JP4755649B2 - Ｈｓｐ６０のペプチド及びａｐｌ型誘導体並びに医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、６０ｋＤａのヒト熱ショックタンパク質（略してｈＨｓｐ６０）のペプチド及びそれから誘導される改変ペプチドリガンド（略してＡＰＬ）に関する。また、本発明は、そのようなペプチドを含む、関節リウマチ（ＲＡ）治療のための医薬組成物に関する。

ＲＡは、世界の人口の約１％が罹患している病因の不明な自己免疫疾患である。この疾患は、関節の慢性の炎症を特徴とする症候群であるが、全身性の症状が認められる場合もある。この疾患は、滑膜の炎症から始まり、しばしば近接する軟骨及び骨の侵食性の破壊を引き起こすが、これによって患者の８０％が中程度の身体的不能となり、早期の死がもたらされる（Ｍｏｃｔｅｚｕｍａ，Ｊ．Ｆ．（２００２）「関節リウマチの関節症状（Ｍａｎｉｆｅｓｔａｃｉｏｎｅｓ ａｒｔｉｃｕｌａｒｅｓ ｄｅ ｌａ Ａｒｔｒｉｔｉｓ Ｒｅｕｍａｔｉｄｅ．）」Ｒｅｖｉｓｔａ Ｍｅｘｉｃａｎａ ｄｅ Ｒｅｕｍａｔｏｌｏｇｉａ １７：２１１−２１９）。ＲＡは、人種又は民族の区別なくいかなる年齢でも見られるが、その発端の最大の出現率は、２５〜５５才の間にある。ＲＡの人々の中でも、３対１の比率で女性が男性を上回っている（Ｅｍｅｒｙ，Ｐ．（２００２）「新しく診断された関節リウマチの早期照会の勧め：証拠に基づいた臨床ガイドの開発（Ｅａｒｌｙ ｒｅｆｅｒｒａｌ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ．）」Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．６１：２９０−２９７）。

ＲＡの原因は不明である。ＲＡは、遺伝的、環境的、免疫学的、及びホルモン性の要因の存在が関与する疾患である。ある種の遺伝子は、免疫系において、ＲＡになる傾向と関連付けられる役割を有する。同時に、そのような遺伝子をもたないＲＡ患者もおり、またそうした遺伝子をもちながら決してこの疾患にかからない者もいる。したがって、遺伝的背景は重要であるが決定的ではないことが示唆されている。

自己免疫疾患モデルでは、自身の抗原と同様の構造を有する微生物抗原が、自己抗原に対する交差性の応答を解除して、寛容性の機序の変化を生み出し、自己免疫応答を永続させ得る。一般的な意味では、感染性病原体によって組織中に損傷及び局所的な壊死を生じさせることで、自己抗原潜在性エピトープを発見し、自己反応性のＴ細胞を活性化することができた（Ａｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ｊ．（１９９９）「疾患の機序：分子擬態と自己免疫（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｍｉｃｒｙ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．）」Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４１：２０６８−２０７４）。

Ｔリンパ球の寛容と免疫／自己免疫の間の移行期は、種々のレベルで調節される。この移行における２種の重要なパラメータは、抗原提示細胞（略してＡＰＣ）の成熟状態及び免疫系によって検出される自己抗原のレベルである（Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．Ｓ．（２００２）「寛容性の獲得及び破壊（Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４：７４４−７５９）。

自己免疫疾患の発生の説明を試みる現在の仮説の１つでは、ＡＰＣは、生得免疫系によるサイン又は危険のサインなしでは相対的に未成熟のままであり、これらに自身のペプチドが提示されるときは自己反応性Ｔ細胞の寛容性を誘発するという概略が述べられている（Ｓｔｅｉｍａｎ，Ｒ．Ｍ．（２０００）「アポトーシス細胞を捕捉した樹状細胞による寛容性の誘発（Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｃａｐｔｕｒｅｄ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．）」 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９１：４１１−４１６）。末梢性寛容の誘発は、自身の抗原の濃度とも相関がある（Ｋｕｒｔｓ，Ｃ．（１９９９）「島状抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞イグノランス又は寛容性は抗原投与量に依存する（ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｇｎｏｒａｎｃｅ ｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｉｓｌｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｏｓｅ．）」ＰＮＡＳ ９６：１２７０３−１２７０７）。それらの発現レベルの増加のために自身の抗原の提示が増加すると、自己反応性の無知な（ｉｇｎｏｒａｎｔ）Ｔ細胞によってそれらが検出されるようになる。ＡＰＣの成熟を促進する事象の存在なしで自身の抗原のレベルが増大すれば、これらの抗原に対する寛容性は維持され、そうでなく炎症促進性のサイン又はＡＰＣの成熟を促進する他の事象の存在下でこれが起これば、無知な（ｉｇｎｏｒａｎｔ）Ｔ細胞の活性化によって寛容性が破られ、自己免疫疾患になる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．（２００２）「生得的免疫認識（Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．）」Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１９７−２１６）。ＲＡの原因のような研究対象となっている感染性病原体は、中でも、エプスタイン・バーウィルス、レトロウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、結核菌（略してＭｔ）、及びヘリコバクターピロリである。

ＲＡの病因は、軟骨及び骨の進行性の破壊を引き起こす、異なる種類の細胞による協調作用を特徴とする。

正常な状況では、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、及びＩＦＮγのような炎症性サイトカインと、ＩＬ−４、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１又はＴＮＦαのアンタゴニストのような抗炎症性サイトカインとの間にバランスが存在する。しかし、ＲＡではこのバランスが炎症性サイトカインの方に傾く（Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．（２００１）「関節リウマチの病因におけるサイトカインアンバランス：インターロイキン−１受容アンタゴニストの役割（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．）」Ｓｅｍｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３０（２）：１−６）。

外来抗原又は自己抗原の認識はおそらく、ＲＡ患者において関節の破壊を引き起こす一連の事象の動機である。この現象は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化を引き起こし、この活性化が、種々のサイトカインの刺激と協同してそのＴｈ１細胞への分化を誘発し、その結果として炎症促進性のサイトカイン（ＩＬ−２及びＩＮＦγ）が放出される（Ｓｉｍｏｎ，Ａ．Ｊ．（２００１）「関節リウマチの生物学的な治療（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）」Ｍａｇａｚｉｎｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ５３（５）：４５２−４５９）。多くの研究者が、関節の慢性的な炎症は、滑膜に浸透するこれらの活性化したＴ細胞によって誘発されるという見解を同じくしている。これらサイトカインがマクロファージに及ぼす作用が、多量のＴＮＦα及び１Ｌ−１の産生を引き起こす。これらは、他の細胞を炎症部位に補充する、内皮細胞の接着分子（ＬＦＡ１、１ＣＡＭ−１）の発現を調節しながら、一連の局所性及び全身性作用を引き起こす。これらはまた、マクロファージ、線維芽細胞、軟骨細胞、及び溶骨細胞を刺激して、ＩＬ−１５及び１Ｌ−８のような他の炎症メディエーターを放出させる。ＴＮＦα及びＩＬ−１は、パンヌスの形成を引き起こす滑膜増殖を刺激し、また、Ｂリンパ球が、関節の破壊に関与する可能性を秘めた抗体産生細胞に分化するように誘発することもできる。これらはまた、Ｔｈ２細胞によって産生される抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−４及びＩＬ−１４）の産生を抑制し、肝実質細胞を刺激して、ＩＬ−６を放出させる。ＩＬ−６は、免疫応答の強化に関与する急性期タンパク質の産生に好都合である（Ｆｏｒｒｅ，Ｏ．（２０００）「ＡＲ治療の新たな可能性（Ｎｅｗ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ＡＲ）」．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２９（２）：７３−８４）。

ＲＡの病因に関与する自己抗原には、例外的に進化の過程で保存されてきた免疫原性タンパク質であるＨｓｐのファミリーに属するタンパク質、Ｈｓｐ６０が含まれる。未知のＨｓｐに対する免疫応答は、細菌感染に対する重要な防御機構である。これらのタンパク質に対する抗体は、健常者及び自己免疫疾患患者において豊富であり、自身の抗原と交差反応することもある。（Ｃｈｅｎ，Ｗ．（１９９９）「ヒト６０−ｋＤａ熱ショックタンパク質：生得免疫系への危険信号のために（Ｈｕｍａｎ ６０−ｋＤａ Ｈｅａｔ−Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｔｏ Ｄａｎｇｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．）」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３２１２−３２１９）。

