JP2019532103A - ペプチドライブラリーおよび使用方法 - Google Patents

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Abstract

免疫原性ペプチドを同定するための方法、ならびにそれらの方法に使用されるツールおよび／または試薬が開示される。より具体的には、本発明は、天然Ｔ細胞受容体によって認識される合成抗原性ペプチドをスクリーニングするコンビナトリアルペプチドライブラリーに関する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１６年１０月４日に出願された、“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ”という発明の名称のオーストラリア仮特許出願第２０１６９０４０２４号の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、一般に、免疫原性ペプチドを同定するための方法、ならびにそれらの方法に使用されるツールおよび／または試薬に関する。より具体的には、本発明は、天然Ｔ細胞受容体によって認識される合成抗原性ペプチドをスクリーニングするコンビナトリアルペプチドライブラリーに関する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、有核細胞の表面上の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）分子によって提示される短鎖ペプチドフラグメントを認識する（Ｙｅｗｄｅｌｌ ａｎｄ Ｈａｅｒｙｆａｒ，２００５；Ｙｅｗｄｅｌｌ，２０１０；およびＭｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５を参照）。これらのペプチド−ＭＨＣ−Ｉ（ｐＭＨＣ−Ｉ）分子配列は、クローン型的に（ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ）分布したαβ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって走査され（Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照）、それが、予め設定された単量体ＴＣＲ／ｐＭＨＣ−Ｉ親和性閾値を超えて、Ｔ細胞活性化を誘発する（Ｂｒｉｄｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｔｅｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３のいずれかを参照）。このプロセスは、免疫系が、非改変自己由来ペプチドのレパートリーを発現する正常細胞の存在下で不活性なままである一方、標的とされた細胞毒性によって、感染細胞および異常細胞を特定し、排除することを可能にする。弱毒化した全生物、タンパク質サブユニットおよび／またはペプチドが、典型的に、様々な癌および危険な病原体に対する免疫応答を引き起こすためにワクチン製剤において使用される。単独の感染症の場合、予防ワクチンが、年間約９百万人の死亡を防ぐものと考えられる（ＵＮＩＣＥＦ，１９９６を参照）。しかしながら、有効な予防は、ほとんどのヒト疾患で不足しており、現在使用可能なワクチンの世界的な経済コストは高く、年間約４０億米国ドルの費用がかかっている（Ｗｏｌｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６を参照）。特に、これらの感受性の高い生体化合物のための温度管理されたサプライチェーンは、総配備コストの最大で８０％を占め得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照）。したがって、環境的安定性が、現在のワクチン研究開発のための戦略的な優先事項である。
自然界におけるタンパク質の大部分は、Ｌ−アミノ酸から構成され、Ｌ−アミノ酸は、内因性および環境プロテアーゼによる分解に対して高度に感受性である。対照的に、Ｄ−アミノ酸は、例えば、原核生物細胞壁、細菌抗生物質、特定の動物のタンパク質および毒、ならびにヒト脳における神経調節因子において、稀に存在するに過ぎない（Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｌｕ，２０１４；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１０；およびＴｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照）。Ｄ−アミノ酸は、同一の化学的および物理的特性を有するＬ−アミノ酸の鏡像立体異性体であるが、対応するタンパク質は、本質的に、プロテアーゼ媒介性加水分解に対して抵抗性がある（Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｌｕ，２０１４）。したがって、これらの構成単位から設計される免疫調節ペプチドが、向上したバイオアベイラビリティおよび生体内有効性を有する安定したワクチンの製造を可能にし得る。さらなる利益は、経口摂取による治療活性の可能性を含む。
コンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）を用いた大規模なＴ細胞走査研究（Ｐｉｎｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１２；およびＥｋｅｒｕｃｈｅ−Ｍａｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）および酵母ディスプレイによるｐＭＨＣライブラリー（Ｂｉｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）は、交差反応がＴＣＲの固有の特性であることを示した（Ｓｅｗｅｌｌ，２０１２に概説されている）。したがって、それらの天然の同等物を模倣する非天然Ｄ−アミノ酸アゴニストを生成することが実現可能であり得る（Ｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；およびＰｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明につながる研究において、九量体ＣＰＬが、関連するヒト疾患の設定において完全合成アゴニストをリバースエンジニアリングするために、Ｄ−アミノ酸サブユニットのみを用いて合成された。データは、後述されるように、現在のワクチン製剤に比べてかなりの利点を提供する非天然免疫調節組成物の設計のための新規なかつ体系的なアプローチを有効にする。
本発明は、Ｄ−アミノ酸ペプチド「模倣体」が、インビトロでヒトインフルエンザ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を有効にかつ特異的に増幅し、致死性インフルエンザ抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）から保護する、マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を開始させ得るという発見に部分的に基づいている。
さらに、本発明者らは、定義された長さのペプチドに関してインデックス位置における単一の定義されたＤ−アミノ酸が、ＴＣＲによって認識されるかどうかを調べる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ことによって、ペプチドの各位置の縮重に関して重要な情報が得られたことを発見した。他の位置（すなわち、インデックス位置以外）におけるランダムなアミノ酸は、ＭＨＣに結合し、また、同種ＴＣＲによって認識されるＤ−アミノ酸を有するペプチドを提供する。ペプチド中の全ての位置についてインデックス位置で各Ｄ−アミノ酸を体系的にスクリーニングすることによって、ペプチドの全ての位置において認識されるＤ−アミノ酸のリストが、ＭＨＣ分子の抗原結合裂け目に結合し、および／または同種ＴＣＲによって認識されることが分かっている個々のＤ−アミノ酸に基づいて作成され得る。
任意の所与のペプチドのランダムな位置に存在するＤ−アミノ酸のいずれかを実際に特徴付けるものがない場合でも、体系的アプローチが、調べられるインデックス位置に存在する単一の一定のＤ−アミノ酸のＴＣＲによる認識のレベルに対して評価を行うことを可能にする。ペプチド中の全てのアミノ酸が、ＭＨＣおよび／またはＴＣＲとの関連を有するとは限らない。したがって、いくつかの位置は、所与の位置におけるアミノ酸選択に関して可変であり得る。
意外にも、本発明者らによって同定される合成アゴニストのＤ−アミノ酸配列は、天然Ｌ−アミノ酸アゴニストとかなり異なっているため、予測できなかった。したがって、本明細書に示される結果は、体系的でかつ偏りのない方法で作動性Ｄ−アミノ酸ペプチド配列を同定する際のＣＰＬの能力を示す。本発明は、ＭＨＣ（例えば、ＭＨＣクラスＩ）システム内の任意の標的に適用可能なプラットフォームとしての明白および重要な有用性を有し、例えば、現在の製剤より潜在的に安価で、より生物学的に安定した有効なヒトＴ細胞治療法の合理的設計に使用され得る。
したがって、一態様において、本発明は、合成Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト（すなわち、Ｄ−アミノ酸ペプチド）を同定するためのＣＰＬを提供する。これらのＣＰＬは、一般に、複数のペプチドセットであって、各セットがペプチドの異なるアミノ酸位置（「インデックス位置」）を照会する複数のペプチドセットと、複数の別個のペプチド混合物とを含み、ここで、各混合物が、インデックス位置において定義されたＤ−アミノ酸（すなわち、ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉ、ｆ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖ、ｗ、ｙ、またはそれらの修飾形態）を有し、一つ置きの位置が、ランダムＤ−アミノ酸であり、セットの数が、ペプチド中に存在する位置の数に等しい。特定の実施形態において、ペプチド混合物は、インデックス位置以外の各位置において、各アミノ酸のほぼ同等の提示を含む。
ある実施形態において、インデックス位置以外の位置におけるＤ−アミノ酸は、システインを除外する。システインの重合する傾向のため、このタイプの実施形態が、有利であり得る。
ある実施形態において、ペプチド混合物中の各Ｄ−アミノ酸ペプチドは、およそ等モル濃度で存在する。これは、各個々のペプチドが、検出可能な免疫を引き起こすのに一般に不十分な少量（例えば、約５．５×１０−６ｎＭ）でペプチド混合物中に存在することの有益な効果を有する。したがって、スクリーニングプロセス中のＴＣＲによるペプチド混合物の検出可能な認識は、混合物中の全てのペプチドの組合せから得られ、したがって、インデックス位置における一定のＤ−アミノ酸の特徴であると考えられ得る（これは、ペプチドの全ての間の唯一の共通の特徴であるため）。
ある実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、ＭＨＣ分子による提示に好適な長さのものである。さらに、好ましい実施形態において、ＣＰＬに含まれるペプチドの全ては、互いに等しい長さのものである。好適には、ＣＰＬペプチドが結合することが予想されるＭＨＣ分子は、クラスＩ ＭＨＣ分子（「ＭＨＣ−Ｉ」）であり、したがって、このようなペプチドは、約８Ｄ−アミノ酸長から約１１Ｄ−アミノ酸長（すなわち、８、９、１０、または１１Ｄ−アミノ酸長）である。本発明の特定の実施形態において、ＣＰＬは、九量体を含む。
本発明のＣＰＬは、当該技術分野において公知の任意の手段を用いて合成され得る。例えば、ある実施形態において、ペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、マイクロチップによる産生、固体マトリックス中のモノマーのレーザーによる転移、または当該技術分野において公知の任意の他の好適な技術によって合成される。
ある実施形態において、ＣＰＬの各ペプチド混合物は、容器の別個のおよび異なる区画中に存在し、または異なる容器に位置する。各ペプチド混合物が、容器中、または容器の区画中に存在することの１つの利点は、ハイスループットスクリーニング方法を促進する容易さである。例示的な例として、各ペプチド混合物は、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）の別個のウェル中に存在し得る。
ある実施形態において、各ＭＨＣ分子がペプチド混合物中の個々のペプチドを提示するように、ペプチド混合物は、ＭＨＣ分子と接触される。当該技術分野において一般に理解されるように、ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に位置するＭＨＣ分子によって、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に提示される。したがって、ある実施形態において、ＣＰＬのペプチドは、エフェクター細胞への曝露の前に、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ−Ｉ分子）とともにインキュベートされる。特定の実施形態において、ＣＰＬのペプチド混合物は、ＭＨＣ−Ｉ分子より高い濃度で、ＭＨＣ−Ｉによって接触される。抗原結合裂け目へのペプチド充填のレベルは、ＭＨＣ−Ｉ分子の濃度と比較してより高い濃度のＤ−アミノ酸ペプチドを提供することによって、著しく増加される。
別の態様において、本発明は、標的抗原に対する免疫応答を引き起こすことが可能なＴ細胞ペプチドアゴニストを同定するための方法であって、
コンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）を、対象とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することが知られているＭＨＣクラスＩ分子に提供する工程であって、ＣＰＬが、複数のペプチドセットであって、各セットがペプチドの異なるアミノ酸位置（「インデックス位置」）を調べる複数のペプチドセットと、複数の別個のペプチド混合物とを含み、ここで、各混合物が、インデックス位置において定義されたＤ−アミノ酸（すなわち、ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉ、ｆ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖ、ｗ、ｙ、またはそれらの修飾形態）を有し、一つ置きの位置が、ランダムＤ−アミノ酸であり、セットの数が、ペプチド中に存在する位置の数に等しい、工程と；
各ＭＨＣおよびペプチド混合物を、標的抗原に結合することが知られているＴＣＲと接触させて、ペプチドの各インデックス位置において認識されるＤ−アミノ酸を決定する工程と；
各インデックス位置において認識されるＤ−アミノ酸を選択することによって、アミノ酸配列を生成して、それによって、標的抗原に対する免疫応答を引き起こすかまたは促進するＴＣＲアゴニストを同定する工程と
を含む方法を提供する。
本発明によって提供される利点は、上記および本明細書の他の箇所に記載されるスクリーニング方法によって同定されるペプチドが、天然Ｌ−アミノ酸ペプチドアゴニストより高い安定性、より長いバイオアベイラビリティ、および／またはよりゆっくりとした排泄半減期を有することである。さらに、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、公知のＬ−アミノ酸ペプチドアゴニストの配列を単に分析することによって、または関連するｐＭＨＣ−ＴＣＲ複合体の構造モデルを単に分析することによって、予測することができなかった。
ある実施形態において、スクリーニング方法は、標的細胞（例えば、ＡＰＣ）と、抗原特異的エフェクター細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）との間の相互作用を測定する細胞ベースのアッセイである。このタイプの特定の実施形態において、ＭＨＣ分子は、ＡＰＣの細胞表面に存在する。同じおよび他の実施形態のいくつかにおいて、ＴＣＲは、エフェクター細胞の表面に存在する。エフェクター細胞は、ＭＨＣに関して標的抗原を特異的に認識することが知られている任意の細胞であり得る。好適なエフェクター細胞の非限定的な例としては、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。非細胞ベースアッセイも考えられる（例えば、ｐＭＨＣとＴＣＲとの間の結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定）。
ある実施形態において、ＴＣＲに曝露されるペプチド混合物の総濃度は、約１μＭ〜約５００μＭである。ある実施形態において、ペプチド混合物は、約１００μＭの濃度で、ＴＣＲと接触される。
インデックス位置における各Ｄ−アミノ酸の認識のレベルを決定するために、エフェクター細胞機能の分析が行われる。例えば、エフェクター細胞機能の好適な分析としては、細胞毒性アッセイ、およびエフェクター細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）からのサイトカインおよび／またはケモカイン放出の測定が挙げられる。
細胞によるサイトカインおよび／またはケモカイン放出を測定するためのいくつかの技術が、当該技術分野において公知である。しかしながら、このような技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＭＨＣ−ペプチド四量体染色、またはフローベースの分析（例えば、フローサイトメトリー）が挙げられる。エフェクター細胞から分泌されることが知られている任意のサイトカインおよび／またはケモカイン、特に、Ｔｈ１免疫応答に密接に関連するものは、候補Ｄ−アミノ酸ペプチドの認識のレベルを測定するのに好適である。例えば、好適なサイトカインおよび／またはケモカインは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＦＮβ、ＣＤ１０７ａ、およびＲＡＮＴＥＳを含む群から選択され得る。
エフェクター細胞機能を測定するための特に好適な細胞毒性アッセイは、クロム放出アッセイである。
このタイプのさらにいくつかの他の実施形態において、スクリーニング方法は、同定されたペプチドが、予想される活性／免疫原性を有することを確認する工程をさらに含む。この確認試験は、上記または本明細書の他の箇所に記載される活性アッセイのいずれかとして、または免疫応答の存在を評価するための任意の公知の方法によって行われ得る。
さらに別の態様において、本発明は、式Ｉ：
Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
（式中：
Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
によって表されるＤ−アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる免疫原性ペプチドを提供する。
これらのＤ−アミノ酸ペプチドは、インフルエンザのマトリックスＭ１タンパク質に対する免疫応答を引き起こす際に特に有用である。したがって、ある実施形態において、これらのＤ−アミノ酸ペプチドは、インフルエンザウイルス感染を処置するのに使用され得る。特定の実施形態において、Ｄ−アミノ酸配列は、配列番号３〜１０のいずれか１つに記載される配列を含む。好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号３に記載されるＤ−アミノ酸配列を含む。
関連する態様において、本発明は、インフルエンザマトリックスＭ１タンパク質に対する免疫応答を引き起こすかまたは促進するための免疫調節組成物を提供する。このタイプの組成物は、式Ｉ：
Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
（式中：
Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
によって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるＤ−アミノ酸ペプチドを含む。
このタイプの特定の実施形態において、ペプチドは、配列番号３〜１０のいずれか１つに記載されるＤ−アミノ酸配列を含む。好ましくは、Ｄ−アミノ酸配列は、配列番号３に記載される配列を含む。
本発明の組成物は、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。非限定的な例として、ペプチドは、好適には、粒子状形態であり得る。
別の関連する態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤と一緒に、配列番号３〜１０のいずれか１つに記載されるＤ−アミノ酸配列を含む組成物を含む医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、組成物は、ワクチンとして製剤化される。本発明の１つの利点は、Ｄ−アミノ酸配列を含むペプチドが、Ｌ−アミノ酸ベースのペプチドより安定しており、したがって、増加した貯蔵寿命から利益を得て、貯蔵要件をより容易に満たすことを本発明者らが示したことである。
ある実施形態において、組成物は、全身投与用に製剤化される。例えば、医薬組成物は、経口投与用に製剤化され得る。意外にも、Ｄ−アミノ酸ペプチドが、特に胃酸様条件下で、Ｌ−アミノ酸ベースの同等物よりはるかに安定していることが示された。さらに、経口的に送達されたＤ−アミノ酸ペプチドが、補助剤を必要とせずに胃腸系内でエフェクターＴ細胞をプライムする能力を保持することも確認された。特定の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、経口または腸内投与用に製剤化される。これは、消化管などの粘膜との免疫調節組成物の直接の接触を可能にするため、従来のＬ−アミノ酸ペプチド抗原に勝る利点である。さらに、これらの投与経路は、皮膚を破壊することから生じる二次感染のリスクを低下させる（したがって、家畜対象にとって特に有利である）。
別の態様において、本発明は、対象におけるインフルエンザを処置するための方法であって、免疫原性Ｄ−アミノ酸ペプチドを対象に投与する工程を含み、ここで、ペプチドが、式Ｉ：
Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
（式中：
Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
によって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる方法を提供する。
特定の実施形態において、Ｄ−アミノ酸配列は、配列番号３〜１０のいずれか１つに記載される配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
９残基長（９−ｍｅｒ）コンビナトリアルペプチドライブラリーの概略図である。九量体（９−ｍｅｒ）ライブラリーは、１８０の異なるペプチド混合物からなり、それぞれが、定義された位置（インデックス「Ｏ」）において２０のＤ−アミノ酸のうちの１つ、ならびに残りの位置（「Ｘ」）のそれぞれにおいてシステイン（ｃ）を除く全てのアミノ酸を含む。 インフルエンザレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）の免疫原性および経口送達による合成アゴニストの活性のグラフ表示およびＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。（Ａ）クローンＡＬＦ３ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＧＩＬまたはｌｔｆ（１０−５Ｍ）の存在下で、Ｃ１Ｒ−Ａ２標的細胞とともにインキュベートした。上清中のＭＩＰ−１β放出を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。エラーバーは、２つの複製を表す。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２細胞を、指示される濃度のＧＩＬ、ｌｔｆまたはＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（ＨＬＡ−Ａ１制限陰性対照）とともにインキュベートし、αＨＬＡ−Ａ２−ＦＩＴＣで染色した。ＤＭＳＯが、さらなる対照として含まれていた。平均蛍光強度が、各条件について示される。（Ｃ）１００μｇのｇｐｐまたは等体積のＰＢＳ（モック）の強制経口投与によって、ＨＨＤマウスにプライムし（０日目）、ブーストした（７日目および１４日目）。２１日目に採取した腸間膜リンパ節からの細胞を、ＧＩＬ（１０−６Ｍ）を用いて、インビトロで１０日間刺激した。次に、ＧＩＬ反応性細胞を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて定量化した。 典型的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローンが、Ｄ−アミノ酸ペプチドにわたって広い認識フットプリントを有することを示す。ＡＬＦ３ ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン細胞を、九量体Ｄ−アミノ酸を含むＣＰＬアレイスクリーンで被覆されたＣ１Ｒ−Ａ２＋標的細胞とともにインキュベートした。上清を収集し、ＭＩＰ−１β放出を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。インデックスＧＩＬペプチドに対応する各位置におけるアミノ酸残基が、赤色で示される。ペプチド骨格に沿って一定のアミノ酸位置（一文字記号）が示される。個々のペプチド混合物についてのエラーバー。 典型的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローンが、Ｄ−アミノ酸ペプチドにわたって広い認識フットプリントを有することを示す。ＡＬＦ３ ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン細胞を、九量体Ｄ−アミノ酸を含むＣＰＬアレイスクリーンで被覆されたＣ１Ｒ−Ａ２＋標的細胞とともにインキュベートした。上清を収集し、ＭＩＰ−１β放出を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。インデックスＧＩＬペプチドに対応する各位置におけるアミノ酸残基が、赤色で示される。ペプチド骨格に沿って一定のアミノ酸位置（一文字記号）が示される。個々のペプチド混合物についてのエラーバー。 完全合成Ｔ細胞アゴニストが、ヒトプロテアーゼおよび胃酸に対して非常に耐性のあるＣＰＬアレイを用いて構築され得ることを示すグラフ表示を提供する。（Ａ）ＡＬＦ３ ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、１０−４Ｍ〜１０−７Ｍの対数的に減少する用量でのＣＰＬペプチド混合物中の定量的シグナルによって示唆されるように、８つのＤ−アミノ酸候補アゴニストで被覆されたＣ１Ｒ−Ａ２＋標的細胞とともにインキュベートした。次に、培養物からの上清を収集し、ＭＩＰ−１β放出を、ＭＩＰ−１β ＥＬＩＳＡによって競合的に定量化した。エラーバーが示される。（Ｂ）天然Ｌ−ペプチドＧＩＬおよび最適なＤ−アゴニストｇｐｐを、ヒト血清またはＭｉｌｌｉＱ水に加え、３連で、０〜６０分で経時的にサンプリングした。次に、各アゴニストを同定したイオンピークシグナルを、ＬＣＭＳを用いて定量化した。