、プラスミド
ｐＡＲ−ＩＳＶ中に存在するプロウィルス配列と同一で
はあるが逆方向（第６図（Ｂ））のプロウィルス配列を
含むプラスミド（ｐＡＲ−ＩＳＶＲ）を使用してプロモ
ーター及びポリアゾニレ−ジョン配列に対するＣＡＲ配
列の方向の影響を示した。プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶＲ
によって支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、ａｒｔ
の非存在下にプラスミドｐＡＲ−ＩＳＶによって支配さ
れるレベルと同様であった。プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶ
ＲとｐＨ３−ａｒｔとのコトランスフエクションによっ
てＣＡＴ酵素活性レベルの増加は全く観察されなかった
。プラスミドｐＵ３Ｒ−１に比較して活性レベルがエン
ハンサ−エレメントを除いて、コード領域内部のＣＡＲ
配列の場所が、先に同定されたｃｉｓ作用調節配列から
このエレメントを識別する。ｅｎｖ逍伝遺封子の配列が
転写開始部位に対して５′側に配置されているときにＣ
ＡＴ３！！伝子発現を調子発現るか否かを決定するため
に、ｅｎｖ遺伝子の部分がエンハンサ−配列の欠失した
プロモーターに対して５′側に配置されたプラスミドを
構築した（第９図）。
されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、ａｒｔ遺伝子産物の
存在下にかなり増加した（１６〜４３倍）、プラスミド
ｐＡＲ−ＩＳＶ中に存在するプロウィルス配列と同一で
はあるが逆方向（第６図（Ｂ））のプロウィルス配列を
含むプラスミド（ｐＡＲ−ＩＳＶＲ）を使用してプロモ
ーター及びポリアゾニレ−ジョン配列に対するＣＡＲ配
列の方向の影響を示した。プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶＲ
によって支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、ａｒｔ
の非存在下にプラスミドｐＡＲ−ＩＳＶによって支配さ
れるレベルと同様であった。プラスミドｐＡＲ−ＩＳＶ
ＲとｐＨ３−ａｒｔとのコトランスフエクションによっ
てＣＡＴ酵素活性レベルの増加は全く観察されなかった
。プラスミドｐＵ３Ｒ−１に比較して活性レベルがエン
ハンサ−エレメントを除いて、コード領域内部のＣＡＲ
配列の場所が、先に同定されたｃｉｓ作用調節配列から
このエレメントを識別する。ｅｎｖ逍伝遺封子の配列が
転写開始部位に対して５′側に配置されているときにＣ
ＡＴ３！！伝子発現を調子発現るか否かを決定するため
に、ｅｎｖ遺伝子の部分がエンハンサ−配列の欠失した
プロモーターに対して５′側に配置されたプラスミドを
構築した（第９図）。
これらの実験に使用されたプロモーターは、ＩＩ Ｔ
Ｌ Ｖ−Ｉ ＬＴＲから誘導され、外来性エンハンサ
−配列に反応性であることが予め判っていた配列−５５
〜＋３２５を含む。プロモーターに対して５°側に位置
するｅｎｖｓ伝子配列を含むプラスミド（ｐＣ−５５／
ｍ １４７０及びｐＣ−５５／ｌｌＩ２４７９）によ
って支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、ＨＴＬＶ−
１プロモーターだけを含むプラスミドｐＣ−５５で観察
された活性レベルと同様であった（表■）。これらのプ
ラスミドはプラスミドｐＨ３−ａｒｔとコトランスフエ
クションの後にもＣＡＴ活性の増加を全く示さなかった
