JP4272264B2 - 診断予防及び治療的使用のための、特に多発性硬化症及び/又は慢性関節リウマチに関連した、レトロウイルス核材料及びヌクレオチドフラグメント - Google Patents
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Description
多数の研究が該疾患のウイルス病因論のための仮説を裏付けているが、しかし、E. NorrbyとR.T. Jonsonによって多年にわたり実施されているMSについて試験したウイルスのレビューで、試験した原因となる作因として提供されている周知の試験ウイルスはない。
最近、周知のヒトレトロウイルスとは異なるレトロウイルスが、MSに罹った患者から分離された。その著者は、そのレトロウイルスがインビトロで伝染できること、MSに罹った患者がこのレトロウイルスによって軟髄膜細胞の感染に関連したタンパク質を認識することができる抗体を誘導すること、および後者の発現が幾つかのヘルペスウイルスの仲介-早期遺伝子によって非常に大きく刺激することができることを示すことができた。
これらの結果の全ては、少なくとも1つの未知のレトロウイルスの、又はH. Perronによって公表された方法によって検出可能であり且つ“LM7型RT”活性と称される、逆転写酵素(RT)活性を有するウイルスのMSにおける役割に賛成論を唱える。
本出願人による研究は、その内容が本記載中に参考により取り込まれる、文献WO-A-93 20188中に記載された通りの培養法によって、MSに罹った2名の異なる患者から得られた天然単離体に感染した2つの連続する細胞系を得ることを可能にしている。LM7PCとPLI−2と称す、ヒト脈絡叢の細胞から得られた、これら2つの系は、ブダペスト条約の規定に従い、ナンバー92 072201と93 010817の下に、それぞれ1992年7月22日と1993年1月8日付でE.C.A.C.C.に寄託した。さらに、LM7型RT活性を持つウイルス単離体もまた、“株”の全般的名称の下にE.C.A.C.C.に寄託した。POL−2と称す、PLI−2系に宿されたその“株”と単離体は、No.V92072202の下に1992年7月22日付で寄託した。MS7PGと称す、LM7PC系に宿されたその“株”と単離体は、No.V93010816の下に1993年1月8日付で寄託した。
生物学的及び形態学的な基準によって特徴付けられた上述した培養物と単離体を用いる努力は、これらの培養物中で生産されるウイルス粒子に関連した遺伝的材料を特徴付けした。
既に特徴付けしたゲノムの割合は、ウイルス感染及び/又は発現と関連したエピトープに対して向けられた免疫応答を検出するために、そのウイルスゲノムの核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を用いた、該ウイルスゲノムのための分子検出試験及び免疫血清学的試験を開発するために用いられた。
これらの道具は、MSと、さらに引用される特許において同定された配列の発現との間の関連を裏付けることを既に可能にしている。しかしながら、本出願人によって発見された該ウイルス系は、複合レトロウイルス系に関している。実際、MSに罹った患者の細胞の異なる培養物によって作製された細胞外ウイルス粒子中に被包されることが見出されるその配列は、感染ウイルス粒子を生産する“野生型”レトロウイルスゲノムに関連するがしかし異なるレトロウイルスゲノムの共被包があることが明確に示される。この現象は、複製レトロウイルスと、同じ科に、又は一様に異種のレトロウイルスに属する内因性レトロウイルスとの間で観測される。内因性レトロウイルスの概念は、MSRV−1の場合、MSRV−1に相同な配列を含む内因性レトロウイルスの配列が通常のヒトDNA中に存在することが観測されているために、我々の発見の状況において非常に重要である。それらのゲノムの全部又は一部を通してMSRV−1に関連した内因性レトロウイルス要素(ERV)の存在は、ヒト細胞中のMSRV−1レトロウイルスの発現が関連した内因性配列と相互作用できる事実を説明する。これらの相互作用は、病原性及び/又は感染性の内因性レトロウイルス(例えばネズミ白血病ウイルスの幾つかのエコトロピック株)の場合、宿主動物のゲノムにおいて、核酸配列がERVsの形態で部分的に又は完全に見出され得る外因性レトロウイルスの場合(例えば、乳を経て伝染するマウス乳房腫瘍外因性ウイルス)に見出される。これらの相互作用は、(i)複製レトロウイルスによるERVsの相互活性化又は共活性化、(ii)時折伝播し得る及び時折固有の病原性を持つ複製株の発現によって生産されたレトロウイルス粒子への、匹敵し得る被包配列を単に持っているERVsの関連したRNAの、又はERVsの−又は一様な細胞のRNAsの“非正統的”被包、及び(iii)特に時折伝播し得る及び時折固有の病原性を持つハイブリッドゲノムの形成に至る逆転写相における、共被包化ゲノム間の相対的に高い組換え、から主に構成される。
かくして、(i)各種のMSRV−1−関連配列は精製したウイルス粒子中に見出される;(ii)MSRV−1レトロウイルスゲノムの各種領域の分子分析は、共被包化した、感染及び/又はMSRV−1の感染及び/又は発現によって生成される組換え配列を系統的に分析することによって実行されるであろう;従って、幾つかのクローンは、レトロウイルス複製と鋳型及び/又は逆転写酵素によりもたらされた転写エラーによって生産された欠陥のある配列の部分を有し得る;(iii)同じレトロウイルスゲノム領域に関連した配列の群は、発現したクローンの中の一定の領域を同定することによって及び一部によってのみ、又は発現した及びこれらの条件下のクローンの一つのみが生産され得る抗原の及び/又は病原性のポリペプチドの生産に応答可能な読み枠の同定によって最適化され得る全般にわたる診断的検出のための裏付けであり、与えられた遺伝子の一つの領域中の発現したクローンの系統的分析は、この領域中のMSRV−1遺伝子の変化及び/又は組換えの頻度を評価すること、及び適用の、特に診断的な適用のために最適な配列を定義することを可能にする;(iv)MSRV−1のようなレトロウイルスによってもたらされた病因は、その発現の及び結果として生成したタンパク質又はポリペプチドの直接的な効果となるであろうが、しかしまた、関連した又は相同のゲノム及び結果として生成されたタンパク質又はペプチドの活性化、被包、組換えの効果となもなるだろう;かくして、MSRV−1による発現及び/又は感染に関連したこれらのゲノムは、このウイルスの潜在的病原性の必須の部分であり、従って診断的検出サポート及び特別な治療の標的を構成する。同様に、MSRV−2又は特許出願公開FR-2,716,198中に記載されたグリオトキシック因子のような、当該の病原性に応答可能なこれら相互作用に関連した、又はそのための共因子であるいずれかの作用因子は、特にMSのための、また同じ作用因子に関連した他の疾患のための治療的診断、予後、モニタリング及び/又は統合した治療の全般にわたり及び非常に有効な方策の発展において参加することができる。
この状況において、類似の発見が、別な自己免疫疾患、No.95 02960の下に出願されたフランス特許出願中に記載されている、慢性関節リウマチ(RA)においてなされている。この発見は、MSについて本発明者による研究において使用されたそれに類似の方法論的アプローチを適用することによって、MS中のMSRV−1について記載された配列を共有し且つまたMSにおいても記載されるMSRV−2−関連配列に共存するRAにおいて発現したレトロウイルスを同定することを可能にしていることを示した。MSRV−1に関して、MSとRA中で検出した共通の配列は、pol及びgag遺伝子に関連する。現在の知識に基づいて、これら2つの疾患において発現したMSRV−1株と、記載されたgag及びpol配列を結合することができる。
本特許出願は、フランス特許出願:
− No.2,689,519の下に公開された、03.04.1992のNo.92/04322;
− No.2,689,521の下に公開された、03.11.1992のNo.92/13447;
− No.2,689,520の下に公開された、03.11.1992のNo.92/13443;
− No.2,715,936の下に公開された、04.02.1994のNo.94/01529;
− No.2,715,939の下に公開された、04.02.1994のNo.94/01531;
− No.2,715,936の下に公開された、04.02.1994のNo.94/01530;
− No.2,715,937の下に公開された、04.02.1994のNo.94/01532;