各時点での安定性を、０分での同じイオンピークの面積におけるパーセンテージとして、各血清処理されたイオンピークの面積として計算した。（Ｃ）天然Ｌ−ペプチドＧＩＬおよび最適なＤ−アゴニストｇｐｐを、模擬胃酸（ｐＨ１．２で、ＮａＣｌ、ペプシンおよびＨＣＬ）に加え、３連で、０〜１８０分で経時的にサンプリングした。次に、各アゴニストを同定したイオンピークシグナルを、ＬＣＭＳを用いて定量化した。各時点での安定性を、０分での同じイオンピークの面積におけるパーセンテージとして、各血清処理されたイオンピークの面積として計算した。エラーバーが示される。 合成Ｔ細胞アゴニストが、ＨＬＡ−Ａ２に関してインフルエンザマトリックスエピトープ特異的ＣＴＬを活性化し、ＣＤ８共受容体に依存していることを示すグラフ表示を提供する。（Ａ）ＣＴＬクローンＡＬＦ３を、ＧＩＬまたはｇｐｐを用いて、Ｃ１Ｒ−Ａ２＋標的とともにインキュベートし、一晩のインキュベーションの後、ＭＩＰ−１β放出を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。結果は、ｇｐｐが、ＡＬＦ３ ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを用量依存的に刺激することを示す。（Ｂ）ＣＴＬクローンＡＬＦ３を、ＧＩＬ−またはｇｐｐパルスＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２標的とともにインキュベートし、特定の標的細胞死滅を、４時間のインキュベーションの後、クロム放出アッセイによって定量化した。結果は、ｇｐｐ中で被覆された標的細胞を用量依存的に溶解させるＣＴＬの能力を示す。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２細胞を、１０−４Ｍのｇｐｐ、ＧＩＬ、ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（ＨＬＡ−Ａ１結合陰性対照）またはＤＭＳＯとともにインキュベートし、その後、表面ＨＬＡ−Ａ２分子へのペプチドの結合強度を定量化するために、抗ＨＬＡ−Ａ２−ＦＩＴＣ抗体で染色した。記載される平均蛍光強度での、各ペプチドおよび対照についてのヒストグラムが示される。（Ｄ）ＣＴＬクローンＡＬＦ３を、１０−４ＭのｇｐｐパルスＨＬＡ−Ａ２＋Ｃ１Ｒ（Ａ２＋Ｃ１Ｒ）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｃ１Ｒ（Ａ２−Ｃ１Ｒ）、向上したＣＤ８結合を有するＣ１Ｒ−Ａ２＋細胞（ＱＥ−Ｃ１Ｒ）およびＣＤ８共受容体（２２７／８−Ｃ１Ｒ）に結合しないＨＬＡ−Ａ２＋Ｃ１Ｒ細胞とともに、一晩インキュベートした。上清中のＭＩＰ−１βを、一晩のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＡによって定量化した。図示されるように、ＡＬＦ３細胞は、ＨＬＡ−Ａ２＋および必要なＣＤ８共受容体の補助に関して活性化したに過ぎない。 Ｄ−アミノ酸ペプチドＴ細胞アゴニストが、多機能性活性を有する交差反応性Ｔ細胞を刺激することが可能であることを示すグラフ表示を提供する。ＧＩＬ特異的ＣＴＬクローンＧＤ（ＡＬＦ３に類似のＴＲＡＶ１９＋クローン）を、様々な濃度の（Ａ）ＧＩＬ（Ｂ）ｇｐｐおよび（Ｃ）無関連ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＥＬＡ）でパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２＋標的細胞とともにインキュベートし、細胞内サイトカイン染色を用いて５つのエフェクター機能（ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦα）について同時に評価した。バーは、１０−４Ｍ（黒色のバー）または１０−５Ｍ（灰色のバー）のアゴニストで刺激したときに測定される、５つの機能のそれぞれを発現するＣＴＬ細胞のパーセンテージを示す。（Ｄ）円グラフは、１０−４Ｍまたは１０−５Ｍでのアゴニスト刺激に応答する、５つの機能（赤色）、４つの機能（オレンジ色）、３つの機能（黄色）、２つの機能（緑色）、１つの機能（青色）から、機能なし（灰色）までの範囲の数の機能を行うＣＴＬ細胞の割合を示す。 合成Ｔ細胞アゴニストが、重複するＴＣＲレパートリーを有する同様の数のメモリーエフェクターをプライムする、グラフ表示を示す。（Ａ）健常成人ＨＬＡ−Ａ２＋ＰＢＭＣを、ＧＩＬまたはｇｐｐのいずれかでプライムし、１０日間にわたってインビトロで培養した。抗原特異的細胞を、フローサイトメトリーを用いて、ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ四量体とともに定量化した。総ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが示される。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照が示される。（Ｂ）ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞エフェクターを、低下する標的対エフェクター比率でインフルエンザＭ１タンパク質を発現する５１Ｃｒ標識Ｃ１Ｒ−ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と組み合わせた。標的溶解を、液体シンチレータにおいて上清を用いて定量化した。（Ｃ）ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞エフェクターを、１０−６ＭのＧＩＬペプチドでパルスされたＣＦＳＥ標識ＣＩＲ−Ａ２＋標的と組み合わせた。標的溶解を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞培養物からのＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ四量体陽性細胞を、高純度（＞９８％）にソートし、定量的テンプレートスイッチアンカー（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｗｉｔｃｈ ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＴＣＲ ＲＴ−ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒシーケンシングを用いてクローン型を分類した（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｄ）。（Ｄ）独自のクローン型（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）の数を、各ドナーにわたって各実験条件について計算した。３つの健常な遺伝的に無関係のドナーにわたるＧＩＬ−およびｇｐｐでプライムされたＴ細胞についての総ＴＲＢＶ使用（Ｅ）およびＴＲＢＪ使用（Ｆ）が示される。各ドナーについてのインフレームクローン型の総数が示される。ランダムな配列サンプリングを行って、各ドナーにわたって各実験条件について等しい数のクローン型を産生した。ｎｓ：非有意。 合成Ｔ細胞アゴニストが、重複するＴＣＲレパートリーを有する同様の数のメモリーエフェクターをプライムする、グラフ表示を示す。（Ａ）健常成人ＨＬＡ−Ａ２＋ＰＢＭＣを、ＧＩＬまたはｇｐｐのいずれかでプライムし、１０日間にわたってインビトロで培養した。抗原特異的細胞を、フローサイトメトリーを用いて、ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ四量体とともに定量化した。総ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが示される。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照が示される。（Ｂ）ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞エフェクターを、低下する標的対エフェクター比率でインフルエンザＭ１タンパク質を発現する５１Ｃｒ標識Ｃ１Ｒ−ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と組み合わせた。標的溶解を、液体シンチレータにおいて上清を用いて定量化した。（Ｃ）ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞エフェクターを、１０−６ＭのＧＩＬペプチドでパルスされたＣＦＳＥ標識ＣＩＲ−Ａ２＋標的と組み合わせた。標的溶解を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞培養物からのＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ四量体陽性細胞を、高純度（＞９８％）にソートし、定量的テンプレートスイッチアンカー（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｗｉｔｃｈ ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＴＣＲ ＲＴ−ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒシーケンシングを用いてクローン型を分類した（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｄ）。（Ｄ）独自のクローン型（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）の数を、各ドナーにわたって各実験条件について計算した。３つの健常な遺伝的に無関係のドナーにわたるＧＩＬ−およびｇｐｐでプライムされたＴ細胞についての総ＴＲＢＶ使用（Ｅ）およびＴＲＢＪ使用（Ｆ）が示される。各ドナーについてのインフレームクローン型の総数が示される。ランダムな配列サンプリングを行って、各ドナーにわたって各実験条件について等しい数のクローン型を産生した。ｎｓ：非有意。 合成Ｔ細胞アゴニストが、重複するＴＣＲレパートリーを有する同様の数のメモリーエフェクターをプライムする、グラフ表示を示す。（Ａ）健常成人ＨＬＡ−Ａ２＋ＰＢＭＣを、ＧＩＬまたはｇｐｐのいずれかでプライムし、１０日間にわたってインビトロで培養した。抗原特異的細胞を、フローサイトメトリーを用いて、ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ四量体とともに定量化した。総ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが示される。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照が示される。（Ｂ）ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞エフェクターを、低下する標的対エフェクター比率でインフルエンザＭ１タンパク質を発現する５１Ｃｒ標識Ｃ１Ｒ−ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と組み合わせた。標的溶解を、液体シンチレータにおいて上清を用いて定量化した。（Ｃ）ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞エフェクターを、１０−６ＭのＧＩＬペプチドでパルスされたＣＦＳＥ標識ＣＩＲ−Ａ２＋標的と組み合わせた。標的溶解を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ＧＩＬ−またはｇｐｐでプライムされたＴ細胞培養物からのＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ四量体陽性細胞を、高純度（＞９８％）にソートし、定量的テンプレートスイッチアンカー（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｗｉｔｃｈ ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＴＣＲ ＲＴ−ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒシーケンシングを用いてクローン型を分類した（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｄ）。（Ｄ）独自のクローン型（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）の数を、各ドナーにわたって各実験条件について計算した。３つの健常な遺伝的に無関係のドナーにわたるＧＩＬ−およびｇｐｐでプライムされたＴ細胞についての総ＴＲＢＶ使用（Ｅ）およびＴＲＢＪ使用（Ｆ）が示される。各ドナーについてのインフレームクローン型の総数が示される。ランダムな配列サンプリングを行って、各ドナーにわたって各実験条件について等しい数のクローン型を産生した。ｎｓ：非有意。 天然および合成Ｔ細胞ペプチドアゴニストが、類似の全体的な構造配置を形成し得ることを示すグラフィカルモデルを提供する。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２結合裂け目（灰色のカトゥーン）中のＧＩＬペプチド（オレンジ色のスティック）の側面図。位置４と７との間の中央の突出部を強調したペプチド残基が示される。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２結合裂け目（灰色のカトゥーン）中のＤ−アミノ酸アゴニストｇｐｐ（青色のスティック）の構造を、Ｗｉｎｃｏｏｔを用いて、ＪＭ２２−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ複合体（ＰＤＢ：ＩＯＧＡ）を用いてモデル化した。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２分子（灰色のカトゥーン）によって表されるＧＩＬペプチド（オレンジ色のスティック）およびｇｐｐアゴニスト（青色のスティック）の重ね合わせ。矢印は、残基４、５、６および８におけるＪＭ２２−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ複合体に基づいた主なＴＣＲ接触点を示す。 致死性インフルエンザウイルス感染に対する合成Ｔ細胞アゴニスト保護を用いた、ヒト化マウスのワクチン接種のグラフ表示を提供する。（Ａ）１００μｇのＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＧＩＬ、ｎ＝４）、ｇｐｐｑｗｎｎｐｐ（ｇｐｐ、ｎ＝４）またはＤＭＳＯ（モック、ｎ＝２）および１００μＬの不完全フロイントアジュバントのいずれかの皮下注射によって、ＨＨＤマウスをプライムし（０日目）、ブーストした（１４日目）。単一の細胞懸濁液を、２１日目に抽出された脾臓および末梢リンパ節（ＬＮ）から生成した。ＧＩＬ特異的細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによって検出し、ここで、細胞を、１０−５ＭのＧＩＬとともに、一晩インキュベートし、ＩＦＮ−γを産生する細胞の数を計数した。スポット形成単位（ＳＦＵ）の数を、ペプチド刺激なしの対照から得られたバックグラウンドを差し引くことによって正規化した。代表的なＥＬＩＳＰＯＴウェルが、各バーの下に示される。示される結果は、同様の結果で繰り返された単一の実験の結果である。（Ｂ）ＨＨＤマウスに、１００μｇのＧＩＬ（ｎ＝１７）、ｇｐｐ（ｎ＝２０）または非関連Ｌ−アミノ酸ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＥＬＡ、ｎ＝１７）および１００μＬの不完全フロイントアジュバントを皮下にワクチン接種し、１４日目に同じ処方でブーストした。別の群のマウスには、注射を与えなかった（ワクチン接種なし（ｎｏｔ ｖａｃ）、ｎ＝７）。マウスを、雌マウスについて５０ＰＦＵおよび雄マウスについて１００ＰＦＵで、２１日目にインフルエンザ株Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）に感染させ、マウスの体重を、次の８日間にわたって監視した。初期体重の２０％超を減量したマウスは、抗原投与で生存できなかったものと見なし、安楽死させた。ＮＳ、スチューデントのｔ検定によって有意に異なっていない（ｐ＝０．４）；＊は、ｐ＝０．０３を表し；＊＊は、ｐ＝０．００２を表す。
Figure 2019532103
１．定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい材料および材料が記載されている。本発明の趣旨では、以下の用語が、以下に定義される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
「約」または「およそ」およびそれらの文法的に同等の表現によって、参照数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、存在度、濃度、重量または長さに対して１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度異なる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、存在度、濃度、重量または長さを意味する。
本明細書において使用される際の「ＴＣＲアゴニスト」という用語は、ＴＣＲの機能に作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）あるいはそれを活性化または増大するように、成分に直接または間接的に作動するまたは拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）任意の薬剤を指す。ある実施形態において、ＴＣＲアゴニストは、ＴＣＲ機能に直接作動する。好適には、Ｄ−アミノ酸ペプチド抗原は、ＴＣＲと結合し、受容体を活性化することによって、ＴＣＲ機能に直接作動し得る。
「抗原」とは、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合可能な分子（例えば、タンパク質、ペプチド、または他の分子または高分子）の全てまたは一部を意味する。抗原は、さらに、免疫系によって認識可能であり得、および／またはＢ−および／またはＴ−リンパ球の活性化につながる、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を刺激または誘発することが可能であり得る。抗原は、１つまたは複数のエピトープ（Ｂ−およびＴ−エピトープ）を有し得る。本明細書において使用される際の抗原はまた、いくつかの個々の抗原の混合物であり得る。
本明細書において使用される際、「バイオアベイラビリティ」という用語は、対象に投与される所与の量の特定のペプチドの全身アベイラビリティを指す。バイオアベイラビリティは、投与される剤形からの全身循環に到達するペプチドの時間（速度）および総量（程度）の両方の測定を示す絶対的な用語である。バイオアベイラビリティは、曲線下の面積（ＡＵＣ）または哺乳動物への化合物の投与後の不変の形態のペプチドの最大血清もしくは血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することによって評価され得る。ＡＵＣは、横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対して縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清または血漿濃度をプロットする曲線下の面積の測定値である。一般に、特定の化合物についてのＡＵＣは、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．７２，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９６（その内容は、全体が参照により本明細書に援用される）に記載される、当業者に公知の方法を用いて計算され得る。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載される工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の包含を示唆するが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の除外を示唆しないことが理解されるであろう。したがって、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語の使用は、列挙される要素が必要または必須であるが、他の要素が任意選択であり、存在してもまたは存在しなくてもよいことを示す。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、「からなる」という語句の後に続くものが何であれ、それを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙される要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙される要素についての開示中に記載される活性または作用を妨げないかまたはそれに寄与する他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要または必須であるが、他の要素が任意選択であり、他の要素が列挙される要素の活性または作用に影響するか否かに応じて存在してもまたは存在しなくてもよいことを示す。
免疫応答を調節するか、または疾患または病態を処置もしくは予防する文脈において、「有効量」とは、調節、処置または予防に有効な、単一用量でまたは一連の用量の一部としての、それを必要とする個体への組成物の該当量の投与を意味する。有効量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類群、組成物の配合、医学的状況の評価、および他の関連する要因に応じて変化する。この量が日常的な試験によって決定され得る比較的広い範囲に入ることが予想される。
本明細書において使用される際、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識および活性化相ではなく、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を意味する。例示的な免疫細胞としては、骨髄またはリンパ系由来の細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞、および好塩基球が挙げられる。エフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。エフェクター細胞は、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発することができ、例えば、好中球は、ＡＤＣＣを誘発することが可能である。例えば、ＦｃαＲを発現する、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は、標的細胞の特異的死滅および免疫系の他の成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞、転移性癌細胞、または微生物も貪食し得る。
本明細書において使用される際の「排泄半減期」という用語は、対象の血漿からのペプチドの排泄の終端対数線形率（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ ｒａｔｅ）を指す。当業者は、半減期が、クリアランスおよび分布容積の両方の関数として変化する導出パラメータであることを理解するであろう。排泄半減期に関して使用される「長期の（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）」、「より長い（ｌｏｎｇｅｒ）」、または「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」という用語は、本明細書において同義的に使用され、同等の条件下で決定した際の、参照分子（例えば、Ｌ−アミノ酸ペプチド）の半減期と比べた、ペプチド（例えば、候補Ｄ−アミノ酸ペプチド）の半減期の統計的に有意な増加があることを意味することが意図される。
本明細書において使用される際、「免疫調節組成物」という用語は、組成物、または本発明の組成物を含有し、任意の脊椎動物、好ましくは、動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに投与可能な形態である製剤を指す。典型的に、免疫調節組成物は、本発明の組成物が懸濁または溶解される従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体中の乾燥粉末を含むか、またはそれから調製される。この形態で、本発明の組成物を用いて、好都合に、病態を予防し、改善し、管理し、または他の形で処置することができる。宿主に導入されると、免疫調節組成物は、免疫応答、好ましくは、限定はされないが、抗体、サイトカインの産生、および／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、および／または他の細胞応答を含む検出可能な免疫応答を引き起こすことができる。本発明の免疫調節組成物は、インフルエンザペプチド配列、好ましくは、保存インフルエンザペプチド配列、より好ましくは、反復保存インフルエンザペプチド配列を含む。本発明の免疫調節組成物は、補助剤を含むか、または補助剤中もしくは補助剤とともに投与され得る。
本発明の文脈において、「充填（ｌｏａｄｉｎｇ）」という用語は、ＭＨＣ分子の抗原結合裂け目中のペプチドのアセンブリを意味する。
「から得られる」とは、例えば、ポリヌクレオチド抽出物またはポリペプチド抽出物などの試料が、特定の源から単離されるか、またはそれに由来することを意味する。
