CN101969987A

CN101969987A - 长散布核元件多肽组合物及其使用方法

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Publication number: CN101969987A
Application number: CN2008801164478A
Authority: CN
Inventors: D·尼克松; K·加里森; D·梅克勒约翰; M·奥斯特洛夫斯基; R·B·琼斯; A·阿格拉沃尔; F·M·赫克特
Original assignee: University of California; J David Gladstone Institutes
Current assignee: University of California; J David Gladstone Institutes
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2011-02-09
Also published as: MX2010003110A; KR20100075483A; EP2200637A2; AU2008301888A1; WO2009038756A2; US20110046042A1; EP2200637A4; WO2009038756A3; CA2700115A1; JP2010539901A; BRPI0817209A2; RU2010115088A

Abstract

本发明提供LINE多肽和包含主题LINE多肽的组合物，包括免疫原性组合物。本发明提供包含编码主题LINE多肽的核苷酸序列的重组核酸。主题组合物可用于刺激对于LINE肽的T-细胞免疫应答。本发明还提供在个体中刺激对逆转录病毒-或慢病毒-感染细胞的免疫应答的方法。本发明还提供了治疗癌症的方法，所述癌症与LINE多肽异常表达的组织相关。本发明也提供治疗疾病的方法，包括降低对LINE多肽的免疫应答。

Description

长散布核元件多肽组合物及其使用方法

交叉参考

本申请要求2007年9月20日提交的美国临时专利申请60/973,993的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明受到来自国立卫生研究所(National Institutes of Health)联邦基金号AI68498和AI41531的政府资助。政府享有本发明的一定权利。

背景技术

逆转录元件至少可分为三类：外源性逆转录病毒，包含长末端重复(LTR)的逆转座子以及缺少LTR的逆转座子。非LTR逆转座子可进一步分为长散布核元件(LINE)和短散布核元件(SINE)。LINE-1(“L1”)是在所有哺乳动物基因组可见的非LTR逆转座子，并且是最常见的人LINE。人基因组中约有500,000个LINE-1元件，占总序列的～17％。在全部LINE-1基因组群体中，约有100个全长元件，其余被不同程度地截短。LINE-1转录得到～6kb的编码两种蛋白质ORF1p(或p40)和ORF2p(或p150)的mRNA。ORF1p编码具有核酸侣伴蛋白活性的RNA结合蛋白质，并且ORF2p编码逆转录转座所需的酶：核酸内切酶和逆转录酶。LINE-1逆转录转座通过靶标引导的逆转录(TPRT)机制发生，其中逆转录与整合同时发生。

文献

Bogerd等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(23)：8780-5；Hohjoh等(1997)EMBO J.16(19)：6034-6043；Boissinot等(2000)Mol.Biol.Evol.18(12)：2186-2194；Ergun等(2004)J.Biol.Chem.279(26)：27753-27763；美国专利号5,280,108。

发明概述

本发明提供LINE多肽和包含主题LINE多肽的组合物，包括免疫原性组合物。本发明提供包含编码主题LINE多肽的核苷酸序列的重组核酸。主题组合物可用于刺激对LINE肽的T-细胞免疫应答，导致LINE特异性T细胞识别病毒感染细胞上呈现的LINE肽。本发明还提供在个体中刺激对逆转录病毒-或慢病毒-感染细胞的免疫应答的方法。本发明还提供治疗癌症的方法，所述癌症与LINE多肽异常表达的组织相关。本发明也提供治疗疾病的方法，包括降低对LINE多肽的免疫应答。

发明特点

本发明提供包含LINE多肽的免疫原性组合物。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含主题LINE多肽和药学上可接受的载体。主题LINE多肽可包含与SEQ ID NO：1-22中任一项具有至少约75％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。在另一些实施方式中，主题LINE多肽包含SEQ ID NO：1-101中任一项所列的氨基酸序列。主题免疫原性组合物可制成多种制剂，包括用于胃肠道外给药或向粘膜组织给药的形式。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物还包含佐剂。在一些实施方式中，佐剂是氢氧化铝、MF59或单磷酰脂A。

本发明提供一种免疫原性组合物，其包含含有LINE多肽编码核苷酸序列的核酸。所编码的LINE多肽可包含与SEQ ID NO：1-22中任一项具有至少约75％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，将主题免疫原性组合物配制成用于胃肠道外给药或对粘膜组织给药的形式。在一些实施方式中，包含LINE多肽编码核苷酸序列的核酸可以是重组载体，如病毒载体。

还提供一种在个体中诱导对致病性病毒感染或具有感染风险的宿主细胞的T淋巴细胞应答的方法，其中所述方法包括将免疫原性组合物给予需要的个体，该免疫原性组合物含有主题LINE多肽和药学上可接受的载体或包含主题LINE多肽编码核苷酸序列的核酸。在一些实施方式中，T淋巴细胞应答包括CD8⁺T细胞应答或CD4⁺T细胞应答。在其它实施方式中，T淋巴细胞应答包括粘膜T淋巴细胞应答。适于使用主题方法治疗的个体包括例如，致病性病毒如人逆转录病毒，如人体免疫缺陷病毒感染或具有感染风险的个体。

可在未被致病性病毒感染的个体上进行所述主题方法，诱导个体对感染致病性病毒或有感染风险的宿主细胞的T淋巴细胞应答。在这些实施方式中，主题方法可涉及将免疫原性组合物给予未感染致病性病毒的个体，该免疫原性组合物包含LINE多肽和药学上可接受的载体或含有LINE多肽编码核苷酸序列的核酸。在其它实施方式中，主题方法在感染致病性病毒的个体中诱导T淋巴细胞应答。

还提供在个体中诱导对癌细胞的T淋巴细胞应答的方法，其中癌细胞表达LINE并且在其表面上展示LINE表位，所述方法通常涉及给予该个体含有主题LINE多肽和药学上可接受的载体的主题免疫原性组合物，或者将主题免疫原性组合物给予该个体，所述主题免疫原性组合物包含含有编码主题LINE多肽的核苷酸序列的核酸。

还提供产生对LINE多肽具有特异性的CD8⁺T细胞群的方法，其中所述方法通常涉及在抗原递呈平台关联的条件下，将未刺激的CD8⁺T细胞群在体外与分离的主题LINE多肽接触，其中所述接触产生LINE肽特异性CD8⁺T细胞群。

附图说明

图1A和1B显示了HIV-1感染的原代CD4⁺T细胞中L1-P150的表达。

图2显示HIV-1感染个体外周血中对L1的免疫应答，但非感染个体没有产生应答。

图3A-E显示L1-特异性CD8⁺T细胞特异性识别HIV-1-感染的细胞。

图4A和4B显示L1-特异性CD8⁺T细胞克隆消除HIV-1感染细胞并抑制病毒产生。

图5A-E显示使用不同HIV-1板块和HIV-2进行的L1-特异性T细胞克隆识别实验(实验“TO1”)。

图6A-D显示了L1-特异性T细胞克隆不同HIV-1板块识别实验“SF1”。

图7显示了L1-特异性T细胞克隆不同HIV-1板块识别实验“TO2”。

图8显示克隆L1-3O对不同HIV-1分离物感染的自体细胞的反应程度与感染水平的相关性。

图9显示与抗-HLA-A、B、C抗体预先孵育阻断感染细胞的识别。

图10的表格提供了对HIV-1蛋白质使用BLAST搜索LINE氨基酸序列鉴定的候选LINE多肽。

图11的表格提供LINE主题多肽和对HIV-1蛋白进行LINE氨基酸序列BLAST搜索所得的HIV蛋白序列之间的示例性序列比对。

图12的表格表示使用计算机表位预测鉴定的LINE-1肽。

图13的表格提供分离的LINE多肽LiD9R、LiE13E、LiK10I、Lil9C、Lim12T、LiN13V和LiQ9E的ELISPOT实验结果。

图14的表格提供分离的LINE多肽LiIV9、LiKI9、LiRV9、LiTV9的ELISPOT实验结果。

图15的表格表示图2中提及的肽序列以及肽的特征。

图16的表格提供关于HIV-1-感染对象的信息。

图17的表格提供关于HIV-1-感染对象的信息。

图18的表格提供关于病毒分离物的信息。

图19表示使用不同HIV-1板块进行的LINE-1(L1)-特异性T细胞克隆杀伤实验的结果。

图20显示15-聚体LINE多肽的氨基酸序列。

图21A-C显示15-聚体LINE多肽的氨基酸序列。

定义

本文所用“生物样品”包括从个体获得的各种样品类型，可用于诊断或监测实验。术语“生物样品”包括生物来源的血液和其它液体样品，固体组织样品如活检样品或组织培养物或由其产生的细胞，以及它们的后代。术语“生物样品”也包括在获得后以任何方式操作的样品，这些方式包括例如试剂处理；洗涤；或富集某些细胞群，如CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞、胶质细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞、外周血单核细胞(PBMC)等。术语“生物样品”包括临床样品，也包括培养的细胞、细胞悬浮液、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清、脑脊液等。

本领域熟知术语“逆转录病毒”，其包括单链、正义、有包膜的RNA病毒，包括例如，γ逆转录病毒属(如，鼠乳房肿瘤病毒)；ε逆转录病毒属；α逆转录病毒属(如，禽白血病病毒(avian leukosis virus))；β逆转录病毒属；δ逆转录病毒属(如，牛白血病病毒；人T-淋巴营养性病毒(HTLV))；慢病毒属；和泡沫病毒属。本文所用术语“慢病毒”是逆转录病毒科的一个病毒属，包括人体免疫缺陷病毒-1(HIV-1)；人体免疫缺陷病毒-2(HIV-2)；猿免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。

本文所用的“基因递送载体”指能够向宿主细胞递送，在一些实施方式中在宿主细胞中表达感兴趣的一种或多种基因或核苷酸序列的构建物。这类载体的代表性例子包括病毒载体、核酸表达载体、裸露DNA和某些真核细胞(如生产细胞)。

本文所用“操作性连接”指配置所述组件以便行使其普通功能的元件安排。因此，操作性连接于编码序列的控制元件可影响该编码序列的表达。控制元件可不必与编码序列毗连，只要它们可发挥功能指导编码序列的表达。因此，例如，间插非翻译的转录序列存在于启动子序列和编码序列之间时，仍可认为该启动子序列与该编码序列“操作性连接”。

本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指任何长度氨基酸的多聚形式，可包含编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸s以及具有修饰的肽主链的多肽。术语融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合蛋白，具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫学标记的蛋白质等。NH₂指在多肽氨基末端出现的游离氨基。COOH指在多肽羧基末端出现的游离羧基。使用J.Biol.Chem.，243(1969)，3552-59以保持标准多肽命名法。

本文所用术语“分离”用于描述在与多核苷酸、多肽或细胞天然存在环境不同的环境中的多核苷酸、多肽或细胞。分离的遗传修饰宿主细胞可能存在于遗传修饰宿主细胞的混合群体中。在一些实施方式中，分离多肽是合成的多肽。“合成多肽”由氨基酸组装而成，是在体外通过(例如)无细胞化学合成、利用本领域技术人员已知的方法化学合成的。在一些实施方式中，分离多肽是纯化的多肽。

“纯化”指感兴趣化合物(如多肽)与其天然伴随组分相分离。“纯化”也可用来指感兴趣化合物(如多肽)与制造过程(如化学合成)中可能出现的伴随组分相分离。在一些实施方式中，当化合物(如多肽)至少50-60重量％不含天然伴随的或制造过程中相关的有机分子时，则称该化合物基本纯。在一些实施方式中，以重量计，该制备物包含至少75％、至少90％、至少95％或至少99％的感兴趣化合物。因此，如“纯化的”主题多肽出现于组合物中，则其中多肽占组合物重量的至少75％、至少90％、至少95％或至少99％。可通过，例如，由天然来源(如细菌)提取、化合物化学合成或纯化和化学修饰的组合获得基本纯的化合物。也可通过，例如，富集包含结合感兴趣抗体的化合物的样品来获得基本纯的化合物。可通过任何合适方法，如色谱、质谱、高效液相色谱分析等测定纯度。

提到LINE多肽，例如LINE多肽融合蛋白包含LINE多肽和“异源”多肽时，本文所用术语“异源”指除LINE多肽以外的多肽，如天然条件下通常不与LINE多肽相结合的多肽。例如，异源多肽与LINE多肽没有显著的氨基酸序列相同性，如，该异源多肽与LINE多肽的氨基酸序列相同性小于约50％、小于约40％、小于约30％、或小于约20％。

本文中“抗原”的定义包括任何抗体分子或T细胞受体可特异性结合的物质。“免疫原”是能够启动淋巴细胞激活，从而导致抗原-特异性免疫应答的抗原。

“表位”指对其产生特异性B细胞和/或T细胞应答的抗原上的位点。该术语也可与″抗原决定簇″或″抗原决定位点″互换使用。蛋白质、多糖或其它生物聚合物上的B细胞表位位点可由通过折叠聚在一起的大分子不同部位的部分(moiety)组成。这种表位称为构象或不连续表位，因为该位点由线性序列中不连续、但在折叠构象中连续的聚合物区段组成。由生物聚合物或其它分子的单个区段组成的表位称为连续表位或线性表位。T细胞表位通常是线性肽。可以在简单的免疫实验中鉴定识别相同表位的抗体，显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。

本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指任意长度核苷酸的多聚形式，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。因此该术语包括但不限于包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生化的核苷酸碱基的单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂交物或聚合物。

本文修饰核酸所用“重组的”指克隆、限制性酶切和/或连接步骤的各种组合所得的产物，产生具有区别于天然系统中内源性核酸的结构性编码或非编码序列的构建物。通常，编码结构性编码序列的DNA序列可组装自cDNA片段和短寡核苷酸接头，或组装自一系列的合成寡核苷酸，以提供能够由细胞中包含的重组转录单元或无细胞转录和翻译系统表达的合成核酸。因此，如术语“重组的”多核苷酸或核酸指非天然产生的，例如，通过人工干涉将两个分离的序列片段人工组合产生的。

“操作性连接”指并列，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子操作性连接于该编码序列。

术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”在本文中可互换使用，指具有相当高的自主生长活性，因而具有异常生长表型的细胞，其特征是明显丧失对细胞增殖的控制。用于本申请的感兴趣细胞包括癌前细胞、恶性细胞、转移前细胞、转移细胞和非转移细胞，以及原位癌。

″癌症表型″通常指以癌细胞为特征的各种生物学现象，这些现象视癌症类型而不同。通常通过以下现象来鉴定癌症表型，例如，细胞生长或增殖异常(如生长或增殖不受控制)、细胞周期调节异常、细胞运动异常、细胞-细胞相互作用异常或转移等。

术语“对象”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于：鼠类(大鼠、小鼠)、猫、非人灵长动物(如猿)、人、犬、有蹄类等。

本文所用术语“治疗”、“治疗的”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。从完全或部分防止疾病或其症状方面来说，这种作用可以是预防性的，和/或从部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病产生的不良影响来说，这种作用可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”包括在哺乳动物，特别是人中进行的任何疾病治疗，包括：(a)在可能易患该疾病或症状但尚未诊断患有该疾病或症状的对象中防止该疾病或症状的发生；(b)抑制疾病症状，即阻滞其发展；或(c)缓解疾病症状，即引起该疾病或症状消退。

在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。应理解，本文所用术语的目的只是描述具体实施方式，不应为限制性，因为本发明范围仅受所附权利要求书的限制。

应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它标称或间插数值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包含一个或两个限值时，排除这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明范围内。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。本文所述的所有发表物通过引用纳入本文，以公开或描述与所引用发表物有关联的方法和/或材料。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，例如，提到“长散布核元件(LINE)多肽”包括多种这类多肽，提到“免疫原性组合物”包括本领域技术人员已知的一种或多种免疫原性组合物和其等同形式，等等。还注意到，权利要求书可撰写成排除任何任选元素。同样，这种说明应用作引用权利要求元素相关地使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等，或使用“负”限制的前提基础。

本文只提供其公开日期早于本申请申请日的发表物。本文中没有任何内容可被解释为承认本发明因在先发明而不早于这篇发表物。另外，所提供的发表日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独验证。

具体实施方式

本发明提供LINE多肽(如分离的LINE多肽；合成LINE多肽)及包含主题LINE多肽的组合物包括免疫原性组合物。本发明提供包含编码主题LINE多肽的核苷酸序列的核酸。本发明提供包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的组合物。免疫原性组合物可用于刺激对LINE多肽如病毒感染细胞上的多肽的T细胞免疫应答。例如，主题免疫原性组合物可用于刺激识别HTLV-或HIV-感染细胞上LINE多肽(或其片段)的T细胞免疫应答。如下文详述，刺激对HTLV-或HIV-感染细胞上LINE多肽或其片段的T细胞免疫应答可治疗病毒感染(如，HTLV感染，HIV感染)。本发明还提供在个体中刺激对逆转录病毒-或慢病毒-感染细胞的免疫应答的方法。本发明还提供治疗癌细胞异常表达LINE多肽的癌症的方法。例如，主题免疫原性组合物可用于刺激识别癌或癌前细胞上LINE多肽(或其片段)的T细胞免疫应答。本发明也提供治疗疾病的方法，包括降低对LINE多肽的免疫应答。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物能诱导对逆转录病毒-感染细胞，如人免疫缺陷病毒(HIV)-感染细胞特异性的T细胞免疫应答。主题LINE多肽展示的表位能刺激或提高对该表位的T细胞免疫应答。逆转录病毒-感染细胞表面上也存在LINE表位时，也发生对逆转录病毒感染细胞的T细胞应答。“T细胞免疫应答”包括以下一种或多种情况：1)LINE表位特异性的CD4⁺T细胞的数量和/或活性提高；2)LINE表位特异性的CD8⁺T细胞的数量和/或活性(如细胞毒性)提高；和3)分泌诱导或表明Th1-型免疫应答的细胞因子。诱导或表明Th1免疫应答的细胞因子包括但不限于：干扰素-γ(IFN-γ)和IL-2。用该免疫原性组合物刺激的T细胞免疫应答包括粘膜T细胞免疫应答和全身性T细胞免疫应答。

可以各种方式配制主题免疫原性组合物，包括适合静脉内给药、皮下给药或其它胃肠道外给药途径的制剂；适合给予粘膜组织的制剂等。本发明提供包含主题免疫原性组合物的药物制剂。

本发明还提供适用于监测患者对逆转录病毒感染(如HTLV感染)治疗的反应的LINE多肽组合物。因此，本发明还提供监测患者对逆转录病毒感染(如HTLV感染)治疗的反应的方法。

本发明还提供适用于监测患者对慢病毒感染(如HIV感染)治疗的反应的LINE多肽组合物。因此，本发明还提供监测患者对慢病毒感染(如HIV感染)治疗的反应的方法。

分离的LINE多肽

本发明提供LINE多肽和包含主题LINE多肽的组合物。主题LINE多肽可用于，例如，产生免疫原性组合物(如，用于增强个体对LINE多肽的免疫应答或增强个体对HIV表位或多肽的免疫应答)；产生免疫调节组合物(如用于减轻个体对LINE多肽的免疫应答；监测病人对治疗，如治疗逆转录病毒感染治疗的响应；疾病分期；疾病探测；以及产生用于过继转移法的CD8⁺T细胞。在一些实施方式中，主题LINE多肽是分离的。在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽是合成的(如化学合成的)。因此，本发明提供合成的LINE多肽。在下文讨论中，使用术语“分离的主题LINE多肽”或简单说“主题LINE多肽”；然而，应当理解的是下列讨论同样应用于“合成的主题LINE多肽”。

LINE多肽

LINE多肽包括任何LINE进化支、家族、亚家族、类或组编码的多肽，如CRE、R2、R4、L1、L2、RTE、Tad1、R1、LOA、Jockey、CR1和I及其任何亚组。本领域已知LINE进化支、家族、亚家族、类、组和亚组。参见例如，Malik等，Molecular Biology and Evolution 16(6)：793.(1999)；Lovsin等，Molecular Biology and Evolution 18：2213-2224。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽(或合成的主题LINE多肽)包括含有某氨基酸序列的约6、7、8、9、10、11、12、13-15、15-17、17-20、20-25、25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、或350-400、或更多个毗连氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与LINE-编码多肽的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性。LINE-编码多肽包括LINE的ORF1p(p40)和ORF2p(p150)编码的多肽。

在另一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8、9、10、11、12、13-15、15-17、17-20、20-25、25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、或350-400、或更多个毗连氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与LINE编码多肽的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性，前提是所述LINE编码多肽的氨基酸序列短于LINE-1的ORF1p(p40)或ORF2p(p150)编码的多肽。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含一段约6、7、8、9、10、11、12、13-15、15-17、17-20或20-25个、或更多毗连氨基酸，该段氨基酸与HIV-编码的蛋白质、多肽或表位中一段相同长度的氨基酸具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性。

在其它实施方式中，分离的主题LINE多肽由一段约6、7、8、9、10、11、12、13-15、15-17、17-20或20-25、或更多毗连氨基酸组成或基本由其组成，该段氨基酸与HIV-编码的蛋白质、多肽或表位中的一段相同长度氨基酸具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性。

在另外的实施方式中，分离的主题LINE多肽是鉴定并分离的LINE多肽，其中通过搜索逆转录病毒蛋白质数据库，如HIV蛋白质数据库以获取与LINE多肽序列的短近精确匹配对该LINE多肽进行鉴定。可通过对HIV蛋白进行LINE氨基酸序列的BLAST搜索(Altschul等，1997)进行此类搜索，该算法使用短近精确匹配参数(e-值＝200000，PAM30矩阵，SEG过滤关闭，字长＝2)。用于BLAST算法的短近精确匹配参数利于探测肽序列间的短匹配(通常被蛋白质分歧所淹没)。尽管这些相似或相同的区域在系统发生分析中不具有显著性，但它们可代表T细胞识别的高度保守的功能性蛋白质结构域和/或潜在交叉反应区。