ＭｔのＨｓｐ６５は、哺乳動物のＨｓｐ６０に相同的である。このことは、Ｈｓｐ６０がＲＡ患者で自己抗原として認識され得ることを示唆している。変形性関節炎患者とＲＡ患者とを比較すると、後者は、滑液中でマイコバクテリウムＨｓｐ６５に対するＢリンパ球の増殖性応答が増大している。応答の強度は、滑液の炎症と相関する。この応答は、他の炎症性疾患と比べるとＲＡに特異的でない（Ｌｉｆｅ，Ｐ．（１９９３）「若年性慢性関節炎患者の滑膜Ｔ細胞によるグラム陰性腸内細菌抗原に対する応答：熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０の認識（Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｎｔｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｓｙｎｏｖｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｓ ｗｉｔｈ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｓｐ６０．）」Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０：１３８８−１３９６）。

Ｈｓｐの濃縮は、免疫系への危険サインである可能性があるが、これは、死細胞から放出されるものであり、これによって炎症応答を誘発して、ＡＰＣの成熟を始めることができる。Ｈｓｐは、細胞膜で発現されず分泌もされない細胞内タンパク質であるので、Ｈｓｐは、危険サインとなる分子の魅力的な候補である（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，ＷＢ．（１９９８）：「関節炎と軟骨破壊は別々に起こり得る（Ｊｏｉｎｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｙ ｏｃｃｕｒ ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ．）」．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０：１４９−１６４）。

一部の自己免疫性病態の治療に向けて、Ｈｓｐ６０又はその誘導ペプチドを使用するいくつかの調製物が提案されている。たとえば、特許ＥＰ０２６２７１０では、自己免疫疾患、特に関節炎状態の治療及び診断に向けた、いくつかのＭｔ Ｈｓｐ６０ペプチドの使用が提案されている。本発明は、遺伝的に影響されやすい者ではいくつかの細菌による以前の感染症が自己免疫疾患発生のきっかけとなり得る、たとえば、ＲＡ患者が微生物抗原に対して高い反応性を示し得るという事実に基づく。

その同じ発明者らは、特許ＥＰ０３２２９９０で、以前の特許と同じ目的での他のＭｔ Ｈｓｐ６０ペプチドの使用を提案している。

特許出願ＷＯ９６１００３９では、彼らは、自己免疫性関節炎の診断及び治療に向けたＭｔ Ｈｓｐ６０ペプチドの使用を企図している。

特許出願ＷＯ９７１１９６６では、著者らは、ＲＡ患者のＴ細胞において寛容性を誘発し得るはずの細菌Ｈｓｐ６０と一致しない、ｈＨｓｐ６０の非保存領域のペプチドの使用を企図している。

特許出願ＷＯ０１４３６９１は、詳細にはｈＨｓｐ６０ペプチド及びその変異体によって構成された医薬調製物の、ＲＡなどの炎症性疾患の予防に向けた使用を提案している。

特許ＵＳ６１８０１０３では、著者らは、ｐ２７７と呼ばれるＨｓｐ６０ペプチド及びその類似体の、Ｉ型糖尿病の診断及び予防に向けた使用を企図している。

特許ＵＳ５９９３８０３は、臓器移植の際の免疫応答の重症度を軽減するための、Ｈｓｐ６０、ペプチドｐ２７７、及びこのタンパク質の一群の誘導ペプチドの使用を保護している。

最近では、アテローム性動脈硬化が、自己免疫の過程と同様の一連の特徴を示すと考えられている。特許出願ＷＯ００７２０２３では、著者らは、タンパク質Ｈｓｐ６０を含む調製物を使用する、アテローム性動脈硬化及び冠疾患を治療及び診断するための方法を提案している。

特許出願ＷＯ０２０５７７９５では、Ｈｓｐファミリーのタンパク質及びウィルスや細菌などの病原体由来のタンパク質を使用する、骨粗鬆症の診断及び治療のための新しい方法が保護されている。

現時点では、ＲＡについて治癒は存在しない。現在の治療法は、痛みを緩和して、炎症を軽減し、関節の損傷を遅延し、患者の機能及び健康を向上させることに集中している。最近では、疾患の進行を止め又は緩慢にする目的で、ＲＡにおいて炎症応答の開始及び維持に関与するサイトカインをブロックする免疫調節性の薬物療法が入念に仕上げられた。この種の治療では、２タイプの薬物療法、即ち、腫瘍壊死因子（略してＴＮＦα）の作用をブロックするもの、及びインターロイキン１（ＩＬ−１）の作用を抑制するものが存在する。

抗ＴＮＦα及び抗ＩＬ−１療法で成果は見込まれるものの、感染症の割合が高い。これらの薬物による治療を受けた患者の多くは、場合によっては致命的となる、他の自己免疫疾患、新形成などを含む重篤な感染症にかかる。その上、これらは非常に高価な薬物療法である（Ｂｒｅｓｈｉｎａｎ，Ｂ．（１９９８）「組換え型ヒト抗インターロイキン−１アンタゴニストによる関節リウマチ治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．）」Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｕｍ．４１：２１９６−２２０４）。

経口免疫寛容は、ある特定の抗原を前にして末梢性の寛容を与える方法として提案されている。これは、抗原の投与量及び投与頻度に応じて、能動的な抑制、アネルギー（ａｎｅｒｇｙ）、又はクローン除去の機序によって誘発することができる。この方法は、抗原によって特異的に活性化されるが、その作用を独立して発揮する調節性のＴ細胞を誘発することができる（能動的な抑制）。実施される調節性の作用については、病原性であると推定される抗原を投与する必要はないが、炎症性の病巣において能動的な抑制を誘発し、病原性のあるエフェクター細胞の活動を抑制することのできる他の任意のものを投与する必要がある。ＩＩ型コラーゲン（略してＣＩＩ）は、この意味でより頻繁に使用されている自己抗原である。ニワトリ及びウシのＣＩＩを使用してＲＡ患者で実施された研究の結果からは、矛盾する結果が得られた（Ｔｒｅｎｔｈａｍ，Ｄ．Ｅ．（１９９３）「関節リウマチにおけるＩＩ型コラーゲン経口投与の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１７２７−１７３０；Ｓｉｅｐｅｒ，Ｊ．（１９９６）「早期関節リウマチにおける経口ＩＩ型コラーゲン治療：二重盲検プラセボ対照無作為化する試験へ（Ｏｒａｌ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｔｏ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅ ｔｒｉａｌ．）」Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３９：４１−５１）。

特許ＵＳ６１５３２００は、ＲＡ患者において経口経路で寛容性を誘発するための、Ｈｓｐファミリーに属するタンパク質であるＨｓｐ７０ペプチドの使用を企図している。

ある特定の抗原ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球が、応答能のあるＡＰＣによって提示された抗原を認識するとＴ細胞が活性化されるという事実に基づき、寛容性を誘発することが示唆されている別の変異体は、ＡＰＬペプチドである。やはり、ＴｃＲとの接触部位の１箇所が軽く変更されている、抗原とは異なる形の同じＴ細胞が最初に活性化されるなら、Ｔ細胞は部分的にしか活性化され得ず、又は不活化されることさえある。このような抗原をＡＰＬと名付ける。ＡＰＬは、免疫原性ペプチドに類似しており、ＴｃＲ又はＭＨＣと接触する重要な位置で１箇所又は数箇所が置換されており、これによってＴ細胞の完全な活性化に必要な事象のカスケードが妨げられる。

概念上、特定の抗原に対するＴ細胞の応答を増大させる他の効果の中では、免疫原性ペプチド（アゴニスト）と同様の特性を有するＡＰＬを設計することができる。この効果は、感染症としての病理学的状態のもとで有利である。免疫原性ペプチドに対してアンタゴニストの特性を有するペプチドを設計することもできるが、このペプチドは、ＴｃＲのアンタゴニスト（Ｍ．Ｄｅ Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ（１９９２）「抗原類似物−主要組織適合遺伝子複合体の複合体はＴ細胞受容体アンタゴニストとして作用する（Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎａｌｏｇ−ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｃｔ ａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｃｅｌｌ ６８：６２５−６３４）、部分アゴニストとして作用し、又は能動的な抑制を媒介する調節性Ｔ細胞の集団を誘発するＴ細胞の応答をブロックすることができるので（Ｅｖａｖｏｌｄ，Ｂ．Ｄ．（１９９１）「変更型Ｔ細胞リガンドによるＴｈ細胞増殖からのＩＬ−４産生の分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｔｈ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｇａｎｄ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１３０８−１３１０）、自己免疫疾患の制御において有利となり得るはずである。ペプチドリガンドの固有の特性を実験的に操作することができるので、免疫細胞応答の性質、進路、及び威力を適切に変更することができる。

