JP4249269B2 - 自己免疫疾患および/または妊娠障害に関連する内因性レトロウイルス配列 - Google Patents
自己免疫疾患および/または妊娠障害に関連する内因性レトロウイルス配列 Download PDFInfo
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Description
Ppol−MSRVプローブ(配列番号29)を利用したcDNAライブラリーのスクリーニングにより、推定上の7582ヌクレオチドのゲノムRNAを再構築することができる重複クローンの検出が可能となった。再構築された配列とは、重複クローンのアラインメントから推定された配列を意味するものと解釈する。このゲノムRNAは、R−U5−gag−pol−env−U3−Rという構造を持っている。再構築されたゲノムを利用した場合、いくつかのデータ・ベースにおける「blastn」の入力は、大量の関連したゲノム配列(DNA)がヒトゲノムに存在することを示す。約400の配列がGenBankで同定され(図3参照)、200を越える配列がEST(発現された配列タグ)ライブラリーで同定されたが、大多数はアンチセンスとしてであった。これらの配列は、X染色体上の高い見掛け濃度のLTRとともに、いくつかの染色体上、特に染色体5、7、14、16、21、22、X上で確認された。
再構築された配列(mRNA)はゲノムクローンRG083M05(gb AC00064)(9.6kb)内部に完全に含まれており、また、各末端に反復領域をさらに含んでいるこのクローンの2つの不連続な領域と96%の類似性を示す。RG083M05クローンのDNAを用いた再構築されたゲノムRNAの5’領域および3’領域に対応する実験的配列のアラインメントにより、LTR配列を推定し、レトロウイルスの構成分子特性を同定することが可能となった。特に、それらは逆転写、すなわち5’LTRの下流域PBS(プライマー結合部位)および3’LTRの上流域PPT(ポリプリン域)に関係していた。U3構成分子は、哺乳動物C型レトロウイルスと比較すると非常に短く、D型レトロウイルスおよび鳥類レトロウイルスに関して通常記載されているU3領域に大きさが相当することを確認した。PBS領域は鳥類レトロウイルスのPBSに相同性があり、このことは逆転写用プライマーとしてのtRNATrpの使用を示唆している。従って、この新規のHERV(ヒト内因性レトロウイルス)のファミリーをHERV−Wと称した。
pol領域の系統的分析から、HERV−WファミリーがERV−9ファミリーおよびRTVL−Hファミリーと系統的につながっており、I型内因性レトロウイルスのファミリーに属していることが明らかとなった。また、envのオープンリーディングフレーム(ORF)の系統的分析により、HERV−WファミリーがC型哺乳動物レトロウイルスよりもD型サルレトロウイルスおよび鳥類網内皮症レトロウイルスに近いものであり、C/Dキメラゲノム構造を示唆していることが確認できた。
高「ブートストラップ」値によって支持された系統樹は、ERV−9ファミリーおよびHERV−Wファミリーが独立している挿入の2つのウエーブに由来していることを示している。従って、HERV−Wファミリーの開始点の活性構成分子は、ERV−9ファミリーを誘導したものの活性構成分子とは異なる。さらに、HERV−WのPBSはおそらくtRNATrpを利用するが、ERV−9はおそらくtRNAArgを利用する。
最後に、HERV−Wファミリーの要素は胎盤中で発現するが、ERV−9RNAはこの組織では検出されない。
HERV−Wの生物学的機能
胎盤に限定されたHERV−Wの発現、および潜在的にレトロウイルスのエンベロープをコードする長いリーディングフレームによって、機能障害を病状と関連づけすることができる生理学的生物学的機能を提案することができる。
胎盤に限定される発現は、LTRの制御下におけるレトロウイルス遺伝子および/または非レトロウイルス遺伝子の発現が、ホルモン依存性の可能性があることを示している。これらの遺伝子は隣接していてもよく、分離されたLTRの制御下にあってもよい。その後、様々な因子、すなわち、ウィルス感染(例えばヘルペスウイルス・ファミリーの一部による)または局所型免疫活性化によってサイレントLTRが再活性化された後、異常発現により病状が発症し得る。さらに、LTRのレベルでの多形性がこれらの状態を促進する可能性がある。
HERV−Wのエンベロープは、特に胎盤の細胞亜型のレベルで融合的機能を果たすことが可能であった。このエンベロープの免疫抑制性ペプチドにより、胎児を母体免疫系による作用から保護することができた。最終的には、HERV−Wのエンベロープは、受容体の飽和機構によって外因性レトロウイルス感染に対する保護機能を果たすことができた。局所的な細胞性免疫の機能障害は、エンベロープにより伝えられた免疫賦活化シグナルに起因すると思われる。この作用は、多形現象または投与量作用(過剰発現)のいずれかの後で免疫賦活化が生じる免疫抑制性領域、または超抗原活性を伝える領域と関係すると考えられる。
内因性LTRまたはレトロウイルスエンベロープの生物学的機能の機能障害に関係するこれらの前後関係を確認し、結果を理解することにより、異常妊娠または不完全妊娠、あるいは多発性硬化症または慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患の状態診断方法またはモニタリング方法を確立することができる。
本発明によれば、明確に証明し、下記に記述した、内因性状態において、レトロウイルスの構成を有し、自己免疫疾患およびそれに関連している病状、あるいは、異常妊娠または不完全妊娠と関連付けることが可能な、新規の核酸物質を発見した。
本発明による核酸物質は、mRNAの形で約8kbである。図1にそれを示し、配列番号11に記述した。またゲノムDNAの形態における核酸物質を図2に示した。
「レトロウイルス型の」発現とは、レトロウイルスの構成、および/またはその機能性配列またはコード配列に関係した1つ以上のヌクレオチド配列を含むと考えられる核酸物質による特性を意味すると理解する。
この参照核酸物質は、発現HERV−Wと称されるヒト内因性レトロウイルスと関係する。従って、それは下記に示した任意のヒトDNAのライブラリー、または胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングする適当な技術によって、特に、配列番号11の全部または一部とハイブリダイズするように合成された核酸プライマーまたはプローブを用いることによって得ることができる。
さらに、本発明は、配列番号11に記載の核酸物質から得られた核酸生成物またはペプチド生成物、または配列番号11に記載の核酸物質に由来した核酸生成物またはペプチド生成物に関する。
また、最後に、本発明は、任意の自己免疫疾患および/またはそれに関係する病状、並びに異常妊娠または不完全妊娠と、上述の核酸物質および/またはそれに由来した生成物との間に生じ得る様々な相関作用に関係する。
「自己免疫」という用語は、特に、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、播種性紅斑性狼瘡、インシュリン依存性糖尿病、および/またはそれらに関係している病状を意味すると解釈する。
まず第一に、本発明は、少なくとも部分的に機能性、または非機能性である、分離された状態または精製された状態のレトロウイルスゲノム型の核酸物質に関する。