也可使用表位预测软件通过分析由LINE-1 ORF1和ORF2预测的蛋白质序列，以鉴定主题LINE多肽。例如，可用NETCTL^TM表位预测程序分析由LINE-1 ORF1和ORF2预测的蛋白质序列，以鉴定来自LINE-1的表位肽。NETCTL^TM分析完整蛋白以鉴定蛋白酶体切割位点，所得的最有潜力与抗原加工机器相关转运子(TAP)结合的降解产物子集，以及这些降解产物内与不同人白细胞抗原(HLA)分子具有最佳结合亲和力的肽(Larsen等，European Journal ofImmunology.35(8)：2295-303.2005)。

分离的主题LINE多肽长可为6个氨基酸直至天然产生的LINE多肽的长度，如LINE多肽可以是6个氨基酸(aa)、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12-15aa、15-20aa、20-25aa、25-30aa、30-40aa、40-50aa、50-100aa、或长于100个氨基酸，如100aa-150aa、150aa-200aa。在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽长度约为6aa-150aa、约6aa-10aa、约10aa-15aa、约15aa-20aa、约20aa-25aa、约25aa-30aa、约30aa-40aa、约40aa-50aa、约50aa-75aa、约75aa-100aa、约100aa-125aa或约125aa-150aa。

LINE编码多肽的示例性非限制性例子参见GenBank登录号AAC51261(SEQ ID NO：23)、AAC51262(SEQ ID NO：24)、AAC51263(SEQ ID NO：25)、AAC51264(SEQ ID NO：26)、AAC51265(SEQ ID NO：27)、AAC51266(SEQ IDNO：28)、AAC51267(SEQ ID NO：29)、AAC51268(SEQ ID NO：30)、AAC51269(SEQ ID NO：31)、AAC51270(SEQ ID NO：32)、AAC51271(SEQ ID NO：33)、AAC51272(SEQ ID NO：34)、AAC51273(SEQ ID NO：35)、AAC51274(SEQ IDNO：36)、AAC51275(SEQ ID NO：37)、AAC51276(SEQ ID NO：38)、AAC51277(SEQ ID NO：39)、AAC51278(SEQ ID NO：40)、AAC51279(SEQ ID NO：41)等。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8、9、10、11或12个毗连氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

MNEMKREGKFRE(SEQ ID NO：1)。

在一些实施方式中，主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8、9或10个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

SQLKELEKQE(SEQ ID NO：2)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8、9、10、11或12个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：3所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

MLRAAREKGWVT(SEQ ID NO：3)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列MLRAAREKGRVT；或氨基酸序列MLRAAREEGRVT。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8、9或10个毗连氨基酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：4所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

KIDRLLARLI(SEQ ID NO：4)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列KIDRPLARLI；或氨基酸序列KIDRPLSRLI。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：5所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

LRAAREKGC(SEQ ID NO：5)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8、9、10、11、12或13个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：6所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

NGKQKKAGFAILV(SEQ ID NO：6)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列NGKQKKAGVAILV。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：7所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

DELREEGVR(SEQ ID NO：7)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：8所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

TMRYHLTPV(SEQ ID NO：8)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：9所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

RPNLRLIGV(SEQ ID NO：9)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列RPNLHLIGV。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：10所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

KVIYRFNAI(SEQ ID NO：10)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列KVIYRFSAI或KVTYRFNTI。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：11所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

IVYLENPIV(SEQ ID NO：11)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列IVYLENPMV；或氨基酸序列IVCLKNPIV。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包括含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：12所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

SLQEIWDYV(SEQ ID NO：12)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：13所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

NLEECITRI(SEQ ID NO：13)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：14所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

TPRHIIVRF(SEQ ID NO：14)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列TPRHVIVRF；或氨基酸序列TPRHILVRF；或氨基酸序列TPRHILVKF。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：15所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

LLFNIVLEV(SEQ ID NO：15)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：16所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

YTMEYYAAI(SEQ ID NO：16)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：17所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

RARIAKSIL(SEQ ID NO：17)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列RARMAKSIL；或氨基酸序列RACIAKSILF；或氨基酸序列RAHIAKSTL。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：18所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

APRFIKQVL(SEQ ID NO：18)。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：19所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

ISYPAKLSF(SEQ ID NO：19)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列ISFPAKLSF；或氨基酸序列ISYPATLGF。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：20所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

SSPATEQSW(SEQ ID NO：20)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列SSPATDQSW；或氨基酸序列SSLATEQSW。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：21所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

KATVTKTAW(SEQ ID NO：21)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列KATVTKTVW；或氨基酸序列KATVTKTAC。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含含有某氨基酸序列的约6、7、8或9个毗连氨基酸的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：22所列氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性：

RVNRQPTTW(SEQ ID NO：22)。

例如，主题LINE多肽可包含氨基酸序列RANRQPTTW；或氨基酸序列RVNRQPTEW；或氨基酸序列RVNRQATEW。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含以下一个或多个氨基酸序列：

MNEMKREGKFRE(SEQ ID NO：1)；

SQLKELEKQE(SEQ ID NO：2)；

MLRAAREKGWVT(SEQ ID NO：3)；

KIDRLLARLI(SEQ ID NO：4)；

LRAAREKGC(SEQ ID NO：5)；

NGKQKKAGFAILV(SEQ ID NO：6)；

DELREEGVR(SEQ ID NO：7)；

TMRYHLTPV(SEQ ID NO：8)；

RPNLRLIGV(SEQ ID NO：9)；

KVIYRFNAI(SEQ ID NO：10)；

IVYLENPIV(SEQ ID NO：11)；

SLQEIWDYV(SEQ ID NO：12)；

NLEECITRI(SEQ ID NO：13)；

TPRHIIVRF(SEQ ID NO：14)；

LLFNIVLEV(SEQ ID NO：15)；

YTMEYYAAI(SEQ ID NO：16)；

RARIAKSIL(SEQ ID NO：17)；

APRFIKQVL(SEQ ID NO：18)；

ISYPAKLSF(SEQ ID NO：19)；

SSPATEQSW(SEQ ID NO：20)；

KATVTKTAW(SEQ ID NO：21)；

RVNRQPTTW(SEQ ID NO：22)；

MLRAAREKGRVT(SEQ ID NO：77)；

MLRAAREEGRVT(SEQ ID NO：78)；

KIDRPLARLI(SEQ ID NO：79)；

KIDRPLSRLI(SEQ ID NO：80)；

NGKQKKAGVAILV(SEQ ID NO：81)；

RPNLHLIGV(SEQ ID NO：82)；

KVIYRFSAI(SEQ ID NO：83)；

KVTYRFNTI(SEQ ID NO：84)；

IVYLENPMV(SEQ ID NO：85)；

IVCLKNPIV(SEQ ID NO：86)；

TPRHVIVRF(SEQ ID NO：87)；

TPRHILVRF(SEQ ID NO：88)；

TPRHILVKF(SEQ ID NO：89)；

RARMAKSIL(SEQ ID NO：90)；

RACIAKSIL(SEQ ID NO：91)；

RAHIAKSTL(SEQ ID NO：92)；

ISFPAKLSF(SEQ ID NO：93)；

ISYPATLGF(SEQ ID NO：94)；

SSPATDQSW(SEQ ID NO：95)；

SSLATEQSW(SEQ ID NO：96)；

KATVTKTVW(SEQ ID NO：97)；

KATVTKTAC(SEQ ID NO：98)；

RANRQPTTW(SEQ ID NO：99)；

RVNRQPTEW(SEQ ID NO：100)；和

RVNRQATEW(SEQ ID NO：101)。

在任意上述实施方式中，主题LINE多肽长可为6个氨基酸直至天然产生的LINE多肽的长度，如LINE多肽可以是6个氨基酸(aa)、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12-15aa、15-20aa、20-25aa、25-30aa、30-40aa、40-50aa、50-100aa、或长于100个氨基酸，如100aa-150aa，150aa-200aa。在任意上述实施方式中，主题LINE多肽长度约为6aa-150aa，例如约6aa-10aa、约10aa-15aa、约15aa-20aa、约20aa-25aa、约25aa-30aa、约30aa-40aa、约40aa-50aa、约50aa-75aa、约75aa-100aa、约100aa-125aa或约125aa-150aa。

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽包含图20和图21A-C描述的一个或多个15-聚体氨基酸序列。

在一些实施方式中，LINE多肽是融合蛋白，如LINE融合蛋白包含共价连接于异源蛋白的LINE多肽，其中所述异源蛋白也称为“融合伙伴”。在一些实施方式中，该融合伙伴连接于LINE蛋白的N末端，如NH₂-融合伙伴-LINE-COOH。在其它实施方式中，该融合伙伴连接于LINE蛋白的C末端，如NH₂-LINE-融合伙伴-COOH。在其它实施方式中，该融合伙伴位于LINE蛋白内部，如NH₂-(LINE₁-FP-(LINE₂-COOH)₂，其中FP是融合伙伴，而LINE₁和LINE₂分别是LINE的N-末端和C-末端区域。

合适的融合伙伴包括但不限于：免疫学标签如表位标签，包括但不限于：血凝素、FLAG、myc等；提供可检测信号的蛋白质，包括但不限于：荧光蛋白、酶(如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)等；促进融合蛋白纯化或分离的多肽，如金属离子结合多肽，如6His标签、谷胱甘肽-S-转移酶等；提供亚细胞定位的多肽；和提供由细胞分泌的多肽。提供可检测信号的融合伙伴也称为“报道物”。在一些实施方式中，融合伙伴是除LINE多肽外的免疫调节性多肽，如抗原、细胞因子等。

多聚化LINE多肽

在一些实施方式中，分离的主题LINE多肽是多聚化的，例如两个或多个LINE多肽串联连接。多聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。LINE多肽单体直接或通过接头相互连接。因此，在一些实施方式中，主题LINE多肽具有式(X₁-(Y)_0-40-X₂-(Y)_0-40)_n，其中X₁和X₂是LINE多肽，Y是接头，n是1至约10的整数(如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。使用接头时，Y是一个或多个氨基酸，或其它连接基团。X₁和X₂可以相同或不同，例如，可具有相同的氨基酸序列，或者其氨基酸序列可以互不相同。因此，例如，主题LINE多肽可具有式X₁-(Y)_0-40-X₂，例如当LINE多肽是二聚体时。作为一个非限制性例子，主题LINE多肽具有式(X₁-(Y)_0-40-X₂-(Y)_0-40)_n时，X₁可以是MNEMKREGKFRE(SEQ ID NO：1)，X₂可以是SQLKELEKQE(SEQ ID NO：2)。作为另一个非限制性例子，主题LINE多肽具有式(X₁-(Y)_0-40-X₂-(Y)_0-40)_n，X₁和X₂都可以是MNEMKREGKFRE(SEQ ID NO：1)。

另一个例子是，主题LINE多肽可具有式X₁-(Y)_0-40-X₂-(Y)_0-40-X₃，例如当LINE多肽是三聚体时。作为一个非限制性例子，主题LINE多肽具有式X₁-(Y)_0-40-X₂-(Y)_0-40-X₃时，X₁可以是MNEMKREGKFRE(SEQ ID NO：1)，X₂可以是SQLKELEKQE(SEQ ID NO：2)，X₃可以是MLRAAREKGWVT(SEQ IDNO：3)。作为另一个非限制性例子，主题LINE多肽具有式X₁-(Y)_0-40-X₂-(Y)_0-40-X₃时，X₁、X₂和X₃都可以是MNEMKREGKFRE(SEQ IDNO：1)。

当Y是间隔肽时，它通常为柔性性质，但不排除其它化学连接。目前，考虑到大部分有用接头序列通常为长度约2-40个氨基酸，例如，长度约2至10个氨基酸，约10-20个氨基酸，或约6-25个氨基酸的肽。这些接头通常使用合成的编码接头的寡核苷酸产生，以偶联这些蛋白质。通常使用具有一定程度柔性的肽接头。连接肽基本上可具有任何氨基酸序列，需要注意优选接头具有通常产生柔性肽的序列。小氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸可用于产生柔性肽。示范性肽接头包括(Gly)_2-40(SEQ ID NO：74)、(Ser)_2-40(SEQ ID NO：75)和(Ala)_2-40(SEQ ID NO：76)。本领域技术人员通常了解这类序列的产生。可购得多种不同接头，认为它们适用于本文所述实施方式。然而，通常可采用长度为约2-40个氨基酸，如约6-10个氨基酸的任何柔性接头。接头基本上可具有通常产生柔性肽的任何序列。

可以各种方式提供用于同源或异源聚合物或偶联于载体的连接。例如，可将半胱氨酸残基加到氨基-和羧基-端，其中该肽通过半胱氨酸残基的受控氧化共价连接。其它有用的是大量异源双功能物质，其在一个官能团末端产生二硫键连接，在另一端产生肽连接，这些物质包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。这种试剂在其本身和一种蛋白质的半胱氨酸之间产生二硫键连接，通过赖氨酸上的氨基或其它氨基酸上的其它游离氨基产生酰胺键连接。已知各种这类二硫键/酰胺键形成剂。参见例如，Immun.Rev.62：185(1982)。其它双功能偶联剂形成硫醚，而非二硫键连接。可购得许多这类硫醚形成剂，包括6-马来酰亚胺己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸的反应性酯等。可通过与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠混合激活羧基。示范性偶联剂是琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。当然，应理解，连接应基本不干扰连接基团在所需应用中的功能，例如用作免疫原。

载体

在一些实施方式中，将分离的主题LINE多肽连接于载体。本文所用术语“连接”可与术语“偶联”互换使用，指接近地连接，如LINE多肽和载体在空间上紧邻。在一些实施方式中，连接是共价连接。在其它实施方式中，连接是非共价连接。在一些实施方式中，LINE多肽直接连接于载体。在其它实施方式中，LINE多肽通过接头分子间接连接。

合适载体的例子包括代谢缓慢的大分子，例如：蛋白质；多糖，如琼脂糖凝胶，琼脂糖，纤维素，纤维素珠等；聚合氨基酸如聚谷氨酸，聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，如白喉、破伤风、霍乱、白细胞毒素分子的类毒素；脂质体；灭活的细菌；树突细胞；等。有关载体的进一步详细描述见下。

本领域熟知合适的载体，包括例如，甲状腺球蛋白、清蛋白如人血清白蛋白、破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素，流感病毒核蛋白；乙肝病毒核心蛋白，乙肝病毒表面抗原；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)；灭活的绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(毒素A)；钥孔血蓝素(KLH)；百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的丝状血凝素(FHA)；破伤风类毒素(TT)的T辅助细胞(Th)表位和卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)细胞壁；来自麻风分枝杆菌(M.leprae)或结核分枝杆菌的重组10kDa、19kDa和30-32kDa蛋白，或这些蛋白质的任何组合等。参见例如，美国专利号6,447,778中有关载体和将肽偶联于载体的方法的讨论。

绿脓假单胞菌外毒素A(毒素A)已有效用作偶联疫苗的载体。绿脓假单胞菌外毒素A可由绿脓假单胞菌PA 103的发酵罐培养物的上清液纯化得到。根据动物中的结果，毒素A已被分类为超抗原。可通过共价偶联于4碳间隔分子，即己二酸二酰肼(ADH)，使毒素A完全和不可逆地解毒。这一步骤破坏了毒素分子的ADPR-转移酶活性，从而使其无毒。可采用非反应性酰肼基团将多肽共价偶联于毒素A。也可采用碳二亚胺试剂将毒素A偶联于多肽。

用戊二醛作为偶联剂，方便地制备PPD-肽偶联物。参见例如Rubinstein等，(1995)AIDS 9：243-51。

该多肽与载体偶联的方法包括通过C末端肽的半胱氨酸连接进行二硫键连接、用戊二醛溶液偶联2小时、用酪氨酸偶联、或用水溶性碳二亚胺偶联。

在一些实施方式中，将分离的主题LINE多肽脂化。脂化能提高细胞毒性T细胞(CTL)对连接于脂质的肽的应答。将脂质残基，如棕榈酸等连接于该肽的氨基末端。脂质可直接连接于肽，或通过诸如Ser-Ser、Gly、Gly-Gly、Ser连接等间接连接。另一个例子是大肠杆菌脂蛋白，如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰基-丝氨酰-丝氨酸(P₃CSS)，当它共价连接于肽时，可用于初免特异性CTL。参见Deres等，Nature 342：561-564(1989)。可通过合适的羧酸酐将LINE多肽与不带电的不同链长度和不饱和程度的脂肪酸残基(从乙酸至硬脂酸)，以及与带负电的琥珀酰残基偶联。参见例如，美国专利号6,419,931。

分离的主题LINE多肽可与载体直接偶联或通过接头分子间接偶联。本领域已知各种接头分子，它们可用于偶联物。肽与载体的连接可通过肽反应性侧链，或肽的N-或C-末端进行。接头可以是有机、无机或半有机分子，并且可以是有机分子、无机分子的聚合物，或含有无机和有机分子的共聚物。

如果存在，则接头分子的长度通常足以允许LINE多肽和所连接载体之间进行一些柔性运动。接头分子的长度通常为约6-50个原子。接头分子也可以是，例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。可结合多肽的其它接头分子可用于本发明。

细合物

本发明提供包含分离的主题LINE多肽的组合物。包含分离的主题LINE多肽的组合物可包含以下一种或多种物质：盐，如NaCl、MgCl、KCl、MgSO₄等；缓冲剂，如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂；去污剂，如非离子型去污剂，如吐温-20等；蛋白酶抑制剂等。在一些实施方式中，如下文所详述，主题LINE组合物是免疫原性组合物。在其它实施方式中，如下文所详述，主题LINE组合物是药物组合物，如包含分离的主题LINE多肽和药学上可接受的赋形剂的组合物。

在一些实施方式中，主题组合物包含单一类型(或“种类”)的主题LINE多肽，例如在一些实施方式中，主题组合物中的LINE多肽均包含基本相同的氨基酸序列。在其它实施方式中，主题免疫原性组合物包含两种或多种不同的LINE多肽，例如，该组合物包含主题LINE多肽群，该群体的成员的氨基酸序列可能不同。主题组合物可包含2-约20种不同的LINE多肽，例如，主题组合物可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11-15种、或15-20种不同的LINE多肽，各多肽所含的氨基酸与其它LINE多肽的氨基酸序列不同。例如，在一些实施方式中，主题组合物包含具有第一种氨基酸序列的第一种LINE多肽；且至少包含具有第二种氨基酸序列的第二种LINE多肽，其中第二种氨基酸序列与第一种氨基酸序列不同。另一个例子是，在一些实施方式中，主题组合物包含具有第一种氨基酸序列的第一种LINE多肽；具有第二种氨基酸序列的第二种LINE多肽，其中所述第二种氨基酸序列与第一种氨基酸序列不同；且至少包含具有第三种氨基酸序列的第三种LINE多肽，其中第三种氨基酸序列与第一种和第二种氨基酸序列不同。在其它实施方式中，主题组合物包含多聚化的LINE多肽，如上所述。

LINE多肽的产生

主题LINE多肽可以多种方式产生，这些方式包括例如，化学合成(此时LINE多肽是“合成”多肽)；由天然产生来源分离和纯化；和重组方式(此时LINE多肽是“重组”多肽)。本领域熟知产生主题LINE多肽的重组方式，包括用含有编码主题LINE多肽的核苷酸序列的多核苷酸遗传修饰宿主细胞，在一定条件下体外培养所述宿主细胞合适的时间，以便通过该遗传修饰的细胞产生LINE多肽，和分离所述遗传修饰细胞产生的LINE多肽。

药物组合物

本发明提供包含主题LINE多肽的药物组合物，该组合物包含主题LINE多肽和药学上可接受的赋形剂。

本领域已知各种药学上可接受的赋形剂，在本文中无须详细讨论。以下各种发表物中详细记载了药学上可接受的赋形剂，包括例如A.Gennaro(2000)《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott，Williams和Wilkins；《药物剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(1999)H.C.Ansel等编，第7版，Lippincott，Williams和Wilkins；和《药物赋形剂手册》(Handbookof Pharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等编，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc.。

药学上可接受的赋形剂，如运载体、佐剂、载体或稀释剂容易通过公共渠道获得。而且，药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等容易通过公共渠道获得。

合适的赋形剂载体是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，和其组合。此外，如果需要，该载体可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。

主题LINE多肽药物组合物可通过以下方法制备：在水性或非水性溶剂，如植物油或其它类似油、合成的脂族酸甘油酯、高级脂族酸或丙二醇的酯中溶解、悬浮或乳化主题LINE多肽；如果需要，再加入常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

包含主题LINE多肽的免疫原性组合物

本发明提供包含主题LINE多肽的免疫原性组合物。适合包含在主题免疫原性组合物中的LINE多肽和分离的LINE多肽如上文所述。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含含有一个或多个T细胞表位的LINE多肽，这些表位呈现于逆转录病毒-感染细胞表面上时，能诱导对逆转录病毒-感染细胞，如人免疫缺陷病毒(HIV)-感染细胞或HTLV感染细胞特异性的T细胞免疫应答。“T细胞免疫应答”包括以下一种或多种情况：1)LINE表位特异性的CD4⁺T细胞的数量和/或活性提高；2)LINE表位特异性的CD8⁺T细胞的数量和/或活性提高；和3)分泌诱导或表明Th1-型免疫应答的细胞因子。诱导或表明Th1免疫应答的细胞因子包括但不限于：干扰素-γ(IFN-γ)和IL-2。

在某些实施方式中，给予主题免疫原性组合物引起对逆转录病毒感染的细胞如HIV感染的细胞进行T细胞介导的杀伤，该效应通过特异性T细胞识别逆转录病毒感染细胞表面的LINE多肽或其片段引起。在其它实施方式中，给予主题免疫原性组合物引起对逆转录病毒感染的细胞如HIV感染的细胞进行T细胞介导的杀伤，该效应通过LINE多肽或其片段特异性T细胞与慢病毒感染细胞表面出现的逆转录病毒表位交叉反应引起。