本明細書において同義的に使用される「患者」、「対象」、「宿主」または「個体」という用語は、処置または予防が必要とされる、任意の対象、特に、脊椎動物対象、さらにより具体的には、哺乳動物対象を指す。本発明の範囲内に含まれる好適な脊椎動物としては、限定はされないが、霊長類（例えば、ヒト、サルおよび類人猿を含む脊索動物（Ｃｈｏｒｄａｔａ）亜門の任意のメンバーが挙げられ、さらに、マカク属（Ｍａｃａｃａ）（例えば、マカク・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）などのカニクイザル、および／またはアカゲザル（マカク・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）））およびヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ））、ならびにマーモセット（カリスリクス属（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）の種）、リスザル（サイミリ属（Ｓａｉｍｉｒｉ）の種）およびタマリン（サグイヌス属（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）の種）などのサルの種、ならびにチンパンジー（パン・トログロディテス（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））などの類人猿の種、げっ歯類（例えば、マウス ラット、モルモット）、ウサギ目の動物（例えば、ウサギ、ノウサギ）、ウシ亜科の動物（例えば、ウシ）、ヒツジ属の動物（例えば、ヒツジ）、ヤギ亜科の動物（例えば、ヤギ）、ブタのような動物（例えば、ブタ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、イヌ科の動物（例えば、イヌ）、ネコ科の動物（例えば、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどなどのペットの鳥）、海洋性哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、は虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、および魚類が挙げられる。好ましい対象は、抗原特異的Ｔｈ２応答を刺激または誘発すること、抗原特異的Ｔｈ１応答の発生を抑制すること、選択的に活性化された表現型の抗原提示細胞における発生を刺激すること、炎症性刺激による抗原提示細胞の活性化を防止もしくは阻害すること、リポ多糖に結合すること、リポ多糖結合タンパク質へのリポ多糖の結合を防止もしくは阻害すること、抗原提示細胞へのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、リポ多糖）の結合を防止もしくは阻害すること、抗原提示細胞の細胞膜と相互作用すること、および抗原提示細胞内のソソーム機能を下方制御するかもしくは弱めることを必要とするヒト、または対象とする抗原の存在または異常な発現に関連することが多い、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植に関連する疾患を含む、望ましくないまたは有害な免疫応答の処置または予防を必要とするヒトである。しかしながら、上記の用語は、症状が存在することを示唆しないことが理解されるであろう。
本明細書において使用される際の「ペプチド混合物」という用語は、異なるペプチドの混合物を指す。典型的に、混合物中のペプチドは、少なくとも１つの共通の特徴を有し、例えば、全てが、ペプチドの特定の位置において一定のＤ−アミノ酸を有する。ペプチド混合物は、典型的に、固定された位置以外のペプチドの各位置においてアミノ酸の変異にわたる十分な数のペプチドを含む。ペプチド混合物中の個々のペプチドの同一性は、特に、ペプチド混合物に含まれる全てのペプチド間で均一な特徴を調べるためにペプチド混合物を用いるとき、知られているかまたは完全に特徴付けられている必要はない。
本明細書において使用される際の「ペプチドセット」、「セット」などの用語は、特定のスクリーニング方法を行うためにまとめられた複数の別個のペプチド組成物を指す。例えば、アミノ酸配列の第１の位置において異なるアミノ酸の認識を調べるのに使用されるペプチドセットは、典型的に、調べられるアミノ酸と同じ数の別個のペプチド組成物を含み、セット中の個々のペプチド組成物は、その配列の第１の位置において異なるアミノ酸を有するであろう。
「薬学的に許容できる担体」とは、動物、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物への局所または全身投与において安全に使用され得る、固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」および「タンパク性分子」は、アミノ酸残基のポリマーを含むかまたはそれからなる分子、ならびにその変異体および合成類似体を指すために、本明細書において同義的に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、例えば、対応する天然アミノ酸の化学的類似体、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書において使用される際の「標的細胞」という用語は、ＭＨＣ分子（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞を含むＡＰＣ）の抗原結合溝において標的抗原またはＤ−アミノ酸ペプチドＴ細胞アゴニストに結合する任意の細胞を指す。
「Ｔｈ１」という用語は、特に、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を産生し、抗原投与に対する細胞応答、すなわち、非免疫グロブリン応答に関連する炎症反応を引き起こす、Ｔヘルパー細胞のサブクラスを指す。したがって、Ｔｈ１サイトカイン応答またはＴ１サイトカイン応答は、最も顕著な特徴が、活性化がない場合のこれらのサイトカイン量と比べて、増加したレベルのＴ１サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなど）に関連する十分なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性化を含む免疫応答を包含する。Ｔ１サイトカイン応答は、他の白血球および非白血球からのＴ１サイトカインの産生も指すことがある。Ｔｈ１サイトカイン応答は、Ｔｃ１と呼ばれる、Ｔ１サイトカイン産生を含む十分なＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球活性を含み得る。Ｔｈ１応答は、典型的に、ＣＤ４「Ｔｈ１」Ｔ−ヘルパー細胞によって促進されるが、Ｔｈ１応答は、ＣＤ８ Ｔｃ１ Ｔ細胞傷害性細胞を含み得る。
本明細書において使用される際、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する悪影響の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書において使用される際の「処置」は、哺乳動物、特に、ヒトの疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患に罹患しやすいが、疾患に罹患しているとまだ診断されていない対象から発生する疾患を予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を抑止すること；および（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の軽減を引き起こすことを含む。
２．略語
以下の略語が、本出願全体を通して使用される。
ｎｔ＝ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）
ｎｔｓ＝ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）
ａａ＝アミノ酸
ｋｂ＝キロベースまたはキロベース対
ｋＤａ＝キロダルトン
ｄ＝日
ｈ＝時間
ｓ＝秒
ＡＰＣ＝抗原提示細胞
ＣＰＬ＝コンビナトリアルペプチドライブラリー
ＭＨＣ＝主要組織適合遺伝子複合体
ＴＣＲ＝Ｔ細胞受容体
３．コンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）
本発明は、新規なＤ−アミノ酸ペプチドが、機能的Ｔ細胞応答を生じる天然Ｌ−アミノ酸ペプチドと同程度に有効であるが、配列類似性を（あったとしても）ほとんど示さないという実証に部分的に基づくものである。本発明者らは、合理的なスクリーニング方法を採用せずに、Ｄ−アミノ酸ペプチドが、単に予測によって同定することができないことを認識した。したがって、本発明は、機能的および抗原特異的Ｔ細胞応答を生じ得る新規なペプチドを同定するのに使用され得るＤ−アミノ酸ペプチドライブラリーを作成しようとするものである。新たに同定されたＤ−アミノ酸ペプチドＴ細胞アゴニストは、促進された免疫応答が有益であるいくつもの疾患を処置するのに有用であろうと考えられる。
したがって、本発明は、Ｔ細胞ＴＣＲによる認識のための新規なＤ−アミノ酸ペプチドをスクリーニングするのに有用なコンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）を提供する。認識のレベルは、細胞免疫原性、またはＭＨＣ分子に関してＴ細胞特異的ペプチドを提示するＡＰＣを溶解させる能力を含む、上述されるかまたは以下にさらに詳細に記載される任意の手段によって特性評価され得る。完全なＣＰＬを作成することによって、単一のアミノ酸置換と比較して一般的によりロバストなアプローチが得られる。本発明のＣＰＬは、多重置換ペプチドの同時の大規模なアレイを生成するためにコンビナトリアルケミストリーを利用する。上記および本明細書の他の箇所に記載されるＴ細胞アゴニストを調べるためのＣＰＬアプローチから得られる情報は、Ｔ細胞アゴニストであるＤ−アミノ酸ペプチドを同定するためのペプチド免疫原性の他の評価から得られる情報と組み合わされ得る。
本発明のＣＰＬは、位置走査型（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ−ｔｙｐｅ）ＣＰＬ実験を好都合に容易にする。これらの方法は、多数のＤ−アミノ酸ペプチドをスクリーニングし、それによって、Ｄ−アミノ酸ペプチドの各位置におけるＴＣＲ認識に関する情報を得るための好都合で合理的なプラットフォームを提供する。重要なことに、位置走査によるスクリーニングは、ペプチドの特定の位置におけるペプチド配列の変化と、免疫原性の関連する変化との間の明らかな相関が形成されるのを可能にする。
ＣＰＬスクリーニングの重要な特性は、ペプチド配列の全ての位置において全ての可能なＤ−アミノ酸組合せを同時に走査する能力である。このプロセスは、単一の位置において特定的になされる指向性の（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）アミノ酸置換より適切な（より良好に認識される）多くのＤ−アミノ酸を同定し得る。位置走査フォーマットを用いた最近の研究により、天然ペプチドの結合親和性さえ超える強力なＬ−アミノ酸ペプチドが同定された。これらの過去の報告の焦点は、新たなＴ細胞アゴニストを発見すること、または個々の近交系マウス株、もしくはヒト細胞クローンに特異的な既存のエピトープ免疫原性を促進することのいずれかであった（Ｇｕｎｄｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３６４５−３６５２；Ｈｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３６３１−３６３６；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６４２４−６４３４によって記載されるように）。
好ましくは、ＣＰＬは、体系的に定義された特定の位置（「インデックス位置」）を有する、均一な長さのペプチドから構成される。典型的なＣＰＬは、ペプチドの長さに沿って各位置にペプチドセットを含む。
例えば、八量体（８−ｍｅｒ）ＣＰＬは、８つの独立したペプチドセットを含み、Ｏ１ＸＸＸＸＸＸＸ、ＸＯ２ＸＸＸＸＸＸ、ＸＸＯ３ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＯ４ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＯ５ＸＸＸ、ＸＸＸＸＸＯ６ＸＸ、ＸＸＸＸＸＯ７Ｘ、ＸＸＸＸＸＸＸＯ８として表され、ここで、Ｏ１〜Ｏ８はそれぞれ、定義されたＤ−アミノ酸が占める位置を表し、Ｘは、ランダムなＤ−アミノ酸が占める位置を表す。
別の例において、九量体（９−ｍｅｒ）ＣＰＬは、９つの独立したペプチドセットを含み、Ｏ１ＸＸＸＸＸＸＸＸ、ＸＯ２ＸＸＸＸＸＸＸ、ＸＸＯ３ＸＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＯ４ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＯ５ＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＸＯ６ＸＸＸ、ＸＸＸＸＸＸＯ７ＸＸ、ＸＸＸＸＸＸＸＯ８Ｘ、ＸＸＸＸＸＸＸＸＯ９として表され；ここで、Ｏ１〜Ｏ９はそれぞれ、定義されたＤ−アミノ酸が占める位置を表し、Ｘは、ランダムなＤ−アミノ酸が占める位置を表す。
さらに別の例において、十量体（１０−ｍｅｒ）ＣＰＬは、１０の独立したペプチドセットを含み、Ｏ１ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ、ＸＯ２ＸＸＸＸＸＸＸＸ、ＸＸＯ３ＸＸＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＯ４ＸＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＯ５ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＸＯ６ＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＸＸＯ７ＸＸＸ、ＸＸＸＸＸＸＸＯ８ＸＸ、ＸＸＸＸＸＸＸＸＯ９Ｘ、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＯ１０として表され、ここで、Ｏ１〜Ｏ１０はそれぞれ、定義されたＤ−アミノ酸が占める位置を表し、Ｘは、ランダムなＤ−アミノ酸が占める位置を表す。
ＣＰＬ中の各ペプチドセットは、複数のペプチド混合物を含み、各ペプチド混合物は、「Ｏ」位置を占める異なるＤ−アミノ酸を有する。ＣＰＬのスクリーニングは、Ｔ細胞クローンによる候補ペプチドの各位置における各異なるＤ−アミノ酸の認識についての情報を提供し得る。
３．１ ＣＰＬの生成
Ｔ細胞クローンによって認識されるＤ−アミノ酸ペプチドの長さを定義することは、適切なＣＰＬを設計および／または選択する際の典型的な出発点である。例えば、ＣＰＬが、Ｔ細胞クローンＡＬＦ３によって認識されるＤ−アミノ酸ペプチドを同定するように構築されている場合、九量体である天然エピトープ（すなわち、マトリックスＭ１タンパク質からのＧＩＬＧＦＶＦＴＬ５８〜６６ペプチド、配列番号１）の長さを考慮するであろう。したがって、この例示的な例において、九量体ペプチドＣＰＬが選択されるであろう。ペプチド混合物からの測定可能な細胞傷害性活性は、単一の定義された一定のＤ−アミノ酸が、標的抗原特異的ＴＣＲによって認識され、それによって、所望のＴ細胞応答を誘発することを示す。
ＣＰＬのペプチド長さが決定されたら、ライブラリーは、当該技術分野において公知の任意の手段を用いて合成され得る。例えば、ある実施形態において、ペプチドは、固相ペプチド合成（このタイプの例示的な方法は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｈｅａｔｉｎｇ ｉｎ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ４１：１８２６−１８４４に記載されている）、マイクロチップによる産生（Ｓｃｈｉｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００９によって記載されているものと同様の技術を用いて）、または固体マトリックス中のモノマーのレーザーによる転移（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５によって記載されているものなど）から選択される方法によって合成される。コンビナトリアルペプチドを産生するための無細胞系の最近の開発を考慮すると、拡張された遺伝子コードの利用は、本発明とともに使用するのに好適であり得る。このような方法は、例えば、Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．，２００５，９９（５）：４７３−６によって記載されている。したがって、ある実施形態において、本発明のＣＰＬは、リボザイムベースの産生方法（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００４によって一般に記載されている）を用いて調製され得る。
Ｔ細胞は、ＣＰＬを用いた任意のスクリーニング実験を行う前に、ＭＨＣ分子に関してペプチド抗原を認識し、適切なＭＨＣ分子の抗原結合裂け目は、ＣＰＬのペプチド混合物中に存在するペプチドで充填され得る。ペプチドを、ＭＨＣ抗原結合裂け目に充填する方法は、当該技術分野において周知である。選択されるＭＨＣ分子は、行われるスクリーニング実験に基づいて選択される。すなわち、ＭＨＣ分子は、Ｄ−アミノ酸ペプチド認識を評価する同種抗原特異的ＴＣＲによって認識されなければならない。特定の実施形態において、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）、非古典的ＭＨＣ、そのホモオリゴマー、そのヘテロオリゴマー、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ＭＨＣ分子は、任意の脊椎動物種、例えば、霊長類種、特に、ヒト；げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびウサギを含む）；ウマ科の動物、ウシ亜科の動物、イヌ科の動物、ネコ科の動物などに由来し得る。特に対象となるのは、ヒトＨＬＡ分子、およびマウスＨ−２分子である。ＨＬＡ分子に含まれるのは、ＭＨＣ−Ｉ分子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびβ２−ミクログロブリンであり；ＭＨＣ−ＩＩ分子は、サブユニットＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβを含む。さらに、マウスＨ−２分子は、ＭＨＣ−Ｉ Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、およびＭＨＣ−ＩＩ Ｉ−Ａα、Ｉ−Ａβ、Ｉ−Ｅα、およびＩ−Ｅβ、およびβ２−ミクログロブリンを含む。いくつかの代表的なＭＨＣ分子のアミノ酸配列は、欧州特許第８１２ ３３１号明細書において言及されている。また、本発明の範囲内に含まれるのは、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＱａ１などの非古典的分子である。
例示的な方法において、ＭＨＣ分子は、約４時間〜約６時間、または約２時間〜約３時間にわたって、提示されるペプチドとともにインキュベートされ得る。このようなインキュベーションでは、約１００μＭの総ペプチド混合物濃度が好適であるが、これは変動し得る。一般に、約１μＭ〜約５００μＭが、典型的に使用され得る。理想的に、Ｄ−アミノ酸ペプチドの濃度は、ＭＨＣ分子を飽和し、したがって、ペプチドを、ＭＨＣ分子の抗原結合溝内に十分に結合するのに十分である。しかしながら、ペプチドを、ＭＨＣ分子の抗原結合裂け目に充填する多くの方法が、当該技術分野において公知であり、そのうちのいずれかが、本発明とともに使用され得る。
４．Ｄ−アミノ酸Ｔ細胞ペプチドアゴニストを同定する方法
４．１ スクリーニング方法へのＣＰＬの組み込み
Ｔ細胞アゴニスト活性を示すＤ−アミノ酸ペプチドを同定するために、ＣＰＬは、スクリーニング方法に組み込まれ得る。したがって、特定の実施形態において、本発明は、標的抗原に対する免疫応答を引き起こすことが可能なＴ細胞ペプチドアゴニストを同定するための方法であって、
上記および本明細書の他の箇所に記載されるＣＰＬを、対象とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することが知られているＭＨＣクラスＩ分子に提供する工程であって、ＣＰＬが、複数のペプチドセットであって、各セットがペプチドの異なるアミノ酸位置（「インデックス位置」）を調べる複数のペプチドセットと、複数の別個のペプチド混合物とを含み、ここで、各混合物が、インデックス位置において単一の定義されたＤ−アミノ酸（すなわち、ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉ、ｆ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖ、ｗ、ｙ、またはそれらの修飾形態）を有し、一つ置きの位置が、ランダムＤ−アミノ酸であり、セットの数が、ペプチド中に存在する位置の数に等しい、工程と；
各ＭＨＣおよびペプチド混合物を、標的抗原に結合することが知られているＴＣＲと接触させて、ペプチドの各インデックス位置において認識されるＤ−アミノ酸を決定する工程と；
各インデックス位置において認識されるＤ−アミノ酸を選択することによって、アミノ酸配列を生成して、それによって、標的抗原に対する免疫応答を引き起こすかまたは促進するＴＣＲアゴニストを同定する工程と
を含む方法を含む。
ある実施形態において、本発明の方法は、無細胞アッセイとして行われ得る。これらの無細胞アッセイの実施形態において、ＭＨＣ分子は、一般に、通常、膜結合されたタンパク質の可溶性形態に対応する。ＭＨＣ−Ｉサブユニットのために、可溶性形態は、膜貫通および細胞質ドメインの欠失によって、天然形態から得られる。これらの実施形態において、ＭＨＣは、典型的に、リフォールディングされる前に、組み換えにより産生され、対象とするＤ−アミノ酸ペプチド（またはペプチド混合物）の存在下で精製される。ＭＨＣ−ペプチド複合体のための標準的な産生プロトコルが適用され得る。これらの方法は、一般に、好適なリフォールディング緩衝液中で、不溶性ＭＨＣを、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）およびペプチド（またはペプチド混合物）と一緒にリフォールディングすることを含む。次に、リフォールディング緩衝液およびタンパク質混合物は、精製により好都合な体積（例えば、約５０ｍＬ、約３０ｍＬ、約２０ｍＬ、約１０ｍＬ、約７ｍＬ、約５ｍＬまたは約２ｍＬ）になるまで好適には濃縮される。次に、濃縮されたタンパク質混合物は、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン排除クロマトグラフィーによって精製され得る。ペプチド抗原を、ＭＨＣ分子の抗原結合裂け目に充填する他の方法が、当該技術分野において周知であり、任意の好適な方法が使用され得る。特に、ＭＨＣ−Ｉ分子を精製するのに好適な方法の詳細な説明が、国際ＰＣＴ公開番号国際公開第２００６／１０３４０６号パンフレットにおいて提供されており、その開示内容が、参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、ＭＨＣ分子は、標的細胞（例えば、ＡＰＣ）の細胞表面に位置する。例示的な例として、Ｔ２細胞は、ＨＬＡ Ａ２ ＭＨＣ−Ｉ分子を発現する好適なＡＰＣとして使用され得る。Ｔ２細胞は、抗原プロセシング（ＴＡＰ）に関連するトランスポータを欠いており、したがって、外因性ペプチド抗原の添加が、ＭＨＣ−Ｉの安定した細胞表面発現のために必要とされる。しかしながら、他の細胞株では、ＡＰＣは、ＭＨＣ中の内因性ペプチドを提示し得、内因性ペプチドは、分子の抗原結合裂け目から「取り除かれる」必要がある。これは、特定のペプチドまたはペプチド混合物中に存在するペプチドを再充填する前に、短期間にわたって低いｐＨ（例えば、ｐＨ２〜３）で細胞をインキュベートすることによって行われ得る。
４．１．１．ＡＰＣおよびそれらの前駆体の源
ＡＰＣまたはそれらの前駆体は、当業者に公知の方法によって単離され得る。このような細胞の源は、Ｄ−アミノ酸ペプチドが有することが予想される機能の性質に応じて必要とされるＡＰＣに応じて異なる。例えば、同定されたペプチドの予想される機能は、インフルエンザからのマトリックスＩタンパク質に対する免疫応答を引き起こし得る。これに関して、ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、単球および骨髄細胞系列の他の細胞から選択され得る。
典型的に、ＡＰＣの前駆体は、任意の組織から単離され得るが、血液、臍帯血または骨髄から最も容易に単離される（Ｓｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２９，１２８９−１２９４；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．９，４５３−４６４）。リウマチ性滑膜組織または生検もしくは関節液吸引（ｊｏｉｎｔ ｔａｐ）後の体液などの、罹患組織から好適な前駆体を得ることも可能である（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ａ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３，４０１６−４０２８；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ｂ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３７（４））。他の例としては、限定はされないが、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、胃腸およびへんとう腺が挙げられる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７９，１８２３−１８３４；ＭｃＩｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｌｏｏｄ ９７，３４７０−３４７７；Ｖｒｅｍｅｃ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，５６５−５７３；Ｈａｒｔ ａｎｄ Ｆａｂｒｅ，１９８１，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１５４（２），３４７−３６１；Ｈａｒｔ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，１９８８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１６８（１），１５７−１７０；Ｐａｖｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７０（１），４０−４７）。
組織から直接単離された白血球は、ＡＰＣ前駆体の主な源を提供する。典型的に、これらの前駆体は、様々な成長因子の存在または非存在下で培養することによって、ＡＰＣへと分化することができるに過ぎない。本発明の実施によれば、ＡＰＣは、粗混合物からまたは前駆体の部分的にもしくは実質的に精製された調製物からそのように分化され得る。白血球は、例えば、好中球および赤血球（末梢血単核細胞またはＰＢＭＣ）を取り除くフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ）を用いた密度勾配遠心分離によって、または赤血球（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅまたはｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））の塩化アンモニウム溶解によって、血液または骨髄から好都合に精製され得る。ＡＰＣの多くの前駆体は、特定のサイトカインの存在下で培養することによって、マクロファージおよび樹状細胞を含む特定のＡＰＣへと分化され得る、非増殖単球のような末梢血中に存在する。
組織樹状細胞またはランゲルハンス細胞の前駆体などの組織由来の前駆体は、典型的に、組織（例えば、表皮の基底層）を細かくし、それをコラゲナーゼまたはディスパーゼで消化した後、密度勾配分離、または細胞表面マーカーのそれらの発現に基づいた前駆体の選択によって得られる。例えば、ランゲルハンス細胞前駆体は、ＣＤ１分子ならびにＨＬＡ−ＤＲを発現し、これに基づいて精製され得る。
