ES2247708T3 - Material nucleico retroviral y fragmentos de nucleotidos notablemente asociados a la esclerosis multiple y/o a la poliartritis reumatoide, para obtener un diagnostico, y usos profilactivos y terapeuticos. - Google Patents
Material nucleico retroviral y fragmentos de nucleotidos notablemente asociados a la esclerosis multiple y/o a la poliartritis reumatoide, para obtener un diagnostico, y usos profilactivos y terapeuticos.Info
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Abstract
La invención se refiere a un material nucleico, en estado purificado o aislado, y un fragmento de nucleótido que consta de una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consta de: (i) las secuencias SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO114, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO 141 y SEQ ID NO: 142, (ii) las secuencias complementarias de las secuencias (i) y (iii) las secuencias equivalentes de las secuencias (ii) y (i), en particular la secuencia que tiene para todas las series de 100 monómeros contiguos, al menos un 50%, preferiblemente un 70% homólogo con secuencias (i) y (ii) respectivamente. La invención también se refiere a sus usos para detectar un retrovirus asociado con la esclerosis múltiple y/o artritis reumática.
Description
Material nucleico retroviral y fragmentos de
nucleótidos notablemente asociados a la esclerosis múltiple y/o a la
poliartritis reumatoide, para obtener un diagnóstico, y usos
profilactivos y terapéuticos.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad
desmielinizante del sistema nervioso central cuya causa permanece
todavía completamente desconocida.
Numerosos estudios han apoyado la hipótesis sobre
una etiología viral de la enfermedad, pero ninguno de los virus
conocidos estudiados se ha revelado como el agente causal buscado:
un informe de virus buscados en la EM desde hace años ha sido
realizado por E. Norrby y R. T Johnson.
Recientemente, un retrovirus, diferente de los
retrovirus humanos conocidos, ha sido aislado en pacientes afectados
por la EM. Los autores han podido así demostrar que este retrovirus
podía transmitirse in Vitro, que pacientes afectados por la
EM producían anticuerpos susceptibles de reconocer proteínas
asociadas a la infección de las células de las leptomeninges por
este retrovirus, y que su manifestación podía estar
considerablemente estimulada por los genes
inmediatos-precoces de ciertos herpesvirus.
Todos estos resultados apuntan hacia la
implicación de al menos un retrovirus desconocido en la EM o de un
virus con una actividad transcriptasa inversa (RT, del inglés
Reverse Transcriptase) detectable con el método publicado por
H. Perron y calificada de actividad "RT de tipo LM7".
Los estudios de la Demandante han permitido la
obtención de dos líneas continuas de células infectadas por aislados
naturales que proceden de pacientes diferentes afectados por la EM,
por un procedimiento de cultivo tal como es descrito en el documento
WO-A-93 20188. Estas dos líneas de
células de plexos coroideos humanos, denominados LM7PC y
PLI-2 han sido respectivamente registradas en la
E.C.A.C.C el 22 de julio de 1992 y el 8 de enero de 1993, con los
números 92 072201 y 93 010817, de conformidad con las disposiciones
del Tratado de Budapest. Además, los aislados virales que tienen una
actividad RT de tipo LM7 han sido también registrados en la
E.C.A.C.C. con la denominación global de "cepas". La
"cepa" o aislado alojado por la línea PLI-2,
denominada POL-2, ha sido registrada en la
E.C.A.C.C el 22 de julio de 1992 con el nº V92072202. La "cepa"
o aislado alojado por la línea LM7PC, denominada MS7PG, ha sido
registrada en la E.C.A.C.C. el 8 de enero de 1993 con el nº
V93010816.
A partir de los cultivos y de los aislados
citados, caracterizados por criterios biológicos y morfológicos, nos
hemos involucrado en la caracterización del material nucleico
asociado a las partículas virales producidas en estos cultivos.
Las porciones del genoma ya caracterizadas han
sido utilizadas para elaborar pruebas de detección molecular del
genoma viral y pruebas inmunoserológicas, utilizando las secuencias
de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos del
genoma viral, para detectar la respuesta inmunitaria dirigida contra
epítopos asociados a la infección y/o la expresión viral.
Estas herramientas han permitido confirmar ya una
asociación entre la EM y la expresión de las secuencias
identificadas en las patentes citadas posteriormente. Sin embargo,
el sistema viral descubierto por el Demandante, es similar a un
sistema retroviral complejo. Efectivamente, las secuencias
encontradas encapsidadas en las partículas virales extracelulares
producidas por los diferentes cultivos de células de pacientes
afectados por la EM, muestran claramente que existe una
co-encapsidación de genomas retrovirales similares,
pero diferentes del genoma retroviral "salvaje" que produce las
partículas virales infectantes. Este fenómeno ha sido observado
entre retrovirus endógenos que pertenecen a la misma familia,
incluso heterólogos. La noción de retrovirus endógeno es muy
importante en el contexto de nuestro descubrimiento porque, en el
caso de MSRV-1, hemos observado que secuencias
retrovirales endógenas conteniendo secuencias homólogas al genoma
MSRV-1, existen en el ADN humano normal. La
existencia de elementos retrovirales endógenos (ERV, del inglés
Endogenous RetroViruses) similares a MSRV-1
en una parte o todo su genoma, explica el hecho de que la expresión
del retrovirus MSRV-1 en las células humanas pueda
interactuar con secuencias endógenas cercanas. Estas interacciones
se manifiestan en el caso de retrovirus endógenos patógenos y/o
infecciosos (por ejemplo algunas cepas ecotrópicas del virus de la
leucemia murina), en el caso de retrovirus exógenos cuya secuencia
de nucleótidos puede encontrarse parcialmente o en su totalidad, en
la forma de ERV, en el genoma del animal huésped (p.ej. virus
exógeno del tumor mamario de la rata transmitido por la leche).
Estas interacciones consisten principalmente en (i) una
transactivación o co-activación de ERV por el
retrovirus replicativo, (ii) una encapsidación "ilegítima" de
ARN relacionado con ERV, o con ERVS (incluso con ARN celulares) que
posean simplemente las secuencias de encapsidación compatibles, en
las partículas retrovirales producidas por la manifestación de la
cepa replicativa, a veces transmisibles y a veces con una
patogenicidad propia, y (iii) recombinaciones más o menos
importantes entre los genomas co-encapsidados,
especialmente en las fases de la transcriptasa inversa, que llevan a
la formación de genomas híbridos con una patogenicidad propia.
De esta manera, (i) diferentes secuencias
relacionadas con MSRV-1 han sido encontradas en las
partículas virales purificadas; (ii) el análisis molecular de
diferentes regiones del genoma retroviral MSRV-1
debe hacerse analizando sistemáticamente la secuencias
co-encapsidadas, interferentes y/o recombinadas que
son generadas por la infección y/o la expresión de
MSRV-1, además, algunos clones pueden tener partes
de las secuencias defectivas producidas por la replicación
retroviral y los errores de matriz y/o de transcripción de la
transcriptasa inversa; (iii) los grupos de secuencias relacionados
con una misma región geonómica retroviral son los soportes de una
detección diagnóstica global que puede ser optimizada por la
identificación de regiones invariables entre los clones expresados y
por la identificación de tramas de lecturas responsables de la
producción de polipéptidos antigénicos y/o patógenos que pueden ser
producidos únicamente mediante una parte, incluso por uno solo, de
los clones expresados. En estas condiciones, el análisis sistemático
de los clones expresados en una región de un genoma dado permite
evaluar la frecuencia de variación y/o de recombinación del genoma
MSRV-1 en esta región y definir las secuencias
óptimas para las aplicaciones, especialmente diagnósticas; (iv) la
patología provocada por un retrovirus como el MSRV-1
puede ser un efecto directo de su expresión y de las proteínas o de
los péptidos producidos por este hecho, pero también puede ser
debido a un efecto de la activación, de la encapsidación, de la
recombinación de los genomas relacionados o heterólogos, y de las
proteínas o de los péptidos producidos; de esta manera estos genomas
asociados a la expresión y/o la infección por MSRV-1
son una parte integrante de la patogenicidad potencial de este virus
y así, constituyen soportes de detección diagnóstica y objetivos
terapéuticos concretos. De la misma manera, todo agente que esté
asociado a un co-factor o sea un
co-factor de estas interacciones responsables de la
patogenia causada, como MSRV-2 o el factor
gliotóxico descrito en la solicitud de patente publicada con el nº
FR-2 716 198, puede participar en la elaboración de
una estrategia global y muy eficaz de diagnóstico, de pronóstico, de
seguimiento terapéutico y/o de terapéutica integrada de la EM
concretamente, pero también de cualquier otra enfermedad asociada a
los mismos agen-
tes.
tes.
En este contexto, hemos hecho un descubrimiento
paralelo en otra enfermedad autoinmune, la poliartritis reumatoide
(PR), que se describió en la solicitud de una patente francesa
registrada con el nº 95 02960. Este descubrimiento demuestra que,
aplicando acercamientos metodológicos similares a los que fueron
utilizados en los estudios de la Demandante sobre la EM, hemos
podido identificar un retrovirus expresado en la PR que comparte las
secuencias descritas para MSRV-1 en la EM. También
se ha demostrado la co-existencia de una secuencia
asociada a MSRV-2 también descrita en la EM. En lo
que se refiere a MSRV-1, las secuencias detectadas
de manera común a la EM y la PR, comprenden los genomas pol y
gag. En el estado actual de los conocimientos, se pueden
asociar las secuencias gag y pol descritas en las
cepas MSRV-1 manifiestas en estas dos
enfermedades.