本物質は、そのゲノムが配列番号1〜15の配列、それらに相補的な配列、およびそれらに同等の配列を含む群から選択された参照ヌクレオチド配列を含み、特に、100連続モノマーの任意の配列において、そのヌクレオチド配列が前記配列番号1〜15のそれぞれと少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、例えば、少なくとも90%の相同性を示すことを特徴とする。
さらに、本物質は、そのゲノムが、少なくとも30アミノ酸の任意の連続する配列において、上述の参照ヌクレオチド配列の少なくとも1つの機能的部分によりコードされ得るペプチド配列と少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%の相同性を示す任意のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
特に、この物質は、LTR領域、およびレトロウイルスゲノム構造に対するgag遺伝子にそれぞれ対応する2つの配列の間に挿入された核酸断片、特に配列番号12の配列からなる核酸断片またはそれを含む核酸断片を含む。
さらに、本発明は、クローンcl.PH74(配列番号7)、cl.PH7(配列番号8)およびcl.Pi5T(配列番号9)として例示されたような欠失を有する配列番号11と同一のヌクレオチド配列からなるサブゲノムのレトロウイルス型の核酸物質に関する。なお、欠失はスプライシング方法または他の方法によって生じたものである。
上述の核酸物質は、少なくとも1つのレトロウイルスのタンパク質をコードする少なくとも1つの機能性のヌクレオチド配列、および/または少なくとも1つの制御性ヌクレオチド配列を含む。
次に、本発明は、下記のa)、b)、c)およびd)からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、少なくとも100塩基の任意のヌクレオチド断片に関する。
a)上述の核酸物質の一部のヌクレオチド配列の全部、または完全なヌクレオチド配列の全部、
b)cl.6A2(配列番号1)、
cl.6Al(配列番号2)、
cl.7A16(配列番号3)、
cl.Pi22(配列番号4)、
cl.24.4(配列番号5)、
cl.C4C5(配列番号6)、
cl.PH74(配列番号7)、
cl.PH7(配列番号8)、
cl.Pi5T(配列番号9)、
cl.44.4(配列番号10)、
HERV−W(配列番号11)、
cl.6A5(配列番号12)、
cl.7A20(配列番号13)、
cl.7A21(配列番号14)、
LTR(配列番号15)
のクローンを含む群から選択されたクローンの一部のヌクレオチド配列の全部、または完全なヌクレオチド配列の全部、
c)a)とb)に記載の配列にそれぞれ相補的な配列、
d)a)〜c)に記載の配列にそれぞれ同等な配列、特に、a)〜c)に記載の配列と、任意の100連続モノマーの配列において、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、またはより好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも90%の相同性を示すヌクレオチド配列。
さらに、本発明は、上述のように、核酸物質と特異的にハイブリダイズし得ることを特徴とする、核酸へ挿入その他が行われる、核酸物質の検出用の任意の核酸プローブに関する。
そのようなプローブはマーカーまたはその他を含む。
また、本発明は、上述のような核酸物質または核酸断片と特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、RNAのまたはDNAの重合による増幅を行うための核酸プライマーに関係する。
一例として、本発明による核酸プローブまたは核酸プライマーは、配列番号16〜28を含む群から選択されたヌクレオチド配列からなることを特徴とする。
さらに、本発明は、上述のようなヌクレオチド断片を含む、任意のRNAまたはDNA、特に複製ベクターに関する。
さらにまた、本発明は、上記のようなヌクレオチド断片、特にポリペプチド、例えば、自己免疫疾患またはそれに関係する病状を患った患者、あるいは異常妊娠または不完全妊娠の患者から得た血清により認識される抗原決定基を形成するオリゴペプチド、に属する任意のオープンリーディングフレームによってコードされた任意のペプチドに関する。
一例として、このポリペプチドは、1つ以上のレトロウイルスENVタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド断片によりコードされている。
最後に、本発明は次の事項に関係する。
− 自己免疫疾患またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠または不完全妊娠に対する分子マーカーとしての、上述のような核酸物質、ヌクレオチド断片、またはペプチドの利用。
− 自己免疫疾患の罹病性またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠または不完全妊娠のリスクに対する染色体マーカーとしての、上述のような核酸物質またはヌクレオチド断片の利用。
− 自己免疫疾患またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠または不完全妊娠のリスクに対する感受性についての近接マーカーとしての、上述のような核酸物質またはヌクレオチド断片の利用。
さらに、本発明は、RNAの形態、またはDNAの形態のいずれかの、上述のような任意のヌクレオチド断片を生物学的身体物質で、特に体液で同定および/または定量することを特徴とする、自己免疫疾患、またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠または不完全妊娠の分子標識化のための方法に関係する。
一例として、そのような方法によって、上述のようなヌクレオチド断片を発現する細胞を前記の生物学的身体物質で検出した。
本発明は、上述のような核酸物質、ヌクレオチド断片、またはペプチドの診断上および/または治療上における利用に関し、また、そういうものであるので、本発明の別の目的は、前記物質、前記断片または前記ペプチドを含む診断上の組成物あるいは治療上の組成物である。
本発明を詳述する前に、明細書および請求の範囲において使用された種々の用語をここに定義する。
− ヒト・ウイルスはヒトに感染し得る、または潜在し得るウイルスを意味すると解釈する。
− 本発明の実用的実施において生じ得る天然または誘発性のすべての変異体および/または組換え体を考慮して、上述の記載および請求の範囲に記載の本発明の主題は、以下に記述した種々の生物学的生体試料の同等物または誘導体、特に、相同性ヌクレオチドまたはペプチド配列を含んで示される。
− 本発明のウイルスの変異体、または病原性および/または感染性成分の変異体は、前記ウイルスおよび/または前記病原性および/または感染性成分の少なくとも一つの対応抗原に対して向けられた少なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも一つの抗原、および/または、任意部位が、当業者に周知の所定のハイブリダイゼーション条件下で、前記ウイルスおよび/または前記病原性および/または感染性成分に対して特異的な少なくとも1つのハイブリダイゼーション・プローブおよび/または少なくとも1つのヌクレオチド増幅プライマーによって検出されるゲノム、特にHERV−Wファミリーに属するゲノムを含む。