。これはこれらの実験で使用された旧Ｖ−１配列がａｒ
ｔ産物の存在下又は非存在下にエンハンサ−活性を全く
持たないことを示す。
Ｌ Ｖ−Ｉ ＬＴＲから誘導され、外来性エンハンサ
−配列に反応性であることが予め判っていた配列−５５
〜＋３２５を含む。プロモーターに対して５°側に位置
するｅｎｖｓ伝子配列を含むプラスミド（ｐＣ−５５／
ｍ １４７０及びｐＣ−５５／ｌｌＩ２４７９）によ
って支配されるＣＡＴ酵素活性のレベルは、ＨＴＬＶ−
１プロモーターだけを含むプラスミドｐＣ−５５で観察
された活性レベルと同様であった（表■）。これらのプ
ラスミドはプラスミドｐＨ３−ａｒｔとコトランスフエ
クションの後にもＣＡＴ活性の増加を全く示さなかった
。これはこれらの実験で使用された旧Ｖ−１配列がａｒ
ｔ産物の存在下又は非存在下にエンハンサ−活性を全く
持たないことを示す。
艮ｌ
細胞系
１１ｅＬａ−ｔａＬ−１［Ｉ ＣＩＣｌｌ０−ｔａ
ｔ−実験プラスミドｐＨ３−ａｒｔｂ−＋ □ｃ−＋
０’１ ｐＣ−５５１，０００，８２（０，８）
ｐＣ−５５／■２４７９ １．０００．８８（０
，９）ｐＣ−５５／Ｉ［［１４７００，７１０，７９（
１，６）２ ｐＵ３Ｒ−ＩＩＩ １
．００１．３０（１，３） １．００１．４０（１，４
）ｐＡＲ−ＩＳＶ Ｏ，０２０，８２（３
１） ０．０６０．８２（１４）ｐＡＲ−ＩＳＶＲＯ
，０５０，０５（１，０） ０．１２０．１０（０，８
）注 ａ、 ３μｇの表記プラスミドＤＮＡと３μｇの非特異
的コンペティタープラスミドｐＵ３Ｒ−Ｉ Ｂ又はプラ
スミドｐ ｔｌ ３− ａ ｒ ｔとを細胞にトランス
フェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＣ
ＡＴアッセイを行なった。絶対ＣＡＴ活性をａｒｔの非
存在下にトランスフェクションプラスミドｐＣ−５５（
実験１）又はｐＵ３Ｒ−■（実験２）後に得られた値に
標準化した。
ｔ−実験プラスミドｐＨ３−ａｒｔｂ−＋ □ｃ−＋
０’１ ｐＣ−５５１，０００，８２（０，８）
ｐＣ−５５／■２４７９ １．０００．８８（０
，９）ｐＣ−５５／Ｉ［［１４７００，７１０，７９（
１，６）２ ｐＵ３Ｒ−ＩＩＩ １
．００１．３０（１，３） １．００１．４０（１，４
）ｐＡＲ−ＩＳＶ Ｏ，０２０，８２（３
１） ０．０６０．８２（１４）ｐＡＲ−ＩＳＶＲＯ
，０５０，０５（１，０） ０．１２０．１０（０，８
）注 ａ、 ３μｇの表記プラスミドＤＮＡと３μｇの非特異
的コンペティタープラスミドｐＵ３Ｒ−Ｉ Ｂ又はプラ
スミドｐ ｔｌ ３− ａ ｒ ｔとを細胞にトランス
フェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＣ
ＡＴアッセイを行なった。絶対ＣＡＴ活性をａｒｔの非
存在下にトランスフェクションプラスミドｐＣ−５５（
実験１）又はｐＵ３Ｒ−■（実験２）後に得られた値に
標準化した。
ｂ、括弧内に示す誘導値はａｒｔの存在下に得られた相
対ＣＡＴ活性をａｒｔの非存在下に得られた相対ＣＡＴ
活性で除算して得られた値である。
対ＣＡＴ活性をａｒｔの非存在下に得られた相対ＣＡＴ
活性で除算して得られた値である。
Ｇａ ｅｎｖ’ −−Ｉ Ｃへ
Ｒ１＋＋１Ｖ−Ｉ ＬＴＲとＣＡＴ遺伝子との間に挿入
されたこれらの遺伝子の５′末端部分を含むプラスミド
を構築した（第１０図）。プラスミドｐＬｅｎｖ−３１
４及びｐＬｅｎｖ−１００及びプラスミドｐ１４ａｇ−
３２１をＨｅＬａ−ｔａｔＩ［Ｉ及びＣｌｌ０−Ｌａｔ
Ｉ［［＋！！Ｉ胞にトランスフェクトすると高レベルの