− No.2,727,428の下に公開された、24.11.1994のNo.94/14322;
− No.2,728,585の下に公開された、23.12.1994のNo.94/15810;
及び
− 特許出願WO 97/06260
によって既に保護されるそれらとの関係において補充する、各種の結果をその目的として有する。
本発明は、まず第1に、各種の手法:
− (i)配列番号:112,配列番号:114,配列番号:117,配列番号:120,配列番号:124,配列番号:130,配列番号:141及び配列番号:142の配列;(ii)配列(i)に相補の配列;及び(iii)(i)又は(ii)に均等な配列、特に100の連続したモノマーのシリーズ毎に(i)又は(ii)のそれぞれに少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%の相同性を有する配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む;
− 配列番号:113,配列番号:115,配列番号:118,配列番号:121,配列番号:135及び配列番号:137からなる群から選択されるペプチド配列と少なくとも30アミノ酸の連続したシリーズ毎に、少なくとも50%、好ましくは70%の相同性を有するポリペプチドをコードする;
− そのpol遺伝子が、配列番号:112,配列番号:124及びそれらの相補配列からなる群から選択される配列と同一か又は均等なヌクレオチド配列を含む:
− そのpol遺伝子の5’末端が、配列番号:130のヌクレオチド1419で開始する;
− そのpol遺伝子が、配列番号:113のペプチド配列と少なくとも30アミノ酸の連続したシリーズ毎に、少なくとも50%、好ましくは70%の相同性を有するポリペプチドをコードする;
− そのgag遺伝子の3’末端が、配列番号:130のヌクレオチド1418で終わる;
− そのenv遺伝子が、配列番号:117及びその相補配列からなる群から選択される配列と同一か又は均等なヌクレオチド配列を含む:
− そのenv遺伝子が、配列番号:117のヌクレオチド1で始まり、配列番号:114のヌクレオチド233ヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を含む;
− そのenv遺伝子が、配列番号:118の配列と少なくとも30アミノ酸の連続したシリーズ毎に、少なくとも50%、好ましくは70%の相同性を有するポリペプチドをコードする;
− その3’LTRのU3R領域が、配列番号:114のヌクレオチド617で終わるヌクレオチド配列を含む;
− その5’LTRのRU5領域が配列番号:120のヌクレオチド755で始まり、配列番号:141又は配列番号:142のヌクレオチド337で終わるヌクレオチド配列を含む;
− レトロウイルス核材料が、配列番号:120のヌクレオチド755で始まり、配列番号:114のヌクレオチド617で終わる配列を含む;
− 上記定義した通りのレトロウイルス核材料が、特に多発性硬化症又は慢性関節リウマチのような少なくとも1の自己免疫疾患と結び付けられる、
において理解され得る又は特徴付けされ得る、単離した又は精製した状態で、レトロウイルス材料からなってよい核材料に関する。
本発明はまた、以下の定義:
− (i)配列番号:112,配列番号:114,配列番号:117,配列番号:120,配列番号:124,配列番号:130,配列番号:141及び配列番号:142の配列;(ii)配列(i)に相補の配列;及び(iii)(i)又は(ii)に均等な配列、特に100の連続したモノマーのシリーズ毎に(i)又は(ii)のそれぞれに少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%の相同性を有する配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む又はからなる;
− 配列番号:113,配列番号:115,配列番号:118,配列番号:121,配列番号:135及び配列番号:137からなる群から選択されるペプチド配列と少なくとも30アミノ酸の連続したシリーズ毎に、少なくとも50%、好ましくは70%の相同性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む又はからなる;
の少なくとも1つに一致するヌクレオチドフラグメントにも関係する。
本発明の他の主題は以下のものである:
− 上記定義した及び上記レトロウイルスのゲノムに属するいずれかのフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができる多発性硬化症又は慢性関節リウマチと関連したレトロウイルスの検出のための核プローブ;それは有利には10から100ヌクレオチドまで、好ましくは10から30ヌクレオチドまでを持つ;
− 上記フラグメントの少なくとも上記一部と同一又は均等なヌクレオチド配列、特に上記フラグメントの一部と、10の連続したモノマーのシリーズ毎に、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、多発性硬化症又は慢性関節リウマチと関連したレトロウイルスのRNAの又はDNAの重合化によって増幅するためのプライマー;好ましくは本発明のプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号:116,配列番号:119,配列番号:122,配列番号:123,配列番号:126,配列番号:127,配列番号:128,配列番号:129,配列番号:132,及び配列番号:133から選択される;
− 該核材料のゲノムのフラグメント又は上記定義したフラグメントを含むRNA又はDNA、及び特に複製及び/又は発現ベクター;
− 上記定義したヌクレオチドフラグメントに属するいずれかのオープンリーディングフレームによってコードされたペプチド、特にポリペプチド、例えばMSRV−1によって感染した患者の血清によって認識した抗原決定基、及び/又は再活性化されているMSRV−1を形成する又は含むオリゴペプチド;優先的なペプチドは、配列番号:113,配列番号:115,配列番号:118,配列番号:121,配列番号:135及び配列番号:137から選択した配列と部分的に又は完全に同一の、又は均等な配列を含む;
− 診断の、予後の又は治療用の組成物、特に上記定義した核フラグメントを含む、多発性硬化症及び/又は慢性関節リウマチに関連した少なくとも1のレトロウイルスの発現を防ぐための;
− 上記定義したヌクレオチドフラグメントを含む組成物と、上記レトロウイルスに属すると仮定した又はそれから得られたRNA及び/又はDNA、又はそれの相補RNA及び/又はDNAとを接触させることからなる工程を含む、生物学的サンプル中の、多発性硬化症及び/又は慢性関節リウマチに関連したレトロウイルスを検出するための方法。
本発明の詳細の前に、明細書と請求の範囲において用いた各種の用語を現に定義する:
− 株又は単離は、培養物又は生存宿主に宿される、病原性及び/又は抗原性効力を生じる、例えばウイルス及び/又は細菌及び/又は寄生虫を含む、いずれかの感染性及び/又は病原性生物学的フラクションを意味すると解される;例えば、先の定義に従うウイルス株は、共感染性作用因子、例えば病原性原生生物を含み得る、
− 本明細書中で用いた用語“MSRV”は、MSとの関連として、いずれかの病原性及び/又は感染性作用因子、特に上記ウイルス種の弱毒株、又は感染不完全化粒子又はこの種から得られた、共被包化ゲノム又はMSRV−1ゲノムの一部と再結合した代替的なゲノムを含む粒子を定義する。ウイルス及び特にRNAを含むウイルスは、特に、均等の概念を定義するために以下に考慮されるであろう、相対的に高率の自然発生的な変異に引き続いて可変性を示す、
− ヒトウイルスは、生存するヒトによって感染され又は宿されることができるウイルスを意味すると解される、
− 本発明において実際に遭遇し得る自然の又は誘導した変化及び/又は組換えの全てを与える、その目的、上記定義された及び請求の範囲において、以下に定義される各種の生物学的材料の均等物又は誘導体、特に相同なヌクレオチド又はペプチド配列を含むことによって発現されている、
− 本発明に従うウイルスの又は病原性及び/又は感染性作用因子の変異体は、上記ウイルスの及び/又は上記病原性及び/又は感染性作用因子の少なくとも1つの一致する抗原に対して向けられる少なくとも1つの抗体によって認識される少なくとも1つの抗原、及び/又はいずれかの部分が少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブによって検出されるゲノム、及び/又は当業者に良く知られたハイブリダイゼーション条件下で、上記ウイルス及び/又は病原性及び/又は感染性作用因子に特異的な少なくとも1つのヌクレオチド増幅プライマーを含む、