現在までに、ＡＰＬ型ペプチドを使用する２件のヒトにおける臨床試験が、自己免疫疾患の治療に向けて実施されている。どちらの検定でも、ペプチドは、ミエリン塩基性タンパク質の８３〜９３位にあるエピトープから誘導されるものである。これらの試験一方は、１４２人の多発性硬化症患者を含んでいたが、患者の９％が過敏症になったので中止された（Ｌｕｄｗｉｇ Ｋａｐｐｏｓｉ （２０００）プラセボ対照無作為化第２相試験での、改変ペプチドリガンド投与後の多発性硬化症における非脳炎惹起性２型Ｔヘルパー細胞自己免疫応答の誘発（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃ ｔｙｐｅ ２ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｔｏ ｐｌａｃｅｂｏ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ．）」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：１１７６−１１８２）。

他方の試験は、２５人の患者を含み、３人の患者に疾患の悪化が認められたのでこれも中断された（Ｂｉｂｉａｎａ Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ （２０００）多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質ペプチド（アミノ酸８３〜９９）の脳炎惹起の可能性：改変ペプチドリガンドを用いた第２相臨床試験の結果（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ （ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ８３−９９）ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｏ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ．）」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：１１６７−１１７５）。この研究の中心となる著者は、これらの否定的な結果を決定した、考えられる要因を分析しＡＰＬの部位で行われた変更が、（患者Ｉ中に存在するＡＰＬがＤＲＢ１＊０４０４に結合する場合に起こるように）ＨＬＡに合致する新しいモチーフを創出することがあり、そのＡＰＬ−ＨＬＡ複合体も、天然自己抗原によって交差活性化され得る、ネガティブ選択で排除されないＴ細胞を刺激し得るという概略を述べている。この試験では、自己抗原に対して高い類似性でＴ細胞を刺激することのできる高濃度のＡＰＬが医薬品調製物中に使用されて、異常なＴ細胞応答が誘発された（Ｂｉｂｉａｎａ Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ ａｎｄ Ｒｏｌａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ（２００１）「改変ペプチドの結合による抗原特異性の免疫調節（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｙｉｎｇ．）」Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７９：５５２−５５６）。

これら２種の臨床試験の実施に向けて、著者らは、患者からのＴ細胞のＡＰＬに対するｉｎ ｖｉｔｒｏの応答を事前に分析しなかった。著者らはまた、治療を受けた患者によって発現されるＨＬＡ分子のタイプを考慮しなかった。

自己免疫疾患治療の中心となる挑戦は、他の無関係のＴ細胞に影響することなく、病原性のあるＴ細胞を特異性によって排除することのできる治療戦略の開発である。したがって、治療の探索では、進行型の自己免疫過程を止める安全、特異的、且つ有効な方法を見つけるべきである。

本発明は、以前の技術の状況とは対照的に、ＲＡの過程の抑制性の分子機序を特異的な方法で誘発する、ｈＨｓｐ６０ペプチド及びその誘導型のＡＰＬの使用を提案する。

本発明は、ＲＡ患者において、Ｔ細胞のためのエピトープを構成して、寛容性の機序、特にアネルギー誘発機序、又は調節性Ｔ細胞のクローンによって媒介される機序を誘発し、以下の配列を示す６０ｋＤａのヒト熱ショックタンパク質のペプチドを提供して前述の問題を解決する。
Ｅｌ８−１２ ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１）
Ｅ１８−３ ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡＧ（配列番号２）
Ｆ１９−６ ＩＩＤＰＴＫＶＶＲＴＡＬＬＤＡＡ（配列番号３）

特許出願ＷＯ９７１１９６６は、これらのペプチドが、Ｔ細胞において寛容性を誘発してＲＡを予防することができたという事実に基づき、ｈＨｓｐ６０及びＭｔのペプチドの使用を企図している。この著者らは、これらのペプチドを（プリスチンで事前に関節炎を誘発した）マウスに投与することによって、疾患が一定に改善する確証を得ている。この出願とは逆に、本発明者らは、２種の関節炎動物モデルに加え、患者の単核細胞を使用する「ｅｘ ｖｉｖｏ」アッセイにおいてＩＬ−１０が有意に増加するという確証を得て、我々のペプチドが、末梢性の寛容を誘発する能動的な抑制の機序を非常に効率的な方法で誘発することを実証した。

アジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）モデルにおけるＴ細胞の基本的な応答が、Ｈｓｐ６０に向けられるものであることはよく知られている。本発明者らは、我々のｈＨｓｐ６０誘導ペプチドが、ＩＬ−１０レベルの増加及びＴＮＦαレベルの低下を生み出して、非常に顕著な治療的保護作用を発揮することをこのモデルで確認した。本発明者らは、主要な応答がＩＩ型コラーゲンに対するものであるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）動物モデルにおいても、これらのペプチドによって発揮される同じ治療効果を確認した。

これらの事実は、我々のペプチドの治療的な能力が、誘発物質とは無関係であり、炎症部位での能動的な抑制機序を媒介することができ、この機構は、ＲＡの経過で起こる免疫病原性の過程の漸進的一因となる、関節中に存在する他の自己抗原に広がり得るはずであることを示している。これらの結果は、我々の調製物のＲＡ治療への使用の治療的な可能性を強化するものである。

これらのペプチドは、本発明によれば、ヒトＭＨＣ分子との接触部位が改変されたペプチドＥ１８−１２（配列番号１）及びＥ１８−３（配列番号２）の誘導ＡＰＬ型変異体、並びにラットＭＨＣ分子との接触部位が改変されたペプチドＦ１９−６（配列番号３）の誘導型ＡＰＬの設計に特に有用である。それぞれのアミノ酸配列は次の通りである。
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１）
１ ２ ３４ ５６ ７
１位がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
２位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
３位がＡ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、又はＭに
４位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
５位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＹに
６位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
７位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＹに置換されている。
ＳＩＤＬＫＤＫＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号２）
１ ２ ３ ４５ ６ ７ ８
１位がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＡに
２位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
３位がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
４位がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＡに
５位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
６位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
７位がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
８位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに置換されている。
ＩＩＤＰＴＫＶＶＲＴＡＬＬＤＡＡ（Ｆ１９−６）（配列番号３）
１ ２
１位がＨで置換されており、
２位がＥで置換されている。

ある特定の実施では、誘導ＡＰＬ型ペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明のペプチドは、常法どおりのペプチド合成法によって製造することができる。各ペプチドの特異的な組成物は、後程示す実施例に記載するように、これが実験で誘発する免疫応答のレベル及び質によって検定することができる。

上述及び実施例中のすべての配列が有用であり、改良された特性を有する誘導ペプチドの設計及び合成の基礎として使用することもできる。

本発明は、事前に列挙したペプチドの１種又は複数と、薬剤として許容される任意選択の賦形剤とを含む医薬組成物も含む。

患者への医薬品調製物の投与は、特定の患者によって発現されるＨＬＡクラスＩＩ分子と一致することになる。

医薬組成物の投与方法は、これらの調製物が「ｅｘ ｖｉｖｏ」試験で誘発するサイトカインパターンに応じて様々となる。調節性の応答を誘発するＡＰＬペプチドを含む医薬品調製物は、皮内又は皮下の経路によって投与する。ＴＨ１応答を誘発するもともとのペプチドを含む医薬品調製物は、経口の経路によって投与することができる。

本発明の医薬組成物中のペプチドの量は、宿主において有効な免疫応答を生み出す量である。有効量は、投与されたとき、ＲＡに特有な炎症性のサインを有意に減少させ、この疾患の経過に特有な関節の損傷を止める分子機序を誘発する量である。宿主に投与する医薬組成物の量も、いくつかの要素に応じて様々であり、それらの要素には、一般に、使用するペプチド、ＡＣＲスコア（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、略してＡＣＲ）、ＩＩ型ＨＬＡ、疾患が診断された時期、年齢、性別、一般的な健康状態、及び免疫学的な応答のレベルが含まれる。

本発明はまた、有効量のペプチド又は以前に言及した医薬組成物の患者への投与を含むＲＡの治療方法に関する。

一部、結果を以下の図面において図表によって示す。

ヒトＨＬＡによって提示されるｈＨｓｐ６０ペプチド
選択したｈＨｓｐ６０ペプチドは、以下の使用したプログラム、即ちＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊｕｔｔａ Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎｉｅｌｓ Ｎｉｋｏｌａｕｓ Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏｓｋａｒ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂａｃｈｏｒ ａｎｄ Ｓｔｅｆａｎ Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ．１９９９．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５０：２１３−２１９．「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフのためのデータベース（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／ｕｎｉ／ｋｘｉ／にアクセスされたい））及びＰｒｏＰｒｅｄ（Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ａｎｄ Ｒａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．２００１．「ＰｒｏＰｒｅｄ：ＨＬＡ−ＤＲ結合部位の予測（ＰｒｏＰｒｅｄ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ−ＤＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ．）」Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２）：１２３６−３７）によってヒトＴ細胞のエピトープであると報告されたものとした。