ある実施形態において、ＡＰＣ前駆体は、マクロファージの前駆体である。一般に、これらの前駆体は、任意の源の単球から得られ、培地およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で、持続したインキュベーションによって、マクロファージへと分化され得る（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ８，３４６−３５６；Ｍｅｔｃａｌｆ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，１９８２，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１，２７５−２８３）。
他の実施形態において、抗原提示細胞前駆体は、ランゲルハンス細胞の前駆体である。通常、ランゲルハンス細胞は、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−４／ＴＮＦαおよびＴＧＦβの存在下で、ヒト単球またはＣＤ３４＋骨髄前駆体から生成され得る（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８７，９６１−９６６；Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ，Ｂｌｏｏｄ ９０，１４２５−１４３４；Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂ，ｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．４１７，１６１−１６５；Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，１４９９−１５０７）。
さらに他の実施形態において、ＡＰＣ前駆体は、樹状細胞の前駆体である。いくつかの潜在的な樹状細胞前駆体が、末梢血、臍帯血または骨髄から得られる。これらは、単球、ＣＤ３４＋幹細胞、顆粒球、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞前駆体、および後述される単分化能（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）骨髄性前駆細胞を含む。
単球：
単球は、組織培地（例えば、ＲＰＭＩ）および血清（例えば、ヒトまたはウシ胎仔血清）の存在下で、または無血清培地中で、１〜２時間にわたって、プラスチックへの接着によって精製され得る（Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７，１１６−１２１；Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１４，６８１−６８９；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８６，３８５−３９２；Ｎｅｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ Ｍｅｄ．４，３２８−３３２；Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．１９６，１３７−１５１；Ｔｈｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３，１−１５）。単球はまた、末梢血から浄化され得る（Ｇａｒｄｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０，５５３−５６７）。単球はまた、免疫磁性選択、フローサイトメトリーソーティングまたはパンニングを含む免疫親和性技術（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１、上記；Ｂａｔｔｙｅ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｍａｎ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，２３８−２４１）によって、抗ＣＤ１４抗体を用いて精製されて、ＣＤ１４ｈｉ細胞が得られる。循環血液中の単球の数（したがって収量）は、ＧＭ−ＣＳＦを含む様々なサイトカインの生体内での使用によって高められ得る（Ｇｒｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３１７，５９３−５９８；Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．５８，６３４−６４２）。単球は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、持続したインキュベーションによって、樹状細胞へと分化され得る（Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８０，８３−９３；Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，上記）。約２００〜約２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは、約５００〜約１０００Ｕ／ｍＬ、さらにより好ましくは、約８００Ｕ／ｍＬ（ＧＭ−ＣＳＦ）〜１０００Ｕ／ｍＬ（ＩＬ−４）のそれぞれの濃度のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組合せは、有意量の未熟樹状細胞、すなわち、抗原捕捉貪食樹状細胞を産生する。抗原捕捉貪食樹状細胞への単球の分化を促進する他のサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１３が挙げられる。
ＣＤ３４＋幹細胞：
樹状細胞はまた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα±幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔＬ）、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４±ｆｌｔ３Ｌの存在下で、ＣＤ３４＋骨髄由来前駆体から生成され得る（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２０，２４７−５３；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８，２８０−２９２；Ｌｏｕｄｏｖａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０，５６９−５７８）。ＣＤ３４＋細胞は、骨髄穿刺液または血液に由来することができ、例えば、免疫磁性選択またはイムノカラム（ｉｍｍｕｎｏｃｏｌｕｍｎ）を用いて、単球について濃縮することができる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．１７５，２４７−２５７）。血液中のＣＤ３４＋細胞の割合は、（最も一般的な）Ｇ−ＣＳＦ、さらにはｆｌｔ３Ｌおよびプロゲニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）を含む様々なサイトカインの生体内での使用によって高められ得る（Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２９，９４３−９５１；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，５６６−５７２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．９，７１１−７２０）。
他の骨髄性前駆細胞：
樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４／ＴＮＦの存在下で、ＣＤ３４＋幹細胞と同様の方法で、単分化能初期骨髄性前駆細胞から生成され得る。このような骨髄性前駆体は、炎症時に、関節リウマチ滑膜液を含む多くの組織に浸潤する（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，１７５８−１７６８）。循環血液中の樹状細胞前駆体および単球を含む全身の骨髄細胞の増殖が、ｆｌｔ−３リガンド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）またはプロゲニポエチン（ｐｒｏ−ＧＰ）を含むいくつかのサイトカインで達成され得る（Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１、上記；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００、上記；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００、上記）。ヒトまたは他の哺乳動物への数日間にわたるこのようなサイトカインの投与は、インビトロ操作のために、はるかに多数の前駆体を、末梢血または骨髄から得ることを可能にする。樹状細胞はまた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦαの存在下で、末梢血好中球前駆体から生成され得る（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）４７，４３−５４；Ｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８７，１０１９−１０２８）。樹状細胞はまた、急性骨髄性白血病細胞から、同様の方法を用いて生成され得ることが留意されるべきである（Ｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．７９，３５５−３６２）。
組織樹状細胞前駆体およびＡＰＣ前駆体の他の源：
樹状細胞生成のための他の方法は、例えば、ＩＬ−３＋／−ＧＭ−ＣＳＦの存在下での胸腺前駆体、およびＧＭ−ＣＳＦおよびコラーゲン基質の存在下での肝臓樹状細胞前駆体によるものである。形質転換されたまたは不死化された樹状細胞株が、例えば、（Ｐａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７８（６）：１８９３−１９０１）によって記載されるようにｖ−ｍｙｃなどの癌遺伝子を用いて、またはｍｙｂ（Ｂａｎｙｅｒ ａｎｄ Ｈａｐｅｌ，１９９９，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．６６（２）：２１７−２２３；Ｇｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｌｏｏｄ．８２（９）：２８１３−２８２２）によって産生され得る。
循環血液中の樹状細胞前駆体：
これらは、ヒトおよびマウス末梢血において記載されている。好適な樹状細胞前駆体を同定するための特定の細胞表面マーカーを利用することもできる。具体的には、樹状細胞前駆体の様々な集団が、ＣＤ１１ｃの発現、およびＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６およびＣＤ３の非存在または低発現によって、血液中で同定され得る（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８２，４８７−４９３；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７８，１０６７−１０７８）。これらの細胞はまた、細胞表面マーカーＣＤ１３およびＣＤ３３によって同定され得る（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３ｂ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１２），６８４０−６８５２）。形質細胞様樹状細胞前駆体として知られている、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６およびＣＤ３を欠いた第２のサブセットは、ＣＤ１１ｃを発現せず、ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒ鎖）およびＨＬＡ−ＤＲを発現する（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５９，２３７−２４３；Ｇｒｏｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８５，１１０１−１１１１；Ｒｉｓｓｏａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３，１１８３−１１８６）。ほとんどの循環血液中のＣＤ１１ｃ＋樹状細胞前駆体は、ＨＬＡ−ＤＲ＋であるが、一部の前駆体は、ＨＬＡ−ＤＲ−であり得る。ＭＨＣクラスＩＩ発現の欠如は、末梢血樹状細胞前駆体について明らかに示されている（ｄｅｌ Ｈｏｙｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５，１０４３−１０４７）。
任意選択的に、上述されるＣＤ３３＋ＣＤ１４−／ｌｏまたはＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋系統マーカー陰性樹状細胞前駆体は、培地中または単球条件培地中で、１８〜３６時間にわたるインキュベーションによって、より成熟したＡＰＣへと分化され得る（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３ｂ、上記；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｌｉｐｓｋｙ，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３，４０１６−４０２８；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３、上記）。あるいは、末梢血非Ｔ細胞または非精製ＰＢＭＣのインキュベーションの後、成熟末梢血樹状細胞は、低密度によって特徴付けられ、したがって、メトリザミドおよびＮｙｃｏｄｅｎｚを含む、密度勾配（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，１９９０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７，７６９８−７７０２；Ｖｒｅｍｅｃ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｍａｎ，１９９７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，５６５−５７３）を用いて、または限定はされないが、ＣＭＲＦ−４４ ｍＡｂなどの特定のモノクローナル抗体（Ｆｅａｒｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ ９３，７２８−７３６；Ｖｕｃｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２６，１２５５−１２６４）によって精製され得る。形質細胞様樹状細胞は、細胞表面マーカーに基づいて、末梢血から直接精製され得、次に、ＩＬ−３の存在下でインキュベートされ得る（Ｇｒｏｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７、上記；Ｒｉｓｓｏａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、上記）。あるいは、形質細胞様ＤＣが、上記のように、密度勾配またはインキュベートされた末梢血細胞のＣＭＲＦ−４４選択から得られる。
一般に、任意の前駆体から生成される樹状細胞では、単球由来サイトカイン、リポ多糖およびＤＮＡ含有ＣｐＧリピート、サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、壊死細胞、再接着、全細菌、膜成分、ＲＮＡまたはポリＩＣなどの活性化因子の存在下でインキュベートされると、未熟樹状細胞は、活性化される（Ｃｌａｒｋ，２００２，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．７１，３８８−４００；Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５，２４５−２５１；Ｋａｉｓｈｏ ａｎｄ Ａｋｉｒａ，２００２，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５８９，１−１３；Ｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，１７９−１８９０。樹状細胞活性化のこのプロセスは、ＮＦ−κＢ阻害剤の存在下で阻害される（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，５４９１−５４９８）。
４．１．２．エフェクター細胞
本発明のスクリーニング方法は、一般に、ＭＨＣ分子によって提示される標的抗原を特異的に認識することが可能である、Ｔ細胞クローンまたは細胞株などのエフェクター細胞を含む。Ｔ細胞株およびクローンを生成するためのいくつかの方法が、当該技術分野において公知である。
本発明の方法に使用するための細胞傷害性Ｔ細胞は、限定はされないが、末梢血（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物）、解離された臓器もしくは組織（腫瘍を含む）、滑膜液（例えば、関節炎の関節からの）、癌患者からの腹水もしくは胸水、脳脊髄液などを含む、Ｔ細胞を含有する実質的にあらゆる源から得られる。特定の対象とする源は、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染などの疾患に罹患された組織を含む。特定の実施形態において、使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明の方法に使用され、クローン集団またはほぼクローン集団として提供される。このような集団は、従来の技術、例えば、マイクロタイタープレートの個々のウェル中へのＦＡＣＳによるソーティング、限られた希釈によるクローニングなど、続いて、増殖および複製を用いて産生され得る。所望のＴリンパ球のインビトロ増殖は、公知の技術（限定はされないが、Ｒｉｄｄｅｌｌらに付与された米国特許第６，０４０，１７７号明細書に記載されているものを含む）、または当業者に明らかなその変形にしたがって行われ得る。
Ｔ細胞クローンによる予備実験が、好ましくは、ＨＬＡ適合ＡＰＣの十分な溶解を引き起こす天然ペプチドリガンドの最小濃度を確立するために行われ得る。リンパ球細胞株（ＬＣＬ）などのＡＰＣによって提示されるペプチドを認識するＴ細胞クローンは、所与の濃度の天然ペプチドによる最適な認識を引き起こす限られた数のＡＰＣを用いて滴定実験を行うのに有利に使用され得る。
４．１．３．Ｄ−アミノ酸認識
ＣＰＬの各セット内のペプチド混合物は、ペプチドの各位置におけるどのＤ−アミノ酸が、標的抗原（例えば、基質タンパク質１インフルエンザ抗原）を特異的に認識する（すなわち、それに結合する）ことが知られているＴＣＲによって認識されるかを決定するために好適にスクリーニングされる。Ｄ−アミノ酸認識の評価は、当該技術分野において公知の任意の手段によって好適に行われ得る。非限定的な例示的な例として、標的細胞（例えば、ＡＰＣ）細胞毒性の測定が使用され得る。ペプチドの各位置について認識されたＤ−アミノ酸が決定されると、この情報を用いて、合成される個々のペプチドを同定することができる。
例えば、特定の実施形態において、最も良く認識されたＤ−アミノ酸が、ペプチドの全ての位置において選択される。他の実施形態において、１つまたは複数のインデックス位置が、様々なＤ−アミノ酸に対応する（すなわち、それを認識する）ようである場合、多くの候補ペプチドが、１つまたは複数の位置においてそれぞれ異なる認識されたＤ−アミノ酸を用いて合成され得る。これは、最も好ましいＤ−アミノ酸ペプチドを決定するために、同定されたＤ−アミノ酸ペプチドの認識を確認し、そのさらなる特性（例えば、安定性、バイオアベイラビリティ、半減期、毒性、細胞毒性など）の数を決定するためにさらなる試験を行うのを可能にする。
各位置における認識されたＤ−アミノ酸を選択するための選択基準は、スクリーニングを行うために使用されるアッセイに応じて決まる。例として、ケモカイン選択アッセイが、どのＤ−アミノ酸がＴＣＲによって認識されるかを評価するのに使用される場合、最高の量またはレベルのケモカインの産生をもたらすＤ−アミノ酸が、同定されたＤ−アミノ酸ペプチドに含めるために選択される（このＤ−アミノ酸は、そのインデックス位置において「最も良く認識された」Ｄ−アミノ酸であるため）。いくつかのインデックス位置（「縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）インデックス位置」）において、２つ以上のＤ−アミノ酸が、ＴＣＲによって認識される。これらの場合、認識されたＤ−アミノ酸のいずれかが、同定されたＤ−アミノ酸ペプチドに含めるために選択され得る。あるいは、いくつかの同定されたＤ−アミノ酸ペプチドが、産生され得、各ペプチドは、縮重インデックス位置において異なる認識されたＤ−アミノ酸ペプチドを有する。特定の実施形態において、Ｄ−アミノ酸は、スクリーニングアッセイアウトプット（例えば、ＭＩＰ−１β産生）が、そのインデックス位置において最も良く認識されたＤ−アミノ酸の機能活性の約３０％、２５％、２０％、１５％、１２．５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％または１％以内である場合、同定されたペプチドに含めるために選択され得る。これらの実施形態において、この範囲内に入る任意のＤ−アミノ酸は、Ｔ細胞アゴニスト活性のさらなる試験が行われるべきであるＤ−アミノ酸ペプチドに含めるために選択され得る。
特定のＤ−アミノ酸ペプチドまたはペプチドの混合物の認識は、ペプチドが、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって指令される細胞性免疫応答を引き起こすかどうかを評価することによって好適に決定され得る。このようなアッセイは、当該技術分野において周知であり、以下に詳細に記載されている。
ペプチドのインデックス位置における特異的Ｄ−アミノ酸を認識するエフェクター細胞（例えば、ＣＴＬ）の能力は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、クロム放出アッセイ、細胞内サイトカイン染色、または免疫原性を評価するための任意の他の方法を用いて、全体として対応するペプチド混合物を評価することによって測定され得る。ペプチド混合物が、エフェクター細胞によって認識されることが確認される場合、そのインデックス位置におけるＤ−アミノ酸が同定され得る。情報が、各インデックス位置における全てのＤ−アミノ酸について利用可能であるように、このプロセスは、ＣＰＬの全てのペプチドセットについて繰り返され得る。
４．２ 細胞毒性アッセイ
ＴＣＲが、ＭＨＣ−ペプチド複合体を首尾よく認識する場合、それは刺激される。この刺激は、Ｔ細胞の増殖によって（例えば、３Ｈの組み込みによって）および／またはＴ細胞によるサイトカインおよび／またはケモカインの産生によって（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって）監視され得る。したがって、適切な標的（例えば、ＡＰＣ）およびエフェクター（例えば、Ｔ細胞）株を使用することによって、ＣＰＬ Ｄ−アミノ酸ペプチドの認識を検出することが可能である。
細胞毒性アッセイが、Ｔ細胞応答を引き起こすために上記および本明細書の他の箇所に記載されるスクリーニング方法によって同定されるＤ−アミノ酸ペプチドの能力を評価するための使用に好適である。この目的のために好適なアッセイの例は、標的抗原特異的Ｔ細胞によるサイトカイン産生もしくは分泌の検出；標的抗原特異的Ｔ細胞における表面分子発現の検出；標的細胞（例えば、ＡＰＣ）溶解の検出；および／または細胞増殖の検出である。これに好適な方法の例は、サイトカインアッセイ（Ｃｈａｐｔｅｒ ６．２ ｔｏ ６．２４ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９），ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ Ａ．Ｍ．，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ Ｄ．Ｈ．，Ｓｈｅｖａｃｈ Ｅ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｃｈａｐｔｅｒ ６．１９ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記を参照）、５１Ｃｒ放出アッセイ（Ｃｈａｐｔｅｒ ３．１１ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記を参照）または増殖の検出（Ｃｈａｐｔｅｒ ３．１２ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記を参照）である。
別の実施形態において、Ｔ細胞の表面への（すなわち、ＴＣＲへの）Ｄ−アミノ酸ペプチド抗原を提示するＭＨＣ複合体の結合が検出される。これは、ＭＨＣ複合体がそれ自体標識される、例えば蛍光標識されるように、または、さらなる工程において、ＭＨＣ特異的な、標識された、例えば、蛍光標識された抗体が、ＭＨＣ複合体を検出するために使用されるように行われ得る。次に、Ｔ細胞の蛍光標識は、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）において測定され、評価され得る。Ｔ細胞への複合体の結合を検出する別の可能な方法は、さらに、Ｔ細胞活性化を測定することである。好適な測定は、Ｔ細胞活性の測定について知られている任意の方法であり得、その例としては。サイトカインアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、５１Ｃｒ放出アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｔ−細胞増殖アッセイおよびフローサイトメトリーベースのアッセイが挙げられる。
４．２．１．クロム放出アッセイ
従来、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定するための技術は、自家標的細胞（例えば、ＭＨＣに関してＤ−アミノ酸ペプチドを提示するＡＰＣ）の溶解に依存していた。細胞毒性を評価するためのこのタイプの好適および好都合なアッセイの一例は、クロム（Ｃｒ）放出アッセイである。標的細胞（例えば、Ｄ−アミノ酸ペプチド抗原を提示するＡＰＣ）は、エフェクター細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）に曝される前に５１Ｃｒが充填される。５１Ｃｒで標識した後、標的およびエフェクター細胞は、培養物と一緒に混合され、数時間、例えば、約２時間〜約１６時間、または約２〜約８時間、または約４時間にわたってインキュベートされる。インキュベーションの後、細胞から（すなわち、上清中に）放出される５１Ｃｒの量が測定される。典型的に、５１Ｃｒは、シンチレーションカウンターを用いて測定される。しかしながら、細胞内色素、ＣＦＳＥ、標識された標的を用いた、Ｔ−リンパ球抗原特異的溶解（ＦＡＴＡＬ）アッセイの蛍光分析評価を含む他の検出方法が使用され得る。
一般に、エフェクター細胞の非存在下での自発的Ｃｒ放出、および行われる各スクリーニングアッセイで対照としての最大総放出を試験するために、対照インキュベーションを行うことが好ましい。
