KR20070073787A - Ｈｓｐ60의 펩티드 및 이들의 유도형 ａｐｌ 및 약학적조성물 - Google Patents
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Abstract
T 세포에 대해 에피토프를 구성하는 60 kDa의 인간 히트 쇼크 단백질의 펩티드 뿐 아니라, MHC 분자로 접촉부위에서 수사된 이들의 유도된 펩티드는 류마티스성 관절염 환자에서 조절 T 세포의 클론에 의해 조절되거나 또는, 특히 면역성 결여의 메카니즘에서 말초 내성의 메카니즘 유도하는데 유용하다. 또한, 본 발명은 류마티스성 관절염의 치료를 위해 이들 펩티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
T 세포, 류마티스성 관절염, 인간 히트 쇼크 단백질
Description
본 발명은 60 kDa의 인간 히트 쇼크 단백질의 펩티드(약칭 hHsp60) 및 이들로부터 유래된 변형 펩티드 리간드 (약칭 APL)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 류마티스성 관절염(RA)의 치료를 위해 이들 펩티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
RA는 세계 인구의 대략 1%가 앓고 있는 공지되지 않은 병인의 자가면역 반응 질환이다. 이것은 비록 체계적인 징후가 또한 관찰되어질 수는 없지만 관절의 만성적 염증으로 특징되는 증상이다. 이 질병은 활액 멤브레인의 염증으로 시작되고, 주로 연골 및 벼의 부식적 파괴를 야기하여, 환자의 80%가 완만한 신체적 장애와 조기 사망을 초래한다 (Moctezuma, J.F. (2002) Manifestaciones articulares de la Artritis Reumatide. Revista Mexicana de Reumatologia 17:211-219). RA는 인종이나 민족 군의 구별이 없이 어느 연령대에서나 나타날 수 있지만, 그 시작의 최대 빈도는 25에서 55세 사이이다. RA를 가지고 있는 인구 중에는 여성이 삼분의 일의 비율인 남성을 압도한다 (Emery, P. (2002) Early referral recommendation for newly diagnosed rheumatoid arthritis: evidence based development of to clinical guide. Ann Rheum Dis. 61:290-297).
RA의 원인은 알려지지 않았다. 이것은 유전적, 환경적, 면역학적 및 호르몬적 인자의 존재를 포함하는 질병이다. 어떤 유전자는 면역 반응계에서 역활을 하여, RA를 진행시키는 경향과 연계된다. 동시에, RA가 있는 일부 사람들은 이들 유전자를 가지고 있지 않고, 이들 유전자를 가지고 있는 다른 사람들은 결코 이 질병이 진행되지 않는다. 따라서, 유전적 배경이 중요하기는 하지만 그것이 결정적이지는 않다고 제시되었다.
자가면역 반응 질병의 모델에 있어서, 자기가 갖고 있는 항원에 유사한 미생물의 항원은 내성 메카니즘에서 변화를 형성하고 자가면역 반응을 영속하는 자가 항원에 교차된 반응을 나타낼 수 있다. 일반적인 관점에서, 감염성 제제에 의해 생성된 조직에 손상 및 국부적인 괴사는 자동재활성화 T 세포를 활성화할 수 있는 자가 항원 은익 에피토프를 발견할 수 있다(Albert, L.J. (1999) Mechanisms of Disease: Molecular Mimicry and autoimmunity. N Engl J Med 341:2068-2074).
내성과 면역성/자가면역성 간의 T 림프구의 전이 상은 다른 준위로 제어된다. 이들 전이에 있어서 두 가지 중요한 변수는 항원 존재부 세포 (약칭 APC)의 성숙 상태와 면역 반응계에 의해 검지된 자가 항원의 준위이다 (Ohashi, P.S. (2002) Making and breaking tolerance. Current Opinion in Immmunology 14:744-759).
자가면역 반응 질환의 전개를 설명하기 위한 현행 가설의 하나는 선천적 면역 반응계의 신호 또는 위험 신호의 부재에 있어 APC가 상대적으로 성숙하지 않고 자가 반응적 T 세포에 내성을, 자기가 가지고 있는 펩티드를 이들 세포에 나타낼 때 유도한다는 것이 개략적인 윤곽이다 (Steiman, R.M. (2000) The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med. 191:411-416). 말초 내성의 유도는 또한 자기가 가지고 있는 항원의 농도와 상호관련이 있다 (Kurts, C. (1999) CD8 T cell ignorance or tolerance to islet antigens depends on antigen dose. PNAS 96:12703-12707). 자기 항원의 발현 준위의 증가에 기인한 자기 항원의 존재의 증가는 자가반응적 무관 T 세포에 의한 이들의 검출을 가능하게 한다. 만일 자가 항원의 준위가 APC의 성숙을 증진함이 없이 증가 되었다면, 이들 항원에 대한 내성이 유지되어 지거나 그렇지 않다면, 전 염증성 신호 또는 APC의 성숙을 증진하는 다른 경우에 나타나고, 내성은 무관한 T 세포의 활성화에 의해 깨어져 자가면역 반응 질병이 진행된다 (Janeway, C.A. (2002) Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 20:197-216).
RA의 원인과 같이 연구의 대상이 된 감염성 제제는: Epstein Bar 바이러스, 레트로바이러스, 간염 C 바이러스, 미코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) (약칭 Mt) 및 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori) 등이다.
RA의 발병기전은 연골 및 뼈의 진행성 파괴를 야기하는 다른 타입의 세포의 협동 작용에 의한 것으로 특징되어 진다.
정상적인 상황에서는 TNFα, IL-1, IL-6, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 및 IFNγ와 같은 염증성 시토킨과 IL-4, IL-11, IL-13 및 안타고니스트성 IL-1 또는 TNFα 같은 항-염증성 시토킨 사이에는 균형이 존재한다. 그러나, RA에 있어서는 이 균형이 염증성 시토킨 쪽으로 이동한다 (Arend, W.P. (2001) Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: The role of interleukin-1 receiving antagonist. Semin Arthritis Rheum 30(2):1-6)
외래성 항원 또는 자가 항원의 인지는 아마 RA 환자에 있어 관절의 파괴를 야기하는 일련의 사건이 이유이다. 이 현상은 다른 시토킨의 자극과 공조하여 전 염증성 시토킨(IL-2 및 INFg)의 결과로서 유리된 세포 Th1으로 그 분화를 유도하는 T CD4+ 림프구의 활성화를 야기한다(Simon, A.J. (2001) Biological therapy in Rheumatoid Arthritis. Magazine of Clinical Investigation 53(5):452-459). 수 많은 조사가 관절의 만성 염증이 활액 멤브레인으로 침투한 이들 활성화된 T 세포에 의해 유발된다는 것과 일치한다. 대식세포에 대한 이들 시토킨의 작용은 많은 양의 TNFα 및 IL-1 생성을 야기한다. 이것은 내피 세포(LFA1, ICAM-1)에 점착하는 분자의 발현을 제어함으로 일련의 국부적이고 체계적인 작용을 야기하여, 염증 부위에 다른 세포를 끌어 모은다. 이들은 또한 IL-15 및 IL-8 같은 염증의 다른 조절자의 유리를 위해 대식세포, 섬유아세포, 연골세포 및 파골세포를 자극한다. TNFα 및 IL-1은 지방층의 형성을 야기하는 활액 멤브레인의 증식을 자극하고, 또한 이들은 관절의 파괴에 잠재적으로 참여하는 항체를 생산하는 세포로 B 림프구의 분화를 유도할 수 있다. 이들은 또한 Th2 세포에 의해 생산된 항-염증성 시토킨 (IL-4 및 IL-14)의 생산을 저해하고, 간세포를 자극하여 IL-6를 유리한다. IL-6은 민감한 시기의 단백질의 생성에 유리하여, 면역 반응을 강화하는데 관여한다 (Forre, O. (2000) New possibilities of treatment in AR. Scand J Rheumatol 29(2):73-84).
RA의 발병기전에 포함된 자가 항원 중에는 Hsp60, Hsp의 패밀리에 속하는 단 백질이 있고, 이것은 예외적으로 진화적 보전을 갖는 면역성 단백질이다. 외래 Hsp에 대한 면역 반응은 박테리아성 감염에 대한 방어의 중요한 메카니즘이다. 이들 단백질에 대한 항체는 건강한 사람 및 자가면역 반응 질환이 있는 환자에 풍부할 수 있고 이들은 또한 자가 항원과 교차 반응을 할 수 있다 (Chen, W. (1999) Human 60-kDa Heat-Shock Protein: To Danger Signal to the Innate Immune System. J Immunol. 162:3212-3219).
Mt의 Hsp65는 포유동물의 Hsp60에 유사하다. 이것은 Hsp60 이 RA 환자에게 자가 항원으로 인지될 수 있다는 것을 제시한다. 골관절염을 가지는 환자 및 RA를 가지는 환자를 비교하면, 이들 후자의 것은 미코박테리아의 Hsp65에 활액에서 B 림프구의 증식적 반응의 증가를 가진다. 이 반응의 강도는 활액을 분비하는 염증과 상호 연관된다. 이들 반응은 다른 염증성 질환과 비교하여 RA에 특이적이지 않다 (Life, P. (1993) Responses to Gram negative enteric bacterial antigens by synovial T cells from patiens with juvenile chronic arthritis: recognition of heat shock protein hsp60. J Rheumatol. 20:1388-1396).
