JP2002512530A - 自己免疫疾患および／または妊娠障害に関連する内因性レトロウイルス配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分離状態または精製状態の、少なくとも部分的に機能性または非機能性であるゲノムレトロウイルス核酸物質であって、前記ゲノムが、配列番号１〜１５を含む群から選択される参照ヌクレオチド配列、それらの相補的配列、またそれらに同等の配列からなり、特に、１００連続モノマーのすべての配列において、そのヌクレオチド配列が前記配列番号１〜１５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を持っている核酸物質に関する。さらに、本発明は前記物質の利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患および／または妊娠障害に関連する内因性レトロウイルス配列 本発明は、内因性レトロウイルスゲノム型の新規の核酸物質、それを含む種々 のヌクレオチド断片、または前記物質から得られるもの、並びに、少なくとも１ つの自己免疫疾患またはそれに関係している病状、異常妊娠または不完全妊娠に 対するマーカとしてのそれらの使用に関する。 Ｐｐｏｌ−ＭＳＲＶプローブ（配列番号２９）を利用したｃＤＮＡライブラリ ーのスクリーニングにより、推定上の７５８２ヌクレオチドのゲノムＲＮＡを再 構築することができる重複クローンの検出が可能となった。再構築された配列と は、重複クローンのアラインメントから推定された配列を意味するものと解釈す る。このゲノムＲＮＡは、Ｒ−Ｕ５−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒという 構造を持っている。再構築されたゲノムを利用した場合、いくつかのデータ・ベ ースにおける「ｂｌａｓｔｎ」の入力は、大量の関連したゲノム配列（ＤＮＡ） がヒトゲノムに存在することを示す。約４００の配列がＧｅｎＢａｎｋで同定さ れ（図３参照）、２００を越える配列がＥＳＴ（発現された配列タグ）ライブラ リーで同定されたが、大多数はアンチセンスとしてであった。これらの配列は、 Ｘ染色体上の高い見掛け濃度のＬＴＲとともに、いくつかの染色体上、特に染色 体５、７、１４、１６、２１、２２、Ｘ上で確認された。 再構築された配列（ｍＲＮＡ）はゲノムクローンＲＧ０８３Ｍ０５（ｇｂ Ａ Ｃ０００６４）（９．６ｋｂ）内部に完全に含まれており、また、各末端に反復 領域をさらに含んでいるこのクローンの２つの不連続な領域と９６％の類似性を 示す。ＲＧ０８３Ｍ０５クローンのＤＮＡを用いた再構築されたゲノムＲＮＡの ５'領域および３'領域に対応する実験的配列のアラインメントにより、ＬＴＲ配 列を推定し、レトロウイルスの構成分子特性を同定することが可能となった。特 に、それらは逆転写、すなわち５'ＬＴＲの下流域ＰＢＳ（プライマー結合部位 ）および３'ＬＴＲの上流域ＰＰＴ（ポリプリン域）に関係していた。Ｕ３構成 分子は、哺乳動物Ｃ型レトロウイルスと比較すると非常に短く、Ｄ型レトロウイ ルス および鳥類レトロウイルスに関して通常記載されているＵ３領域に大きさが相当 することを確認した。ＰＢＳ領域は鳥類レトロウイルスのＰＢＳに相同性があり 、このことは逆転写用プライマーとしてのｔＲＮＡ^Trpの使用を示唆している。 従って、この新規のＨＥＲＶ（ヒト内因性レトロウイルス）のファミリーをＨＥ ＲＶ−Ｗと称した。 ｐｏｌ領域の系統的分析から、ＨＥＲＶ−ＷファミリーがＥＲＶ−９ファミリ ーおよびＲＴＶＬ−Ｈファミリーと系統的につながっており、Ｉ型内因性レトロ ウイルスのファミリーに属していることが明らかとなった。また、ｅｎｖのオー プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の系統的分析により、ＨＥＲＶ−Ｗファミ リーがＣ型哺乳動物レトロウイルスよりもＤ型サルレトロウイルスおよび鳥類網 内皮症レトロウイルスに近いものであり、Ｃ／Ｄキメラゲノム構造を示唆してい ることが確認できた。 高「ブートストラップ」値によって支持された系統樹は、ＥＲＶ−９ファミリ ーおよびＨＥＲＶ−Ｗファミリーが独立している挿入の２つのウェーブに由来し ていることを示している。従って、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーの開始点の活性構成 分子は、ＥＲＶ−９ファミリーを誘導したものの活性構成分子とは異なる。さら に、ＨＥＲＶ−ＷのＰＢＳはおそらくｔＲＮＡ^Trpを利用するが、ＥＲＶ−９は おそらくｔＲＮＡ^Argを利用する。 最後に、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーの要素は胎盤中で発現するが、ＥＲＶ−９Ｒ ＮＡはこの組織では検出されない。 ＨＥＲＶ−Ｗの生物学的機能 胎盤に限定されたＨＥＲＶ−Ｗの発現、および潜在的にレトロウイルスのエン ベロープをコードする長いリーディングフレームによって、機能障害を病状と関 連づけすることができる生理学的生物学的機能を提案することができる。 胎盤に限定される発現は、ＬＴＲの制御下におけるレトロウイルス遺伝子およ び／または非レトロウイルス遺伝子の発現が、ホルモン依存性の可能性があるこ とを示している。これらの遺伝子は隣接していてもよく、分離されたＬＴＲの制 御下にあってもよい。その後、様々な因子、すなわち、ウィルス感染（例えばヘ ルペスウイルス・ファミリーの一部による）または局所型免疫活性化によってサ イレントＬＴＲが再活性化された後、異常発現により病状が発症し得る。さらに 、ＬＴＲのレベルでの多形性がこれらの状態を促進する可能性がある。 ＨＥＲＶ−Ｗのエンベロープは、特に胎盤の細胞亜型のレベルで融合的機能を 果たすことが可能であった。このエンベロープの免疫抑制性ペプチドにより、胎 児を母体免疫系による作用から保護することができた。最終的には、ＨＥＲＶ− Ｗのエンベロープは、受容体の飽和機構によって外因性レトロウイルス感染に対 する保護機能を果たすことができた。局所的な細胞性免疫の機能障害は、エンベ ロープにより伝えられた免疫賦活化シグナルに起因すると思われる。この作用は 、多形現象または投与量作用（過剰発現）のいすれかの後で免疫賦活化が生じる 免疫抑制性領域、または超抗原活性を伝える領域と関係すると考えられる。 内因性ＬＴＲまたはレトロウイルスエンベロープの生物学的機能の機能障害に 関係するこれらの前後関係を確認し、結果を理解することにより、異常妊娠また は不完全妊娠、あるいは多発性硬化症または慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患 の状態診断方法またはモニタリング方法を確立することができる。 本発明によれば、明確に証明し、下記に記述した、内因性状態において、レト ロウイルスの構成を有し、自己免疫疾患およびそれに関連している病状、あるい は、異常妊娠または不完全妊娠と関連付けることが可能な、新規の核酸物質を発 見した。 本発明による核酸物質は、ｍＲＮＡの形で約８ｋｂである。図１にそれを示し 、配列番号１１に記述した。またゲノムＤＮＡの形態における核酸物質を図２に 示した。 「レトロウイルス型の」発現とは、レトロウイルスの構成、および／またはそ の機能性配列またはコード配列に関係した１つ以上のヌクレオチド配列を含むと 考えられる核酸物質による特性を意味すると理解する。 この参照核酸物質は、発現ＨＥＲＶ−Ｗと称されるヒト内因性レトロウイルス と関係する。従って、それは下記に示した任意のヒトＤＮＡのライブラリー、ま たは胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする適当な技術によって、特に 、配列番号１１の全部または一部とハイブリダイズするように合成された核酸プ ライマーまたはプローブを用いることによって得ることができる。 さらに、本発明は、配列番号１１に記載の核酸物質から得られた核酸生成物ま たはペプチド生成物、または配列番号１１に記載の核酸物質に由来した核酸生成 物またはペプチド生成物に関する。 また、最後に、本発明は、任意の自己免疫疾患および／またはそれに関係する 病状、並びに異常妊娠または不完全妊娠と、上述の核酸物質および／またはそれ に由来した生成物との間に生じ得る様々な相関作用に関係する。 