例えば、上記におよび候補Ｄ−アミノ酸ペプチドとともに記載されるＡＰＣが、標的抗原特異的Ｔ細胞による溶解についてスクリーニングされ得る。好適なＴ細胞は、健常なウイルス血清反応陽性供血者からのＰＢＭＣから調製され得る。細胞は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、特異的抗体を用いた免疫磁気分離法などによって、ＣＤ４＋、ＣＤ１６＋、およびＣＤ５６＋細胞を取り除かれ得る。あるいは、ＣＤ８＋細胞が精製されてもよく、または半精製ＣＴＬが、培養物中に保持され、ウイルス特異的Ｔ細胞クローンの源として使用され得る。γ照射された新鮮な同種ＰＢＭＣおよびＰＨＤによるＴ細胞培養物のインビトロ刺激は、特異的Ｔ細胞クローンの増殖を引き起こす。制限的希釈およびインビトロ刺激の組合せは、所望のクローンが増殖されるのを可能にする。
Ｃｒ放出アッセイは、エフェクター細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）によるパーフォリンおよびグランザイムの放出に起因する標的細胞（例えば、ＡＰＣ）膜破壊を示す。これらのアッセイは、当該技術分野において、特に、ワクチン試験において、一般的に行われる。
４．２．２．Ｔ細胞によるサイトカインおよび／またはケモカイン分泌
免疫原性活性をスクリーニングするための他の方法は、当業者に周知の技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、またはＴ細胞刺激アッセイなどの免疫測定法）を含む。例示的な例として、このようなスクリーニング方法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されているものなどの方法を用いて行われ得る。Ｔｈ１型サイトカインおよび／またはケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＦＮβ、ＣＤ１０７ａ、およびＲＡＮＴＥＳ）の増加したレベルは、Ｄ−アミノ酸ペプチドが、誘発または促進された細胞媒介性免疫応答を有する（したがって、標的抗原特異的ＴＣＲによって認識される）ことの明らかな指標である。
細胞毒性は、典型的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介され、サイトカインおよび／またはＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＴＦＮβを含むケモカイン；ならびにインターフェロン−γ（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカイン、インターフェロン−γ誘導性タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、活性化制御で、正常Ｉ細胞で発現、分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｉ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＲＡＮＴＥＳ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１α、およびＭＩＰ−１β、およびＣＤ１０７ａを含むケモカインの放出によって特徴付けられる。
ＥＬＩＳＰＯＴ、ＭＨＣ−ペプチド四量体染色、および細胞内サイトカインおよび／またはケモカイン産生のフローサイトメトリー分析などの技術によるウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性の測定は、細胞溶解アッセイ（例えば、上述されるクロム−放出アッセイ）に勝る利点を提供する。例えば、Ｃｒ放出Ｔ細胞アッセイのものと比較して、ＭＨＣ−Ｉ制限エピトープの向上した感度およびより迅速な描写。また、これらのアッセイは、典型的に、より簡単な方法を有し、より少ない細胞を必要とし、抗原特異的Ｔリンパ球を増殖およびクローニングするか、および／または自家Ｂリンパ芽球様細胞株を確立する必要がない。
４．２．３．ＭＨＣ多量体アッセイ
ＭＨＣ多量体（例えば、四量体）染色は、抗原特異的エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を検出するための従来の方法より感度が高い。しかしながら、この技術の使用は、定義されたＭＨＣ対立遺伝子に関連して周知のエピトープに限定され、四量体陽性細胞の機能的特性評価のための後の培養を必要とする。
ある実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドを提示するＭＨＣ四量体は、当該技術分野において周知の方法を用いて、ＭＨＣモノマーをビオチン化することによって生成される。次に、四量体ＭＨＣ（「四量体」）は、好適なＭＨＣ：ストレプトアビジンモル比（例えば、４：１）におけるＰＥ共役ストレプトアビジンの添加によって構築され得る。エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、フローサイトメトリーを用いて分析する前に、アミノアクチノマイシンＤで染色する前に、ＰＥ共役四量体で染色され得る。
ＭＨＣペプチド四量体（欧州特許第８１２３３１号明細書に記載されるように）およびＭＨＣペプチド五量体（国際ＰＣＴ出願公開番号国際公開第２００４／０１８５２０号パンフレットに記載されるように）などのＭＨＣ多量体が、対象とするＭＨＣ結合ペプチドに反応する、試料中のＴ細胞を（例えば、フローサイトメトリーによって）標識および検出するために開発されている。候補Ｄ−アミノ酸ペプチドが充填されたＭＨＣ多量体を使用することによる、同定されたＤ−アミノ酸ペプチドがＴ細胞アゴニストであるかどうかに関する決定的または確認的情報。理論的に可能であるが、実際には、多数のペプチド、例えば、ＣＰＬ中の全てのペプチドのために完全に精製された機能的ＭＨＣ多量体を構築するために、多大な労力を必要とし、時間を要するであろう。結果として、ＭＨＣ多量体は、抗原特異的エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）によるＤ−アミノ酸ペプチドの認識が上記および本明細書の他の箇所に記載されるように初期のＣＰＬスクリーニング方法から確認された後、このような認識を単に確認するためにこれまで主に使用されていた。
４．２．４．フローベースのアッセイ
フローベースのアッセイ（上述されるもののいくつかを含む）において、試料は、検出窓に流しながら、（例えば、蛍光または他の手段によって）検出される。フローベースのアッセイとしては、例えば、フローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーベースのアッセイの利点は、それが、抗原特異的細胞を同定するための、技術的に簡単で、比較的迅速で客観的な方法であり得ることである。
フローサイトメトリーベースの細胞内染色方法は、ＣＰＬ中に存在する候補Ｄ−アミノ酸ペプチドを認識する抗原応答性Ｔ細胞を同定するための、技術的に簡単で、比較的迅速な方法を提供する。細胞内染色アッセイの成功は、慢性的に感染した個体（例えば、ＣＭＶまたはＨＩＶ）からのＰＢＭＣを用いて、ウイルス抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を評価する試験において最もよく報告されている。特に、循環血液中の抗原特異的エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の数が感染因子に曝された個体において見られるよりかなり少なくなり得る実施形態において、ＭＨＣ四量体（上述されるものなど）の使用は、免疫化された個体からのＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞における生体外抗原特異的細胞の検出のために有益である。
４．２．５．ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は、サイトカインおよび／またはケモカインレベルを検出および測定するのに長い間使用されてきた。ＥＬＩＳＡは、免疫応答の評価および特性評価に一般的に使用され、このような分析を行うための方法が、当該技術分野において周知である。ある実施形態において、多検体ＥＬＩＳＡアッセイが、行われてもよく、単一の実験において最大で１２のサイトカインおよび／またはケモカインの分泌の迅速なスクリーニングを可能にする。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを含む、従来のＥＬＩＳＡ方法の変形も、当該技術分野において周知である。
酵素結合イムノスポット（ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ（欧州特許第０９４１４７８号明細書に記載されているものなど）は、サイトカイン−および／またはケモカイン特異的抗体（例えば、モノクローナル抗体）による、吸着膜におけるそれらの近傍の応答エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）によって分泌されるサイトカインおよび／またはケモカインの捕捉によって、標的細胞（例えば、ＡＰＣ）を介して認識されたＤ−アミノ酸ペプチドによる刺激に応答してエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）によって分泌されるサイトカインを検出することによって、試料中の固定化エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化を測定することができる。次に、サイトカイン捕捉は、捕捉抗体と比較して、同じサイトカインにおける異なるエピトープに結合する第２の抗サイトカイン抗体を用いて検出される。次に、第２の抗体の結合が、色による標識反応を用いて検出され得る。結果として、次に、刺激された細胞は、細胞が固定された元の位置の周囲に生じる、膜における着色された点として検出される。
したがって、この技術は、認識されたＤ−アミノ酸ペプチドに応答して、リンパ球分泌特異的サイトカインおよび／またはケモカインの計数（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を可能にする。基本的に、サイトカインおよび／またはケモカイン分泌細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）は、候補Ｄ−アミノ酸ペプチド（または候補Ｄ−アミノ酸ペプチドの混合物）を提示するＭＨＣ分子と一緒に、ウェル表面に結合された対象とするサイトカインおよび／またはケモカインに対する抗体を含む特別に改良されたＥＬＩＳＡウェル中で細胞を培養することによって明らかにされ得る。この方法では、標準的なＥＬＩＳＡ試薬は、分泌細胞に隣接する、着色された沈殿物（点）を生じる酵素−基質複合体で置き換えられる。次に、点は、サイトカイン−および／またはケモカイン産生細胞の数を測定するために計数され得る。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うさらなる利点は、高度な作業者訓練および高価な機器が、応答の頻度を測定するのに必要でないことである。ある実施形態において、ＥＬＩＳＰＯＴは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生を評価し、ＩＦＮ−γは、このサイトカインがＴｈ１応答に典型的であると考えられるため、大量に発生する。しかしながら、他のサイトカインが、評価可能であり、その測定が、本発明のために好適である。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、アッセイの読み取りを簡単にするためにコンピューター支援顕微鏡を加えることによって向上され得、多くの一連の試料のバッチ分析を可能にし、標準化を容易にする（Ｓａｍｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００６に記載されるように）。
候補Ｄ−アミノ酸ペプチドＴ細胞アゴニストが、スクリーニングされた場合、有意な免疫原性を生じたペプチドまたはペプチド群が、活性を確認するために同じ方法で個別にスクリーニングされ得る。さらなるアッセイが、必要に応じて、同定されたペプチドを用いて行われ得る。これに関して、位置ライブラリー（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）のスクリーニングは、いくつかのＣＴＬペプチドエピトープ類似体を示し、これは、典型的に、クロム放出アッセイによる天然ペプチドと同等またはそれより増加した細胞毒性をもたらす。次に、ペプチドの各位置における最も良く認識された定義されたアミノ酸ライブラリーに対応する配列が、選択され、多くの同定されたペプチドが合成され得る。細胞毒性の相違がＤ−アミノ酸間で最小であることが観察された位置において、認識されたＤ−アミノ酸の全てまたはいくつか（すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１）が、選択のために利用可能である。有利には、特定の位置において異なる認識されたＤ−アミノ酸をそれぞれ組み込むいくつかのペプチドが、どのＤ−アミノ酸ペプチドが最も免疫原性であるかを決定するために、必要に応じて、さらなるスクリーニングに進み得る。
５．Ｄ−アミノ酸ペプチド
５．１ Ｄ−アミノ酸ペプチドを産生する方法
上述される方法を用いて同定された後、候補Ｄ−アミノ酸ペプチドは、治療的使用のために合成され得る。ある実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチド抗原は、溶液合成、固相合成（例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｐｐａｒｄ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８９）、またはＲｏｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２）によって記載されるように）を用いて、または拡張された遺伝子コードを有する生物を利用するバイオリアクター（Ｎｅｕｍａｎ，（２０１２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８６：２０５７−２０６４に記載されるように）を用いて合成され得る。
通常、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０Ｄ−アミノ酸残基長である。ある実施形態において、標的抗原特異的Ｔ細胞によって認識されるＤ−アミノ酸配列は、より長いポリペプチド配列の一部を構成する。
本発明の利点は、Ｌ−アミノ酸ペプチド同等物と比較して、侵入経路に関連する宿主バリアを渡るＤ−アミノ酸ペプチドエピトープの増加した能力である。このようなバリアとしては、血清補体／プロテアーゼ、胃酸および消化酵素が挙げられる。したがって、本発明のペプチドは、ヒト血清および模擬胃酸中のＤ−アミノ酸ペプチドの優れた安定性を利用するように、医薬組成物中で好適に製剤化される。生体内Ｄ−アミノ酸ペプチドの向上した安定性は、本発明の方法を用いて同定されたＤ−アミノ酸ペプチドが、任意の同等物であるＬ−アミノ酸ペプチドと比べて、より有効な免疫プライミングを可能にする可能性が高いことを示す。
５．２ インフルエンザを処置するためのＤ−アミノ酸ペプチド
一態様において、本発明は、インフルエンザからのマトリックスＭ１抗原に対する免疫応答を引き起こすのに特に有用なＤ−アミノ酸ペプチドを提供する。上述される位置走査方法ＣＰＬの性質は、特定のインデックス位置におけるＤ−アミノ縮重に関する詳細な情報を可能にする。
例えば、標的抗原特異的ＴＣＲは、いくつかのインデックス位置において１つのみのＤ−アミノ酸を認識し得るが、ＴＣＲは、他のインデックス位置において複数のＤ−アミノ酸を認識し得る。例示的な例として、本発明者らは、インフルエンザマトリックスＭ１のタンパク質の十分に特性評価されたＧＩＬＧＦＶＦＴＬ５８〜６６ペプチドエピトープに特異的なＡＬＦ３ ＴＣＲクローンが、九量体の位置１、２、４および５において２つのＤ−アミノ酸を認識したが、位置３、６、７、８、および９において１つのみのＤ−アミノ酸を認識したことを見出した。したがって、本発明は、式Ｉ：
Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
（式中：
Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
によって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる免疫原性Ｄ−アミノ酸ペプチドを提供する。
特定の実施形態において、式Ｉで表される好適なＤ−アミノ酸配列は、配列番号３〜１０に記載されるＤ−アミノ酸配列を有するものである。さらにより特定的な例示的な実施形態において、配列番号３に記載されるＤ−アミノ酸配列は、インフルエンザからのマトリックスＭ１タンパク質に対する粘膜免疫および全身性免疫の両方を引き起こすのに好適である。したがって、式Ｉで表されるＤ−アミノ酸配列（したがって、配列番号３〜１０に記載される配列のいずれか１つを含む）を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるＤ−アミノ酸ペプチドが、以下にさらに詳細に記載されるように、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を引き起こすように医薬組成物を製剤化するのに特に好適である。これらの配列は、生物学的に極めて安定しており、天然Ｌ−アミノ酸ペプチドと同程度に効率的にインフルエンザ特異的Ｔ細胞をプライムすることができる。さらに、本明細書に開示される方法によって同定されたＤ−アミノ酸ペプチドによってプライムされたＴ細胞集団は、（ｉ）天然の多機能プロフィールを示し；（ｉｉ）標的抗原を密接に模倣するＴＣＲレパートリーを包含し；（ｉｉｉ）インフルエンザからの内因的に提示されるマトリックスＭ１抗原を認識する能力を示すものとして好適に特徴付けられ得る。
６．医薬製剤
本発明によれば、上述されるＣＰＬおよび方法を用いて同定されるＤ−アミノ酸ペプチドは、標的抗原（例えば、ウイルス抗原）に対する免疫応答を促進するかまたは引き起こすための組成物および方法において有用である。したがって、これらの組成物は、標的抗原に関連する疾患または病態（例えば、標的抗原に対する有効な細胞傷害性免疫応答が必要とされる）を処理するのに有用である。
本発明のＤ−アミノ酸ペプチドによる処置に適した好適な疾患としては、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物による感染症が挙げられる。ウイルスとしては、限定はされないが：オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ブタインフルエンザを含むインフルエンザウイルス）；レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、もしくはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ノーウォークおよび関連ウイルスを含む、胃腸炎を引き起こす菌株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス；ジカウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水胞性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（天然痘ウイルス、ＶＡＣＶ、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；および分類不能ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部伝染型；クラス２＝非経口伝染型（すなわち、Ｃ型肝炎）；およびアストロウイルスが挙げられる。
ある実施形態において、病原性感染は、細菌性病原体である。病原性感染が対象において発生することが知られている細菌としては、限定はされないが、病原性パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群ストレプトコッカス属（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群ストレプトコッカス属（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ビリダンス群（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｇｒｏｕｐ））、フェカリス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（嫌気性種（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｐｓ．））、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（例えば、毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）、および侵入性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＩＥＣ））、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）種（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、カンサシ菌（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉ）が挙げられる。
本発明の他の実施形態において、病原性感染は、病原性真菌および寄生虫などの真核病原体である。少なくともある程度病原性であることが知られている真菌としては、限定はされないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔａ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、およびスポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）が挙げられる。
異種抗原が由来し得る他の真核病原体としては、限定はされないが、病原性原生動物、寄生蠕虫、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、および三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）；トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）；ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）；ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）；クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などが挙げられる。
本発明を用いて処置可能な他の疾患および／または病態は、悪性または前癌状態、増殖性または過剰増殖性状態、または機能障害もしくは他の障害または増殖能または身体の任意の細胞もしくは組織の挙動の異常から生じるもしくはそれから派生するもしくはそれに関連する任意の疾患を含む。したがって、本明細書に記載される方法は、癌が転移性癌であるかどうか可能性を評価することを含め、癌を診断するのに使用され得る。例えば、本発明の実施にしたがって好適に診断され得る癌としては、乳癌、結腸癌、肺癌および前立腺癌、血液およびリンパ系の癌（ホジキン病、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、およびワルデンストレーム病を含む）、皮膚癌（悪性黒色腫を含む）、消化管の癌（頭頸部癌、食道癌、胃癌、膵臓の癌、肝臓癌、結腸癌および直腸癌、肛門癌を含む）、生殖器および泌尿器系の癌（腎臓癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌を含む）、女性が罹患する癌（乳癌、卵巣癌、婦人科癌および絨毛腫を含む）ならびに脳腫瘍、骨カルチノイド、鼻咽頭、後腹膜、甲状腺および軟部組織腫瘍が挙げられる。
したがって、本発明の組成物は、（例えば、標的抗原に対する免疫応答を促進するかまたは引き起こすことによって）標的抗原に関連する疾患または病態を処置するのに有用である。医薬組成物は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤を含み得る。ある実施形態において、組成物は、標的抗原に関連する疾患および／または病態に罹患している個体に投与される。他の実施形態において、組成物は、標的抗原に関連する疾患または病態を発症するリスクのある高リスク個体に投与される。
本発明に使用するのに好適な医薬組成物は、Ｄ−アミノ酸ペプチド抗原が、意図された目的を達成するのに有効な量で含まれた組成物を含む。患者に投与される活性化合物の用量は、好適には、病原性感染または癌から選択される病態に関連する疾患および／または病態に関連する少なくとも１つの症状の減少などの、時間とともに患者の有益な応答を達成するのに十分であるべきである。投与される薬学的に活性な化合物の量または投薬回数は、対象の年齢、性別、体重および全体的な健康状態を含め、処置される対象に応じて決まる。これに関して、投与のための活性化合物の正確な量は、専門家の判断に応じて決まる。疾患または病態の処置の際に投与される活性化合物の有効量を決定する際、専門家は、炎症、炎症性サイトカインレベル、リンパ球増殖、細胞傷害性Ｔリンパ球活性および制御性Ｔリンパ球機能を評価することができる。いずれにしても、当業者は、Ｄ−アミノ酸ペプチドの好適な投与量を容易に決定することができる。
したがって、生理活性剤は、投与製剤と適合する方法で、および予防的におよび／または治療的に有効な量で、処置される対象に投与される。一般に、１回の投与につき０．０１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇのＤ−アミノ酸ペプチドの範囲内の、送達される組成物の量は、処置される対象に応じて決まる。ある実施形態において、意図される投与方法に応じて、Ｄ−アミノ酸ペプチド含有組成物は、一般に、約０．１重量％〜９０重量％、約０．５重量％〜５０重量％、または約１重量％〜約２５重量％のペプチドを含有し、残りは、好適な医薬担体および／または希釈剤などである。
処置される具体的な病態に応じて、医薬組成物は、製剤化され、全身に、局所的にまたは局部的に投与され得る。製剤化および投与のための技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに見られる。好適な経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、もしくは腸内投与；筋肉内、皮下、経皮、皮内、髄内送達（例えば、注射）、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内送達（例えば、注射）を含む非経口送達を含み得る。注射のために、本発明の生理活性剤は、水溶液、好適には、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの、生理学的に適合する緩衝液中で製剤化され得る。経粘膜投与のために、透過すべきバリアに適した浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、一般に、当該技術分野において公知である。