Hsp의 농도는 면역 반응계에 대한 가능한 위험의 신호로, 죽은 세포로부터 방출되고, 염증성 반응과 APC의 성숙을 시작하는 것을 유도할 수 있다. Hsp는 세포 내의 단백질로, 세포의 멤브레인에서는 발현되지 않을 뿐 아니라 분비되지도 않아 Hsp는 위험 신호를 구성하는 분자에 대한 매력적인 후보이다 (Van den Berg, WB. (1998): Joint inflammation and cartilage destruction may occur uncoupled. Springer Semin Immunopathol. 20:149-164).
몇몇 자가면역 반응 병리의 치료를 위해 Hsp60 또는 그의 유도된 펩티드를 사용하는 몇 가지 제제가 제안되었다. 예를 들어, 특허 EPO262710호에는 자가면역 반응 질환, 특히 관절염 상태의 치료 및 진단을 위해 Mt의 Hsp60의 몇 가지 펩티드의 사용이 제안되어 있다. 이 발명은 미리 몇몇 박테리아로의 감염은 유전적으로 민감한 사람, 예를 들어 RA 환자가 미생물의 항원에 높은 반응성을 나타낼 수 있는 사람에 있어 자가면역 반응 질환의 진행을 촉발할 수 있다는 사실에 기초한다.
이들 동일한 발명자들은 특허 EPO322990호에서 이전의 특허와 동일한 목적으로 Mt의 Hsp60의 다른 펩티드의 사용을 제안한다.
특허 출원 W09610039호에서 이들은 자가면역 반응 관절염의 진단 및 치료를 위해 Mt의 Hsp60의 펩티드의 사용을 의도하였다.
특허 출원 WO9711966호에서, 저자는 RA 환자의 T 세포에 내성을 유도할 수 있는 박테리아의 Hsp60와 일치하지 않는 hHsp60의 비보전 영역의 펩티드의 사용을 의도하였다.
특허 출원 WO0143691호는 RA와 같은 염증성 질환의 예방을 위해 hHsp60의 펩티드 및 그들의 변형체에 의해 특징적으로 구성된 약학적 제제의 사용을 제안하고 있다.
특허 US618010호에서는 저자는 당뇨병 타입 I의 진단 및 예방을 위해 p277로 불리는 Hsp60의 펩티드 및 그의 유사화합물의 사용을 의도하였다.
특허 US5993803호는 기관의 이식 중에 면역 반응의 민감성을 줄이기 위해 Hsp60, 펩티드 p277 및 이 단백질의 유도된 펩티드 군의 사용을 보호한다.
근년 들어서는 죽상동맥경화증은 자가면역 반응 과정에 일련의 유사한 특성을 나타내는 것이 고려되어졌다. 특허 출원 WO0072023호에서 저자는 단백질 Hsp60을 포함하는 제제를 사용한 죽상동맥경화증 및 관상 질환의 치료 및 예방을 위한 방법을 제안하였다.
특허 출원 WO02057795호에서는, 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체로부터의 단백질 및 Hsp의 패밀리 단백질을 사용한 골다공증의 진단 및 치료를 위한 신규한 방법이 보호된다.
현 시점에서, RA에 대한 치료는 존재하지 않는다. 현행 치료의 방법은 통증을 완화하는 것에 집중되어, 염증을 감소하고, 관절의 손상을 지연시키며 환자의 기능 및 복리를 개선한다. 최근에는 질병의 진행을 멈추거나 또는 지연할 목적으로 RA에 염증성 반응의 시발 또는 유지에 관여하는 시토킨을 차단하는 면역 조절 약제가 만들어졌다. 이러한 종류의 치료를 위해, 두 가지 타입의 약제가 존재한다. 종양 괴사 인자(약칭 TNFα)의 작용의 차단 및 인터류이킨 1 (IL-1)의 작용을 저해하는 것이다.
비록 그 결과가 항-TNFα 및 항-IL-1의 치료로 유망하지만 감염율이 높다. 이들 약물로 치료된 많은 환자는 몇몇의 경우에는 기타 자가면역 반응 질환, 종양형성 등을 포함하여 치명적인 심각한 감염을 전개했다. 게다가 이들은 매우 값 비싼 약제이다(Breshinan, B. (1998) Treatment of rheumatoid arthritis with recombinant human anti-interleukin-1 antagonist. Arthritis Reum. 41:2196- 2204)
어떤 항원의 일선에서 말초의 내성을 만드는 방법으로서 구강 내성이 제안되었다. 이것은 항원의 투여 빈도 및 복용량에 의존하여 활성적 억제, 아네르기 또는 클론 결실의 메카니즘에 의해 유발될 수 있다. 이 방법은 항원에 의해 특이적 방법으로 활성화되지만 그 작용이 독립적으로 발휘되는 조절 T 세포를 유도할 수 있다 (활성적 억제). 조절 작용이 발생되도록 하기 위해서는, 추측되는 발병원의 항원을 투여하는 것이 필수적인 것은 아니지만, 발병원의 이펙터 세포의 활성을 저해하는 염증성 병소에 활성적 억제를 유도할 수 있는 다른 것을 투여하는 것이 필요하다. 콜라겐 타입 II (약칭 CII)는 이러한 관점에서 가장 빈번하게 사용되는 자가 항원이다. 치킨 및 보빈 CII를 사용하여 RA 환자에서 수행된 연구의 결과는 모순된 결과를 나타냈다 (Trentham, D.E. (1993) Effects of oral administration of type II collagen in rheumatoid arthritis. Science 261:1727-1730; Sieper, J. (1996) Oral type II collagen treatment in early rheumatoid arthritis: to double-blind, placebo-controlled, randomize trial. Arthritis Rheum. 39:41-51).
특허 US6153200호는 RA 환자에 있어 경구 경로에 대한 내성을 유도하기 위해 Hsp의 패밀리에 속하는 단백질인 Hsp70의 펩티드의 사용을 의도한다.
내성을 유도하기 위해 제시된 또 다른 변형체는, 만일 어떤 항원성 펩티드에 대한 특이적 T CD4+ 림프구가 항체반응 능력이 있는 APC에 의해 표현된 항원을 인지한다면 T 세포가 활성화된다는 사실에 기초한 완전한 APL 펩티드이다. 그럼에도 불구하고, 만일 동일한 T 세포가 항원으로부터 다른 형태로 먼저 활성화되면, 여기 서 TcR과의 접촉 부위의 하나가 가볍게 변형되고, 이것은 T 세포의 부분적인 활성화 또는 심지어는 불활성화를 초래할 수 있다. 이들 항원은 APLs로 명명된다. 이 APLs는 T 세포의 완전한 활성화를 위한 필수적인 단계적 진행을 막는 TcR 또는 MHC와의 필수적인 접촉 위치에 하나 또는 그 이상이 치환된 면역성 펩티드에 유사하다.
개념상으로는, APLs 특이적 항원에 대한 T 세포의 반응을 증진하기 위한 기타 효과들 중에 면역성 펩티드에 유사한 특성 (어고니스트)으로 디자인될 수 있다. 이 효과는 감염성 질병과 같은 병리학상 증상 하에서 유익하다. 펩티드는 또한 자가면역 반응 질병의 조절에 유익할 수 있는 면역성 펩티드에 대해 안타고니스트 특성을 갖게 디자인될 수 있는데, 이는 이들이 TcR의 안타고니스트(M. De Magistris (1992) Antigen analog-major complex histocompatibility complexes act as antagonist of the T cell receptor. Cell 68:625 - 634), 부분적 어고니스트로 작용하거나 또는 활성적 억제를 조절하는 조절 T 세포의 집단을 유도(Evavold, B.D. (1991) Separation of IL-4 production from Th cell proliferation by an altered T cell ligand. Science 252:1308-1310)하는 T 세포의 반응을 차단할 수 있기 때문이다. 펩티드 리간드의 본질적 특성을 실험적으로 조작하는 능력은 적절하기로는 면역 반응 세포 반응의 그 특성, 경로 및 힘을 개변하는 것을 가능하게 한다.
지금까지, 타입 APL 펩티드를 사용하여 인간에게서 두 가지의 임상적 시도가 자가면역 반응 질환의 치료를 위해 수행되었다. 양자의 분석에서, 펩티드는 미엘린 기초 단백질의 위치 83에서 93에의 에피토프로부터 유래된다. 이들 시도의 하나는 다발성 경화증이 있는 142 환자를 포함하고, 이것은 환자의 9%가 과민증을 전개하였기 때문에 미결되었다 (Ludwig Kapposi (2000) Induction of non-encephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in multiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in to placebo controlled, randomized phase II trial. Nature Medicine 10:1176-1182).
다른 시도는 25 환자를 포함하고, 그리고 또한 세 환자에게서 질병의 악화가 관찰되었기 때문에 중단되었다 (Bibiana Bielekova (2000) Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in multiple sclerosis: Results of to phase II clinical trial with an altered peptide ligand. Nature Medicine 6:1167-1175). 이 작업의 주요 저자는 이들 부정적인 결과를 결정하는 가능한 인자를 분석했으며, APL의 사이트에서 수행된 변화는 HLA에 연합한 새로운 모티브를 만드는 것(이것은 환자 I에 존재하는 DRB1*0404에 결합하는 APL의 경우에 발생되는 것과 같음)으로 윤곽을 잡았고, 복합 APL-HLA는 또한 선천적인 자가 항원에 의해 교차-활성화되어 질 수 있는 부정적 도태에서 제외되지 않은 T 세포를 자극할 수 있다. 이 실험에서, 고농도의 APL이, 자가 항원에 극히 유사하게 T 세포를 자극할 수 있는 약학적 제제에 사용되어 헤테로클리틱 T 세포 반응을 유도한다 (Bibiana Bielekova and Roland Martin (2001) Antigen-specific immunomodulation via altered peptide tying. J Mol Med. 79:552-556).