− 本発明に従い、ヌクレオチドフラグメント又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、予め定義された条件下で何れかの他のヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズすることができる天然核酸の配列情報によって特徴付けされるモノマーの伸張又はバイオポリマーであり、それは異なる化学構造のモノマーを含むような伸張が及び天然核酸分子から及び/又は遺伝的組換えによって及び/又は化学合成によって得ることが可能であり;ヌクレオチドフラグメントは本発明によって意図されたMSRV−1ウイルスの遺伝フラグメント、特に後者の遺伝子、例えば上記ウイルスの場合pol又はenvと同一で良い;
− かくして、モノマーは、構成成分が糖、リン酸基及び窒素塩基である天然核酸ヌクレオチドとして良い;RNAにおいて、糖はリボースである;DNAにおいて、糖は2−デオキシリボースである;DNA又はRNAが含まれるかどうかに基づいて、窒素塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンから選択され;又はヌクレオチドは、3つの構成成分の少なくとも1つにおいて修飾され得る;例えばその修飾は、イノシン、5−メチル−デオキシシチジン、5−ジメチルアミノデオキシウリジン、2.6-ジアミノプリン、5−ブロモデオキシウリジン及びハイブリダイゼーションを促進する何れかの他の修正塩基のような修正塩基を生成する、塩基のレベルで生じる;糖のレベルで、その修飾は、ポリアミドと少なくとも1つのデオキシリボースの置換を含んで良く、且つリン酸基のレベルで、その修飾はエステル、特にジホスファートの、アルキルとアリールホスホナートの、及びホスホロチオアートのエステルから選択されるエステルとの置換を含む、
− “配列情報”は、天然核酸のためのそれと同じ品質の機能的な情報の参照方向、構成又はその他において化学的本質と順序である、モノマーの何れかの連続した順序を意味すると解される、
− ハイブリダイゼーションは、適切な操作条件下で、複合体を形成するためにアニールされる十分相補の配列、特に二重又は三重構造、好ましくはヘリカル形態を有する、2つのヌクレオチド配列の間での処理を意味すると解される、
− プローブは、少なくとも6つの、有利には10から100までの、好ましくは10から30までのモノマーを含む、且つ定義した条件下でハイブリダイゼーション特異性を持っている、化学的ルートによって合成された又はより長いヌクレオチドフラグメントの消化又は酵素的切断によって得られたヌクレオチドフラグメントを含む;好ましくは、10より小さいモノマーを持っているプローブは単独で使用されないが、しかし長さにおいて又はその他で等しく短い他のプローブの存在中で使用される;ある種の特異的条件下で、サイズにおいて100モノマーよりも大きいプローブを使用することが有用となり得る;プローブは特に診断の目的のために使用して良く、且つそれは例えば、捕捉用及び/又は検出用プローブとして良い、
− 該捕捉用プローブは、何れかの適当な手段によって、即ち直接又は間接的に、例えば共有結合又は能動的吸着によって固体支持体上に固定化して良い、
− 検出用プローブは、放射性同位体、酵素、特にペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼから選択される、及び色素形成性、蛍光性又は化学発光性の基質、色素形成性化合物、ヌクレオチド塩基の類似物、及びビオチンから特に選択される標識によって標識して良い、
− 本発明の診断的な目的のために用いるプローブは、全ての周知のハイブリダイゼーション技術において、且つ特に“ドット-ブロット”法、“サザーンブロット”法、“サザーンブロット”法と同じ技術であるが標的としてRNAを用いる“ノーザンブロット”法、サンドウィッチ法と称される技術において用いて良い;有利には、サンドウィッチ法が、特異的は捕捉プローブ及び/又は特異的な検出プローブを含む、本発明において使用され、それは捕捉用プローブと検出用プローブが、少なくとも一部が異なったヌクレオチド配列を有する必要があると理解される、
− 本発明に従う何れかのプローブは、複製をブロックするため、特に翻訳及び/又は転写、現象を及び/又は上記DNA及び/又はRNAを分解するため、RNA及び/又はDNAとインビボで又はインビトロでハイブリダイゼーションされ得る、
− プライマーは、酵素的重合化を開始するための、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)のような増幅技術において、配列決定のような延長方法において、逆転写法においてなどで、定義された条件下でハイブリダイゼーション特異性を持つ、少なくとも6モノマー、有利には10から30までのモノマーを含むプローブである、
− 2つのヌクレオチド又はペプチド配列は、もし機能的に一致するバイオポリマーが同一とされることなしに、その適用に又は意図される使用に関して又はそれらが含まれる技術において実質上同じ役割を演じることができるなら、互いに関して、又は関連配列に関して均等又は誘導されると言われる;特に均等は、天然の可変性の、特に固有の変異のために、それらが同一視される種の、又は誘導した変異体、同じく2つの相同配列の、得られる2つの配列であり、その相同性は以下に定義される、
− “可変性”は、特にヌクレオチド及び/又はヌクレオチドフラグメントの置換及び/又は挿入及び/又は欠失、及び/又はその末端の少なくとも1の配列の延長及び/又は短縮によって、配列の何れかの固有の又は誘導された修正を意味すると解される;非天然可変性は使用される遺伝子操作技術、例えば核酸を増幅するため選択した分解又は非分解合成プライマーの選択で生じ得る;この可変性は、参照として意図される、且つ上記参照配列に関して相同性の度合いによって発現されるであろう、何れかの出発配列の修正に帰結し得る、
− 相同性は、2つの比較されるヌクレオチド又はペプチドフラグメントの同一性の度合を特徴付ける;それは参照ヌクレオチド又はペプチド配列との比較において、ヌクレオチド又はペプチド配列の直接的な比較によって特に決定される同一性パーセンテージによって測定される、
− 何れかのヌクレオチドフラグメントは、もしそれが参照フラグメントの配列に均等なヌクレオチド配列を有するならば、参照フラグメントに均等又はそれから得られたと称される;先の定義に従い、特に参照フラグメントに均等なものは以下のものである:
(a)参照フラグメントとの相補性によって、少なくとも部分的に、ハイブリダイゼーションが可能な何れかのフラグメント、
(b)参照フラグメントを持つ配列が別の分類学の群から得られた何れかの他のフラグメントに関してよりもより大きな数で、同一の近接塩基の同定に至る何れかのフラグメント、
(c)それが得られる種からの天然の可変性を生じる又は生じることができる何れかのフラグメント、
(d)参照フラグメントに適用した遺伝子操作法で生じ得る何れかのフラグメント、
(e)参照フラグメントによってコードしたペプチドに相同な又は同一なペプチドをコードする少なくとも8の隣接ヌクレオチドを含む何れかのフラグメント、
(f)少なくとも1のモノマーの挿入、欠失、置換を、又はその末端の少なくとも1の伸張又は短縮を通して参照フラグメントと異なる何れかのフラグメント;例えば、ポリペプチドをコードしていないヌクレオチド配列によってその末端の少なくとも1つの側面に位置した、参照フラグメントに一致する何れかのフラグメント、
− ポリペプチドは、特にヒトとの関わりを通して、抽出され、単離され又は実質上単離され又は合成された、特に化学合成によって、又は組み換え生物中で発現を経て得られたそれらの、特に少なくとも2のアミノ酸の何れかのペプチド、特にオリゴペプチド、タンパク質を意味すると解される、
− ヌクレオチドフラグメントにより部分的にコードされたポリペプチドは、上記ヌクレオチドフラグメント中に含まれた少なくとも9の隣接したモノマーによりコードされる少なくとも3のアミノ酸を有するポリペプチドを意味すると解される、
− アミノ酸は、それの極性、疎水性及び/又は塩基性、及び/又は酸性、及び/又は中性のようなそれぞれの物理化学的特徴が実質上同じである場合、別なアミノ酸に類似物であると言う;かくして、ロイシンはイソロイシンの類似物である、