可以多种方式配制含有主题LINE多肽的主题免疫原性组合物，详述见下。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含单一种类的LINE多肽，如，免疫原性组合物包含LINE多肽群体，群体中基本上所有多肽具有相同的氨基酸序列。在其它实施方式中，主题免疫原性组合物包含两种或多种不同的LINE多肽，例如，该免疫原性组合物包含LINE多肽群体，该群体的成员的氨基酸序列可能不同。主题免疫原性组合物可包含2-约20种不同的LINE多肽，例如，主题免疫原性组合物可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11-15种、或15-20种不同的LINE多肽，各多肽所含的氨基酸与其它LINE多肽的氨基酸序列不同。例如，在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含具有第一种氨基酸序列的第一种LINE多肽；且至少包含具有第二种氨基酸序列的第二种LINE多肽，其中第二种氨基酸序列与第一种氨基酸序列不同。另一个例子是，在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含具有第一种氨基酸序列的第一种LINE多肽；具有第二种氨基酸序列的第二种LINE多肽，其中所述第二种氨基酸序列与第一种氨基酸序列不同；且至少包含具有第三种氨基酸序列的第三种LINE多肽，其中第三种氨基酸序列与第一种和第二种氨基酸序列不同。在其它实施方式中，主题免疫原性组合物包含多聚化的LINE多肽，如上所述。

可以药学上可接受的稀释剂，例如水溶液，如盐水溶液、半固体形式(如凝胶)或粉末形式提供主题免疫原性组合物。这类稀释剂可以是惰性稀释剂。

佐剂

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含主题LINE多肽(分离的或合成的)和佐剂。合适的佐剂包括适用于人体的那些。已知可用于人类的合适佐剂的例子包括但不限于：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v鲨烯、0.5％聚山梨酯80(吐温80)、0.5％w/v去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶)、QS21(皂苷佐剂)、MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰化MPL)、Aquilla提取物、ISCOMS(参见例如Sjlander等(1998)J.Leukocyte Biol.64：713)、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLG)微粒、Quil A、白介素等。对于兽医应用，包括但不限于动物实验而言，可采用弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷胺酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷胺酰胺(CGP 11637，称为去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其含有2％鲨烯/吐温80乳液中的由细菌提取的三种组分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

用于提高组合物有效性的其它示范性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳剂(含有或不含其它具体的免疫刺激剂如胞壁酰肽(见下)或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59^TM(WO90/14837；《疫苗设计：亚基和佐剂方法》(Vaccine design：thesubunit and adjuvant approach)第10章，Powell和Newman编，普莱努出版社(Plenum Press)1995)，含有5％鲨烯、0.5％吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)和0.5％司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)(任选含有共价连接于二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的胞壁酰三肽(MTP-PE))，用微流化床制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普罗流尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳液或涡旋产生较大粒度的乳液，和(c)RIBI^TM佐剂体系(RAS)(蒙大拿州汉密尔顿的力必免疫化学公司(Ribi Immunochem，Hamilton，MT))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，如MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)可适用皂苷佐剂，如QS21或STIMULON^TM(马萨诸塞州伍斯特的剑桥生物科技公司(Cambridge Bioscience，Worcester，MA))或由其产生的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)，ISCOMS可能不含其它去污剂，如WO 00/07621所述；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、其它TNF超家族分子(如CH40L、OX40L等)等；(5)单磷脂酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰化MPL(3dMPL)，如GB-2220221，EP-A-0689454，与肺炎球菌糖一起使用时任选基本不含明矾，如WO00/56358；(6)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231的组合；(7)含有CpG基序的寡核苷酸[Krieg Vaccine 2000，19，618-622；Krieg Curr Opin Mol Ther20013：15-24；Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner等，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Immunol，1998，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631；Lipford等，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern等，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi等，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol，1998，160，4755-4761；和Yi等，J.Immunol，1998，160，5898-5906；国际专利申请号WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581]，即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，如WO99/52549；(9)聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚糖联用(WO01/21207)，或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子型表面活性剂如辛苯聚糖联用(WO01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，如WO00/23105；(12)皂苷和水包油乳剂，如WO99/11241；(13)皂苷(如QS21)+3dMPL+IM2(任选+固醇)如WO98/57659；(14)用作免疫刺激剂以提高该组合物功效的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰L-苏氨酰-D-异谷胺酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷胺酰胺(去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)等。

主题免疫原性组合物可包含常规的药学上可接受的赋形剂，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。主题免疫原性组合物可含有一种或多种模拟生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的抗原(如主题LINE多肽)浓度可能千差万别，可根据诸如液体体积、粘度、体重等各种因素，按照所选的特定给药方式和患者需要进行选择。得到的组合物可以是以下形式：溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、凝胶剂、乳膏剂、洗剂、油膏剂、气雾剂等。

药物制剂中主题免疫原性组合物的蛋白质浓度可能千差万别，如以重量计少于约0.1％，约0.1％-2％，约2％-20％，或者约20％-50％，或更多，根据不同的因素，如液体体积、粘度等，按照所选特定的给药形式进行选择。

在一些实施方式中，将主题LINE多肽与一种或多种脂质配制在一起。例如，可制备不同大小的脂质体。小脂质体或形成的囊泡是单层，大小范围约为20-400纳米，可通过以下方法产生：对多层囊泡进行超声处理，在加压条件下通过具有确定大小的孔的膜挤出，或高压匀浆。脂质溶解于有机溶剂或去污剂时，可获得直径大小范围约为0.1-1μm的大单层脂质体，通过蒸发或透析分别去除增溶剂。通过需要特定脂质或严谨脱水-水化条件的方法使较小单层脂质体融合可产生与细胞一样大或更大的单层囊泡。

脂质体可包含一种或多种阳离子脂质，如DDAB，二甲基二-十八烷基溴化铵；N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵；1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷(包括但不限于：二油酰(DOTAP)、二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰)；1，2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷(包括但不限于：二油酰、二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰)DOTMA，N-[1-[2，3-双(油酰氧基)]丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵；DOGS，二-十八烷酰氨基甘氨酰精胺；DC-胆固醇，3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇；DOSPA，2，3-二油酰氧基-N-(2(精胺羧酰胺基)-乙基)-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯；1，2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(包括但不限于：二油酰(DOEPC)、二月桂酰、二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、棕榈酰-油酰)；β-丙氨酰胆固醇；CTAB，十六烷基三甲基溴化铵；二C14-脒，N-叔丁基-N′-十四烷基-3-十四烷基氨基丙脒；14Dea2，O，O′-二-十四烷酰-N-(三甲胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物；DOSPER，1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺酰(spermyl))-丙酰胺；N，N，N′，N′-四甲基-N，N′-双(2-羟乙基)-2，3-二油酰氧基-1，4-丁二胺碘化物；1-[2-酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物衍生物，如1-[2-(9(Z)-十八烯酰基氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)，1-[2-(十六酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DPTIM)；1-[2-十四酰氧基)乙基]-2-十三烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DMTIM)-参见Solodin等，(1995)Biochem.43：13537-13544；2，3-二烷氧基丙基季铵化合物衍生物，其季胺上含有羟基烷基部分，如1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基丁基溴化铵(DORIE-HB)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基戊基溴化铵(DORIE-HPe)；1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)；1，2-二棕榈酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)；1，2-二硬脂酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)-参见例如，Felgner等，(1994)J.Biol.Chem.269：25502561。许多上述脂质可购自，例如，阿凡提极性脂质制品公司(Avanti Polar Lipids，Inc.)；西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.)；分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)；北方脂质制品公司(Northerm Lipids，Inc.)；罗氏分子生化制品公司(Roche Molecular Biochemicals)；和普洛麦格公司(Promega Corp.)。

脂质体可只包含阳离子脂质，或者与其它脂质，特别是中性脂质混合，这些中性脂质包括例如：胆固醇；1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(包括但不限于：二油酰(DOPE)、1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；天然蛋黄磷脂酰胆碱(PC)等；合成的单和双酰基磷酸胆碱(如单酰基磷脂酰胆碱(MOPC))和磷酸乙醇胺。也可包含合成和天然来源的不对称脂肪酸，以及上述二酰基衍生物的混合制剂。

其它合适的脂质体组合物包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和胆固醇。这类脂质体参见例如，美国专利号5,916,588。本领域已知其它合适的脂质体组合物及其制备方法，参见各种发表物，包括例如美国专利4,241,046和6,355,267。

L_INE多核苷酸

本发明提供包括编码主题LINE多肽的核苷酸序列的重组(如合成)核酸。本文中包含编码主题LINE多肽的核苷酸序列的重组(如，合成)核酸称作“主题LINE核酸”或“主题LINE多核苷酸”。本发明还提供了组合物，包括含有主题LINE多核苷酸的药物组合物和免疫原性组合物。

在某些实施方式中，主题LINE多核苷酸包含编码主题LINE多肽的核苷酸序列，其中所述LINE多肽包含与SEQ ID NO：1-22中任一项所列氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，主题LINE核酸包括编码单一类型(或“种类”)LINE多肽的核苷酸序列，如，在一些实施方式中，所有LINE核酸都包含(编码)基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。在其它实施方式中，主题LINE核酸组合物包含两种或多种不同的LINE核酸，例如，该组合物包含编码LINE多肽群的LINE核酸群，该多肽群成员的氨基酸序列可能不同。编码的LINE多肽群可包含2-约20种不同的LINE多肽，如，主题组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15或15-20种不同的LINE多肽，各多肽的氨基酸均不同于其它LINE多肽的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，编码的LINE多肽群包含具有第一种氨基酸序列的第一种LINE多肽；且至少包含具有第二种氨基酸序列的第二种LINE多肽，其中第二种氨基酸序列与第一种氨基酸序列不同。另一个例子是，在一些实施方式中，编码的LINE多肽群包含具有第一种氨基酸序列的第一种LINE多肽；具有第二种氨基酸序列的第二种LINE多肽，其中所述第二种氨基酸序列与第一种氨基酸序列不同；且至少包含具有第三种氨基酸序列的第三种LINE多肽，其中第三种氨基酸序列与第一种和第二种氨基酸序列不同。在其它实施方式中，编码的LINE多肽是多聚化LINE多肽，如上所述。

表达载体和递送载体

在一些实施方式中，主题LINE多核苷酸是表达载体。该表达载体将提供转录和翻译起始区，它们可以是诱导型或组成型，此时在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下操作性连接编码区。因此，如，主题LINE多核苷酸可包含编码主题LINE多肽的核苷酸序列，其中编码LINE多肽的核苷酸序列操作性连接于转录控制元件(如启动子)，其中转录控制元件可以是诱导型或组成型。

表达载体通常具有方便的启动子序列附近的限制性位点，以便于插入编码异源蛋白质的核酸序列(如，便于插入编码主题LINE多肽的核苷酸序列)。可存在表达宿主中可操作的选择性标记。合适的表达载体包括但不限于：病毒载体(如基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等，Invest Opthalmol Vis Sci 35：25432549，1994；Borras等，Gene Ther6：515524，1999；Li和Davidson，PNAS 92：7700 7704，1995；Sakamoto等，H Gene Ther 5：1088 1097，1999；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺伴随病毒(参见例如，Ali等，Hum Gene Ther 9：81 86，1998，Flannery等，PNAS 94：6916 6921，1997；Bennett等，Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863，1997；Jomary等，Gene Ther 4：683690，1997，Rolling等，Hum Gene Ther 10：641 648，1999；Ali等，Hum Mol Genet5：591 594，1996；Srivastava，WO 93/09239；Samulski等，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等，Virol.(1988)166：154-165；和Flotte等，PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如，Miyoshi等，PNAS 94：10319 23，1997；Takahashi等，J Virol 73：7812 7816，1999)；逆转录病毒载体(如鼠白血病病毒、脾坏死病毒和逆转录病毒，如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒衍生的载体)等。

本领域技术人员了解许多合适的表达载体，许多可从市场上购得。以举例方式提供以下载体；就真核宿主细胞而言：是pXT1、pSG5(司查塔基公司(Stratagene))、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(法玛西亚公司(Pharmacia))。然而，可采用任何其它载体，只要它与宿主细胞相容。

根据所用的宿主/载体系统，多种合适的转录和翻译控制元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等均可用于该表达载体(参见例如，Bitter等(1987)Methods in Enzymology，153：516-544)。

合适的真核启动子(在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性例子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。本领域普通技术人员熟知如何选择合适的载体和启动子。表达载体也可含有启动翻译的核糖体结合位点和转录终止子。该表达载体也可包括增加表达的合适序列。

在一些实施方式中，主题重组载体包括一种或多种选择性标记。此外，在许多实施方式中，表达载体含有一种或多种选择性标记基因，以提供在真核细胞培养中选择转化宿主细胞的表型特征，如二氢叶酸还原酶或新霉素抗性。

可使用其它基因递送载体和方法，包括连接或不连接杀死腺病毒的聚阳离子凝聚DNA，如Curiel(1992)Hum.Gene Ther.3：147-154所述；连接配体的DNA，参见例如Wu(1989)J.Biol.Chem.264：16985-16987；真核细胞递送载体细胞；光聚合的水凝胶材料的沉积；手持式基因转移枪，如美国专利号5,149,655所述；离子化辐射，如美国专利号5,206,152和WO 92/11033所述；核电荷中和或与细胞膜融合。其它方法参见Philip(1994)Mol.Cell Biol.14：2411-2418和Woffendin(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：1581-1585。

也可采用裸露的DNA。示范性的裸露DNA的引入方法参见WO 90/11092和美国专利号5,580,859。可采用生物降解型胶乳珠提高摄入效率。珠开始发生细胞内吞后，能将DNA包被的胶乳珠有效地转运到细胞中。可对该方法进行以下改进：处理珠提高疏水性，从而帮助破坏内体并将DNA释放到胞质中。可用作基因递送载体的脂质体参见美国专利号5,422,120，PCT号WO95/13796、WO 94/23697和WO 91/14445，以及EP号524 968。

也可采用脂质体或脂质核酸递送载体。用于基因递送的脂质体复合物参见例如，美国专利号7,001,614。例如，摩尔比范围为2.0mM-10mM的含有DOTAP和至少一种胆固醇和/或胆固醇衍生物的脂质体能提供有效的递送系统，例如当DOTAP与胆固醇的摩尔比为1∶1-3∶1时。阳离子脂质N-[(2，3-二油酰氧基)丙基]-L-赖氨酰胺(LADOP)可用于递送LINE多核苷酸的组合物，其中含有LADOP的脂质体参见例如，美国专利号7,067,697。适合使用含有具有极性首基的两亲脂质和能够促进转染的脂族组分的脂质体制剂，参见例如，美国专利号6,433,017。

其它适合使用的非病毒递送载体包括机械递送系统，如Woffendin等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11581-11585所述的方法。而且，可通过沉积光聚合的水凝胶材料来递送编码序列及其表达产物。可用于递送编码序列的其它常规的基因递送方法包括例如，使用手持式基因转移枪，如美国专利号5,149,655所述；使用离子化辐射激活转移的基因，如美国专利号5,206,152和PCT号WO 92/11033所述。

组合物

本发明提供包含主题LINE核酸的组合物。包含主题LINE核酸的组合物可包含以下一种或多种物质：盐，如NaCl、MgCl、KCl、MgSO₄等；缓冲剂，如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂；去污剂，如非离子型去污剂，如吐温-20等；核酸酶抑制剂等。在一些实施方式中，如下文所详述，主题LINE核酸组合物是免疫原性组合物。

药物组合物

本发明提供一种包含主题LINE核酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本领域已知各种药学上可接受的赋形剂，在本文中无须详细讨论。以下各种发表物中详细记载了药学上可接受的赋形剂，包括例如A.Gennaro(2000)《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott，Williams和Wilkins；《药物剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(1999)H.C.Ansel等编，第7版，Lippincott，Williams和Wilkins；和《药物赋形剂手册》(Handbookof Pharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等编，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc.。

免疫原性组合物

本发明提供一种包含主题LINE多核苷酸的免疫原性组合物。当给予需要的个体时，主题LINE多核苷酸被细胞，如抗原递呈细胞摄取，在该细胞中产生编码LINE多肽并将该LINE多肽加工成为与MHC分子一起展现于细胞表面的多肽片段(“表位片段”)。编码的LINE多肽能刺激或提高对细胞表面上展示的表位的T细胞应答。逆转录病毒-感染细胞上也出现LINE表位时，也对逆转录病毒感染细胞产生T细胞应答。

包含主题LINE核酸的主题免疫原性组合物除了主题LINE核酸之外还包含一种或多种其它组分，如上文包含主题LINE多肽的免疫原性组合物中所述。

佐剂

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸和佐剂。合适的佐剂包括适合人用的佐剂。已知可用于人类的合适佐剂的例子包括但不限于：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v鲨烯、0.5％聚山梨酯80(吐温80)、0.5％w/v去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶)、QS21(皂苷佐剂)、MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰化MPL)、Aquilla提取物、ISCOMS(参见例如Sjlander等(1998)J.LeukocyteBiol.64：713)、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLG)微粒、QuilA、白介素等。对于兽医应用，包括但不限于动物实验而言，可采用弗氏佐剂，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷胺酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷胺酰胺(CGP 11637，称为去甲-MDP)，N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其含有2％鲨烯/吐温80乳液中的由细菌提取的三种组分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

用于提高组合物有效性的其它示范性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳剂(含有或不含其它具体的免疫刺激剂如胞壁酰肽(见下)或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59^TM(WO90/14837；《疫苗设计：亚基和佐剂方法》(Vaccine design：the subunit and adjuvant approach)第10章，Powell和Newman编，普莱努出版社(Plenum Press)1995)，含有5％鲨烯、0.5％吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)和0.5％司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)(任选含有共价连接于二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的胞壁酰三肽(MTP-PE))，用微流化床制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普罗流尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳液或涡旋产生较大粒度的乳液，和(c)RIBI^TM佐剂体系(RAS)(蒙大拿州汉密尔顿的力必免疫化学公司(Ribi Immunochem，Hamilton，MT))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，如MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)可适用皂苷佐剂，如QS21或STIMULON^TM(马萨诸塞州伍斯特的剑桥生物科技公司(Cambridge Bioscience，Worcester，MA))或由其产生的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)，ISCOMS可能不含其它去污剂，如WO00/07621所述；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、其它TNF超家族分子(如CH40L、OX40L等)等；(5)单磷脂酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰化MPL(3dMPL)，如GB-2220221，EP-A-0689454，与肺炎球菌糖一起使用时任选基本不含明矾，如WO00/56358；(6)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231的组合；(7)含有CpG基序的寡核苷酸[Krieg Vaccine 2000，19，618-622；Krieg Curr Opin MolTher2001 3：15-24；Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner等，PNASUSA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Immunol，1998，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631；Lipford等，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern等，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi等，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol，1998，160，4755-4761；和Yi等，J.Immunol，1998，160，5898-5906；国际专利申请号WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581]，即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，如WO99/52549；(9)聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚糖联用(WO01/21207)，或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子型表面活性剂如辛苯聚糖联用(WO01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，如WO00/23105；(12)皂苷和水包油乳剂，如WO99/11241；(13)皂苷(如QS21)+3dMPL+IM2(任选+固醇)如WO98/57659；(14)用作免疫刺激剂以提高该组合物功效的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷胺酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷胺酰胺(去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)等。

主题免疫原性组合物可包含常规的药学上可接受的赋形剂，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。主题免疫原性组合物可含有一种或多种模拟生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中主题LINE核酸的浓度可能千差万别，可根据诸如液体体积、粘度、体重等各种因素，按照所选的特定给药方式和患者需要进行选择。得到的组合物可以是以下剂型：溶液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、凝胶剂、乳膏剂、洗剂、油膏剂、气雾剂等。

药物制剂中主题LINE多核苷酸的浓度可能千差万别，如以重量计少于约0.1％、约0.1％-2％、约2％-20％、或者约20％-50％、或更多，根据不同的因素，如液体体积、粘度等，按照所选特定的给药形式进行选择。

在一些实施方式中，将主题LINE多核苷酸与一种或多种脂质配制在一起。例如，可制备不同大小的脂质体。小脂质体或形成的囊泡是单层，大小范围约为20-400纳米，可通过以下方法产生：对多层囊泡进行超声处理，在加压条件下通过具有确定大小的孔的膜挤出，或高压匀浆。脂质溶解于有机溶剂或去污剂时，可获得直径大小范围约为0.1-1μm的大单层脂质体，通过蒸发或透析分别去除增溶剂。通过需要特定脂质或严谨脱水-水化条件的方法使较小单层脂质体融合可产生与细胞一样大或更大的单层囊泡。

脂质体可包含一种或多种阳离子脂质，如DDAB，二甲基二-十八烷基溴化铵；N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵；1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷(包括但不限于：二油酰(DOTAP)、二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰)；1，2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷(包括但不限于：二油酰、二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰)DOTMA，N-[1-[2，3-双(油酰氧基)]丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵；DOGS，二-十八烷酰氨基甘氨酰精胺；DC-胆固醇，3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇；DOSPA，2，3-二油酰氧基-N-(2(精胺羧酰胺基)-乙基)-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯；1，2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(包括但不限于：二油酰(DOEPC)、二月桂酰、二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、棕榈酰-油酰)；β-丙氨酰胆固醇；CTAB，十六烷基三甲基溴化铵；二C14-脒，N-叔丁基-N′-十四烷基-3-十四烷基氨基丙脒；14Dea2，O，O′-二-十四烷酰-N-(三甲胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物；DOSPER，1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺酰(spermyl))-丙酰胺；N，N，N′，N′-四甲基-N，N′-双(2-羟乙基)-2，3-二油酰氧基-1，4-丁二胺碘化物；1-[2-酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物衍生物，如1-[2-(9(Z)-十八烯酰基氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)，1-[2-(十六酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DPTIM)；1-[2-十四酰氧基)乙基]-2-十三烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DMTIM)-参见Solodin等，(1995)Biochem.43：13537-13544；2，3-二烷氧基丙基季铵化合物衍生物，其季胺上含有羟基烷基部分，如1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基丁基溴化铵(DORIE-HB)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基戊基溴化铵(DORIE-HPe)；1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)；1，2-二棕榈酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)；1，2-二硬脂酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)-参见例如，Felgner等，(1994)J.Biol.Chem.269：2550-2561。许多上述脂质可购自，例如，阿凡提极性脂质制品公司(Avanti Polar Lipids，Inc.)；西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.)；分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)；北方脂质制品公司(Northerm Lipids，Inc.)；罗氏分子生化制品公司(Roche Molecular Biochemicals)；和普洛麦格公司(Promega Corp.)。