이들 두 가지의 임상적 실험을 수행하기 위해, 저자는 APL에 대해 환자로부 터 T 세포의 생체외 반응을 미리 분석하지는 않았다. 이들은 또한 치료된 환자에 의해 발현된 HLA 분자의 타입을 고려하지도 않았다.
자가면역 반응 질환의 치료에 있어서의 주요한 도전은 다른 비 관련된 T 세포에 영향을 미침이 없이 특이적으로 발병원 T 세포를 제거할 수 있는 치료적 방책의 개발이다. 따라서, 치료적 연구는 깊어진 자가면역 반응 진행을 없애는 안전하고, 특이적이고 효과적인 방법이 조사되어야 한다.
종래의 기술 상태에 대비하여, 본 발명은 RA의 과정에 저해적인 분자적 메커니즘을 특이적 방식으로 유도하는 hHsp60의 펩티드 및 그의 유도형 APL의 사용을 제안한다.
본 발명은 T 세포에 대한 에피토프를 구성하여, 특히 에너지 유도 메커니즘 또는 RA 환자에 있어 조절 T 세포의 클론에 의해 매개된 내성의 메커니즘을 유도하고 다음의 시퀀스를 나타내는 60 kDa의 히트 쇼크의 인간 단백질의 펩티드를 제공하여 이미 언급된 문제를 해결한다:
E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)
E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO: 2)
F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA (SEQ. ID. NO: 3)
특허 출원 WO9711966호는 이것이 T 세포에서 내성을 유도하고 RA를 방지할 수 있다는 사실에 기초하여 hHsp60 및 Mt의 펩티드의 사용을 의도한다. 이들의 저자는 이들 펩티드를 마우스(관절염이 처음부터 이미 유발된 것임)에 투여함으로써 질병의 개선을 확증했다. 이 출원에 반하여, 우리는 본 펩티드가 환자의 단핵 세포를 사용한 "생체 외" 분석 뿐 아니라 관절염의 두 동물 모델에서 IL-10의 유의성 있는 증가를 확증하는 매우 효과적인 방식으로 말초의 내성을 유도하는 활성적 억제의 메커니즘을 유도한다는 것을 입증했다.
어쥬번트- 유발 관절염 (AIA)의 모델에서 T 세포의 근본적인 반응은 Hsp60에 대한 것으로 잘 알려져 있다. 본 발명자 등은 이 모델에서 hHsp60의 본 유도된 펩티드가 IL-10의 증가 및 TNFα 준위의 감소를 생성하여 매우 현저한 치료적 보호를 발휘한다는 것을 점검했다. 동일한 치료적 효과가 이들 펩티드에 의해 발휘되었고, 본 발명자 등은 또한 그 주요한 반응이 타입 II 콜라겐에 대한 것인 콜라겐- 유발 관절염 (CIA)의 동물 모델에서 점검했다.
이들 사실은 본 펩티드의 치료적 능력은 유도 제제에 의존하지 않고 관절에 존재하는 기타 자가 항원까지 확장할 수 있는 염증의 위치에 활성적 억제의 메커니즘을 조절할 수 있어, RA의 과정 동안에 발생한 면역발병원의 과정에 혁신적으로 공헌한다는 것을 나타낸다. 이들의 결과는 RA의 치료를 위한 본 제제 사용의 치료적 가능성을 공고하게 한다.
본 발명에 따르면, 이들 펩티드는 인간 MHC 분자로 접촉 사이트에서 변형된 펩티드 E18-12 (SEQ. ID. NO: 1) 및 E18-3 (SEQ. ID. NO: 2)의 유도형 APL 변형체와 랫트 MHC 분자로 접촉 사이트에서 변형된 펩티드 F19-6 (SEQ. ID. NO: 3)의 유도형 APL의 디자인에 특히 유용하다. 이들 각 시퀀스의 아미노산은 다음과 같다:
MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)
1 2 34 56 7
위치 1에서 치환된 것: A,F,I,L,M,V,W, 또는 Y
위치 2에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 3에서 치환된 것: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, 또는 M
위치 4에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 5에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, 또는 Y
위치 6에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 7에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, 또는 Y
SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ.ID. NO: 2)
1 2 3 45 6 7 8
위치 1에서 치환된 것: L,I,V,M,Y,W,F, 또는 A
위치 2 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 3 에서 치환된 것: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 4 에서 치환된 것: L,I,V,M,Y,W,F, 또는 A
위치 5 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 6 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 7 에서 치환된 것: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 8 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
IIDPTKVVRTALLDAA (F19-6) (SEQ.ID. NO: 3)
1 2
위치 1은 H에 의해 치환됨.
위치 2는 E에 의해 치환됨.
특정한 수행에 있어서, 유도형 APL 펩티드는 SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 20 y SEQ. ID. NO: 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 가진다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 합성의 종래 방법에 의해 생산될 수 있다. 각 펩티드의 특이적 조성물은 이후에 나타나는 실시예에서 기술된 것과 같이 실험에 있어서 유도하는 면역 반응의 수준과 질에 의해 분석될 수 있다.
상기 및 실시예에 기술된 모든 시퀀스는 유용하고 또한 개선된 특성을 갖는 유도 펩티드의 디자인 및 합성을 위한 기초로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 이미 열거된 펩티드와 그리고 선택적으로 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
환자에게 약학적 제제의 투여는 특이적 환자에 의해 발현된 HLA 클라스 II 분자와 조화될 것이다.
약학적 조성물의 투여 방법은 "생체 외" 테스트에서 이들 제제가 유도하는 시토킨 패턴에 의존한다. 조절 반응을 유도하는 APL 펩티드를 포함하는 약학적 제제는 피내로 또는 피하로의 경로로 투여될 것이다. TH1 반응을 유도하는 본래의 펩티드를 포함하는 약학적 제제는 경구 경로로 투여될 수 있을 것이다.
본 발명의 약학적 조성물에서 펩티드의 양은 숙주에서 효과적인 면역 반응을 생성하는 것이다. 효과적인 양은 투여될 때 RA의 특징적인 염증성 신호를 유의성 있게 감소하고 이 질병의 과정에 특징적인 관절에의 손상을 중단하는 분자 메커니즘을 유도하는 양이다. 숙주에 투여된 약학적 조성물의 양은 또한 사용된 펩티드, ACR 스코어 (American College of Rheumatology, 약칭 ACR), HLA 타입 II, 진단된 질병을 가진 시간, 나이, 성별, 일반적인 건강 뿐 아니라 일반적인 면역학적 반응의 준위를 포함하는 여러 가지 인자에 의존하여 변할 수 있다.
본 발명은 또한 RA의 치료 방법에 관한 것으로, 이미 언급된 효과적인 양의 펩티드 또는 약학적 조성물의 환자에 대한 투여를 포함한다.
부분적으로, 결과는 다음의 도면에 그래픽으로 도시된다:
도 1: AIA 모델에서 피내 경로로 F19-6 및 F19-7 펩티드로 처리된 랫트에 관절염의 임상적 신호의 평가.
도 2: 질병의 유발 15일에 AIA 모델에서 랫트의 단핵세포에서 F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 유발된 TNFα 준위의 조절.
도 3: 질병의 유발 15일에 AIA 모델에서 랫트의 단핵세포에서 F19-6 및 F19- 7 펩티드에 의해 유발된 IL-10 준위의 조절.
도 4: 질병이 치료되지 않은 동물에 속하는 관절 부위의 광학 현미경검사. IS: 관절내부의 공간, EC: 연골의 부식, P: 지방층. 헤마토실린-에오신으로 염색됨.
도 5: 피내의 경로로 F19-7 펩티드로 치료 동물에 속하는 관절 부위의 광학 현미경검사. IS: 관절내부의 공간. 헤마토실린-에오신으로 염색됨.
도 6: 질병의 유발 21일에 CIA 모델에서 랫트의 단핵세포에서 F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 유발된 TNFα 준위의 조절.
도 7: 질병의 유발 21일에 CIA 모델에서 랫트의 단핵세포에서 F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 유발된 IL-10 준위의 조절.
도 8: RA 환자의 단핵세포에서 F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 유발된 TNFα 준위의 조절.
도 9: RA 환자의 단핵세포에서 E18-3 및 E18-12 펩티드에 의한 TNFα 준위의 조절.
도 10: RA 환자의 단핵세포에서 E18-3 및 E18-12 펩티드에 의한 IL-10 준위의 조절.
도 11: RA 환자의 단핵세포에서 E18-3 및 E18-12 펩티드 및 이들의 APLs에 의해 유발된 IL-10 준위의 조절.
도 12: RA 환자의 단핵세포에서 E18-3 및 E18-12 펩티드 및 이들의 APLs에 의해 유발된 TNFα 준위의 조절.
도 13: E18-3 및 E18-12 펩티드 및 이들의 APLs에 의해 유발된 IL-10 및 TNFα 준위의 비율.
도 14: AIA 모델에서 피내 경로로 E18-12 및 E18-12APL1 펩티드로 처리된 랫트에서 관절염의 임상적 신호의 평가.
실시예 1: 인간 HLA 에 의해 존재하는 hHsp60 의 펩티드.
hHsp60의 선택된 펩티드는 다음의 사용된 프로그램에 의해 인간 T 세포의 에피토프로 보고된 것이다: SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor and Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. (access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi /)) 및 ProPred (Singh,H. and Raghava,G.P.S. 2001. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics, 17(12):1236-37).
이들 펩티드에 상당하는 시퀀스는 다음 표 1에 나타냈다.
실시예
2: 루이스
랫트의
에피토프에
대한
hHsp60
의 펩티드.
hHsp60의 시퀀스로부터 시작하여, 데이타베이스 SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. (access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi /))에 기술된 시퀀스 모티브에 따른 랫트 RT1.Bl의 MHC-II의 분자에 결합하는 펩티드를 선택하였다.