本発明の組成物は、許容できる希釈剤（生理食塩水および滅菌水など）を含有する液体の形態での投与のために製剤化されてもよく、または所望のテクスチャ、稠度、粘度および外観を与えるために、許容できる希釈剤もしくは担体を含有する、ローション、クリームもしくはゲルの形態であり得る。許容できる希釈剤および担体は、当業者に周知であり、これらとしては、限定はされないが、エトキシ化および非エトキシ化界面活性剤、脂肪アルコール、脂肪酸、炭化水素油（パーム油、ヤシ油、および鉱油など）、カカオ脂ワックス、シリコン油、ｐＨ平衡剤、セルロース誘導体、乳化剤、例えば、非イオン性有機および無機塩基、保存剤、ワックスエステル、ステロイドアルコール、トリグリセリドエステル、リン脂質、例えば、レシチンおよびセファリン、多価アルコールエステル、脂肪アルコールエステル、親水性ラノリン誘導体、および親水性蜜ろう誘導体が挙げられる。
あるいは、本発明の生理活性剤は、同様に本発明の実施のために考えられる経口投与に好適な投与量に、当該技術分野において周知の薬学的に許容できる担体を用いて容易に製剤化され得る。このような担体により、本発明の生理活性剤を、処置される患者による経口摂取のための剤形、例えば、錠剤、丸薬、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに製剤化することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水、および発熱性物質除去蒸留水から選択され得る。
非経口投与用の医薬製剤としては、水溶性形態の粒子の水溶液が挙げられる。さらに、生理活性剤の懸濁液が、適切な油性注射用懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。任意選択的に、懸濁液は、好適な安定剤、または高濃縮溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増加させる薬剤も含有し得る。
経口用の医薬品製剤は、Ｄ−アミノ酸ペプチドを、固体賦形剤と組み合わせて、必要に応じて好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣丸コアを得ることによって得られる。好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤が添加され得る。このような組成物は、調剤方法のいずれかによって調製され得るが、全ての方法は、上述される１つまたは複数の治療剤を、１つまたは複数の必要な成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣丸形成、水簸、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。
糖衣丸コアには、好適なコーティングが施される。このために、濃縮糖溶液が使用され得、この溶液は、任意選択的に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。粒子用量の異なる組合せを識別または特性評価するために、染料または顔料が、錠剤または糖衣丸コーティングに添加され得る。
経口使用され得る医薬品としては、ゼラチンで作製されたプッシュ・フィット・カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールで作製された密封軟カプセル剤が挙げられる。プッシュ・フィット・カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤および、任意選択的に、安定剤との混合物で有効成分を含有し得る。軟カプセル剤において、活性化合物は、好適な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。
本発明のＤ−アミノ酸ペプチドは、処置される病態の重症度、病態の再発が考えられる可能性が高いかどうかなどを含むいくつかの要因に応じて、数時間、数日、数週間、または数ヶ月の期間にわたって投与され得る。投与は、持続的であってもよく、例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月などの期間にわたる持続注入であり得る。あるいは、投与は、断続的であってもよく、例えば、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、数日間にわたって１日１回、数時間にわたって１時間に１回、または好適と思われるような任意の他のこのようなスケジュールで投与され得る。
本発明のＤ−アミノ酸ペプチドはまた、ネブライザー用の鼻もしくは肺吸入エアロゾルもしくは溶液として、または吹送用の超微粒粉末として、単独で、またはラクトースなどの不活性担体と、もしくは他の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、気道に投与され得る。本発明のある粒子状実施形態において、製剤の粒子は、有利には５０μｍ未満、好適には１０μｍ未満の直径を有し得る。
ある実施形態において、本発明のＤ−アミノ酸ペプチドを含む医薬製剤は、細胞調製物として投与され得る。ＡＰＣまたは制御性リンパ球が用いられる場合、抗原または抗原群に対する所望の修飾免疫応答を生じさせる任意の手段（例えば、注射）によって、それらの細胞が、患者に導入され得る。細胞は、患者（すなわち、自家細胞）に由来するか、または患者とＭＨＣが適合するかまたは適合しない単数または複数の個体（すなわち、同種細胞）に由来し得る。特定の実施形態において、自家細胞は、その源細胞を得た患者に注射によって戻される。注射部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、または静脈内であり得る。望ましくない免疫応答を既に起こしているまたは望ましくない免疫応答を起こしやすい患者に、その応答の発生を防止するもしくは少なくとも部分的に抑止する、またはその応答の発現を低減するもしくはなくすのに十分な数の細胞が投与され得る。処置または予防を必要とする患者に注射される細胞の数は、特に、１つまたは複数の抗原および個体のサイズに応じて変化し得る。この数は、例えば、約１０３〜１０１１個、通常、約１０５〜１０７個の細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞などまたはそれらの前駆体）の範囲であり得る。処置する医師によって選択される細胞数およびパターンによって、細胞の単回または複数回投与が行われ得る。細胞は、細胞および個体に対して非毒性である薬学的に許容できる担体中で投与されるべきである。このような担体は、細胞を成長させる成長培地、またはリン酸緩衝生理食塩水などの任意の好適な緩衝媒質であり得る。細胞は、単独で、または標的抗原に関連する疾患または病態の処置のために当該技術分野において公知の他の治療法、および／または他の形態の特異的免疫療法とともに補助療法として投与され得る。特定の実施形態において、ＡＰＣは、Ｄ−アミノ酸ペプチドと予め接触され、または１つまたは複数のこのようなペプチド抗原とともに対象に同時に投与される。
６．１ 粒子状組成物
ある実施形態において、本発明のＤ−アミノ酸ペプチドは、粒子状形態で製剤化される。限定はされないが、リポソーム、ミセル、脂質粒子、セラミック／無機粒子およびポリマー粒子を含む様々な粒子が、本発明において使用されてもよく、典型的に、ナノ粒子および微粒子から選択される。粒子は、ＡＰＣによる食作用または飲食作用に好適なサイズである。
ある実施形態において、粒子は、非ＡＰＣより高いレベルでＡＰＣ（例えば、樹状細胞）上で発現されるマーカーと免疫反応性である抗原結合分子を粒子の表面上に含む。このタイプの例示的なマーカーとしては、例えば、Ｈａｗｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９４，７６９）、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，３４０３５）、Ｂｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６，１０３５５）、Ｓｃｈｊｅｔｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，１４２３）およびｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｓｅｐ ２４；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００６，２１１：５７７−５８５）によって開示されるように、ＭＧＬ、ＤＣＬ−１、ＤＥＣ−２０５、マクロファージマンノースＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮもしくは他のＤＣまたは骨髄系特異的（レクチン）受容体が挙げられる。
粒子は、Ｄ−アミノ酸ペプチドと、界面活性剤、賦形剤またはポリマー材料との組合せから調製され得る。ある実施形態において、粒子は、生体分解性および生体適合性であり、任意選択的に、治療または診断薬の送達のために制御された速度で生体内分解することができる。粒子は、様々な材料で作製され得る。無機および有機材料の両方が使用され得る。ポリマーおよび非ポリマー材料、例えば、脂肪酸が使用され得る。他の好適な材料としては、限定はされないが、ゼラチン、ポリエチレングリコール、トレハロース、デキストランおよびキトサンが挙げられる。粒子材料などの要因に基づいて、数秒から数ヶ月の範囲の分解および放出時間を有する粒子が、設計され、製造され得る。
６．１．１．ポリマー粒子
ある粒子状実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、例えば米国特許第５，７８３，５６７明細書（Ｐａｎｇａｅａ）に記載されるように、例えば食作用による、細胞による能動取り込みのために投与される。ある実施形態において、これらの細胞による食作用は、典型的に、約２０μｍ未満、好ましくは、約１１μｍ未満の粒径を維持することによって向上され得る。
特定の粒子状実施形態において、肝臓および脾臓を含む細網内皮系（ＲＥＳ）の食細胞による取り込みが所望される場合、粒子状形態のＤ−アミノ酸ペプチドが、血流に直接（すなわち、静脈内または動脈内注射または注入によって）送達される。あるいは、皮下注射によって、流入領域リンパ節の食細胞による取り込みを標的にすることができる。粒子は、例えば、弾道的またはマイクロニードル送達を用いて、皮内に（すなわち、樹状細胞およびランゲルハンス細胞などの、皮膚のＡＰＣに）導入することもできる。例示的な粒子媒介性送達技術としては、例えば、米国特許第４，９４５，０５０明細書、同第５，１２０，６５７明細書、同第５，１４９，６５５明細書および同第５，６３０，７９６明細書に記載されるように、標的細胞に向かって担体粒子を推進する爆発性、電気または気体放電送達が挙げられる。マイクロニードル送達の非限定的な例は、国際公開第２００５／０６９７３６号パンフレットおよび国際公開第２００５／０７２６３０号パンフレットおよび米国特許第６，５０３，２３１号明細書および同第５，４５７，０４１号明細書に開示されている。
他の特定の粒子状実施形態において、粒子送達の経路は、消化管を介し、例えば経口的である。あるいは、粒子は、粒子が肺胞マクロファージによって拾い上げられる肺などの臓器に（例えば、粉末微粒子またはこの微粒子を含有する霧状もしくはエアロゾル化溶液の吸入によって）導入され得、または鼻腔内もしくは口腔に投与され得る。食細胞が粒子を貪食すると、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、細胞の内部に放出される。
ポリマー粒子は、任意の生体適合性および望ましくは生分解性ポリマー、コポリマー、またはブレンドから形成され得る。ポリマーは、ｉ）生理活性剤の安定化および送達時の活性の保持をもたらす、送達される生理活性剤とポリマーとの間の相互作用；ｉｉ）ポリマー分解速度プロフィールおよび、それによって、薬剤放出速度プロフィール；ｉｉｉ）表面特性および化学修飾による標的化能力；およびｉｖ）粒子空隙率を含む、粒子の様々な特性を最適化するように調整され得る。
ポリ無水物などの表面浸食性ポリマーが、粒子を形成するのに使用され得る。例えば、ポリ［（ｐ−カルボキシフェノキシ）−ヘキサン無水物］（ＰＣＰＨ）などのポリ無水物が使用され得る。生体分解性ポリ無水物が、米国特許第４，８５７，３１１号明細書に記載されている。
他の実施形態において、ポリ（ヒドロキシ酸）またはポリ（エステル）を含む、ポリエステルに基づくものなどのバルク浸食性ポリマーが使用され得る。例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはそのコポリマーが、粒子を形成するのに使用され得る。ポリエステルはまた、荷電または官能性基、例えば、アミノ酸を有し得る。例示的な例において、制御放出特性を有する粒子が、ＤＰＰＣなどの界面活性剤を組み込んだポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）および／またはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）で形成され得る。
他のポリマーとしては、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニル化合物、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、およびポリビニルエステル、アクリル酸およびメタクリル酸のポリマー、セルロースおよび他の多糖類、ならびにペプチドまたはタンパク質、またはそれらのコポリマーもしくはブレンドが挙げられる。様々な制御薬剤送達用途のための適切な生体内安定性および分解速度を有するポリマーが選択され、またはそれらを有するようにポリマーが修飾され得る。
ある実施形態において、Ｈｒｋａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８：４７３６−４７３９；および“Ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ−ｃｏ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）Ｇｒａｆｔ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ：Ａ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”ｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．６２７，Ｒａｐｈａｅｌ Ｍ．Ｏｔｔｅｎｂｒｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，ｐｐ．９３−１０１，１９９６）に記載されるように、粒子は、官能化ポリエステルグラフトコポリマーから形成される。
生分解性ポリマー以外の材料が、粒子を形成するのに使用され得る。好適な材料としては、様々な非生分解性ポリマーおよび様々な賦形剤が挙げられる。粒子はまた、生理活性剤および界面活性剤のみで形成され得る。
ポリマー粒子は、シングルおよびダブルエマルジョン溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、溶媒蒸発、相分離、単純および複合コアセルベーション、界面重合、ならびに当業者に周知の他の方法を用いて調製され得る。粒子は、当該技術分野において公知のマイクロスフェアまたはマイクロカプセルの作製方法を用いて作製され得るが、ただし、所望の直径を有する粒子を形成するために条件が最適化される。
封入される薬剤の送達のためのマイクロスフェアを作製するために開発された方法が、例えば、Ｄｏｕｂｒｏｗ，Ｍ．，Ｅｄ．，“Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９２に記載されるように、文献に記載されている。方法は、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ（１９８７，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５，１３−２２）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ ６，２７５−２８３）；およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．３５，７５５−７７４）ならびに米国特許第５，２１３，８１２号明細書、米国特許第５，４１７，９８６号明細書、米国特許第５，３６０，６１０号明細書、および米国特許第５，３８４，１３３号明細書にも記載されている。方法の選択は、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０、Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ４：３２９−３４０；１９９２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．４５、１２５−１３４）；およびＢｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８４，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７３，１７２１−１７２４）によって記載されるように、所望されるポリマーの選択、サイズ、外部形態、および結晶化度に応じて決まる。
例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｂｅｎｉｔａ；およびＪａｆｆｅに付与された米国特許第４，２７２，３９８号明細書に記載されている溶媒蒸発では、ポリマーは、塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に溶解される。いくつかの異なるポリマー濃度、例えば、０．０５〜２．０ｇ／ｍＬが使用され得る。可溶性形態であるかまたは微粒子として分散された生理活性剤は、ポリマー溶液に添加され、混合物が、ポリ（ビニルアルコール）などの表面活性剤を含有する水性相中で懸濁される。水性相は、例えば、蒸留水中１％のポリ（ビニルアルコール）ｗ／ｖの濃度であり得る。得られたエマルジョンは、有機溶媒の大部分が蒸発するまで撹拌され、固体マイクロスフェアが残り、それが、水で洗浄され、凍結乾燥機で一晩乾燥され得る。異なるサイズ（１〜１０００μｍ）および形態を有するマイクロスフェアが、この方法によって得られる。
溶媒除去は、主に、ポリ無水物などの安定性の低いポリマーとともに使用するために設計された。この方法では、薬剤は、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒中の選択されたポリマーの溶液に分散または溶解される。次に、混合物は、撹拌によって、シリコン油などの油中で懸濁されて、エマルジョンを形成する。２４時間以内に、溶媒は、油相に拡散し、エマルジョン液滴が硬化して、固体ポリマーマイクロスフェアになる。例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：２７５）に記載されるホットメルトマイクロカプセル化法と異なり、この方法を用いて、高い融点および広範囲の分子量を有するポリマーからマイクロスフェアを作製することができる。例えば１〜３００μｍの直径を有するマイクロスフェアが、この手順で得られる。
一部のポリマー系に関して、シングルまたはダブルエマルジョン技術を用いて調製されるポリマー粒子は、液滴のサイズに応じてサイズが変化する。油中水型エマルジョン中の液滴が、所望のサイズ範囲を有する粒子を形成するのに好適な小さなサイズのものでない場合、例えば、エマルジョンの超音波処理または均質化によって、または界面活性剤の添加によって、より小さい液滴が調製され得る。
上記の方法のいずれかによって調製された粒子が、所望の範囲外のサイズ範囲を有する場合、粒子は、例えば、篩を用いて分粒され、当業者に公知の技術を用いて密度によってさらに分けられ得る。
ポリマー粒子は、噴霧乾燥によって調製され得る。ＳｕｔｔｏｎおよびＪｏｈｎｓｏｎによるＰＣＴ国際公開第９６／０９８１４号パンフレットに開示されるものなどの噴霧乾燥方法により、水溶性材料の平滑な球形微粒子の調製が開示され、粒子の少なくとも９０％は、１〜１０μｍの平均サイズを有する。
６．１．２．セラミック粒子
セラミック粒子も、本発明の生理活性剤を送達するのに使用され得る。これらの粒子は、典型的に、周知のゾル・ゲル法に類似の方法を用いて調製され、通常、例えば、Ｂｒｉｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｏｌ−Ｇｅｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｏｌ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０，ｐ−６０）、およびＡｖｎｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．６，１６０５）に記載されるような単純および室温条件を必要とする。所望のサイズ、形状および空隙率を有するセラミック粒子が調製され得、極めて安定している。これらの粒子はまた、ドープされた分子（ポリペプチド、薬剤など）を、極端なｐＨおよび温度によって誘導される変性から有効に保護する（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１１０９２−１１０９５）。さらに、それらの表面は、様々な基で容易に官能化され得（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１２，２６３２−２６３９；Ｂａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ６，７９２−８０１）、したがって、それらは、それらの標的を所望の生体内部位に向けるために、様々なモノクローナル抗体および他のリガンドに結合され得る。
様々なセラミック粒子が、活性薬剤含有ペイロードの生体内送達について記載されている。例えば、英国特許第１ ５９０ ５７４号明細書には、ゾル・ゲルマトリックスへの生物活性成分の組み込みが開示されている。国際公開第９７／４５３６７号パンフレットには、生物活性薬剤が予め焼結された粒子（１〜５００μｍ）またはディスクへの含浸によって組み込まれる、ゾル・ゲル法によって調製された制御可能に溶解できるシリカキセロゲルが開示されている。国際公開第００５０３４９号パンフレットには、生物活性薬剤が繊維の合成中に組み込まれる、ゾル・ゲル法によって調製された制御可能に生体内分解できるシリカ繊維が開示されている。米国特許出願公開第２００４０１８００９６号明細書には、生理活性物質が捕捉されたセラミックナノ粒子が記載されている。セラミックナノ粒子は、色素のミセル組成物の形成によって作製される。セラミック材料が、ミセル組成物に添加され、セラミックナノ粒子が、アルカリ加水分解によって沈殿される。米国特許出願公開第２００５０１２３６１１号明細書には、粒子全体にわたって実質的に均一に分散された活性材料を含む、制御放出セラミック粒子が開示されている。これらの粒子は、界面活性剤を非極性溶媒と混合して、逆ミセル溶液を調製する工程；（ｂ）ゲル前駆体、触媒、縮合剤および可溶性活性材料を極性溶媒に溶解させて、前駆体溶液を調製する工程；（ｃ）逆ミセル溶液および前駆体溶液を組み合わせて、エマルジョンを得る工程および（ｄ）エマルジョン中の前駆体を濃縮する工程によって調製される。米国特許出願公開第２００６０２１０６３４号明細書には、蒸発による金属酸化物（例えば、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化スカンジウム、酸化セリウムおよび酸化イットリウム）を含むセラミック粒子上への生理活性物質の吸着が開示されている。Ｋｏｒｔｅｓｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｍａｙ １０；２００（２）：２２３−２２９）は、トレミフェンクエン酸塩およびデクスメデトミジンＨＣｌなどの薬剤の制御送達のための狭い粒径範囲を有する球形シリカゲル粒子を製造するための噴霧乾燥方法を開示している。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．３０８（１−２）：１６０−１６７）は、多孔質ＣａＣＯ３微粒子による吸着と、生理活性物質の送達のための高分子電解質多層フィルムによる封入との組合せを記載している。
６．１．３．リポソーム
リポソームは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８３、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８，３３９−３４８）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０４，９５−１０１）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１０３，１８５−１９７）、Ｂｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００２００４１８６１号明細書）、Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００５０２３２９８４号明細書）、Ｋｉｓａｋ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００５０２６０２６０号明細書）およびＳｍｙｔｈ−Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００６０２０４５６６号明細書）によって報告されるものなどの標準的な方法によって産生され得る。さらに、抗原の送達のための脂質ベースの粒子状製剤を概説するＣｏｐｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８３：９５−１０５）、およびタンパク質が充填されたリポソームの調製方法を含む、ワクチンのための粒子状送達系を概説するＢｒａｍｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２２（２）：１５１−２１４；２００６，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８（６）：７１７−７２８）が参照され得る。様々な異なる脂質成分を用いた多くのリポソーム製剤が、様々なインビトロ細胞培養および動物実験に使用されている。リポソーム特性を決定するパラメータが特定されており、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１０３，１８５−１９７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１０４，９５−１０１）；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，９５０８−９５１）によって文献に報告されている。
簡潔に述べると、有機溶媒に溶解された最適な（および任意の有機可溶性生理活性）脂質が、混合され、減圧下でガラス管の底部で乾燥される。脂質フィルムが、任意の水溶性生理活性成分を含有する水性緩衝溶液を用いて再水和されて、穏やかな回旋によって封入される。次に、水和された脂質小胞は、押し出しによってさらに加工され、一連の凍結融解サイクルに供されるかまたは脱水され、次に、再水和されて、生理活性成分の封入を促進することができる。次に、リポソームは、遠心分離によって洗浄され、またはサイズ排除カラムに充填されて、リポソーム製剤から非捕捉生理活性成分を除去し、４℃で貯蔵され得る。リポソーム調製のための基本的な方法が、Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５６９１−５６９８）により詳細に記載されている。