「自己免疫」という用語は、特に、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、播種性 紅斑性狼瘡、インシュリン依存性糖尿病、および／またはそれらに関係している 病状を意味すると解釈する。 まず第一に、本発明は、少なくとも部分的に機能性、または非機能性である、 分離された状態または精製された状態のレトロウイルスゲノム型の核酸物質に関 する。 本物質は、そのゲノムが配列番号１〜１５の配列、それらに相補的な配列、お よびそれらに同等の配列を含む群から選択された参照ヌクレオチド配列を含み、 特に、１００連続モノマーの任意の配列において、そのヌクレオチド配列が前記 配列番号１〜１５のそれぞれと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％ 、例えば、少なくとも９０％の相同性を示すことを特徴とする。 さらに、本物質は、そのゲノムが、少なくとも３０アミノ酸の任意の連続す る配列において、上述の参照ヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的部分に よりコードされ得るペプチド配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７ ０％の相同性を示す任意のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列を含 むことを特徴とする。 特に、この物質は、ＬＴＲ領域、およびレトロウイルスゲノム構造に対するｇ ａｇ遺伝子にそれぞれ対応する２つの配列の間に挿入された核酸断片、特に配列 番号１２の配列からなる核酸断片またはそれを含む核酸断片を含む。 さらに、本発明は、クローンｃｌ．ＰＨ７４（配列番号７）、ｃｌ．ＰＨ７（ 配列番号８）およびｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（配列番号９）として例示されたような欠失 を有する配列番号１１と同一のヌクレオチド配列からなるサブゲノムのレトロウ イルス型の核酸物質に関する。なお、欠失はスプライシング方法または他の方法 によって生じたものである。 上述の核酸物質は、少なくとも１つのレトロウイルスのタンパク質をコードす る少なくとも１つの機能性のヌクレオチド配列、および／または少なくとも１つ の制御性ヌクレオチド配列を含む。 次に、本発明は、下記のａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）からなる群から選択され たヌクレオチド配列を含む、少なくとも１００塩基の任意のヌクレオチド断片に 関する。 ａ）上述の核酸物質の一部のヌクレオチド配列の全部、または完全なヌクレオ チド配列の全部、 ｂ）ｃｌ．６Ａ２（配列番号１）、 ｃｌ．６Ａｌ（配列番号２）、 ｃｌ．７Ａ１６（配列番号３）、 ｃｌ．Ｐｉ２２（配列番号４）、 ｃｌ．２４．４（配列番号５）、 ｃｌ．Ｃ４Ｃ５（配列番号６）、 ｃｌ．ＰＨ７４（配列番号７）、 ｃｌ．ＰＨ７（配列番号８）、 ｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（配列番号９）、 ｃｌ．４４．４（配列番号１０）、 ＨＥＲＶ−Ｗ（配列番号１１）、 ｃｌ．６Ａ５（配列番号１２）、 ｃｌ．７Ａ２０（配列番号１３）、 ｃｌ．７Ａ２１（配列番号１４）、 ＬＴＲ（配列番号１５） のクローンを含む群から選択されたクローンの一部のヌクレオチド配列の全部、 または完全なヌクレオチド配列の全部、 ｃ） ａ）とｂ）に記載の配列にそれぞれ相補的な配列、 ｄ） ａ）〜ｃ）に記載の配列にそれぞれ同等な配列、特に、ａ）〜ｃ）に記 載の配列と、任意の１００連続モノマーの配列において、少なくとも５０％、好 ましくは少なくとも７０％、またはより好ましくは少なくとも８０％、例えば少 なくとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列。 さらに、本発明は、上述のように、核酸物質と特異的にハイブリダイズし得る ことを特徴とする、核酸へ挿入その他が行われる、核酸物質の検出用の任意の核 酸プローブに関する。 そのようなプローブはマーカーまたはその他を含む。 また、本発明は、上述のような核酸物質または核酸断片と特異的にハイブリダ イズし得るヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＲＮＡのまたはＤＮＡの 重合による増幅を行うための核酸プライマーに関係する。 一例として、本発明による核酸プローブまたは核酸プライマーは、配列番号１ ６〜２８を含む群から選択されたヌクレオチド配列からなることを特徴とする。 さらに、本発明は、上述のようなヌクレオチド断片を含む、任意のＲＮＡまた はＤＮＡ、特に複製ベクターに関する。 さらにまた、本発明は、上記のようなヌクレオチド断片、特にポリペプチド、 例えば、自己免疫疾患またはそれに関係する病状を患った患者、あるいは異常妊 娠または不完全妊娠の患者から得た血清により認識される抗原決定基を形成する オリゴペプチド、に属する任意のオープンリーディングフレームによってコード された任意のペプチドに関する。 一例として、このポリペプチドは、１つ以上のレトロウイルスＥＮＶタンパク 質をコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド断片によりコ ードされている。 最後に、本発明は次の事項に関係する。 − 自己免疫疾患またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠または不 完全妊娠に対する分子マーカーとしての、上述のような核酸物質、ヌクレオチド 断片、またはペプチドの利用。 − 自己免疫疾患の罹病性またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠 または不完全妊娠のリスクに対する染色体マーカーとしての、上述のような核酸 物質またはヌクレオチド断片の利用。 − 自己免疫疾患またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠または不 完全妊娠のリスクに対する感受性についての近接マーカーとしての、上述のよう な核酸物質またはヌクレオチド断片の利用。 さらに、本発明は、ＲＮＡの形態、またはＤＮＡの形態のいずれかの、上述の ような任意のヌクレオチド断片を生物学的身体物質で、特に体液で同定および／ または定量することを特徴とする、自己免疫疾患、またはそれに関係している病 状、あるいは異常妊娠または不完全妊娠の分子標識化のための方法に関係する。 一例として、そのような方法によって、上述のようなヌクレオチド断片を発現 する細胞を前記の生物学的身体物質で検出した。 本発明は、上述のような核酸物質、ヌクレオチド断片、またはペプチドの診断 上および／または治療上における利用に関し、また、そういうものであるので、 本発明の別の目的は、前記物質、前記断片または前記ペプチドを含む診断上の組 成物あるいは治療上の組成物である。 本発明を詳述する前に、明細書および請求の範囲において使用された種々の用 語をここに定義する。 − ヒト・ウイルスはヒトに感染し得る、または潜在し得るウイルスを意味す ると解釈する。 − 本発明の実用的実施において生じ得る天然または誘発性のすべての変異体 および／または組換え体を考慮して、上述の記載および請求の範囲に記載の本発 明の主題は、以下に記述した種々の生物学的生体試料の同等物または誘導体、特 に、相同性ヌクレオチドまたはペプチド配列を含んで示される。 − 本発明のウイルスの変異体、または病原性および／または感染性成分の変 異体は、前記ウイルスおよび／または前記病原性および／または感染性成分の少 なくとも一つの対応抗原に対して向けられた少なくとも一つの抗体によって認識 される少なくとも一つの抗原、および／または、任意部位が、当業者に周知の所 定のハイブリダイゼーション条件下で、前記ウイルスおよび／または前記病原性 および／または感染性成分に対して特異的な少なくとも１つのハイブリダイゼー ション・プローブおよび／または少なくとも１つのヌクレオチド増幅プライマー によって検出されるゲノム、特にＨＥＲＶ−Ｗファミリーに属するゲノムを含む 。 − 本発明によれば、ヌクレオチド断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオ チドは、所定の条件下に他のヌクレオチド断片とハイブリダイズし得る、情報ま たはその他の、天然核酸配列によって特徴化されたモノマーまたはバイオポリマ ーの延長であり、それは、異なる化学的構造のモノマーを含むように、また、天 然の核酸分子から得られるように延長することができ、および／または遺伝的組 換えおよび／または化学合成の手段によって延長することが可能である。ヌクレ オチド断片は、本発明によって検討されたＨＥＲＶ−Ｗファミリーの構成分子の ゲノム断片と同一であってもよく、特に後者の遺伝子、例えば、前記構成分子場 合、ｐｏｌまたはｅｎｖと同一であってよい。 − 例えば、モノマーは核酸の天然のヌクレオチドであって良く、その構成 元素は糖、燐酸基および窒素塩基である。ＲＮＡでは、糖がリボースであり、Ｄ ＮＡでは、糖が２−デオキシリボースである。ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれてい るかどうかによって、窒素塩基はアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チ ミンから選択され、また、３つの構成元素の少なくとも１つでヌクレオチドが修 正されていてもよい。一例として、その修飾は塩基のレベルで生じ、イノシン、 ５−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、５−（ジメチルアミノ）デオ キシウリジン、２、６−ジアミノプリン、５−ブロムデオキシウリジンのような 修飾塩基およびハイブリダイゼーションを促進する他の修飾塩基を生成すること ができる。糖のレベルでは、修飾は少なくとも１つのデオキシリボースがポリア ミドと置換して生じ、また、燐酸基のレベルでは、修飾はエステル、特に、二燐 酸塩、アルキルおよびアリールホスホナートおよびホスホロチオアートエステル から選択されるエステルとの置換によって生じる。 − 「機能性の」という用語は、ヌクレオチド配列、核酸物質またはヌクレオ チド断片が「情報配列」を含むことによる特性を意味すると解釈する。 − 「情報配列」は、化学的本質および基準方向における秩序が天然の核酸と 同じ質の機能的情報、例えば、タンパク質をコードするリーディングフレーム、 調節配列、スプライシング部位または組換え部位を構成等するモノマーの任意の 規則正しい配列を意味すると解釈する。 − ハイブリダイゼーションは、特に、厳密な条件で、複合体、特に、二重構 造または三重構造、好ましくはａヘリックス形状を生成するよう相補的な配列、 対を十分に保持した２つのヌクレオチド断片を適切に操作する方法を意味すると 解釈する。 − プローブは、特に化学的手段または重合手段によって合成されたヌクレオ チド断片、または、より長いヌクレオチド断片の酵素的消化または切断によって 得られたヌクレオチド断片からなる。また、それは少なくとも６つのモノマー、 好ましくは１０〜１００のモノマー、さらに好ましくは１０〜３０のモノマーか らなり、所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を持つ。１０未満のモノ マーを有するプローブは単独で使用せずに、大きさまたは他の点で等しく短い他 のプローブの存在下で使用することが好ましい。ある特定の条件の下では、１０ ０モノマーより大きな大きさのプローブを使用することが有効であると思われる 。プローブは、診断の目的として特に使用することが可能であり、それには、例 えば捕捉プローブおよび／または検出プローブが含まれる。 − 捕捉プローブは、任意の適当な手段、すなわち、直接的にまたは間接的に 、例えば共有原子価または受動的吸着によって固体担体上に固定化することがで きる。 − 検出プローブは、ラジオアイソトーブ、ペルオキシダーゼまたはアルカリ ホスファターゼおよび色素産生、蛍光生成または発光性の基質を加水分解し得る ものから特に選択された酵素、発色化学化合物、色素産生、蛍光生成または発光 性の化合物、ヌクレオチド塩基類似体およびビオチンから特に選択されたマーカ ーによって標識化することができる。 − 本発明の診断の目的で使用されるプローブは、当業者に公知のすべてのハ イブリダイゼーション方法、特に、「ドットブロット」、「サザンブロット」、 サザンブロット方法と同一の方法であるが標的としてＲＮＡを用いる「ノーザン ブロット」、サンドイッチ法と称される方法で用いることができる。本発明にお いてはサンドイッチ方法を使用するのが好ましく、それは特定の捕捉プローブお よび／または特定の検出プローブからなり、その捕捉プローブおよび検出プロー ブは、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有していなければならない と解する。 − 本発明による任意のプローブは、ｉｎ ｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒ ｏでＲＮＡと、および／またはＤＮＡとハイブリダイズし、複製の現象、特に、 翻訳および／または転写をブロックすること、および／または前記ＤＮＡおよび ／または前記ＲＮＡを減成させることができる。 − プライマーは少なくとも６つのモノマー、好ましくは１０〜３０のモノマ ーからなるプローブであり、所定の条件下に、ＰＣＲ（合成酵素連鎖反応）のよ うな増幅方法、シーケンシングのような延長方法、逆転写方法等の酵素的重合の 連鎖開始反応において、ハイブリダイゼーション特異性を保持する。 − 検討された応用または使用に関して、またはそれらを用いる方法において 、同一ではなく、機能的に対応するバイオポリマーが実質的に同じ機能を働き得 る場合、２つのヌクレオチドまたはペプチド配列は、同等であるか互いから由来 したもの、または参照配列に相対的であるものと言える。特に同等とは、同一個 体内の自然的変異性、または同じ種内である同一個体から別の個体へ自然的多様 性により得られた２つの配列であり、特に、同定された種の自然突然変異、また は誘発突然変異、並びに下記に定義されている相同性の２つの相同性配列である 。 − 「変異性」とは、自発性または誘発性の配列の任意の修飾、特に、ヌクレ オチドの、および／またはヌクレオチド断片の置換、および／または挿入、およ び／または欠失、および／または少なくとも１つの末端での配列の延長、および ／または短縮を意味すると解釈する。人為的な変異性は用いた遺伝的工学方法に より得ることができる。例えば、核酸の増幅に対して選択された合成プライマー により変性するかその他の状態になる。この変異性は、参照配列のように検討さ れた、任意の開始配列の修飾を生成し得る。そして、それは前記参照配列に相対 的な相同性の程度によって示され得る。 − 相同性は、比較される２つのヌクレオチドまたはペプチド断片の同一性の 程度を特徴づける。それは同一性百分率で評価し、特に、参照ヌクレオチドまた はペプチド配列に対する、ヌクレオチドまたはペプチドの配列の直接比較によっ て決定する。 − ヌクレオチド断片、特に、本発明において同一個体から得られたクローン についてこの同一性百分率を特異的に決定した。制限されない一例として、同一 個体からの異なるクローン（配列番号１３および１４を参照）間で確認された最 も低い同一性百分率は少なくとも９０％であり、また、２つの個体の異なるクロ ーン間で確認された最も低い同一性百分率は少なくとも８０％であった。 − 参照断片の配列に同等なヌクレオチド配列を示す場合、任意のヌクレオチ ド断片は、その参照断片に同等またはそれに由来したものといえる。この定義に よれば、参照ヌクレオチド断片と同等であるとは以下のとおりである。 （ａ）少なくとも部分的に参照断片の相補体とハイブリダイズすることが可能 な任意の断片。 （ｂ）参照フラグメントとのアラインメントが、別の分類群から得た他の断片 とのアラインメントよりも大きな数で同定されている同一連続塩基を導く任意の 断片。 （ｃ）同一個体内の自然的変異性から、および同一種内の１つの個体から別の 個体への自然的多様性から形成されるか、形成し得る任意の断片、 （ｄ）参照断片に用いた遺伝工学方法から形成し得る任意の断片、 （ｅ）参照断片によってコードされたペプチドに相同的なペプチド、または同 一であるペプチドをコードする少なくとも８つの連続するヌクレオチドを含んで いる任意の断片。 （ｆ）少なくとも末端の１つでの挿入、欠失、少なくとも１つのモノマーの置 換、延長または短縮により参照断片と異なる任意の断片。例えば、少なくとも１ つのその末端で、ポリペプチドをコードしないヌクレオチド配列が隣接している 参照断片に対応する任意の断片。 − 参照核酸物質の一部のヌクレオチド配列または完全なヌクレオチド配列は 、共同キャプシド形成または同時発現によって結合した任意の配列、または前記 参照核酸物質と再結合した任意の配列を意味するものと解釈する。 − ポリペプチドは、特に、少なくとも２つのアミノ酸の任意のペプチド、特 に、人間の操作による関与を介して抽出、分離、あるいは実質的に遊離、または 合成されたオリゴペプチドまたはタンパク質、特に、化学合成、または組換え生 命体での発現によって得られたものを意味すると解釈する。 − ヌクレオチド断片によって部分的にコードされたポリペプチドは、前記ヌ クレオチド断片に含まれる少なくとも９つの連続するモノマーによってコードさ れる少なくとも３つのアミノ酸を有するポリペプチドを意味すると解釈する。 − 極性、疎水性および／または塩基性度、および／または酸性度、または中 性のようなそれらのそれぞれの物理化学的特性が実質的に同じである場合、アミ ノ酸は別のアミノ酸と類似性があると言える。例えば、ロイシンはイソロイシン と類似している。 − 比較されたポリペプチドが同一特性、特に、同一の抗原的、免疫学的、酵 素学的および／または分子認識の特性を実質的に有している場合、任意のポリペ プチドは参照ポリペプチドと同等である、あるいはそれに由来したものと言える 。特に、参照ポリペプチドとの同等なものは以下のとおりである。 （ａ）類似のアミノ酸で少なくとも１つのアミノ酸が置換された配列を有する 任意のポリペプチド。 （ｂ）前記参照ポリペプチドの、および／または前記ポリペプチドをコードす るヌクレオチド断片の自然的または誘発的変異によって得られた同等のペプチド 配列を有する任意のポリペプチド。 （ｃ）前記参照ポリペプチドのミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、 （ｄ）１つ以上のＬ型アミノ酸をＤ型アミノ酸と置換した任意のポリペプチド 、あるいはその逆の任意のポリペプチド。 （ｅ）例えばアミン官能基のアセチル化、チオール官能基のカルボキシル化、 カルボキシル官能基のエステル化のようなアミノ酸の側鎖の修飾が導入された任 意のポリペプチド。 （ｆ）１つ以上のペプチド結合が修飾された配列の任意のポリペプチド。例え ば、カルバ、レトロ、インバース、レトロ-インバース、還元またはメチレンオ キシ結合。 （ｇ）少なくとも１つの抗原が、参照ポリペプチドに向けられた抗体によって 認識される任意のポリペプチド。 − 本発明の、２つの比較されたペプチド断片間の相同性を特徴とする同一性 百分率は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％である。 第１ヌクレオチド配列のような、本朋細書および請求の範囲で用いられる配列 に関する表現は、特定の配列を表現するために選択されたのではなく、本発明を より明白に定義するためである。 物質または成分の検出は、同定または定量の両方、または前記物質または前記 成分の分離または単離を意味するものと解釈する。 以下の添付された図を参照し、続く詳細な明細書を読むことによって本発明を より明白に理解する。 − 図１は、一つには、本発明によって発見された内因性レトロウイルス物質 の構成を推定上のゲノムｍＲＮＡの形として表わしており、また、一方では、こ の構成に関連した本発明により用いられるクローンの位置を示した。長さの測定 尺度はｋｂで表し、フランキング領域（５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲ）は平行斜線 枠で示した。これらの２つのフランキング領域で繰り返された領域は黒い矢印で 示した。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に対応する領域を黒、白色およびグ レーでそれぞれ示した。また、Ｐｐｏｌ−ＭＳＲＶプローブの位置を示した。 − 図２は、クローンＲＧ０８３Ｍ０５として図示した遺伝子的構成（ＤＮＡ ）の可能性、およびこの配列に関係するスプライシング方法、実験的クローン（ ｍＲＮＡ）を示す。また、この図はレトロウイルス生物体に関して確認されたス プライス部位を示す。さらに、この図で示されたものは次のとおりである。 用いたプローブの位置（Ｐｇａｇ−ＬＢ１９、Ｐｐｒｏ−Ｅ、Ｐｐｏｌ−ＭＳ ＲＶ、およびＰｅｎｖ−Ｃ１５）。 スプライス供与部位（ＤＳ１およびＤＳ２）および受容部位（ＡＳ１〜ＡＳ３ ）。 下段文字枠中のクローンＲＧ０８３Ｍ０５から得られた配列、および上部文字 枠中の実験的胎盤クローン（ｍＲＮＡ）に由来した配列。 推定上のＯＲＦ（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３）。 および垂直平行線の形で示した、ＤＮＡの形で存在するがＲＮＡの形では検出 されない２ｋｂの挿入断片。 この図で使用した他のきまりは、図１に対するものと同様である。 − 図３は、分離されたｃＤＮＡクローンに対応するゲノム（ＤＮＡ）クロー ンを図示する。この図で示されたものは次のとおりである。 再構築されたゲノムＲＮＡ（Ｒｅｃｏｎｓ ＲＮＡ）に関しての類似性百分率 。 これらのゲノムの各末端での反復配列の存在（反復）。 およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在および大きさ。 − 図４は、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーを同定する系統的分析を表わす。 − 図５は、いくつかの胎盤クローンの末端５'および／または３'領域を有す るクローンＲＧ０８３ＭＯ５の５'および３'フランキング領域のアラインメント を表わす。３'および５'ＬＴＲに隣接するＣＡＡＣタンデムについては、ＤＮＡ 配列の下に二重線を付した。７８３ｂｐ（塩基対）のコンセンサスＬＴＲ配列は アラインメントの下に示す。ＬＴＲ５'末端の土流のＰＰＴ、およびＬＴＲ３'末 端の下流のＰＢＳを示す。Ｕ３ＲおよびＵ５の領域を示す。転写因子の結合に対 応する部位に下線を付し、１〜６まで番号に付けた。領域−７３〜２８４は、「 ＣＡＴアッセイ」で評価された配列に対応する。＊は「キャップ形成」に関する 推定上の部位と一致する。［ｐｏｌｙＡ］はポリアデニル化シグナルを示す。 − 図６は、３つの異なる胎盤ｃＤＮＡクローンから得られたＨＥＲＶ−Ｗエ ンベロープポリペプチド（ＯＲＦ１）の推定上の配列を表わす。リーダーペプチ ド（Ｌ）、表面タンパク質（ＳＵ）およびトランスメンブレンタンパク質（ＴＭ ）を矢印で示す。疎水性融合ペプチドおよびトランスメンブレンカルボキシ領域 にそれぞれ一重線および二重線を付した。免疫抑制領域はイタリック体で示した 。可能性のあるグリコシル化部位は小点により示した。分岐アミノ酸は下の行に 示した。さらに、図６は図２に記載したようなＯＲＦ２およびＯＲＦ３に対応す るオープンリーディングフレーム、および、特に、レトロウイルス制御遺伝子と の相同性を示す。 前述で明白に説明した核酸物質は、下記に記述した実験手順の終わりに発見し 特性を決定したが、この手順により、本発明の範囲および添付の請求の範囲の範 囲を制限することはできないことを理解すべきである。 実施例 １ 重複ｃＤＮＡ断片の分離とシーケンシング ＨＥＲＶ−Ｗの構成に関係する情報は、プローブＰｐｏｌ−ＭＳＲＶ（配列番 号２９）およびＰｅｎｖ−Ｃ１５（配列番号３１）（実施例８参照）を用いて胎 盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔ＃ＨＬ５０１４ａ）を試験 し、次に、得られた新規の配列を利用した「遺伝子歩行（ｇｅｎｅ ｗａｌｋｉ ｎｇ）」を実施して得た。実験は、ライブラリーの供給者の助言を参考にして実 施した。また、この構成を推察するためにＤＮＡのＰＣＲ増幅を利用した。 