これらのペプチドに対応する配列を表１に示す。

ＬｅｗｉｓラットのエピトープのためのｈＨｓｐ６０ペプチド
ｈＨｓｐ６０の配列を出発材料として、データベースＳＹＦＰＥＩＴＨＩに記載されている配列モチーフに従い、ラットのＭＨＣ−ＩＩ分子ＲＴ１．ＢＩに結合するペプチドを選択する（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊｕｔｔａ Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎｉｅｌｓ Ｎｉｋｏｌａｕｓ Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏｓｋａｒ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂａｃｈｏｒ，Ｓｔｅｆａｎ Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ．１９９９．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５０：２１３−２１９．「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフのためのデータベース（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／ｕｎｉ／ｋｘｉ／にアクセスされたい））。

９アミノ酸からなるすべてのペプチドを分析するプログラムを、そのモチーフにかなうものを探索するように設計した。１箇所の位置に足場又は優先されるものとして記述された残基が含まれていなかった変異体も含めた。これらのペプチドの１つ（Ｆ１９−６）に対応する配列を表２に示す。

ＭＨＣへの結合に関与するアミノ酸が改変されているＡＰＬの設計
実施例１及び２で選択したペプチドを出発材料として、特定のＭＨＣへの結合に関与する位置（１、３、４、６、８、又は９位）を改変して、ペプチドのＨＬＡ分子に対する親和性を増大させようとした。これらの各位置の中で、結合モチーフ（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）を使用する方法向けにペプチドを選択したならば足場の残基、又は別のアルゴリズムタイプ（ＰｒｏＰｒｅｄ）を使用してペプチドの選択を行ったならばペプチドのＭＨＣリガンドとしてのスコアを上げることのできる残基となり得るはずの最適な残基を探索した。

これらの分析の結果として、ペプチドＥ１８−１２は、以下のように指定されるアミノ酸のそれぞれ１個によって１〜７位を置換した。
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１）
１ ２ ３４ ５６ ７
１位をＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
２位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
３位をＡ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、又はＭに
４位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
５位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＹに
６位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
７位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＹに置換する。
ＳＩＤＬＫＤＫＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号２）
１ ２ ３ ４５ ６ ７ ８
１位をＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＡに
２位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
３位をＡ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
４位をＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＡに
５位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
６位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
７位をＡ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
８位をＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに置換する。

ペプチドＦ１９−６は、以下のように指定されるアミノ酸によって１位及び２位を置換した。
ＩＩＤＰＴＫＶＶＲＴＡＬＬＤＡＡ（Ｆ１９−６）
１ ２
１位をＨによって置換する。
２位をＥによって置換する。

Ｌｅｗｉｓラットにおけるアジュバント及びコラーゲンによる関節炎の誘発
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＣＥＮＰＡＬＡＢ、キューバ）より供給された、メスの同系交配Ｌｅｗｉｓラット（ＲＴ１．ＢＩ ＭＨＣ）を実験で使用した。重量が約１０１〜１２０ｇであり、５〜８週齢のラットを無作為に選択した。

使用した疾患誘導剤の１つは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ、米国）中Ｍｔ（Ｈ３７Ｒａ、Ｄｉｆｃｏ、イングランド）であった。他の関節炎誘導剤は、ＩＦＡ中ウシＩＩ型コラーゲンであった。

この実施例では、２種の異なる誘発物質を使用して、２種の異なる自己抗原に対する免疫応答によってラットの関節炎を起こした。Ｍｔを疾患の誘発物質として使用する関節炎の動物モデルでは、Ｔ細胞の基本的な応答がＨｓｐ６０に対するものであることは非常によく知られている（Ａｎｄｅｒｔｏｎ，ＳＭ （１９９５）「Ｔ細胞の活性化を認識する自己６０ｋＤ熱ショックタンパク質は、実験的関節炎に対する保護となり得る（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｓｅｌｆ ６０ｋＤ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｎ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：９４３−９５２）。コラーゲンを誘発物質として使用するモデルでは、この抗原に対する抗体応答だけでなくＴ細胞クローンが現れる（Ｍ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ （１９８８）「ラットにおけるコラーゲン誘発関節炎の免疫遺伝学（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ．）」Ｉｎｔｅｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：１−１５）。

これらの２種の動物モデルを創り出す本発明者らの基本的な目標は、これらのペプチドの保護作用が、ラットにおいて関節炎の誘発物質として使用した自己抗原と独立したものであるか否かを実証する目的で、我々のペプチドを両方のモデルにおいて評価することであった。

臨床サインの評価
各ラットで見られる関節炎発生に随伴する炎症の程度を、この目的のために準備した以下の平均値（ａｖｅｒａｇｅ）に従って評価した。
０点：正常な足
１点：足首又はｄｏｌｌのわずかであるが決定的な発赤、冒された指の本数に関係なく個々の指に限定された明らかな発赤及び炎症
２点：足首及びｄｏｌｌの中程度の発赤及び炎症
３点：指を含む足全体の激しい発赤及び炎症
４点：複数の関節を含む足の最大の炎症及び変形。

確定したスコアに従って４本の足を別々に評価し、各足に４点までを与えることができた。したがって、各ラットに、最高で１６点を与えることができた。

疾患を誘発した後５日間ごとに視覚的な評価を実施した。関節炎サインの臨床的な評価では、図１に示すように、疾患を誘発しなかった健常対照群（ＩＶ群）に対応する動物、及び疾患を誘発したがペプチドで処置しなかった疾患対照群（ＩＩＩ群）に対応する動物とに有意な統計学的な差があったことが実証された。

ペプチド合成
ペプチドは、シリンジ中でＦｍｏｃ／ｔＢｕ戦略によって合成した。使用した樹脂は、Ｆｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡ（０．５４ミリモル／ｇ）であり、機械的に撹拌しながら合成プロトコルを継続した。ＴＦＡで処置した後、ペプチドを凍結乾燥し、それをＨＰＬＣ及び質量分析によって特徴付けた。

ペプチドの皮内投与
動物を各群が１２匹のラットからなる４群に分けた。３群の動物（Ｉ群〜ＩＩＩ群）において疾患を誘発し、２群はペプチドで処置し、１群は疾患誘発の対照とした。ペプチドで処置した２群の動物には、Ｍｔで疾患を誘発してから１２、１７、及び２２日後に、ラット１匹につき１００μＬの体積のＰＢＳ中の２００μｇのペプチドを与えた。

４群に分けられた動物は、以下の様に処置した。
・Ｉ群：ペプチドＦ１９−６で処置した動物
・ＩＩ群：ペプチドＦ１９−７で処置した動物
・ＩＩＩ群：ペプチドで処置していない動物（疾患誘発の対照）
・ＩＶ群：疾患を誘発せず、ペプチドで処置しなかった動物（負の対照）。

誘発してから１５、２１、２８、及び３５日後、組織病理学的な分析のために、群あたり３匹の動物を屠殺し、脾臓を摘出し、関節からサンプルを採取した。

図１に示すように、関節炎発生に随伴するサインは徐々に始まった。疾患発生の対照群に相当するＩＩＩ群の動物では、関節炎誘発後１０日目から、炎症の過程の発展が、下位の関節のわずかな発赤から始まり、残りの関節へと広がっていき、一部のラットでは重症になるに至ったことが明らかになった。

この図では、ｈＨｓｐ６０のもともとのエピトープに相当するペプチドＦ１９−６及びその変異体ＡＰＬＦ１９−７の投与が、どちらのペプチドで処置した動物においても関節炎臨床サインの有意な減少を誘発したことは明らかである。ペプチドＦ１９−６及びＦ１９−７で処置した群と、疾患の正の対照とした群とに統計学的に有意な差が得られた（Ｐ＜０．０５）。

この検定で得られた結果は、ラットにおいて疾患のほとんど完全な寛解を認めることが可能であったので、ペプチドＦ１９−６及びＦ１９−７が、処置した動物において保護作用を発揮することの確証となる。

ｍＲＮＡの単離
ラットの脾臓から単離した単核細胞を約２０時間インキュベートした。その後、上清を廃棄し、１ｍＬの試薬、即ちＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）（Ｓｉｇｍａ、米国）を各ウェルに加え、それを室温で５分間放置した。続いて、供給元推奨のプロトコルに従ってｍＲＮＡの単離を実施した。

ＲＮＡの逆転写
相補ＤＮＡを得るために、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｍｅｒ、米国）というシステムを使用した。各サンプル及びプロトコルに対応する１ｍｇのｍＲＮＡを使用し供給元が推奨する通りにプロトコルを継続した。反応液を、４２℃で１時間、その後９５℃で５分間、及び４℃で５分間の最初のサイクルの概要に従い、サーマルサイクラー（Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）中でインキュベートした。