9 아미노산의 모든 펩티드를 분석하는 프로그램이 이 모티브를 충족하는 것을 조사하기 위해 디자인되었다. 우리는 또한 기술된 잔기를 앵커리지 또는 특별한 것으로 위치의 한 곳에 포함하지 않는 변형체를 포함했다.
이들 펩티드 (F19-6)의 하나에 상응하는 시퀀스로 이것은 표 2에 나타냈다.
실시예 3: MHC 에 결합하여 포함된 아미노산에 변형을 갖는 APL 의 디자인.
실시예 1 및 2에서 선택된 펩티드로부터 출발하여, HLA 분자에 대한 펩티드의 친화성을 증가하기 위해 특이적 MHC (위치 1, 3, 4, 6, 8 또는 9)에 결합하여 포함된 위치를 변형하였다. 만일 펩티드의 선정이 다른 알고리듬 타입(ProPred)을 사용하여 이루어졌다면 MHC 리간드로서 펩티드의 스코어를 증가할 수 있는 결합 모티브(SYFPEITHI) 또는 잔기를 사용하는 방법으로 만일 펩티드가 선택되었다면 앵커리지 잔기가 될 수 있는 이들 위치의 각 하나에서 최적의 잔기에 대해 조사되었다.
이들 분석의 결과로서, 펩티드 E18-12는 다음과 같이 특정된 각 하나의 아미노산에 의해 위치 1 내지 7에서 치환되었다:
MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)
1 2 34 56 7
위치 1에서 치환된 것: A,F,I,L,M,V,W, 또는 Y
위치 2 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 3 에서 치환된 것: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, 또는 M
위치 4 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 5 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, 또는 Y
위치 6 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 7 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, 또는 Y
SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 2)
1 2 3 45 6 7 8
위치 1에서 치환된 것: L,I,V,M,Y,W,F, 또는 A
위치 2 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 3 에서 치환된 것: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 4 에서 치환된 것: L,I,V,M,Y,W,F, 또는 A
위치 5 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 6 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 7 에서 치환된 것: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, 또는 Y
위치 8 에서 치환된 것: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는 Y
펩티드 F19-6은 다음과 같이 특정된 아미노산에 의해 위치 1 및 2에서 치환되었다:
IIDPTKVVRTALLDAA (F19-6)
1 2
위치 1은 H에 의해 치환됨.
위치 2는 E에 의해 치환됨.
실시예
4: 루이스
랫트에서
어쥬번트
및 콜라겐에 의한 관절염의 유도.
실험실 동물의 생산을 위한 내셔날 센터(CENPALAB, Cuba)에 의해 공급된 암컷 근친교배 루이스 랫트 (RT1.Bl MHC)가 실험에 사용되었다. 대략 101-120g의 체중을 지니고, 5 내지 8주령의 랫트가 랜덤하게 선택되었다.
사용된 질병의 유도제의 하나는 인컴플릿 프로이드 어쥬번트(IFA) (Sigma, USA) 안에 Mt (H37Ra, Difco, England)를 포함하는 것이다. 관절염의 다른 유도제는 IFA 내의 보빈 타입 II 콜라겐이었다.
이 실시예에서는, 두 가지의 다른 자가 항원에 대한 면역 반응에 의해 랫트에 관절염을 전개하기 위해 두 가지의 다른 유도제가 사용되었다. 질병의 유도제로서 Mt를 사용한 관절염에 대한 동물 모델에 있어서, T-세포의 근본적 반응은 Hsp60에 대한 것이라는 것은 매우 잘 알려져 있다 (Anderton, SM (1995) Activation of T cells recognizing self 60-kD heat shock protein can protect against experimental arthritis. J. Exp . Med. 181: 943-952). 유도제로 콜라겐을 사용한 모델에서는, 현저한 항체 반응 뿐 아니라 T-세포 클론이 이 항원에 대해 전개되었다 (M Griffiths (1988) Immunogenetics of collagen-induced arthritis in rats. Inten. Rev. Immunology 4: 1-15).
이 두 동물 모델을 전개하기 위한 우리의 근본적인 목적은 양자의 모델에서 이들 펩티드의 보호 효과가 랫트에서 관절염의 유도제로서 사용된 자가 항원에 독립적인지 또는 아닌지를 입증할 목적으로 본 펩티드를 평가하는 것이다.
실시예
5: 임상적 신호의 평가.
각 랫트에 나타난 관절염의 전개와 관련된 염증의 등급은 본 목적을 위해 준비된 다음의 평균에 따라 평가되었다.
0 점: 정상적인 발.
1 점: 발목관절 또는 돌의 가볍지만 명확한 홍조 또는 개체의 핑거에 제한된 뚜렷한 홍조 및 염증, 영향을 입은 핑거의 수는 별개임.
2 점: 발목관절 및 돌의 중간정도의 홍조 및 염증.
3 점: 핑거를 포함하는 전체 발의 심한 홍조 및 염증.
4 점: 복수의 관절을 포함하는 발의 최대 염증 및 기형.
네 발은 상기 설정된 점수에 따라 별도로 평가되었고, 각 발은 4점까지 받을 수 있다. 따라서 각 랫트는 최대 16점을 받을 수 있다.
육안 평가는 질병의 유도 후 매 5일 수행되었다.
관절염의 신호의 임상적 평가는 도 1에 도시된 바와 같이, 질병이 유발되지 않은 경우는 건강한 대조군(그룹 IV)에 상당하는 동물들 중에 유의성 있는 통계적 차이가 있고, 질병이 유발되었지만 펩티드로 치료되지 않은 경우는 질병 대조군(그룹 III) 에 상당하는 동물들 중에 유의성 있는 통계적 차이가 있다는 것을 입증했다.
실시예
6: 펩티드 합성.
펩티드는 시린지에서 Fmoc/tBu 방법에 의해 합성되었다. 사용된 수지는 Fmoc-AM-MBHA (0.54 mmol/g)이었고, 합성 프로토콜은 기계적인 교반이 지속되었다. TFA로 처리 후, 펩티드는 동결 건조되었고, HPLC 및 질량 스펙트로메트리에 의해 결정되었다.
실시예
7: 펩티드의
피내로
투여.
동물들은 각 12 랫트의 4 그룹으로 나뉘었다. 질병은 세 동물 군 (그룹 I 그룹 III)에서 유발되었고, 두 그룹은 펩티드로 처리되었고 하나는 질병 유도의 대조군이 되었다. 펩티드로 처리된 두 그룹의 동물은 Mt로 질병의 유도 후 12, 17 및 22일에 100μL 부피의 PBS에 각 랫트 당 200㎍의 펩티드를 투여하였다.
네 그룹으로 나뉘어진 동물은 다음의 방법으로 처리되었다:
?그룹 I: 펩티드 F19-6으로 처리된 동물
?그룹 II: 펩티드 F19-7로 처리된 동물
?그룹 III: 펩티드로 처리되지 않은 동물 (질병 유도의 대조)
?그룹 IV: 질병이 유발되지 않고 펩티드로 처리되지 않은 동물 (음성 대조)
유도 후 15, 21, 28 및 35일 후, 세 동물은 그룹 별로 희생되어, 지라가 추출되고 샘플은 조직병리학적 분석을 위해 관절로부터 채취되었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 관절염의 전개와 연관된 신호가 점진적으로 시작되었다. 그룹 III의 동물에 있어서, 관절염의 유도 10일 후로부터 질병의 전개가 대조군에 대응하여, 하위 관절의 가벼운 홍조로 시작하여 몇몇의 랫트에서는 심각하게 될 때까지 관절의 나머지 부위로 확장되어가는 염증성 과정의 전개가 입증되어 졌다.
이 도면에서, hHsp60의 원래의 에피토프에 상당한 펩티드 F19-6 및 이들의 변형체인 APL F19-7의 투여는 양 펩티드로 처리된 동물에 있어 관절염의 임상적 신호의 유의성 있는 감소를 유도하는 것으로 증명되었다. 펩티드 F19-6 및 F19-7로 처리된 그룹과 질병의 양성 대조군으로 취해진 그룹 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 얻어졌다 (P <0.05).
이 분석에서 얻어진 결과는 랫트에 있어서 질병의 거의 완전한 경감이 관찰될 수 있었기 때문에 펩티드 F19-6 및 F19-7이 처리된 동물에서 긍정적인 효과를 발휘한다는 것을 확증한다.
실시예
8:
mRNA
분리.
랫트의 지라로부터 분리된 단핵 세포는 약 20 시간 동안 배양되었다. 그 후, 상등액을 버리고 1mL의 시약인 TRI REAGENT TM (SIGMA, USA)이 각 웰에 부가되고 5 분 동안 실온에 방치하였다. 그런 다음 mRNA의 분리는 상기 상품공급자에 의해 제시된 프로토콜에 따라 수행되었다.
실시예
9:
RNA
의
역전사
.
상보 DNA를 얻기 위해, 시스템 Gene Amp RNA PCR Kit (Perkin - Elmmer, USA)가 사용되었다. 각 샘플에 상응하는 1 mg의 mRNA 및 프로토콜이 사용되었고, 이 프로토콜은 공급자에 의해 제시된 것과 같이 하여 지속되었다.
반응물은 다음의 아웃터라인에 따라 써모싸이클러 (Minicycler, MJ Research, USA)에서 배양되었다: 42℃에서 1시간 동안의 제일 주기, 이어서 95℃에서 5분 및 4℃에서 5분.
실시예
10: 중합효소 연쇄반응.
