JP6830660B2 - がんの治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1]下記の工程を含む、がんの治療薬をスクリーニングする方法;
(i)対象となるがん細胞において、被験物質との接触下または非接触下でトランスポーザブルエレメントの発現量を測定する工程、および
(ii)被験物質との接触下において、非接触下と比較して前記トランスポーザブルエレメントの発現量が増加した場合、当該被験物質をがんの治療薬として選出する工程。
[2]前記トランスポーザブルエレメントが、レトロトランスポゾンまたはその断片である、[1]に記載の方法。
[3]前記トランスポーザブルエレメントが、内在性レトロウィルス、LINE、SINEおよびその断片から選択される少なくとも一つの配列である、[2]に記載の方法。
[4]前記トランスポーザブルエレメントが、HERV-H、HERV-W、L1-ORF2、ERVKおよびその断片から選択される少なくとも一つの配列である、[2]に記載の方法。
[5]下記の工程を含む、がん治療薬の創薬標的となり得るタンパク質の同定方法;
(i)被験タンパク質をコードする遺伝子を、発現制御可能な形態で含むがん細胞内で、該遺伝子を発現する条件下または該遺伝子の発現が抑制された条件下で、トランスポーザブルエレメントの発現量を測定する工程、および
(ii)該遺伝子の発現が抑制された条件下において、該遺伝子を発現する条件下と比較して前記トランスポーザブルエレメントの発現量が増加した場合、当該被験タンパク質をがんの治療薬の創薬標的となり得るタンパク質として選出する工程。
(i)対象となるがん細胞へ、被験物質との接触下でトランスポーザブルエレメントの発現を測定する工程、および
(ii)被験物質と接触させる条件下において、接触させない条件下より前記トランスポーザブルエレメントの発現が増加した場合、当該被験物質をがんの治療薬として選出する工程。
本発明において、がんとは、悪性腫瘍を意味し、癌腫(上皮細胞由来の悪性腫瘍)、肉腫、その他白血病などを含み、特定のがんに限定されない。また、本発明で用いるがん細胞とは、悪性腫瘍を構成する細胞であり、株化された細胞であっても生体内から単離された細胞であってもよい。また、本発明で用いるがん細胞は、有効な標的タンパク質が既知(即ち、ある既存の分子標的薬に対して感受性であることが既知)のがん細胞(例えば、EWS/ATF1融合遺伝子強制発現がん細胞、ゲフィチニブ感受性の変異EGFR発現がん細胞、ラパチニブ感受性のHER2-増幅がん細胞、アレクチニブ感受性のEML4-ALK融合遺伝子発現がん細胞、イマチニブ感受性の慢性骨髄性白血病細胞など)であってもよいし、有効な標的タンパク質が不明のがん細胞であってもよい。
本発明のスクリーニング方法においては、任意の被験物質を用いることができ、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、核酸(特にsiRNA)、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物等が挙げられる。本発明において、被験物質はまた、(1)生物学的ライブラリー法、(2)デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、(3)「1ビーズ1化合物(one-bead one-compound)」ライブラリー法、及び(4)アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67)。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る(DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51)。化合物ライブラリーは、溶液(Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと)またはビーズ(Lam (1991) Nature 354: 82-4)、チップ(Fodor (1993) Nature 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9)若しくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号)として作製され得る。
本発明において、トランスポーザブルエレメントとは、可動遺伝因子またはトランスポゾンと呼ばれるゲノム上を移動または複写されゲノム内へ挿入される遺伝子配列を意味する。本発明のがんの治療薬のスクリーニングの指標として用いる好ましいトランスポーザブルエレメントは、レトロトランスポゾンである。本発明において、レトロトランスポゾンとは、RNAに複写される配列であることから、当該複写されたRNAを指標として用いることができる。本発明において、レトロトランスポゾンは、LTR(long terminal repeat)型レトロトランスポゾン(内在性レトロウィルス)と非 LTR 型レトロトランスポゾンを含む。LTR型レトロトランスポゾンとして、HERV-E、HERV-F、HERV-H、HERV-K、HERV-L、HERV-T、HERV-W、HERV-FRD、ERV9、HML-1、HML-2、HML-3、HML-4、HML-5、HML-6、HML-9HML-10およびERVKから成る群より選択される遺伝子が例示され、非 LTR 型レトロトランスポゾンとして、LINE(長鎖散在反復配列)またはSINE(短鎖散在反復配列)が例示される。LINEとして、オープンリーディングフレーム(ORF)1とORF2というエンドヌクレアーゼ/逆転写酵素をコードするLINE-1 (L1) レトロトランスポゾンが例示される。