− 本発明によれば、ヌクレオチド断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドは、所定の条件下に他のヌクレオチド断片とハイブリダイズし得る、情報またはその他の、天然核酸配列によって特徴化されたモノマーまたはバイオポリマーの延長であり、それは、異なる化学的構造のモノマーを含むように、また、天然の核酸分子から得られるように延長することができ、および/または遺伝的組換えおよび/または化学合成の手段によって延長することが可能である。ヌクレオチド断片は、本発明によって検討されたHERV−Wファミリーの構成分子のゲノム断片と同一であってもよく、特に後者の遺伝子、例えば、前記構成分子場合、polまたはenvと同一であってよい。
− 例えば、モノマーは核酸の天然のヌクレオチドであって良く、その構成元素は糖、燐酸基および窒素塩基である。RNAでは、糖がリボースであり、DNAでは、糖が2−デオキシリボースである。DNAまたはRNAが含まれているかどうかによって、窒素塩基はアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンから選択され、また、3つの構成元素の少なくとも1つでヌクレオチドが修正されていてもよい。一例として、その修飾は塩基のレベルで生じ、イノシン、5−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、5−(ジメチルアミノ)デオキシウリジン、2、6−ジアミノプリン、5-ブロムデオキシウリジンのような修飾塩基およびハイブリダイゼーションを促進する他の修飾塩基を生成することができる。糖のレベルでは、修飾は少なくとも1つのデオキシリボースがポリアミドと置換して生じ、また、燐酸基のレベルでは、修飾はエステル、特に、二燐酸塩、アルキルおよびアリールホスホナートおよびホスホロチオアートエステルから選択されるエステルとの置換によって生じる。
− 「機能性の」という用語は、ヌクレオチド配列、核酸物質またはヌクレオチド断片が「情報配列」を含むことによる特性を意味すると解釈する。
− 「情報配列」は、化学的本質および基準方向における秩序が天然の核酸と同じ質の機能的情報、例えば、タンパク質をコードするリーディングフレーム、調節配列、スプライシング部位または組換え部位を構成等するモノマーの任意の規則正しい配列を意味すると解釈する。
− ハイブリダイゼーションは、特に、厳密な条件で、複合体、特に、二重構造または三重構造、好ましくはaヘリックス形状を生成するよう相補的な配列、対を十分に保持した2つのヌクレオチド断片を適切に操作する方法を意味すると解釈する。
− プローブは、特に化学的手段または重合手段によって合成されたヌクレオチド断片、または、より長いヌクレオチド断片の酵素的消化または切断によって得られたヌクレオチド断片からなる。また、それは少なくとも6つのモノマー、好ましくは10〜100のモノマー、さらに好ましくは10〜30のモノマーからなり、所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を持つ。10未満のモノマーを有するプローブは単独で使用せずに、大きさまたは他の点で等しく短い他のプローブの存在下で使用することが好ましい。ある特定の条件の下では、100モノマーより大きな大きさのプローブを使用することが有効であると思われる。プローブは、診断の目的として特に使用することが可能であり、それには、例えば捕捉プローブおよび/または検出プローブが含まれる。
− 捕捉プローブは、任意の適当な手段、すなわち、直接的にまたは間接的に、例えば共有原子価または受動的吸着によって固体担体上に固定化することができる。
− 検出プローブは、ラジオアイソトープ、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼおよび色素産生、蛍光生成または発光性の基質を加水分解し得るものから特に選択された酵素、発色化学化合物、色素産生、蛍光生成または発光性の化合物、ヌクレオチド塩基類似体およびビオチンから特に選択されたマーカーによって標識化することができる。
− 本発明の診断の目的で使用されるプローブは、当業者に公知のすべてのハイブリダイゼーション方法、特に、「ドットブロット」、「サザンブロット」、サザンブロット方法と同一の方法であるが標的としてRNAを用いる「ノーザンブロット」、サンドイッチ法と称される方法で用いることができる。本発明においてはサンドイッチ方法を使用するのが好ましく、それは特定の捕捉プローブおよび/または特定の検出プローブからなり、その捕捉プローブおよび検出プローブは、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有していなければならないと解する。
− 本発明による任意のプローブは、in vivoでまたはin vitroでRNAと、および/またはDNAとハイブリダイズし、複製の現象、特に、翻訳および/または転写をブロックすること、および/または前記DNAおよび/または前記RNAを減成させることができる。
− プライマーは少なくとも6つのモノマー、好ましくは10〜30のモノマーからなるプローブであり、所定の条件下に、PCR(合成酵素連鎖反応)のような増幅方法、シーケンシングのような延長方法、逆転写方法等の酵素的重合の連鎖開始反応において、ハイブリダイゼーション特異性を保持する。
− 検討された応用または使用に関して、またはそれらを用いる方法において、同一ではなく、機能的に対応するバイオポリマーが実質的に同じ機能を働き得る場合、2つのヌクレオチドまたはペプチド配列は、同等であるか互いから由来したもの、または参照配列に相対的であるものと言える。特に同等とは、同一個体内の自然的変異性、または同じ種内である同一個体から別の個体へ自然的多様性により得られた2つの配列であり、特に、同定された種の自然突然変異、または誘発突然変異、並びに下記に定義されている相同性の2つの相同性配列である。
− 「変異性」とは、自発性または誘発性の配列の任意の修飾、特に、ヌクレオチドの、および/またはヌクレオチド断片の置換、および/または挿入、および/または欠失、および/または少なくとも1つの末端での配列の延長、および/または短縮を意味すると解釈する。人為的な変異性は用いた遺伝的工学方法により得ることができる。例えば、核酸の増幅に対して選択された合成プライマーにより変性するかその他の状態になる。この変異性は、参照配列のように検討された、任意の開始配列の修飾を生成し得る。そして、それは前記参照配列に相対的な相同性の程度によって示され得る。
− 相同性は、比較される2つのヌクレオチドまたはペプチド断片の同一性の程度を特徴づける。それは同一性百分率で評価し、特に、参照ヌクレオチドまたはペプチド配列に対する、ヌクレオチドまたはペプチドの配列の直接比較によって決定する。
− ヌクレオチド断片、特に、本発明において同一個体から得られたクローンについてこの同一性百分率を特異的に決定した。制限されない一例として、同一個体からの異なるクローン(配列番号13および14を参照)間で確認された最も低い同一性百分率は少なくとも90%であり、また、2つの個体の異なるクローン間で確認された最も低い同一性百分率は少なくとも80%であった。
− 参照断片の配列に同等なヌクレオチド配列を示す場合、任意のヌクレオチド断片は、その参照断片に同等またはそれに由来したものといえる。この定義によれば、参照ヌクレオチド断片と同等であるとは以下のとおりである。
(a)少なくとも部分的に参照断片の相補体とハイブリダイズすることが可能な任意の断片。