중합효소 연쇄반응 (PCR)이 시토킨: TNFα 및 IL-10 그리고 효소 GAP-DH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 약칭 GAP-DH)를 코드하는 구성 유전자에 대해 수행되었다.
각 반응에 대해, 25μL의 최종 부피 내에 공급자에 의해 제시된 버퍼(KCl 50Mm, Tris-HCl 10mM, pH 9.0, 트립톤 X-100 to 0.1% 및 MgCl2 1.5 mm)에 5mL의 DNA 몰드, 0.25mL의 DNA 열안정성 중합효소 (Taq-Pol) (Perkin - Elmmer, USA)로된 각 프라이머 10pmol이 사용되었다.
GAP-DH에 대한 반응물은 다음의 프로그램에 따라 써모싸이클러 (Minicycler, MJ Research, U.S)에서 배양되었다: 94℃(변성온도)에서 3분, 94℃에서 1분 58℃(하이브리드화 온도)에서 1분 및 72℃(신장 온도)에서 1분의 제일 주기, 이어서 각각 94℃에서 1분, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 35 주기. 마지막으로, 72℃에서 3분의 익스텐션 단계.
시토킨에 대해서는, 이전의 아웃터라인이 지속되었고, 단지 하이브리드화 온도 만이 변하였다. IL-10에 대해서는 54℃ 그리고 TNFα에 대해서는 64℃임.
실시예
11:
아가로스
겔 내에서 전기영동에 의한
PCR
제품의 분석.
PCR의 결과는 아가로스 겔 내에서 전기영동에 의해 분석되었다. 전기영동의 이동 상이 캡쳐되고 Molecular Program Analyst (BioRad)로 분석되었다. 그 결과는 각 시토킨에 대한 mRNA의 상대적인 준위로 표현되었다.
실시예
12: 각
시토킨에
대한
mRNA
의 상대적인 준위의 통계적 분석.
치료된 동물의 그룹 중에서 시토킨(각각에 대한 mRNA의 상대적 준위에 따른 것)의 패턴에 있어서의 차이를 결정하기 위해, Kruskal-Wallis 및 Student-Newman-Keuls의 테스트가 사용되었다 (Statistical package Sigma Stat v 2 1997, GraphPad Software, Inc).
이 통계적 분석은 질병의 유도 15일 후에 펩티드가 질병의 대조군에 비하여 TNFα의 준위를 유의적으로 감소하였다.
이들 결과는 도 2에 도시되었으며, 여기서 GI은 F19-6 펩티드로 처리된 동물에 상응하고, GII는 F19-7 펩티드로 처리된 랫트 그룹에 상응하고, GIII는 비처리된 병든 그룹을 나타내고 그리고 GIV는 건강한 동물을 포함한다. 펩티드로의 처리는 동물의 염증성 진행의 유발에 아주 크게 책임이 있는 이 시토킨의 상대적인 준위에서의 감소를 야기했음이 명확하게 입증되었다. 펩티드로 처리된 그룹 중에 시토킨 TNFα의 경우에 대해서 그리고 질병의 양성 대조군으로 사용된 그룹에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 있었다. 펩티드로 처리된 다른 그룹 중에서 유의성 있는 차이는 이들 중에서 뿐 아니라 질병의 음성 대조군으로 취해진 그룹 중에서 입증되지 않았다. 이 결과는 이들 두 펩티드의 투여가 실질적으로 건강한 동물에서와 같이 이 시토킨이 정상적인 준위가 될 때까지 TNFα의 준위에서의 감소를 야기한다는 것을 나타낸다.
이 연구에 사용된 펩티드가 IL-10같은 항- 염증성 시토킨의 생산을 자극할 수 있는지를 결정할 목적으로, 이 시토킨에 상응하는 mRNA의 상대적 준위가 평가되었다.
IL-10은 T 세포 조절 반응을 통해 말초 내성의 유발에 포함된다. IL-10은 IL-2, IL-5 및 TNFα의 생산을 저해하기 위해 T 세포를 직접적으로 조절한다.
도 3은 질병의 유도 15일 후에 처리의 다른 그룹에서 IL-10 발현 준위의 정량적 측정을 보여준다. 이 도면에서, GI은 F19-6 펩티드로 처리된 동물에 상응하고, GII는 F19-7 펩티드로 처리된 랫트 그룹을 나타내고, GIII는 비처리된 병든 그룹을 나타내고 그리고 GIV는 건강한 동물을 포함한다.
이들 펩티드로 동물의 치료는 IL-10의 상대적인 발현 준위에서의 증가를 유도한다. 우리는 양 펩티드로 처리된 그룹들 사이에서 통계적으로 유의성 있는 차이를 얻지 못했지만, 양성 및 음성 대조군을 구성하는 동물들과 이들 그룹들 간의 차이는 존재한다. 이들 결과로부터 출발하여 우리는 이 펩티드가 IL-10의 경우와 같은 항-염증성 시토킨의 생산 준위를 증가하고 TNFα같은 전-염증성 시토킨의 생산 준위를 감소하여 질병의 발병기전에 포함된 T 세포의 관능적 표현형에서의 변화를 유도하는 작용을 하는 것으로 추론할 수 있다.
실시예
13: 조직-병리학상 분석.
이 동물 모델에서 관찰된 임상적 신호를 확증하고 Mt에 의해 발생된 손상적인 진행과정을 전환하거나 줄이기 위한 양 펩티드의 능력을 분석하기 위해, 각 그룹의 동물 관절의 병리학상 분석을 수행하였다.
관절에 상응하는 시트가 CIGB의 병리학의 그룹에 의해 분석되었다.
관절은 칼슘이 제거된 10% 포르말린의 중화 완충액에 고정되었다. 조직은 알코올 분배액에서 탈수되고, 파라핀에 흡수된 후 5㎛의 분획으로 절단되었다. 그 후, 샘플은 글라스 슬라이드에 얻혀진 후 헤마톡실린-에오신 혼합물로 염색되고 광학 현미경으로 관찰되었다.
표 3에서, P: 지방층을 나타내고; EC: 연골 부식; IM: 골수의 침투; HO: 파골세포의 과다형성; G: 육아종 반응; PMN: 다핵형백혈구.
15일에 희생된 것을 포함하는 그룹 III의 동물에서, 연골의 부식과 골수의 침투를 야기하는 지방층의 존재가 입증되었다. 또한, Mt로 유도의 전형적인 육아종 반응이 관찰되었고 뼈의 기질의 강력한 파괴력을 가지는 거대 T 세포인 파골세포의 과다형성이 빈번하게 관찰되었다. 이들 조직학적인 결과는 AR 환자에서 발생하는 관절에서의 변형의 특징적인 징후를 형성하며, 우리가 약학적 후보군을 평가하기 위한 적절한 동물 모델을 개발하였다는 것을 입증한다.
도 4A는 그룹 III의 동물의 관절에 대한 것이다. 전체 관절 내의 공간으로 침투하여 그 부식이 명백하게 된 연골로 신장할 뿐 아니라 골수로 향해 침투하는 지방층의 존재를 관찰할 수 있다. 도 4B는 지방층이 세균탐식 세포에 풍부한 알갱이 모양의 조직으로 명확하게 관찰되는 골수에 상응하는 영역의 확대를 나타낸다.
도 5에 도시된 바와 같이 피내로의 경로에 의한 F19-7 펩티드로 처리(그룹 II)에서는, 15일에 희생된 동물은, 심각한 조직학적 징후가 존재하는 특징이 있는 그룹 III의 나머지 동물들과 대비적으로, 단지 다핵형백혈구 만이 존재하고 조직학적 변이가 존재하지 않았고, 상흔 조직에 많지 않았다.
표 3에 나타난 바와 같이, F19-6 및 F19-7 펩티드로 처리된 그룹의 동물들은 제일 분석의 과정 중에는 실질적으로 조직학적 영향을 보여주지 않았다. 관절염의 전개에 대한 보다 큰 보호가 F19-7 펩티드로 처리된 동물들에서 입증되었다. 이 처리 그룹에 포함된 랫트의 절반(6 마리)은 F19-6으로 처리된 그룹의 동물들이 단지 두 마리가 조직병리학상 손상을 나타내지 않은 것에 대비하여, 어떠한 조직학적 징후도 나타내지 않았다. F19-6 및 F19-7 펩티드로 처리된 그룹에서, 지방층의 존재는 관절염의 유도 15일 및 21일에는 관찰되지 않았으며, 이는 이들 펩티드의 투여는 관절염의 전개 동안에 염증성 반응의 특징적인 세포 상 변화의 출현에 있어서의 지연을 야기했다는 것을 나타낸다. 관절염의 유도 후 35일에 희생된 F19-7 펩티드로 처리된 동물에 있어서 단지 하나의 랫트가 질병의 전개에 특징적인 조직학적 영향을 받음을 입증했다는 것은 유의성이 있다. 이들 결과는 이 펩티드로 동물의 치료는 오리지날 에피토프 F19-6을 포함하는 펩티드에 비해 F19-7 APL의 치료적 우월성을 보여 질병의 임상적인 표현의 지연에 부가하여 실질적으로 관절염의 조직병리학상 징후의 전반적인 퇴화를 유도하였다는 것을 나타낸다.
실시예
14. 타입
II
콜라겐으로 관절염이 유발된
랫트로부터
단핵
세포를 사용하여, F19-6 및 F19-7 펩티드에 의한
시토킨
패턴 유발의 생체 외 평가.
이 분석에 있어서, 관절염이 IFA에 보빈 타입 II 콜라겐을 사용하여 유발된 병든 랫트가 사용되었다. 각 분석된 랫트의 지라가 추출되고 단핵세포가 분리되었다.