本発明において、がんの治療薬をスクリーニングするためのキットは、上述したトランスポーザブルエレメントの発現量を測定するために用いるプライマーまたはプローブを含む。
(i)被験タンパク質をコードする遺伝子(候補遺伝子)を、発現制御可能な形態で含むがん細胞内で、候補遺伝子を発現する条件下または該遺伝子の発現が抑制された条件下で、トランスポーザブルエレメントの発現量を測定する工程、および
(ii)候補遺伝子の発現が抑制された条件下において、該遺伝子を発現する条件下と比較して前記トランスポーザブルエレメントの発現量が増加した場合、当該被験タンパク質をがんの治療薬の創薬標的となり得るタンパク質として選出する工程
を含むことを特徴とする。
ここで、候補遺伝子としては、がん細胞における遺伝子発現をマイクロアレイ等を用いて網羅的に解析した結果同定される、がん細胞に特有に発現している遺伝子やがん細胞で高発現している遺伝子が挙げられる。
また、発現制御可能な形態とは、候補遺伝子の発現のON/OFFが可能な形態を意味し、例えば、候補遺伝子が、誘導プロモーター(例、メタロチオネインプロモーター(重金属イオンで誘導)、ヒートショックタンパク質プロモーター(ヒートショックで誘導)、Tet-ON/Tet-OFF系プロモーター(テトラサイクリン又はその誘導体の添加又は除去で誘導)、ステロイド応答性プロモーター(ステロイドホルモン又はその誘導体で誘導)等)の制御下におかれた発現ベクター等が挙げられる。
トランスポーザブルエレメントの発現の確認・評価については、上記したがん治療薬のスクリーニング方法と同様である。
続いて、これらのメチルトランスフェラーゼのEWS/ATF1による発現誘導を抑制した場合のMYOD1の制御遺伝子の発現を調べた。実験方法および各メチルトランスフェラーゼのsiRNAの効果を(図9A)に記載した。その結果、サルコーマ細胞においてSuv39h1をノックダウンすると、L1の発現が増加した(図9B)。また、Suv39h1およびSuv39h2をノックダウンすると、EWS/ATF1が発現していても、Myogeninの発現誘導を有意に増加させた(図3E)。さらに、Suv39h1を抑制し、MYOD1を導入または導入しなかった場合の遺伝子変化をマイクロアレイ法により解析したところ、Myogeninを含むMYOD1によって誘導される遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった(図3F)。一方、Ezh2 または Eedをノックダウンした場合であっても、MYOD1によってMyogeninの発現が誘導されなかった。この結果より、EWS/ATF1によりH3K9メチルトランスフェラーゼの発現が誘導されることによって、サルコーマ細胞において、細胞の運命を決定づける遺伝子の転写を抑制することが示唆された。
以上の結果より、上記の同定したERVKトランスポーザブルエレメントは、本発明のスクリーニング方法に適用可能であることが示された。
Claims (5)
- 下記の工程を含む、がんの治療薬をスクリーニングする方法;
(i)対象となるがん細胞内に外来性の初期化因子を導入し、当該細胞内で被験物質との接触下または非接触下でトランスポーザブルエレメントの発現量を測定する工程、および
(ii)被験物質との接触下において、非接触下と比較して前記トランスポーザブルエレメントの発現量が増加した場合、当該被験物質をがんの治療薬として選出する工程。 - 前記トランスポーザブルエレメントが、レトロトランスポゾンまたはその断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスポーザブルエレメントが、内在性レトロウィルス、LINE、SINEおよびその断片から選択される少なくとも一つの配列である、請求項2に記載の方法。
- 前記トランスポーザブルエレメントが、HERV-H、HERV-W、L1-ORF2、ERVKおよびその断片から選択される少なくとも一つの配列である、請求項2に記載の方法。
- 下記の工程を含む、がん治療薬の創薬標的となり得るタンパク質の同定方法;
(i)被験タンパク質をコードする遺伝子を、発現制御可能な形態で含むがん細胞内に外来性の初期化因子を導入し、当該細胞内で該遺伝子を発現する条件下または該遺伝子の発現が抑制された条件下で、トランスポーザブルエレメントの発現量を測定する工程、および
(ii)該遺伝子の発現が抑制された条件下において、該遺伝子を発現する条件下と比較して前記トランスポーザブルエレメントの発現量が増加した場合、当該被験タンパク質をがんの治療薬の創薬標的となり得るタンパク質として選出する工程。
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