La presente solicitud de patente tiene por
objetivo diferentes resultados, que se suman a los que ya están
protegidos por las solicitudes de patente francesas:
- Nº 92 04322 del 03.04.1992, publicada con el nº
2 689 519;
- Nº 92 13447 del 03.11.1992, publicada con el nº
2 689 521;
- Nº 92 13443 del 03.11.1992, publicada con el nº
2 689 520;
- Nº 94 01529 del 04.02.1994, publicada con el nº
2 715 936;
- Nº 94 01531 del 04.02.1994, publicada con el nº
2 715 939;
- Nº 94 01530 del 04.02.1994, publicada con el nº
2 715 936;
- Nº 94 01532 del 04.02.1994, publicada con el nº
2 715 937;
- Nº 94 14322 del 24.11.1994, publicada con el nº
2 727 428;
- Nº 94 15810 del 23.12.1994, publicada con el nº
2 728 585;y
- la solicitud de la patente
WO-97/06260.
La presente invención se refiere ante todo a un
material nucleico, que puede estar compuesto por un material
retroviral, aislado o purificado, pudiendo ser aprehendido o
caracterizado de diferentes maneras:
- contiene una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo compuesto por (i) las secuencias ID DE SEC Nº
114, ID DE SEC Nº 117, ID DE SEC Nº 120; (ii) las secuencias
complementarias a las secuencias de (i); y (iii) las secuencias que
equivalen a las secuencias de (i) o (ii), especialmente las
secuencias que presentan una sucesión de 100 monómeros contiguos,
con al menos un 50%, y preferentemente al menos un 70% de homología,
con las secuencias de (i) o de (ii) respectivas;
- codifica para un polipéptido que presenta una
sucesión contigua de al menos 30 aminoácidos, con al menos un 50%, y
preferentemente al menos un 70% de homología, con una secuencia
peptídica seleccionada del grupo compuesto por las secuencias ID DE
SEC Nº 115, ID DE SEC Nº 118, ID DE SEC Nº 121;
- su gen env contiene una secuencia de
nucleótidos idéntica o que equivale a una secuencia seleccionada del
grupo compuesto por la secuencia ID DE SEC Nº 117, y sus secuencias
complementarias;
- su gen env contiene una secuencia de
nucleótidos que empieza con el nucleótido 1 de la ID DE SEC Nº 117 y
acaba con el nucleótido 233 de la ID DE SEC Nº 114;
- su gen env codifica para un polipéptido
que presenta una sucesión de al menos 30 aminoácidos contiguos, con
al menos un 50%, y preferentemente al menos un 70% de homología con
la secuencia ID DE SEC Nº 118;
- la región U3R de su LTR 3' contiene una
secuencia de nucleótidos que se acaba con el nucleótido 617 de la ID
DE SEC Nº 114;
- la región RU5 de su LTR 5' contiene una
secuencia de nucleótidos que empieza con el nucleótido 755 de ID DE
SEC Nº 120;
- un material nucleico retroviral conteniendo una
secuencia que empieza con el nucleótido 755 de ID DE SEC Nº 120 y
que se acaba con el nucleótido 617 de ID DE SEC Nº 114;
- el material nucleico retroviral, como se ha
definido anteriormente, se asocia especialmente al menos a una
enfermedad autoinmune como la esclerosis múltiple o la poliartritis
reumatoide.
La presente invención se refiere también a un
fragmento de nucleótidos que responde al menos a una de las
definiciones siguientes:
- contiene o consta de una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo compuesto por (i) las secuencias
ID DE SEC Nº 114, ID DE SEC Nº 117, ID DE SEC Nº 120; (ii) las
secuencias complementarias de las secuencias de (i); y (iii) las
secuencias que equivalen a las secuencias de (i) o de (ii),
especialmente las secuencias que presentan una sucesión contigua de
100 monómeros, con al menos un 50%, y preferentemente al menos un
70% de homología con las secuencias de (i) o de (ii)
respectivas;
- contiene o consta de una secuencia de
nucleótidos que codifican para un polipéptido que presenta una
sucesión contigua de al menos 30 aminoácidos, con al menos un 50%, y
preferentemente al menos un 70% de homología con una secuencia
peptídica seleccionada del grupo compuesto por las secuencias ID DE
SEC Nº 115, ID DE SEC Nº 118, ID DE SEC Nº 121.
Otros objetos de la presente invención son los
siguientes:
- una sonda nucleica para la detección de un
retrovirus asociado a la esclerosis múltiple y/o la poliartritis
reumatoide, susceptible de hibridarse específicamente sobre todo
fragmento anteriormente definido y perteneciendo al genoma de dicho
retrovirus; ésta tiene la ventaja de poseer entre 10 y 100
nucleótidos, preferentemente entre 10 y 30 nucleótidos.
- un cebador para la amplificación por
polimerización de un ARN o de un ADN de un retrovirus asociado a la
esclerosis múltiple y/o la poliartritis reumatoide, que contiene una
secuencia de nucleótidos idéntica o equivalente al menos a una parte
de la secuencia de nucleótidos de un fragmento definido
anteriormente, específicamente una secuencia de nucleótidos que
presentan una sucesión de 10 monómeros contiguos, con al menos 50%,
preferentemente al menos un 70%, de homología con por lo menos dicha
parte de dicho fragmento; la secuencia de nucleótidos de un cebador
de la invención es preferentemente seleccionada entre la ID DE SEC
Nº 116 y la ID DE SEC Nº 119;
- un ARN o un ADN, y específicamente un vector de
replicación y/o de expresión, conteniendo un fragmento genómico del
material nucleico o un fragmento definido anteriormente;
- un péptido codificado por cualquier marco de
lectura abierto que pertenece a un fragmento de nucleótidos definido
anteriormente, específicamente un polipéptido, por ejemplo
oligopéptido formando parte o conteniendo un antigénico determinante
reconocido por el suero de pacientes infectados por el virus
MSRV-1, y/o en los que el virus
MSRV-1 ha sido reactivado; un péptido preferente
contiene una secuencia idéntica, en parte o totalmente, o
equivalente a una secuencia seleccionada entre la ID DE SEC Nº 115,
la ID DE SEC Nº 118, la ID DE SEC Nº 121;
- una composición diagnóstica, profiláctica, o
terapéutica, específicamente para inhibir la expresión de al menos
un retrovirus asociado a la esclerosis múltiple y/o la poliartritis
reumatoide, conteniendo un fragmento de nucleótidos definido
anteriormente;
- un procedimiento para detectar un retrovirus
asociado a la esclerosis múltiple y/o la poliartritis reumatoide, en
una muestra biológica, que consta de las etapas que consisten en
poner en contacto un ARN y/o un ADN que pertenezca supuestamente o
proceda de dicho retrovirus, o sus ARN y/o ADN complementarios, con
una composición que contenga un fragmento de nucleótidos definido
anteriormente.
Antes de detallar la invención, vamos a proceder
a definir diferentes términos utilizados en la descripción y las
reivindicaciones:
- por cepa o aislado se entiende cualquier
fracción biológica infecciosa y/o patógena, conteniendo por ejemplo
virus y/o bacterias y/o parásitos, generando un poder patógeno y/o
antigénico, acogida por un cultivo o un huésped vivo; como ejemplo,
una cepa viral de acuerdo con la definición anterior puede contener
un agente co-infeccioso, por ejemplo un protista
patógeno,
- el termino "MSRV" utilizado en la presente
descripción se refiere a todo agente patógeno y/o infeccioso,
asociado a la EM, específicamente una especie viral, las cepas
atenuadas de dicha especie viral, o las partículas defectivas
interferentes o conteniendo genomas co-encapsidados
o recombinados con una parte del genoma MSRV-1,
derivado de esta especie. Se sabe que los virus y particularmente
los virus conteniendo el ARN tienen una variabilidad, consecutiva
especialmente a índices relativamente elevados de mutación
espontánea, de la cual se tendrá en cuenta mas adelante para definir
la noción de equivalencia,
- por virus humano, nos referimos a un virus
susceptible de infectar o de ser acogido por el ser humano,
- teniendo en cuenta todas las variaciones y/o
las recombinaciones naturales o inducidas, pudiendo encontrarse en
la práctica de la presente invención, los objetivos de ésta,
definidos anteriormente y en las reivindicaciones, han sido
formuladas incluyendo las equivalencias o los derivados de
diferentes materiales biológicos definidos más adelante,
especialmente las secuencias homólogas de nucleótidos o
peptídicas,
- la variación de un virus o de un agente
patógeno y/o infeccioso de acuerdo con la invención, contiene al
menos un antígeno reconocido por al menos un anticuerpo dirigido
contra al menos un antígeno referente de dicho virus y/o de dicho
agente patógeno y/o infeccioso, y/o del genoma cuya parte se detecta
a través de al menos una sonda de hibridación, y/o al menos un
cebador de amplificación de nucleótidos especifica de dicho virus
y/o agente patógeno y/o infeccioso, en estas condiciones de
hibridación determinadas tan conocidas por el experto,
- de acuerdo con la invención, un fragmento de
nucleótidos o un oligonucleótido o un polinucleótido es un
encadenamiento de monómeros, o un biopolímero, caracterizado por la
secuencia informacional de los ácidos nucleicos naturales,
susceptible de hibridarse a cualquier otro fragmento de nucleótidos
en condiciones predeterminadas, el encadenamiento pudiendo contener
monómeros de estructuras químicas diferentes y ser obtenido a partir
de una molécula de ácido nucleico natural y/o por recombinación
genética y/o por síntesis química; un fragmento de nucleótidos puede
ser idéntico a un fragmento genómico del virus
MSRV-1 considerado por la presente invención,
especialmente un genoma de éste, por ejemplo pol o env en el caso de
el dicho virus;
- así mismo un monómero puede ser un nucléotido
natural de ácido nucleico, cuyos elementos constitutivos son un
azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada; en el ARN el azúcar
es la ribosa, en el ADN el azúcar es la
desoxi-2-ribosa; según sea ADN o
ARN, la base nitrogenada es elegida entre la adenina, la guanina, el
uracilo, la citosina, la timina; donde el nucléotido puede ser