− 何れかのポリペプチドは、もし比較したそのポリペプチドが実質上同じ性質を、特に同じ抗原性、免疫原性、酵素的及び/又は分子認識特性を有するならば、参照ポリペプチドと均等又はから得られたと言う;特に参照ポリペプチドに均等なものは以下のものである:
(a)少なくとも1のアミノ酸が類似アミノ酸により置換されている配列を持った何れかのポリペプチド、
(b)上記参照ポリペプチドの、及び/又は上記ポリペプチドをコードするヌクレオチドフラグメントの天然又は誘導した変異によって得られた、均等ペプチド配列を有する何れかのポリペプチド、
(c)上記参照ポリペプチドのミモトープ、
(d)Lシリーズの1又はそれ以上のアミノ酸がDシリーズのアミノ酸で置換された配列、及びその逆の何れかのポリペプチド、
(e)そのアミノ酸の側鎖の修正、例えばアミノ含有官能基のアセチル化、チオール官能基のカルボキシル化、カルボキシル官能基のエステル化のような修正が導入されている配列の何れかのポリペプチド、
(f)1又はそれ以上のペプチド結合が、例えばカルバ、レトロ、インベルソ、レトロ-インベルソ、還元、及びメチレンオキシ結合のように修正されている配列の何れかのポリペプチド、
(g)少なくとも1の抗原が参照ポリペプチドに対して向けられた抗体によって認識される何れかのポリペプチド、
− 比較した2つのペプチドフラグメント間の相同性を特徴付ける同一性パーセンテージは、本発明に従って少なくとも50%、好ましくは70%とされる。
逆転写酵素活性を所有するウイルスがRNAとDNA形態の両方で遺伝的に特徴付けされ得る規定の、ウイルスDNAとRNAの両方は、本明細書に従いMSRV−1と称した、そのような逆転写酵素活性を所有するウイルスに関する配列を特徴付けるために記載されるであろう。
“第1のヌクレオチド配列”のような、本明細書及び請求の範囲で用いた順番の表現は、特有の順番を表現するために選ばれたものではないが、しかしより明確に本発明を表すためのものである。
物質又は作用因子の検出は、上記物質の又は上記作用因子の同定、定量又は分離又は単離を意味すると以下に解される。
本発明は、添付の図面を参照することで以下の詳細な説明を読むことによってより明確に理解されるであろう、ここで:
図1は、プロウイルスDNAとMSRV−1のゲノムRNAの一般構造を示す。
図2はCL6−5’(配列番号:112)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーディングフレームを示す。
図3はCL6−3’(配列番号:114)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーディングフレームを示す。
図4はC15(配列番号:117)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーデイングフレームを示す。
図5は5M6(配列番号:120)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーディングフレームを示す。
図6はCL2(配列番号:130)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーディングフレームを示す。
図7はpET28C−クローン2によって発現した及びそのヌクレオチド配列の下に提供したアミノ酸における3つの潜在的リーディングフレームを示す。
図8はpET21C−クローン2によって発現した及びそのヌクレオチド配列の下に提供したアミノ酸における3つの潜在的リーディングフレームを示す。
図9はLB13(配列番号:141)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーディングフレームを示す。
図10はLA15(配列番号:142)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーデイングフレームを示す。
図11はLB16(配列番号:124)と称すクローンのヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の下に表したアミノ酸において3つの潜在性リーディングフレームを示す。
図12は、プラスミドPCAT3と異なる起源のLTRsからサブクローンしたU3R配列のcpm/4min中で発現したプロモーター活性を示す。PCAT3はプラスミド単独を意味し、PCAT−PH74はプラスミドプラス胎盤中で発現した内因性U3Rクローンを意味し、PCAT−c16はプラスミドプラスMSプラスマのRNA中で増幅したU3Rクローンを意味し、PCAT−5M6はプラスミドプラス細胞のDNA中で増幅したU3R領域を意味し、“プラスミドなし”はその試験においてプラスミドの不在を意味する。
図13は、MSRV−1envと3’LTR配列を示す。水平矢印はenv,U3とR領域の開始を示す。env領域において、そのシグナルペプチドと潜在的免疫抑制領域は、下線を付し、そのグリコシル化サイトはボックスとし、且つ潜在的切断サイトは垂直矢印によって示した。U3R領域において:調節要素CAATとTATAボックスは下線を付し、“cap”サイトとポリアデニル化シグナルもまた示される。
図14は、Trp tRNAに相補なPBSサイト(プライマー結合サイト)に及び約487アミノ酸のタンパク質をコードするgag遺伝子に続く5’LTR(RU5)領域を示す。ヌクレオカプシド中に保存されるアミノ酸は二重下線を付した。該カプシドにおいて最も大きな相同性の領域を定義するアミノ酸は太字とし且つ下線を付した。アミノ酸配列中の/シンボルは、クローンに基づく及びヌクレオチド配列中で観測された変異体を示す。ボックス化した領域は、C末端領域のペプチド分析により同定したエピトープに相当する。
図15は、MSRV−1のインテグラーゼ領域を示し、該ヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、クローン87−23に相当するインテグラーゼ領域から推定した。図15において、//は潜在的ORFを復帰するため発現されているフレームジャンプを意味する。下線を付した太字の文字は、レトロウイルスインテグラーゼ中の保存されたアミノ酸を表す。
図16は、ドットにより表したORFsと停止コドンの表示によってクローンB13(先の出願中に記載したクローンFBd13と同一)のヌクレオチドとペプチド配列を記載する。太字で下線を付した領域は、潜在的免疫抑制ドメインを示す。一重下線ドメインは3’LTRの開始を示す。
実施例1: インテグラーゼのN末端をコードするCL6−5’領域とMSRV−1ゲノムの3’末端配列を含むCL6−3’領域の作製
3’RACEを、MSに罹った患者からの血漿から抽出した全RNAについて実施した。同じ条件下で処理した、健康者コントロール血漿をネガティブコントロールとして用いた。cDNAの合成は、配列番号:68(5’GAC TCG CTG CAG ATC GAT TTT TTT TTT TTT TTT T 3’)によって同定したオリゴdTプライマーと、Boehringer社からの逆転写酵素“ExpandTM”によって、該社の推奨する条件に従い実施した。PCRは、以下の条件下で酵素Klentaq(Clontech)により実施した:94℃5分次いで93℃1分、58℃1分、68℃3分、40サイクルにわたり、且つ68℃8分、50μlの最終反応容量で。
PCRに用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:69と同定した
− 3’プライマー、配列番号:68と同定した
第2の“セミネスト化”PCRは、既に増幅した領域内部に位置した5’プライマーで実施した。この第2のPCRは、第1のPCRで得られた増幅生産物の10μlを用いて、第1のPCRのために用いたそれと同じ実験条件下に実施した。
セミネスト化PCRに用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:70と同定した
− 3’プライマー、配列番号:68と同定した
プライマー配列番号:69と配列番号:70は、MRSV−1のpol領域に特異的である。
1.9kbの増幅生成物がMS患者の血漿から得られた。相当するフラグメントは、健康者コントロール血漿では観測されなかった。この増幅生成物は、以下の手法によってクローン化した:
増幅したDNAは、TAクローニングキットRによってプラスミド中に挿入した。DNA溶液の2μlを滅菌蒸留水の5μl、10倍濃度のリゲーション緩衝液“10X LIGATION BUFFER”の1μl、“pCRTM”ベクター(25ng/ml)”の2μl及び“T4 DNA リガーゼ”の1μlと混合した。この混合物は、12℃で一晩インキュベーションした。次の工程は、TAクローニングキットR(Invitrogen)用の指示書に従って実施した。その操作の終わりに、組換え細菌の白色コロニー(白)が培養されるように継体培養し且つ“ミニプレップ”と称す方法に従い組み込んだプラスミドの抽出を許した。それぞれの組換えコロニーのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによりそのゲルを染色した後、UV光下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、TAクローニングキットRのクローン化プラスミド上に存在するSp6プロモーターに相補のプライマーとハイブリダイゼーションした後、その挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS,DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems,ref.402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
得られたクローンは、インテグラーゼのN末端をコードしているCL6−5’領域とMSRV−1の3’末端領域に相当するCL6−3’領域とを含み、該MSRV1レトロウイルスのエンベロープ(234bp)とU3とR(401bp)領域の末端を提起することを可能にする。
インテグラーゼのN末端に一致する領域は、図27のそのヌクレオチド配列(配列番号:112)によって示される。3つの潜在的リーディングフレームは、そのヌクレオチド配列の下のそのアミノ酸配列によって表し、且つインテグラーゼのN末端のそのアミノ酸配列は、配列番号:113と同定される。
C16−3’領域は、図3中のそのヌクレオチド配列(配列番号:114)によって示される。3つの潜在的リーディングフレームは、そのヌクレオチド配列の下のそのアミノ酸配列によって表し、且つMSRV−1envタンパク質のC末端のそのアミノ酸配列は、配列番号:115と同定される。クローン6(c16)から得られるLTRのプロモーター活性を評価するために、酵素CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)を用いたプロモーター活性の試験をU3R領域に一致して実施した。並行して、正常胎盤(PH74)中で発現した内因性レトロウイルスRNAの同じU3R領域を含むクローンとDNAから得たクローン(5M6)で試験した。図12中に提示した結果は、MS血漿(c16)から得られたLTRの非常に高いプロモーター活性と非MS内因性起源の配列による有意により低い活性とを示す。
実施例2: MSRV−1レトロウイルスエンベロープの部分をコードする領域を含むC15クローンの作製
RT−PCRは、MS患者から得られたシノビオサイト培養上清の超遠心分離によって濃縮したビリオンから抽出した全RNAについて実施した。cDNAの合成は、Boehringer社からの逆転写酵素“ExpandTMRT”によって、該社の推奨する条件に従い実施した。PCRは、以下の条件下で酵素ExpandTMLong Template PCR System(Boehringer)により実施した:94℃5分次いで93℃1分、60℃1分、68℃3分、40サイクルにわたり、且つ68℃8分、50μlの最終反応容量で。
PCRに用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:69と同定した
− 3’プライマー、配列番号:116と同定した
第2の“セミネスト化”PCRは、既に増幅した領域内部に位置した5’プライマーで実施した。この第2のPCRは、第1のPCRで得られた増幅生産物の10μlを用いて、第1のPCRのために用いたそれと同じ実験条件下に(30サイクルが40の代わりに用いされたことを除いて)実施した。
セミネスト化PCRに用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:70と同定した
− 3’プライマー、配列番号:116と同定した
プライマー配列番号:69と配列番号:70は、MRSV−1のpol領域に特異的である。プライマー配列番号:116は、配列FBd13(B13とも称す)に特異的であり、且つオンコレトロウイルスの中に保存されたenv領域中に配置される。
1932bpの増幅生成物が得られ、以下の手法によってクローン化した:
増幅したDNAは、TAクローニングキットRによってプラスミド中に挿入した。各種の工程をTAクローニングキットR(Invitrogen)用の指示書に従って実施した。その操作の終わりに、組換え細菌の白色コロニー(白)が培養されるように継体培養し且つ“ミニプレップ”と称す方法に従い組み込んだプラスミドの抽出を許した。それぞれの組換えコロニーのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによりそのゲルを染色した後、UV光下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、TAクローニングキットRのクローン化プラスミド上に存在するSP6プロモーターに相補のプライマーとハイブリダイゼーションした後、その挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS, DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems, ref. 402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
得られたC15クローンは、1481bpのMSRV−1エンベロープの領域と一致する領域を含む。
C15クローンのenv領域は、図5のそのヌクレオチド配列(配列番号:117)によって示される。このクローンの3つの潜在的リーディングフレームは、そのヌクレオチド配列の下のそのアミノ酸配列によって表した。MSRV−1構造的envに一致するリーディングフレームは、配列番号:118と同定した。
クローンc16とC15から得られた定義した配列から、一致するリーディングフレームとともに図13中に示したように、3’LTRに続く完全なエンベロープをコードするプラスミド構築物を生産することが可能であった。
実施例3: MSRV−1プロウイルスタイプU3、R及びU5配列に続く、エンベロープの3’末端領域の配列を含む5M6クローンの作製
単一指向性PCRを、MS患者からの培養物中の不朽化したBリンパ球から抽出したDNAについて実施した。該PCRは、以下の条件下で酵素ExpandTMLong Template PCR System(Boehringer)により実施した:94℃3分次いで93℃1分、60℃1分、68℃3分、10サイクルにわたり、次いで93℃1分、60℃1分を核サイクルで15秒間の延長と共に、68℃3分、35サイクルにわたり、且つ68℃7分および50μlの最終反応容量で。
配列番号:119と同定したPCRに用いたプライマーは、5’ TCA AAA TCG AAG AGC TTT AGA CTT GCT AAC CG 3’である;
そのプライマー配列番号:119は、C15クローンのenv領域に特異的である。
1673bpの増幅生成物が得られ、以下の手法によってクローン化した:
増幅したDNAは、TAクローニングキットRによってプラスミド中に挿入した。各種の工程をTAクローニングキットR(Invitrogen)用の指示書に従って実施した。その操作の終わりに、組換え細菌の白色コロニー(白)が培養されるように継体培養し且つ“ミニプレップ”と称す方法に従い組み込んだプラスミドの抽出を許した。それぞれの組換えコロニーのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによりそのゲルを染色した後、UV光下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、TAクローニングキットRのクローン化プラスミド上に存在するT7プロモーターに相補のプライマーとハイブリダイゼーションした後、その挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS, DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems, ref. 402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