ポリメラーゼ連鎖反応法
サイトカイン、即ちＴＮＦα及びＩＬ−１０、並びに成分である、酵素ＧＡＰ−ＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、略してＧＡＰ−ＤＨ）をコードする遺伝子について、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を実施した。

各反応液について、１０ｐｍｏｌの各プライマー、５ｍＬのＤＮＡ鋳型、０．２５ｍＬのＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｑ−Ｐｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｍｅｒ、米国）を供給元推奨の緩衝液（ＫＣｌ ５０Ｍｍ、トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、ｐＨ９．０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％まで、及びＭｇＣｌ２ １．５ｍｍ）に入れて最終体積２５μＬとしたものを使用した。

ＧＡＰ−ＤＨの反応液を、サーマルサイクラー（Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）中で次のプログラムに従ってインキュベートした。９４℃で３分間（変性温度）、９４℃で１分間、５８℃で１分間（ハイブリダイゼーション温度）、及び７２℃で１分間（伸長温度）の最初のサイクル、その後それぞれ９４℃で１分間、５８℃で１分間、及び７２℃で１分間を３５サイクル。最後に、延長ステップを７２℃で３分間。

サイトカインについては、ハイブリダイゼーション温度のみを変えて以前の概要を継続した。ＩＬ−１０については５４℃、ＴＮＦαについては６４℃。

アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ生成物の分析
ＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動によって分析した。電気泳動の像を捕捉し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｎａｌｙｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析した。結果は、各サイトカインの相対的ｍＲＮＡレベルとして示された。

各サイトカインの相対的なｍＲＮＡレベルの統計分析
処置した動物の群間のサイトカインパターンの相違を、（それぞれについての相対的なｍＲＮＡレベルに従って）決定するために、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ及びＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの試験を使用した（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｐａｃｋａｇｅ Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ ｖ ２ １９９７，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）。

統計学的な分析では、疾患誘発後１５日目に、このペプチドがＴＮＦαレベルを疾患対照群と比べて有意に低下させることが実証された。

これらの結果を図２に示すが、ＧＩは、Ｆ１９−６ペプチドで処置した動物に対応し、ＧＩＩは、Ｆ１９−７ペプチドで処置したラット群を表し、ＧＩＩＩは、処置していない疾患群を表し、ＧＩＶは、健常な動物を含む。ペプチドによる処置が、動物において炎症の過程を誘発する大きな原因であるこのサイトカインの相対的なレベルの低下を引き起こしたことは明らかに証明された。サイトカインＴＮＦαの場合では、ペプチドで処置した各群と、疾患の正の対照として使用した群とに統計学的に有意な差があった。ペプチドで処置した異なる各群の間、及びこれらと疾患の負の対照とした群とには、どちらにも有意差が証明されなかった。この結果は、これら２種のペプチドの投与が、ＴＮＦαレベルを、事実上このサイトカインの健常動物での正常レベルまで低下させたことを示している。

この研究で使用したペプチドが、ＩＬ−１０としての抗炎症性サイトカインの産生を刺激し得るかどうかを判定する目的で、このサイトカインに相当するｍＲＮＡの相対的なレベルを評価した。

ＩＬ−１０は、Ｔ細胞によって媒介される応答を通して末梢性寛容の誘発に関与する。ＩＬ−１０は、直接Ｔ細胞を調節して、ＩＬ−２、ＩＬ−５、及びＴＮＦαの産生を抑制する。

図３は、異なる処置群での疾患誘発後１５日目のＩＬ−１０発現レベルの定量的な測定を示す。この図では、ＧＩは、Ｆ１９−６ペプチドで処置した動物に対応し、ＧＩＩは、Ｆ１９−７ペプチドで処置したラット群を表し、ＧＩＩＩは、処置していない疾患動物群を表し、ＧＩＶは、健常な動物を含む。

これらのペプチドによる動物の処置は、ＩＬ−１０の相対的な発現レベルの増加を誘発する。我々は、両方のペプチドで処置した各群間に統計学的有意差を得なかったが、これらの群と正負の対照となる動物との間には差が存在する。これらの結果から出発して、このペプチドは、ＩＬ−１０の場合のように抗炎症性サイトカインの産生レベルを増大させ、ＴＮＦαのように炎症促進性サイトカインの産生レベルを低下させて、疾患の病因に関与するＴ細胞の機能上の表現型を変化させる働きをすると推測することができる。

組織病理学的な分析
この動物モデルの動物で認められた臨床サインの確証を得、また両方のペプチドが、Ｍｔによって生じた破壊性の過程を戻し、又は縮小し得る能力を分析することを目標として、各群の動物の関節の病理学的分析を実施した。

関節に相当するシートをＣＩＧＢの病態群によって分析した。

関節を１０％の中性ホルマリン緩衝液中に固定し、脱石灰した。組織を勾配アルコール中で脱水し、パラフィンに吸収させ、５μｍの切片に切断した。続いて、サンプルをガラススライドに載せ、ヘマトキシリン−エオシン混合物で染色し、光学顕微鏡で観察した。

組織学的分析の結果を表３に示す。

表３において、Ｐはパンヌス、ＥＣは軟骨の侵食、ＩＭは骨髄への浸潤、ＨＯは溶骨細胞の過形成、Ｇは肉芽腫症反応、ＰＭＮは多形核を表す。

１５日目に屠殺された動物を含むＩＩＩ群の動物では、軟骨の侵食及び骨髄への浸潤を引き起こすパンヌスの存在が明らかであった。また、Ｍｔによって誘発される典型的な肉芽腫症反応が観察され、骨性物質の大きな破壊力を有する巨細胞である溶骨細胞の過形成も頻繁に観察される。これらの組織学に関する結果は、ＡＲ患者で起こる関節の変更の特徴的なサインを再現するものであり、我々が薬理学的な候補を評価するために適切な動物モデルを開発したことを示している。

図４Ａは、ＩＩＩ群の動物の関節に相当する。関節内の間隙全体に浸潤し、その侵食が証明される軟骨の方へと広がるパンヌスの存在、及び骨髄に向かう浸潤を認めることができる。図４Ｂは、骨髄に相当する領域の拡大を示し、食細胞に富む肉芽組織としてパンヌスが明らかに認められる。

図５に示す、皮内経路によるＦ１９−７ペプチドでの処置（ＩＩ群）では、１５日目に屠殺された動物は、重症の組織学的サインを示すことが特徴付けられたＩＩＩ群の残りの動物とは対照的に、組織学的な変化を示さず、多形核の存在及び豊富な瘢痕組織のみを示す。

表３に示すように、Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドで処置した動物の群は、最初の検定の過程では事実上組織学的な影響を示さなかった。Ｆ１９−７ペプチドで処置した動物では、関節炎発生に対するより大きな防御が証明された。この処置群に含まれるラットの半分（６匹のラット）は、２匹のラットだけが組織病理学的な損傷を示さなかった、Ｆ１９−６で処置した動物の群と一致して、少しも組織学的なサインを示さなかった。Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドで処置した群では、関節炎誘発後１５日及び２１日目にはパンヌスの存在が認められず、これらのペプチドの投与が、関節炎発生の際に炎症反応に特有な細胞事象の出現の遅延を引き起こしたことが示唆される。関節炎誘発後３５日目に屠殺した、Ｆ１９−７ペプチドで処置した動物では、１匹のラットのみが疾患発生に特有な組織学的な影響を明示したことは重要であった。これらの結果は、このペプチドでの動物の処置が、疾患の臨床的症状の遅延のほかに、事実上、関節炎の組織病理学的なサインの全寛解を誘発したことを示唆するものであり、Ｆ１９−７ＡＰＬの、もともとのエピトープＦ１９−６を含むペプチドに対する治療的な優位性を示している。

ラットの単核細胞を使用し、ＩＩ型コラーゲンで関節炎を誘発する、Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって誘発されるサイトカインパターンのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
この検定では、ＩＦＡ中ウシＩＩ型コラーゲンを使用して関節炎を誘発した病気のラットを使用した。分析した各ラットの脾臓を摘出し、単核細胞を単離した。

脾臓から単離した単核細胞を２４ウェルプレートの１．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０中で培養した（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）。この検定は、３通りに実施し、合計３×１０^６細胞／ウェルを５ｍｇ／ｍＬの濃度のＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドと共に２４時間培養し、湿気のある５％ＣＯ_２雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。ペプチドなしで培養した細胞を負の対照として使用した。

次いで、ｍＲＮＡを単離し、以前の実施例に記載したのと同じ方法で、核酸の逆転写反応及びＰＣＲを実施した。実施例１２に記載したように、アガロースゲル電気泳動によって反応産物の分析を実施した。各サンプルのｍＲＮＡの相対レベルに従うサイトカインパターンの差異を決定するために、実施例ｌ３に記載したような統計学的な試験を使用した。