지라로부터 분리된 단핵세포는 24 웰 플레이트(Costar, USA) 내 1.5mL의 RPMI 1640에서 배양되었다. 이 분석은 3회 수행되었고, 전체 3x106 세포/웰이 CO2 5%의 가습 분위기에서 37℃에서 5mg/mL 농도의 F19-6 및 F19-7로 24시간 동안 배양되었다. 펩티드를 가하지 않고 배양된 세포가 음성 대조군으로 사용되었다.
그 후 mRNA가 분리되고 핵산의 역전사 반응 및 PCR이 상기 실시에에 기술된 것과 동일한 방법으로 수행되었다. 반응 산물의 분석은 실시예 12에 기술된 바와 같이 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 수행되었다. 각 샘플에 대한 mRNA의 상대적 준위에 따른 시토킨 패턴에서의 차이를 결정하기 위해, 실시예13에 기술된 것과 같은 통계적 테스트가 사용되었다.
도 6은 질병의 유도 후 21일에 대응하는 F19-6 및 F19-7 펩티드로 생체 외에서 자극된 것과 펩티드없이 배양된 세포의 TNFα의 준위를 나타낸다. 알파벳 A는 펩티드없이 배양된 세포의 TNFα의 준위를 나타내고, 알파벳 B는 세포가 F19-6 펩티드로 자극되었을 때 이 시토킨의 값을 나타내고, 알파벳 C는 세포가 F19-7 펩티드로 자극되었을 때 TNFα의 준위를 나타낸다. 이 도면에서, CII는 관절염이 콜라겐 타입 II로 유발된 동물의 그룹을 나타내고, 대조군은 건강한 동물의 그룹을 나타낸다.
도 7은 질병의 유도 후 21일에 대응하는 F19-6 및 F19-7 펩티드로 생체 외에서 자극된 것과 펩티드없이 배양된 세포의 IL-10의 준위를 나타내는 것으로, 알파벳 A는 펩티드없이 배양된 세포의 IL-10의 준위를 나타내고, 알파벳 B는 세포가 F19-6 펩티드로 자극되었을 때 이 시토킨의 값을 나타내고, 알파벳 C는 세포가 F19-7 펩티드로 자극되었을 때 IL-10의 준위를 나타낸다. 이 도면에서, CII는 AR이 콜라겐 타입 II로 유발된 동물의 그룹을 나타내고, 대조군은 건강한 동물의 그룹을 나타낸다.
이들 두 도면에서 관찰되어 지는 것과 같이, F19-6 및 F19-7 펩티드는 생체 외에서 TNFα의 준위를 감소하였지만, IL-10의 준위의 경우에 있어서는 단지 F19-7 펩티드만이 유의적으로 그것을 증가하였다.
이들 결과는 F19-7 펩티드가 콜라겐으로 관절염이 유발된 동물 모델에서 조절 표현형에 대한 시토킨 패턴을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 생체 외에서 hHsp60로부터 유래된 이 펩티드의 면역조절 작용이 질병의 전개에 관여하는 유도제가 Mt 또는 자가 항원에 관련되지 않는 경우의 관절염의 동물 모델까지 신장될 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
이들 결과는 F19-7 펩티드가 염증 부위에서 생체 내에서 활성적 억제를 중재할 수 있는 구조적으로 관련된 항원에 대해 내성을 유도할 수 있다는 것을 제시한다.
이들 결과로, F19-7 펩티드가 IL-10을 생산하는 조절 T 세포에 의해 중재된 동물에서 Mt 또는 타입 II 콜라겐에 의해 유발된 관절염에 대한 보호를 유도한다는 것을 제안할 수 있다. 이 효과는 RA 과정 중에 발생하는 면역병리학적 과정에 혁신적으로 기여하는 관절에 존재하는 다른 자가 항원까지 확장될 수 있다.
실시예
15: F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 유발된
RA
환자에서
시토킨
측정.
RA 환자의 혈액을 사용하여 시토킨: TNFα, IFNδ 및 IL-10의 측정 분석을 수행하였다. 질병의 발병기전에 포함된 다른 시토킨을 증가하거나 또는 감소하는 hHsp60의 펩티드의 효력이 이 분석에서 평가되었다.
PBS 1X에 1/2 희석된 각 환자의 10 mL의 혈액으로부터 출발하여, 이 희석액으로부터 5 mL가 15 mL의 원심분리 튜브 내의 Ficoll-Paque (Amershan) 3 mL에 부가되고, 30분 동안 1200 rpm으로 원심분리되었다. 단핵세포에 상당하는 고리 층이 추출되었다. 그 후, 이 세포는 15 mL의 PBS 1X로 2회 수세되었고, 각 수세 후 900 rpm에서 원심분리되었다. 마지막으로, 세포의 펠릿은 10%의 송아지 태아 혈청을 포함하고, 페니실린 (100U/mL), 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL), HEPES 25 mM/L 및 L-글루타민 2mM (모두 Gibco BRL사로부터 수득)이 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁되었다.
얻어진 단핵세포는 800 μL 부피의 24 웰 플레이트(Costar)에 106 세포/웰의 수로 접종되었다. 그 후, hHsp60의 펩티드가 시토킨 준위를 조절하는 각 펩티드의 최적의 농도를 알아보기 위해 0.5 ㎍/mL 로부터 100 ㎍/mL까지의 농도 범위로 부가되었다. 식물성 적혈구응집소 (PHA) 1%가 세포 자극의 양성 대조군으로 사용되었으며, 반면 RPMI 1640 자체가 기본적 세포 성장의 대조군으로 사용되었다.
세포는 24시간 동안 배양되었고, 그 후 각 웰의 상등액이 취해지고, 희석되어 시토킨 농도가 특정 키트(Quantikine® R&D Systems)에 의해 상기 상품 공급자의 지시에 따라 결정되었다.
RA 환자의 단핵 세포에서 F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 조정된 TNFα의 준위는 도 8에 나타낸다. 이 도면에서, 알파벳 A는 펩티드없이 생체 외에서 배양된 세포를 나타내고, 반면 알파벳 B는 F19-6 펩티드로 생체 외에서 자극된 세포에 상응하고, 알파벳 C는 F19-7 펩티드로 생체 외에서 자극된 세포에 상응한다. 이 도면에서, 비 자극된 세포에 비해 펩티드로 자극된 세포에 의해 분비된 시토킨의 준위 중에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 존재할 때, 다른 글자가 상응하는 시토킨의 준위에 대해 막대 내에 할당된다.
P19 및 P21로 표시된 환자에 있어서, 도 8에서 관찰되는 것과 같이, 비록 환자 P19에서 이 시토킨의 준위에서의 감소가 F19-7 펩티드로의 것보다 유의적이지만, TNFα의 준위가 비 자극된 세포의 것에 비해 F19-6 및 F19-7 펩티드에 의해 유의적으로 감소하였다.
P13으로 표시된 환자에 있어서, TNFα의 준위가 F19-6 펩티드에 의해 증가되었지만, 이 환자의 단핵 세포가 F19-7 펩티드로 자극되었을 때, 이 시토킨의 준위는 유의적으로 감소하였다. 이들 결과는 비록 F19-7 펩티드가 랫트로부터 MHC에 의해 존재되도록 의도되지만, 이것이 이 시토킨의 준위를 감소할 수 있어, RA의 특징적인 염증성 과정에 주요한 원인이 되고, 따라서 이 펩티드는 이 질병의 치료에 잠정적인 치료 후보라는 것을 입증한다.
실시예
16:
E18
-12 및
E18
-3 펩티드에 의한
RA
유발
환자에서
시토킨
측정.
RA 환자의 혈액을 사용하여 시토킨 측정의 분석이 수행되었다: TNFα, IFNδ 및 IL-10. 질병의 발병기전에 포함된 다른 시토킨을 증가하거나 또는 감소하는 hHsp60의 펩티드의 효력이 이 분석에서 평가되었다.
10 mL의 혈액이 각 환자로부터 추출되어, PBS 1X에 1/2 희석되었다. 이 희석액 5 mL가 15 mL의 원심분리 튜브 내의 Ficoll-Paque (Amershan) 3 mL에 부가되고, 30분 동안 1200 rpm에서 원심분리되었다. 단핵세포에 상당하는 고리 층이 추출되었다. 그 후, 이 세포는 15 mL의 PBS 1X로 2회 수세되었고, 각 수세 후 900 rpm에서 원심분리되었다. 마지막으로, 침전물은 페니실린 (100U/mL), 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL), 25 HEPES mM/L 및 L-글루타민 2mM (모두 Gibco BRL사 로부터 수득)이 보충된 10%의 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지에 재현탁되었다.
얻어진 단핵세포는 800 μL 부피의 24 웰 플레이트(Costar)에 106 세포/웰의 수로 접종되었다. 그 후, hHsp60의 펩티드가 시토킨 준위를 조절하는 각 펩티드의 최적의 농도를 알아보기 위해 0.5 ㎍/mL 로부터 100 ㎍/mL까지의 농도 범위로 부가되었다. 식물성 적혈구응집소 (PHA) 1%가 세포 자극의 양성 대조군으로 사용되었으며, 반면 RPMI 1640 자체가 기본적 세포 성장의 대조군으로 사용되었다.
세포는 24시간 동안 배양되었고, 그 후 각 웰의 상등액이 취해지고, 희석되어 시토킨 농도가 특정 키트(Quantikine®R&D Systems)에 의해 상기 상품 공급자의 지시에 따라 결정되었다.