得られた5M6クローンは、MSRV1の領域U3、RとU5(837bp)に続く492bpのMSRV−1エンベロープの3’領域と一致する領域を含む。
その5M6クローンは、図5中のそのヌクレオチド配列(配列番号:120)で表される。このクローンの3つの潜在的リーディングフレームは、そのヌクレオチド配列の下のそのアミノ酸配列によって表した。MSRV−1envタンパク質のC末端に一致するリーディングフレームは、配列番号:121と同定した。
実施例4: MSRV−1レトロウイルスインテグラーゼをコードする領域を含むLB16クローンの作製
RT−PCRは、MS患者から得た脈絡叢から抽出しDNAseIで処理した全RNAについて実施した。cDNAの合成は、Boehringer社からの逆転写酵素“ExpandTMRT”によって、該社の推奨する条件に従い実施した。“RTなし”は、同じ材料について並行して実施した。PCRは、以下の条件下でTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer)により実施した:95℃5分、次いで95℃1分、55℃1分、72℃2分、35サイクルにわたり、且つ72℃8分、50μlの最終反応容量で。
PCRに用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:122と同定した
− 3’プライマー、配列番号:123と同定した
該プライマー配列番号:122は、MSRV−1のpol領域に特異的でありより詳しくは上述したインテグラーゼ領域と類似する。プライマー配列番号:123は、先の試験の間に得られたクローンの配列上で定義した。
約760bpの増幅生成物がRTを伴う試験においてのみ得られ、以下の手法によってクローン化した:
増幅したDNAは、TAクローニングキットRによってプラスミド中に挿入した。各種の工程をTAクローニングキットR(Invitrogen)用の指示書に従って実施した。その操作の終わりに、組換え細菌の白色コロニー(白)が培養されるように継体培養し且つ“ミニプレップ”と称す方法に従い組み込んだプラスミドの抽出を許した。それぞれの組換えコロニーのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによりそのゲルを染色した後、UV光下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、TAクローニングキットRのクローン化プラスミド上に存在するT7プロモーターに相補のプライマーとハイブリダイゼーションした後、その挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS, DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems, ref. 402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
得られたLB16クローンは、インテグラーゼと一致する領域を含む。
このクローンのヌクレオチド配列は、図11中に配列番号:124で同定し、3つのリーディングフレームが決定された。
実施例5: プロテアーゼ遺伝子に一致する、pol遺伝子に相同3’部分を含むクローン2、CL2、及びヌクレオカプシドに一致するGAG遺伝子(GM3)、及びGAG遺伝子により特有なMSRV−1の鋳型とカプシドに一致する新規5’コード化領域の作製
PCR増幅は、MSに罹った患者からの血漿の100μlから抽出した全RNAについて実施した。同じ条件下で処理した水のコントロールを、ネガティブコントロールとして用いた。cDNAの合成は、ランダムプライマー(GIBCO-BRL, France)の300pモルと逆転写酵素“Expand RT”(BOEHRINGER MANNHEIM, France)によって該社によって推奨された条件に従い実施した。PCR(“ポリメラーゼ連鎖反応”)による増幅は、以下の条件下にcDNAの10μlを用い酵素Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer, France)によって実施した:94℃2分、55℃1分、72℃2分次いで94℃1分、55℃1分、72℃2分、30サイクルにわたり、及び72℃7分、50μlの最終反応容量で。
PCR増幅に用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:126と同定した
− 3’プライマー、配列番号:127と同定した
第2の“セミネスト化”PCRは、既に増幅した領域内部に位置した5’プライマーで実施した。この第2のPCRは、第1のPCRで得られた増幅生産物の10μlを用いて、第1のPCRのために用いたそれと同じ実験条件下に実施した。
セミネスト化PCRによる増幅に用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:128と同定した
− 3’プライマー、配列番号:129と同定した
該プライマー配列番号: と配列番号: は、pol領域、クローンG+E+A、より具体的にはE領域:ヌクレオチド位置No.423とNo.448に特異的である。5’領域中で用いたプライマーは、先の試験の間に得られたクローンの配列上で定義した。
1511bpの増幅生成物がMS患者の血漿から抽出したRNAから得られた。一致するフラグメントは水のコントロールで観測されなかった。この増幅生成物は以下の手法でクローン化した。
増幅したDNAは、TAクローニングキットRによってプラスミド中に挿入した。DNA溶液の2μlを滅菌蒸留水の5μl、10倍濃度のリゲーション緩衝液“10X LIGATION BUFFER”の1μl、“pCRTM”ベクター(25ng/ml)”の2μl及び“T4 DNA リガーゼ”の1μlと混合した。この混合物は、14℃で一晩インキュベーションした。次の工程は、TAクローニングキットR(Invitrogen)用の指示書に従って実施した。その混合物は、大腸菌INVαF’細菌への結紮の形質転換後、平板培養した。その操作の終わりに、組換え細菌の白色コロニー(白)が培養されるように継体培養し且つ“ミニプレップ”と称す方法(17)に従い組み込んだプラスミドの抽出を許した。それぞれの組換えコロニーのプラスミド調製物は、制限酵素EcoRIで切断し、アガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによりそのゲルを染色した後、UV光下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、TAクローニングキットRのクローン化プラスミド上に存在するT7プロモーターに相補のプライマーとハイブリダイゼーションした後、その挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS, DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems, ref. 402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
CL2と称す得られたクローンは、gag遺伝子のC末端とMSRV−1gag遺伝子のN末端に一致する新規の領域を定義することができる、MSRV−1のクローンG+E+Aの5’末端領域に類似のC末端領域を含む。
CL2は、MSRV−1gag遺伝子のC末端領域に一致する359アミノ酸をコードする1077bpのN末端オープンリーディングフレームと454bpの非オープンリーディングフレームを有する1511bpの領域を定義することを可能にする。
CL2のヌクレオチド配列は、配列番号:130と同定した。それはアミノ酸中の潜在的リーディングフレームと共に図6中に示される。
359アミノ酸をコードするCL2の1077bpフラグメントは、以下の条件下、クローン2のDNAミニ調製物の1μlを用いてPwo酵素(5U/μl)(Boehringer Mannheim, France)でのPCRによって増幅した:95℃1分、60℃1分、72℃2分、25サイクルにわたり、50μlの最終反応容量で、プライマーの助けと共に:
− 5’プライマー(BamHI),配列番号:132と同定
及び
− 3’プライマー(HindIII),配列番号:133と同定