生理活性剤のペイロードを担持する粒子は、Ｐａｕｔｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（１９）：１０７１８−２１）に記載されるような手順を用いて作製され得る。Ｐａｕｔｏｔらの技術を用いて、ストレプトアビジン被覆脂質（ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、および類似の脂質）を用いて、リポソームを製造することができる。Ｎｅｅｄｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５３（３）：２８５−３０５）によって記載される薬剤封入技術を用いて、１つまたは複数の活性薬剤をこれらの小胞に充填することができる。
リポソームは、様々な脂質混合物のクロロホルム溶液を高真空に曝露し、その後、得られた脂質フィルム（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ）を、ｐＨ４の緩衝液で水和し、凍結融解手順の後、それらをポリカーボネートフィルタに通して押し出すことによって、調製され得る。ＤＳＰＣまたはコレステロールが補充されたＤＰＰＣを用いて、封入効率を高め、または安定性を高めるなどが可能である。アルカリ化剤の添加によって、小胞外媒体のｐＨを７．５に調整することによって、膜貫通ｐＨ勾配が生成される。その後、生理活性剤（例えば、ＨＤＭおよび任意選択的に、免疫寛容原性応答が所望される抗原）が、生理活性剤の溶液を、高温で小胞溶液に少しずつ添加することによって捕捉されて、リポソーム内の生理活性剤の蓄積を可能にし得る。
ニオソームなどの、本発明の生理活性剤の送達に好適な他の脂質ベースの粒子が、Ｃｏｐｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８３：９５−１０５）によって記載されている。
６．１．４．弾道粒子
本発明のＤ−アミノ酸ペプチドは、無針または「弾道」（微粒子銃）送達に使用するのに好適な粒子に、（例えば、コーティングまたはコンジュゲーションによって）結合され得るか、またはこのような粒子と他の方法で会合され得る。弾道送達のための例示的な粒子が、例えば、国際公開第０２／１０１４１２号パンフレット；国際公開第０２／１００３８０号パンフレット；国際公開第０２／４３７７４号パンフレット；国際公開第０２／１９９８９号パンフレット；国際公開第０１／９３８２９号パンフレット；国際公開第０１／８３５２８号パンフレット；国際公開第００／６３３８５号パンフレット；国際公開第００／２６３８５号パンフレット；国際公開第００／１９９８２号パンフレット；国際公開第９９／０１１６８号パンフレット；国際公開第９８／１０７５０号パンフレット；および国際公開第９７／４８４８５号パンフレットに記載されている。しかしながら、このような粒子が、弾道送達デバイスを用いたそれらの使用に限定されず、粒子を免疫細胞に送達することが可能な任意の代替的な技術（例えば、注射またはマイクロニードル送達）によって他の形で投与され得ることが理解されるべきである。
生理活性剤は、当該技術分野において公知の様々な技術を用いて、担体粒子（例えば、コア担体）に被覆されるかまたは化学的に結合され得る。担体粒子は、細胞内送達に典型的に使用される粒径範囲で好適な密度を有する材料から選択される。最適な担体粒径は、当然ながら、標的細胞の直径に応じて決まる。例示的な粒子は、約０．０１〜約２５０μｍ、約１０〜約１５０μｍ、および約２０〜約６０μｍの範囲のサイズ；および約０．１〜約２５ｇ／ｃｍ３の範囲の粒子密度、および約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ３以上のかさ密度を有する。このタイプの非限定的な粒子としては、タングステン、金、白金およびイリジウム担体粒子などの金属粒子が挙げられる。直径０．５〜２．０μｍの平均サイズのタングステン粒子が、容易に入手可能である。金粒子または微結晶金（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ Ｎｅｗａｒｋ，Ｎ．Ｊ．から入手可能な金粉末Ａ１５７０）も使用され得る。金粒子は、サイズの均一性（１〜３μｍの粒径でＡｌｐｈａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能、または０．９５μｍを含む粒径範囲でＤｅｇｕｓｓａ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．から入手可能）および低い毒性を提供する。微結晶金は、典型的に、０．１〜５μｍの多様な粒度分布を提供する。微結晶金の不規則な表面積により、本発明の活性薬剤による高効率のコーティングが提供される。
金またはタングステン粒子などの粒子上に生理活性分子（例えば、タンパク質および核酸などの親水性分子）を吸着させる、カップリングするまたは他の形で結合するための多くの方法が公知であり、記載されている。例示的な例において、このような方法は、所定の量の金またはタングステンを、生理活性分子、ＣａＣｌ２およびスペルミジンと組み合わせる。他の例において、エタノールを用いて、金またはタングステン粒子上に生理活性分子を沈殿させる（例えば、Ｊｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｈｙｓ Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４９：３６０３−３６１２を参照）。得られた溶液は、好適には、コーティング手順の間、継続的にボルテックスされて、反応混合物の均一性を確実にする。生理活性分子の結合後、粒子は、例えば好適な膜に移され、使用前に乾燥され、試料モジュールもしくはカセットの表面に被覆され、または特定の粒子媒介送達機器に使用するための送達カセットに充填され得る。
製剤化された組成物は、標準的な技術を用いて、例えば、単純蒸発（空気乾燥）、真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥（凍結乾燥）、噴霧・凍結乾燥、スプレーコーティング、沈殿、超臨界流体粒子形成などによって、粒子として好適に調製され得る。必要に応じて、得られた粒子は、国際公開第９７／４８４８５号パンフレットに記載される技術を用いて緻密化（ｄａｎｄｉｆｉｅｄ）され得る。
６．１．５．界面活性剤
粒子に組み込まれ得る界面活性剤としては、ホスホグリセリドが挙げられる。例示的なホスホグリセリドとしては、ホスファチジルコリン、例えば、天然界面活性剤、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジパルミトイル（「ＤＰＰＣ」）が挙げられる。界面活性剤は、例えば、粒子間相互作用を低減することによって、表面特性を有利に向上させ、粒子の表面の接着性をより低くすることができる。肺内在性の界面活性剤の使用により、非生理的界面活性剤の使用の必要性が回避され得る。
粒子の表面に界面活性剤を提供することにより、静電相互作用、ファン・デル・ワールス力、および毛管現象などの相互作用による粒子の凝集傾向を低減することができる。粒子表面における界面活性剤の存在により、表面凹凸度（粗面度）を増加させ、それによって、密接な粒子間相互作用に利用可能な表面積を減少させることによってエアロゾル化を改善することができる。
任意の天然界面活性剤を含む、当該技術分野において公知の界面活性剤が使用され得る。他の例示的な界面活性剤としては、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサデカノール；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの脂肪アルコール；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；パルミチン酸もしくはオレイン酸などの表面活性脂肪酸；ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）；グリココーレート；サーファクチン；ポロキサマー；ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステル；チロキサポールおよびリン脂質が挙げられる。
本発明を容易に理解し、実際に実施することができるように、ここで、特定の好ましい実施形態が、以下の非限定的な実施例によって説明される。
実施例１
合成ペプチドコンビナトリアルライブラリーの作成
インビトロでヒト細胞中の実験的合成Ｔ細胞アゴニストのロバストでかつ再現可能な試験を可能にするシステムを提供するために、合成Ｄ−アミノ酸（「Ｄ−ＣＰＬ」）を用いたコンビナトリアルペプチドライブラリーを、Ｔ細胞ワクチンとして使用するための合成リガンドを同定するための新規なプラットフォームとして作成した。まず、９つの残基（九量体）Ｄ−ＣＰＬを、同時の複数ペプチド合成方法を用いて、先行技術の方法にしたがって製造した（Ｐｉｎｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：９０１−９０５，１９９２を参照）。ライブラリーは、ＯＸ８フォーマットの１８０の混合物からなり、ここで、Ｏは、定義された位置における２０の天然Ｄ−アミノ酸（すなわち、ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉ、ｆ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖ、ｗおよびｙ）のそれぞれを表し、Ｘは、残りの位置のそれぞれにおける２０のＤ−アミノ酸（システインを除く）のいずれかを表す（図１を参照）。
第１の混合物は、位置１においてＤ−アラニン（ａ）（ａ１Ｘ８）を有していた一方、混合物番号１８０は、位置０においてＤ−チロシン（ｙ）（ｘ８ｙ９）を有していた。したがって、各ＯＸ混合物は、ほぼ等モル濃度で１．７×１０１０（１９８）の異なる九量体ペプチドからなり、総Ｘ９ライブラリーは、３．４×１０１１（９×２０×１９８）の異なるペプチドからなっていた。各九量体の１０８０Ｄａの平均分子量および混合物中のノナペプチドの１００μｇ／ｍＬ（９３μＭ）の濃度を仮定すると、混合物中の個々のノナペプチドの平均濃度は、約５．５×１０−１５であった。
材料および方法
位置走査フォーマット（Ｐｅｐｓａｎ Ｐｒｅｓｔｏ；およびＷｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１０においてＬ−ペプチド合成について以前に記載されるように）におけるＤ−アミノ酸九量体ＣＰＬを、固相ペプチド合成および高速液体クロマトグラフィー（Ｐｅｐｓｃａｎ ＰｒｅｓｔｏおよびＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて高純度に作製した。
実施例２
Ｄ−アミノ酸アゴニストの同定
インフルエンザＡモデルを、概念データの証拠を得るために使用したが、このモデルは、ヒトＴ細胞記憶が、ヒトおよびヒト化マウスの両方を感染させ得る病原体を用いてインビトロで明らかに調べられるのを可能にする。合成アゴニスト設計の設計図は、マトリックスＭ１タンパク質からの免疫優勢ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ５８−６６（「ＧＩＬ」）ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ）であった。
第１の実験として、典型的なＴＲＢＶ１９陽性（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．１９９１を参照）ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＡＬＦ３を活性化するＧＩＬエピトープのレトロインバージョン（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）（すなわち、Ｄ−アミノ酸を示すのに使用される小文字を用いてｌｔｆｖｆｇｌｉｇ；（「ｌｔｆ」））の能力を調べた。Ｄ−アミノ酸レトロインバージョンは、それらの天然Ｌ−アミノ酸同等物と時々交差反応することが知られているため（Ｐｅｎｉｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１３に概説されている）、この実験を行った。ＡＬＦ３クローンにおけるＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ対ＨＬＡ−Ａ２−ｌｔｆ活性化の直接比較は、レトロインバージョンが免疫原性でなかったことを示し（図２Ａ）、この結果は、ＨＬＡ−Ａ２の結合裂け目内のｌｔｆの弱い結合によって影響される可能性が高い（図２Ｂ）。
ＣＰＬ走査は、ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発することが可能な非天然Ｄ−アミノ酸アゴニストのための体系的検索を可能にする。本質的に、ＴＣＲアミノ酸選択性の定量的で偏りのない決定のためのこのプラットフォームは、ＭＨＣ結合ペプチドの全骨格にわたり、Ｔ細胞アゴニストを同定し、および／または増大するための強力な手段である。病原体、癌、および自己免疫の設定においてＬ−アミノ酸ベースのｐＭＨＣ−Ｉアゴニストを生成するためにＣＰＬプラットフォームを使用することの成功（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｅｋｅｒｕｃｈｅ−Ｍａｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１４；およびＥｋｅｒｕｃｈｅ−Ｍａｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を所与として、非天然Ｄ−アミノ酸ベースのＣＰＬが、同様のシグナルおよび結果を引き起こし得るという仮説が立てられた。これを試験するために、新規なＤ−アミノ酸九量体ＣＰＬを合成し（実施例１を参照）、完全に定量的なＭＩＰ−１β ＥＬＩＳＡ読み取りを用いてＡＬＦ３ Ｔ細胞を刺激するために位置走査フォーマットに使用した（図３）。ＡＬＦ３を、ＧＩＬ特異的メモリー内のＴＲＢＶ１９遺伝子使用に対する共通のバイアスを表すように選択した（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｌｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；およびＮｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。注目すべきことに、ＭＨＣ−Ｉ制限ＴＣＲが定義された数の残基に及ぶ結合リガンドに噛み合うように予めプログラムされていることを示す過去のデータ（Ｅｋｅｒｕｃｈｅ−Ｍａｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照）を所与として、Ｄ−アミノ酸ＣＰＬは、ＧＩＬペプチドと長さが一致していた。従来のＬ−アミノ酸ＣＰＬ走査と対照的に、それは、１８０のペプチド混合物のほとんどにわたる限られた認識プロフィールを示し、Ｄ−ＣＰＬ走査は、ペプチド骨格に沿った全ての残基が、いくつかの異なるＤ−アミノ酸で潜在的に置換され得ることを示した。実際に、走査は、ＡＬＦ３ Ｔ細胞が、Ｌ−アミノ酸アゴニストと比較して多くのさらなるＤ−アミノ酸アゴニストを認識し得ることを示唆し、非古典的抗原に対するαβ ＴＣＲ監視の膨大な交差反応の可能性をさらに強調している。
材料および方法
ヒトＴ細胞クローンおよび標的細胞
ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＡＬＦ３およびＧＤを、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）および２．５％のＣｅｌｌｋｉｎｅｓ（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と一緒に、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｒ１０）が補充されたＲＰＭＩ培地中で維持した。Ｃ１Ｒ−ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（Ｃ１Ｒ−Ａ２）細胞を、以前に記載されるように生成し、Ｒ１０中で維持した。また、Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞に、レンチウイルスにより形質導入して、インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）からのＭ１タンパク質を発現した。Ｔ−リンパ芽球様ハイブリッド細胞株０．１７４×ＣＥＭ．Ｔ２（Ｔ２）を、Ｒ１０中で維持した。
ヒトＴ細胞のインビトロ増殖
ＰＢＭＣを、現地で得た（ｌｏｃａｌｌｙ ｓｏｕｒｃｅｄ）静脈血試料またはＷｅｌｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＵＫから入手したバフィーパック（ｂｕｆｆｙ ｐａｃｋ）から標準的な密度勾配遠心分離によって単離した。全てのドナーから、組織的ガイドラインにしたがってインフォームド・コンセントを得た。凍結保存されたＰＢＭＣを、Ｒ１０中で、指示された濃度のペプチドで刺激した。次第に増加する濃度のＩＬ−２を、２日目から、１４日目まで最大で２０ＩＵ／ｍＬになるまで添加した。次に、培養物を分析し、フローサイトメトリーによってソートした。
ＣＰＬ走査
ＣＰＬスクリーニングでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、Ｒ２（２％のＦＢＳを含む以外Ｒ１０と同様）中で一晩静置させた。標的細胞（ウェル当たり６×１０４個）を、３７℃で２時間にわたって２連で、ライブラリー混合物（１００μＭで）とともに９６ウェルＵ底プレート中でインキュベートした。その後、３×１０４個のクローンＣＤ８＋Ｔ細胞を添加し、アッセイを３７℃で一晩ンキュベートした。次に、上清を収集し、製造業者の指示（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって、ＥＬＩＳＡによってＭＩＰ−１βについてアッセイした。
個々のペプチドの滴定のための条件および分析を、所定のペプチド濃度を用いて、ＣＰＬと同様に行った。さらに、個々のペプチドの機能感受性は、ＴＣＲに関してそのペプチドのｐＥＣ５０によって表される。これは、機能感受性の増加がｐＥＣ５０値の増加に換算されるように、５０％の有効性濃度の１０を底とする対数のマイナス１倍として定義される。ｐＥＣ５０値は、以前に記載されるように推定した（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｌ．，Ｅｋｅｒｕｃｈｅ−Ｍａｋｉｎｄｅ，Ｊ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｈ．Ａ．，Ｓｋｏｗｅｒａ，Ａ．，Ｍｉｌｅｓ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ａ ｍｉｌｌｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：１１６８−１１７７を参照）。
実施例３
Ｔ細胞アゴニストを調製するための認識された残基の選択
実施例２に記載される定量的データによって情報を得て、本発明者らは、機能実験における競合試験のために８つのＤ−アミノ酸ペプチドアゴニストを設計し、合成した。生成されたペプチドが、以下の表に列挙される。
Figure 2019532103
読み取りとしてＭＩＰ−１β産生を用いた用量反応滴定は、ｇｐｐｑｗｎｎｐｐ（ｇｐｐ）、配列番号３が、ＡＬＦ３の最も強力な活性化因子であったことを示した（図４Ａ）。ｇｐｐ配列は、各インデックス位置におけるシグナル強度に関して優勢な残基を組み込んでいた。ｇｐｐは、Ｄ−アミノ酸同等物がそのために存在しないＮ末端グリシン残基がなければ、一次配列に関してＧＩＬとの類似性を有さないことも注目すべきである。この観察は、非関連アゴニストを同定するための手段としてのコンビナトリアルスクリーニングの能力を実証している。
次に、本発明者らは、各アゴニストが、ＡＬＦ３ Ｔ細胞を用いたペプチド滴定実験においてエフェクターアウトプット（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｏｕｔｐｕｔ）を誘発する能力を比較した。ＭＩＰ−１β産生（図５Ａ）および標的細胞死滅（図５Ｂ）の両方に関して、強い活性化が、ＧＩＬに対する応答において観察された。同様に、ｇｐｐは、強力な応答を引き起こしたが、より高い濃度のアゴニストが、各機能に必要とされた。本発明者らは、ｇｐｐのより低い機能感受性が、Ｄ−アミノ酸配列における従来のＨＬＡ−Ａ２アンカー残基の欠如を反映し得、それによって、二元ｐＭＨＣ−Ｉ複合体を不安定化するという仮説を立てた。Ｔ２ペプチド結合アッセイ（Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を用いて、本発明者らは、ｇｐｐの存在下でのＨＬＡ−Ａ２の弱い上方制御（図５Ｃ）を観察し、外因性β２−ミクログロブリンの添加後の改善はなかった（データは図示せず）（Ｎｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。このアッセイの限られたダイナミックレンジ（Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を所与として、本発明者らは、トランスジェニック細胞系におけるエピトープ提示を確認しようとした（図５Ｄ）（Ｐｕｒｂｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；およびＷｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明者らは、ｇｐｐパルスＨＬＡ−Ａ２−ＣＩＲ標的ではなく、ｇｐｐパルスＨＬＡ−Ａ２＋ＣＩＲ（Ｃ１Ｒ−Ａ２）標的が、ＡＬＦ３を活性化し得ることを見出した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２のα２ドメインにおけるＱ１１５Ｅ変異により促進されたＣＤ８結合を有するＣ１Ｒ−Ａ２標的が、ｇｐｐについての有効な提示細胞であった一方、ＨＬＡ−Ａ２のα３ドメインにおける化合物Ｄ２２７Ｋ／Ｔ２２８Ａ変異により無効にされたＣＤ８結合を有するＣ１Ｒ−Ａ２標的は、ｇｐｐがＡＬＦ３を活性化するのを可能にしなかった。これらの観察は、ｇｐｐが、ＨＬＡ−Ａ２によって制限され、ＣＤ８に応じた機能的アウトプットを引き起こすことを示す。
さらなる実験において、本発明者らは、別のＴＲＢＶ１９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン（ＧＤ）のアゴニスト誘導機能プロフィールを調べるために細胞内サイトカイン染色を使用した。５つの異なるエフェクターアウトプット（ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦα）を、１０−４Ｍで、２つの異なる濃度のｇｐｐおよびＧＩＬ（図６Ａ〜Ｄ）に応答して、フローサイトメトリーによって同時に測定し、ｇｐｐは、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦαの両方を発現する８０％超のクローンＧＤ細胞で、複数の機能を引き起こした。しかしながら、サイトカイン放出および細胞毒性データと一致して、より弱いプロフィールが１０−５Ｍで観察された。この感受性の低下は、ＨＬＡ−Ａ２に対するｇｐｐの弱い親和性に関連している可能性が高い。対照的に、天然ＧＩＬペプチドは、１０−４および１０−５Ｍで、より高い多機能的応答を引き起こした。
これらの観察を拡大するために、本発明者らは、インビトロでＧＩＬ特異的ヒト記憶Ｔ細胞を増幅するｇｐｐの能力を調べた。健常なＨＬＡ−Ａ２＋個体からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０日間にわたってｇｐｐまたはＧＩＬのいずれかで刺激し、特異的Ｔ細胞増殖を、蛍光色素標識四量体ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ複合体で染色した後、フローサイトメトリーによって定量化した（図５Ａ）。意外なことに、本発明者らは、ｇｐｐおよびＧＩＬの両方が、同等の数の四量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライムしたことを見出した。さらに、本発明者らは、完全長インフルエンザＡウイルスＭ１タンパク質を発現するＣ１Ｒ−Ａ２標的細胞に対する同等の機能的反応性を観察した（図５ＢおよびＣ）。これらのデータは、ｇｐｐが、ＨＬＡ−Ａ２に関して内因的にプロセシングされたＬ−アミノ酸標的抗原を認識することが可能なＧＩＬ特異的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖し得ることを示す。
材料および方法
ｐＭＨＣ−Ｉ四量体染色
可溶性のビオチン化ｐＭＨＣ−Ｉモノマーを、以前に記載されるように生成した（Ｌｉｓｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。四量体ｐＭＨＣ−Ｉ試薬（四量体）を、４：１のｐＭＨＣ−Ｉ：ストレプトアビジンモル比で、ＡＰＣ共役ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加によって構築した。ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンまたはバルク培養物（５×１０４）を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した後、３７℃で１５分間にわたってＡＰＣ標識四量体（２５μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて分析した。
細胞内サイトカイン染色
Ｔ細胞を、Ｒ２中でｍＬ当たり１×１０６個で、一晩静置させ、５μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３５μＬ／ｍＬのモネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および５μＬ／ｍＬのαＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、１：２のエフェクター：標的比で、ペプチドパルス標的に添加した。３７℃で５時間後、細胞を洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、続いてαＣＤ３−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、αＣＤ８−ＡＰＣＨ７およびαＣＤ１９−ＢＶ５２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。次に、細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定／透過処理し、αＩＦＮγ−ＰＥＣｙ７、αＴＮＦα−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５およびαＩＬ−２−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびαＭＩＰ−１β−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞内を染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて分析した。細胞集団ゲートを、以前に記載されるように蛍光マイナスワン染色対照を用いて設定した（Ｆｉｒａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