modificado por lo menos en uno de los tres elementos constitutivos;
por ejemplo, la modificación puede intervenir al nivel de las bases,
generando bases modificadas tal como la inosina, la
metil-5-desoxicitidina, la
desoxiuridina, la
dimetilamino-5-desoxiuridina, la
diamino-2,6-purina, la
bromo-5-desoxiuridina y toda base
modificada favoreciendo la hibridación, al nivel del azúcar, la
modificación puede consistir en la sustitución de al menos una
desoxirribosa por una poliamida, y al nivel del agrupamiento
fosfato, la modificación puede consistir en su sustitución por
ésteres, específicamente elegidos entre los ésteres de difosfato, de
alquil y arilfosfonato y de fosforotioato,
- por "secuencia informacional", nos
referimos a una continuación ordenada de monómeros, cuyas natura
química y orden en un sentido de referencia, constituyen o no una
información funcional de misma calidad que la de los ácidos
nucleicos naturales,
- por hibridación, nos referimos al proceso en
curso del que, dentro de condiciones operatorias apropiadas, dos
fragmentos de nucleótidos, teniendo secuencias suficientemente
complementarias, se emparentan para formar una estructura compleja,
especialmente doble o triple, preferentemente en forma de
hélice,
- una sonda contiene un fragmento de nucleótidos
sintetizado por vía química u obtenido por digestión o corte de un
fragmento de nucleótidos más largo, incluyendo al menos 6 monómeros,
ventajosamente entre 10 y 100 monómeros, preferentemente entre 10 y
30 monómeros, y poseyendo una especificidad de hibridación en
condiciones determinadas; preferentemente una sonda poseyendo menos
de 10 monómeros no se utiliza sola, pero si cuando hay otras sondas
igual de cortas o no; en ciertas condiciones especificas, puede
resultar útil utilizar sondas de tamaño superior a 100
monóme-
ros; una sonda puede por cierto ser utilizada para diagnóstico y serán por ejemplo sondas de captura y/o de detección,
ros; una sonda puede por cierto ser utilizada para diagnóstico y serán por ejemplo sondas de captura y/o de detección,
- la sonda de captura puede ser inmovilizada con
un fuerte soporte por todos modos apropiados, es decir directamente
o indirectamente, por ejemplo por covalencia o absorción pasiva,
- la sonda de detección puede marcarse gracias a
un marcador elegido especialmente entre los isótopos radioactivos,
enzimas especialmente elegidas entre la peroxidasa y la fosfatasa
alcalina y los que son susceptibles de hidrolizar un sustrato
cromógeno, fluorígeno o luminiscente, componentes químicos
cromóforos, componentes cromógenos, fluorígenos o luminiscentes,
análogos de base de nucleótidos, y la biotina,
- la sondas utilizadas para diagnóstico de la
invención pueden ser manejadas en todas las técnicas de hibridación
conocidas, y especialmente la técnicas llamadas "DOT BLOT",
"SOUTHERN BLOT", "NORTHERN BLOT" cuya técnica es idéntica
a la técnica "SOUTHERN BLOT" pero que utilizan ARN como
objetivo, la técnica SANDWICH; ventajosamente, se utiliza la técnica
SANDWICH en la presente invención, conteniendo una sonda de captura
específica y/o una sonda de detección específica, quedando entendido
que la sonda de captura debe presentar una secuencia de nucleótidos
al menos parcialmente diferente,
- cualquier sonda de acuerdo con la presente
invención puede hibridarse in vivo o in vitro sobre el
ARN y/o sobre el ADN, para bloquear los fenómenos de replicación,
especialmente traducción y/o transcripción, y/o para degradar dicho
ADN y/o ARN,
- un cebador es una sonda conteniendo al menos
seis monómeros, y ventajosamente entre 10 y 30 monómeros, poseyendo
una especificidad de hibridación en condiciones determinadas, para
la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una
técnica de amplificación tal como la PCR (Polymerase Chain Reaction)
en un procedimiento de alargamiento, tal como la secuenciación, en
un método de transcripción inversa o análoga,
- dos secuencias de nucleótidos o peptídicas se
dicen equivalentes o derivadas una con relación a la otra, o con
relación a una secuencia de referencia, si de manera funcional los
biopolímeros correspondientes pueden tener la misma función, sin ser
idénticas, en relación con la aplicación o la utilización
considerada, o en la técnica en la que intervienen; son de hecho
equivalentes dos secuencias obtenidas por el hecho de la
variabilidad natural, específicamente mutación espontánea de la
especie a partir de la cual son identificadas o inducidas, igual que
dos secuencias homólogas, la homología siendo definida a
continuación,
- por "variabilidad", nos referimos a
cualquier modificación, espontánea o inducida de una secuencia,
especialmente por sustitución, y/o inserción, y/o deleción de
nucléotidos y/o de fragmentos de nucléotidos, y/o extensión y/o
acortamiento de la secuencia en por lo menos una de las
extremidades; una variabilidad no natural puede resultar ser de
técnicas de ingeniería genética utilizadas, por ejemplo por la
elección de los cebadores de síntesis degenerados o no, retenidos
para amplificar un ácido nucleico; esta variabilidad puede
traducirse por modificaciones de cualquier secuencia de inicio,
considerada como referencia, y pudiendo ser expresadas por un grado
de homología en relación con dicha secuencia de referencia,
- la homología caracteriza el grado de identidad
de dos fragmentos de nucleótidos o peptídicos comparados; se mide
por el porcentaje de identidad que es específicamente determinada
por comparación directa de secuencias de nucléotidos o peptídicas,
en relación con secuencias de nucléotidos o peptídicas de
referencia,
- todo fragmento de nucleótidos se llama
equivalente o derivado de un fragmento de referencia, si presenta
una secuencia de nucleótidos equivalente a la secuencia del
fragmento de referencia; de acuerdo con la definición anterior, son
de hecho equivalentes a un fragmento de nucleótidos de
referencia:
- (a)
- cualquier fragmento susceptible de hibridarse al menos parcialmente con el complemento del fragmento de referencia,
- (b)
- cualquier fragmento cuyo alineamiento con el fragmento de referencia conduce a poner en evidencia bases contiguas idénticas, en número más importante que con cualquier otro fragmento procediendo de otro grupo taxonómico,
- (c)
- cualquier fragmento resultando o pudiendo resultar de la variabilidad natural de la especie, a partir de la cual es obtenida,
- (d)
- cualquier fragmento pudiendo resultar de técnicas de ingeniería genética aplicadas al fragmento de referencia,
- (e)
- cualquier fragmento, conteniéndola menos ocho nucléotidos contiguos, codificando para un péptido homólogo o idéntico al péptido codificado por el fragmento de referencia,
- (f)
- cualquier fragmento diferente del fragmento de referencia, por inserción, deleción, sustitución de al menos un monómero, extensión; o acortamiento a por lo menos una de sus extremidades; por ejemplo, cualquier fragmento correspondiendo al fragmento de referencia, flanqueado por lo menos en uno de sus extremos por una secuencia de nucleótidos no codificando para un polipéptido,
- por polipéptido nos referimos especialmente a
todo péptido de al menos dos aminoácidos, específicamente
oligopéptido, proteína, extracto, separado, o sustancialmente
aislado o sintetizado, por la intervención del hombre,
específicamente los que se obtienen por síntesis química, o por
expresión en un organismo recombinante,
- por polipéptido codificado de manera parcial
por un fragmento de nucleótidos, nos referimos a un polipéptido
presentando al menos tres aminoácidos codificados por al menos nueve
monómeros contiguos incluido en el dicho fragmento de
nucleótidos,
- un aminoácido se dice análogo a otro
aminoácido, cuando sus características fisicoquímicas respectivas,
como la polaridad, la hidrofobicidad, y/o la alcalinidad, y/o
acidez, y/o neutralidad, son sensiblemente las mismas; de esta
manera, una leucina es análoga a una isoleucina.
- cualquier polipéptido se llama equivalente o
derivado de un polipéptido de referencia, si los polipéptidos
comparados tienen sensiblemente las mismas propiedades, y
específicamente las mismas propiedades antigénicas, inmunológicas,
enzimológicas y/o de reconocimiento molecular; es específicamente
equivalente a un polipéptido de referencia:
- (a)
- cualquier polipéptido poseyendo una secuencia de la que al menos un aminoácido ha sido sustituido por un aminoácido análogo,
- (b)
- cualquier polipéptido teniendo una secuencia peptídico equivalente, obtenida por variación natural o inducida del dicho polipéptido de referencia, y/o del fragmento de nucleótidos codificando para dicho polipéptido,
- (c)
- un mimotopo de dicho polipéptido de referencia,
- (d)
- cualquier polipéptido en la secuencia del cual uno o varios aminoácidos de la serie L se sustituyen por un aminoácido de la serie D, y viceversa,
- (e)
- cualquier polipéptido en la secuencia del cual se ha introducido una modificación des las cadenas laterales de los aminoácidos, tal como por ejemplo una acetilación de las funciones aminas, una carboxilación de las funciones tiol, una esterificación des las funciones carboxílicas,
- (f)
- cualquier polipéptido en la secuencia del cual uno o varios enlaces peptídicas han sido modificados, como por ejemplo enlaces carba, retro, inverso, retro-inverso, reducidas, y metilen-oxi,
- (g)
- cualquier polipéptido del que al menos un antígeno es reconocido por un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de referencia,
- el porcentaje de identidad caracterizando la
homología de dos fragmentos peptídicos comparados es de acuerdo con
la presente invención de al menos 50% y preferentemente de al menos
70%.