治疗方法

本公开文本还关注多种治疗方法，所述方法使用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。主题治疗方法包括在个体中诱导对LINE多肽产生免疫应答的方法，和提高对象对LINE多肽的免疫应答的方法，例如治疗逆转录病毒感染(如慢病毒感染)、治疗癌症等的方法；和降低对象对LINE多肽的免疫应答的方法，例如治疗自身免疫病、治疗精神分裂症等的方法。

诱导或提高对逆转录病毒-感染细胞的免疫应答的方法

本发明提供在需要的个体中诱导、引发或提高对逆转录病毒-感染细胞，如HTLV-感染细胞的T细胞免疫应答的方法。所述方法通常涉及给予个体有效量的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如，主题LINE免疫原性组合物)。

因此，如本发明提供了用于治疗个体中逆转录病毒感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如、主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，本发明提供治疗个体的逆转录病毒感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物，如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备用于治疗个体逆转录病毒感染的药物中的应用。本发明提供主题LINE免疫原性组合物(如，包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)在制备治疗个体逆转录病毒感染的药物中的应用。本发明提供了用于治疗个体的逆转录病毒感染的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。本发明提供了用于治疗个体的逆转录病毒感染的主题LINE免疫原性组合物(如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)。

因此，如本发明提供了用于治疗个体的HTLV感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，本发明提供治疗个体的HTLV感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物，如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备用于治疗个体HTLV感染的药物中的应用。本发明提供主题LINE免疫原性组合物(如，包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)在制备治疗个体HTLV感染的药物中的应用。本发明提供了用于治疗个体HTLV感染的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。本发明提供用于治疗个体HTLV感染的主题LINE免疫原性组合物(如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”指，以一个或多个剂量给予个体时，与用LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中的病毒载量相比，使个体中逆转录病毒载量(如，HTLV载量)减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约90％的用量。

在一些实施方式中，诱导、引起或增强对于逆转录病毒感染细胞的T细胞免疫应答涉及给予需要的个体有效量的主题免疫原性组合物。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体的病毒载量相比，以一个或多个剂量给予个体时，能使个体的逆转录病毒载量降低至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约90％的用量。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多肽。在其它实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中该逆转录病毒表位的特异性T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体中该逆转录病毒表位的特异性T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多肽。在其它实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中该逆转录病毒表位的特异性CD8⁺T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体中该逆转录病毒表位的特异性CD8⁺T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致逆转录病毒-感染细胞上出现的逆转录病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多肽。在其它实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸。

在一些实施方式中，例如，当主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物给予未免疫个体(即未感染逆转录病毒如HTLV的个体)时，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能降低该个体发生逆转录病毒感染引起的疾病症状(如果随后感染逆转录病毒如HTLV)的可能性的用量。在一些实施方式中，例如，当主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物给予未免疫个体(即未感染逆转录病毒的个体)时，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能提高该个体限制和/或清除逆转录病毒感染(如果随后感染逆转录病毒如HIV)的可能性的用量。

在一些实施方式中，例如，当主题免疫原性组合物给予未免疫个体(即未感染逆转录病毒如HTLV的个体)时，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能降低该个体发生逆转录病毒感染引起的疾病症状(如果随后感染逆转录病毒如HTLV)的可能性的用量。在一些实施方式中，例如，当免疫原性组合物给予未免疫个体(即未感染逆转录病毒的个体)时，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能提高该个体限制和/或清除逆转录病毒感染(如果随后感染逆转录病毒如HIV)的可能性的用量。

诱导或提高对慢病毒-感染细胞的免疫应答的方法

本发明提供在需要的个体中诱导、引发或提高对慢病毒-感染细胞，如HIV-感染细胞的T细胞免疫应答的方法。所述方法通常涉及给予个体有效量的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。

本发明提供了用于治疗个体的慢病毒感染(如HIV感染)的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，本发明提供治疗个体中慢病毒感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物，如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备用于治疗个体慢病毒感染的药物中的应用。本发明提供主题LINE免疫原性组合物(如，包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)在制备治疗个体慢病毒感染的药物中的应用。本发明提供了用于治疗个体慢病毒感染的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。本发明提供了用于治疗个体慢病毒感染的主题LINE免疫原性组合物(如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)。

本发明提供了用于治疗个体的HIV感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，本发明提供治疗个体的HIV感染的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物，如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备用于治疗个体HIV感染的药物中的应用。本发明提供主题LINE免疫原性组合物(如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)在制备治疗个体HIV感染的药物中的应用。本发明提供用于治疗个体的HIV感染的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。本发明提供了用于治疗个体的HIV感染的主题LINE免疫原性组合物(如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”指，以一个或多个剂量给予个体时，与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中的病毒载量相比，使个体的病毒载量(如HIV载量)减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约90％的用量。

在一些实施方式中，诱导、引起或增强对慢病毒感染细胞的T细胞免疫应答涉及给予个体有效量的主题免疫原性组合物。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体的病毒载量相比，以一个或多个剂量给予个体时，能使个体的病毒载量降低至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约90％的用量。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多肽。在其它实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致个体的CD4⁺T淋巴细胞水平和功能提高的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前该个体的CD4⁺T淋巴细胞水平相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致其提高至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍或至少约100倍或更多的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致CD4⁺T淋巴细胞数量在正常范围内的用量，其中人的正常范围是约600-1500个CD4⁺T淋巴细胞/毫米³血液。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致个体的CD4⁺T淋巴细胞水平和功能提高的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前该个体的CD4⁺T淋巴细胞水平相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致其提高至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍或至少约100倍或更多的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致CD4⁺T淋巴细胞数量在正常范围内的用量，其中人的正常范围是约600-1500个CD4⁺T淋巴细胞/毫米³血液。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多肽。在其它实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞(如HIV感染细胞)上出现的慢病毒表位(如HIV表位)的特异性T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中该慢病毒表位的特异性T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞(如HIV感染细胞)上出现的慢病毒表位(如HIV表位)的特异性T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞上出现的慢病毒表位的特异性T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体中该慢病毒表位的特异性T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞上出现的慢病毒表位的特异性T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多肽。在其它实施方式中，所述免疫原性组合物包含主题LINE多核苷酸。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞上出现的慢病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中该慢病毒表位的特异性CD8⁺T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞上出现的慢病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞上出现的慢病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体中该慢病毒表位的特异性CD8⁺T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致慢病毒-感染细胞上出现的慢病毒表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，例如，当主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物给予未免疫个体(即未感染慢病毒如HIV的个体)时，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能降低该个体发生慢病毒感染引起的疾病症状(如果随后接触或感染慢病毒如HIV)的可能性的用量。在一些实施方式中，例如，当主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物给予未免疫个体(即未感染慢病毒如HIV的个体)时，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能提高该个体限制和/或清除慢病毒感染(如果随后感染慢病毒如HIV)的可能性的用量。

在一些实施方式中，例如，当免疫原性组合物给予未免疫个体(即未感染慢病毒如HIV的个体)时，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能降低该个体发生慢病毒感染引起的疾病症状(如果随后接触或感染慢病毒如HIV)的可能性的用量。在一些实施方式中，例如，当免疫原性组合物给予未免疫个体(即未感染慢病毒如HIV的个体)时，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，能提高该个体限制和/或清除慢病毒感染(如果随后感染慢病毒如HIV)的可能性的用量。

联合治疗

主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物可与一种或多种治疗慢病毒感染或治疗可能伴随慢病毒感染的疾病(如细菌感染、真菌感染等)的治疗剂联合给药。治疗剂是β-内酰胺抗体、四环素、氯霉素、新霉素、短杆菌肽、杆菌肽、磺酰胺、呋喃西林、萘啶酸、可的松、氢化可的松、倍他米松、地塞米松、氟可龙、泼尼松龙、曲安西龙、吲哚美辛、舒林酸、阿昔洛韦、金刚烷胺、金刚乙胺、重组可溶性CD4(rsCD4)、抗-受体抗体(如用于鼻病毒)、奈韦拉平、西多福韦(Vistide^TM)、磷酸三钠甲酸盐(Foscamet^TM)、泛昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、核酸/复制抑制剂、干扰素、齐多夫定(AZT、Retrovir^TM)、去羟肌苷(双脱氧肌苷、ddI、Videx^TM)、司他夫定(d4T、Zerit^TM)、扎西他滨(双脱氧胞嘧啶、ddC、Hivid^TM)、奈韦拉平(Viramune^TM)、拉米夫定(Epivir^TM、3TC)、蛋白酶抑制剂、沙奎那韦(Invirase^TM、Fortovase^TM)、利托那韦(Norvir^TM)、那非那韦(Viracept^TM)、依法韦仑(Sustiva^TM)、阿巴卡韦(Ziagen^TM)、安泼那韦(A基因rase^TM)茚地那韦(Crixivan^TM)、更昔洛韦、AzDU、地拉韦啶(Rescriptor^TM)、kaletra、三协唯、利福平、克莱霉素(clathiromycin)、红细胞生成素、集落刺激因子(G-CSF和GM-CSF)、非-核苷逆转录酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、阿霉素、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、天冬酰胺酶和其组合。

可与主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物联合给药的治疗HIV感染的药物包括例如，非核苷逆转录酶抑制剂(如依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦啶、依曲韦林)、核苷类似物逆转录酶抑制剂(如齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨)、核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(泰诺福韦、阿德福韦)、HIV蛋白酶抑制剂(沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、那非那韦、安泼那韦、洛匹那韦、弗泼那韦、替拉那韦、地瑞拉韦)、HIV整合酶抑制剂(如雷特格韦、伊特格韦)、HIV进入或融合抑制剂(如马拉韦诺(Maraviroc)、恩夫韦地)以及成熟抑制剂(如比韦特(bevirimat)、韦为康(vivecon))。

治疗癌症的方法

本发明还提供治疗个体的癌症的方法，其中癌症阶段与异常的LINE多肽表达或增加的LINE多肽表达相关，其中癌症包含异常表达LINE多肽的癌细胞或癌前细胞(如，LINE多肽的表达水平比相同细胞类型的非癌(正常)细胞表达水平高至少约15％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、或至少约10倍或多于10-倍)。此类癌症包括但不限于：黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌和睾丸癌(包括畸胎瘤、精原细胞瘤、胚胎癌或由一个或多个这些类型组成的混合瘤)。该方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物(如含有一种或多种主题LINE多肽或一种或多种主题LINE多核苷酸的主题LINE免疫原性组合物)。

本发明提供用于治疗个体中癌症(如黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌和睾丸癌(包括畸胎瘤、精原细胞瘤、胚胎癌或由一个或多个这些类型组成的混合瘤)的方法，该方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，本发明提供治疗个体的癌症的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物，如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备治疗个体的癌症的药物中的应用。本发明提供主题LINE免疫原性组合物(如，包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)在制备治疗个体的癌症的药物中的应用。本发明提供用于治疗个体的癌症的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。本发明提供用于治疗个体的癌症的主题LINE免疫原性组合物(如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)。

例如，给予荷瘤(如实体瘤)个体有效量的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物，其中肿瘤细胞表达LINE多肽，如LINE-1多肽，作为癌症阶段的标记物。

例如，给予荷瘤(如实体瘤)个体有效量的包含一种或多种主题LINE多肽的主题免疫原性组合物，其中肿瘤细胞表达LINE多肽，如LINE-1多肽，作为癌症阶段的标记物。

另一个例子是将有效量的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物给予荷瘤对象，其中来自对象的组织在非癌阶段表达LINE多肽(如LINE-1多肽)，并且此类组织中作为癌症阶段标记物的LINE多肽的表达增加(如，至少约15％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、或至少约10倍或多于10倍的增加)。

另一个例子是将有效量的主题免疫原性组合物给予荷瘤对象，其中来自对象的组织在非癌阶段表达LINE多肽(如LINE-1多肽)，并且此类组织中作为癌症阶段标记物的LINE多肽的表达增加(如至少约15％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、或至少约10倍或多于10倍的增加)。

适合主题免疫原性组合物治疗的癌症包括卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和睾丸癌(包括精原细胞瘤、畸胎瘤和胚胎癌)。

在一些实施方式中，关于癌症治疗的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”指，以一个或多个剂量给予个体时，使肿瘤大小、癌细胞数目和癌细胞转移中一项或多项降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％，至多完全消除该癌症的用量。

在一些实施方式中，在癌症治疗中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，使肿瘤大小、癌细胞数量和癌细胞转移中一项或多项降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％，至多完全消除该癌症的用量。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中癌细胞表位的特异性T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体中癌细胞表位的特异性T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5-倍、至少约10-倍、或至少约100-倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是与用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗前个体中癌细胞表位的特异性CD8⁺T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加的用量。在一些实施方式中，主题免疫原性组合物的“有效量”是与用该免疫原性组合物治疗前个体中癌细胞表位的特异性CD8⁺T细胞的数量相比，以一个或多个剂量给予个体时，导致癌细胞上出现的表位的特异性CD8⁺T细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％、或2倍、至少约5-倍、至少约10-倍、或至少约100-倍，或更多的用量。

在一些实施方式中，给予需要的个体主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE免疫原性组合物)作为标准癌症疗法的辅助疗法。标准癌症治疗包括手术(如手术切除癌组织)、放疗、骨髓移植、化疗、生物反应修饰剂治疗和某些上述治疗的联合治疗。

放疗包括但不限于，由外部应用源如射线束，或通过植入小放射源递送的x-射线或γ射线。

化疗药是降低癌细胞增殖的非肽(即非蛋白性质的)化合物，包括细胞毒剂和细胞生长抑制剂。化疗药的非限制性例子包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。

本领域已知并广泛使用降低细胞增殖的药物。这类药物包括烷化剂，如氮芥、亚硝基脲、氮丙啶衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于：双氯乙基甲胺、环磷酰胺(环磷酰胺^TM)、美法仑(L-沙可来新)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链佐星、吡葡亚硝脲、乌拉莫司汀、氮芥、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、曲他胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。

抗代谢剂包括叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于：阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿糖胞苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5，8-二脱氮叶酸(PDDF、CB3717)、5，8-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)、甲酰四氢叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。

合适的天然产物和其衍生物(如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)，包括但不限于：Ara-C、紫杉醇(泰素

)、多西他赛(泰索帝

)、脱氧考福霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那；生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，如依托泊甙、替尼泊苷等；抗生素，如蒽环类抗生素、盐酸道诺霉素(道诺霉素、柔红霉素、红比霉素)、黄胆素、多柔比星、表柔比星和吗啉代衍生物等；吩噁嗪酮(phenoxizone)双环肽，如放线菌素d；碱性糖肽，如博来霉素；蒽醌苷，如普卡霉素(光神霉素)；蒽二酮，如米托蒽醌；氮丙啶吡咯并吲哚二酮(azirinopyrroloindoledione)，如丝裂霉素；大环类免疫抑制剂、如环孢霉素、FK-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等等。

其它抗增殖细胞毒剂是长春瑞滨、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、来罗噻吩(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)和多罗噻吩(droloxafine)。

具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用，包括但不限于：异秋水仙素(NSC 406042)、软海绵素B(NSC609395)、秋水仙素(NSC757)、秋水仙素衍生物(如NSC33410)、海兔毒素(dolstatin)10(NSC376128)、美登素(NSC153858)、根霉素(NSC332598)、紫杉醇(泰素

)、泰素

衍生物、多西他赛(泰素帝

)、硫代秋水仙素(NSC361792)、三苯甲基半胱氨酸(cysterin)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱，天然和合成的大环内酯，包括但不限于：大环内酯A、大环内酯B、淅皮海绵内酯(discodermolide)；雌莫司汀、诺考达唑等。

适合使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于：肾上腺皮质类固醇，如氯泼尼松、地塞米松等；雌激素和黄体酮，如己酸羟基孕酮、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、雌二醇、氯米芬、他莫昔芬；等等；和肾上腺皮质抑制剂，如氨鲁米特；17α-炔雌醇；己烯雌酚、睾酮、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酪、甲泼尼龙、甲基-睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟基孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、乙酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(氟他米特)、托瑞米芬(法乐通)和诺雷德

。雌激素能刺激增殖和分化；因此，采用结合雌激素受体的化合物来阻断这种活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。

其它化疗药包括金属复合物，如顺铂(顺-DDP)、卡铂等；脲，如羟基脲；和肼，如N-甲基肼；表叶毒素；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；替加氟；等。其它感兴趣的抗增殖药包括免疫抑制剂，如霉酚酸、沙利度胺、脱氧精胍菌素、氮杂孢菌素(azasporine)、来氟米特、咪唑立宾、氮杂螺烷(azaspirane)(SKF 105685)；易瑞沙(Iressa)

(ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)；等。

″紫杉烷″包括紫杉醇，以及任何有活性的紫杉烷衍生物或前药。可利用本领域技术人员已知技术容易地制备″紫杉醇″(在本文中应理解为包括类似物、制剂和衍生物，例如，多西他赛、泰素、泰素帝(多西他赛制剂)、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物和紫杉醇的3′N-脱苯甲酰-3′N-叔丁氧基羰基类似物)(也参见WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；美国专利号5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和EP 590,267)，或由各种商业来源获得，包括例如，密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)(来自红豆杉(Taxus brevifolia)的T7402；或来自云南红豆杉(Taxusyannanensis)的T-1912)。

应理解，紫杉醇不仅指紫杉醇的普通化学形式，还指类似物和衍生物(如泰素帝多西他赛，如上所述)和紫杉醇偶联物(如紫杉醇-PEG、紫杉醇-右旋糖苷或紫杉醇-木糖)。

术语“紫杉烷”也包括各种已知的衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于：国际专利申请WO 99/18113所述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209所述的哌嗪和其它衍生物；WO 99/09021、WO98/22451和美国专利号5,869,680所述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288所述的6-硫代衍生物；美国专利号5,821,263所述的磺胺衍生物；和美国专利号5,415,869所述的紫杉醇衍生物。它还包括紫杉醇的前药，包括但不限于WO98/58927；WO 98/13059；和美国专利号5,824,701所述的药物。

适合与本发明方法联用的生物反应修饰剂包括但不限于：(1)酪氨酸激酶(RTK)活性抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，如特异性结合肿瘤抗原的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白介素-2；(6)IFN-α；(7)IFN-γ；(8)集落刺激因子；和(9)血管新生抑制剂。

治疗自身免疫病的方法

本发明提供了用于治疗个体的自身免疫病的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)以降低对象对LINE多肽的免疫应答，从而治疗自身免疫病。可用主题方法治疗的自身免疫病包括但不限于：多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和1型糖尿病。

本发明提供用于治疗个体的自身免疫病的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。在一些实施方式中，本发明提供治疗个体的自身免疫病的方法，所述方法通常涉及给予需要的个体有效量的主题LINE免疫原性组合物，如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备治疗个体的自身免疫病的药物中的应用。本发明提供主题LINE免疫原性组合物(如，包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)在制备治疗个体的自身免疫病的药物中的应用。本发明提供用于治疗个体自身免疫病的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。本发明提供用于治疗个体自身免疫病的主题LINE免疫原性组合物(如包含主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题免疫原性组合物)。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的有效量指，与没有使用主题LINE多肽治疗的对象对LINE多肽的免疫应答水平相比，能使对象对LINE多肽免疫应答有效降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、或多于50％的用量。

在一些实施方式中，主题方法能有效降低自身反应性，其中“降低自身反应性”包括降低自身反应性细胞的数量；降低自身反应性细胞的活性和降低自身反应性抗体的水平中的一种或多种现象。自身反应性取决于多种白细胞的相互作用，这些白细胞包括但不限于：T淋巴细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞和树突细胞。T淋巴细胞包括CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺淋巴细胞。B细胞可用作抗原呈递细胞，并可用于产生可靶向组织的自身抗体。在一些实施方式中，主题方法可改变参与各种自身免疫反应性的这些细胞的活性和数量。在一些实施方式中，与不用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗的个体的自身反应性细胞的数量和/或水平相比，主题方法能使个体的自身反应性细胞的数量和/或活性有效降低至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％，或更多。

在一些实施方式中，主题方法能有效降低自身反应性T淋巴细胞的数量和/或活性。因此，在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的有效量是与不用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗的个体的自身反应性T淋巴细胞的数量和/或水平相比，能使个体的自身反应性T淋巴细胞的数量和/或活性有效降低至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％，或更多的用量。

在一些实施方式中，主题方法能有效降低自身反应性B细胞的数量和/或活性。因此，在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的有效量是与不用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗的个体的自身反应性B细胞的数量和/或水平相比，能使个体的自身反应性B细胞的数量和/或活性有效降低至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％，或更多的用量。

自身反应性T淋巴细胞的活性包括但不限于：对“自身”细胞的细胞溶解活性；分泌细胞因子；分泌趋化因子；对趋化因子的反应；和运输。在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的有效量是能有效降低个体的自身反应性T淋巴细胞的一种或多种活性的用量。

不难利用已知实验确定给予主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物是否能有效降低个体的自身反应性T淋巴细胞的数量和/或活性。例如，当自身反应性T淋巴细胞对自身抗原特异时，利用，例如混合的淋巴细胞反应测定自身抗原特异性T淋巴细胞的数量和活性水平，该反应中胞质中含有可检测标记且展示自身抗原的受辐射细胞与该个体的淋巴细胞混合。由自身抗原展示细胞的胞质释放可检测标记表明该个体中存在自身反应性淋巴细胞。本领域已知与1型糖尿病有关的自身反应性T淋巴细胞的检测方法，可采用任何这类方法。参见例如，美国专利号6,022,697中有关与1型糖尿病有关的自身反应性T淋巴细胞的检测方法的讨论。