(b)参照フラグメントとのアラインメントが、別の分類群から得た他の断片とのアラインメントよりも大きな数で同定されている同一連続塩基を導く任意の断片。
(c)同一個体内の自然的変異性から、および同一種内の1つの個体から別の個体への自然的多様性から形成されるか、形成し得る任意の断片、
(d)参照断片に用いた遺伝工学方法から形成し得る任意の断片、
(e)参照断片によってコードされたペプチドに相同的なペプチド、または同一であるペプチドをコードする少なくとも8つの連続するヌクレオチドを含んでいる任意の断片。
(f)少なくとも末端の1つでの挿入、欠失、少なくとも1つのモノマーの置換、延長または短縮により参照断片と異なる任意の断片。例えば、少なくとも1つのその末端で、ポリペプチドをコードしないヌクレオチド配列が隣接している参照断片に対応する任意の断片。
− 参照核酸物質の一部のヌクレオチド配列または完全なヌクレオチド配列は、共同キャプシド形成または同時発現によって結合した任意の配列、または前記参照核酸物質と再結合した任意の配列を意味するものと解釈する。
− ポリペプチドは、特に、少なくとも2つのアミノ酸の任意のペプチド、特に、人間の操作による関与を介して抽出、分離、あるいは実質的に遊離、または合成されたオリゴペプチドまたはタンパク質、特に、化学合成、または組換え生命体での発現によって得られたものを意味すると解釈する。
− ヌクレオチド断片によって部分的にコードされたポリペプチドは、前記ヌクレオチド断片に含まれる少なくとも9つの連続するモノマーによってコードされる少なくとも3つのアミノ酸を有するポリペプチドを意味すると解釈する。
− 極性、疎水性および/または塩基性度、および/または酸性度、または中性のようなそれらのそれぞれの物理化学的特性が実質的に同じである場合、アミノ酸は別のアミノ酸と類似性があると言える。例えば、ロイシンはイソロイシンと類似している。
− 比較されたポリペプチドが同一特性、特に、同一の抗原的、免疫学的、酵素学的および/または分子認識の特性を実質的に有している場合、任意のポリペプチドは参照ポリペプチドと同等である、あるいはそれに由来したものと言える。特に、参照ポリペプチドとの同等なものは以下のとおりである。
(a)類似のアミノ酸で少なくとも1つのアミノ酸が置換された配列を有する任意のポリペプチド。
(b)前記参照ポリペプチドの、および/または前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド断片の自然的または誘発的変異によって得られた同等のペプチド配列を有する任意のポリペプチド。
(c)前記参照ポリペプチドのミモトープ(mimotope)、
(d)1つ以上のL型アミノ酸をD型アミノ酸と置換した任意のポリペプチド、あるいはその逆の任意のポリペプチド。
(e)例えばアミン官能基のアセチル化、チオール官能基のカルボキシル化、カルボキシル官能基のエステル化のようなアミノ酸の側鎖の修飾が導入された任意のポリペプチド。
(f)1つ以上のペプチド結合が修飾された配列の任意のポリペプチド。例えば、カルバ、レトロ、インバース、レトロ-インバース、還元またはメチレンオキシ結合。
(g)少なくとも1つの抗原が、参照ポリペプチドに向けられた抗体によって認識される任意のポリペプチド。
− 本発明の、2つの比較されたペプチド断片間の相同性を特徴とする同一性百分率は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%である。
第1ヌクレオチド配列のような、本明細書および請求の範囲で用いられる配列に関する表現は、特定の配列を表現するために選択されたのではなく、本発明をより明白に定義するためである。
物質または成分の検出は、同定または定量の両方、または前記物質または前記成分の分離または単離を意味するものと解釈する。
以下の添付された図を参照し、続く詳細な明細書を読むことによって本発明をより明白に理解する。
− 図1は、一つには、本発明によって発見された内因性レトロウイルス物質の構成を推定上のゲノムmRNAの形として表わしており、また、一方では、この構成に関連した本発明により用いられるクローンの位置を示した。長さの測定尺度はkbで表し、フランキング領域(5’UTRおよび3’UTR)は平行斜線枠で示した。これらの2つのフランキング領域で繰り返された領域は黒い矢印で示した。gag、polおよびenv遺伝子に対応する領域を黒、白色およびグレーでそれぞれ示した。また、Ppol−MSRVプローブの位置を示した。
− 図2は、クローンRG083M05として図示した遺伝子的構成(DNA)の可能性、およびこの配列に関係するスプライシング方法、実験的クローン(mRNA)を示す。また、この図はレトロウイルス生物体に関して確認されたスプライス部位を示す。さらに、この図で示されたものは次のとおりである。
用いたプローブの位置(Pgag−LB19、Ppro−E、Ppol−MSRV、およびPenv−C15)。
スプライス供与部位(DS1およびDS2)および受容部位(AS1〜AS3)。
下段文字枠中のクローンRG083M05から得られた配列、および上部文字枠中の実験的胎盤クローン(mRNA)に由来した配列。
推定上のORF(ORF1、ORF2およびORF3)。
および垂直平行線の形で示した、DNAの形で存在するがRNAの形では検出されない2kbの挿入断片。
この図で使用した他のきまりは、図1に対するものと同様である。
− 図3は、分離されたcDNAクローンに対応するゲノム(DNA)クローンを図示する。この図で示されたものは次のとおりである。
再構築されたゲノムRNA(Recons RNA)に関しての類似性百分率。
これらのゲノムの各末端での反復配列の存在(反復)。
およびオープンリーディングフレーム(ORF)の存在および大きさ。
− 図4は、HERV−Wファミリーを同定する系統的分析を表わす。
− 図5は、いくつかの胎盤クローンの末端5’および/または3’領域を有するクローンRG083M05の5’および3’フランキング領域のアラインメントを表わす。3’および5’LTRに隣接するCAACタンデムについては、DNA配列の下に二重線を付した。783bp(塩基対)のコンセンサスLTR配列はアラインメントの下に示す。LTR5’末端の上流のPPT、およびLTR3’末端の下流のPBSを示す。U3RおよびU5の領域を示す。転写因子の結合に対応する部位に下線を付し、1〜6まで番号に付けた。領域−73〜284は、「CATアッセイ」で評価された配列に対応する。*は「キャップ形成」に関する推定上の部位と一致する。[polyA]はポリアデニル化シグナルを示す。
− 図6は、3つの異なる胎盤cDNAクローンから得られたHERV−Wエンベロープポリペプチド(ORF1)の推定上の配列を表わす。リーダーペプチド(L)、表面タンパク質(SU)およびトランスメンブレンタンパク質(TM)を矢印で示す。疎水性融合ペプチドおよびトランスメンブレンカルボキシ領域にそれぞれ一重線および二重線を付した。免疫抑制領域はイタリック体で示した。可能性のあるグリコシル化部位は小点により示した。分岐アミノ酸は下の行に示した。さらに、図6は図2に記載したようなORF2およびORF3に対応するオープンリーディングフレーム、および、特に、レトロウイルス制御遺伝子との相同性を示す。
前述で明白に説明した核酸物質は、下記に記述した実験手順の終わりに発見し特性を決定したが、この手順により、本発明の範囲および添付の請求の範囲の範囲を制限することはできないことを理解すべきである。
実施例 1
重複cDNA断片の分離とシーケンシング