図６では、ペプチドなし、且つＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによってｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した培養細胞の、疾患誘発後２１日に対応するＴＮＦαレベルを示す。文字Ａは、ペプチドなしで培養した細胞のＴＮＦαレベルを表し、文字Ｂは、細胞をＦ１９−６ペプチドで刺激したときのこのサイトカインの値を表し、文字Ｃは、細胞をＦ１９−７ペプチドで刺激したときのＴＮＦαレベル相当する。この図で、ＣＩＩは、ＩＩ型コラーゲンで関節炎を誘発した動物群を表し、対照は、健常動物群を表す。

図７は、ペプチドなし、且つＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによってｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した培養細胞の、疾患誘発後２１日に対応するＩＬ−１０レベルを示し、文字Ａは、ペプチドなしで培養した細胞のＩＬ−１０レベルを表し、文字Ｂは、細胞をＦ１９−６ペプチドで刺激したときのこのサイトカインの値を表し、文字Ｃは、細胞をＦ１９−７ペプチドで刺激したときのＩＬ−１０レベルに相当する。この図で、ＣＩＩは、ＩＩ型コラーゲンでＡＲを誘発した動物群を表し、対照は、健常な動物群を表す。

これら２つの図で認められるように、Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドは、ＴＮＦαレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで低下させるが、ＩＬ−１０レベルの場合では、Ｆ１９−７ペプチドだけがそれを有意に増大させる。

これらの結果は、コラーゲンによって関節炎が誘発される動物モデルにおいて、Ｆ１９−７ペプチドが、サイトカインパターンをモジュレートして表現型を調節し得ることを示している。したがって、ｈＨｓｐ６０から誘導されるこのペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫調節作用は、疾患発生に関与する誘発物質がＭｔ又は同類の自己抗原でない関節炎動物モデルにまで広がり得ると断言することができる。

これらの結果は、Ｆ１９−７ペプチドが、炎症部位でのｉｎ ｖｉｖｏの能動的な抑制の媒介となり得る、構造的に同類の抗原に対する寛容性を誘発し得ることを示唆している。

これらの結果を踏まえて、Ｆ１９−７ペプチドが、動物においてＭｔ又はＩＩ型コラーゲンによって誘発される、ＩＬ−１０を産生する調節性Ｔ細胞によって媒介される、関節炎に対する防御を誘発することを提唱することができる。この効果は、ＲＡの経過中に起こる免疫病原性の過程の漸進的一因となる、関節中に存在する他の自己抗原に広がり得るはずである。

Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって誘発されるＲＡ患者のサイトカインの測定
ＲＡ患者の血液を使用して、サイトカイン、即ちＴＮＦα、ＩＦＮδ、及びＩＬ−１０の測定アッセイを実施した。このアッセイでは、ｈＨｓｐ６０ペプチドが、疾患の病因に関与する種々のサイトカインを増加又は減少させるかどうかを評価した。

各患者の１０ｍＬの血液を１倍ＰＢＳで１／２希釈したものから出発して、この希釈物からの５ｍＬを、１５ｍＬの遠心分離管に入った３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｎ）に加え、これを１２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞に相当する環を摘出した。次いで、細胞を１５ｍＬの１倍ＰＢＳで２回洗浄し、それぞれの洗浄した後、これを９００ｒｐｍで遠心分離した。最後に、細胞ペレットを、１０％のウシ胎児血清を含み、ペニシリン（１０００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ／Ｌ、及びＬ−グルタミン２ｍＭを補充したＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した）。

得られた単核細胞を、１０^６細胞／ウェルの細胞数を含む８００μＬの体積で２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。次いで、各ペプチドがサイトカインレベルをモジュレートするのに最適な濃度を知るために、ｈＨｓｐ６０ペプチドを０．５μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまでの濃度範囲で加えた。細胞刺激の正の対照としてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）１％を使用し、基礎の細胞増殖の対照としてＲＰＭＩ１６４０を単独で使用した。

細胞を２４時間培養し、次いで各ウェルの上清を取り、１／２希釈し、特定のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、供給元の推奨に従いサイトカイン濃度を決定した。

Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによってモジュレートされる、ＲＡ患者単核細胞中のＴＮＦαレベルを図８に表す。この図で、文字Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドなしで培養した細胞を表し、Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦ１９−６ペプチドによって刺激した細胞に対応し、Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦ１９−７ペプチドによって刺激した細胞を表す。この図では、ペプチドで刺激した細胞によって分泌されるサイトカインのレベルに、刺激していない細胞に関して統計学的有意差が存在するとき、対応するサイトカインレベルのバーに異なる文字が割り当てられている。

Ｐ１９及びＰ２１として表した患者では、図８で認められるように、Ｆ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって、ＴＮＦαレベルが、刺激していない細胞と比べて有意に低下したが、患者Ｐ１９ではこのサイトカインレベルの低下がＦ１９−７ペプチドの場合よりも有意である。

Ｐ１３として表した患者では、Ｆ１９−６ペプチドによってＴＮＦαレベルが増大したが、しかしこの患者の単核細胞をＦ１９−７ペプチドで刺激したとき、このサイトカインレベルは有意に低下した。これらの結果は、Ｆ１９−７ペプチドが、ラット由来のＭＨＣによって提示されるように設計されたものであるとはいえ、ＲＡに特有な炎症の過程を広く司るこのサイトカインのレベルを低下させることができ、したがってこのペプチドがこの疾患の治療のための有望な治療薬候補であることを証明している。

Ｅ１８−１２及びＥ１８−３ペプチドによって誘発されるＲＡ患者のサイトカインの測定
ＲＡ患者の血液を使用して、サイトカイン、即ちＴＮＦα、ＩＦＮδ、及びＩＬ−１０の測定アッセイを実施した。これらのアッセイでは、ｈＨｓｐ６０ペプチドが、疾患の病因に関与する種々のサイトカインを増加又は減少させるかどうかを評価した。

各患者から１０ｍＬの血液を採取し、それを１倍ＰＢＳで１／２希釈した。この希釈物５ｍＬを、１５ｍＬの遠心分離管に入った３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｎ）に加え、１２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞に相当する環を摘出した。その後、細胞を１５ｍＬの１倍ＰＢＳで２回洗浄し、それぞれの洗浄した後、これらを９００ｒｐｍで遠心分離した。最後に、沈殿を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ｉｇ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ／Ｌ、及びＬ−グルタミン２ｍＭを補充した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した）。

得られた単核細胞を、１０^６細胞／ウェルの細胞数を含む８００μＬの体積で２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。後に、各ペプチドがサイトカインレベルをモジュレートするのに最適な濃度を知るために、ｈＨｓｐ６０ペプチドを０．５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で加えた。細胞刺激の正の対照として１％のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を使用し、基礎の細胞増殖の対照としてＲＰＭＩ１６４０を単独で使用した。

細胞を２４時間培養し、次いで、各ウェルの上清を取り、１／２希釈し、特定のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、供給元の推奨に従いサイトカイン濃度を決定した。

ＲＡ患者単核細胞中のＥ１８−３及びＥ１８−１２ペプチドによってモジュレートされるＴＮＦαレベルを図９に表す。Ｐ４、Ｐ５、及びＰ１６によって表される患者は、分子ＤＲ０３０６を発現させ、Ｐ７、Ｐ８、及びＰ１２として確認される患者は、分子ＤＲ０３０３を発現させ、患者Ｐ９は遺伝子型ＤＲ０５０６を示し、患者Ｐ１０は遺伝子型ＤＲ０２０４を有する。この図で、文字Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドなしで培養した細胞を表し、Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ１８−３ペプチドによって刺激した細胞に対応し、Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ１８−１２ペプチドによって刺激した細胞を表す。

この図では、ペプチドで刺激した細胞によって分泌されるサイトカインレベルに、刺激していない細胞に関して統計学的有意差が存在するとき、対応するサイトカインレベルのバーに異なる文字が割り当てられている。

図９で認められるように、Ｅ１８−１２及びＥ１８−３ペプチドで刺激した患者単核細胞におけるＴＮＦα合成の誘発は、これらの患者が発現させるＨＬＡタイプＩＩ分子に応じて様々である。遺伝子型ＤＲ０３０６を示す患者Ｐ４、Ｐ５、及びＰ６では、ペプチドで刺激していない細胞と比べて、ＴＮＦα濃度の統計学的に有意な増大が認められた。

遺伝子型ＤＲ０５０６の患者Ｐ９及びＤＲ０２０４の患者Ｐ１０でもこの同じ効果が起こる。

遺伝子型ＤＲ０３０３を示す患者Ｐ７、Ｐ８、及びＰ１２では、単核細胞を我々のペプチドで刺激したとき、ＴＮＦαレベルに少しも差異が認められなかった。

Ｅ１８−３及びＥ１８−１２ペプチドについてのＩＬ−１０レベルのモジュレーションを図９に表すが、文字Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドなしで培養した細胞を表し、Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ１８−３ペプチドによって刺激した細胞に対応し、Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ１８−１２ペプチドによって刺激した細胞を表す。