ＣＡＴ酵素活性が得られた。
Ｒ１＋＋１Ｖ−Ｉ ＬＴＲとＣＡＴ遺伝子との間に挿入
されたこれらの遺伝子の５′末端部分を含むプラスミド
を構築した（第１０図）。プラスミドｐＬｅｎｖ−３１
４及びｐＬｅｎｖ−１００及びプラスミドｐ１４ａｇ−
３２１をＨｅＬａ−ｔａｔＩ［Ｉ及びＣｌｌ０−Ｌａｔ
Ｉ［［＋！！Ｉ胞にトランスフェクトすると高レベルの
ＣＡＴ酵素活性が得られた。
ｇａｇ及びｅｎＶ３ｉ！を調子リーダー領域配列を含む
ハイブリッドプラスミドの概略図及び活性を第１０図に
示す。ｅｎｖ遺伝子（＾）又はｇａｇ遺伝子（Ｂ）のリ
ーダー配列の表示部分’！−１＋１Ｖ−１配列（ヌクレ
オチド−１６７〜＋８０）に対して３°側及びＣＡＴ遺
伝子に対して５°側にクローニングした。各プラスミド
の名称に使用した数字は各ハイブリッド構築物中に存在
するＨ［Ｖ−１塩基対の数を示す、各プラスミドのＣＡ
Ｔ活性を、プラスミドｐＵ３Ｒ−１［［で得られた値（
十＋＋）に標準化した。フレーム（ｆｒａｍｅ）はＨＩ
Ｖ−１配列がＣＡＴ遺伝子の同じ翻訳読取枠（ｉｎ）に
あるか異なる翻訳読取枠（ｏｕｔ）にあるかを示す。開
始コドンは・、終結コドンは■で示される。
ハイブリッドプラスミドの概略図及び活性を第１０図に
示す。ｅｎｖ遺伝子（＾）又はｇａｇ遺伝子（Ｂ）のリ
ーダー配列の表示部分’！−１＋１Ｖ−１配列（ヌクレ
オチド−１６７〜＋８０）に対して３°側及びＣＡＴ遺
伝子に対して５°側にクローニングした。各プラスミド
の名称に使用した数字は各ハイブリッド構築物中に存在
するＨ［Ｖ−１塩基対の数を示す、各プラスミドのＣＡ
Ｔ活性を、プラスミドｐＵ３Ｒ−１［［で得られた値（
十＋＋）に標準化した。フレーム（ｆｒａｍｅ）はＨＩ
Ｖ−１配列がＣＡＴ遺伝子の同じ翻訳読取枠（ｉｎ）に
あるか異なる翻訳読取枠（ｏｕｔ）にあるかを示す。開
始コドンは・、終結コドンは■で示される。
これらのプラスミドとプラスミドｐ［ｌ３−ａｒｔとの
コトランスフェクションによってＣＡＴ酵素活性のレベ
ルは増加しなかった。プラスミドｒ’Ｌｅｎｖ−３１７
又はｐＬｇａｇ−４０４をトランスフエフｌ−した細胞
中でＣＡＴ活性は全く検出されながった。これらの２つ
のプラスミドのｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の読取枠はＣＡ
Ｔ遺伝子と同じである。プラスミドｐＬｅｎｖ−３１４
及びｐＬｅｎｖ−１０ｏ中のｃｎｖＫｉ伝子＾Ｕ封子読
取枠とプラスミドｐＬｇａｇ−３２１中のｇａｇ遺伝子
封子Ｇの読取枠とはＣＡＴ遺伝子の読取枠とは異なって
いた。従って、プラスミドｐＬｅｎｖ−３１７及びｐＬ
Ｈａｇ−４０４がＣＡＴ遺伝子発現を支配できない理由
は、ＣＡＴ遺伝子のタンパク質合成の開始が５°に位置
する枠内（ｉｎｆｒａｍｅ）開始コドンによって妨害さ
れるためであると推測できる。
コトランスフェクションによってＣＡＴ酵素活性のレベ
ルは増加しなかった。プラスミドｒ’Ｌｅｎｖ−３１７
又はｐＬｇａｇ−４０４をトランスフエフｌ−した細胞
中でＣＡＴ活性は全く検出されながった。これらの２つ
のプラスミドのｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子の読取枠はＣＡ
Ｔ遺伝子と同じである。プラスミドｐＬｅｎｖ−３１４
及びｐＬｅｎｖ−１０ｏ中のｃｎｖＫｉ伝子＾Ｕ封子読
取枠とプラスミドｐＬｇａｇ−３２１中のｇａｇ遺伝子
封子Ｇの読取枠とはＣＡＴ遺伝子の読取枠とは異なって
いた。従って、プラスミドｐＬｅｎｖ−３１７及びｐＬ
Ｈａｇ−４０４がＣＡＴ遺伝子発現を支配できない理由