在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的有效量是能有效降低自身免疫病的一种或多种症状的严重程度的用量。例如，在一些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的有效量是与未用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗的个体中症状的严重程度相比，将自身免疫病的一种或多种症状的严重程度有效降低至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％，或更多的用量。

本领域已知与自身免疫病有关的症状。参见例如，“自身免疫病手册”(Textbook of the Autoimmune Diseases)R.G.Lahita编(2000)Lippincott Williams和Wilkins，第1版。以下是非限制性例子。

多发性硬化的特征是中枢神经系统(CNS)功能障碍的各种症状和迹象，伴随减轻和复发加重。最常见的表现症状是在一个或多个肢体、躯干或面部一侧感觉异常；腿或手软弱或笨拙；或视觉障碍，如部分失明和一只眼睛疼痛(眼球后视神经炎)，视野模糊或有暗点。其它常见的早期症状是眼肌麻痹，导致双重视野(复视)、一个或多个肢体暂时性软弱、轻度僵硬或不寻常的四肢易疲劳、轻微行走障碍(minor gait disturbances)、膀胱控制困难、眩晕和轻微情感障碍。

糖尿病(DM)是特征是胰岛素分泌和/或胰岛素作用的绝对或相对损伤造成的高血糖的综合征。虽然糖尿病可以在任何年龄发病，但I型DM最常见的发病年龄为儿童或青少年，是30岁之前诊断的DM的主要类型。此种类型的糖尿病占所有DM病例的10-15％，其临床特征是高血糖。

联合治疗

在一些实施方式中，主题治疗方法包括给予需要的个体有效量的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物；和能有效治疗自身免疫病的至少一种其它药物。在一些实施方式中，所述至少一种其它药物不是主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。

在一些实施方式中，主题治疗方法包括给予需要的个体有效量的主题LINE多肽；和能有效治疗自身免疫病的至少一种其它药物。在一些实施方式中，所述至少一种其它药物不是主题LINE多肽。

本领域技术人员应了解适合治疗自身免疫病的药物(除主题LINE多肽以外)。例如，适合治疗1型糖尿病的药物包括胰岛素，包括天然产生的胰岛素、胰岛素类似物等。

适用于本发明的胰岛素包括但不限于：常规胰岛素、速效胰岛素锌悬液(semilente)、NPH、纯化猪胰岛素锌混悬液(lente)、鱼精蛋白胰岛素锌(PZI)、长效胰岛素锌悬液(ultralente)、甘精胰岛素、速效胰岛素制剂(insulin aspart)、酰化胰岛素、单体胰岛素、超活性胰岛素、肝选择性胰岛素和任何其它胰岛素类似物或衍生物，以及上述任何物质的混合物。适用于本发明的胰岛素包括但不限于：美国专利4,992,417；4,992,418；5,474,978；5,514,646；5,504,188；5,547,929；5,650,486；5,693,609；5,700,662；5,747,642；5,922,675；5,952,297和6,034,054；以及公开的PCT申请WO 00/121197；WO 09/010645和WO 90/12814所公开的胰岛素形式。胰岛素类似物包括但不限于：超活性胰岛素类似物、单体胰岛素和肝特异性胰岛素类似物。

治疗精神分裂症的方法

本发明提供了用于治疗个体的精神分裂症的方法，所述方法通常包括给予需要的个体有效量的主题LINE多肽(如分离的主题LINE多肽、合成的主题LINE多肽)、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)。本发明提供主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物在制备治疗个体精神分裂症的药物中的应用。本发明提供用于治疗个体精神分裂症的主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物。

在这些实施方式中，主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物的“有效量”是指与不用主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物治疗个体的症状的水平或严重程度相比，以一个或多个剂量给予需要的个体时，使精神分裂症的至少一种症状减轻至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％，或更多的用量。本领域了解精神分裂症的症状，包括例如，“阳性”症状(如妄想、幻觉、语言混乱、行为粗劣紊乱或紧张)；和“阴性”症状(如失语、情感冷淡、无意志(avolition))。

制剂

可以多种方式配制如上所述的主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸，以便给予需要的个体。本发明提供包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的药物制剂。上文描述了包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的免疫原性组合物。其它制剂如下所述。

包含LINE多肽或主题LINE多核苷酸的主题制剂通常包含一种或多种赋形剂(如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石粉、磷酸钙或碳酸钙)、粘合剂(如纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖或淀粉)、崩解剂(如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、低取代羟丙基纤维素、碳酸氢钠、磷酸钙或柠檬酸钙)、润滑剂(如硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石粉或十二烷基硫酸钠)、调味剂(如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸或橙粉)、防腐剂(如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、稳定剂(如柠檬酸、柠檬酸钠或乙酸)、助悬剂(如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或硬脂酸铝)、分散剂(如羟丙基甲基纤维素)、稀释剂(如水)和基蜡(base wax)(如可可油、白凡士林或聚乙二醇)。

包含活性剂的片剂可用合适的成膜剂包衣，合适的成膜剂包括例如，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素或乙基纤维素，其中可任选地加入合适的赋形剂，例如软化剂，如甘油、丙二醇、邻苯二甲酸二乙酯或三乙酸甘油酯；填料，如蔗糖、山梨糖醇、木糖醇、葡萄糖或乳糖；着色剂，如氢氧化钛等。

合适的赋形剂载体是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，和其组合。此外，如果需要，该载体可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。本领域技术人员了解或明白制备这类剂型的实际方法。参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company，Easton，Pa.)，第17版，1985。在任何情况下，给予的组合物或制剂含有足以在所治疗对象中实现所需状态的药物用量。药学上可接受的赋形剂，如运载体、佐剂、载体或稀释剂容易通过公共渠道获得。而且，药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等容易通过公共渠道获得。

在一些实施方式中，例如，用于诱导或提高对慢病毒的免疫应答时，将LINE多肽或主题LINE多核苷酸配制成阴道递送的形式。阴道内给药的主题制剂可配制成阴道内生物粘附片剂、阴道内生物粘附微粒、阴道内乳膏剂、阴道内洗剂、阴道内泡沫、阴道内油膏剂、阴道内糊剂、阴道内溶液剂或阴道内凝胶剂。

剂量

以一个或多个剂量给药时，具有所需效果(如提高对慢病毒的T细胞免疫应答；提高对癌细胞的免疫应答；降低自身免疫应答；等)的主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸的合适剂量将取决于各种因素，但通常是在约1μg-100mg的范围内，如约1μg-5μg、约5μg-10μg、约10μg-25μg、约25μg-50μg、约50μg-100μg、约100μg-500μg、约500μg-1mg、约1mg-10mg、约10mg-50mg、或约50mg-100mg，所述剂量可以一次给药或分成多个剂量给药。

在一些实施方式中，以单位体重确定每个剂量中主题LINE多肽的含量。例如，在一些实施方式中，主题LINE多肽的给药量约为0.5mg/kg-100mg/kg，例如每剂约0.5mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-2mg/kg、约2mg/kg-3mg/kg、约3mg/kg-5mg/kg、约5mg/kg-7mg/kg、约7mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-15mg/kg、约15mg/kg-20mg/kg、约20mg/kg-25mg/kg、约25mg/kg-30mg/kg、约30mg/kg-40mg/kg、约40mg/kg-50mg/kg、约50mg/kg-60mg/kg、约60mg/kg-70mg/kg、约70mg/kg-80mg/kg、约80mg/kg-90mg/kg或约90mg/kg-100mg/kg，或者高于100mg/kg。

在一些实施方式中，以单位体重确定每个剂量中主题LINE多核苷酸的含量。例如，在一些实施方式中，主题LINE多核苷酸的给药量约为0.5mg/kg-100mg/kg，例如每剂约0.5mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-2mg/kg、约2mg/kg-3mg/kg、约3mg/kg-5mg/kg、约5mg/kg-7mg/kg、约7mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-15mg/kg、约15mg/kg-20mg/kg、约20mg/kg-25mg/kg、约25mg/kg-30mg/kg、约30mg/kg-40mg/kg、约40mg/kg-50mg/kg、约50mg/kg-60mg/kg、约60mg/kg-70mg/kg、约70mg/kg-80mg/kg、约80mg/kg-90mg/kg或约90mg/kg-100mg/kg，或者高于100mg/kg。

本领域技术人员容易理解，剂量水平可视具体化合物、症状严重程度和对象对副作用的易感性而改变。本领域技术人员通过各种方式不难确定给定化合物的优选剂量。

在一些实施方式中，给予多个剂量的主题LINE多肽或主题LINE多核苷酸。给予LINE多肽或主题LINE多核苷酸的频率可取决于各种因素，如症状的严重性等。例如，在一些实施方式中，LINE多肽或主题LINE多核苷酸的给药频率为每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔天一次(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)、或每天三次(tid)。

LINE多肽给药的持续期，如给予LINE多肽的时间可以是不同的，这取决于多种因素，如病人的反应等。例如，LINE多肽的给药持续时间范围可以是约1天-1周、约2周-4周、约1个月-2个月、约2个月-4个月、约4个月-6个月、约6个月-8个月、约8个月-1年、约1年-2年、或约2年-4年或更长。

LINE多核苷酸给药的持续期，如给予LINE多核苷酸的时间可以是不同的，这取决于多种因素，如病人的反应等。例如，LINE多核苷酸的给药持续时间范围可以是约1天-1周、约2周-4周、约1个月-2个月、约2个月-4个月、约4个月-6个月、约6个月-8个月、约8个月-1年、约1年-2年、或约2年-4年或更长。

给药途径

常规和药学上可接受的给药途径包括鼻内、肌肉内、气管内、肿瘤内、透皮、皮下、皮内、外用、静脉内、阴道、鼻腔和其它胃肠道外给药途径。合适的给药途径也包括口服和直肠途径。如果需要，可组合给药途径，或者根据药物和/或所需效果进行调节。可以通过单一剂量或多剂量给予该组合物。

可利用任何可获得的常规方法以及适合递送常规药物的途径将主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物给予宿主，所述途径包括全身途径或局部途径。通常，本发明考虑的给药途径包括但不限于肠道、胃肠外或吸入途径。

除吸入给药以外的胃肠道外给药途径包括但不限于：外用、阴道、透皮、皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、肿瘤内、肿瘤周和静脉内途径，即除消化道以外的任何给药途径。可进行胃肠道外给药，以实现药物的全身或局部递送。需要全身递送时，给药一般包括药物制剂的侵入性或全身吸收的局部或粘膜给药。

也可通过肠道给药将主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物递送给对象。肠道给药途径包括但不限于口服和直肠(如栓剂)递送。

可将主题LINE多肽、主题LINE多核苷酸或主题LINE组合物(如主题LINE药物组合物、主题LINE免疫原性组合物)递送至粘膜组织，如阴道组织、直肠组织等。

产生LINE-特异性CTL的方法

本发明提供体外产生LINE-特异性CD8⁺T细胞群的方法。该方法通常包括使CD8⁺T细胞或其前体与连接于抗原呈递平台的LINE多肽相接触，其中所述接触在体外进行。可利用该方法产生LINE多肽-特异性CD8⁺T细胞群，进而用于治疗疾病如逆转录病毒感染、慢病毒感染(如HIV感染)和癌症的方法。

在一些实施方式中，由个体获得CD8⁺T细胞，在体外与连接于抗原呈递平台的LINE多肽相接触。在一些实施方式中，从个体获得包含CD8⁺T细胞的混合细胞群；从混合细胞群分离CD8⁺T细胞，产生未刺激的CD8⁺T细胞群。然后，在体外使未刺激的CD8⁺T细胞群与连接于抗原呈递平台的LINE多肽相接触。该接触步骤活化至少一部分具有能够结合LINE多肽的T细胞受体的未刺激的CD8⁺T细胞群使其对LINE多肽产生特异性。

包含CD8⁺T细胞的混合细胞群的来源可以是，例如，全血。可以一种或多种方式或步骤操作混合细胞群，例如，以去除红细胞；选择CD8⁺T细胞；和/或选择CD4⁺T细胞或其它非-CD8⁺细胞群。未刺激CD8⁺细胞的数量范围可以是约10²个细胞-10⁹个细胞，如约10²个细胞-10³个细胞、约10³个细胞-10⁴个细胞、约10⁴个细胞-10⁵个细胞、约10⁵个细胞-5x10⁵个细胞、约5x10⁵个细胞-10⁶个细胞、约10⁶个细胞-5x10⁶个细胞、约5x10⁶个细胞-10⁷个细胞、约10⁷个细胞-5x10⁷个细胞、约5x10⁷个细胞-10⁸个细胞、约10⁸个细胞-5x10⁸个细胞、约5x10⁸个细胞-10⁹个细胞。

抗原-呈递平台可以是抗原呈递细胞(APC)，如用LINE多肽脉冲的APC，其中APC可以是活的或者可以是灭活的。在一些实施方式中，抗原呈递平台是结合LINE多肽的珠(如塑料珠、磁珠等)或其它颗粒。本领域已知除天然产生APC外的抗原呈递平台，包括但不限于：珠；灭活的表面工程病毒(参见例如，Mosca等(2007)Retrovirol.4：32)；人造APC，如脂质体(参见例如，美国专利公开号2006/0034865)等。

除LINE多肽外，抗原呈递平台还包括足以刺激LINE-特异性CD8⁺T细胞群扩增的一种或多种表面分子，如I类MHC分子(如I类HLA分子)等。抗原呈递平台也可包括一种或多种共同刺激分子，其中合适的共同刺激分子包括但不限于：抗CD28抗体、抗-CD49d抗体等)。

未刺激的CD8⁺T细胞在体外与连接于抗原呈递平台的LINE多肽相接触；LINE-特异性CD8⁺T细胞数量增加。该方法导致LINE-特异性CD8⁺T细胞数量增加10倍至10⁶倍。通过主题方法获得的LINE-特异性CD8⁺细胞的数量范围可以是约10³-10⁹个细胞，如约10³-10⁴个细胞、约10⁴-10⁵个细胞、约10⁵-5x10⁵个细胞、约5x10⁵-10⁶个细胞、约10⁶-5x10⁶个细胞、约5x10⁶-10⁷个细胞、约10⁷-5x10⁷个细胞、约5x10⁷-10⁸个细胞、约10⁸-5x10⁸个细胞、或约5x10⁸-10⁹个细胞。

本发明提供使用LINE-特异性CD8⁺T细胞的治疗方法。在一些实施方式中，该方法是治疗HIV感染的方法。在其它实施方式中，该方法是治疗癌症的方法。该方法通常包括给予需要的个体有效量的LINE-特异性CD8⁺T细胞。在一些实施方式中，LINE-特异性CD8⁺T细胞是自体的，例如，将LINE-特异性CD8⁺T细胞给予取得混合细胞群的同一个体(即供体个体和接受个体相同)。在其它实施方式中，LINE-特异性CD8⁺T细胞是同种异体的，例如，将LINE-特异性CD8⁺T细胞给予与取得混合细胞群的个体(供体个体)遗传背景不同的个体(接受个体)。

在一些实施方式中，以一个或多个剂量给予接受个体的LINE-特异性CD8⁺T细胞数量为约10³-10⁹个细胞，如约10³-10⁴个细胞、约10⁴-10⁵个细胞、约10⁵-5x10⁵个细胞、约5x10⁵-10⁶个细胞、约10⁶-5x10⁶个细胞、约5x10⁶-10⁷个细胞、约10⁷-5x10⁷个细胞、约5x10⁷-10⁸个细胞、约10⁸-5x10⁸个细胞或约5x10⁸-10⁹个细胞。

诊断方法

本发明提供各种诊断方法，这些方法利用主题LINE多肽或主题LINE组合物。主题诊断方法包括监测患者对治疗的反应的方法；为疾病分期的方法；和检测疾病的方法。

在一些实施方式中，主题诊断方法包括检测个体中是否存在产生LINE多肽的癌细胞。检测产生LINE多肽的癌细胞的方法包括免疫学方法，例如，使用LINE多肽的特异性抗体，其中免疫学实验包括例如，免疫组织学实验以及荧光活化的细胞分析实验(如荧光活化的细胞分选实验，使用荧光标记的LINE多肽的抗体)。

在其它实施方式中，主题诊断方法通常包括检测获自个体的生物样品中LINE-特异性CD8⁺T细胞的数量。可使用，如⁵¹Cr释放试验测定LINE-特异性CD8⁺T细胞的数量，其中用LINE肽脉冲处理并用⁵¹Cr标记的靶细胞与可能含有LINE-特异性CD8⁺T细胞的受试样品相接触。通过测定靶细胞释放的⁵¹Cr确定LINE-特异性CD8⁺T细胞的数量。

在其它实施方式中，主题诊断方法包括检测个体的血清或血浆(或其它生物学液体)中的LINE多肽。可采用，例如，LINE多肽特异性抗体的免疫学实验检测获自个体的生物学液体中的LINE多肽。合适的免疫学实验包括但不限于：酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫实验(RIA)、蛋白质印迹(“Western印迹”)实验、免疫沉淀实验等。

LINE-特异性抗体

如上所述，在一些实施方式中，主题诊断实验将采用LINE多肽的特异性抗体(“抗-LINE抗体”)。合适的抗-LINE抗体包括任何同种型的完整抗体；抗-LINE抗体的表位结合片段；多克隆抗体；单克隆抗体；人工抗体；单链抗体等。在一些实施方式中，本发明提供与主题LINE多肽特异性结合的抗体。可在主题诊断实验中使用主题LINE多肽-特异性抗体。在一些实施方式中，主题抗体是分离的。在一些实施方式中，主题抗体是人造的或合成的。

通过常规技术产生单克隆抗体。通常，被免疫的宿主动物的脾脏和/或淋巴结提供浆细胞来源。通过与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，从而使浆细胞永生化。利用标准技术筛选来自单个杂交瘤的培养物上清液，以鉴定产生具有所需特异性的抗体的杂交瘤。适用于产生单克隆抗体的动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、家兔等。可通过常规技术由杂交瘤上清液或腹水纯化抗体，这些技术包括例如采用结合于不溶性支持物，蛋白A琼脂糖的蛋白质进行亲和层析等。

可产生单链形式，而非正常的多聚体结构的抗体。单链抗体参见Jost等，(1994)J.B.C.269：26267-73等等。将编码重链可变区和轻链可变区的DNA序列连接于编码至少约4个氨基酸的间隔物，所述氨基酸是小中性氨基酸，包括甘氨酸和/或丝氨酸。此融合物的编码蛋白使得能够组装保持了原始抗体的特异性和亲和力的功能性可变区。

合适的抗-LINE抗体也包括“人造”抗体，如体外产生和选择的抗体和抗体片段。在一些实施方式中，在噬菌体或其它病毒颗粒表面上展示这类抗体。在许多实施方式中，这类人造抗体是与病毒或噬菌体结构蛋白，包括但不限于M13基因III蛋白形成的融合蛋白。产生这类人造抗体的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,516,637；5,223,409；5,658,727；5,667,988；5,498,538；5,403,484；5,571,698；和5,625,033。

可通过切割完整蛋白，如通过蛋白酶或化学切割制备抗体片段，如Fv、F(ab’)₂和Fab。或者，设计截短基因。例如，编码一部分F(ab’)₂片段的嵌合基因包括编码CH1结构域和H链绞链区的DNA序列，后接翻译终止密码子，以产生截短分子。

在一些实施方式中，用(例如)放射性同位素，产生可检测产物的酶、荧光蛋白、发色蛋白等可检测地标记抗-LINE抗体。抗-LINE抗体还可偶联于其它部分，如特异性结合对成员，如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。抗-LINE抗体也可结合于固体支持物，包括但不限于：聚苯乙烯平板或珠、磁珠、试片、膜等。

可直接或间接标记LINE多肽的特异性抗体。直接标记包括放射性同位素(如¹²⁵I；³⁵S等)；产物可检测的酶(如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)；荧光标签(如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白等)；通过金属螯合基团如EDTA连接于抗体的荧光发射金属如¹⁵²Eu，或其它镧系元素；化学发光化合物，如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶鎓盐等；生物发光化合物，如萤光素；荧光蛋白(如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)；等。间接标记包括LINE-特异性抗体的特异性第二抗体(如上所述标记所述第二抗体)；以及特异性结合对，如生物素-亲和素等的成员。

在一些实施方式中，抗-LINE抗体包含共价连接于该抗体的提供可检测信号的蛋白质。合适的蛋白质包括但不限于：荧光蛋白和酶(如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)。合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于衍生自维多利亚水母的GFP或其衍生物，其中数种可购得；来自诸如海肾(Renilla reniformis)、海蝴蝶花(Renilla mulleri)或海笔(Ptilosarcus guernyi)等物种的GFP，如WO 99/49019和Peelle等(2001)J.Protein Chem.20：507-519所述；珊瑚虫(Anthozoan)种类的各种荧光和有色蛋白，如Matz等(1999)Nature Biotechnol.17：969-973，美国专利公开号2002/0197676或美国专利公开号2005/0032085所述；等等。

在某些实施方式中，主题诊断实验使用LINE多肽的特异性抗体，其中LINE多肽特异性抗体特别排除对LINE-1 p40具有结合亲和力的抗体或其片段，如多克隆抗体AH40.1。