HERV−Wの構成に関係する情報は、プローブPpol−MSRV(配列番号29)およびPenv−C15(配列番号31)(実施例8参照)を用いて胎盤cDNAライブラリー(Clontech cat#HL5014a)を試験し、次に、得られた新規の配列を利用した「遺伝子歩行(gene walking)」を実施して得た。実験は、ライブラリーの供給者の助言を参考にして実施した。また、この構成を推察するためにDNAのPCR増幅を利用した。
いくつかのクローンを選択し、シーケンシングした(図1を参照)。
− クローンcl.6A2(配列番号1):HERV−Wの非翻訳5’領域およびgagの一部
− クローンcl.6A1(配列番号2):gag、およびpolの一部
− クローンcl.7A16(配列番号3): polの3’領域
− クローンcl.Pi22(配列番号4):polの3’領域およびenvの開始点
− クローンcl.24.4(配列番号5):HERV−Wの非翻訳5’領域の一部からなるスプライスされたRNA、polの末端およびenvの5’領域
− クローンcl.C4C5(配列番号6):envの末端およびHERV−Wの非翻訳3’領域
− クローンcl.PH74(配列番号7):サブゲノムRNA:HERV−Wの非翻訳5’領域、polの末端、envおよびHERV−Wの非翻訳3’領域
− クローンcl.PH7(配列番号8):多重スプライスされたRNA:HERV−Wの非翻訳5’領域、envの末端およびHERV−Wの非翻訳3’領域。
− クローンcl.Pi5T(配列番号9):部分的pol遺伝子およびU3−R領域
− クローンcl.44.4(配列番号10):R−U5領域、gag遺伝子および部分的pol遺伝子。
これらのクローンを利用して配列アラインメントを行なうことによって、HERV−Wの完全な配列のモデルを作製した。可能性のあるスプライス供与部および受容部位とともにスプライスされたRNAを同定した。この情報の集合を図2に示す。既存のレトロウイルスとの類似性の試験を行い、LTR、gag、polおよびenvの構成要素を明らかにした。
RNA形態のHERV−Wの推定上の遺伝子的構成は以下のとおりである(配列番号11)。
遺伝子 1..7582
再構築されたゲノムRNA配列上のクローンの位置
cl.6A2(1321bp)1〜1325、
cl.PH74(535+2229=2764bp)72〜606および5353〜7582、
cl.24.4(491+1457=1948bp)、115〜606および5353〜6810;
cl.44.4(2372bp)115〜2496、
cl.PH7(369+297=666bp)237〜606および7017〜7313、
cl.6A1(2938bp)586〜3559、
cl.Pi5T(2785+566=3351bp)2747〜5557および7017〜7582、
cl.7A16(1422bp)2908〜4337、
cl.Pi22(317+1689=2006bp)3957〜4273および4476〜6168、
cl.C4C5(1116bp)6467〜7582
実施例2
分離されたDNAクローンに対応するゲノム(DNA)クローンの同定
再構築されたゲノムを利用して、いくつかのデータ・ベースでの「blastn」の入力により、関連する大量の配列がヒトゲノムに存在することが示された。約400の配列がGenBankで、200を越える配列がESTライブラリーで同定され、その大多数がアンチセンスとして同定された。図3で図示した、大きさおよび類似性において最も重要な4つの配列は、次のゲノム(DNA)クローンであった。
染色体の位置が7q21〜7q22であるヒト・クローンRG083M05(gb AC000064)、
14q11〜12に位置した、T細胞受容体のαデルタ座に対応するヒト・クローンBAC378(gb U85196,gb AE000660)、
染色体21の21q22.3領域に対応するヒトコスミドQ11M15(gb AF045450)、
染色体Xq22上のコスミドU134E6(embl Z83850)。
各々のクローンに対する配列領域の位置を示し、染色体との関連を角括弧中に示した。ゲノムの各末端における反復配列の存在、および最大のリーディングフレーム(ORF)の大きさとともに、4つの配列と再構築されたゲノムRNAの間の類似性百分率(広い欠失のない)を示す。これらのクローンのうちの3つクローンの末端で反復配列を確認した。再構築された配列はクローンRG083M05(9.6kb)内に完全に含まれており、96%の類似性を示した。しかしながら、クローンRG083M05は、非翻訳5’領域(5’UTR)の下流域すぐ近くに位置した2kbの挿入断片を示した。この挿入断片は、さらに、非翻訳3’領域(3’UTR)の上流域すぐ近くに2.3Kbの欠失を示す他の2つのゲノムクローンでも確認された。クローンは3つの機能性リーディングフレーム(ORF)、gag、polおよびenvを含んではいなかった。クローンRG083M05は、エンベロープ全体に対応する538のアミノ酸(AA)のORFを示す。コスミドQ11M15は、短縮されたpolポリタンパク質に対応する305のAA(フレーム+1)および413のAA(フレーム0)という2つの大きな連続したORFを含んでいる。
実施例3
系統的分析
再構築されたゲノムRNAの11の異なる部分領域上の核酸レベル、およびenvの2つの異なる部分領域上のタンパク質レベルで系統的分析を行なった。研究された領域にかかわらず、得られたすべての枝分かれ図は同一トポロジーを示した。得られた配列とERV−9およびRTLV−Hの間で最も保存されたLTRおよびpol領域の核酸のレベルについて図4に説明した。枝分かれ図は、実験の配列がERV−9とは異なり、また「ブートストラップ」分析により下線を付したRTLV−Hとは非常に異なる新規のファミリーを説明していることを明らかに示している。これらの配列は、いくつかの染色体上、特に、X染色体上の高い見かけ濃度のLTRとともに、染色体5、7、14、16、21、22およびX上に確認できる。
レトロウイルスのenvタンパク質で最も保存された領域間のタンパク質レベルにおける比較により、HERV−WファミリーがD型のサルレトロウイルスに近似しており、さらに、C型哺乳動物レトロウイルスよりも鳥類の網内皮症レトロウイルスに近いものであることがわかった。これはC/Dキメラゲノム構造を示唆している。
実施例4
LTR、PPTおよびPBSのエレメントの同定
再構築された配列(RNA)は、ゲノムクローンRG083M05(9.6kb)内に完全に含まれており、各末端にさらに反復領域を含んでいるこのクローンの2つの不連続の領域と96%の類似性を示した。クローンRG083M05[5’(5−RG−28000−28872)および3’(3−RG−37500−38314)]のDNAで再構築されたゲノムRNAの5’領域および3’領域に対応する実験的配列のアラインメントにより、LTR配列を推定しレトロウイルスの構成分子特性を同定することができた。特に、それらは逆転写、すなわち、5’LTRの下流域のPBSおよび3’LTRの上流域のPPTに関与していた(図5参照)。また、哺乳動物のC型レトロウイルスで確認されたU3エレメントと比較した場合、そのU3エレメントは非常に短く、D型レトロウイルスおよび鳥類レトロウイルスについて一般に記述されているU3領域の大きさに匹敵することを確認した。クローンcl.PH74(配列番号7)の塩基2364〜2720に対応する領域をPCRにより増幅し、プロモーター活性の評価を行なうため、ベクターpCAT3(Promega)へサブクローン化した。いわゆる「CATアッセイ」方法により、有意な活性がHeLa細胞で確認され、LTRのプロモーター配列の機能性が示された。