は、ＣＡＴ遺伝子のタンパク質合成の開始が５°に位置
する枠内（ｉｎｆｒａｍｅ）開始コドンによって妨害さ
れるためであると推測できる。
これらの結果は、翻訳読取枠が下流遺伝子の読取枠に等
しいときに上流へ〇Ｇコドンが下流の開始を最も効果的
に妨害するという別の報告と一致する。
しいときに上流へ〇Ｇコドンが下流の開始を最も効果的
に妨害するという別の報告と一致する。
第１図は旧Ｖｌ ｍＲＮ＾を産生するために使用され
たスプライシング過程の概略図、第２図は遺伝子内ＨＩ
Ｖ−１配列で同定されたｃｉｓ作用抑制配列の場所（八
）及びＣＡＲ，活性に必要なヌクレオチド配列（Ｂ）の
説明図、第３図はハイブリッド旧Ｖ／ＣＡＴ構築物の構
造（＾）及びハイブリッドＨＩＶ−ヒト成長ホルモン（
ｈｃ：Ｉｆ／ＨＩＶ）構築物ノ構造（Ｂｏ）説明図、第
４図はプラスミドｐＨ３−ａｒｔの構造及びｐＨ３−ａ
ｒｔ中に存在する配列（＾）及びプラスミドｐＨ３−ａ
ｒｔの活性（Ｂ）を示す説明図、第５図は種々のハイブ
リッド−ＨＩＶ／ＣＡＴｆ′Ｒ築物によって支配される
Ｊｕｒｋａｔ ｔａｔＩ［［中のＣＡＴ発現に対するａ
ｒｔ３Ｊｌ伝子産物の影響を示す説明図、第６図はプラ
スミドｐＩ［ｌＡＲ中のＨＩＶ−Ｉ配列内部の欠失の相
対位置（Ａ）及び３’ ＬＴＲが欠失しＳ Ｖ ４０
’Ｆ刀期領域に由来のＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョン配
列を含むｐｉｌｌＡＲ中に存在するＨＩＶ川配列向配列
内部の相対位置（Ｂ）を示す概略説明図、第７図はａｒ
ｔ遺伝子産物の存在下又は非存在下の欠失突然変異体の
ＣＡＴ活性を示す説明図、第８図は１ＩＩＶｉヌクレオ
チド配列５３３２−７７６０内部に形成された５′欠失
の概略説明図、第９図はエンハンサーテスＩ・プラスミ
ドの説明図、第１０図はｇａｇ及びＱｎＶ遺伝子のリー
ダー領域配列を含むハイブリッドプラスミドの活性を示
す概略説明図、第１１図はＣｌｌ５及びＣＡＲ配列のコ
ントロール下の遺伝子のＣＡＲ領域と２０ｋＤのａｒｔ
Ｉｔ伝子産物封子相互作用の説明図、第１２図はａｒｔ
／ｃｉｓ調節コントロールの推定メカニズムの説明図、
第１３図ハ１ｌＩＶ−Ｉゲ／ム（７）概略説明図、第１
４図はＩＩ Ｉ Ｖ −Ｉゲノム中のＣＲＳ、ＣＡＲ及
びΔＲＥ領域及びｍＲＮ＾を示す説明図である。 代理人弁理士 船 山 武 −一 １寸 二 Ｃ す 菖 し＼− 禽 ａ−＋ −÷ Ｂ −＋ −→ ・ −十−＋ ト − 十−十 ）Ｃ− く ロ
たスプライシング過程の概略図、第２図は遺伝子内ＨＩ
Ｖ−１配列で同定されたｃｉｓ作用抑制配列の場所（八
）及びＣＡＲ，活性に必要なヌクレオチド配列（Ｂ）の
説明図、第３図はハイブリッド旧Ｖ／ＣＡＴ構築物の構
造（＾）及びハイブリッドＨＩＶ−ヒト成長ホルモン（
ｈｃ：Ｉｆ／ＨＩＶ）構築物ノ構造（Ｂｏ）説明図、第
４図はプラスミドｐＨ３−ａｒｔの構造及びｐＨ３−ａ
ｒｔ中に存在する配列（＾）及びプラスミドｐＨ３−ａ
ｒｔの活性（Ｂ）を示す説明図、第５図は種々のハイブ
リッド−ＨＩＶ／ＣＡＴｆ′Ｒ築物によって支配される
Ｊｕｒｋａｔ ｔａｔＩ［［中のＣＡＴ発現に対するａ
ｒｔ３Ｊｌ伝子産物の影響を示す説明図、第６図はプラ
スミドｐＩ［ｌＡＲ中のＨＩＶ−Ｉ配列内部の欠失の相
対位置（Ａ）及び３’ ＬＴＲが欠失しＳ Ｖ ４０
’Ｆ刀期領域に由来のＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョン配
列を含むｐｉｌｌＡＲ中に存在するＨＩＶ川配列向配列
内部の相対位置（Ｂ）を示す概略説明図、第７図はａｒ