それぞれ、位置−9から21と1066から1095でクローン2のヌクレオチド配列に一致する。
PCRにより得られたフラグメントは、BamHIとHIndIIIで線状化し、BamHIとHIndIIIで線状化した発現ベクターpET28CとpET21C(NOVAGEN)にサブクローン化した。2つの発現ベクター中のクローン2の1077bpフラグメントのDNAの配列決定は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS, DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems, ref. 402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
発現ベクターpET28CとPET21Cによるクローン2の1077bpのヌクレオチド配列の発現は、それぞれ、配列番号:135と配列番号:137によって同定される。
実施例6: 大腸菌におけるクローン2の発現
構築物pET28c−クローン2(1077bp)とpET21C−クローン2(1077bp)を細菌のBL21株(DE3)中で合成し、タンパク質を、SDS−PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS=ドデシル硫酸ナトリウム)(Laemmli, 1970(1))によって同定した、約45kDaの外見上の分子質量を有する、ベクターpET28CのN及びC末端及び6ヒスチジンを持ったベクターpET21C6のC末端で融合した。該タンパク質の反応性は、ウェスタンブロット法(Towbin等、1979(2))によって抗ヒスチジンモノクローナル抗体(DIANOVA)に向けて示された。
組換え体タンパク質pET28c−クローン2(1077bp)とpET21C−クローン2(1077bp)は、50μlのリゾチーム(10mg/ml)によって細菌抽出物の酵素的消化と超音波溶菌後に不溶性分画中のSDS−PAGEによって視覚化した。
組換え体抗原pET28C−クローン2(1077bp)とpET21C−クローン2(1077bp)の抗原特性は、2%SDSと50mM β-メルカプトエタノールによって細菌ペレットの可溶化の後、ウェスタンブロット()により試験した。多発性硬化症に罹った患者からの血清、神経学的コントロールからの血清及び血液輸血センター(CTS)でのコントロールからの血清と共にインキュベーション後、その免疫複合体を、アルカリホスファターゼ−対合ヤギ血清抗−ヒトIgGと抗−ヒトIgMの補助によって検出した。
その結果を以下の表中に示した。
(a)組換え抗原pET−gagクローン2(1077bp)の1.5μgを含む空は1/100希釈した血清に対して反応性を示す。ウェスタンブロット解釈は空についての特異的pET-gagクローン2(1077bp)の存在又は不在に基づいている。ポジティブ及びネガティブコントロールはそれぞれの実験中に含まれる。
これらの結果は、用いた技術的条件の下で、ヒト血清の約40%が、組換え体タンパク質pET28C−クローン2(1077bp)とpET21C−クローン2(1077bp)との反応を試験した多発性硬化症によって影響されたことを示す。反応性は、神経学的コントロールについても観測され且つ逆転写酵素工程の後の、この血清から抽出したRNAsもまた、pol領域中のPCRによって増幅されることを示すことは重要である。これは、MSが明らかでない人達もまたこのウイルスを宿し且つ発現し得ることを示唆する。一方、外見上健康なコントロール(CTSドナー)は抗gag(クローン2,1077bp)抗体を所有する。これは、示された関連自己免疫疾患と独立してMSRV−1に対して得られた免疫性と和合する。
実施例7: gag遺伝子に一致するクローン2に相同な3’部分に、及びU5LTR領域に一致する5M6クローンに相同な5’部分を含むLB13クローンの作製
RT−PCR(“逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応”)を、超遠心分離によって濃縮した、多発性硬化症に罹った患者のBリンパ球細胞の上清から得られた、ビリオンから抽出した全RNAを用いて実施した。cDNAの合成は、特異的プライマー配列番号:XXXとBOEHRINGER MANNHEIMからの逆転写酵素“ExpandTM RT”によって該社によって推奨された条件に従い実施した。
cDNAの合成用に用いたプライマー、配列番号:138と同定した:
PCR増幅は、以下の条件下でTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer, France)によって実施した:94℃2分、55℃1分、72℃2分、35サイクルにわたり、72℃7分、100μlの最終反応容量で。
PCR増幅に用いたプライマー:
− 5’プライマー、配列番号:139と同定した
− 3’プライマー、配列番号:138と同定した
第2のいわゆる“セミネスト化”PCRは既に増幅した領域内部に位置した3’プライマーで実施した。この第2の増幅は、第1のPCRで得られた増幅生産物の10μlを用いて、第1の増幅のために用いたそれと同じ実験条件下に実施した。
セミネスト化PCRによる増幅に用いたプライマー:
− 5′プライマー、配列番号:139と同定した
− 3’プライマー、配列番号:140と同定した
該プライマー配列番号:138と配列番号:140は、gag領域、クローン2ヌクレオチド位置No.373-397とNo.433-456に特異的である。5’領域中で用いたプライマーは、予備試験の間に得られたクローンの配列上で定義した。
746bpの増幅生産物が得られ、以下の手法でクローン化した:
増幅したDNAは、TAクローニングキットRによってプラスミド中に挿入した。DNA溶液の2μlを滅菌蒸留水の5μl、10倍濃度のリゲーション緩衝液“10X LIGATION BUFFER”の1μl、“pCRTMベクター(25ng/ml)”の2μl及び“T4 DNA リガーゼ”の1μlと混合した。この混合物は、14℃で一晩インキュベーションした。次の工程は、TAクローニングキットR(Invitrogen)用の指示書に従って実施した。その混合物は、大腸菌INVαF’細菌への結紮の形質転換後、平板培養した。その操作の終わりに、組換え細菌の白色コロニー(白)が培養されるように継体培養し且つ“ミニプレップ”と称す方法(17)に従い組み込んだプラスミドの抽出を許した。それぞれの組換えコロニーのプラスミド調製物は、制限酵素EcoRIで切断し、アガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによりそのゲルを染色した後、UV光下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、TAクローニングキットRのクローン化プラスミド上に存在するT7プロモーターに相補のプライマーとハイブリダイゼーションした後、その挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット“PRISMTM Ready Reaction AmpliTaqR FS, DyeDeoxyTM Terminator”(Biosystems, ref. 402119で提供される)を使用するために推奨された方法に従い実施し、且つ自動配列決定は、製造者の指示に従って、Applied Biosystems 373A and 377装置で実施した。
得られたLB13クローンは、クローン2に相同のMSRV−1gag遺伝子のN末端領域とU5領域の部分に一致するLTRを含む。U5領域とgagの間の転移RNAsのための結合サイト、PBS“プライマー結合サイト”は同定した。
プラスミド“pCRTMベクター”中のLB13クローンの764bpフラグメントのヌクレオチド配列は、同定物配列番号:141で表される。
PBSトリプトファンタイプの配列を有する、転移RNAsのための結合サイトは、LB13クローンのヌクレオチド位置No.342-359で同定した。
この同じPBSがMSRV1に相同な内因性コピー中で見出されたように、かくして定義した内因性ファミリーは、内因性レトロウイルスファミリーのために提案された用語に従って、今後HERV Wと称す(W=トリプトファン)。
約65アミノ酸の短ORFがLB13クローンの5’LTRのU5領域中で見出された。
ORFの配列は:
PMASNRAITLTAWSKIPFLGIRETKNPRSENTRLATMLEAAHHHFGSSPPLSWELWEQGPQVTIW.