监测病人对逆转录病毒感染治疗的反应

在一些实施方式中，主题LINE多肽的组合物可用于监测病人对逆转录病毒感染，如HIV感染、HTLV感染等的治疗的反应。

因此，本发明还提供监测患者对逆转录病毒感染，如HIV感染的治疗的反应的方法。该方法通常包括使患者的白细胞(WBC)在体外与主题LINE多肽相接触；并检测WBC接触LINE多肽后分泌的细胞因子。与治疗前或治疗中较早时间点获自个体的WBC产生的细胞因子水平相比，接触LINE多肽后WBC产生的细胞因子减少，表明该治疗能有效治疗逆转录病毒感染(如病毒载量减少、CD4⁺T淋巴细胞水平升高(HIV感染的病例中)等)。合适的WBC包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)、分离的T淋巴细胞、分离的CD4⁺T淋巴细胞、分离的CD8⁺T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T淋巴细胞(NKT，如NK1.1⁺T淋巴细胞)等。

例如，在一些实施方式中，主题监测方法包括：a)将WBC在体外接触合成的主题LINE多肽，其中在逆转录病毒感染治疗开始后第一时间点从病人中获取WBC；和b)检测WBC在接触LINE多肽后分泌的细胞因子，其中与对照WBC接触LINE多肽后产生的细胞因子水平相比，WBC接触LINE多肽后产生的细胞因子减少，表明该治疗能有效治疗逆转录病毒感染，其中对照WBC在治疗开始前或在治疗中早于第一时间点的时间点从病人中获取。

例如，在一些实施方式中，主题监测方法包括：a)将WBC在体外接触合成的主题LINE多肽，其中在逆转录病毒感染治疗开始后第二时间点从病人中获取WBC；和b)检测WBC因接触LINE多肽而分泌的细胞因子，其中与对照WBC接触LINE多肽后产生的细胞因子水平相比，WBC接触LINE多肽后产生的细胞因子减少，表明该治疗能有效治疗逆转录病毒感染，其中对照WBC在治疗开始后的第一时间点从病人获取，第一时间点早于第二时间点。

在一些实施方式中，主题LINE多肽组合物可用于监测患者对HTLV感染(如HTLV-I或HTLV-II感染)治疗的反应。该方法通常包括使患者的白细胞(WBC)在体外与主题LINE多肽相接触；并检测接触LINE多肽后WBC分泌的细胞因子。接触LINE多肽后WBC的细胞因子产量降低表明该治疗能有效治疗HTLV-I或-II感染(如使病毒载量降低、使CD4⁺T淋巴细胞水平升高(在HIV感染的情况下)等)。合适的WBC包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)、分离的T淋巴细胞、分离的CD4⁺T淋巴细胞、分离的CD8⁺T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T淋巴细胞(NKT，如NK1.1⁺T淋巴细胞)等。

适用于主题检测方法的LINE多肽长度可以是6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、12-15个氨基酸、15-18个氨基酸、18-20个氨基酸或20-25个氨基酸、或更长。合适的LINE多肽包括上述任何LINE多肽。在一些实施方式中，LINE多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-22中任一项所列氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列相同性。

由PBMC分泌并在主题患者监测方法中检测到的细胞因子包括但不限于：IFN-γ、TNF-α和IL-2。

检测适用于主题患者监测方法的分泌细胞因子的方法包括但不限于：免疫学实验，如酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫实验(RIA)、酶联免疫斑点(ELISPOT)实验；细胞实验等。

在一些实施方式中，与治疗前或治疗中较早时间点获自病人的WBC所产生的细胞因子水平相比，因接触LINE多肽WBC产生的细胞因子减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％或更多，表明对逆转录病毒感染的治疗是有效的。

可以在治疗之前和之后、或者在治疗过程中的不同时间点获得包含WBC的患者样品；比较第一个时间点所取样品和第二个(随后)时间点所取样品的细胞因子产量水平。

在一些实施方式中，使获自患者的PBMC与一种或多种LINE多肽体外相接触；用ELISPOT实验检测细胞因子产量。本领域已经记载过ELISPOT实验。参见例如Lalvani等(1997)J.Exp.Med.186：859；和美国专利号5,853,697。在这些实施方式中，PBMC产生的细胞因子水平表示为每10⁶个PBMC中斑点形成单位(SFU)的数量。SFU数量减少表明逆转录病毒感染的治疗是有效的。

监测患者对癌症治疗的反应

在某些实施方式中，提供了监测病人对癌症治疗方案反应的方法。例如，在治疗方案前、治疗方案中和治疗方案后监测与癌症相关的LINE多肽的水平。

在一些实施方式中，监测(例如)血清中、特定细胞群表面上的LINE多肽水平等。

疾病分期

本发明提供在个体中进行疾病分期的方法，其中LINE多肽水平与疾病的分期或严重程度有关。该方法通常包括检测获自个体的生物样品中LINE多肽水平。生物样品中LINE多肽的水平与疾病或失调的严重程度相关联，可用于进行疾病分期。

在一些实施方式中，主题疾病分期方法包括检测获自个体的生物样品中对主题LINE多肽特异的CD8⁺T细胞的数量。在一些实施方式中，LINE-特异性CD8⁺T细胞的数量表明了疾病的分期。

检测疾病

本发明提供检测个体的疾病，如癌症的方法，其中获自个体的生物样品中LINE多肽的存在或水平表明生物样品(个体)中是否存在癌细胞。该方法通常包括检测获自个体的生物样品中的LINE多肽水平。当LINE多肽水平高于正常细胞的水平时，表明样品中存在癌细胞。

在一些实施方式中，检测LINE表达异常的疾病，如癌组织(如肿瘤)或HIV感染细胞中LINE-1表达异常升高，包括检测获自个体生物样品中主题LINE多肽特异性CD8⁺T细胞的数目。当生物样品中存在对主题LINE多肽的CD8⁺T细胞应答时，表明该个体患有LINE异常表达相关性疾病。

适合治疗的对象

治疗逆转录病毒感染

本发明考虑到适于治疗逆转录病毒感染如慢病毒感染个体的方法；治疗处于逆转录病毒感染风险中的未感染个体的方法；治疗进行过逆转录病毒感染治疗但对治疗没有反应的个体的方法；治疗进行过逆转录病毒感染治疗但复发的个体的方法。在一些实施方式中，“风险”个体指比一般接触逆转录病毒感染(如慢病毒感染，如HIV感染)的人群具有更高的感染风险的个体。

在一些实施方式中，将含有主题LINE多肽的主题免疫原性组合物给予幼稚个体，如未感染HIV的个体。如果个体感染HIV，将主题免疫原性组合物给予幼稚个体可降低HIV感染引起疾病的严重程度和/或可限制HIV感染和/或可清除HIV感染。

将主题免疫原性组合物给予幼稚个体可引起HIV亚临床感染的清除，如，未发生HIV感染症状的HIV感染。例如，将主题免疫原性组合物给予幼稚个体可引起HIV亚临床感染的清除，因此个体不发生临床HIV感染(如个体不发生血清转化，不发展成可检测的HIV病毒载量，不具有可检测的HIV抗原水平)。

例如，本发明方法适合治疗发生人免疫缺陷病毒(HIV)感染的个体；尚未感染HIV、但处于接触HIV感染的风险中的个体；和曾治疗过HIV感染、但对治疗无反应或一开始对治疗有反应但后来复发的个体。这类个体包括但不限于：免疫系统健康、完整，但处于感染HIV风险中的未感染个体(″风险″个体)。风险个体包括但不限于：比普通人群感染HIV的可能性高的个体。处于发生HIV感染风险中的个体包括但不限于：由于与HIV感染个体发生性行为而处于发生HIV感染风险中的个体；静脉内药物使用者；可能接触过HIV感染的血液、血液制品或其它HIV污染体液的个体；和由HIV感染母亲抚养的婴儿。适合治疗的个体包括感染HIV-1、HIV-2或其任何变体、或处于此种感染风险中的个体。

治疗HTLV感染

可使用上述方法治疗个体的人T细胞白血病病毒(HTLV)感染，如HTLV-I或HTLV-II感染。因此，主题方法也适合治疗感染HTLV的个体；尚未感染HTLV，但处于HTLV感染风险中的个体；和尚未感染HTLV，但将来可能感染HTLV的个体。

癌症治疗

在某些实施方式中，主题方法适于对诊断患有LINE表达相关癌症的个体进行治疗，其中此类癌症包括但不限于：乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、畸胎瘤、精原细胞瘤、前列腺癌和睾丸癌(包括畸胎瘤、精原细胞瘤和胚胎癌或这些类型的一种或多种组成的混合肿瘤)。主题方法适合治疗诊断患有乳腺癌的个体；诊断患有卵巢癌的个体；和诊断患有睾丸癌的个体。治疗癌症的主题方法也适合治疗曾治疗过乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌或睾丸癌，且对治疗无反应或最初有反应但后来复发的个体。

治疗自身免疫病

在某些实施方式中，主题方法适合治疗诊断患有自身免疫病的个体，其中这类自身免疫病包括但不限于：多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和1型糖尿病。在某些实施方式中，所述方法适合治疗曾治疗自身免疫病，且对治疗无反应或最初有反应但后来复发的个体。

实施例

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不应限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有和仅有的实验。努力保证所用数值(如含量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可采用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；mAb，单克隆抗体等。

实施例1：LINE肽刺激人外周血单核细胞(PBMC)产生细胞因子。

方法

患者.选择HIV-1阳性志愿者进行本研究。本研究经本地伦理委员会批准，对象均签署过知情同意书。在来自不同患者时间点的冷藏外周血单核细胞(PBMC)上进行研究。

肽的选择。以两种方式选择候选LINE表位：(1)基于HIV-1中肽序列的相似性，(2)基于对LINE开放阅读框(ORF)ORF 1和LINE ORF 2编码的蛋白的免疫原性的计算机预测。

使用BLAST(Altschul等，Nucleic Acids Res.1997 25(17)：3389-402)相对HIV蛋白搜索LINE氨基酸序列以鉴定与HIV-1肽相似的LINE-1肽，该算法使用短近精确匹配(e-值＝200000，PAM30矩阵，SEG过滤关闭，字长＝2)参数。这些参数适合搜索高度相似序列的短区域。这些参数将搜索字长从3减少到2、消除了SEG过滤、将期望值从10升高至20,000或更高，并且包括使用低严谨相似性矩阵的选项(PAM30相对BLOSUM62)。LINE序列数据获自NCBI数据库和L1base数据库(Penzkofer等，Nucleic Acids Res.2004 33：D498-D500)，并汇编为BLAST数据库格式文件用于搜索。还将HIV HXB-2参考株序列汇编为独立的BLAST数据库格式文件用于搜索。用于BLAST算法的短近精确匹配参数利于探测肽序列间的短匹配，通常被蛋白质分歧所淹没。蛋白质间的整体序列保守性作为CD8⁺T-细胞对内源性病毒和HIV的应答之间存在相互作用的原因相对不重要；并且，此类相互作用取决于表位大小区域内氨基酸序列的高水平的相似性或相同性。选择与已知HIV表位具有相似性的候选LINE肽进行肽合成并用于后续测试。此外，还选择与已知表位之外的HIV蛋白质相似的LINE区域进行深入研究。

基于对LINE-1 ORF 1和LINE-1 ORF 2编码蛋白质的免疫原性的计算机预测鉴定LINE-1的候选表位肽。使用表位预测软件(NETCTL^TM)分析LINE-1 ORF 1和ORF 2的序列，该软件鉴定蛋白酶体切割位点，所得的最有潜力与抗原加工机器相关转运子(TAP)结合的降解产物子集，以及这些降解产物内与不同人白细胞抗原(HLA)分子具有最佳结合亲和力的肽(Larsen等，European Journal of Immunology.35(8)：2295-303.2005)。图12所示表中显示根据该方法鉴定的LINE-1肽。

ELISPOT实验根据Meiklejohn等，J.Immunol.Methods(2004)288，135-47所述进行酶联免疫斑点(ELISPOT)实验分析。37℃孵育平板16小时。使用相等抗原浓度进行HIV和LINE肽反应的比较。每种条件进行两复孔的实验，除了由存档样品回收细胞时采用单孔进行实验。用AID ELISPOT阅读器(细胞技术公司(Cell Technology))进行平板计数。对两复孔的斑点总量求平均，将所有斑点数量标准化至每1x10⁶ PBMC的IFN-Γ斑点形成单位(SFU)数量。减去培养基对照孔的斑点值，以确定对各肽的应答。减去培养基值后，所得任何＜0的肽值被设定为0，以便进行进一步的分析。

结果

图10中的表格显示了使用BLAST(Altschul等，Nucleic Acids Res.199725(17)：3389-402)相对HIV-1蛋白质搜索LINE氨基酸序列所鉴定的候选LINE多肽。

图11的表格提供了LINE主题多肽和用BLAST相对HIV-1蛋白搜索LINE氨基酸序列所得的HIV蛋白序列之间的示例性序列比对。竖线代表氨基酸序列匹配，“*”代表非匹配氨基酸。提供了“主题”HIV-1序列的NCBI数据库登录号。图12中表格所示使用计算机表位预测鉴定的LINE-1肽。

HIV感染细胞中LINE-1转录物水平升高

通过比较HIV-1感染和模拟物感染对照中转录物表达水平监测HIV-1感染在体外影响LINE-1转录物水平的能力。用定量RT-PCR(qRT-PCR)平行测量细胞DNA以检测LINE-1基因组拷贝数的增加。用抗-CD3/抗-CD28活化原代CD4+T细胞，并用HIV-1-81A的R5-热带株进行感染。感染后144小时，观察到相对于模拟物感染对照，LINE-1转录物的水平显著升高。在HIV-1-81A感染培养物144小时后观察到β-肌动蛋白标准化的LINE-1DNA定量测量水平升高。用Trizol分离所有的RNA样品，并在逆转录前用DNA酶处理。HIV-1-81A和模拟物感染对照间的台盼蓝染料排斥相似。

检测分离自HIV-1感染对象的PBMC中对LINE-1多肽的特异性免疫应答

图13的表格提供了分离的LINE多肽LiD9R、LiE13E、LiK10I、Lil9C、Lim12T、LiN13V和LiQ9E的ELISPOT实验结果，分别对应SEQ ID NO：1-7。研究编号2-34代表非感染对照，研究编号429-841代表HIV感染个体。“LINE”列代表对由LiE13E、LiK10I、Lil9C、Lim12T、LiN13V和LiQ9E组成的LINE多肽库的应答。Gag和Nef列代表对Gag和NefHIV蛋白质(来自每一蛋白质的库)的应答。PHA和SEB列代表对阳性对照的应答。结果用每1x10⁶ PBMC的斑点形成单位(SFU)表示。低于50的值认为是背景，高于50则认为是阳性反应。“NT”表示在特定测试日期的所示条件下未对特定病人样品进行测试。ELISPOT实验的结果表明可用来自HIV-感染对象的PBMC检测因LINE多肽抗原性刺激而产生的细胞因子。

图14的表格提供了分离的LINE多肽LiD9R、LiE13E、LiK10I、Lil9C、LiIV9、LiKI9、LiRV9和LiTV9的ELISPOT实验结果，分别对应SEQ ID NO：8-11。研究编号30-42代表非感染对照，研究编号562-653代表HIV感染个体。Gag和Nef列代表对HIV蛋白Gag和Nef(来自每一蛋白质的库)的应答。SEB列代表对阳性对照的应答。结果用每1x10⁶ PBMC的斑点形成单位(SFU)表示。低于50的值认为是背景，高于50则认为是阳性反应。“NT”表示在特定测试日期的所示条件下未对特定病人样品进行测试。ELISPOT实验的结果表明可用来自HIV-感染对象的PBMC检测因LINE多肽抗原性刺激而产生的细胞因子。

数据证明，针对与HIV-1感染有关的LINE肽的LINE转录物表达和T细胞应答升高。在HIV-1感染个体中天然产生的对LINE的T细胞应答表明在感染早期，或处于风险中的未感染个体中诱导应答，以形成新型HIV-1疫苗范例的可行性。HIV-1疫苗开发中的最大困难之一是克服该病毒的突变，这种突变使得病毒可以逃避疫苗引发的特异性免疫应答。LINE是基因组编码元件；预计由LINE插入物的转录失调产生的翻译产物比HIV-1蛋白质的变异性低得多。如果LINE抗原的产生和呈递是细胞HIV-1感染的结果，那么LINE产物可用作可稳定识别的替代标记物，将HIV-1感染的信号传导给免疫系统。通过疫苗接种训导免疫系统识别LINE替代标记物可诱导对HIV-1-感染细胞的杀伤作用后，则不需要识别变异性高的HIV-1抗原。

实施例2：HIV-感染细胞的L1-特异性CD8⁺T细胞识别

方法

对象对象选自加拿大免疫缺陷研究协作(Canadian ImmunodeficiencyResearch Collaborative)(CIRC)组以及加州大学旧金山分校(UCSF)的SCOPE组。慢性进展者指HIV-1感染时间＞1年的CD4⁺T细胞计数降低＞50个细胞/毫米³/年的个体。病毒对照者指HIV-1感染时间＞1年，没有证据表明CD4⁺T细胞计数降低，且病毒载量＜5,000拷贝/毫升bDNA的个体。该研究经多伦多大学审查委员会和UCSF人体研究委员会批准，并且对象均签署知情同意书。用冻存PBMC在融化后立即进行本研究。

L1-p150蛋白质表达的免疫沉淀/Western印迹分析PBMC获自HIV-1-未感染的捐献者。用Easysep(干细胞技术公司)(Stemcell Technologies)分离CD4⁺T细胞，并在含有10％FBS、谷胺酰胺、青霉素/链霉素和50U/ml IL-2(霍夫曼罗氏公司)(Hofmann-La Roche)的RPMI培养基中用CD3和CD8的单克隆抗体(mAb)(电子生物技术公司)(ebiosciences)刺激48小时。将这些细胞等分成两份，其中一份用0.05MOI的HIV-1-NL4-3感染，另一分用模拟物感染对照进行维持。在感染后所示时间点(48和170小时)，用含有完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司)(Roche)的放射性免疫沉淀实验(RIPA)缓冲液裂解10⁶个细胞。使用Seize蛋白质G免疫沉淀试剂盒(皮尔斯生物技术公司)(Pierce Biotechnology)，根据生产商指导进行免疫沉淀。使用40μg山羊多克隆抗-L1-p150 S19(圣克鲁兹生物技术公司)(Santa CruzBiotechnologies)从5mg全细胞裂解物蛋白质中免疫沉淀蛋白质。使用YM-5050kDa分子量截留microcon(密理博公司)(Millipore)将每一洗脱液浓缩至50μl，分成三等份，使用NuPage系统(英骏公司)(Invitrogen)根据生产商方案在三块独立的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上进行分离。在100V作用1小时的条件下将蛋白质转移至聚(偏二氟乙烯)(PVDF)膜上。按照标准步骤进行Western印迹，用抗-L1-p150 S19和C16抗体(圣克鲁兹生物技术公司)(Santa Cruz Biotechnologies)以1∶200稀释后探测，然后用1∶10,000稀释的驴抗-山羊IgG-马辣根过氧化物酶(HRP)(杰克逊免疫研究公司)(Jackson Immunoresearch)探测；用1∶10,000稀释的抗-HIV-1-p24抗血清(NIH AIDS试验项目目录号#4250)(NIH AIDS ReagentProgram cat#4250)后随1∶10,000稀释的山羊抗-兔IgG-HRP(杰克逊免疫研究公司)(Jackson Immunoresearch)进行探测。

表位选择和肽合成。将Brouha等((2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：5280)展示的“热”L1元件的共有核酸序列进行翻译，以产生L1ORF1和ORF2氨基酸序列。将这些序列上传进入NetCTL算法(互联网cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)以预测A2和B7超家族表位。将这些超家族各自的最高评分预测表位与选择对于两者均为高分的肽的目标相互参照，因此具有广泛反应性的潜能。通过标准9H-芴-9-基-甲氧基羰基(FMoc)化学方法合成肽。参见如《Fmoc固相肽合成：实践方法》(Solid Phase PeptideSynthesis：A Practical Approach)W.C.Chan和P.D.White编(2000)牛津大学出版社。

ELISP0T.使用标准步骤(参考文献)进行ELISPOT实验。以10⁵PBMC/孔铺板。使用代表L1表位的单个肽10μg/ml，CMV pp65库5微克/毫升/肽以及HIV-1大库1微克/毫升/肽。在37℃，5％CO_2.条件下孵育16小时。

CD8⁺T细胞克隆。本研究使用两种不同的克隆方法。一种标准方法，其中抗原特异性细胞通过体外扩增进行富集；一种磁性细胞分离(MACS)方法，其中用磁性捕获富集抗原特异性细胞。

简单说，在离体PBMC的环境中用肽刺激CD8⁺T细胞16小时。使用细胞因子捕获试剂对因该刺激而产生细胞因子(如IFN-γ)的CD8⁺T细胞进行标记，从而可以使用磁珠进行特异性标记(IFN-γ-分泌实验，美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))。通过磁性分离从混合群体中富集这些抗原-特异性CD8⁺T细胞，连续稀释铺板，使用辐照的自体PBMC和产生CD3(克隆OKT3)和CD28(克隆CD28.7)mAb的B细胞淋巴瘤细胞株(均来自电子生物科学公司(ebioscience))进行扩增。

富集后的细胞进行连续稀释，铺板于辐照的饲细胞上。对有限稀释的抗原-特异性克隆进行第二轮的有限稀释，而后进行扩增并维持于含50U/mlIL-2(豪夫曼罗氏公司)(Hoffman La-Roche)的RPMI 10％胎牛血清(FBS)中，并每两周加入辐照的饲细胞。使用MACS方法获得“L1-3O”克隆。

HIV-1感染。用Fugene6(罗氏)转染HEK293T细胞并在4天后收集上清制备HIV-1的NL4-3和81A储存物。使用来自NIH AIDS试验项目的代表不同HIV-1进化支的原代分离物。通过标准方法制备活化的原代CD4⁺T细胞。在所有的实验中，除了p24抑制实验和免疫沉淀/western印迹，我们使用之前描述的磁性转染(Sacha，J.Immunol，2007；178：2746-2754)以获得高水平的感染。对于p24抑制实验，加入0.02感染复数(MOI)的HIV-1 1小时后洗脱，感染在37℃，5％CO₂的条件下进行。