ｔ遺伝子産物の存在下又は非存在下の欠失突然変異体の
ＣＡＴ活性を示す説明図、第８図は１ＩＩＶｉヌクレオ
チド配列５３３２−７７６０内部に形成された５′欠失
の概略説明図、第９図はエンハンサーテスＩ・プラスミ
ドの説明図、第１０図はｇａｇ及びＱｎＶ遺伝子のリー
ダー領域配列を含むハイブリッドプラスミドの活性を示
す概略説明図、第１１図はＣｌｌ５及びＣＡＲ配列のコ
ントロール下の遺伝子のＣＡＲ領域と２０ｋＤのａｒｔ
Ｉｔ伝子産物封子相互作用の説明図、第１２図はａｒｔ
／ｃｉｓ調節コントロールの推定メカニズムの説明図、
第１３図ハ１ｌＩＶ−Ｉゲ／ム（７）概略説明図、第１
４図はＩＩ Ｉ Ｖ −Ｉゲノム中のＣＲＳ、ＣＡＲ及
びΔＲＥ領域及びｍＲＮ＾を示す説明図である。 代理人弁理士 船 山 武 −一 １寸 二 Ｃ す 菖 し＼− 禽 ａ−＋ −÷ Ｂ −＋ −→ ・ −十−＋ ト − 十−十 ）Ｃ− く ロ
Claims (26)
- （１）ＨＩＶ− I 、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−IV及びＳ
ＴＬＶ−３から成るグループのゲノムの３′部分のヌク
レオチドに対応するヌクレオチドを、或る遺伝子の下流
で該遺伝子の非翻訳メッセージ中に挿入されたときに該
遺伝子にｃｉｓ作用抑制効果を与えるに十分な数で含む
ことを特徴とする￥ｃｉｓ￥作用調節配列。 - （２）ＨＩＶ− I ゲノムの領域６３７６−６７２５内
の十分な数のヌクレオチドに対応することを特徴とする
請求項１記載のｃｉｓ作用調節配列。 - （３）ＨＩＶ− I ゲノムの領域７２８３−７３２５内
の十分な数のヌクレオチドに対応することを特徴とする
請求項１記載のｃｉｓ作用調節配列。 - （４）ＨＩＶ− I ゲノムの領域５８９３−６５３８内
の十分な数のヌクレオチドに対応することを特徴とする
請求項１記載のｃｉｓ作用調節配列。 - （５）ＨＩＶ− I ゲノムの領域８２０４−８４９７内
の十分な数のヌクレオチドに対応することを特徴とする
請求項１記載のｃｉｓ作用調節配列。 - （６）ＨＩＶ− I 、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−IV及びＳ
ＴＬＶ−３から成るグループのゲノムのヌクレオチドを
、有効量のａｒｔ遺伝子産物の存在下に或る遺伝子に対
するｃｉｓ作用抑制効果に拮抗するに十分な数で含むこ
とを特徴とするｃｉｓ作用抗抑制配列。 - （７）ＨＩＶ− I ゲノムの領域６９６９−７１６３内
の十分な数のヌクレオチドに対応することを特徴とする
請求項６記載のｃｉｓ作用抗抑制配列。 - （８）ＨＩＶ− I ゲノムの領域７２８３−７３２５内
の十分な数のヌクレオチドに対応することを特徴とする
請求項６記載のｃｉｓ作用抗抑制配列。 - （９）（ａ）所望遺伝子を含み、その下流で非翻訳メッ
セージ中に、 （ｂ）ＨＩＶ− I 、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−IV及びＳ
ＴＬＶ−３から成るグループのゲノムの３′部分に対応
するヌクレオチドを、該所望遺伝子にｃｉｓ作用抑制効
果を与えるに十分な数で含むｃｉｓ作用抑制配列（ＣＲ
Ｓ）と、 （ｃ）ＨＩＶ− I 、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−IV及びＳ
ＴＬＶ−３から成るグループのゲノムの３′領域に対応
するヌクレオチドを、十分な量のａｒｔ遺伝子産物の存
在下にＣＲＳのｃｉｓ作用抑制効果に拮抗するに十分な