RA 환자의 단핵 세포에서 E18-3 및 E18-12 펩티드에 의해 조정된 TNFα의 준위는 도 9에 나타낸다. P4, P5 및 P16으로 표시된 환자는 분자 DR 0306을 발현하고, P7, P8 및 P12로 표시된 환자 분자 DR 0303을 발현하고, 반면 환자 P9는 유전형 DR0506을 나타내고 환자 P10은 유전형 DR 0204를 나타낸다. 이 도면에서, 알파벳 A는 펩티드없이 생체 외에서 배양된 세포를 나타내고, 반면 알파벳 B는 E18-3 펩티드로 생체 외에서 자극된 세포에 상응하고, 알파벳 C는 E18-12 펩티드로 생체 외에서 자극된 세포에 상응한다.
이 도면에서, 비 자극된 세포에 비해 펩티드로 자극된 세포에 의해 분비된 시토킨의 준위 중에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 존재할 때, 다른 글자가 상응하는 시토킨의 준위에 대해 막대 내에 할당된다.
도 9에서 관찰되어 지는 바와 같이, E18-12 및 E18-3 펩티드로 자극된 환자의 단핵세포에서의 TNFα의 합성의 유도는 이들 환자가 발현하는 HLA 타입 II 분자에 의존한다. 유전형 DR 0306을 나타내는 환자 P4, P5 및 P6에 있어서, 펩티드로 자극되지 않은 세포에 비하여 TNFα 농도의 통계적으로 유의성 있는 증가가 관찰되었다.
이 동일한 효과가 유전형 DR 0506의 환자 P9 및 유전형 DR 0204의 환자 P10에서 발생되었다.
유전형 DR 0303을 나타내는 환자 P7, P8 및 P12에 있어서, 단핵세포가 우리의 펩티드로 자극될 때, TNFα의 준위에 있어서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. E18-3 및 E18-12 펩티드에 대한 IL-10 준위의 조절은 도 9에 나타나 있고, 여기서 알파벳 A는 펩티드없이 생체 외에서 배양된 세포를 나타내고, 반면 알파벳 B는 E18-3 펩티드로 생체 외에서 자극된 세포에 상응하고, 알파벳 C는 E18-12 펩티드로 생체 외에서 자극된 세포를 나타낸다.
IL-10의 경우 있어서, 도 10에 나타난 바와 같이 환자 P9 및 P10에서는 이 시토킨의 유의성 있는 감소가 있지만, 나머지의 환자에서는 유의성 있는 변화가 없다.
이들 관찰로부터 우리는 E18-12 및 E18-3 펩티드가 말초의 단핵세포에 TH1 표현형을 유도하는 것으로 추론할 수 있다.
오리지날 펩티드: E18-12 또는 E18-3의 치료적 변형체가 경구의 경로로 이들의 투여가 될 수 있어서, 이들은 염증을 감소하는데 유의적으로 기여하는 내성 메카니즘을 유도할 것이다.
실시예
17: 유도형
APL
펩티드에 의한
RA
유발
환자에서
시토킨
측정.
이전의 결과로부터, 우리는 바이오인포매틱 도구를 사용하여 HLA 분자와 접촉하는 부위에, T 세포의 에피토프 상당하는 이들 오리지날 펩티드를 수정하기로 결정하였고, 이 수정된 타입의 APL 펩티드는 조절 표현형에 시토킨의 패턴을 변화시킬 것이다. 부가하여, 이들 펩티드의 각각에 형성된 수정은 다른 HLA 분자로 이들의 각각의 상호작용에 이론적으로 유리하게 될 환자에 의해 발현된 대부분의 HLA 분자에 대해 보고된 펩티드 결합 모티브를 충족한다.
시토킨: TNFα 및 IL-10의 측정을 위한 분석은 RA 환자의 혈액을 사용하여 수행되었다. 질환의 발병기전에 포함된 다른 시토킨을 증가하거나 감소하는 hHsp60으로부터의 유도형 APL 펩티드의 효력은 이들 테스트에서 평가되었다. 부가하여 오리지날 펩티드는 실험적 대조로서 이 평가(E18-3, E18-12)에 포함되었다.
이 테스트에서 평가된 APL 펩티드는 다음과 같다:
MGPKGRTVIILQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 5)
MGPKGRTVIIMQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 6)
MGPKGRTVIIAQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 7)
MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 8)
MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 9)
MGPKGRTVIILQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 10)
MGPKGRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 11)
MGPKLRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 12)
MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 13)
SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 14)
SIDLKDKYKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 15)
SIDLKDKLKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 16)
SIDLKDKYKNAGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 17)
SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 18)
SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 19)
SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNANEEA (SEQ. ID. NO: 20)
SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNANEEA (SEQ. ID. NO: 21)
10 mL의 혈액이 각 환자로부터 추출되고 PBS 1X에 1/2 희석되었다. 이 희석액 5 mL가 15 mL의 원심분리 튜브 내의 Ficoll-Paque (Amershan) 3 mL에 부가되고, 30분 동안 1200 rpm에서 원심분리되었다. 단핵세포에 상당하는 고리 층이 추출되었다. 그 후, 이 세포는 15 mL의 PBS 1X로 2회 수세되었고, 각 수세 후 900 rpm에서 원심분리되었다. 마지막으로, 침전물은 페니실린 (100U/mL), 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL), 25 HEPES mM/L 및 L-글루타민 2mM (모두 Gibco BRL사로부터 수득)이 보충된 10%의 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지에 재현탁되었다.
얻어진 단핵세포는 800 μL 부피의 24 웰 플레이트(Costar)에 106 세포/웰의 수로 접종되었다. 세포는 3회에 의해 그리고 40 ㎍/mL의 농도에서 펩티드 [E18-3, E18-12, E18-3APL1 (SEQ. ID. NO: 18), E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21), E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5), E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12)]로 자극되었다. RPMI 1640 자체가 기본적 세포 성장의 대조군으로 사용되었다.
세포는 24시간 동안 배양되었고, 그 후 각 웰의 상등액이 취해지고, 1/2 희석되어 시토킨 농도가 특정 키트(Quantikine® R&D Systems)에 의해 상기 상품 공급자의 지시에 따라 결정되었다.
오리지날 펩티드 (E18-12 및 E18-3) 및 APLs: E18-3APL1 (SEQ.ID. NO: 18); E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21); E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5); E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12)의 펩티드 판넬에 의해 유발된 IL-10의 준위는 도 11에 나타난다. 이 도면에서, 글자는 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다(우리는 단지 각 개개 환자에 있어서의 대조 세포와 다른 펩티드 간의 통계적인 유의성 만을 언급하였다). 부가하여, 환자 P4 및 P6의 세포는 펩티드 E18-3APL2 뿐 아니라 E18-12APL3에 의해서도 자극되지 않았다. 이것은 모든 환자에 있어서, 펩티드 E18-3APL1이 비 자극된 세포에 비해 매우 유의적으로 IL-10의 준위를 증가한다는 것을 입증한다. P2 및 P4와 같은 몇몇의 환자에서 이 펩티드에 의해 유발된 증가는 자극이 없는 세포에 의해 생산된 양보다 약 9 배 높으며, P1, P3 및 P5와 같은 환자에서는 약 5배 월등하다. 또한, 유사한 결과가 환자 P1, P4 및 P6에서 IL-10의 준위에서의 유의성 있는 증가에 기인하여 E18-12APL1으로 관찰되었다. 한편, 오리지날 펩티드 뿐 아니라 펩티드 E18-3APL2 및 E18-12APL3도 음성 대조군을 나타내는 세포와 비교하여 IL-10의 준위에서의 증가를 유발하지 않았다.
도 12는 환자의 동일한 그룹에 다른 펩티드에 의해 유발된 TNFα 준위를 나타낸다. 이 도면에서, 글자는 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다(우리는 단지 각 개개 환자에 있어서의 대조 세포와 다른 펩티드 간의 통계적인 유의성 만을 언급하였다). 부가하여, 환자 P4 및 P6의 세포는 펩티드 E18-3APL2 뿐 아니라 E18-12APL3에 의해서도 자극되지 않았다. 관찰되어 지는 바와 같이, 비록 반응이 매우 유사하다는 것이 현저하지만 모든 환자가 다른 펩티드로의 자극에 대해 같은 강도로 반응하지는 않았다. 한편, TNFα 생산을 보다 증가한 펩티드는 환자 P4 및 P5에서는 주로 E18-12APL1이 었고, 반면 환자: P1, P2 및 P3는 음성 대조군에 비해 완만한 증가를 보였다. 또한, 펩티드 E18-3APL1은 대부분의 환자에 있어서 유사한 거동을 나타낸다. 펩티드 E18-3APL1의 경우에, 환자 P2, P4 및 P5는 비록 덜 현저하지만 TNFα 준위의 주요한 증가를 나타냈다. 이 테스트에서, 우리는 오리지날 펩티드로의 이전의 평가에 유사한 결과를 얻었다. 이전의 결과는 펩티드 뿐 아니라 이의 APL도 환자의 단핵세포에서 TNFα 발현의 감소를 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
IL-10의 생성을 증가하는 이런 APLs가 TNFα 준위의 증가를 증진하기 때문에 이들 결과는 모순일 수 있다. 도 13에 오리지날 펩티드 및 이들의 APLs에 의해 유발된 IL-10 및 TNFα 준위의 비가 나타나 있다. 이 도면에서, 글자는 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다(우리는 단지 각 개개 환자에 있어서의 대조 세포와 다른 펩티드 간의 통계적인 유의성 만을 언급하였다). 부가하여, 환자 P4 및 P6의 세포는 펩티드 E18-3APL2 뿐 아니라 E18-12APL3에 의해서도 자극되지 않았다. 이것은 E18-3APL1으로 자극된 세포가 6 환자 중에 4명에서 1보다 큰 지수를 나타내고, 이는 IL-10 준위가 TNFα의 것을 초과했다는 것을 나타내기 때문에, TNFα 준위에 대한 IL-10의 증가가 상당하게 높다는 것을 입증한다. 부가하여 모든 환자에 있어, IL-10 준위는 음성 대조군을 구성하는 세포에 비하여 펩티드 E18-3APL1로 자극된 세포에서 상당하게 높았고, 통계적으로 유의성 있는 차이를 보였다. E18-12APL1의 경우에는 음성대조군에 비교한 차이는 그렇게 현저하지는 않았다. 그래서, 비록 E18-3APL1이 TNFα 준위를 증가하지만, 전체의 뛰어난 효과는 IL-10의 준위에서의 증가이고, 이는 면역억제자 시토킨에 유리한 반응으로의 편중으로 해석된다.