识别实验。如前述(Sacha，J.Immunol，2007；178：2746-2754)进行CD8⁺T细胞克隆和细胞系对HIV-1-感染细胞的识别。简单说，再次刺激约2周后，用磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗CD8⁺T细胞效应细胞株和克隆，与HIV-1和模拟物感染CD4⁺T细胞靶标以1∶1的比例混合(每种至少2x10⁴)。对于动力学实验，在感染后所述时间点加入感染的细胞。效应细胞和靶细胞在37℃，5％CO₂的条件下共同培养1小时。在表明CD107a作为检验结果(readout)的实验(实验TO2)中，在此阶段(共培养前1小时)加入5μg/ml PE-偶联的抗-CD107a mAb(BD)。加入Brefeldin A至终浓度为10μg/ml，然后再孵育5小时。然后用CD4和CD8的mAb对细胞表面进行染色，用cytofix/cytoperm(BD公司)(Becton Dickinson；BD)通透细胞，然后使用mAB(BD)对干扰素-γ(IFN-γ)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行染色。在LSRII或FACSCalibur仪器上(均来自BD)进行流式细胞术。

消除实验。通过磁性转染(见上)用HIV-1同步感染靶细胞自体或HLA-错配的CD4⁺T细胞。感染后2小时，将靶细胞与冲洗的CD8⁺T细胞效应细胞株和克隆1∶1混合(最近一次再刺激的至少3周后)。将靶细胞和效应细胞在37℃，5％CO₂的条件下共培养48小时。用荧光团偶联的CD4和CD8的mAb(BD)和胺红活力染料(英骏公司)对细胞进行表面染色。用cytofix/cytoperm(BD)通透后，用荧光素异硫氰酸酯(FITC)-偶联的HIV-1-Gag单克隆抗体(克隆Kc57，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))对细胞进行染色。用LSRII流式细胞仪进行分析(BD)。

抑制p24产生。用HIV-1 NL4-3(参见上文HIV-1感染)感染靶细胞自体和人白细胞抗原(HLA)错配CD4⁺T细胞，以2x10⁴细胞/孔的密度铺板于96孔圆底板中。取最后再刺激3周后的CD8⁺T细胞效应细胞，PBS冲洗2遍，以所需比例加入孔中。在总体积200μl含50U/ml IL-2的RPMI-10％FBS中孵育效应细胞/靶细胞混合物。感染后9天移除100μl培养液，并按照生产商指示进行p24酶联免疫吸附实验(ELISA)(NCI福莱德里克)(NCIFrederick)。用NCI福莱德里克(NCI Frederick)提供的p24标准品得到的标准曲线计算p24的浓度。

HLA-A，B，C阻断。抗-HLA-A，B，C小鼠单克隆IgG1抗体(克隆G46-2.6)和小鼠IgG1对照抗体获自BD生物科学公司。如上所述制备靶细胞和效应细胞群。在靶细胞和效应细胞共孵育前，将感染的靶细胞在10μg/ml的抗-HLA-A，B，C或同种型对照中于37℃，5％CO₂的条件下孵育30分钟。然后将效应细胞和靶细胞共培养，并如上所述进行识别评价。

结果

在HIV-1感染的原代CD4⁺T细胞中可检测到L1 p150，但在未感染的细胞中检测不倒。

从来自未感染HIV-1的个体的PBMC中富集CD4⁺T细胞，并用CD3和CD28的单克隆抗体(mAb)刺激48小时。然后按照标准感染方案用0.05MOI的HIV-1-NL4-3感染这些细胞或将其维持作为模拟物感染对照(参见方法)。在感染后的48小时和170小时时间点用含有完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏)的RIPA缓冲液裂解细胞。用SDS-PAGE分离来自全细胞裂解物的蛋白质，使用来自圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)的S19和C16抗-L1-ORF2多克隆抗体(pAb)进行western印迹分析。这些研究在期望分子量150kDa处未检测到任何条带。为了增加实验的灵敏度，我们在western印迹分析前进行免疫沉淀的步骤。使用seize经典(G)免疫沉淀试剂盒(皮尔斯公司)(Pierce)和抗-L1-p150 S19抗体(圣克鲁兹生物技术公司)(Santa Cruz Biotechnology)对来自上述细胞裂解物样品的5mg蛋白质进行免疫沉淀。保留下的组分通过SDS-PAGE分离并使用S19抗体或抗-L1-p150 C16抗体(圣克鲁兹生物技术公司)(Santa Cruz Biotechnology)在western印迹中进行检测。

使用S19或C16 western印迹探测HIV-1-NL4-3感染后170小时的样品在期望L1-p150分子量150kDa处观察到条带(图1A，B)。在模拟物感染样品和HIV-1感染后48小时的样品中均未发现该条带。用抗-HIV-1-Gag探测L1-p150-S19免疫沉淀组分时未观察到条带。这些数据显示体外HIV-1-感染原代CD4⁺T细胞导致L1-p150表达。事实上免疫沉淀后仅检测到微弱的条代，western印迹表明在HIV-1感染细胞中仅有低水平的L1-p150表达。这与最近关于高水平L1-p150的表达具有毒性的研究相一致(Wallace，Gene.2008；418(1-2)：75-81)。然而低水平的L1-p150表达足以刺激细胞免疫应答。

图1A和1B.HIV-1-感染原代CD4⁺T细胞中表达L1-p150。用抗-CD3/CD28刺激48小时活化来自HIV-1未感染个体的原代CD4⁺T细胞。然后将细胞等分两份，用0.05MOI的HIV-1-NL4-3感染细胞或维持作为模拟物感染对照。在感染后(或模拟物感染后)48和170小时取出等份，并用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。用多克隆抗-L1-p150抗体S 19(圣克鲁兹生物技术公司)免疫沉淀裂解物。将来自这些免疫沉淀的洗脱物浓缩，用SDS-PAGE分离并用抗-L1-p150抗体S19或抗-L1-p150抗体C16(圣克鲁兹生物技术公司)在western印迹中探测。图1A.用S19抗体免疫沉淀样品的western印迹，用C16抗体探测。图1B.用S19抗体免疫沉淀并探测的样品的western印迹。每一印迹的第1泳道样品为PageRuler蛋白质梯度(富酶泰斯公司)(Fermentas)，第2泳道样品为大肠杆菌(E.coli)表达的L1-p150的核酸内切酶结构域(p150检测的阳性对照，但因为仅仅是L1-ORF2p的片段所以跑出较小分子量)。55kDa和25kDa的黑色条带代表免疫沉淀中所用抗体的重链和轻链。因为S19和C16均来源于山羊，因此第二抗体与探测和免疫沉淀中所用的抗体均产生反应。因为阳性对照L1-核酸内切酶结构域未免疫沉淀，因此该泳道中没有这些条带。

来自HIV-1感染个体的PBMC中检测到对L1的细胞免疫应答。

使用NetCTL算法分析共有“热”L1 p40和p150序列，以预测潜在的HLA A02、B07和B58限制性T细胞表位。制造对应7p40和10p150表位的肽，通过ELISPOT测试它们刺激来自60名临床特征不同的HIV-1感染者(SCOPE组，参见图13表格中的肽序列，以及图16表格中的对象特征)以及27名低风险HIV-1未感染个体的PBMC产生IFN-γ的能力。在HIV-1感染个体中观察到对于p40和p150来源表位的频繁IFN-γ反应，但在HIV-1未感染个体中则没有这种反应(图2)。

图2.HIV-1感染个体而非未感染个体外周血中对L1的免疫应答。用IFN-γELISPOT实验检测10⁵个细胞/孔来自60名HIV-1感染个体和27名HIV-1未感染个体的冻存PBMC对合成L1p40(ORF1p)和p 150(ORF2p)肽的反应性。ORF1p肽以前缀“L1O1”表示，ORF2p以“L1O2”表示。图15的表中显示了肽序列和特征。图16和17中的表格显示了HIV-1-感染对象的信息。

L1 p150-特异性CD8⁺T细胞克隆以HLA-限制性方式特异性识别HIV-1-感染细胞。

从一名维持病毒载量不可探测＞10年且没有HAART的HIV-1感染个体中获取6个L1-p150表位“KVIYRFNAI”(KI9；SEQ ID NO：10)特异性CD8⁺T细胞克隆，2个CMV-pp65-特异性CD8⁺T细胞克隆。使用基于之前报道的识别实验的胞内细胞因子染色测试这些克隆特异性应答自体HIV-1感染细胞的能力(Sacha，J.Immunol，2007；178：2746-2754)。简单说，从自体PBMC中富集CD4⁺T细胞，用HIV-1-NL4-3感染或维持作为模拟物感染对照。将克隆与模拟物感染、HIV-1-NL4-3感染的靶细胞和关联肽脉冲的模拟物感染靶细胞共孵育6小时，并且用流式细胞术评价CD107a染色水平和克隆产生的IFN-γ。图3A概述了这些数据。

观察到所有L1-p150-KI9和CMV-pp65-特异性克隆均能识别肽-脉冲处理的模拟物感染靶细胞。6个L1-p150-KI9-特异性CD8⁺T细胞克隆中的每个均能强烈识别HIV-1-感染靶细胞。与之形成对照的是CMV-pp65-特异性CD8⁺T细胞克隆不能识别HIV-1感染靶细胞。图3B-E显示L1-p150-KI9-特异性CD8⁺T细胞克隆“L1-3O”的详细数据。KI9表位与HIV-1-NL4-3内的任何序列不具有高度相同性(clustalw比对中与NL4-3序列NCBI登录号M19921具有最高1/9氨基酸相同性)。

意料之外的是L1-p150-KI9-特异性CD8⁺T细胞克隆可直接交叉识别HIV-1-衍生的肽。然而，利用IFN-γELISPOT通过测试L1-3O-KI9克隆是否对横跨所有HIV-1共有序列基因产物的重叠15聚体库“HIV-1-大库”产生反应可直接检验这种可能性。该克隆无法识别HIV-1-大库，而能强烈识别其关联的L1-p150肽。平行测试获自相同个体的HIV-1-Gag-特异性克隆识别HIV-1-Gag库和HIV-1-大库的能力，并观察到对两个库的相似程度的反应(图3B)。接下来测试克隆L1-30对自体的和HLA-错配的HIV-1-NL4-3感染和模拟物感染靶细胞的识别。观察到对自体HIV-1感染靶细胞的强烈识别，表现为高水平的CD107a染色和IFN-γ的产生(89.2％CD107a⁺IFN-γ⁺)(图3C)。与之相对的是与模拟物感染自体靶细胞(23.8％CD107a⁺IFN-γ⁺)共培养或与模拟物或HIV-1感染的HLA-错配的靶细胞共培养(分别为14.1％和11.2％CD107a⁺IFN-γ⁺)产生CD107a⁺或IFN-γ⁺克隆细胞的频率低。该实验再重复4次得到相似的结果。总之，这些数据支持L1-p150-特异性T细胞以HLA-1限制性方式识别HIV-1-感染细胞而不直接识别HIV-1-肽。

为了确定识别自体细胞是否取决于HIV-1的剂量，将克隆L1-3O效应细胞与等量的自体CD4⁺T细胞靶点和模拟物感染对照混合，所述靶细胞用4-倍梯度稀释的MOI范围从1.6x10^-4-2.0x10^-2的HIV-1-NL4-3进行感染。如上所述用CD107a mAb进行共孵育，流式细胞术测定CD107a染色作为克隆反应性的指标。随着HIV-1滴度的升高，CD107a染色以剂量依赖的方式增加，范围从模拟物感染的0.56％CD107a⁺至MOI 2x10^-2感染的16.7％CD107a⁺(图3D)。测定L1-特异性克隆识别HIV-1感染细胞的动力学(图3E)。使用高滴度的HIV-1和前述的磁性转染方案来同步化HIV-1感染靶细胞(Sacha，J.Immunol，2007；178：2746-2754)(参见方法)。在感染后的不同时间点将L1-特异性CD8⁺T细胞克隆与感染靶细胞混合1小时，然后用布雷菲德菌素A(BFA)处理并再孵育5小时。图3E中的时间表示靶细胞和克隆首次混合后的感染后小时数。加入BFA阻止了新产生的肽：MHC复合物运输到细胞表面，因此将培养过程中T细胞上递呈的表位限制于加入BFA时存在的那些表位。如之前的实验，将CD107a和细胞因子染色作为克隆刺激的实验结果。图3E的数据展现克隆细胞上的TNF-α染色-在比较动力学中，使用CD107a或IFN-γ作为实验结果。同样在HIV-1感染后2小时内观察到L1-特异性CD8⁺T细胞克隆对靶细胞的识别，12小时的反应峰值为82.4％TNF-α⁺。

图3A-E.L1-特异性CD8⁺T细胞在感染2小时内特异性识别HIV-1感染细胞。A.使用有限稀释方法从长期非进展(elite controller)HIV-1感染个体中获取6个L1-特异性CD8⁺T细胞克隆和2个CMV-特异性CD8⁺T细胞克隆。将这些克隆与自体CD4⁺T细胞靶点共同培养：用HIV-1-NL4-3感染的，维持为模拟物感染对照的或者用关联肽脉冲处理的。使用CD4、CD8、CD107a和IFN-γ通过胞内细胞因子染色流式细胞术评价靶细胞识别。显示为减去对模拟物感染细胞的背景反应后产生IFN-γ的克隆细胞％(CD8⁺门选)。B.利用IFN-γELISPOT确认克隆对关联肽的反应性，以及对HIV-1大库(包含横跨所有HIV-1基因产物的15聚体肽)的交叉反应性。显示来自L1-ORF-2-KVIYRFNAI(SEQ ID NO：10)表位特异性克隆“L1-3O”的结果，一式三份进行实验。如图所示平行测试HIV-1-Gag-特异性CD8⁺T细胞克隆对Gag汇集肽和HIV-1大库的反应性。两个克隆均使用金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为阳性对照。C.显示L1-p150-KVIYRFNAI(SEQ ID NO：10)-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-KI9-3O的代表性识别实验数据。D.测试L1-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-KI9-3O对于自体CD4⁺T细胞靶点的识别，其中用0-0.02MOI的连续稀释的HIV-1-NL4-3感染靶细胞。用流式细胞术评价识别，在刺激期开始时加入mAb，对脱颗粒标记物CD107a进行染色。E.在HIV-1-NL4-3感染后0、2、6、12和24小时测试克隆L1-KI9-3O对自体CD4⁺T细胞靶点的识别。用磁性转染使HIV-1感染靶细胞的过程同步化(参见方法)。在所述时间点加入布雷菲德菌素A中止肽的MHC-I递呈，并继续刺激5小时。

L1p150-特异性CD8⁺T细胞克隆特异性消除HIV-1感染细胞并抑制病毒复制。

测定L1-特异性CD8⁺T细胞克隆对HIV-1感染细胞的识别是否可以消除HIV-1感染细胞。通过磁性转染使用HIV-1 81A的NL4-3/Ba-L嵌合克隆(81A与NL4-3同类，除了env的V1-V3区来源于Ba-L并且赋予CCR5向性)同步感染靶细胞自体或HLA-错配CD4⁺T细胞。感染后2小时，用PBMC充分冲洗克隆细胞后将靶细胞与L1-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-3O 1∶1混合，或不加入效应细胞平行维持。将靶细胞和效应细胞共培养48小时。对细胞CD4和CD8进行表面染色，并且用PE-偶联的mAb克隆Kc57(贝克曼库尔特公司)(Beckman Coulter)对HIV-1-Gag进行胞内染色。流式细胞术分析显示在没有L1-3O-KI9存在的条件下培养的自体和HLA-错配靶细胞发生强烈感染(分别是24.5％和31.5％)。在与L1-3O-KI9共培养的自体细胞中观察到Gag⁺靶细胞的频率显著降低，在HLA-错配对照中Gag⁺靶细胞的频率仅有轻微降低(独立的自体消除实验中分别降低93.1％和92.7％，独立的HLA-错配消除实验中分别降低30.5％和31.1％)(图4A)。因此，L1-p150-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-3O-KI9在体外特异性消除HIV-1-感染的原代CD4⁺T细胞。

因为L1-3O-KI9可在感染后迅速识别HIV-1-感染细胞(2小时内)并能够消除HIV-1-感染的细胞，我们推测该克隆可在体外以剂量依赖的方式抑制HIV-1-复制。根据标准感染实验方案(并非磁性转染，参见实验方案)，用0.02MOI HIV-1NL4-3感染自体和HLA错配的CD4⁺T细胞。以2x10⁴细胞/孔的密度在96孔板中种植这些靶细胞。最后一次再刺激后三周取得CD8⁺T细胞，用PBS冲洗，加入以5倍梯度稀释物，效应细胞∶靶细胞的范围为1∶1-1∶3125。每一效应细胞∶靶细胞比例以一式三分进行测试，对于仅有靶细胞和仅有效应细胞的对照也进行同样操作。用自体和HLA-错配的靶细胞测试来自相同个体的L1-3O-KI9L1-p150-特异性CD8⁺T细胞克隆和CMV-特异性CD8⁺T细胞克隆。在感染后第9天，用p24ELISA测试上清，作为HIV-1颗粒产生的实验结果(NCI福莱德里克)(NIC Frederick)。L1-3O-KI9克隆高效抑制自体靶细胞产生p24，在效应细胞∶靶细胞为1∶4时观察到最大抑制(图4B)。因此，L1-p150-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-3O-KI9高效抑制HIV-1-病毒颗粒的产生。

图4A和4B.L1-特异性CD8⁺T细胞克隆消除HIV-1-感染细胞并抑制病毒的产生。A.通过磁性转染用HIV-1-NL4-3同步感染CD4⁺T细胞靶点。以1∶1的比例加入L1-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-3O-KI9以感染自体和HLA-错配靶细胞。平行维持不加入CD8⁺T细胞的对照感染培养物。感染进行18小时时用CD4的mAb对细胞进行表面染色，用HIV-1-Gag的mAb(Ki67，贝克曼库尔特公司)(Beckman Coulter)进行胞内染色。显示HIV-1-Gag(x-轴)和CD4(y-轴)的流式细胞术图。以一式两份显示克隆抑制。B.用0.02MOI的HIV-1-NL4-3感染CD4⁺T细胞靶点并以15,000细胞/孔在96孔板中种植。将效应细胞CD8⁺T细胞克隆(L1-3O)以给定比例加入，并感染9天。这时，与已知p24浓度标准品一起三复孔检测上清中的HIV-1-p24水平。显示基于标准曲线计算的p24的浓度。误差线代表标准差。

L1-特异性CD8⁺T细胞完全识别HIV-1和HIV-2的不同分离物感染的细胞。

既然L1-特异性T细胞识别HIV-1-感染细胞表面的稳定基因组编码的L1抗原，那么对于这些细胞的识别应该与HIV-1-序列变异性无关。从NIHAIDS试验项目获取42个不同HIV-1病毒组成的板块，包括5个实验室适应性分离物和37个原代分离物。通过进化支对这些原代分离病毒进行分类：进化支B-9种分离物，进化支C-10种分离物，进化支D-4种分离物，进化支A-8种分离物，进化支E-1种分离物，进化支G-1种分离物，CRF01_AE-2种分离物，CRF02_AG-2种分离物。根据向性，这个板块包括4株CXCR4-向性病毒，27株CCR5-向性病毒，2株双向性病毒，和4株未知向性病毒。图18的表格显示了这些分离物的详细内容，包括NCBI登录号。除了这个HIV-1差异板块，从NIH AIDS试验项目获取HIV-2分离物“60145K”。

图18表格中的实验代码如下：TO1：首次不同分离物识别实验(在加拿大多伦多进行)；SFI：不同分离物识别实验(在加州旧金山进行)；TO2：不同分离物识别实验(在加拿大多伦多进行)。

使用上述流式细胞术测试L1-p150-特异性克隆L1-3O-KI9对于自体和HLA错配原代CD4⁺T细胞的识别。分别在3次实验中对板块进行测试：“TO1”、“SF1”和“TO2”。图18的表格中显示了这些实验的日期和受试病毒。图5显示TO1的数据，图6显示SF1的数据，图7显示TO2的数据。在每一实验中，均使用模拟物感染对照测定克隆L1-3O对未感染自体CD4⁺T细胞的背景反应。每一实验中还包括另外的不同对照的集合，使用不同的反应性实验结果。在TO1(图5)中，使用CD107a染色(脱粒)和TNF-α产量作为识别的实验结果。

观察到每一受试HIV-1分离物转染的自体靶细胞的识别，以及HIV-2感染自体靶细胞的识别。用HIV-1-1 165MB和HIV-1-IIIB感染HLA-错配的CD4⁺T细胞，并测试L1-3O克隆对于这些靶细胞的识别，这能表明不依赖MHC-I的识别。未观察到这些对照的识别。平行测试克隆L1-3O识别自体或HLA-错配CD4⁺细胞靶点所递呈的关联肽“KI9”的能力。仅仅观察到肽脉冲处理的自体靶细胞的识别。本实验所示用的另一对照是，测试来自与L1-3O相同个体的CMV-pp65-特异性CD8⁺T细胞克隆对HIV-1-感染自体靶细胞的识别。观察到缺少CMV-pp65-特异性克隆的识别，进一步支持L1-p150-特异性克隆L1-3O识别HIV-1感染细胞的特异属性(图5)。

图5A-E.使用不同HIV-1板块和HIV-2的L1-特异性T细胞克隆识别实验。图3详述的识别实验在克隆L1-3O上使用不同HIV-1分离物板块和HIV-2 60145K感染的原代CD4⁺T细胞进行重复(参见图18表格中病毒详情)。显示对CD8⁺细胞(克隆)门选的流式细胞术数据对作为脱粒标记物的CD107a和TNF-α作图的图像。图5A和5B显示了该克隆对给定病毒感染的自体细胞的反应(模拟物(mock)＝未感染的，模拟物+KI9肽＝用10μg/ml合成KI9肽脉冲处理的未感染细胞)。用这些病毒的子集感染HLA-错配CD4⁺T细胞靶点，并作为对照测试。图5C中所示结果表明克隆L1-3O识别自体而非HLA-错配感染的靶细胞。对于获自与L1-p150-特异性克隆L1-3O相同个体的CMV-pp65-特异性CD8⁺T细胞克隆也进行自体感染靶细胞识别测试，并显示没有识别(图5D和E)。