数で含むｃｉｓ作用抗抑制配列（ＣＡＲ）とを含むこと
を特徴とするベクター。 - （１０）ＣＲＳ及びＣＡＲ配列がＨＩＶ− I ゲノムに
対応することを特徴とする請求項９記載のベクター。 - （１１）ＣＲＳ及びＣＡＲ配列がＨＩＶ−２ゲノムに対
応することを特徴とする請求項９記載のベクター。 - （１２）ＣＲＳ及びＣＡＲ配列がＨＴＬＶ−IVゲノムに
対応することを特徴とする請求項９記載のベクター。 - （１３）ＣＲＳ及びＣＡＲ配列がＳＴＬＶ−３ゲノムに
対応することを特徴とする請求項９記載のベクター。 - （１４）所望遺伝子に対して３′側のＨＩＶ− I ＬＴ
ＲとＣＲＳ及びＣＡＲ配列に対して５′側のＨＩＶ−
I ＬＴＲとを含むことを特徴とする請求項１０記載のベ
クター。 - （１５）所望遺伝子に対して３′側のＨＩＶ−２ＬＴＲ
とＣＲＳ及びＣＡＲ配列に対して５′側のＨＩＶ−２Ｌ
ＴＲとを含むことを特徴とする請求項１０記載のベクタ
ー。 - （１６）所望遺伝子に対して３′側のＨＴＬＶ−IVＬＴ
ＲとＣＲＳ及びＣＡＲ配列に対して５′側のＨＴＬＶ−
IVＬＴＲとを含むことを特徴とする請求項１０記載のベ
クター。 - （１７）所望遺伝子に対して３′側のＳＴＬＶ−３ＬＴ
ＲとＣＲＳ及びＣＡＲ配列に対して５′側のＳＴＬＶ−
３ＬＴＲとを含むことを特徴とする請求項１０記載のベ
クター。 - （１８）所望遺伝子が外来性遺伝子であることを特徴と
する請求項９記載のベクター。 - （１９）（ａ）予め選択した細胞系に請求項９記載のの
ベクターをトランスフェクトし、（ｂ）ＣＲＳ配列を抑
制して所望の遺伝子産物を発現させるべくＣＡＲ配列を
活性化するに十分な量のａｒｔ遺伝子産物とＣＡＲ配列
とを所定の時間に接触させることを特徴とする所望遺伝
子産物の産生をコントロールする方法。 - （２０）予め選択された細胞系がウイルスゲノムに対応
するｔａｔ遺伝子を含むｔａｔを細胞系であり、ベクタ
ーが更に、該ｔａｔ遺伝子に対応するウイルスゲノム由
来のＬＴＲセグメントを含むことを特徴とする請求項１
９記載の方法。 - （２１）操作可能なａｒｔ遺伝子を含むベクターを使用
することによってａｒｔ遺伝子産物をトランスフェクト
細胞と接触させることを特徴とする請求項２０記載の方
法。 - （２２）ａｒｔ遺伝子産物が二次因子のコントロール下
にあり、該因子は、ＣＡＲを活性化するに十分な量のａ
ｒｔ遺伝子を発現すべく所定の時間に活性化されること
を特徴とする請求項１９記載の方法。 - （２３）ａｒｔ遺伝子産物の非存在下に所望遺伝子に対
するｃｉｓ作用抑制効果を与えるに十分な数のＨＩＶ−
I ゲノムの領域６３７６−７７６０に対応するヌクレ
オチドを含むセグメントの上流に該所望遺伝子を含み、
前記ｃｉｓ作用の効果がａｒｔ遺伝子産物の存在下に拮
抗されることを特徴とするベクター。 - （２４）（ａ）予め選択された細胞系に請求項２３記載
のベクターをトランスフェクトし、 （ｂ）ＣＲＳを抑制して所望遺伝子産物を発現させるべ
くＣＡＲ配列を活性化するに十分な量のａｒｔ遺伝子産
物とＣＡＲ配列とを所定の時間に接触させることを特徴
とする所望の遺伝子産物の産生をコントロールする方法
。 - （２５）ベクターが所望遺伝子の３′側にＨＩＶ− I
ＬＴＲを含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。 - （２６）予め選択された細胞系がｔａｔIII細胞系であ
ることを特徴とする請求項２５記載の方法。
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