ＩＬ−１０の場合では、図１０で認められるように、患者Ｐ９及びＰ１０でこのサイトカインの有意な減少が見られるが、残りの患者では有意な変化がなかった。

これらの知見から、Ｅ１８−１２及びＥ１８−３ペプチドは、末梢性の単核細胞においてＴＨ１表現型を誘発すると推測することができる。

もともとのペプチドＥ１８−１２又はＥ１８−３の治療用の変異体は、経口経路で投与することができるはずであるので、炎症の減少にかなり寄与した寛容性の機序を誘発するであろう。

誘導ＡＰＬ型ペプチドによって誘発されるＲＡ患者のサイトカインの測定
以前の結果から、本発明者らは、生物情報学ツールを使用して、Ｔ細胞エピトープに相当するこれらもともとのペプチドをＨＬＡ分子との接触部位で改変して、改変型ＡＰＬペプチドが、サイトカインパターンを変更して表現型を調節することができるようにすることを決めた。さらに、これらペプチドのそれぞれにおいてなされた改変は、患者によって示されるほとんどのＨＬＡ分子について報告されているペプチド結合モチーフにかない、これらのそれぞれと異なるＨＬＡ分子との相互作用を理論的に裏付けるものとなる。

ＲＡ患者の血液を使用して、サイトカイン、即ちＴＮＦα及びＩＬ−１０の測定アッセイを行った。これらの試験では、ｈＨｓｐ６０の誘導ＡＰＬ型ペプチドが、疾患の病因に関与する種々のサイトカインを増加又は減少させるかどうかを評価した。さらに、もとのペプチド（Ｅ１８−３、Ｅ１８−１２）を実験の対照としてこの評価に含めた。

これらの試験で評価したＡＰＬペプチドは以下の通りであった。
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＬＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号５）
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＭＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号６）
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＡＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号７）
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＬＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号８）
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＭＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号９）
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＬＱＳＬＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１０）
ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＬＱＳＭＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１１）
ＭＧＰＫＬＲＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１２）
ＭＧＰＫＬＲＴＶＩＩＬＱＳＭＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１３）
ＳＩＤＬＫＤＫＬＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号１４）
ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＳＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号１５）
ＳＩＤＬＫＤＫＬＫＮＩＧＡＫＬＳＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号１６）
ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＡＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号１７）
ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＬＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号１８）
ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＡＶＡＮＮＴＮＥＥＡ（配列番号１９）
ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＡＮＥＥＡ（配列番号２０）
ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＬＶＡＮＮＡＮＥＥＡ（配列番号２１）。

各患者から１０ｍＬの血液を採取し、１倍ＰＢＳで１／２希釈した。５ｍＬのこの希釈物を、１５ｍＬの遠心分離管に入った３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｎ）に加え、１２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞に相当する環を摘出した。その後、細胞を１５ｍＬの１倍ＰＢＳで２回洗浄し、それぞれを洗浄した後、それらを９００ｒｐｍで遠心分離した。最後に、沈殿を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、２５ ＨＥＰＥＳ ｍＭ／Ｌ、及びＬ−グルタミン２ｍＭを補充した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した）。

得られた単核細胞を、１０^６細胞／ウェルの細胞数を含む８００μＬの体積として２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で培養した。細胞を、４０μｇ／ｍＬの濃度のペプチド［Ｅ１８−３、Ｅ１８−１２、Ｅ１８−３ＡＰＬ１（配列番号１８）、Ｅ１８−３ＡＰＬ２（配列番号２１）、Ｅ１８−１２ＡＰＬ１（配列番号５）、Ｅ１８−１２ＡＰＬ３（配列番号１２）］で３通りに刺激した。基礎の細胞増殖の対照としてＲＰＭＩ１６４０を使用した。

細胞を２４時間培養した、次いで各ウェルの上清を取り、１／２希釈し、特定のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、供給元の推奨に従いサイトカイン濃度を決定した。

図１１に、もとのペプチド（Ｅ１８−１２及びＥ１８−３）、並びにＡＰＬペプチドパネル：Ｅ１８−３ＡＰＬ１（配列番号１８）、Ｅ１８−３ＡＰＬ２（配列番号２１）、Ｅ１８−１２ＡＰＬ１（配列番号５）、Ｅ１８−１２ＡＰＬ３（配列番号１２）によって誘発されるＩＬ−１０レベルを示す。この図で、文字は、統計学的有意差を示す（各患者における種々のペプチドと対照細胞間の統計学的有意性のみを個々に指し示す）。さらに、患者Ｐ４及びＰ６の細胞は、ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ２又はＥ１８−１２ＡＰＬ３によって刺激しなかった。すべての患者において、ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ１が、刺激していない細胞に対して非常に有意にＩＬ−１０レベルを増大させることは明らかである。このペプチドによって誘発される増大は、Ｐ２及びＰ４である患者の一部では、刺激なしで細胞によって産生される量の約９倍であり、Ｐ１、Ｐ３、及びＰ５である患者では約５倍であった。また、患者Ｐ１、Ｐ４、及びＰ６におけるＩＬ−１０レベルの有意な増大のために、Ｅ１８−１２ＡＰＬ１でも同様の結果が得られた。一方、もとのペプチドもペプチドＥ１８−３ＡＰＬ２及びＥ１８−１２ＡＰＬ３も、負の対照となる細胞と比べてＩＬ−１０レベルの増大を誘発しなかった。

図１２では、同じ群の患者において異なるペプチドによって誘発されるＴＮＦαレベルを示す。この図では、文字は、統計学的有意差を示す（各患者における種々のペプチドと対照細胞間の統計学的有意性のみを個々に指し示す）。さらに、患者Ｐ４及びＰ６の細胞は、ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ２又はＥ１８−１２ＡＰＬ３で刺激しなかった）。見てわかるように、患者は全員、種々のペプチドによる刺激に同じ強度で応答しないものの、応答がかなり同質であったことは周知のことである。一方、ＴＮＦα産生をより増大させたペプチドは、主に患者Ｐ４及びＰ５においてＥ１８−１２ＡＰＬ１であり、患者Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３は、負の対照に対してわずかな増大を示した。ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ１も、患者のほとんどにおいて同様の挙動を示した。ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ１の場合では、患者Ｐ２、Ｐ４、及びＰ５の細胞が、それほど顕著ではないもののＴＮＦαレベルの主要な増大を示した。この試験では、もとのペプチドでの以前の評価と同様の結果が得られた。以前の結果は、ペプチドもそのＡＰＬも、患者単核細胞におけるＴＮＦα発現の減少を誘発しないことを示している。

これらの結果は、ＩＬ−１０産生を増大させるＡＰＬがＴＮＦαレベルの増大を促進するのであるので、矛盾するかもしれない。図１３では、もとのペプチド及びそれらのＡＰＬによって誘発されるＩＬ−１０レベルとＴＮＦαレベルの比を示す。この図では、文字は、統計学的有意差を示す（各患者における種々のペプチドと対照細胞間の統計学的有意性のみを個々に指し示す）。さらに、患者Ｐ４及びＰ６の細胞は、ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ２又はＥ１８−１２ＡＰＬ３によって刺激しなかった）。６人のうち４人の患者で、Ｅ１８−３ＡＰＬ１で刺激した細胞が１より高い指数を示し、これによってＩＬ−１０レベルがＴＮＦαレベルを上回ったことが示されるので、ＩＬ−１０の増加が、ＴＮＦαレベルに対してかなり高いことは明らかである。さらに、すべての患者において、ペプチドＥ１８−３ＡＰＬ１で刺激した細胞のＩＬ−１０レベルが、負の対照となった細胞に対してかなり高く、統計学的有意差が示された。Ｅ１８−１２ＡＰＬ１の場合では、負の対照との差があまり顕著でなかった。このように、Ｅ１８−３ＡＰＬ１は、ＴＮＦαレベルを増大させるとしても、正味の優勢な効果はＩＬ−１０レベルの増大であり、免疫抑制サイトカインへの応答の偏りであると解釈される。

研究結果は、これらの２種のＡＰＬが患者に投与されれば、全身レベルで能動的な抑制を媒介する、ＩＬ−１０を分泌する調節性Ｔ細胞の亜集団を誘発し得るはずであることが示唆されるので、非常に有望である。本発明者らが到達することのできる別の部分的な結論は、これらの結果の分析によって、これらのＡＰＬが、研究対象のすべての患者において、患者らが有する遺伝子型とは無関係に実際は均質な挙動を示すことである。これらの結果は、これらのＡＰＬの投与が、患者が有するＨＬＡ−ＩＩ分子の型に関して存在する差異に拘らず、すべての患者で同じ効果を有することが可能になるので、非常に有望である。