Dado que un virus poseyendo una actividad
enzimática transcriptasa inversa puede ser genéticamente
caracterizado tanto en forma de ARN como de ADN, se mencionará tanto
el ADN como el ARN viral para caracterizar las secuencias relativas
a un virus poseyendo una tal actividad transcriptasa inversa, dicho
MSRV-1 de acuerdo con la presente descripción.
Las formulaciones de orden utilizadas en las
presentes descripciones y las reivindicaciones, como las de
"primera secuencia de nucleótidos" no lo son para expresar un
orden particular sino para definir más claramente la invención.
Por detección de una sustancia o agente, nos
referimos más adelante tanto a una identificación como a una
cuantificación, o a una separación o aislamiento de dicha sustancia
o de dicho agente.
La invención se entenderá mejor con la lectura de
la descripción detallada que sigue, realizada con referencia a las
figuras anexadas en las que:
La Figura 1 representa la estructura general del
ADN proviral y el ARN genómico de MSRV-1.
La figura 2 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado CL6-5' (ID DE SEC Nº
112) y tres marcos de lectura potenciales en aminoácidos figurando
en la secuencia de nucleótidos.
La figura 3 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado CL6-3' (ID DE SEC Nº
114) y tres marcos de lectura potenciales en aminoácidos figurando
en la secuencia de nucleótidos.
La figura 4 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado C15 (ID DE SEC Nº 117) y tres marcos de
lectura potenciales en aminoácidos figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La figura 5 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado 5M6 (ID DE SEC Nº 120) y tres marcos de
lectura potenciales en aminoácidos figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La figura 6 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado CL2 (ID DE SEC Nº 130) y tres marcos de
lectura potenciales en aminoácidos figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La Figura 7 representa tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos expresadas por
pET28C-clon2 y figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La Figura 8 representa tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos expresados.
La figura 9 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado LB13 (ID DE SEC Nº 141) y tres marcos
de lectura potenciales en aminoácidos figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La figura 10 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado LA15 (ID DE SEC Nº 142) y tres marcos
de lectura potenciales en aminoácidos figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La figura 11 representa la secuencia de
nucleótidos del clon llamado LB16 (ID DE SEC Nº 124) y tres marcos
de lectura potenciales en aminoácidos figurando en la secuencia de
nucleótidos.
La figura 12 representa la actividad promotora
expresada en cpm/4 min de las secuencias U3R subclonadas a partir de
LTRs de orígenes diferentes en el plásmido PCAT3. PCAT3 significa
plásmido solo, PCAT-PH74 significa plásmido con clon
U3R endógena expresado en la placenta, PCAT-c16
significa plásmido con clon U3R amplificado en el ARN de un plasma
EM, PCAT-5M6 significa plásmido con región U3R
amplificada en el ADN celular, "sin plásmido" significa la
ausencia de plásmido en las pruebas.
La Figura 13 representa las secuencias MSRV1 env
y LTR3'. Las flechas horizontales indican el inicio de las regiones
env, U3 y R. En la región env: el péptido señal y la región
inmunosupresiva potencial están subrayadas, los sitios de
glicosilación potenciales están enmarcados y los sitios de escisión
potenciales se indican con flechas verticales. En la región U3R: el
elemento de regulación CAAT y la TATA Box están subrayadas, el sitio
"cap" y la señal de poliadenilación también están
indicadas.
La Figura 14 representa una región LTR5' (RU5)
con un sitio PBS (primer binding site) complementario al tARN Trp y
de un gen gag codificando para una proteína de alrededor de 487
aminoácidos. Los aminoácidos conservados en la nucleocápside están
subrayados dos veces. Los aminoácidos que definen la región de más
fuerte homología en la cápside aparecen en negrita y están
subrayados dos veces. Las / en la secuencia de aminoácidos indican
variaciones observadas según los clones y en la secuencia de
nucleótidos indican saltos de marco en algunos clones. Las regiones
enmarcadas corresponden a epítopos identificados por análisis
peptídico de la región C-terminal.
La Figura 15 representa la región integrasa de
MSRV1, la secuencia de nucleótidos y la secuencia en aminoácidos
deducida de la región integrasa correspondiendo al clon
87-23. En la Figura 15 // significa un salto de
marco suprimido para restituir el ORF potencial. Las letras en
negrita subrayadas representan los aminoácidos conservados de las
integrasas retrovirales.
La Figura 16 describe las secuencias de
nucléotidos y peptídicas del clon B13 (idéntico al clon FBd13
descrito en preguntas anteriores) con indicación de los ORFs y de
codones stop representados por un punto. La región subrayada y en
negrita representa el dominio inmunosupresor potencial. El dominio
solo subrayado representa el inicio del
LTR3'.
LTR3'.
Una 3'RACE ha sido efectuada sobre el ARN total
extraído del plasma de un paciente afectado por la EM. Un plasma
indicador sano, tratado en las mismas condiciones, ha sido utilizado
como control negativo. La síntesis de cDNA ha sido realizada con un
cebador oligo dT identificado por ID DE SEC Nº 68 (5' GAC TCG CTG
CAG ATC GAT TTT TTT TTT TTT TTT T 3') y la transcriptasa inversa
"Expand^{TM} RT" de Boehringer de acuerdo con las condiciones
recomendadas por la sociedad: Una PCR ha sido efectuada con la
enzima Klentaq (Clontech) bajo las siguientes condiciones: 94ºC 5
min después 93ºC 1 min, 58ºC 1 min, 68ºC 3 min durante 40 ciclos y
68ºC durante 8 min, con un volumen de reacción final de 50
\mul.
Cebadores utilizados para la PCR:
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
69
5' GCC ATC AAG CCA CCC AAG AAC TCT TAA CTT 3'
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
68
Una segunda PCR llamada "semi anidada" ha
sido realizada con un cebador 5' situado en el interior de la región
ya amplificada. Esta segunda PCR ha sido efectuada bajo las mismas
condiciones experimentales que las que fueron utilizadas durante la
primera PCR, utilizando 10 \mul del producto de amplificación
resultante de la primera PCR.
Cebadores utilizados para la PCR
semi-nidada:
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
70
5' CCA ATA GCC AGA CCA TTA TAT ACA CTA ATT
3';
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
68
Los cebadores ID DE SEC Nº 69 y ID DE SEC Nº 70
son específicos de la región pol de MSRV-1.
Un producto de amplificación de 1,9Kb ha sido
obtenido del plasma del paciente afectado por la EM. El fragmento
correspondiente no ha sido observado en el plasma de indicador sano.
Este producto de amplificación ha sido clonado de la manera
siguiente:
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda de un kit TA Cloning®: Los 2 \mul de
solución de ADN han sido mezclados con 5 \mul de agua destilada
estéril, 1 \mul de un tampón de ligación 10 veces concentrado
"10X LIGATION BUFFER", 2 \mul de "pCR^{TM} VECTOR" (25
ng/ml) y 1 \mul de "T4 DNA LIGASA". Esta mezcla se incubó una
noche a 12ºC. Las etapas siguientes han sido realizadas conforme con
las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Al final del
proceso, las colonias blancas de bacterias recombinantes (white) han
sido repicadas de nuevo para ser cultivadas y permitir la extracción
de plásmidos incorporados de acuerdo con el proceso llamado
"miniprep". La preparación de plásmido de cada colonia
recombinante ha sido cortada por una enzima de restricción apropiada
y analizada sobre gel del agarosa. Los plásmidos portadores de
inserto detectado bajo luz UV después de ser marcado en el gel con
bromuro de etidio, han sido seleccionados para la secuenciación del
inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del
promotor Sp6 presente sobre el plásmido del TA Cloning kit®: La
reacción preliminar a la secuenciación ha sido después efectuada de
acuerdo con el método recomendado por la utilización del kit de
secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS,
DyeDeoxy^{TM} Terminador" (Applied Biosystems, ref. 402119) y
la secuenciación automático ha sido realizado con los aparatos 373 A
377 Applied Biosystems, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
El clon obtenido, contiene una región
CL6-5' codificando para el extremo N Terminal de la
integrasa y una región CL6-3', correspondiendo a la
región 3' Terminal de MSRV-1 y permitiendo definir
el final de la cubierta (234 pb) y las regiones U3, R (401 pb) del
retrovirus MSRV1.
La región correspondiente al extremo N Terminal
de la integrasa esta representada por su secuencia de nucleótidos
(ID DE SEC Nº 112) en la figura 2. Los tres marcos de lectura
potenciales están representadas por su secuencia de aminoácidos bajo
la secuencia de nucleótidos, y la secuencia de aminoácidos del
extremo N-terminal de la integrasa se identifica por
ID DE SEC Nº 113.
La región Cl6-3' esta
representada por su secuencia de nucleótidos (ID DE SEC Nº 114) en
la figura 3. Los tres marcos de lectura potenciales están
representados por su secuencia de nucleótidos. Una secuencia de
aminoácidos correspondiendo al extremo C-terminal de
la proteína env de MSRV-1 se identifica por ID DE
SEC Nº 115.
Para evaluar la actividad promotora del LTR
obtenido a partir del clon 6 (cl6) una prueba de actividad promotora
utilizando la enzima CAT (cloramfenicol acetil transferasa) ha sido
efectuada con la región U3R correspondiente. Paralelamente un clon
conteniendo la misma región U3R de ARN retroviral endógeno expresado
en la placenta normal (PH74) y un clon (5M6) procediendo de ADN han
sido experimentadas. El resultado presentado en la figura 12
demuestra una muy fuerte actividad promotora del LTR resultando de
la plasma EM (CL6) y una actividad significativamente más feble con
las secuencias de origen endógeno no EM.