在实验中(图6A-D)使用SF1CD107a染色(脱粒)和IFN-γ产生作为识别的实验结果。用7种受试病毒中的每一种感染自体和HLA-错配CD4⁺细胞靶点。在自体和HLA-错配靶细胞所观察到的对于每一受试病毒的感染强度相似(图6A，B)。测试克隆L1-3O对于这些靶点中每一个的识别。观察到对于感染这些病毒中每一种的自体CD4⁺细胞靶点的识别，与之相比，不识别HLA-错配的靶点感染细胞。

图6.L1-特异性T细胞克隆不同HIV-1板块识别实验“SF1”。进一步测试L1-p150-特异性CD8⁺T细胞克隆对于其它不同HIV-1分离物的识别。实验设定与图5中的类似，图18中表格显示病毒详情。如A、B所示，流式细胞术数据显示HIV-1-Gag染色和CD4染色，以评价A.自体，和B.HLA-错配CD4⁺T细胞靶点中的HIV-1感染水平。C，D.流式细胞术数据，CD8⁺T细胞(克隆)门选，显示IFN-γ染色和CD107a染色，以评价克隆细胞对于C.自体和D.HLA-错配靶细胞的反应性(“模拟物”(mock)＝未感染细胞，BCL+KI9肽＝用10μg/ml KI9肽脉冲的自体B细胞系)。

在TO2实验中，CD107a染色(脱粒)和IFN-γ产量用作识别的实验结果，并测试克隆L1-3O对其它17种HIV-1-分离物感染的自体CD4⁺靶细胞的识别(图7)。用低于SF1水平的HIV-1感染靶细胞，得到的识别水平较低。观察到不同分离物感染的靶细胞的识别水平有一些变化(1.49％-8.21％CD107a⁺)。测试克隆显示的反应水平是否与CD4⁺T细胞靶点群内的感染水平相关。用抗-HIV-1-Gag(Kc57-RD1，BD生物科学公司(BD Biosciences))通过流式细胞术测定感染靶细胞的％，并对于％CD107a⁺克隆细胞作图。

图7.L1-特异性T细胞克隆不同HIV-1板块识别实验“TO2”。进一步测试L1-p150-特异性CD8⁺T细胞克隆对于其它不同HIV-1分离物的识别。实验设定与图5.6中的类似，图18中表格显示病毒详情。

这两个参数间观察到强相关性(R＝0.5766，p＝0.0078，图8)，表明这些不同病毒储备物的不同HIV-1感染水平是克隆对靶细胞反应性不同的主要原因。此外，观察到每一感染靶细胞的识别程度对于特定病毒进化支不一定更高或更低(图8)。因为进化支中病毒序列簇的变化，提供的证据表明HIV-1分离物的序列变化并不是用L1-p150-特异性克隆L1-3O观察到的识别程度的影响因素。作为实验TO2的另一对照，测试HIV-1-89SM_145或HIV-1-94US_3393感染的靶细胞与10μg/ml HLA-A、B、C封闭抗体(克隆G46-2.6，BD生物科学公司)预孵育是否能阻止克隆L1-3O的识别。将感染靶细胞与等量IgG1同种型对照预孵育进行比较。观察到与HLA-A、B、C预孵育高效抑制识别(图9)。综上所述，这些数据表明L1-p150-KI9-特异性CD8⁺T细胞克隆“L1-3O”以MHC-1限制性方式识别HIV-1和HIV-2感染的细胞，与序列变化无关。

图8.克隆L1-3O对不同HIV-1-分离物感染的自体细胞的反应程度与感染水平相关。通过流式细胞术和HIV-1-Gag的荧光抗体(Kc57-RD1)染色测定用于图7中识别实验的靶细胞群中的HIV-1-感染细胞的百分数。显示感染靶细胞百分数(X轴)和对于脱粒起反应的克隆L1-3O的百分数(CD107a+)。

图9.与抗-HLA-A、B、C抗体预孵育阻断感染细胞的识别。在图7所示识别实验中，在自体靶细胞与10μg/ml抗-HLA-A、B、C抗体(克隆G46-2.6，BD生物科学)或10μg/ml IgG1同种型对照预孵育后还测试对于病毒89SM_145和94_US_3393的识别。如图所示流式细胞术数据显示CD8染色和CD107a染色(脱粒标记物)。

实施例3：L1-特异性T细胞克隆介导对不同HIV-1分离物感染细胞的杀伤作用。

测试L1-ORF-2-KVIYRFNAI(SEQ ID NO：10)表位-特异性克隆“L1-3O”对于HIV-感染细胞的杀伤作用。

通过磁性转染用不同HIV-1分离物板块同步感染来自两个捐献者、即L1-3O克隆来源个体和HLA-错配个体的CD4⁺T细胞，感染进行24小时。以克隆细胞∶靶细胞＝1∶15的比例将L1-特异性CD8⁺T细胞克隆L1-3O-KI9加入感染的自体和HLA-错配靶细胞中。平行维持未加CD8⁺T细胞的对照感染培养物。感染再进行18小时，用CD4的mAb对细胞进行表面染色，用HIV-1-Gag的mAb(Ki67，贝克曼库尔特公司)(Beckman Coulter)进行胞内染色。流式细胞术测量％Ki67+细胞，以评价感染的程度。数据如图19所示。

如图19所示，LINE-1-ORF2p-特异性克隆L1-3O-KI9高效清除每一受试HIV-1分离物感染的自体细胞。与克隆共培养的HLA-错配靶细胞感染水平的降低幅度小于自体靶细胞的观察值。数据显示LINE-1-特异性CD8⁺T细胞特异性识别并消除不同HIV1分离物感染的自体细胞。

实施例4：L1-特异性T细胞克隆介导对HIV-感染细胞的杀伤作用。

从未经治疗显示对感染有天然控制力的HIV-感染个体(HIV病毒载量＜50拷贝/毫升bDNA)中分离CD8⁺T细胞。使用肽脉冲处理自体B细胞淋巴瘤细胞株，用LINE-1-ORF1-RPNLRLIGV(SEQ ID NO：9)、HIV-Gag汇集肽(获自NIH AIDS试验项目的共有肽)或CMV pp65汇集肽(JPT肽技术公司)(JPT Peptide Technologies)中将这些细胞体外扩增7天。将扩增的B细胞系与用HIV-1-NL4-3感染的自体CD4⁺T细胞以1∶1比例混合，或作为模拟物感染对照维持。作为阳性对照，还将扩增细胞系与感染HIV-1-NL4-3的经肽(RPNLRLIGV(SEQ ID NO：9)、汇集的Gag肽或汇集的CMV pp65肽)脉冲处理的自体CD4⁺T细胞混合。

将效应细胞与靶细胞在37℃，5％CO₂的条件下共孵育1小时。在该阶段加入5μg/ml PE-偶联的抗-CD107a mAb(BD)(共培养前1小时)。加入布雷菲德菌素A至终浓度为10μg/ml，然后再孵育5小时。然后用CD4和CD8的mAb对细胞表面进行染色，用cytofix/cytoperm(BD公司)通透细胞，然后使用mAB(BD)对干扰素-γ(IFN-γ)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行染色。使用FACSCalibur仪器(BD)进行流式细胞术。

结果表明HIV-1-NL4-3感染的自体细胞刺激LINE-1-RPNLRLIGV(SEQ ID NO：9)扩增的CD8+T细胞，以及HIV-1-Gag扩增的CD8⁺T细胞。HIV-1-NL4-3感染的自体细胞不刺激CMV-pp65扩增CD8⁺T细胞(作为阴性对照)。这些数据表明LINE-1-特异性CD8⁺T细胞特异性识别HIV-1-感染的细胞。

虽然参照具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解可在不背离本发明真实构思和范围的情况下作出各种改变并用其等同形式替代。此外，可根据本发明目的、构思和范围进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤。所有这些修改均应包括在所附权利要求书的范围之内。

序列表

<110>D.尼克松(NIXON，DOUGLAS F.)

K.加里森(GARRISON，KEITH)

D.梅克勒约翰(MEIKLEJOHN，DUNCAN)

M.奥斯特洛夫斯基(OSTROWSKI，MARIO)

R.B.琼斯(JONES，R.BRADLEY)

A.阿格拉沃尔(AGRAWAL，ASHISH)

F.M.赫克特(HECHT，FREDERICK M.)

<120>长散布核元件多肽组合物及其使用方法

<130>GLAD-041 WO

<140>

<141>

<150>60/973,993

<151>2007-09-20

<160>76

<170>PatentIn 3.5版

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>1

Met Asn Glu Met Lys Arg Glu Gly Lys Phe Arg Glu

1 5 10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>2

Ser Gln Leu Lys Glu Leu Glu Lys Gln Glu

1 5 10

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>3

Met Leu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Gly Trp Val Thr

1 5 10

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>4

Lys Ile Asp Arg Leu Leu Ala Arg Leu Ile

1 5 10

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

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Leu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Gly Cys

1 5

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>6

Asn Gly Lys Gln Lys Lys Ala Gly Phe Ala Ile Leu Val

1 5 10

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>7

Asp Glu Leu Arg Glu Glu Gly Val Arg

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<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

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<400>8

Thr Met Arg Tyr His Leu Thr Pro Val

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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Arg Pro Asn Leu Arg Leu Ile Gly Val

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

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Lys Val Ile Tyr Arg Phe Asn Ala Ile

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

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Ile Val Tyr Leu Glu Asn Pro Ile Val

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

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Ser Leu Gln Glu Ile Trp Asp Tyr Val

1 5

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<211>9

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<213>人工序列

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Asn Leu Glu Glu Cys Ile Thr Arg Ile

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<211>9

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Thr Pro Arg His Ile Ile Val Arg Phe

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<211>9

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<213>人工序列

<220>

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Leu Leu Phe Asn Ile Val Leu Glu Val

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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Tyr Thr Met Glu Tyr Tyr Ala Ala Ile

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<211>9

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<213>人工序列

<220>

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<400>17

Arg Ala Arg Ile Ala Lys Ser Ile Leu

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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Ala Pro Arg Phe Ile Lys Gln Val Leu

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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Ile Ser Tyr Pro Ala Lys Leu Ser Phe

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<213>人工序列

<220>

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Ser Ser Pro Ala Thr Glu Gln Ser Trp

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<220>

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Lys Ala Thr Val Thr Lys Thr Ala Trp

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<213>人工序列

<220>

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<400>22

Arg Val Asn Arg Gln Pro Thr Thr Trp

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<210>23

<211>1275

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>23

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Gly Ser Lys Ala Leu Leu Ser Lys Cys Lys Arg Thr Glu Ile Ile Thr

210 215 220

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Ala Ile Lys Asn Asp Glu Phe Met Ser Phe Val Gly Thr Trp Met

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Thr Lys His Arg Ile Phe Ser Leu Ile Gly Gly Asn

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<210>24

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<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>24

Met Gly Lys Lys Gln Asn Arg Lys Thr Gly Asn Ser Lys Thr Gln Ser

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Ala Ser Pro Pro Pro Lys Glu Arg Ser Ser Ser Pro Ala Thr Glu Gln

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Ser Trp Met Glu Asn Asp Phe Asp Glu Leu Arg Glu Glu Gly Phe Arg

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Glu Val Glu Asn Phe Glu Lys Asn Leu Glu Glu Cys Ile Thr Arg Ile

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Lys Met

<210>25

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<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

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1175 1180 1185

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Ile Ala Lys Thr Trp Asn Gln Pro Lys Cys Pro Thr Met Ile Asp

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<210>26

<211>1275

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>26

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Ala Asn Gly Lys His Lys Lys Ala Gly Val Ala Ile Leu Val Ser Asp

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Asp Phe Met Ser Lys Thr Pro Lys Ala Met Ala Thr Lys Ala Lys Ile

995 1000 1005

Asp Lys Trp Asp Leu Ile Lys Leu Lys Ser Phe Cys Thr Ala Lys

1010 1015 1020

Glu Thr Thr Ile Arg Ala Asn Arg Gln Pro Thr Thr Trp Glu Lys

1025 1030 1035

Ile Phe Ala Thr Tyr Ser Ser Asp Lys Gly Leu Ile Ser Arg Ile

1040 1045 1050

Tyr Asn Glu Leu Lys Gln Ile Tyr Lys Lys Lys Thr Asn Asn Pro

1055 1060 1065

Ile Lys Lys Trp Ala Lys Asp Met Asn Arg His Phe Ser Lys Glu

1070 1075 1080

Asp Ile Tyr Ala Ala Lys Lys His Met Lys Lys Cys Ser Ser Ser

1085 1090 1095

Leu Ala Ile Arg Glu Met Gln Ile Lys Thr Thr Met Arg Cys His

1100 1105 1110

Phe Thr Pro Val Arg Met Ala Ile Ile Lys Lys Ser Gly Asn Asn

1115 1120 1125

Arg Cys Trp Arg Gly Cys Gly Glu Ile Gly Thr Leu Leu His Cys

1130 1135 1140

Trp Trp Asp Cys Lys Leu Val Gln Pro Leu Trp Lys Ser Val Trp

1145 1150 1155

Arg Phe Leu Arg Asp Leu Glu Leu Glu Ile Pro Phe Asp Pro Ala

1160 1165 1170

Ile Pro Leu Leu Gly Ile Tyr Pro Lys Asp Tyr Lys Ser Cys Cys

1175 1180 1185

Tyr Lys Asp Thr Cys Thr Arg Met Phe Ile Ala Ala Leu Phe Thr

1190 1195 1200

Ile Ala Lys Thr Trp Asn Gln Pro Lys Cys Pro Thr Met Ile Asp

1205 1210 1215

Trp Ile Lys Lys Met Trp His Ile Tyr Thr Met Glu Tyr Tyr Ala

1220 1225 1230

Ala Ile Lys Asn Asp Glu Phe Met Ser Phe Val Gly Thr Trp Met

1235 1240 1245

Lys Leu Glu Thr Ile Ile Leu Ser Lys Leu Ser Gln Glu Gln Lys

1250 1255 1260

Thr Lys His Arg Ile Phe Ser Leu Ile Gly Gly Asn

1265 1270 1275

<210>42

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>42

Glu Met Lys Arg Glu Gly Lys

1 5

<210>43

<211>7

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>43

Glu Met Lys Arg Glu Gly Lys

1 5

<210>44

<211>8

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>44

Asn Glu Met Lys Arg Glu Gly Lys

1 5

<210>45

<211>8

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>45

Asn Glu Met Glu Arg Glu Gly Lys

1 5

<210>46

<211>8

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>46

Asp Glu Met Lys Lys Glu Gly Lys

1 5

<210>47

<211>8

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>47

Gln Leu Lys Glu Leu Glu Lys Gln

1 5

<210>48

<211>8

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>48

Gln Ile Lys Glu Leu Gln Lys Gln

1 5

<210>49

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>49

Ser Gln Leu Lys Glu Leu Glu Lys Gln

1 5

<210>50

<211>11

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>50

Ser Glu Leu Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln

1 5 10

<210>51

<211>12

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>51

Met Leu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Gly Trp Val Thr

1 5 10

<210>52

<211>14

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>52

Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Ala Glu Lys Gly Trp Val Thr

1 5 10

<210>53

<211>12

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>53

Met Ile Arg Ser Ala Ala Glu Lys Leu Trp Val Thr

1 5 10

<210>54

<211>6

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>54

Glu Lys Gly Trp Val Thr

1 5

<210>55

<211>6

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>55

Glu Lys Gly Trp Val Thr

1 5

<210>56

<211>12

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>56

Met Ile Arg Ser Ala Glu Glu Lys Leu Trp Val Thr

1 5 10

<210>57

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>57

Lys Ile Asp Arg Leu Leu Ala Arg Leu Ile

1 5 10

<210>58

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>58

Lys Ile Asp Arg Leu Leu Asp Arg Leu Ile

1 5 10

<210>59

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>59

Lys Val Asp Arg Leu Ile Ala Arg Leu Ile

1 5 10

<210>60

<211>8

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>60

Lys Ile Asp Arg Leu Leu Ala Arg

1 5

<210>61

<211>8

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>61

Lys Ile Asp Arg Leu Leu Ala Arg

1 5

<210>62

<211>8

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>62

Arg Ala Ala Arg Glu Lys Gly Cys

1 5

<210>63

<211>8

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>63

Arg Ala Ala Arg Lys Lys Gly Cys

1 5

<210>64

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>64

Lys Ala Gly Phe Ala Ile Leu

1 5

<210>65

<211>7

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>65

Lys Ala Gly Phe Ala Ile Leu

1 5

<210>66

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>66

Ala Gly Phe Ala Ile Leu Val

1 5

<210>67

<211>7

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>67

Ala Gly Phe Ala Ile Leu Ile

1 5

<210>68

<211>6

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>68

Ala Gly Phe Ala Ile Leu

1 5

<210>69

<211>6

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>69

Ala Gly Phe Ala Ile Leu

1 5

<210>70

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>70

Asp Glu Leu Arg Glu Glu Gly Val Arg

1 5

<210>71

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>71

Glu Glu Leu Lys Glu Glu Ala Val Arg

1 5

<210>72

<211>6

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>72

Asp Glu Leu Arg Glu Glu

1 5

<210>73

<211>6

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1

<400>73

Asp Glu Leu Arg Glu Gln

1 5

<210>74

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<223>肽可包含2-40个残基

<400>74

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

35 40

<210>75

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<223>肽可包含2-40个残基

<400>75

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

35 40

<210>76

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<223>肽可包含2-40个残基

<400>76

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

35 40

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含分离的长散布核元件(LINE)多肽和药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的LINE多肽包含与SEQ ID NO：1-22中任一项具有至少约75％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的LINE多肽包含SEQ ID NO：1-22中任一项所列的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，将所述组合物配制成胃肠道外给药的形式。

5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，将所述组合物配制成向粘膜组织给药的形式。

6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。

7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂包含氢氧化铝、MF59或单磷酰基脂质A。

8.一种免疫原性组合物，其包含含有编码长散布核元件(LINE)多肽的核苷酸序列的核酸。

9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述LINE多肽包含SEQ ID NO：1-22中任一项所列的氨基酸序列。

10.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，将所述组合物配制成胃肠道外给药的形式。

11.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，将所述组合物配制成向粘膜组织给药的形式。

12.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述核酸是重组载体。

13.如权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述重组载体是重组病毒载体。

14.一种合成的长散布核元件(LINE)多肽。

15.如权利要求14所述的合成LINE多肽，其特征在于，所述合成LINE多肽包含与SEQ ID NO：1-22中任一项所列的氨基酸序列具有至少约75％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。

16.如权利要求14所述的合成LINE多肽，其特征在于，所述多肽是多聚化的。

17.如权利要求14所述的合成LINE多肽，其特征在于，所述多肽与运载体连接。

18.如权利要求14所述的合成LINE多肽，其特征在于，所述多肽长为6-约200个氨基酸。

19.一种包含权利要求14所述的长散布核元件(LINE)多肽的组合物。

20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物，并且所述组合物还包含佐剂。

21.如权利要求19所述组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的赋形剂。

22.一种包含编码权利要求14所述合成LINE多肽的核苷酸序列的核酸。

23.一种包含权利要求22所述核酸的组合物。

24.一种在个体中诱导感染致病性病毒或具有感染风险的宿主细胞的T淋巴细胞应答的方法，所述方法包括给予该个体权利要求1、8、19和23中任一项所述的组合物。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述T淋巴细胞应答包括CD8⁺T细胞应答或CD4⁺T细胞应答。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述T淋巴细胞应答包括粘膜T淋巴细胞应答。

27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述致病性病毒是人免疫缺陷病毒。

28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述个体未感染所述致病性病毒。

29.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述个体已感染所述致病性病毒。

30.一种在个体中诱导对具有LINE表达并在癌细胞表面呈现LINE表位的癌细胞的T淋巴细胞应答的方法，所述方法包括给予个体权利要求1、8、19和23中任一项所述的组合物。

31.一种产生对长散布核元件(LINE)多肽具有特异性的CD8⁺T细胞群的方法，所述方法包括在抗原递呈平台关联的条件下，将未刺激的CD8⁺T细胞群在体外与分离的LINE多肽相接触，其中所述接触产生LINE肽特异性CD8⁺T细胞群。

32.一种在个体中治疗逆转录病毒感染的方法，所述方法包括给予该个体有效量的权利要求1、8、9和23中任一项所述的组合物。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述给药使该个体中的病毒载量有效减少至少约10％。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，还包括给予该个体有效量的一种或多种核苷酸类似物逆转录酶抑制剂、核苷类似物逆转录酶抑制剂、非核苷类似物逆转录酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂和HIV进入/融合抑制剂。

36.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括给予该个体有效量的权利要求1、8、19和23中任一项所述的组合物，其中所述癌症含有长散布核元件(LINE)多肽表达水平异常的癌细胞。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述癌症是黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌或睾丸癌。

38.一种治疗个体的自身免疫病的方法，所述方法包括给予该个体有效量的权利要求19所述组合物。

39.一种监测病人对于逆转录病毒感染治疗的响应的方法，所述方法包括：

a)将白细胞(WBC)在体外与合成长散布核元件(LINE)多肽接触，其中在治疗开始后第一时间点由该病人获得所述WBC；以及

b)检测WBC因与LINE多肽接触而分泌的细胞因子，

与对照WBC接触LINE多肽后产生的细胞因子水平相比，WBC接触LINE多肽后产生的细胞因子减少，表明所述疗法能有效治疗逆转录病毒感染，其中在治疗开始前或在治疗中早于第一时间点的时间点从病人中获取对照WBC。