本発明者らの実験結果から、本発明の根本的な利点は、この疾患の免疫病原性の機序において、関与した自己反応性Ｔ細胞のクローンをサイレンシングするように仕向けられた特異的な免疫応答を誘発して、ＲＡ患者の治療で効果的に使用することのできる、Ｔ細胞エピトープに相当するヒトストレスタンパク質Ｈｓｐ６０の免疫調節性ペプチド、又はこれらのペプチドの変異体型ＡＰＬを含む医薬調製物の使用である。

本発明において本発明者らが提案する治療は、合理的であり、多数の患者に拡大することができ、さらに、この疾患のための現在の療法と組み合わせて使用することもできる。

関節炎がＭｔによって誘発される動物モデルにおける誘導ＡＰＬ型ペプチドの治療効果の評価
動物を、それぞれが８匹のラットからなる１２の群に分けた。１１の動物群（Ｉ群〜ＸＩ群）で疾患を誘発し、そのうちの１０をペプチドで処置し、１つを疾患誘発対照としてそのままにした。ペプチドで処置した動物群に、Ｍｔによる疾患誘発後１２日、１４日、１６日、１８日、２０日、２２日、２４日、２６日目に、ラットあたり５０μｇのペプチドを含む１００μＬのＰＢＳを与えた。

１２群に分けられた動物を以下の形で処置した。
−Ｉ群：ペプチドＥ１８−１２（配列番号１）を与えた。
−ＩＩ群：配列番号５に相当するペプチドを与えた。
−ＩＩＩ群：配列番号８に相当するペプチドを与えた。
−ＩＶ群：配列番号１２に相当するペプチドを与えた。
−Ｖ群：配列番号１３に相当するペプチドを与えた。
−ＶＩ群：ペプチドＥ１８−３（配列番号２）を与えた。
−ＶＩＩ群：配列番号１４に相当するペプチドを与えた。
−ＶＩＩＩ群：配列番号１５に相当するペプチドを与えた。
−ＩＸ群：配列番号１６に相当するペプチドを与えた。
−Ｘ群：配列番号１７に相当するペプチドを与えた。
−ＸＩ群：ペプチドを与えなかった（疾患誘発対照）
−ＸＩＩ群：疾患を誘発せず、又はどのペプチドも投与しなかった（負の対照）。

誘発後２１日及び３５日目に、組織病理学的な分析に向けて各群から数匹の動物を屠殺し、脾臓を摘出し、関節からサンプルを採取した。

ＡＰＬ型ペプチドで処置した動物群では、未処置の動物群並びにＥ１８−１２及びＥ１８−３で処置した群と比べて臨床的な改善が有意であった。これらの結果は、すべての場合において誘導ＡＰＬ型ペプチドがもとのペプチドに優っていることを示す組織病理学的分析及びサイトカイン測定によって確証が得られた。

図１４では、この動物モデルに属する４つの動物群における疾患の展開のグラフを示す。この場合では、各群は、Ｉ群（Ｅ１８−１２で処置した動物）、ＩＩ群（Ｅ１８−１２ＡＰＬ１、配列番号５で処置した動物）、ＸＩ群（疾患誘発対照）、及びＸＩＩ群（健常動物）である。このグラフでは、種々の文字は、有意差（ｐ＜０．００１）を示す（特定の測定日におけるすべての群の統計学的な有意性を指す。

このグラフでは、疾患誘発後１２日目から、Ｉ、ＩＩ、及びＸＩ群の動物がＲＡの特徴的な臨床サインを示し始めたことを見分けることが可能である。多くの動物は、耳、尾部、及び四肢に小結節のような関節外の症状も示した。３つの疾患動物群では、２０日目辺りで最も重症のＲＡ症状が認められた。Ｅ１８−１２で処置した動物の場合では、２１日目に、疾患誘発対照群に関して有意差を見分けることができなかった。それにもかかわらず、疾患誘発後３５日目辺りではこの群の動物の臨床サインはＸＩ群より有意に劣っていた（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、Ｅ１８−１２ペプチドの保護作用が３５日目辺りで示されることを示唆している。この意味で、２１日目により良い結果を得るために、疾患のより早期の段階でこのペプチドを投与することを推奨できるはずである。しかし、ＩＩ群の動物の場合では、炎症の臨床サインは、Ｉ群及びＸＩ群と比べて明らかに少なく（ｐ＜０．００１）、このペプチドが疾患を誘発した動物において強力な保護作用を発揮することが示唆される。

皮内経路によってＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドで処置したラットの関節炎臨床サインのＡＩＡモデルにおける評価を示すグラフである。 疾患誘発後の１５日目にラット単核細胞でＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって誘発された、ＡＩＡモデルにおけるＴＮＦαレベルのモジュレーションを示すグラフである。 疾患誘発後の１５日目にラット単核細胞でＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって誘発された、ＡＩＡモデルにおけるＩＬ−１０レベルのモジュレーションを示すグラフである。 病気の未処置の動物に属する関節切片の光学的な顕微鏡観察を示す図である。ＩＳ：関節内の間隙、ＥＣ：軟骨の侵食、Ｐ：パンヌス。ヘマトキシリン−エオシンで染色。 皮内経路によってＦ１９−７ペプチドで処置した動物に属する関節切片の光学的な顕微鏡観察を示す図である。ＩＳ：関節内の間隙。ヘマトキシリン−エオシンで染色。 疾患誘発後の２１日にラット単核細胞でＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって誘発された、ＣＩＡモデルにおけるＴＮＦαレベルのモジュレーションを示すグラフである。 疾患誘発後の２１日目にラット単核細胞でＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによって誘発された、ＣＩＡモデルにおけるＩＬ−１０レベルのモジュレーションを示すグラフである。 ＲＡ患者単核細胞におけるＦ１９−６及びＦ１９−７ペプチドによるＴＮＦαレベルのモジュレーションを示すグラフである。 ＲＡ患者単核細胞におけるＥ１８−３及びＥ１８−１２ペプチドによるＴＮＦレベルαのモジュレーションを示すグラフである。 ＲＡ患者単核細胞におけるＥ１８−３及びＥ１８−１２ペプチドによるＩＬ−１０レベルのモジュレーションを示すグラフである。 Ｅ１８−３及びＥ１８−１２ペプチド並びにそのＡＰＬによって誘発される、ＲＡ患者単核細胞におけるＩＬ−１０レベルのモジュレーションを示すグラフである。 Ｅ１８−３及びＥ１８−１２ペプチド並びにそのＡＰＬによって誘発される、ＲＡ患者単核細胞におけるＴＮＦαレベルのモジュレーションを示すグラフである。 Ｅ１８−３及びＥ１８−１２ペプチド並びにそのＡＰＬによって誘発されるＩＬ−１０レベル対ＴＮＦαレベルの比を示すグラフである。 皮内経路によってＥ１８−１２及びＥ１８−１２ＡＰＬ１ペプチドで処置したラットの関節炎臨床サインのＡＩＡモデルにおける評価を示すグラフである。

Claims (7)

1. 関節リウマチ患者において、Ｔ細胞のためのエピトープを構成する６０ｋＤａヒト熱ショックタンパク質のペプチドであって、次の配列
   Ｅ１８−１２ ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ（配列番号１）又は、
   Ｅ１８−３ ＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡＧ（配列番号２）
   からなる、上記ペプチド。
2. ヒトＭＨＣ分子との接触部位で改変された、Ｅ１８−１２ペプチド（配列番号１）のＡＰＬ型誘導ペプチドであると特徴付けられ、アミノ酸配列が、
   ＭＧＰＫＧＲＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫＶＴＫ
   １ ２ ３４ ５６ ７
   であり、
   １位がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ２位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ３位がＡ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、又はＭに
   ４位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ５位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＹに
   ６位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ７位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＹに置換されている、
   請求項１記載のペプチド。
3. 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２記載のＡＰＬ型誘導ペプチド。
4. ヒトＭＨＣ分子との接触部位で改変された、Ｅ１８−３ペプチド（配列番号２）のＡＰＬ型誘導ペプチドであることが特徴付けられ、アミノ酸配列が、
   ＳＩＤＬＫＤＫＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＤＶＡＮＮＴＮＥＥＡ
   １ ２ ３ ４５ ６ ７ ８
   であり、
   １位がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＡに
   ２位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ３位がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ４位がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＡに
   ５位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ６位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ７位がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに
   ８位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに置換されている、
   請求項１記載のペプチド。
5. 配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４記載のＡＰＬ型誘導ペプチド。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の１種又は複数のペプチドと、薬剤として許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
7. 関節リウマチ治療のための請求項６記載の医薬組成物。