いくつかのクローンを選択し、シーケンシングした（図１を参照）。 − クローンｃｌ．６Ａ２（配列番号１）：ＨＥＲＶ−Ｗの非翻訳５'領域およ びｇａｇの一部 − クローンｃｌ．６Ａ１（配列番号２）：ｇａｇ、およびｐｏｌの一部 − クローンｃｌ．７Ａ１６（配列番号３）：ｐｏｌの３'領域 − クローンｃｌ．Ｐｉ２２（配列番号４）：ｐｏｌの３'領域およびｅｎｖの 開始点 − クローンｃｌ．２４．４（配列番号５）：ＨＥＲＶ−Ｗの非翻訳５'領域の 一部からなるスプライスされたＲＮＡ、ｐｏｌの末端およびｅｎｖの５'領域 − クローンｃｌ．Ｃ４Ｃ５（配列番号６）：ｅｎｖの末端およびＨＥＲＶ−Ｗ の非翻訳３'領域 − クローンｃｌ．ＰＨ７４（配列番号７）：サブゲノムＲＮＡ：ＨＥＲＶ−Ｗ の非翻訳５'領域、ｐｏｌの末端、ｅｎｖおよびＨＥＲＶ−Ｗの非翻訳３'領域 − クローンｃｌ．ＰＨ７（配列番号８）：多重スプライスされたＲＮＡ：ＨＥ ＲＶ−Ｗの非翻訳５'領域、ｅｎｖの末端およびＨＥＲＶ−Ｗの非翻訳３'領域。 − クローンｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（配列番号９）：部分的ｐｏｌ遺伝子およびＵ３− Ｒ領域 − クローンｃｌ．４４．４（配列番号１０）：Ｒ−Ｕ５領域、ｇａｇ遺伝子お よび部分的ｐｏｌ遺伝子。 これらのクローンを利用して配列アラインメントを行なうことによって、ＨＥ ＲＶ−Ｗの完全な配列のモデルを作製した。可能性のあるスプライス供与部およ び受容部位とともにスプライスされたＲＮＡを同定した。この情報の集合を図２ に示す。既存のレトロウイルスとの類似性の試験を行い、ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏ ｌおよびｅｎｖの構成要素を明らかにした。 ＲＮＡ形態のＨＥＲＶ−Ｗの推定上の遺伝子的構成は以下のとおりである（配 列番号１１）。 遺伝子 １．．７５８２ 再構築されたゲノムＲＮＡ配列上のクローンの位置 ｃｌ．６Ａ２（１３２１ ｂｐ）１〜１３２５、 ｃｌ．ＰＨ７４（５３５＋２２２９＝２７６４ｂｐ）７２〜６０６および５ ３５３〜７５８２、 ｃｌ．２４．４（４９１＋１４５７＝１９４８ｂｐ）、１１５〜６０６およ び５３５３〜６８１０； ｃｌ．４４．４（２３７２ｂｐ）１１５〜２４９６、 ｃｌ．ＰＨ７（３６９＋２９７＝６６６ｂｐ）２３７〜６０６および７０１ ７〜７３１３、 ｃｌ．６Ａ１（２９３８ｂｐ）５８６〜３５５９、 ｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（２７８５＋５６６＝３３５１ｂｐ）２７４７〜５５５７お よび７０１７〜７５８２、 ｃｌ．７Ａ１６（１４２２ｂｐ）２９０８〜４３３７、 ｃｌ．Ｐｉ２２（３１７＋１６８９＝２００６ｂｐ）３９５７〜４２７３お よび４４７６〜６１６８、 ｃｌ．Ｃ４Ｃ５（１１１６ｂｐ）６４６７〜７５８２ ５'ＬＴＲ １．．１２０ 注記＝「５'ＬＴＲのＲ（不確定の５'末端」 １２１．．５７５ 注記＝「５'ＬＴＲのＵ５」 別の構成 ５７９．．５９６ 注記＝「ｔＲＮＡ−Ｗに対するＰＢＳプライマー結合部位」 別の構成 ６０６ 注記＝「スプライス部位（スプライス供与部位ＡＴＣＣＡＡ ＡＧＴＧ−ＧＴＧＡＧＴＡＡＴＡ、およびスプライス受容部位ＣＴＴＴＴＴＴＣ ＡＧ−ＡＴＧＧＧＡＡＡＣＧ クローンＲＧ０８３Ｍ０５、ＧｅｎＢａｎｋａｃ ｃｅｓｓｉｏｎ ＡＣ００００６４）」 別の構成 ５３５３ 注記＝「ＯＲＦ１（ｅｎｖ）に対するスプライス受容部位」 別の構成 ５５６０ 注記＝「スプライス供与部位」 ＯＲＦ ５５８１．．７１９４ 注記＝「ＯＲＦ１ ｅｎｖ ５３８ ＡＡ」 ／生成物−＝「エンベロープ」 別の構成 ７０１７ 注記＝「ＯＲＦ２およびＯＲＦ３に対するスプライス受容部位 」 ＯＲＦ ７０３９．．７１９４ 注記＝「ＯＲＦ２ ５２ ＡＡ」 ＯＲＦ ７１１２．．７２５５ 注記＝「ＯＲＦ３ ４８ ＡＡ」 別の構成 ７２４４．．７２５４ 注記＝「ＰＰＴ ポリプリン域（ｔｒａｃｔ）」 ３'ＬＴＲ ７２５６．．７５８２ 注記＝「３'ＬＴＲのＵ３−Ｒ（Ｕ３−Ｒ接合部は不確定であ る）」 別の構成 ７５６３．．７５６９ ポリアデニル化シグナル 実施例２ 分離されたＤＮＡクローンに対応するゲノム（ＤＮＡ）クローンの同定 再構築されたゲノムを利用して、いくつかのデータ・ベースでの「ｂｌａｓｔ ｎ」の入力により、関連する大量の配列がヒトゲノムに存在することが示された 。約４００の配列がＧｅｎＢａｎｋで、２００を越える配列がＥＳＴライブラリ ーで同定され、その大多数がアンチセンスとして同定された。図３で図示した、 大きさおよび類似性において最も重要な４つの配列は、次のゲノム（ＤＮＡ）ク ローンであった。 染色体の位置が７ｑ２１〜７ｑ２２であるヒト・クローンＲＧ０８３Ｍ０５（ ｇｂ ＡＣ００００６４）、 １４ｑ１１〜１２に位置した、Ｔ細胞受容体のαデルタ座に対応するヒト・ク ローンＢＡＣ３７８（ｇｂ Ｕ８５１９６，ｇｂ ＡＥ０００６６０）、 染色体２１の２１ｑ２２．３領域に対応するヒトコスミドＱ１１Ｍ１５（ｇｂ ＡＦ０４５４５０）、 染色体Ｘｑ２２上のコスミドＵ１３４Ｅ６（ｅｍｂｌ Ｚ８３８５０）。 各々のクローンに対する配列領域の位置を示し、染色体との関連を角括弧中に 示した。ゲノムの各末端における反復配列の存在、および最大のリーディングフ レーム（ＯＲＦ）の大きさとともに、４つの配列と再構築されたゲノムＲＮＡの 間の類似性百分率（広い欠失のない）を示す。これらのクローンのうちの３つク ローンの末端で反復配列を確認した。再構築された配列はクローンＲＧ０８３Ｍ ０５（９．６ｋｂ）内に完全に含まれており、９６％の類似性を示した。しかし ながら、クローンＲＧ０８３Ｍ０５は、非翻訳５'領域（５'ＵＴＲ）の下流域す ぐ近くに位置した２ｋｂの挿入断片を示した。この挿入断片は、さらに、非翻訳 ３'領域（３'ＵＴＲ）の土流域すぐ近くに２．３Ｋｂの欠失を示す他の２つのゲ ノムクローンでも確認された。クローンは３つの機能性リーデイングフレーム（ ＯＲＦ）、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含んではいなかった。クローンＲＧ０ ８３Ｍ０５は、エンベロープ全体に対応する５３８のアミノ酸（ＡＡ）のＯＲＦ を示す。コスミドＱ１１Ｍ１５は、短縮されたｐｏｌポリタンパク質に対応する ３０５のＡＡ（フレーム＋１）および４１３のＡＡ（フレーム０）という２つの 大きな連続したＯＲＦを含んでいる。 実施例３ 系統的分析 再構築されたゲノムＲＮＡの１１の異なる部分領域上の核酸レベル、およびｅ ｎｖの２つの異なる部分領域上のタンパク質レベルで系統的分析を行なった。研 究された領域にかかわらず、得られたすべての枝分かれ図は同一トポロジーを示 した。得られた配列とＥＲＶ−９およびＲＴＬＶ−Ｈの間で最も保存されたＬＴ Ｒおよびｐｏｌ領域の核酸のレベルについて図４に説明した。枝分かれ図は、実 験の配列がＥＲＶ−９とは異なり、また「ブートストラップ」分析により下線を 付したＲＴＬＶ−Ｈとは非常に異なる新規のファミリーを説明していることを明 らかに示している。これらの配列は、いくつかの染色体上、特に、Ｘ染色体上の 高い見かけ濃度のＬＴＲとともに、染色体５、７、１４、１６、２１、２２およ びＸ上に確認できる。 レトロウイルスのｅｎｖタンパク質で最も保存された領域間のタンパク質レベ ルにおける比較により、ＨＥＲＶ−ＷファミリーがＤ型のサルレトロウイルスに 近似しており、さらに、Ｃ型哺乳動物レトロウイルスよりも鳥類の網内皮症レト ロウイルスに近いものであることがわかった。これはＣ／Ｄキメラゲノム構造を 示唆している。 実施例４ ＬＴＲ、ＰＰＴおよびＰＢＳのエレメントの同定 再構築された配列（ＲＮＡ）は、ゲノムクローンＲＧ０８３Ｍ０５（９．６ｋ ｂ）内に完全に含まれており、各末端にさらに反復領域を含んでいるこのクロー ンの２つの不連続の領域と９６％の類似性を示した。クローンＲＧ０８３Ｍ０５ ［５'（５−ＲＧ−２８０００−２８８７２）および３'（３−ＲＧ−３７５００ −３８３１４）］のＤＮＡで再構築されたゲノムＲＮＡの５'領域および３'領域 に対応する実験的配列のアラインメントにより、ＬＴＲ配列を推定しレトロウイ ルスの構成分子特性を同定することができた。特に、それらは逆転写、すなわち 、５'ＬＴＲの下流域のＰＢＳおよび３'ＬＴＲの上流域のＰＰＴに関与していた （図５参照）。