Una RT-PCR ha sido efectuada
sobre ARN total extraído de viriones concentrados por
ultracentrifugación a partir de un sobrenadante de cultivo de
sinoviocitos procediendo de un paciente PR. La síntesis de cDNA ha
sido realizada con un cebador oligo dT y la transcriptasa inversa
"Expand^{TM} RT" de Boehringer de acuerdo con las condiciones
recomendadas por el fabricante. Una PCR ha sido efectuada con
Expand^{TM} Long Template PCR System (Boehringer) bajo las
condiciones siguientes: 94ºC 5 min y 93ºC 1 min, 60ºC 1 min, 68ºC 3
min durante 40 ciclos y 68ºC durante 8 min y con un volumen que
reaccionario final de 50 \mul.
Cebadores utilizados para la PCR:
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº :
69
5' GCC ATC AAG CCA CCC AAG AAC TCT TAA CTT
3';
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
116
5' TGG GGT TCC ATT TGT AAG ACC ATC TGT AGC TT
3'
Una segunda PCR llamada
"semi-anidada" ha sido realizada con un cebador
5' situado dentro de la región ya amplificada. Esta segunda PCR ha
sido efectuada bajo las mismas condiciones experimentales que las
que se utilizaron durante la primera PCR (solo que 30 ciclos fueron
realizados en vez de 40, utilizando 10 \mul del producto de
amplificación resultando de la primera PCR.
Cebadores utilizados para la PCR
semi-nidada:
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
70
5' CCA ATA GCC AGA CCA TTA TAT ACA CTA ATT 3'
- cebador 3', identificado por SECID Nº 116
Los cebadores ID DE SEC Nº 69 y ID DE SEC Nº 70
son específicos de la región pol de MSRV-1. El
cebador ID DE SEC Nº 116 es específico de la secuencia FBd13
(también llamada B13) y esta localizada en la región env conservada
entre les oncoretrovirus.
Un producto de amplificación de 1932 pb ha sido
obtenido y clonado de la manera siguiente:
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®. Las diferentes etapas han
sido realizadas conforme con las instrucciones del kit TA Cloning®
(Invitrogen). Al fin del proceso, las colonias blancas de bacterias
recombinantes (white) han sido picadas de nuevo para ser cultivadas
y permitir la extracción de plásmidos incorporados de acuerdo con el
procedimiento llamado "miniprep". La preparación de plásmido de
cada colonia recombinante ha sido cortada por una enzima de
restricción apropiada y analizada sobre gel del agarosa. Los
plásmidos poseyendo un inserto detectado bajo luz UV después de ser
marcada con gel al bromuro de etidio, han sido seleccionados para la
secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador
complementario del promotor SP6 presente sobre el plásmido de la
clonación del TA cloning kit®. La reacción preliminar a la
secuenciación ha sido efectuada de acuerdo con el método recomendado
para la utilización del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready
Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied
Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automático ha sido
realizado sobre las máquinas 373 A y 377 de Applied Biosystems, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El clon C15 obtenido, contiene una región
correspondiente a la región de la capa de MSRV-1, de
1481 pb.
La región env del clon C15 esta representada por
su secuencia de nucleótidos (ID DE SEC Nº 117) en la figura 5. Los
tres marcos de lectura potenciales de este clon están presentadas
por su secuencia de aminoácidos bajo la secuencia de nucleótidos. El
marco de lectura correspondiendo a una proteína env estructural
MSRV-1 se identifica por ID DE SEC Nº 118.
A partir de las secuencias definidas que
provienen de los clones cl6 y C15, ha podido ser efectuada una
construcción plasmídica codificando para una cubierta completa con
el LTR3'a continuación, como se presentó en la figura 13 con el
marco de lectura correspondiente.
Una PCR monodireccional ha sido efectuada sobre
ADN extracto de linfocitos B inmortalizados en cultivos de un
paciente PR. La PCR ha sido efectuada con el Expand^{TM} Long
Template PCR System (Boehringer) bajo las condiciones siguientes:
94ºC 3 min y 93ºC 1 min, 60ºC 1 min, 68ºC 3 min durante 10 ciclos,
después 93ºC 1 min, 60ºC 1 min con 15 sec de extensión a cada ciclo,
68ºC 3 min durante 35 ciclos y 68ºC durante 7 min con un volumen que
tiene una reacción final de 50 \mul.
El cebador utilizado para la PCR identificada por
ID DE SEC Nº 119 es 5' TCA AAA TCG AAG AGC TTT AGA CTT GCT AAC CG
3';
Los cebadores ID DE SEC Nº 119 son específico de
la región env del Clon C15.
Un producto de amplificación de 1673 pb ha sido
obtenido y clonado de la manera siguiente:
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®.Las diferentes etapas han
sido realizadas conforme con las instrucciones del kit TA Cloning®
(Invitrogen. Al final del proceso, las colonias blancas de bacterias
recombinantes (white) han sido picadas de nuevo para ser cultivadas
y permitir la extracción de plásmidos incorporados de acuerdo con el
procedimiento llamado "miniprep". La preparación de plásmido de
cada colonia recombinante ha sido cortada por una enzima de
restricción apropiada y analizada sobre gel del agarosa. Los
plásmidos poseyendo un inserto detectado bajo luz UV después de ser
marcado el gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la
secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador
complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de la
clonación del TA cloning kit®. La reacción preliminar a la
secuenciación ha sido efectuada de acuerdo con el método recomendado
para la utilización del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready
Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied
Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automático ha sido
realizado sobre las máquinas 373 A y 377 Applied Biosystems, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El clon 5M6 obtenido, contiene una región
correspondiente a la región 3'de la capa de MSRV-1,
de 492 pb con las regiones U3,R y U5 (837 pb) de
MSRV-1 a continuación.
El clon 5M6 es representado por su secuencia de
nucleótidos (ID DE SEC Nº 120) en la figura 5. Las tres marcos de
lectura potenciales de este clon se representan por su secuencia
aminoácido bajo la secuencia de nucleótidos. La trama de lectura
corresponde a la extremidad C-terminal de la
proteína env MSRV-1 se identifica por ID DE SEC Nº
121.
Una RT-PCR ha sido efectuada
sobre el ADN total tratado a la DNAsaI y extraído a partir de un
plexo coroideo procediendo de un paciente afectado por la EM. La
síntesis de cDNA ha sido realizada con un cebador oligo dT y la
transcriptasa inversa "Expand ^{TM} RT" de Boehringer de
acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. Un
control "no RT" ha sido efectuado paralelamente sobre el mismo
material. Una PCR ha sido efectuada con la Taq polimerasa (Perkin
Elmer) bajo las condiciones siguientes: 95ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC
2 min durante 35 ciclos y 72ºC durante 8 min y con un volumen de
reacción final de 50 \mul.
Cebadores utilizados para la PCR:
-cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
122
5' GGC ATT GAT AGC ACC CAT CAG 3' ;
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
123
5' CAT GTC ACC AGG GTG GAA TAG 3'
El cebador ID DE SEC Nº 122 es específico de la
región pol de MSRV-1 y más precisamente similar a la
región integrasa descrita anteriormente. El cebador ID DE SEC Nº 123
ha sido definido sobre secuencias de clones obtenidos durante las
pruebas preliminares.
Un producto de amplificación de al menos 760 pb
ha sido obtenido únicamente en la prueba con RT y ha sido clonado de
la manera siguiente:
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®. Las diferentes etapas han
sido realizadas conforme a las instrucciones del kit TA Cloning®
(Invitrogen). Al final del proceso, las colonias blancas de
bacterias recombinantes (white) han sido picadas de nuevo para ser
cultivadas y permitir la extracción de plásmidos incorporados de
acuerdo con el procedimiento llamado "miniprep". La preparación
de plásmido de cada colonia recombinante ha sido cortada por una
enzima de restricción apropiada y analizada sobre gel de agarosa.
Los plásmidos poseyendo un inserto detectado bajo luz UV después de
ser marcado el gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados
para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un
cebador complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de
la clonación del TA cloning kit®. La reacción preliminar a la
secuenciación ha sido efectuada de acuerdo con el método recomendado
para la utilización del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready
Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied
Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido
realizado con las máquinas 373 A y 377 de Applied Biosystems, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El clon LB16 obtenido, contiene las secuencias
que corresponde a la integrasa. La secuencia de nucleótidos de este
clon es identificada por ID DE SEC Nº 124 en la figura 11, tres
marcos de lecturas están determinados.
Una amplificación por PCR ha sido efectuada sobre
ADN total extraído a partir de 100 \mul de plasma de un paciente
afectado por la EM. Una muestra de agua, tratada bajo las mismas
condiciones, ha sido utilizada como control negativo. La síntesis de
cDNA ha sido realizada con 300 pmol de un cebador aleatorio
(GIBCO-BRL, Francia) y la transcriptasa inversa
"Expand RT" (BOEHRINGER MANNHEIM, Francia) de acuerdo con las
condiciones recomendadas por el fabricante. Una amplificación por
PCR ("polymerase chain reaction") ha sido efectuada con la
enzima Taq polimerasa (Perkin Elmer, Francia) utilizando 10 \mul
de cDNA bajo las condiciones siguientes: 94ºC 2 min, 55ºC 1 min,
72ºC 2 min y 94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 2 min durante 30 ciclos y
72ºC durante 7 min y con un volumen de reacción final de 50
\mul.