ATGコドンで開始する一致するヌクレオチド配列は、プロウイルスLTR(U3RU5)からのサブゲノムDNA中で発現することができる。
LA15と称す別なクローンは、慢性関節リウマチに罹った患者から得られたシノビオサイトの培養上清から超遠心分離によって濃縮したビリオンから抽出した全RNAについて得た。LA15クローンの増幅とクローン化の方策はLB13クローンのために用いたと正確に同じとした。
同定物配列番号:142に示される、LA15クローンのヌクレオチド配列は、LD13クローンに非常に類似している。これは、多発性硬化症中で検出したMSRV−1レトロウイルスが、慢性関節リウマチで見出されたそれに類似した配列を有することを示唆する。
実施例8: クローンLB15,LB13,CL2及びCL17からのRU5−GAG領域の再構築
クローンCL2とLB13は、先の実施例において既に記載されている。LB15クローンは、5’中のプライマーを定義するためにc16クローンのLTRのR配列を用いて得られ、且つ用いたアンチセンスプライマーはLB13クローンと同じである。CL17クローンは、以下のプライマーを用いてネスト化RT−PCRにより得られた:
該LB15クローンは、MS細胞を培養することによって得られたビリオンから得られた。LB17クローンは、MS患者からの血漿を培養することで得られた。
これらのオーバーラップクローンは、図14中に提示した通り、gag遺伝子中の潜在的ORFを持つRU5−gag配列を再構築することを可能にする。
実施例9: クローン87−23の作製
インテグラーゼに一致する領域は、MSRV1のpol及びenv領域中に配された次のプライマーと共にセミネスト化RT PCRを用いてMS血漿から増幅し且つクローン化した。
pol領域において:
増幅したクローンは、pol/RT領域中の774bp、インテグラーゼ領域(1197bp)の全部及びenv領域(480bp)の開始を含む。インテグラーゼ領域に一致するヌクレオチド配列と潜在的ORFのアミノ酸への翻訳は、図15中に提示される。
実施例10: MSRV1ゲノムと結合したレトロウイルス粒子中のERV9に関するENV配列を含むRNAの存在の確認:
ERV9に関連した配列は、MSRV1配列と比較したMSから得られたビリオン調製物においてマイナーな割合で見出されている。複製株によって生産したレトロウイルス粒子への系統発生的に関連した内因性配列の共被包の現象の存在は記載されている。驚くべきことに、envの3′部分のORF開始と3’LTRへの潜在的な継続を含むRNA領域が各種のMSサンプル中で見出されている。ORFの存在を特定するために、転写−翻訳試験を実行し、推定上のLTRの開始での完全なトランスメンブラン(TM)部分と終わりを含むenvORFの現実性を示すことを可能にした。しかしながら、付加フレーム(ORFX)は3’LTRに続き且つ継続する。発現の2つの生産物は視覚化され、それぞれのORFsをサブクローン化した。図16は、端切りしたenv領域中の及び推定上のLTR中のORFsを特定化する、既に記載したB13クローンのヌクレオチドとペプチド配列を表す。そのようなRNAsの存在は、複製株と共に組換えのために応答可能とされるであろうし、結果として変更された病原性を有する株を生成する。
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Claims (12)
- (i)配列番号:112,配列番号:114,配列番号:117,配列番号:120,配列番号:124,配列番号:130,配列番号:141及び配列番号:142の配列;(ii)配列(i)に相補の配列;及び
(iii)配列(i)若しくは(ii)における1つ若しくは数個のヌクレオチドの置換、挿入、及び/若しくは欠失、並びに/又は、配列(i)又は(ii)の少なくとも一方の末端での1つ若しくは数個のヌクレオチドの延長若しくは短縮によって得られる配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチドフラグメントであり、EMBLHTGデータベース上で使用し得るヒトクローンRG083M05の配列番号:HSAC64の配列と異なるものであるヌクレオチドフラグメント。 - (i)配列番号:112,配列番号:114,配列番号:117,配列番号:120,配列番号:124,配列番号:130,配列番号:141及び配列番号:142の配列;(ii)配列(i)における1つ若しくは数個のヌクレオチドの置換、挿入、及び/若しくは欠失、並びに/又は、配列(i)の少なくとも一方の末端での1つ若しくは数個のヌクレオチドの延長若しくは短縮によって得られる配列、
からなる群から選択される、DNAの形態のヌクレオチド配列を含む、単離した又は精製した状態のレトロウイルス分子。 - レトロウイルスのゲノムに属する、請求項1記載のヌクレオチドフラグメントのヌクレオチド配列と、又は、請求項2記載のレトロウイルス分子のヌクレオチド配列と、適切な操作条件下で、特異的にハイブリダイズできることを特徴とする多発性硬化症及び/又は慢性関節リウマチに関連したレトロウイルスの検出のためのプローブ。
- 請求項2記載のレトロウイルス分子のヌクレオチド配列と、適切な操作条件下で、特異的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む請求項2記載のレトロウイルス分子のヌクレオチド配列の増幅のためのプライマー、又は、得られた特異的な増幅生産物と、適切な操作条件下で、特異的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む請求項2記載レトロウイルス分子のヌクレオチド配列の増幅のためのプライマー。
- そのヌクレオチド配列が、配列番号:116,配列番号:119,配列番号:122,配列番号:123,配列番号:126,配列番号:127,配列番号:128,配列番号:129,配列番号:132,配列番号:133,配列番号:138,配列番号:139,及び配列番号:140から選択されることを特徴とする、請求項4記載のプライマー。
- 請求項1記載のヌクレオチドフラグメントを含むDNA分子。
- 請求項1記載のヌクレオチドフラグメントを含む複製及び/又は発現ベクター。
- 請求項1記載のヌクレオチドフラグメントに属する何れかのオープンリーディングフレームによりコードされるペプチドであって、MSRV−1ウイルスに感染した、及び/又はMSRV−1ウイルスが再活性化されている患者の血清によって認識された抗原決定基を形成する又は含むペプチド。
- 配列番号:113,配列番号:115,配列番号:118,配列番号:121,配列番号:135及び配列番号:137からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項8記載のペプチド。
- レトロウイルスに属すると仮定した又はレトロウイルスから得たRNA及び/又はDNAを、請求項1記載のヌクレオチドフラグメントを含む組成物と接触させることを特徴とする、生物学的サンプルにおける、多発性硬化症及び/又は慢性関節リウマチに関連したレトロウイルスの検出方法。
- 請求項8又は9記載のペプチドを少なくとも1つ含む診断用組成物。
- 生物学的サンプルを、請求項11記載の組成物と接触させることを特徴とする、生物学的サンプルにおける、多発性硬化症及び/又は慢性関節リウマチに関連したレトロウイルスの検出方法。
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