PBSの領域は鳥類レトロウイルスのPBSに相同であった。
実施例5
遺伝子的構成および発現の制御
DNA形態における構成
以下のオリゴヌクレオチド対を使用して、ヒト・ゲノムライブラリー(生成方法に関しては実施例1を参照)上で再生された全HERV−WクローンについてPCR増幅を実施した。
U5 4992(配列番号16)、GAG 4619(配列番号17)
GAG 4782(配列番号18)、POL 3167(配列番号19)
POL 3390(配列番号20)、POL 5144(配列番号21)
POL 5145(配列番号22)、U5 4991(配列番号23)。
PCRは以下の条件下で実施した。
0.33マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチド
TAQポリメラーゼ緩衝液Boerhinger 1X
TAQポリメラーゼBoerhinger 0.5単位
各々0.25mMのdNTPの混合物
ヒトDNA 0.5mg
最終容量100ml
PCR条件は、(95℃、5分間)×1、(95℃、30秒+54℃、30秒+72℃、3分間)×35。
その後、PCR産物を1%アガロースゲルに沈積させ、泳動の後に分析した。PCRは、推測した大きさ(胎盤ライブラリーからのcDNAから推定した)に比べて約2kbだけ大きな大きさの断片を生じるLTR−4991−−gag−4619 PCRを除いて、推測した大きさの増幅断片を生じた。従って、内因性のDNA形態におけるHERV−Wの再構築は、約10Kbの構成を表わす。
PCR−4992 gag−4619のクローニング、シーケンシング、および分析の後、挿入領域の存在を配列番号12(クローンcl.6A5)のLTRおよびgagの間に確認した。この領域は、レトロウイルスの非翻訳の従来領域に該当しなかった。すなわち、Ψ領域またはPBS領域はなかった。
さらにPCR pol−3390、pol−5144の産物をクローン化し、得られたクローンのうちの2つをシーケンシングした。これらの配列の結果がクローンcl.7A20(配列番号13)、およびcl.7A21(配列番号14)である。これらの2つのヌクレオチド配列の比較により、関連する領域に対し90%の相同性の結果を得た。このことは、同一個体でのHERV−Wの変異性を示している。
DNA形態のHERV−Wを図2に示した。
一般的構成:転写方法
得られた多様なcDNAクローンは、DNAのPCRで後天的に得られたものであり、次のように推定される。
− LTRとgagの間に2kbの挿入配列を有する10kbのDNA構成。
LTR領域とgag領域の間に2kbの挿入断片の存在を示すDNAのPCRの結果は、胎盤から分離されたcDNAがRG083M05型のゲノムの発現から生じたものであることを示唆している。
− LTRとgagの間のスプライシングによって生じた10kbの転写から得られた8kbのRNA構成により、連続性FR(フランキング領域)5’gagを再生することができ、その結果、ノーザンブロッティングで同定されたような8kbのRNAが得られた。
プローブgag(Pgag−LB19、配列番号30)およびプロテアーゼ(Ppro−E、配列番号32)は8kb近くの大きさを有するRNAを明らかにし、さらに、プローブPenv−C15(配列番号31)は3.1Kb近くのRNAを明らかにした。上述のcDNAライブラリーのスクリーニングによって得られた、非翻訳5’領域に特定された2つのプローブ(クローンcl.6A2に由来のプローブP5’−gag−cl.6A2、およびクローンcl.24.4に由来のプローブP5’−env−cl.24.4)は、上記の2つのRNAおよび約1.3kbのRNAを明らかにした。RNAのこの分布は複合体レトロウイルス転写産物、すなわち、gag−pro−polをコードするゲノムRNA、エンベロープをコードするサブゲノムRNA、および制御遺伝子を潜在的にコードする1つ以上の多重スプライスされたRNAに特有のものである。
ノーザンブロッティングでは10KbのRNAを検出しないので、そのようなRNA(LTR−R−U5−挿入部−GAG−POL−ENV−U3−R−HERV−W)の半減期は恐らく非常に短い。配列の分析および比較によって、潜在的なスプライス供与部位(DS1およびDS2)と受容部位を決定し、図2に記述した。
実施例6
健全な組織における転写
実施例1の記述のように標識された、プローブPpol−MSRV(配列番号29)、Pgag−LB19(配列番号30)、Penv−C15(配列番号31)、Ppro−E(配列番号32)、P5’−gag−cl.6A2およびP5’−env−cl.24.4利用して、多様な健全なヒト組織をノーザンブロット法(Human Multiple Tissue Northern Blot、 Clontech cat# 7760−1)により試験した。メーカーの助言に従って実験を実施し、5日間オートラジオグラフに感光させた。結果を分析したところ、胎盤においてのみ転写産物を示し、試験した他のヒト組織(心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓)ではいずれも示されなかった。
RNAドットプロット方法(Clontech: Human RNA Master Blot Cat# 7770−1)を使用し、かつ、メーカーによって推薦された実験手順を使用して、胎児組織を含む他の約40の組織を試験した。プローブPgag−LB19(配列番号30)およびPenv−C15(配列番号31)を用いたハイブリダイゼーションの後、胎盤だけに特定の反応が生じた。
RNAドットブロットにおいてシグナルが腎臓で確認され、これはノーザンブロット分析により内固定されたことがわかった。
実施例7
エンベロープをコードするmRNAの同定およびそれを特異的に検知するための手段
非翻訳5’領域に特定されたプローブを利用した胎盤cDNAライブラリーのスクリーニングにより、非翻訳5’領域(5’NTR)、スプライシングジャンクション、コード配列、非翻訳3’領域(3’NTR)、およびポリアデニル化テールによって確定されるcDNAを分離することができたcl.PH74(配列番号7)。このクローンはエンベロープをコードするスプライスされたRNAに対応する。図2に提案したこのcDNAと内因性HERV−Wモデルの間の配列の比較によって、スプライシングジャンクションをmRNA上で同定し、スプライシングジャンクションは連続性5’NTR領域およびenv遺伝子に位置し、エンベロープ遺伝子をコードするスプライスされたサブゲノムRNAの生成を導く。この情報により、スプライシング部位上にある位置を選択することによって、このmRNAに特異的なオリゴヌクレオチドを特定することができた(Oligo 5307、配列番号24による)。
このJ領域の同定により、PCRにおいて、このJ領域の上で特定されたオリゴヌクレオチド、特に、env遺伝子から選択されたオリゴヌクレオチド(Oligo4986、配列番号25による)を使用して、内因性レトロウイルスのRNAとDNAを区別する方法を確立することができた。
PCRは以下の条件で実施した。
0.33マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチド
TAQポリメラーゼ緩衝液Boerhinger 1X
TAQポリメラーゼBoerhinger 0.5単位
各々0.25mMのdNTPの混合物
ヒトDNA 0.5mg
最終容量 100ml