細胞毒性アッセイ
５１Ｃｒ放出アッセイを、標的としてＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２またはＭ１−Ｃ１Ｒ−ＨＬＡ−Ａ２細胞を用いて、以前に記載されるように行った（Ｔｕｎｇａｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。フローサイトメトリーアッセイを、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識標的を用いて行った。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞（ウェル当たり３×１０４個）を、３０℃で１時間にわたって１０−６ＭのＧＩＬペプチドでパルスし、１０分間にわたって０．２μＬのＣＦＳＥで標識して、ＣＦＳＥｈｉ標的を生成するか、またはパルスしないまま、１０分間にわたって０．０２μｌのＣＦＳＥで標識して、ＣＦＳＥｌｏ対照を生成した。標的および対照を、９６ウェルＵ底プレート中で、５：１のエフェクター：標的比で、Ｔ細胞の存在下または非存在下でインキュベートした。アッセイを、３７℃で一晩インキュベートした。収集した後、細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびαＣＤ８−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色してから、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて分析した。ペプチド特異的溶解を、Ｔ細胞の存在下でＣＦＳＥｌｏ対照と比べたＣＦＳＥｈｉ標的の低下パーセントとして決定した。
クローン型分析
生存四量体陽性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を、特注のＦＡＣＳＡｒｉａＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて９８％超の純度でソートした。発現されたＴＲＢ遺伝子再構成の分子分析を、以前に記載されるように（Ｑｕｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）Ｓａｎｇｅｒシーケンシング技術を用いたテンプレートスイッチ固定ＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。
実施例４
天然対合成アゴニストのプロテアーゼおよび酸耐性
生体内免疫応答を引き起こすために、抗原構造は、血清補体／プロテアーゼ、胃酸および消化酵素などの、侵入経路に関連する宿主バリアを渡らなければならない。これに関して、Ｄ−アミノ酸の鎖が、プロテアーゼに誘導される加水分解と立体的に適合しないと考えられることに注目することが妥当である（Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｌｕ，２０１４）。本発明者らは、長期の生物学的安定性および免疫原性の潜在的指標として、ヒト血清および模擬胃酸中でのｇｐｐおよびＧＩＬの安定性を比較した。ＧＩＬは、ヒト血清中で急速に分解され、１０分以内にほぼ検出できないレベルに達した（図４Ｂ）。対照的に、ｇｐｐは、ヒト血清中で１時間後にほぼ無傷のままであった。同様の相違が、模擬胃酸で観察された（図４Ｃ）。これらの観察は、ｇｐｐが、生体内で高度に安定している可能性が高く、潜在的に、ＧＩＬと比べてより有効な免疫プライミングを可能にすることを示す。
材料および方法
ＡＢ血漿からのヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２０，０００ＲＣＦで１０分間遠心分離して、脂質成分を除去した。血清上清を、ＭｉｌｌｉＱ水で２５％に希釈し、３７℃で１５分間インキュベートした。天然および合成ペプチド（９３％超の純度；ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の３連の試料を、２５％の血清での１：２０の希釈の後、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で同時にアッセイした。対照反応を、ＭｉｌｌｉＱ水中で同じ濃度に希釈されたペプチドを用いた単一の試験として設定した。アッセイを、３７℃で指示される時間にわたって行った。次に、各ペプチド溶液（１００μＬ）の試料を取り出し、等体積の１５％のトリクロロ酢酸水溶液と混合して、血清タンパク質を沈殿させた。反応物を、４℃で４０分間インキュベートし、１４，０００ＲＣＦで５分間遠心分離した。次に、上清を、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）による分析の前に、−２０℃で貯蔵した。これらの異なるイオンフラグメントを、各ペプチドについて監視した。安定性を、０分の時点の同じイオンピークに対する各血清処理されたイオンピークの面積パーセンテージとして計算した。模擬胃酸を、２０ｍｇのＮａＣｌおよび１６ｍｇのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、７０μＬの濃縮ＨＣｌに溶解させ、溶液を水で１０ｍＬに希釈する（最終ｐＨ１．２）ことによって調製した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。天然および合成ペプチドの３連の試料を、模擬胃酸中で希釈して、上述されるようにアッセイした。対照反応を、ペプシンなしで、模擬胃酸中で同じ濃度に希釈されたペプチドを用いた単一の試験として設定した。アッセイを、３７℃で指示される時間にわたって行った。次に、各ペプチド溶液（１００μＬ）の試料を取り出し、ＬＣＭＳによる分析の前に、−２０℃で貯蔵した。パーセンテージで示されるデータを、全てのアッセイについて平方根変換した。Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いたＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ方法（Ａｌｐｈａ ０．０５）を用いた多重比較のために補正された独立ｔ検定（１つの時点につき１つ）を用いて、統計分析を行った。
実施例５
天然対合成アゴニストの構造配置
この設定でアゴニスト交差認識（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の分子基盤を決定するために、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐｐ複合体の二元構造を解決しようとした。リフォールディングされたタンパク質の収量は、おそらく、ＨＬＡ−Ａ２に対するｇｐｐの弱い親和性を反映して、非常に少ないが、本発明者らは、同じ結晶を生成することができた。しかしながら、これらの結晶は、原子の解像度まで回折することができなかった。したがって、本発明者らは、指針としてＪＭ２２−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ三重複合体（Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）を用いて、ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐｐ構造をインシリコでモデル化した（図８ＡおよびＢ）。このモデルは、ｇｐｐが、ＧＩＬのものと類似の全体配置でＨＬＡ−Ａ２によって提示され得ることを示す。特に、Ｄ−アミノ酸残基Ｇｌｕ４、Ｔｒｐ５、Ａｓｐ６およびＰｒｏ８は、溶媒で露出され、ＪＭ２２−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ複合体において確認される主なＴＣＲ接触残基を三次元で模倣している（図８Ｃ）（Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、ｇｐｐとＧＩＬとの間の配列相同性の欠如にかかわらず、両方の抗原は、形状相補性に関して類似して見える。
材料および方法
ＨＬＡ−Ａ２と複合体化されたｇｐｐの構造を、対照としてＪＭ２２ ＴＣＲ−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＩＬ三元構造を用いてＷｉｎＣｏｏｔ中でモデル化した（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照）。このモデルを、ＲＥＦＭＡＣ５を用いて正規化した。
実施例６
合成アゴニストは、致死性インフルエンザ抗原投与から保護し得るＴ細胞応答を有効にプライムする
これらの観察の生物学的関連性を評価するために、本発明者らは、未処理のＴ細胞プールからの有効なデノボ応答をプライムするｇｐｐの能力を試験した。本発明者らは、同様のトランスジェニックマウスシステムにおける過去の研究（Ｐｌｏｔｎｉｃｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）に基づいて、この目的のためにトランスジェニックＨＬＡ−Ａ２ ＨＨＤマウスを使用した。マウスに、０日目および１４日目に、不完全フロイントアジュバント中で、ＧＩＬ、ｇｐｐまたは非関連ＨＬＡ−Ａ２制限Ｌ−アミノ酸ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を注射した。予備投与実験は、ｇｐｐが安全でかつ非毒性であることを示した（データは図示せず）。２回目の注射の１週間後、細胞を、脾臓および末梢リンパ節（ＰＬＮ）から採取した。直接の生体外ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて、本発明者らは、ｇｐｐが、生体内ＧＩＬ特異的応答を誘導し、ＰＬＮ中で最も顕著に検出可能であったことを見出した（図９Ａ）。このような応答が、ＧＩＬのｌｔｆレトロインバージョンで観察された（データは図示せず）。
次に、マウスに、同じ投薬計画で免疫付与し、その後、２１日目に鼻腔内的にインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）に感染させた。ＰＲ８感染後６日目に、対照ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶペプチドでワクチン接種されたマウスは、早くも死亡し始めた（図９Ｂ）。対照的に、ＧＩＬまたはｇｐｐのいずれかでワクチン接種されたマウスは、かなり良好な結果になり、８日目の生存率が６０％を超えていた。ＧＩＬ群に対してｇｐｐ群においてより良好な結果になる傾向が観察されたことも注目される。
これらの知見を拡大するために、本発明者らは、経口投与されたｇｐｐの免疫原性効果を評価し、これは、模擬胃酸中で安定していた（図４）。強制経口投与によって、１週間間隔で炭酸水素ナトリウム中のアジュバントなしのｇｐｐ（合計で３００μｇ）を、マウスに３回用量で投与した。最後の投与の１週間後、細胞を、腸間膜リンパ節から採取し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてＧＩＬ反応性について試験した（図２Ｃ）。かなりのＧＩＬ特異的応答が、ｇｐｐでワクチン接種されたマウスにおいて検出されたが、モックでワクチン接種された対照では観察されなかった。まとめると、これらの実験は、ｇｐｐが、インフルエンザウイルス感染のヒト化マウスモデルにおいて保護免疫応答をプライムし得ることを実証している。
材料および方法
マウス
全てのマウス実験は、ｔｈｅ ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ １９８６ ｕｎｄｅｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅｓ ３０／２３５５、３０／２６３５および３０／３１８８にしたがって行った。ＨＨＤマウスは、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ Ｌｔｄ．（Ｄｉｄｃｏｔ，ＵＫ）によって寄付として提供されるか、またはオックスフォード大学ウェザオール分子医学研究所（ｔｈｅ Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ）（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）から購入された。これらのマウスは、マウスα３ドメイン（Ｈ−２Ｄｂ）［５７，５８］と融合されたヒトα１／α２ドメインおよびβ２−ミクログロブリンを含むハイブリッドＨＬＡ−Ａ２導入遺伝子を発現する。マウスを、特定の病原体フリー条件下で全体を通して飼育した。
免疫付与、臓器摘出およびインフルエンザ感染
１００μｇのペプチド（ＧＩＬ、ｇｐｐまたはＥＬＡ）および１００μＬの不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２００μＬのＰＢＳ調製物の前面鼠径部への注射によって、ＨＨＤマウスをプライムした。同じ調製物を用いて、１４日後に反対側にブーストした。注射部位の隆起部の形成を確実にすることに留意し、これは、ワクチンが、腹腔内ではなく皮下に送達されたことを示す。臓器摘出を含む実験では、マウスを、最後の免疫付与の７日後に安楽死させ、末梢リンパ節（鼠径部、腋窩、上腕および顎下腺）を、単一の細胞懸濁液として調製した。抗原投与実験では、マウスを、イギリス国立医学研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から入手したインフルエンザＡウイルス株ＰＲ８に鼻腔内的に感染させた。用量最適化実験に基づいて、浅麻酔下で、５０μｌの滅菌ＰＢＳ中のＰＲ８を、雄マウスに、１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）与え、雌マウスに５０ＰＦＵ与えた。体重を感染後に毎日記録した。マウスの体重が２０％超減少した場合、マウスを非生存マウスとして分類し、安楽死させた。全ての他のマウスを、感染の８日後に安楽死させた。
マウスインターフェロン−γ ＥＬＩＳＰＯＴ
ＩＦＮγ産生細胞を、マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｋｉｔ（ＭａｂＴｅｃｈ）を用いて定量化した。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＰＯＴマルチスクリーンフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、３７℃で４時間にわたって捕捉抗体で被覆し、次に、ＰＢＳで洗浄し、室温で１時間にわたってＲ１０でブロックした。細胞を、１０−５Ｍの最終濃度で、ペプチドの存在下で、ウェル当たり２×１０５個で添加した。媒質のみを陰性対照として使用し、ＰＨＡ（１μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。アッセイを、３７℃で一晩インキュベートし、プレートを、製造業者の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）にしたがって発色させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。スポット形成単位（ＳＦＵ）を、ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｅｒ ｖ５（ＡＩＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ）を用いて計数した。
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書におけるいずれの参考文献の引用も、このような参考文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書全体を通して、その目的は、いずれか１つの実施形態または特徴の特定の集合に本発明を限定せずに、本発明の好ましい実施形態を説明することであった。したがって、当業者は、本開示を考慮して、本発明の範囲から逸脱せずに、例示される特定の実施形態に様々な変更および変形を行うことができることを理解するであろう。全てのこのような変更および変形は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
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Claims (35)

  1. 複数のペプチドセットであって、各セットが前記ペプチドの異なるアミノ酸位置（「インデックス位置」）を調べる複数のペプチドセットと、複数の別個のペプチド混合物とを含む、コンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）であって、ここで、各混合物が、前記インデックス位置において単一の定義されたＤ−アミノ酸（すなわち、ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉ、ｆ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖ、ｗ、ｙ、またはそれらの修飾形態）を有し、一つ置きの位置が、ランダムＤ−アミノ酸であり、セットの数が、前記ペプチド中に存在する位置の数に等しいコンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）。
  2. 前記ペプチド混合物が、前記インデックス位置以外の各位置における各アミノ酸のほぼ等しい提示を含む、請求項１に記載のＣＰＬ。
  3. 前記インデックス位置以外の位置における前記Ｄ−アミノ酸が、システインを除外する、請求項１に記載のＣＰＬ。
  4. 前記混合物中の各ペプチドが、ほぼ等モル濃度で存在する、請求項２に記載のＣＰＬ。
  5. 前記ペプチドが、ＭＨＣ分子によって提示されることが知られている長さのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＰＬ。
  6. 前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子である、請求項４に記載のＣＰＬ。
  7. 前記ペプチドが、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＰＬ。
  8. 各混合物が、マルチウェルプレートの別個のウェル中に位置する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＰＬ。
  9. 前記ペプチド混合物が、ＭＨＣ分子と接触される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＰＬ。
  10. Ｔ細胞ペプチドアゴニストを同定する方法であって、
    コンビナトリアルペプチドライブラリー（ＣＰＬ）を、対象とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することが知られているＭＨＣクラスＩ分子に提供する工程であって、前記ＣＰＬが、複数のペプチドセットであって、各セットが前記ペプチドの異なるアミノ酸位置（「インデックス位置」）を調べる複数のペプチドセットと、複数の別個のペプチド混合物とを含み、各混合物が、前記インデックス位置において単一の定義されたＤ−アミノ酸（すなわち、ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉ、ｆ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖ、ｗ、ｙ、またはそれらの修飾形態）を有し、一つ置きの位置が、ランダムＤ−アミノ酸であり、セットの数が、前記ペプチド中に存在する位置の数に等しい、工程と；
    各ＭＨＣおよびペプチド混合物を、前記標的抗原に結合することが知られているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と接触させて、前記ペプチドの各インデックス位置において認識される前記Ｄ−アミノ酸を決定する工程と；
    各インデックス位置において認識されるＤ−アミノ酸を選択することによってアミノ酸配列を生成して、それによって、前記標的抗原に対する免疫応答を引き起こすかまたは促進するＴ細胞アゴニストを同定する工程と
    を含む方法。
  11. 前記ＭＨＣ分子が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に存在する、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ＴＣＲが、エフェクター細胞の表面に提示される、請求項９または請求項１０に記載の方法。
  13. 前記エフェクター細胞が、前記標的抗原を認識することが知られているＴ細胞である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記ペプチド混合物が、約１μＭ〜約５００μＭの濃度で、前記ＴＣＲと接触される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ペプチド混合物が、約１００μＭの濃度で、前記ＴＣＲと接触される、請求項１３に記載の方法。
  16. 各Ｄ−アミノ酸のＴＣＲ認識の前記決定が、エフェクター細胞機能に基づいて選択される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記エフェクター細胞が、標的抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記エフェクター細胞機能が、細胞毒性アッセイ、またはサイトカインおよび／またはケモカイン放出の測定によって決定される、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
  19. 前記サイトカインおよび／またはケモカイン放出が、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＭＨＣ−ペプチド四量体染色、またはフローサイトメトリーを用いて測定される、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記サイトカインおよび／またはケモカインが、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＦＮβ、ＣＤ１０７ａ、およびＲＡＮＴＥＳを含む群から選択される、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
  21. 前記細胞毒性アッセイが、クロム放出アッセイである、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記スクリーニングが、免疫原性について前記同定されたＤ−アミノ酸ペプチドを試験する工程をさらに含む、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 式Ｉ：
    Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
    （式中：
    Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
    Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
    Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
    Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
    によって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる免疫調節Ｄ−アミノ酸ペプチド。
  24. 配列番号３〜１０に記載されるＤ−アミノ酸配列のいずれか１つを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項２３に記載の免疫調節Ｄ−アミノ酸ペプチド。
  25. 前記Ｄ−アミノ酸配列が、配列番号３に記載される配列を含む、請求項２３または請求項２４に記載の免疫調節Ｄ−アミノ酸ペプチド。
  26. 式Ｉ：
    Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
    （式中：
    Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
    Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
    Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
    Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
    によって表されるアミノ酸配列を有するＤ−アミノ酸ペプチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、標的抗原に対する免疫応答を引き起こすかまたは促進するための組成物であって；
    前記標的抗原が、インフルエンザマトリックスＭ１タンパク質である組成物。
  27. 配列番号３〜１０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記Ｄ−アミノ酸ペプチドが、配列番号３に記載される配列を含む、請求項２６または請求項２７に記載の組成物。
  29. 粒子状形態である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のＤ−アミノ酸ペプチド、または請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
  31. ワクチンとして製剤化される、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 経口投与用に製剤化される、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. インフルエンザを処置するための方法であって、Ｄ−アミノ酸ペプチド抗原を対象に投与する工程を含み、ここで、前記Ｄ−アミノ酸ペプチドが、式Ｉ：
    Ｘ１ Ｘ２ ｐ Ｘ３ Ｘ４ ｎ ｎ ｐ ｐ （Ｉ）
    （式中：
    Ｘ１は、ｇまたはｒから選択され；
    Ｘ２は、ｐまたはｆから選択され；
    Ｘ３は、ｐまたはｑから選択され；
    Ｘ４は、ｗまたはｇから選択される）
    によって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる方法。
  34. 前記アミノ酸配列が、配列番号３〜１０のいずれか１つに記載される配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記アミノ酸配列が、配列番号３に記載される配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
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