Cebadores utilizados para la amplificación por
PCR:
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
126
5' CGG ACA TCC AAA GTG ATG GGA AAC G 3' ;
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
127
5' GGA CAG GAA AGT AAG ACT GAG AAG GC 3'
Una segunda amplificación por PCR llamada
"semi-anidada" ha sido realizada con un
cebador 5' situado dentro de la región ya amplificada. Esta segunda
PCR ha sido efectuada bajo las mismas condiciones experimentales que
las que se utilizaron durante la primera PCR, utilizando 10 \mul
del producto de amplificación resultante de la primera PCR.
Cebadores utilizados para la amplificación por
PCR semi-anidada:
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
128
5' CCT AGA ACG TAT TCT GGA GAA TTG GG 3' ;
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
129
5' TGG CTC TCA ATG GTC AAA CAT ACC CG 3'
Los cebadores ID DE SEC Nº y ID DE SEC Nº son
específicos de la región pol, clon G+E+A, más específicamente la
región E: posición de nucleótidos del nº 423 al nº 448. Los
cebadores utilizados en la región 5' han sido definidos sobre
secuencias de clones obtenidos durante pruebas preliminares.
Un producto de amplificación de 1511 pb ha sido
obtenido a partir de el ARN extracto del plasma del paciente
afectado por la EM.
El fragmento correspondiente no se observó para
el control con agua. Este producto de amplificación ha sido clonado
de la manera siguiente.
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®. Los 2 \mul de solución
de ADN han sido mezclados con 5 \mul de agua destilada estéril, 1
\mul de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION
DNA BUFFER", 2 \mul de "pCR^{TM} VECTOR" (25 ng/ml) y 1
\mul de "T4 DNA LIGASA". Esta mezcla ha se incubó una noche a
14ºC. Las etapas siguientes han sido realizadas conforme con las
instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Esta mezcla se
extendió después de la transformación de la ligación en las
bacterias E. coli INV\alphaF'. Al final del proceso, las
colonias blancas de bacterias recombinantes han sido picadas de
nuevo para ser cultivadas y permitir la extracción de plásmidos
incorporados de acuerdo con el procedimiento llamado
"minipreparación de ADN" (17). La preparación de plásmido de
cada colonia recombinante ha sido cortada por la enzima de
restricción Eco RI y analizada sobre gel de agarosa. Los
plásmidos poseyendo un inserto detectado bajo luz UV después de ser
marcada el gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la
secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador
complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de la
clonación del TA cloning kit®. La reacción preliminar a la
secuenciación ha sido luego efectuada de acuerdo con el método
recomendado para la utilización del kit de secuenciación
"PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM}
Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación
automático ha sido realizado sobre las máquinas 373 A y 377 de
Applied Biosystems, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
El clon obtenido, llamado CL2, contiene una
región C-terminal similar a la región 5' terminal
de los clones G+E+A de MSRV-1, que permite definir
la región C-terminal del genoma gag y una nueva
región que corresponde a la región N-terminal del
genoma gag MSRV-1.
CL2 permite definir una región de 1511 pb
presentando una fase abierta de lectura dentro de la región
N-terminal de 1077 pb codificante para 359
aminoácidos y una fase no abierta de lectura, de 454 pb, que
corresponde a la región C-terminal del genoma gag
MSRV-1.
La secuencia de nucleótidos de CL2 se identifica
por ID DE SEC Nº 13. Esta representado en la figura 6, con los
marcos de lectura potenciales en aminoácido.
El fragmento de 1077 pb de CL2 codificando para
359 aminoácidos ha sido amplificado por PCR con la enzima Pwo
(5 U/\mul) (Boehringer Mannheim, Francia) utilizando 1 \mul
de la minipreparación del ADN del clon 2 bajo las condiciones
siguientes: 95ºC 1 min, 60ºC 1 min, 72ºC 2 min durante 25 ciclos y
con un volumen de reacción final de 50 \mul con la ayuda de los
cebadores:
- cebador 5' (Bam HI), identificado por ID
DE SEC Nº 132
5' TGC TGG AAT TCG GGA TCC TAG AAC GTA TTC 3' (30
mer) y
- cebador 3' (Hind III), identificado por
ID DE SEC Nº 133
5' AGT TCT GCT CCG AAG CTT AGG CAG ACT TTT 3' (30
mer)
correspondiendo, respectivamente, a la secuencia
de nucleótidos del clon 2 en posición -9 a 21 y 1066 a 1095.
El fragmento obtenido después de la PCR, ha sido
linearizado por Bam HI y Hind III y subclonado en los
vectores de expresión pET28C y pET21C (NOVAGEN) linearizado por
Bam HI y Hind III. La secuenciación del ADN del
fragmento de 1077pb del clon 2 en los dos vectores de expresión ha
sido realizado de acuerdo con el método recomendado para la
utilización del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction
Amplitaq®FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems,
ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido realizado sobre
las máquinas 373 A y 377 de Applied Biosystems, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
La expresión de la secuencia de nucleótidos del
fragmento de 1077 pb del clon 2 por los vectores de expresión pET28C
y pET21C se identifican respectivamente por ID DE SEC Nº 135 y ID DE
SEC Nº 137.
Las construcciones pET28C-clon 2
(1077 pb) y pET21C-clon 2 (1077 pb) sintetizan,
dentro de la cepa bacteriana BL21 (DE3), una proteína en fusión N- y
C-terminal para el vector pET28C y
C-terminal para el vector pET21C con 6 Histidinas,
de masa molecular aparente de 45 kDa, puesta en evidencia por
electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS-PAGE
(SDS = Dodecyl Sulfato de Sodio) (Laemmli, 1970 (1)). La reactividad
de la proteína ha sido revelado en relación con un anticuerpo
monoclonal anti-histidina (DIANOVA) por la técnica
de Western Blot (Towbin et al., 1979 (2)).
Las proteínas recombinantes
pET28C-clon 2 (1077 pb) y
pET21C-clon 2 (1077 pb) han sido visualizadas en
SDS-PAGE en la fracción insoluble después de la
digestión enzimática de extractos bacterianos con 50 \mul de
lisozimas (10 mg/ml) y lisis por ultrasonidos.
Las propiedades antigénicas de los antígenos
recombinantes pET28C-clon 2 (1077 pb) y
pET21C-clon 2 (1077 pb) han sido testadas por
Western Blot () después de la solubilización del pellet bacteriano
con 2% SDS y 50 mM \beta-mercaptoetanol. Después
de la incubación con los sueros de pacientes afectados por la
esclerosis múltiple, los sueros de los indicadores neurológicos y
los sueros de indicadores de centros de transfusiones sanguíneas
(CTS), los inmunocomplejos han sido detectados con la ayuda de un
suero de cabra anti-IgG y anti-IgM
humanas, acoplados a la fosfatasa alcalina.
Los resultados están presentados en la tabla que
sigue.
| Enfermedad | Número de individuos testados | Número de individuos positivos |
| EM | 15 | 6 |
| 2 (+++), 2 (++), 2 (+) | ||
| Indicadores neurológicos | 2 | 1 (+++) |
| Indicadores sanos (CTS) | 22 | 1 (+/-) |
| (a) las tiras conteniendo 1,5 \mug de antígeno recombinante pET-gag clon 2 (1077 pb) presentan una reactividad | ||
| contra sueros diluidos al 1/100. |
La interpretación de Western Blot se basa sobre
la presencia o la ausencia de una banda pET-gag clon
2 (1077 pb) especifica sobre las tiras. Controles positivos y
negativos se incluyen en cada experimento.
Estos resultados muestran que, en las condiciones
técnicas utilizadas, mas o menos 40% de los sueros humanos afectados
por la esclerosis múltiple testados reaccionan con las proteínas
recombinantes pET28C-clon 2 (1077 pb) y
pET21C-clon 2 (1077 pb). Se observó una reactividad
en un indicador neurológico y es interesante apuntar que los ARN
extraídos a partir de este suero, después de la etapa de
transcriptasa inversa, se amplifican también por PCR en la región
pol. Esto sugiere que personas que no han desarrollado una EM pueden
también incubar y expresar este virus. Por el contrario, un
indicador (donante CTS) aparentemente sano, posee anticuerpos
anti-gag (clon 2, 1077 pb). Lo cual es compatible
con una inmunidad adquirida contra MRSV-1 fuera de
una enfermedad autoinmune asociada declarada.
Una RT-PCR
("reverse-transcriptase-polymerase
chain reaction") ha sido efectuada a partir del ARN total
extraído de viriones, procediendo de sobrenadantes de células
limfocitarias B de pacientes afectados por la esclerosis múltiple,
concentrados por ultracentrifugaciones. La síntesis de cDNA ha sido
realizada con un cebador específico SEC Nº XXX y la transcriptasa
inversa "Expand^{TM} RT" de BOEHRINGER MANNHEIM de acuerdo
con las condiciones recomendadas por el fabricante.
Cebador utilizado para la síntesis del cDNA,
identificado por ID DE SEC Nº 138:
5' CTT GGA GGG TGC ATA ACC AGG GAA T 3'
Una amplificación por PCR ha sido realizada con
la Taq polimerasa (perkin Elmer, Francia) bajo las
condiciones siguientes: 94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 2 min durante
35 ciclos y 72ºC durante 7 min y con un volumen de reacción final de
100 \mul.
Cebadores utilizados para la amplificación por
PCR:
- cebador 5', identificado por SECID Nº 139
5' TGT CCG CTG TGC TCC TGA TC 3'
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
138
5' CTT GGA GGG TGC ATA ACC AGG GAA T 3'
Una segunda amplificación por PCR llamada
"semi-anidada" ha sido realizada con un cebador
3' situado dentro de la región ya amplificada. Esta segunda
amplificación ha sido realizada bajo las mismas condiciones
experimentales que las que se utilizaron durante la primera
amplificación, utilizando 10 \mul del producto de amplificación
resultante de la primera PCR.