試験された10の異なるDNAにおいては、この種類のPCRにより増幅産物を得ることができなかった。一方、胎盤RNAまたはHERV−Wを発現する細胞に由来するcDNAにおいては、このPCRにより増幅産物が得られた。この結果により、このサブゲノム断片の特異的RNA性質を確認した。
実施例8
特定のmRNAに含まれるコード配列の同定
実施例5に記述したスプライシング方法は、3つのリーディングフレーム、ORF1(配列番号33)、ORF2(配列番号34)およびORF3(配列番号35)の存在と適合する(図6参照)。
胎盤cDNAライブラリーのスクリーニングにより、非翻訳5’領域(5’NTR)、スプライシングジャンクション、コード配列、非翻訳3’領域(3’NTR)およびポリアデニル化テールによって特定されたcDNA(配列番号7、cl.PH74)を分離することができた。コード配列は538のアミノ酸(配列番号33)である。データバンクで実施した分析により、完全なレトロウイルスエンベロープの特性、すなわち、エンベロープポリタンパク質の翻訳の開始、約21のアミノ酸の高疎水性リーダーペプチドの翻訳の開始、表面タンパク質SUの翻訳の開始、トランスメンブレンタンパク質TMの翻訳の開始を同定することができた。これらの2つのタンパク質構成要素は異なる潜在的なグリコシル化部位を示す。免疫抑制領域をTMタンパク質内に同定した。
52 AA(ORF2、配列番号34)の合成、および48 AA(ORF3、配列番号35)の合成を導くことができるスプライス受容部位の上流域にある22bpおよび95bpの2つの開始コドンをそれぞれ確認した。ORF2はenvのカルボキシターミナル末端の一部から成り、また、ORF3は異なるが重複する翻訳に対応する。
「blast」の入力による有意な相同性は見つからなかった。しかしながら、レトロウイルス科、ORF2およびORF3に制限されたサブデータバンクにおけるLFASTAの入力は、それぞれ、ヒトおよび霊長類のリンパ親和性TウイルスのRex、およびサルの免疫不全ウイルスのTatと35%の同一性百分率を示した。
実施例9
HERV−Wファミリーの複雑性
プローブ、Pgag−LB19(配列番号30)、Ppro−E(配列番号32)およびPenv−C15(配列番号31)を利用して、ドットブロット方法により、各々の配列のヒトゲノムに存在するコピーの数を求めた。
各々のプローブを変性させ、1つの沈積に対し2.5、5、10、25、50、100pgの量で、Hybond N+膜上に沈積させた。また、ヒトDNAの0.5mgを同一膜上に沈積させた。その膜を80℃、真空下で2時間乾燥した。その後、その膜を沈積したプローブとハイブリダイズした。プローブを標識する方法、ハイブリダイズする方法、また、膜を洗浄する方法は、サザンブロッティングと同様である。膜のオートラジオグラフィーの後に、膜上の沈積に比例するシグナル強度のレベルを確認した。ハイブリダイゼーションゾーンを切り出した後、シンチレーションカウントを実施した。膜上に沈積したプローブに対する希釈系列とヒトDNAで得られた結果を比較することによって、プローブに覆われた領域の各々の一倍体ゲノム当たりコピーの数を求めることが可能である。
− 内因性のgagの数は56〜112のコピー数(76)と求められる。
− 内因性のプロテアーゼの数は166〜334のコピー数(260)と求められる。
− 内因性のenvの数は52未満のコピー数(13)と求められる。
ヒト胎盤DNAライブラリー(Clontech cat# Hl5014b)の106クローンのスクリーニングによって、プローブPgag−LB19により認識された144のクローン、およびプローブPenv−C15により認識された64のクローンが計測できた。プローブPenv−C15およびPgag−LB19と結合してハイブリダイズされた13のクローンを分離し、機能性の検討は行わず、gagおよびenvの両方を保持するゲノムのいくつかのコピーの存在を確認した。
前記物質および配列により発現し得る核酸物質、ヌクレオチド配列、およびペプチドまたはタンパク質は、任意の自己免疫疾患およびそれに関係している病状、並びに、異常妊娠、または不完全妊娠を検知し、予測し、治療し、観察するために使用することができる。
実際、客観的および実験的データにより、レトロウイルスおよび自己免疫疾患、およびレトロウイルスと妊娠障害を結びつけることができた。
(1)レトロウイルスの病状および自己免疫疾患において共通のメカニズムが用いられる(自己抗体の存在、免疫複合体の存在、ある組織の細胞浸潤、神経学上疾患)。
(2)ある自己免疫性疾患に匹敵する病理学的障害はHIVおよびHTLVのレトロウイルスに感染している間に現われる(シェーグレン症候群、播種性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ等)。
(3)多発性硬化症(Perronら、Res. Virol. 1989; 140: 551−561/Lancet 1991; 337:862−863/Res. Virol. 1992; 143: 337−350)または慢性関節リウマチを患っている患者の細胞培養上清中に逆トランスクリプターゼ活性を検出し、レトロウイルス型粒子を確認した。
(4)自己免疫性または慢性炎症性動物病状が内因性レトロウイルスと結びつけられ、その一部がヒト疾病(インシュリン依存性糖尿病、播種性紅斑性狼瘡)の動物モデルとして使用される。
(5)顕著なレベルの内因性抗レトロウイルス抗体が、自己免疫性疾病、全身性疾病または炎症性疾病との関係で記述されている。内因性レトロウイルスに関する第4回欧州大会(ウプサラ、1996年10月)で、数人の著者からこの性質の他のデータが伝えられた。Venables(内因性レトロウイルスに関する第4回欧州大会(ウプサラ、1996年10月)の公報)によれば、かなり高レベルの抗−HERVH抗体が妊娠中に確認される。また、直接的関与の証拠は今までに提供されていないが、シェーグレン症候群、播種性紅斑性狼瘡または慢性関節リウマチのような多様な自己免疫疾患の情況においても確認されている。
自己免疫性現象へのレトロウイルスの関与は、遺伝的因子、ホルモン因子、環境因子、感染因子に直面する自己免疫性疾病、全身性疾病または炎症性疾病の多元的特徴と相和性を保持する。
多発性硬化症(Perronら、 Res. Virol. 1989; 140: 551−561/Lancet 1991; 337: 862−863/Res. Virol. 1992; 143: 337−350)を患う患者、または慢性関節リウマチ(未公開データ)を患う患者から得た細胞培養上清で確認された粒子は、次の発現から生じる可能性がある。(i)複製に適した内因性レトロウイルスの発現。(ii)トランス相補の現象により協力し合ういくつかの不完全な内因性レトロウイルスの発現。(iii)外因性レトロウイルスの発現。
これらの観察により、上述の生物学的試料を、自己免疫疾患に対するマーカー、または妊娠障害に対するマーカーとして使用し検討することができる。
特に、以下の標識化方法が考えられる。
− 上述の核酸物質に由来した、高度に厳密なハイブリダイゼーション・プローブを用いてのヒトゲノムのスクリーニング、
− 検討された領域に対して特異的なプライマーを使用する、PCR法によるゲノムDNAの直接増幅、
− 外来細胞遺伝子のフランキング領域の分析。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:
(A)名称:BIO MERIEUX
(B)通り:CHEMIN DE L’ORME
(C)都市名:MAECY L’ETOILE
(E)国名:フランス