また、哺乳動物のＣ型レトロウイルスで確認されたＵ３エレメン トと比較した場合、そのＵ３エレメントは非常に短く、Ｄ型レトロウイルスおよ び鳥類レトロウイルスについて一般に記述されているＵ３領域の大きさに匹敵す ることを確認した。クローンｃｌ．ＰＨ７４（配列番号７）の塩基２３６４〜２ ７２０に対応する領域をＰＣＲにより増幅し、プロモーター活性の評価を行なう ため、ベクターｐＣＡＴ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローン化した。いわゆ る「ＣＡＴアッセイ」方法により、有意な活性がＨｅＬａ細胞で確認され、ＬＴ Ｒのプロモーター配列の機能性が示された。 ＰＢＳの領域は鳥類レトロウイルスのＰＢＳに相同であった。 実施例５ 遺伝子的構成および発現の制御 ＤＮＡ形態における構成 以下のオリゴヌクレオチド対を使用して、ヒト・ゲノムライブラリー（生成方 法に関しては実施例１を参照）上で再生された全ＨＥＲＶ−Ｗクローンについて ＰＣＲ増幅を実施した。 Ｕ５ ４９９２（配列番号１６）、ＧＡＧ ４６１９（配列番号１７） ＧＡＧ ４７８２（配列番号１８）、ＰＯＬ ３１６７（配列番号１９） ＰＯＬ ３３９０（配列番号２０）、ＰＯＬ ５１４４（配列番号２１） ＰＯＬ ５１４５（配列番号２２）、Ｕ５ ４９９１（配列番号２３）。 ＰＣＲは以下の条件下で実施した。 ０．３３マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチド ＴＡＱポリメラーゼ緩衝液Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ １Ｘ ＴＡＱポリメラーゼＢｏｅｒｈｉｎｇｅｒ ０．５単位 各々０．２５ｍＭのｄＮＴＰの混合物 ヒトＤＮＡ ０．５ｍｇ 最終容量１００ｍｌ ＰＣＲ条件は、（９５℃、５分間）×１、（９５℃、３０秒＋５４℃、３０秒 ＋７２℃、３分間）×３５。 その後、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに沈積させ、泳動の後に分析した。 ＰＣＲは、推測した大きさ（胎盤ライブラリーからのｃＤＮＡから推定した）に 比べて約２ｋｂだけ大きな大きさの断片を生じるＬＴＲ−４９９１−−ｇａｇ− ４６１９ ＰＣＲを除いて、推測した大きさの増幅断片を生じた。従って、内因 性のＤＮＡ形態におけるＨＥＲＶ−Ｗの再構築は、約１０Ｋｂの構成を表わす。 ＰＣＲ−４９９２ ｇａｇ−４６１９のクローニング、シーケンシング、およ び分析の後、挿入領域の存在を配列番号１２（クローンｃｌ．６Ａ５）のＬＴＲ およびｇａｇの間に確認した。この領域は、レトロウイルスの非翻訳の従来領域 に該当しなかった。すなわち、Ψ領域またはＰＢＳ領域はなかった。 さらにＰＣＲ ｐｏｌ−３３９０、ｐｏｌ−５１４４の産物をクローン化し、 得られたクローンのうちの２つをシーケンシングした。これらの配列の結果がク ローンｃｌ．７Ａ２０（配列番号１３）、およびｃｌ．７Ａ２１（配列番号１４ ）である。これらの２つのヌクレオチド配列の比較により、関連する領域に対し ９０％の相同性の結果を得た。このことは、同一個体でのＨＥＲＶ−Ｗの変異性 を示している。 ＤＮＡ形態のＨＥＲＶ−Ｗを図２に示した。 一般的構成：転写方法 得られた多様なｃＤＮＡクローンは、ＤＮＡのＰＣＲで後天的に得られたもの であり、次のように推定される。 − ＬＴＲとｇａｇの間に２ｋｂの挿入配列を有する１０ｋｂのＤＮＡ構成。 ＬＴＲ領域とｇａｇ領域の間に２ｋｂの挿入断片の存在を示すＤＮＡのＰＣＲ の結果は、胎盤から分離されたｃＤＮＡがＲＧ０８３Ｍ０５型のゲノムの発現か ら生じたものであることを示唆している。 − ＬＴＲとｇａｇの間のスプライシングによって生じた１０ｋｂの転写から 得られた８ｋｂのＲＮＡ構成により、連続性ＦＲ（フランキング領域）５'ｇａ ｇを再生することができ、その結果、ノーザンブロッティングで同定されたよう な８ｋｂのＲＮＡが得られた。 プローブｇａｇ（Ｐｇａｇ−ＬＢ１９、配列番号３０）およびプロテアーゼ（ Ｐｐｒｏ−Ｅ、配列番号３２）は８ｋｂ近くの大きさを有するＲＮＡを明らかに し、さらに、プローブＰｅｎｖ−Ｃ１５（配列番号３１）は３．１Ｋｂ近くのＲ ＮＡを明らかにした。上述のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得 られた、非翻訳５'領域に特定された２つのプローブ（クローンｃｌ．６Ａ２に 由来のプローブＰ５'−ｇａｇ−ｃｌ．６Ａ２、およびクローンｃｌ．２４．４ に由来のプローブＰ５'−ｅｎｖ−ｃｌ．２４．４）は、上記の２つのＲＮＡお よび約１．３ｋｂのＲＮＡを明らかにした。ＲＮＡのこの分布は複合体レトロウ イルス転写産物、すなわち、ｇａｇ−ｐｒｏ−ｐｏｌをコードするゲノムＲＮＡ 、エン ベロープをコードするサブゲノムＲＮＡ、および制御遺伝子を潜在的にコードす る１つ以上の多重スプライスされたＲＮＡに特有のものである。 ノーザンブロッティングでは１０ＫｂのＲＮＡを検出しないので、そのような ＲＮＡ（ＬＴＲ−Ｒ−Ｕ５−挿入部−ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＥＮＶ−Ｕ３−Ｒ−ＨＥ ＲＶ−Ｗ）の半減期は恐らく非常に短い。配列の分析および比較によって、潜在 的なスプライス供与部位（ＤＳ１およびＤＳ２）と受容部位を決定し、図２に記 述した。 実施例６ 健全な組織における転写 実施例１の記述のように標識された、プローブＰｐｏｌ−ＭＳＲＶ（配列番号 ２９）、Ｐｇａｇ−ＬＢ１９（配列番号３０）、Ｐｅｎｖ−Ｃ１５（配列番号３ １）、Ｐｐｒｏ−Ｅ（配列番号３２）、Ｐ５'−ｇａｇ−ｃｌ．６Ａ２およびＰ ５'−ｅｎｖ−ｃｌ．２４．４利用して、多様な健全なヒト組織をノーザンブロ ット法（Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂ ｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔ＃ ７７６０−１）により試験した。メーカ ーの助言に従って実験を実施し、５日間オートラジオグラフに感光させた。結果 を分析したところ、胎盤においてのみ転写産物を示し、試験した他のヒト組織（ 心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓）ではいずれも示されなかった。 ＲＮＡドットブロット方法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｈｕｍａｎ ＲＮＡ Ｍａｓ ｔｅｒ Ｂｌｏｔ Ｃａｔ＃ ７７７０−１）を使用し、かつ、メーカーによっ て推薦された実験手順を使用して、胎児組織を含む他の約４０の組織を試験した 。プローブＰｇａｇ−ＬＢ１９（配列番号３０）およびＰｅｎｖ−Ｃ１５（配列 番号３１）を用いたハイブリダイゼーションの後、胎盤だけに特定の反応が生じ た。 ＲＮＡドットブロットにおいてシグナルが腎臓で確認され、これはノーザンブ ロット分析により内固定されたことがわかった。 実施例７ エンベロープをコードするｍＲＮＡの同定およびそれを特異的に検知するため の手段 非翻訳５'領域に特定されたプローブを利用した胎盤ｃＤＮＡライブラリーの スクリーニングにより、非翻訳５'領域（５'ＮＴＲ）、スプライシングジャンク ション、コード配列、非翻訳３'領域（３'ＮＴＲ）、およびポリアデニル化テー ルによって確定されるｃＤＮＡを分離することができたｃｌ．ＰＨ７４（配列番 号７）。このクローンはエンベロープをコードするスプライスされたＲＮＡに対 応する。図２に提案したこのｃＤＮＡと内因性ＨＥＲＶ−Ｗモデルの間の配列の 比較によって、スプライシングジャンクションをｍＲＮＡ上で同定し、スプライ シングジャンクションは連続性５'ＮＴＲ領域およびｅｎｖ遺伝子に位置し、エ ンベロープ遺伝子をコードするスプライスされたサブゲノムＲＮＡの生成を導く 。この情報により、スプライシング部位上にある位置を選択することによって、 このｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを特定することができた（Ｏｌｉｇ ｏ５３０７、配列番号２４による）。 