Cebadores utilizados para la amplificación por
PCR "semi-anidada":
- cebador 5', identificado por ID DE SEC Nº
139
5' TGT CCG CTG TGC TCC TGA TC 3'
- cebador 3', identificado por ID DE SEC Nº
140
5' CTA TGT CCT TTT GGA CTG TTT GGG T 3'
Los cebadores ID DE SEC Nº 138 y ID DE SEC Nº 140
son específicos de la región gag, clon 2 posición de nucleótidos nº
373-397 y nº 433-456. Los cebadores
utilizados en la región 5' han sido definidos sobre secuencias de
los clones obtenidos durante pruebas preliminares.
Un producto de amplificación de 764 pb ha sido
obtenido y clonado de la manera siguiente:
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda del kit TA Cloning^{TM}. Los 2 \mul de
solución de ADN han sido mezclados con 5 \mul de agua destilada
estéril, 1 \mul de un tampón de ligación 10 veces concentrado
"10X LIGATION BUFFER", 2 \mul de "pCR^{TM} VECTOR" (25
ng/ml) y 1 \mul de "T4 DNA LIGASA". Esta mezcla se incubó una
noche a 14ºC. Las etapas siguientes han sido realizadas conforme con
las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Esta mezcla se
extendió después de la transformación de la ligación en las
bacterias E. coli INV\alphaF'. Al final del proceso, las
colonias blancas de bacterias recombinantes han sido picadas de
nuevo para ser cultivadas y permitir la extracción de plásmidos
incorporados de acuerdo con el procedimiento llamado
"minipreparación de ADN" (17). La preparación de plásmido de
cada colonia recombinante ha sido cortada por la enzima de
restricción Eco RI y analizada sobre gel de agarosa. Los
plásmidos poseyendo un inserto detectado bajo luz UV después de ser
marcado el gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la
secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador
complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de la
clonación del TA cloning kit®. La reacción preliminar a la
secuenciación ha sido luego efectuada de acuerdo con el método
recomendado para la utilización del kit de secuenciación
"PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM}
Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación
automática ha sido realizada con las máquinas 373 A y 377 de Applied
Biosystems, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El clon LB13 obtenido contiene una región
N-terminal del genoma gag MSRV-1
homóloga al clon 2 y un LTR que corresponde a una parte de la región
U5. Entre la región U5 y gag un lugar de fijación para los ARN de
transferencia, el PBS "primer binding site" ha sido
identificado.
La secuenciación de nucleótidos del fragmento de
764 pb del clon LB13 en el plásmido "pCR^{TM} VECTOR" esta
representado en el identificador ID DE SEC Nº 141.
El lugar de fijación para los ARN de
transferencia, presentando una secuencia de tipo PBS triptófano, ha
sido identificado en posición de nucleótidos nº
342-359 del clon LB13.
Ya que este mismo PBS se ha vuelto a encontrar en
las copias endógenas homólogas a MSRV-1, la familia
endógena así definida se llamará de ahora en adelante HERV W, de
acuerdo con la nomenclatura propuesta para las familias de
retrovirus endógenos (W=Triptófano).
Una ORF corta de más o menos 65 aminoácidos se ha
encontrado en la región U5 del LTR 5' del clon LB13.
Secuencia del ORF
PMASNRAITLTAWSKIPFLGIRETKNPRSENTRLATMLEAAHHHFGSSPPLSWELWEQGPQVTIW.
La secuencia de nucleótidos correspondiente que
empieza con un codón ATG es susceptible de ser expresado dentro de
un ADN subgenómico a partir de un LTR proviral (U3RU5).
Otro clon, denominado LA15, ha sido obtenido a
partir del ARN total extraído de viriones concentrados por
ultracentrifugación a partir de un sobrenadante de cultivo de
sinoviocitos derivados de un paciente que sufre poliartritis
reumatoide. La estrategia de amplificación y clonaje del clon LA15
es exactamente la misma que se ha utilizado para el clon LB13.
La secuencia de nucleótidos del clon LA15 que
está representada dentro del identificador ID DE SEC Nº 142 es muy
similar a la del clon LB13. Esto sugiere que el retrovirus
MSVR-1 detectado en la esclerosis múltiple presenta
unas secuencias similares a las encontradas en el caso de la
poliartritis reumatoide.
Los clones CL2 y LB13 se han descrito en los
ejemplos precedentes. El clon LB15 se ha obtenido al utilizar la
secuencia R del LTR del clon C16 para definir un cebador en 5' y los
cebadores anti-sentido utilizados son los mismos que
para el clon LB13. El clon CL17 se ha obtenido por
RT-PCR anidada al utilizar los cebadores
siguientes:
5'-TCATGCAACTGCACTCTTCTGGTCCG-3'
\hskip0.4cm(sentido)
5'-TCTTGCACTAACCTCCACTGTCCGTTCC-3'
\hskip0.4cm(anti-sentido)
5'-ATCCCCCAGTAACAATTTGGTGACCACG-3'
\hskip0.4cm(sentido)
5'-TCGGGTCTAAGAGGGTACTTCCTTTGGTACC-3'
\hskip0.4cm(anti-sentido)
El clon LB15 se ha obtenido a partir de viriones
obtenidos por cultivo de células de EM. El clon LB17 se ha obtenido
a partir del cultivo de plasma de paciente EM.
Los clones superpuestos/que se solapan pueden
reconstruir una secuencia RU5-gag con una ORF
potencial dentro del gen GAG, mostrados en la figura 14.
La región correspondiente a la integrasa se ha
amplificado y clonado a partir de plasma de EM utilizando
RT-PCR semi anidado con los cebadores siguientes
situados dentro de las regiones pol y env de
MSRV1.
Dentro de la región pol:
5'-TTACGCAGGTCTCAGGGATGAGCTT-3'
\hskip0.4cm(sin-PCR primario)
5'-CGGCAGTAGCAGTCTTAGTATCTGAAGCAGTTA-3'
\hskip0.4cm(sin-PCR secundario)
Dentro de la región env:
5'GGTACGGAGGGTTTCATGTAGTTTTGAG-3'
\hskip0.4cm(PCR anti sentido primario y secundario)
El clon amplificado comporta 774pb dentro de la
región pol/RT, toda la región integrasa (1197pb) y el inicio de la
región env (480pb). En la figura 15 se muestra la secuencia
de nucleótidos correspondiente a la región integrasa y la traducción
en aminoácidos del ORF potencial.
Las secuencias relacionadas con ERV9 se han
encontrado en proporción minoritaria dentro de las preparaciones de
virión derivadas del EM en relación con las secuencias MSRV1. Se ha
descrito la existencia de fenómenos de
co-encapsidación de secuencias endógenas
filogenéticamente cercanas dentro de las partículas retrovirales
producidas por una cepa replicativa. De manera sorprendente, una
región de ARN que comprende un inicio ORF dentro de la sección 3' de
env continuándose potencialmente dentro del LTR3' ha sido
encontrada reiteradamente dentro de diferentes muestras de EM. Con
el fin de precisar la existencia de una ORF, se ha realizado ensayos
de transcripción-traducción que han mostrado la
realidad de una ORF env que contiene cualquier segmento
transmembrana (TM) y se termina en el inicio del LTR putativo. Sin
embargo, una trama adicional (ORFX) sigue y continúa dentro del
LTR3'. Los dos productos de expresión se han visualizado en sus ORF
respectivas y han sido subclonados. La figura 16 representa las
secuencias de nucleótidos y peptídicas del clon B13 anteriormente
descrito al precisar las ORF dentro de la región env truncado
y dentro del LTR putativo. La presencia de tales ARN puede ser un
original de recombinaciones con la cepa replicativa, y por
consiguiente, generar las cepas de patogenicidad modificada.
(1) Laemli U. K. Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature. (1970). 227:
680-685.
(2) Towbin H., Staehelin T. &
Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some
applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1979).
76: 4350-4354.
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCGCTGC AGATCGATTT TTTTTTTTTT TTTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 310 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 112:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 103 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 113:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 114:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 115:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGGTTCCA TTTGTAAGAC CATCTGTAGC TT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1481 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 493 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAAAATCGA AGAGCTTTAG ACTTGCTAAC CG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1329 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 162 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCATTGATA GCACCCATCA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGTCACCA GGGTGGAATA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 758 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 124:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 126:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGACATCCA AAGTGATGGG AAACG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 127:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACAGGAAA GTAAGACTGA GAAGGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 128:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTAGAACGT ATTCTGGAGA ATTGGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCTCTCAA TGGTCAAACA TACCCG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1511 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 130:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 131:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 352 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 131
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 132:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 132:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTGGAATT CGGGATCCTA GAACGTATTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 133:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 133:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTCTGCTC CGAAGCTTAG GCAGACTTTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 135:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 398 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 135:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 137:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 378 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 138:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 138:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGGAGGGT GCATAACCAG GGAAT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 139:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 139:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCCGCTGT GCTCCTGATC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 140:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 140:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATGTCCTT TTGGACTGTT TGGGT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 141:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 764 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 141:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC Nº 142:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 800 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº 142:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Material nucleico, en estado aislado o
purificado, comprendiendo una secuencia de nucleótidos seleccionada
del grupo compuesto por (i) las secuencias ID DE SEC Nº 114, ID DE
SEC Nº 117, ID DE SEC Nº 120; (ii) las secuencias complementarias de
las secuencias (i); y (iii) las secuencias equivalentes a las
secuencias de (i) o (ii) presentando una sucesión de 100 monómeros
contiguos con por lo menos un 50% de homología con las secuencias
(i) y (ii) respectivamente, siendo diferente dicho material nucleico
de la secuencia HASAC64 del clon humano RG083M05 accesible sobre la
base del EMBL dado, bajo el número AC000064.