(F)郵便番号:69280
(ii)発明の名称:自己免疫疾患および/または妊娠障害に関連する内因性レトロウイルス配列
(iii)配列の数:35
(iv)コンピューターが読み込むことのできる形態:
(A)媒体種:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0,Version #1.30(EPO)
(2)配列番号(SEQ ID NO):1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1321塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:1:
(2)配列番号(SEQ ID NO):2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2938塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:2:
(2)配列番号(SEQ ID NO):3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1422塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:3:
(2)配列番号(SEQ ID NO):4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2006塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:4:
(2)配列番号(SEQ ID NO):5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1948塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:5:
(2)配列番号(SEQ ID NO):6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1136塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:6:
(2)配列番号(SEQ ID NO):7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2782塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:mRNA(DNAとして)
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:7:
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(2)配列番号(SEQ ID NO):9の情報:
(i)配列の特徴:
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(iii)ハイポセティカル:No
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
(A)長さ:2575塩基対
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(ii)配列の種類:DNA
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(i)配列の特徴:
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(ii)配列の種類:DNA
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
(A)長さ:678塩基対
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
(A)長さ:364塩基対
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(i)配列の特徴:
(A)長さ:538塩基対
(B)型:アミノ酸
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(2)配列番号(SEQ ID NO):34の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:52塩基対
(B)型:アミノ酸
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(ii)配列の種類:ペプチド
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(2)配列番号(SEQ ID NO):35の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:48塩基対
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)ハイポセティカル:No
(xi)配列:SEQ ID NO:35:
Claims (11)
- DNAの形態では、配列番号1〜15の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、分離された状態あるいは精製された状態の、組織から取得可能であるレトロウイルスRNA分子。
- 配列番号1〜15の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるいずれかのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列を含む、分離された状態あるいは精製された状態の、組織から取得可能であるレトロウイルスRNA分子。
- RNAまたはDNAの形態では、配列番号16〜28からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項1または2に記載の分子の検出用核酸プローブ。
- マーカーを含むことを特徴とする請求項3に記載のプローブ。
- RNAまたはDNAの形態では、配列番号16〜28を含む群から選択されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項1または2に記載の分子の増幅用核酸プライマー。
- RNAまたはDNAの形態では、請求項1または2に記載の分子を含む複製ベクター。
- 請求項1または2に記載の分子によってコードされるペプチド。
- 請求項1または2に記載の分子を含む診断用組成物。
- 生物学的サンプルを取得する工程;
前記生物学的サンプルを請求項1または2に記載の分子を含む染色体マーカーと接触させる工程;及び
前記マーカーを検出する工程
を含む、異常妊娠または不完全妊娠の検出方法。 - 生物学的サンプルを取得する工程;
前記生物学的サンプルを請求項1または2に記載の分子を含む染色体マーカーと接触させる工程;及び
前記マーカーを検出する工程
を含む、異常妊娠のリスクまたは不完全妊娠のリスクに対する感受性の検出方法。 - 生物学的サンプルを取得する工程;
前記生物学的サンプルを請求項1または2に記載の分子を含む染色体マーカーと接触させる工程;及び
前記マーカーを検出する工程
を含む、異常妊娠のリスクまたは不完全妊娠のリスクに対する感受性と関係している遺伝子の検出方法。
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