このＪ領域の同定により、ＰＣＲにおいて、このＪ領域の上で特定されたオリ ゴヌクレオチド、特に、ｅｎｖ遺伝子から選択されたオリゴヌクレオチド（Ｏｌ ｉｇｏ４９８６、配列番号２５による）を使用して、内因性レトロウイルスのＲ ＮＡとＤＮＡを区別する方法を確立することができた。 ＰＣＲは以下の条件で実施した。 ０．３３マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチド ＴＡＱポリメラーゼ緩衝液Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ １Ｘ ＴＡＱポリメラーゼＢｏｅｒｈｉｎｇｅｒ ０．５単位 各々０．２５ｍＭのｄＮＴＰの混合物 ヒトＤＮＡ ０．５ｍｇ 最終容量 １００ｍｌ 試験された１０の異なるＤＮＡにおいては、この種類のＰＣＲにより増幅産物 を得ることかできなかった。一方、胎盤ＲＮＡまたはＨＥＲＶ−Ｗを発現する細 胞に由来するｃＤＮＡにおいては、このＰＣＲにより増幅産物が得られた。この 結果により、このサブゲノム断片の特異的ＲＮＡ性質を確認した。 実施例８ 特定のｍＲＮＡに含まれるコード配列の同定 実施例５に記述したスプライシング方法は、３つのリーディングフレーム、Ｏ ＲＦ１（配列番号３３）、ＯＲＦ２（配列番号３４）およびＯＲＦ３（配列番号 ３５）の存在と適合する（図６参照）。 胎盤ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、非翻訳５'領域（５'ＮＴ Ｒ）、スプライシングジャンクション、コード配列、非翻訳３'領域（３'ＮＴＲ ）およびポリアデニル化テールによって特定されたｃＤＮＡ（配列番号７、ｃｌ ．ＰＨ７４）を分離することができた。コード配列は５３８のアミノ酸（配列番 号３３）である。データバンクで実施した分析により、完全なレトロウイルスエ ンベロープの特性、すなわち、エンベロープポリタンパク質の翻訳の開始、約２ １のアミノ酸の高疎水性リーダーペプチドの翻訳の開始、表面タンパク質ＳＵの 翻訳の開始、トランスメンブレンタンパク質ＴＭの翻訳の開始を同定することが できた。これらの２つのタンパク質構成要素は異なる潜在的なグリコシル化部位 を示す。免疫抑制領域をＴＭタンパク質内に同定した。 ５２ ＡＡ（ＯＲＦ２、配列番号３４）の合成、および４８ ＡＡ（ＯＲＦ３ 、配列番号３５）の合成を導くことができるスプライス受容部位の上流域にある ２２ｂｐおよび９５ｂｐの２つの開始コドンをそれぞれ確認した。ＯＲＦ２はｅ ｎｖのカルボキシターミナル末端の一部から成り、また、ＯＲＦ３は異なるが重 複する翻訳に対応する。 「ｂｌａｓｔ」の入力による有意な相同性は見つからなかった。しかしながら 、レトロウイルス科、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３に制限されたサブデータバンクに おけるＬＦＡＳＴＡの入力は、それぞれ、ヒトおよび霊長類のリンパ親和性Ｔウ イルスのＲｅｘ、およびサルの免疫不全ウイルスのＴａｔと３５％の同一性百分 率を示した。 実施例９ ＨＥＲＶ−Ｗファミリーの複雑性 プローブ、Ｐｇａｇ−ＬＢ１９（配列番号３０）、Ｐｐｒｏ−Ｅ（配列番号３ ２）およびＰｅｎｖ−Ｃ１５（配列番号３１）を利用して、ドットブロット方法 により、各々の配列のヒトゲノムに存在するコピーの数を求めた。 各々のプローブを変性させ、１つの沈積に対し２．５、５、１０、２５、５０ 、１００ｐｇの量で、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜上に沈積させた。また、ヒトＤＮＡ の０．５ｍｇを同一膜上に沈積させた。その膜を８０℃、真空下で２時間乾燥し た。その後、その膜を沈積したプローブとハイブリダイズした。プローブを標識 する方法、ハイブリダイズする方法、また、膜を洗浄する方法は、サザンブロッ ティングと同様である。膜のオートラジオグラフィーの後に、膜土の沈積に比例 するシグナル強度のレベルを確認した。ハイブリダイゼーションゾーンを切り出 した後、シンチレーションカウントを実施した。膜上に沈積したプローブに対す る希釈系列とヒトＤＮＡで得られた結果を比較することによって、プローブに覆 われた領域の各々の一倍体ゲノム当たりコピーの数を求めることが可能である。 − 内因性のｇａｇの数は５６〜１１２のコピー数（７６）と求められる。 − 内因性のプロテアーゼの数は１６６〜３３４のコピー数（２６０）と求め られる。 − 内因性のｅｎｖの数は５２未満のコピー数（１３）と求められる。 ヒト胎盤ＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔ＃ Ｈ１５０１４ｂ ）の１０⁶クローンのスクリーニングによって、プローブＰｇａｇ−ＬＢ１９に より認識された１４４のクローン、およびプローブＰｅｎｖ−Ｃ１５により認識 された６４のクローンが計測できた。プローブＰｅｎｖ−Ｃ１５およびＰｇａｇ −ＬＢ１９と結合してハイブリダイズされた１３のクローンを分離し、機能性の 検討は行わず、ｇａｇおよびｅｎｖの両方を保持するゲノムのいくつかのコピー の存在を確認した。 前記物質および配列により発現し得る核酸物質、ヌクレオチド配列、およびペ プチドまたはタンパク質は、任意の自己免疫疾患およびそれに関係している病状 、並びに、異常妊娠、または不完全妊娠を検知し、予測し、治療し、観察するた めに使用することができる。 実際、客観的および実験的データにより、レトロウイルスおよび自己免疫疾患 、およびレトロウイルスと妊娠障害を結びつけることができた。 （１）レトロウイルスの病状および自己免疫疾患において共通のメカニズムが用 いられる（自己抗体の存在、免疫複合体の存在、ある組織の細胞浸潤、神経学上 疾患）。 （２）ある自己免疫性疾患に匹敵する病理学的障害はＨＩＶおよびＨＴＬＶのレ トロウイルスに感染している間に現われる（シェーグレン症候群、播種性紅斑性 狼瘡、慢性関節リウマチ等）。 （３）多発性硬化症（Ｐｅｒｒｏｎら、Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１９８９；１４０ ：５５１−５６１／Ｌａｎｃｅｔ １９９１；３３７：８６２−８６３／Ｒｅｓ ．Ｖｉｒｏｌ．１９９２；１４３：３３７−３５０）または慢性関節リウマチを 患っている患者の細胞培養上清中に逆トランスクリプターゼ活性を検出し、レト ロウイルス型粒子を確認した。 （４）自己免疫性または慢性炎症性動物病状が内因性レトロウイルスと結びつけ られ、その一部がヒト疾病（インシュリン依存性糖尿病、播種性紅斑性狼瘡）の 動物モデルとして使用される。 （５）顕著なレベルの内因性抗レトロウイルス抗体が、自己免疫性疾病、全身性 疾病または炎症性疾病との関係で記述されている。内因性レトロウイルスに関す る第４回欧州大会（ウプサラ、１９９６年１０月）で、数人の著者からこの性質 の他のデータが伝えられた。Ｖｅｎａｂｌｅｓ（内因性レトロウイルスに関する 第４回欧州大会（ウプサラ、１９９６年１０月）の公報）によれば、かなり高レ ベルの抗−ＨＥＲＶＨ抗体が妊娠中に確認される。また、直接的関与の証拠は今 までに提供されていないが、シェーグレン症候群、播種性紅斑性狼瘡または慢性 関節リウマチのような多様な自己免疫疾患の情況においても確認されている。 自己免疫性現象へのレトロウイルスの関与は、遺伝的因子、ホルモン因子、環 境因子、感染因子に直面する自己免疫性疾病、全身性疾病または炎症性疾病の多 元的特徴と相和性を保持する。 多発性硬化症（Ｐｅｒｒｏｎら、Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１９８９；１４０：５ ５１−５６１／Ｌａｎｃｅｔ １９９１；３３７：８６２−８６３／Ｒｅｓ．Ｖ ｉｒｏｌ．１９９２；１４３：３３７−３５０）を患う患者、または慢性関節リ ウマチ（未公開データ）を患う患者から得た細胞培養上清で確認された粒子は、 次の発現から生じる可能性がある。（ｉ）複製に適した内因性レトロウイルスの 発現。（ii）トランス相補の現象により協力し合ういくつかの不完全な内因性レ トロウイルスの発現。（iii）外因性レトロウイルスの 発現。 これらの観察により、上述の生物学的試料を、自己免疫疾患に対するマーカー 、または妊娠障害に対するマーカーとして使用し検討することができる。 特に、以下の標識化方法が考えられる。 − 上述の核酸物質に由来した、高度に厳密なハイブリダイゼーション・プロ ーブを用いてのヒトゲノムのスクリーニング、 − 検討された領域に対して特異的なプライマーを使用する、ＰＣＲ法による ゲノムＤＮＡの直接増幅、 − 外来細胞遺伝子のフランキング領域の分析。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 37/02 29/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 14/15 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/15 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ベルナール・マンドラン フランス・Ｆ―69100・ヴィリュバンヌ・ リュ・ドゥ・ラ・ドゥーア・21 (72)発明者 フランソワ・マレ フランス・Ｆ―69100・ヴィリュバンヌ・ リュ・アナトール・フランス・84 (72)発明者 エルヴェ・ペロ フランス・Ｆ―69005・リヨン・リュ・ド ゥ・ボイェ・５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 分離された状態あるいは精製された状態の、少なくとも部分的に機能性か または非機能性のレトロウイルスゲノム型の核酸物質であって、前記ゲノムが配 列番号１〜１５の配列、それらに相補的な配列およびそれらに同等な配列を含む 群から選択されるヌクレオチド配列を含み、特に、任意の１００連続モノマーの 配列において、前記ヌクレオチド配列が前記配列番号１〜１５の配列とそれぞれ 少なくとも７０％、好ましくは９０％の相同性を示すレトロウイルスゲノム型の 核酸物質。 ２． 分離された状態あるいは精製された状態の、少なくとも部分的に機能性か または非機能性の、レトロウイルスゲノム型の核酸物質であって、少なくとも３ ０のアミノ酸の任意の連続した配列において、前記ゲノムが請求項１に記載のヌ クレオチド配列の少なくとも１つの機能性部分によってコードされ得るペプチド 配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を示す任意のポ リペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列からなるレトロウイルスゲノム型 の核酸物質。 ３． レトロウイルスゲノム構造のＬＴＲ領域およびｇａｇ遺伝子にそれぞれ対 応する２つの配列の間に挿入される核酸断片、特に、配列番号１２からなる、ま たは配列番号１２を含む核酸断片を含む請求項１または２のいずれかに記載のレ トロウイルスゲノム型の核酸物質。 ４． 配列番号７〜９から選択される配列のような、少なくとも１つの欠失を有 する、配列番号１１と同一のヌクレオチド配列からなるサブゲノムレトロウイル ス型の核酸物質。 ５． 少なくとも１つのレトロウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つ の機能性ヌクレオチド配列を含む、請求項１または４のいずれかに記載の核酸物 質。 ６． 少なくとも１つの制御ヌクレオチド配列を含む請求項１または４のいずれ かに記載の核酸物質。 ７． 次のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列 を含む少なくとも１００塩基のヌクレオチド断片。 ａ）請求項１ないし６のいずれか一項に記載の核酸物質の、部分的および完全な 、ヌクレオチド配列の全部。 ｂ）次のクローンを含む群から選択されるクローンの、部分的および完全な、ヌ クレオチド配列の全部。 − ｃｌ．６Ａ２（配列番号１） − ｃｌ．６Ａ１（配列番号２） − ｃｌ．７Ａ１６（配列番号３） − ｃｌ．Ｐｉ２２（配列番号４） − ｃｌ．２４．４（配列番号５） − ｃｌ．Ｃ４Ｃ５（配列番号６） − ｃｌ．ＰＨ７４（配列番号７） − ｃｌ．ＰＨ７（配列番号８） − ｃｌ．Ｐｉ５Ｔ（配列番号９） − ｃｌ．４４．４（配列番号１０） − ＨＥＲＶ−Ｗ（配列番号１１） − ｃｌ．６Ａ５（配列番号１２） − ｃｌ．７Ａ２０（配列番号１３） − ｃｌ．７Ａ２１（配列番号１４） − ＬＴＲ（配列番号１５） ｃ） ａ）およびｂ）に記載の配列にそれぞれ相補的な配列。 ｄ） ａ）〜ｃ）に記載の配列とそれぞれ同等な配列であって、 特に、１００連続モノマーの任意の配列において、そのヌクレオチド配列が、配 列ａ）〜ｃ）と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば少なく とも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列。 ８． 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の核酸物質、または請求項７に記 載の核酸断片と特異的にハイブリダイズすることができることを特徴とする、核 酸に挿入またはその他が行われる、核酸物質を検出するための核酸プローブ。 ９． マーカーを含むことを特徴とする請求項８に記載のプローブ。 １０． 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の核酸物質、または請求項７に 記載の核酸断片と特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことを 特徴とするＲＮＡの重合またはＤＮＡの重合によって増幅を行うための核酸プラ イマー。 １１． 配列番号１６〜２８を含む群から選択されるヌクレオチド配列からなる ことを特徴とする核酸プローブまたは核酸プライマー。 １２． 請求項７に記載のヌクレオチド断片を含むＲＮＡまたはＤＮＡ、および 特に複製ベクター。 １３． 請求項７記載のヌクレオチド断片に属する任意のオープンリーディング フレームにコードされたペプチド、特にポリペプチドであって、例えば、自己免 疫疾患またはそれに関係している病状を患っている患者、あるいは異常妊娠また は不完全妊娠の患者から得た血清によって認識される抗原決定基を形成するオリ ゴペプチド。 １４． １つ以上のレトロウイルスＥＮＶタンパク質をコードするオープンリー ディングフレームを含むヌクレオチド断片によってコードされることを特徴とす る請求項１３に記載のペプチド。 １５． 自己免疫疾患、またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠、ま たは不完全妊娠用の分子マーカーとしての、請求項１ないし６のいずれか一項に 記載の核酸物質の使用、請求項７に記載のヌクレオチド断片の使用、あるいは請 求項１３または１４に記載のペプチドの使用。 １６． 自己免疫疾患に対する感受性、またはそれに関係している病状、あるい は異常妊娠のリスク、または不完全妊娠のリスク用の染色体マーカーとしての、 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の核酸物質の使用、請求項７に記載のヌ クレオチド断片の使用。 １７． 自己免疫疾患、またはそれに関係している病状、あるいは異常妊娠のリ スク、または不完全妊娠のリスクに対する感受性用の遺伝子用近接マーカーとし ての、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の核酸物質の使用、請求項７に記 載のヌクレオチド断片の使用。 １８． ＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態のいずれかの、請求項７に記載のクレオチ ド断片が、任意の生物学的身体物質、特に体液中に同定および／または定量され ることを特徴とする自己免疫疾患、またはそれに関係している病状、あるいは異 常妊娠、または不完全妊娠の分子標識化方法。 １９． 前記請求項に記載のヌクレオチド断片を発現する細胞が前記生物学的身 体物質中に検出されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２０． 請求項１ないし６に記載の核酸物質、または請求項７に記載のヌクレオ チド断片、あるいは請求項１３または１４に記載のペプチドを含む診断用組成物 または治療用組成物。