이들 두 APLs이 환자에 투여될 수 있고 그리고 계의 준위에서 활성적 억제를 조정하는 IL-10의 분비성 조절 T 세포의 부차집단을 유도할 수 있다는 것을 제시하였기 때문에 이 연구의 결과는 극히 전도 유망하다. 이들 결과의 분석의 수단에 의해 우리가 도달할 수 있는 또 다른 부차적인 결론은 이들 APLs가 실질적으로 모든 연구된 환자에 있어 이들이 가지고 있는 유전형에 의존하지 않고 유사한 행동을 보여주었다는 것이다. 이들 결과는 매우 고무적인데, 이는 이들 APL의 투여가 모든 환자에 있어서 그들이 가지고 있는 HLA-II 분자 타입에 대해 차이가 존재함에도 불구하고 동일한 효과를 가지는 것을 가능하게 하기 때문이다.
이러한 실험결과로부터, 본 발명의 기본적인 이점은 RA 환자의 치료에 효과적으로 사용될 수 있는, 펩티드의 T 세포 에피토프 또는 변형체 타입 APL에 상응하는 인간 스트레스 단백질 Hsp60의 면역 조절 펩티드를 포함하는 약학적 제제의 용도이고, 이는 이들 질환의 면역발병원의 매카니즘에 포함된 자가반응적 T 세포의 클론을 단절하기 위한 특이적 면역 반응을 유도한다.
본 발명에서 우리가 제안한 치료는 합리적이고 그리고 다수의 환자에게 확장될 수 있으며 또한 이것은 이 질환에 대한 현행 치료와 조합하여 사용될 수 있다.
실시예
18: 관절염이
Mt
로 유발된 동물 모델에서 유도형
APL
펩티드의
치료적
효과의 평가.
동물들은 각각이 8 마리씩 12 그룹으로 나뉘었다. 질병은 11 동물 그룹 (그룹 I- 그룹 XI)에서 유발되었고, 이들의 10은 펩티드로 처리되었고 하나는 질병 유도의 대조군으로 남겨두었다. 펩티드로 처리된 동물 그룹은 Mt로 질병 유발 후 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26일에 100 μL의 PBS 부피로 랫트 당 50 ㎍의 펩티드를 취하였다.
12 그룹으로 분리된 동물은 다음과 같은 형식으로 처리되었다:
- 그룹 I: E18-12 (SEQ. ID. NO: 1) 펩티드 수취
- 그룹 II: SEQ. ID. NO: 5에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 III: SEQ. ID. NO: 8 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 IV: SEQ. ID. NO: 12 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 V: SEQ. ID. NO: 13 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 VI: E18-3 (SEQ. ID. NO: 2) 펩티드 수취
- 그룹 VII: SEQ. ID. NO: 14 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 VIII: SEQ. ID. NO: 15 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 IX: SEQ. ID. NO: 16 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 X: SEQ. ID. NO: 17 에 상당하는 펩티드 수취
- 그룹 XI: 펩티드 수취하지 않음 (질병유발의 대조군)
- 그룹 XII: 질병이 유발되지 않았거나 또는 어떠한 펩티드도 수취하지 않음(음성 대조군).
유발 후 21 및 35일에 각 그룹으로부터 몇 마리 동물이 희생되고, 지라가 추출되고 샘플이 조직 병리학상 분석을 위해 관절로부터 취출되었다.
펩티드 타입 APL로 처리된 동물의 그룹에서, 임상적인 개성이 비 처리된 동물 그룹 및 E18-12 및 E18-3으로 처리된 그룹에 비교하여 유의성이 있었다. 이들 결과는 모든 경우에서 오리지날 펩티드 보다 유도형 APL 펩티드 우월성을 입증하는 조직 병리학상 분석 및 시토킨의 측정에 의해 확증되었다.
도 14에 이 동물 모델이 속하는 네 동물 그룹에 질병의 진화과정을 그래프로 도시하였다. 이 경우에, 그룹들은: 그룹 I (E18-12로 처리된 동물), 그룹 II (E18-12APL1 SEQ. ID. NO: 5로 처리된 동물), 그룹 XI (질병 유도의 대조군) 및 그룹 XII(건강 동물)이다. 이 그래프에서, 다른 글자는 유의성 있는 차이(p<0.001)를 나타낸다(이것은 특정한 날에 측정된 모든 그룹 사이의 통계적 유의성에 대한 것임).
이 그래프에서, 질병의 유발 12일 후로부터 그룹 I, II 및 XI의 동물은 RA의 특징적인 임상적 징후를 보여주기 시작했다는 것은 알 수 있다. 많은 동물들은 또한 귀, 꼬리 및 사지에서 결절과 같은 외부 관절의 징후를 나타냈다. 가장 심각한 RA의 징후는 세 병든 동물 그룹에 대해 약 20일 전후에서 관찰되었다. E18-12로 처리된 동물의 경우에, 21일에 질병 유발의 대조 그룹에 대해 유의성 있는 차이를 감지할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 질병 유발 후 35일 전후에는 이 그룹의 동물들에서의 임상적 신호는 그룹 XI의 것보다 유의적으로 열등하였다 (p<0.001). 이들 결과는 E18-12 펩티드의 보호 효과가 35일 전후에 나타난다는 것을 지적한다. 이러한 점에서, 21일에 보다 나은 결과를 얻기 위해 질병의 초기 상태에서 이 펩티드를 투여하는 것이 천거되어진다. 그러나, 그룹 II의 동물의 경우에는 염증의 임상적 증상이 그룹 I 및 XI에 비하여 명백하게 적었고(p<0.001), 이는 이 펩티드가 질병이 유발된 동물에 있어서 강력한 보호 효과를 발휘한다는 것을 나타낸다.
SEQUENCES LISTING
<110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia
<120> PEPTIDES AND THEIR DERIVED TYPE APL OF THE HSP60 AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS.
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Gln Leu Val Ala Asn Asn Ala Asn Glu Glu Ala
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Claims (9)
- 다음의 시퀀스에 의해 특징되는 류마티스성 관절염 환자에서 조절 T 세포의 클론에 의해 조절되거나 또는, 특히 면역성 결여의 메카니즘 유도자에서 말초 내성의 메카니즘 유도하는, T 세포에 대해 에피토프를 구성하는 60 kDa의 인간 히트 쇼크 단백질의 펩티드 :E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO: 2)F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA (SEQ. ID. NO: 3)
- 제 1항에 있어서, 아미노산 시퀀스가 다음과 같이 인간 MHC 분자로 접촉부위에서 수사된, E18-12 펩티드의 유도된 펩티드 타입 APL (SEQ.ID. NO: 1)임을 특징으로 하는 펩티드 :MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK1 2 34 56 7각 위치에 대해 치환된 것위치 1에 대해: A,F,I,L,M,V,W, 또는Y위치 2에 대해: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는Y위치 3에 대해: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, 또는M위치 4에 대해: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는Y위치 5에 대해: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, 또는Y위치 6에 대해: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, 또는Y위치 7에 대해: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, 또는Y.
- 제 2항에 있어서, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12 및 SEQ. ID. NO: 13으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 시퀀스를 가짐을 특징으로 하는 유도형 APL 펩티드:
- 제 1항에 있어서, 아미노산 시퀀스가 다음과 같이 인간 MHC 분자로 접촉부위에서 수사된, E18-3 펩티드의 유도형 APL 펩티드 (SEQ.ID. NO: 2)임을 특징으로 하는 펩티드 :SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA1 2 3 45 6 7 8각 위치에 대해 치환된 것위치 1에 대해 L,I,V,M,Y,W,F, 또는A위치 2에 대해 A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는Y위치 3에 대해 A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, 또는Y위치 4에 대해 L,I,V,M,Y,W,F, 또는A위치 5에 대해 A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는Y위치 6에 대해 A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는Y위치 7에 대해 A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, 또는Y위치 8에 대해 A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, 또는Y.
- 제 4항에 있어서, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 20 y SEQ. ID. NO: 21로 구성된 군에서 선택된 아미노산 시퀀스를 가짐을 특징으로 하는 유도형 펩티드 타입 APL.
- 제 1항에 있어서, 아미노산 시퀀스가 다음과 같이 랫트 MHC 분자로 접촉부위에서 수사된, F19-6 펩티드의 유도형 APL 펩티드 (SEQ.ID. NO: 3)임을 특징으로 하는 펩티드 :IIDPTKVVRTALLDAA (F19-6)1 2원래의 F19-7 펩티드: (SEQ.ID. NO: 4)로부터위치 1은H 에 대해 치환됨위치 2는E 에 대해 치환됨.
- 청구항 1 내지 6의 하나 또는 그 이상의 펩티드와 약학적으로 용인가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 제 7항에 있어서, 류마티스성 관절염을 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 청구항 1 내지 6의 어느 하나에 따른 펩티드의 유효량 또는 청구항 7에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 류마티스성 관절염이 있는 대상 인간을 치료하는 방법.
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