2. Material nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho compuesto
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo (iii)
de las secuencias equivalentes a las secuencias (i) o (ii)
presentando una sucesión de 100 monómeros contiguos, con menos de un
70% de homología con las secuencias de (i) o (ii),
respectivamente.
3. Material nucleico, en estado aislado o
purificado, que codifica para el polipéptido presentando una
sucesión contigua de al menos 30 aminoácidos, con al menos un 50% de
homología con una secuencia peptídica seleccionada del grupo
compuesto por ID DE SEC Nº 115, ID DE SEC Nº 118, ID DE SEC Nº 121,
siendo dicho material nucleico diferente de la secuencia HSAC64 del
clon humano RG083M05 accesible sobre la base de dicho EMBL, bajo el
número AC000064.
4. Material nucleico de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado por codificar para un
polipéptido, presentando una sucesión contigua de al menos 30
aminoácidos, con por lo menos un 70% de homología, con una secuencia
peptídica seleccionada del grupo compuesto por la ID DE SEC Nº 115,
ID DE SEC Nº 118, ID DE SEC Nº 121.
5. Material nucleico retroviral, donde el gen
env comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del
grupo compuesto por la ID DE SEC Nº 114, ID DE SEC Nº 117, y ID DE
SEC Nº 120; así como sus secuencias complementarias.
6. Material nucleico retroviral, donde el gen
env comprende una secuencia de nucleótidos que comienza con
un nucleótido 1 de ID DE SEC Nº 117 y finaliza con un nucleótido 223
de ID DE SEC Nº 114.
7. Material nucleico retroviral, donde el gen
env codifica para un polipéptido presentando una sucesión
contigua de al menos 30 aminoácidos, con por lo menos un 70% de
homología con la secuencia ID DE SEC Nº 118.
8. Material nucleico de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizada porque su gen env
codifica para un polipéptido que presenta una sucesión contigua de
al menos 30 aminoácidos, con por lo menos un 50% de homología, con
la secuencia ID DE SEC Nº 118.
9. Material nucleico retroviral donde la región
U3R de LTR 3' comprende una secuencia nucleotídica que termina con
el nucleótido 617 de la ID DE SEC Nº 114.
10. Material nucleico retroviral donde la región
RU5 de LTR 5' comprende una secuencia de nucleótidos que empieza con
el nucleótido 755 de la ID DE SEC Nº 120.
11. Material nucleico retroviral que comprende
una secuencia que comienza con el nucleótido 755 de la ID DE SEC Nº
120 y que finaliza con el nucleótido 617 de la ID DE SEC Nº 114.
12. Material nucleico retroviral de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
por que está asociado a por lo menos una enfermedad autoinmune
seleccionada entre la esclerosis múltiple y la poliartritis
reumatoide.
13. Un fragmento de nucleótidos que comprenda una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo compuesto por (i)
las secuencias ID DE SEC Nº 114, ID DE SEC Nº 117, ID DE SEC Nº 120;
(ii) las secuencias complementarias de las secuencias (i) o (ii) que
presentan una sucesión de 100 monómeros contiguos, con al menos un
50% de homología con las secuencias (i) o (ii) respectivamente,
siendo dicho fragmento de nucleótidos diferente de la secuencia
HSAC64 del clon humano RG083M05 accesible sobre la base de dicho
EMBL, bajo el número AC000064.
14. Un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con
la reivindicación 13, caracterizado porque comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo (iii) de secuencias
equivalentes a las secuencias (i) o (ii) que presentan una sucesión
de 100 monómeros contiguos, con al menos un 70% de homología con las
secuencias de (i) y (ii) respectivamente.
15. Un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con
la reivindicación 13, que está compuesto por una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo compuesto por (i) las secuencias
ID DE SEC Nº 114, ID DE SEC Nº 117, ID DE SEC Nº 120; (ii) las
secuencias complementarias de las secuencias (i); y (iii) las
secuencias equivalentes a las secuencias (i) o (ii) que presentan
una sucesión de 100 monómeros contiguos, con por lo menos un 50% de
homología con las secuencias de (i) o (ii) respectivamente.
16. Un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con
la reivindicación 15, caracterizado por estar compuesto por
una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo (iii) de las
secuencias equivalentes a las secuencias de (i) o (ii), presentando
una sucesión de 100 monómeros contiguos, con al menos un 70% de
homología con las secuencias (i) o (ii) respectivamente.
17. Un fragmento de nucleótidos que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que
presenta una sucesión contigua de por lo menos de 30 aminoácidos, y
al menos un 50% de homología con una secuencia peptídica
seleccionada del grupo compuesto por la ID DE SEC Nº 115, ID DE SEC
Nº 118, ID DE SEC Nº 121, siendo dicho fragmento de nucleótidos
diferente de la secuencia HSAC64 del clon humano RG083M05 accesible
sobre la base de dicho EMBL, bajo el número AC000064.
18. Un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con
la reivindicación 17, caracterizado por codificar para un
polipéptido que presenta una sucesión de por lo menos 30
aminoácidos, y una homología de al menos un 70%, con una secuencia
peptídica seleccionada del grupo compuesto por la ID DE SEC Nº 115,
ID DE SEC Nº 118, ID DE SEC Nº 121.
19. Un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con
la reivindicación 17, compuesto por una secuencia de nucleótidos que
codifica para un polipéptido que presenta una sucesión contigua de
por lo menos 30 aminoácidos, con una homología de al menos 50%, con
una secuencia peptídica seleccionada del grupo compuesto por la ID
DE SEC Nº 115, ID DE SEC Nº 118 y ID DE SEC Nº 121.
20. Un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con
la reivindicación 19, caracterizado por que está compuesto
por una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido
que presenta una sucesión contigua de por lo menos 30 aminoácidos,
con al menos un 70% de homología, con una secuencia peptídica
seleccionada del grupo compuesto por la ID DE SEC Nº 115, ID DE SEC
Nº 118, ID DE SEC Nº 121.
21. Una sonda nucleica para la detección de un
retrovirus asociado a la esclerosis múltiple y/o a la poliartritis
reumatoide, caracterizada porque es susceptible de hibridarse
específicamente con cualquier fragmento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones de la 13 a la 20, perteneciente al genoma de
dicho retrovirus, y porque posee de 10 a 100 nucleótidos.
22. Una sonda, de acuerdo con la reivindicación
21, caracterizada por poseer de 10 a 30 nucleótidos.
23. Un cebador para la amplificación por
polimerización de ARN o de ADN de un retrovirus asociado a la
esclerosis múltiple y/o a la poliartritis reumatoide,
caracterizado por comprender una secuencia de nucleótidos
idéntica a por lo menos una parte de la secuencia de nucleótidos de
un fragmento, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de
la 13 a la 20, donde dicho fragmento de nucleótidos pertenece al gen
env de dicho retrovirus, y caracterizado también
porque dicha parte de la secuencia de nucleótidos comprende por lo
menos 6 monómeros.
24. Un cebador, de acuerdo con la reivindicación
23, caracterizado en que comprende de 10 a 30 monómeros.
25. Un cebador para la amplificación por
polimerización de ARN o ADN de un retrovirus asociado a la
esclerosis múltiple o a la poliartritis reumatoide,
caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos
presentando una sucesión de 10 monómeros contiguos, con al menos un
50% de homología con un fragmento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 a la 20, donde dicho fragmento de nucleótidos
pertenece al gen env de dicho retrovirus, y se
caracteriza también porque dicha secuencia de nucleótidos
comprende de 10 a 30 monóme-
ros.
ros.
26. Un cebador, de acuerdo con la reivindicación
25, caracterizado por comprender una secuencia de nucleótidos
que presenta una sucesión de 10 monómeros contiguos, con al menos
una homología del 70% con dicho fragmen-
to.
to.
27. Un cebador, de acuerdo con la reivindicación
24, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos es
seleccionada entre ID DE SEC Nº 116 y ID DE SEC Nº 119.
28. Un vector de replicación y/o expresión, que
comprende un fragmento de nucleótidos, de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 13 a la 20.
29. Un péptido codificado por cualquier marco de
lectura abierto perteneciente a un fragmento de nucleótidos de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 20.
30. Un péptido que comprende una secuencia
peptídica idéntica a una secuencia seleccionada entre ID DE SEC Nº
115, ID DE SEC Nº 118 y ID DE SEC Nº 121.
31. Un péptido que comprende una secuencia
peptídica que contiene una sucesión de al menos 30 aminoácidos y
presenta una homología de por lo menos el 50% con una secuencia
seleccionada entre la ID DE SEC Nº 115, ID DE SEC Nº 118 y la ID DE
SEC Nº 121.
32. Un péptido, de acuerdo con la reivindicación
31, caracterizado por comprender una secuencia peptídica que
contiene una sucesión de al menos 30 aminoácidos y presenta una
homología de por lo menos el 70% con una secuencia seleccionada
entre la ID DE SEC Nº 115, ID DE SEC Nº 118 y ID DE SEC Nº 121.
33. Una composición diagnóstica, profiláctica o
terapéutica que comprende un fragmento de nucleótidos de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 20.
34. Un procedimiento para detectar un retrovirus
asociado a la esclerosis múltiple y/o a la poliartritis reumatoide,
en una muestra biológica, caracterizado porque en dicho
método se pone en contacto ARN y/o ADN sospechoso de pertenecer o
provenir de dicho retrovirus, o su ARN y/o ADN complementarios, con
una composición que contiene un fragmento de nucleótidos de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 20.
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